Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью"

На правах рукописи

Желткова Екатерина Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ МУСОБАСТЕЯНМ ТиБЕЕСиЬОБШ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Черноусова Л.Н.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Леви Д.Т. доктор медицинских наук Меньшиков Д.Д.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова Минздрава Российской Федерации.

Защита состоится «_»_2004 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ по адресу: 125121, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук С Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. С целью повышения эффективности борьбы с туберкулезом ВОЗ выпустила рекомендации по его лечению, предполагающие унификацию курсов химиотерапии для того, чтобы предотвратить развитие устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам, которая возникает в результате использования неправильных схем лечения. Тем не менее, отмечена тенденция к увеличению уровня заболеваемости, которая связана с появлением новых штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к нескольким или ко всем современным противотуберкулезным препаратам.

Высокий уровень инфицированности и смертности от туберкулеза требует быстрого выявления штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, очагов и путей их распространения. С этой целью разрабатываются методы молекулярного типирования, позволяющие по генетическим маркерам охарактеризовать особенности штаммов, выделенных от больных туберкулезом. В последнее время это направление интенсивно развивается, особенно в отношении штаммов M.tuberculosis с лекарственной устойчивостью. Однако, практически нет публикаций по комплексному анализу особенностей генотипа штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, и нет однозначных выводов по этой проблеме, которая и обусловила актуальность нашего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Особенности генотипа штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью при типировании по комплексу наиболее известных молекулярно-генетических маркеров, на примере штаммов микобактерий, выделенных от больных туберкулезом из региона Средней Волги.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1. Изучить спектр мутаций в генах rpoB, katG и inhA, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампи

даос, НАЯашимьц^я ртаммов БИБЛИОТЕКА

M.tuberculosis, выделенных от больных тубер кулезоцлегербург.*

оэ

1 11 ——*

2. Провести типирование штаммов М. tuberculosis по числу спейсерных последовательностей DR-локуса (сполиготипирование).

3. Выполнить типирование штаммов М.tuberculosis по вариабельному числу точных тандемных повторов (VNTR-типирование).

4. Протипировать штаммы M. tuberculosis по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, содержащих вставочную последовательность IS6110 (RFLPIS6110 -типирование).

5. Провести сравнительный анализ результатов комплексного генотипирования штаммов М tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и штаммов чувствительных к рифампицину и изониазиду.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Анализ спектра мутаций в генах rpoB, katG, inhA в штаммах M.tuberculosis, одновременно устойчивых к рифампицину и изониазиду, выявил значительное преобладание микобактерий туберкулеза с сочетанными мутациями в 531 кодоне гена гроВ и в 315 кодоне гена katG.

Дана характеристика штаммов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью по комплексу наиболее известных эпидемиологических маркеров - по сполиготипу, VNTR и RFLP IS6110. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Методом INNO-LiPA и Масгоаггау было показано, что 72,2% штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью имеют сочетанные мутации в 531 кодоне гена гроВ и в 315 кодоне гена katG.

2. Сполиготипирование показало, что 84,5% штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью относятся к Beijing кластеру.

3. VNTR-типирование продемонстрировало, что 75,3% штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью относятся к кластеру 42435.

4. Типирование по RFLP IS6U0 показало, что 81,8% штаммов М tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью относятся к W кластеру.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Комплексная молекулярно-генетическая характеристика штаммов M.tuberculosis по генетическим маркерам позволяет при выделении от больных туберкулезом штаммов либо

Beijing, либо 42435 VNTR, либо W кластеров, либо с сочетанными мутациями в 531 кодоне гена гроВ и 315 кодоне гена katG, отнести их к М.tuberculosis, потенциально имеющим множественную лекарственную устойчивость. Регион, в котором зафиксировано преобладание штаммов с подобными особенностями генома, считать эпидемически неблагоприятным, требующим неотложных мер по проведению противотуберкулезных мероприятий.

Благодаря тому, что определение точечных мутаций в генах гроВ, katG, inhA относится к быстрым методам анализа, а также может быть применено не только при изучении культур M.tuberculosis, но и при анализе диагностического материала от больных туберкулезом, внедрение в практику фтизиатрии молекулярно-генетических методов позволит ускорить выявление лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Генотипирование штаммов M. tuberculosis по нескольким молекулярно-генетическим маркерам внедрено в работу отдела микробиологии ГУ ЦНИИТ РАМН. Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций аспирантам и ординаторам ГУ ЦНИИТ РАМН, а также на курсах усовершенствования врачей-лаборантов бактериологических лабораторий из различных регионов России.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на: 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (2002), на научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (2002), на конгрессе Европейского общества микробиологов в Дубровниках (2002), на Всероссийском научно-практическом съезде общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2002, 2003), на конференции молодых ученых (2001,2003).

Работа апробирована на совместном заседании отдела микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (30.10.2003 г.)

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов. Указатель литературы включает ссылки на 22 отечественных и 147 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 22 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В основу работы положены результаты комплексной молекулярно-генетической характеристики 224 штаммов М.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом из региона Средней Волги в 5 основных лабораториях г. Самары и Самарской области, относящихся к общелечебной и тюремной сети, которые покрывают 40% больных туберкулезом в этом регионе (табл.1).

Таблица 1.

Распределение исследованных штаммов М. tuberculosis по лечебным учреждениям г. Самары и Самарской области.

Название лечебного учреждения Число штаммов, абс (%)

Самарский городской госпиталь №1 51(22,8%)

Самарский городской туберкулезный, диспансер №1 23(10,3%)

Тюремная колония №19 109(48,7%)

Областная региональная туберкулезная лаборатория 19(8,5%)

Новокуйбышевская городская лаборатория 22(9,7%)

Всего штаммов МЛиЪегси1оь1в 224

Эпидемиологические показатели по заболеваемости активным туберкулезом в Самарской области: в 2000г.-61,8, 2001г.-61,0 на 100 тыс. населения. Смертность от туберкулеза составила в 2000г.-13,6, 2001г.-11,5 на 100 тыс. населения.

Исследования были проведены в лаборатории PHLS Mycobacterium Reference Unit, King's College Hospital, London, руководитель профессор

Дробниевский ФА, и в лаборатории молекулярно-генетических методов исследования отдела микробиологии ГУ ЦНИИТ РАМН, руководитель д.б.н. Черноусова Л.Н.

Для всех 224 штаммов M. tuberculosis была проанализирована лекарственная чувствительность к рифампицину и изониазиду методом абсолютных концентраций [WHO/TB/98.258] при посеве на среду Левенштейна-Йенсена с использованием концентраций: 20 мкг/мл рифампицина, 10 мкг/мл изониазида- Данные, о результатах теста на лекарственную чувствительность были любезно предоставлены микробиологами лаборатории PHLS Mycobacterium Reference Unit, King's College Hospital, London.Weldon L. и Yates M.

Определение точечных мутаций в генах rpoB, katG, inhA, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, проводили молекулярно-генетическим методом множественной обратной гибридизации ПЦР фрагментов на тест-системе INNO-LiPA. Rif.Tb, Innogenetics, Бельгия (для рифампицина), методом Масгоаггау (для изониазида).

Сравнение результатов определения лекарственной чувствительности штаммов M.tuberculosis бактериологическим методом и по точечным мутациям в генах rpoB, katG, inhA показало несовпадение результатов у 25 из 224 штаммов M.tuberculosis. Поэтому эти 25 штаммов были исключены из дальнейших исследований, а анализу были подвергнуты 199 штаммов.

С целью более полной характеристики полиморфизма M.tuberculosis 199 штаммов были протипированы по 3 наиболее известным эпидемиологическим генетическим маркерам - по числу спейсерных последовательностей DR-локуса хромосомы микобактерий туберкулезного комплекса (сполиготипирование), по вариабельному числу точных тандемных повторов (VNTR-типирование), по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, содержащих вставочную последовательность IS6110 (RFLP IS6110 типирование).

Сполиготипирование (spoligotyping) проводили согласно стандартному протоколу [Kamerbeek J., 1997] с использованием коммерческой тест-системы

"Spoligotyping" производства- ISOGEN Bioscience BV (Нидерланды). Сполиотипирование - основанный на ПЦР метод, позволяющий изучать полиморфизм Мtuberculosis по числу спейсерных последовательностей DR-локуса хромосомы микобактерий туберкулезного комплекса. DR-локус состоит из прямых повторов длиной 36 п.о., которые чередуются со спейсерными последовательностями разной длины (максимум 43 п.о. для М. tuberculosis). ПЦР проводили с использованием биотинмеченых праймеров, позволяющих амплифицировать спейсерные последовательности между DR-мишенями. Полученные ПЦР продукты гибридизовали в миниблотере с 43 иммобилизованными на биодин С мембране олигонуклеотидными зондами. Детекцию реакции осуществляли хемилюминесцентным методом с использованием ECL системы (Amersham, Великобритания) и последующей экспозицией с рентгеновской пленкой.

VNTR-типирование (variable number of tandem repeat) - основанный на ПЦР метод типирования M. tuberculosis по вариабельному числу точных тандемных повторов ETR А, В, С, D, Е - проводили в соответствии со стандартным протоколом [Frotingham R., 1998] с использованием коммерческой тест-системы "Master Mix Kit" производства QIAGEN (Германия), и 5 пар праймеров (Bioline, Великобритания). Полиморфизм оценивали по стандартной схеме, предложенной Frothingham R., согласно которой каждый ДНК образец характеризуется совокупностью числа копий каждого из 5 точных тандемных повторов, что выражается в пятизначном номере. Электрофоретическое разделение продуктов пяти реакций амплификации с различными праймерами проводили в 3% агарозном геле с использованием маркеров молекулярных масс 100 п.о. и 20 п.о. Результаты VNTR-типирования выражались в пятизначным номером после определения размера ПЦР продукта в результате проведения электрофоретического разделения с последующим расчетом числа копий каждого точного тандемного повтора (ETR А, В, С, D, Е).

RFLP IS6110 типирование M. tuberculosis (restriction fragments length polymorphism), основанное на полиморфизме длин рестрикционных

фрагментов, содержащих вставочную последовательность IS6110, проводили, как описано в международном стандартном протоколе по van Embden J. [1993]. Для этого из культур М. tuberculosis выделяли хромосомную ДНК, затем с помощью фермента PvuII (Promega Co., США) проводили рестрикцию образцов ДНК, которые затем разделяли в электрофорезе. После вакуумного переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на нейлоновую мембрану проводили гибридизацию с 186110-зондом, меченым флуоресцентной меткой. Визуализацию результатов проводили с помощью ECL-набора-(Amersham, Великобритания). Генотипы штаммов М. tuberculosis классифицировали согласно базе данных Нью-Йоркского института общественного здравоохранения (PHRI). Степень родства определяли по критерию Пирсона при помощи компьютерной программы GelCompareII версия 3.0. (Applied Maths, Бельгия).

Исходя из цели исследования, был выполнен сравнительный анализ результатов генотипирования штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и штаммов чувствительных к рифампицину и изониазиду.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программных пакетов Excel и Biostat (по критерию

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Определение лекарственной чувствительности к рифампицину 199 штаммов M. tubérculos is, выполненное на тест-системе INNO-LiPA показало, что 78 (39,2%) штаммов не имели мутаций в гене rpoB гене, в то время как у 121 (60,8%) штамма были выявлены мутации в различных участках гена rpoB.

Анализ спектра мутаций в гене rpoB показал, что наибольшее число штаммов имело мутации в 531 кодоне - 94 штамма (77,7%) (табл. 2). Остальные мутации представлены малым числом штаммов: мутации в 526 кодоне с различными аминокислотными заменами были обнаружены у 10 штаммов, двойная мутация в 531 и 526 кодонах, в 516 и 511 кодонах - каждая встречалась у 5, мутация в 513 кодоне и делеция в гене rpoB - у единичных штаммов.

Таблица 2.

Спектр мутаций в гене хроВ штаммов M.tuberculosis (метод INNO-LiPA).

Тип мутации в гене гроВ Число штаммов, абс.(%)

Ser531>Leu 94 (77,7%)

Ser531>Leu, His526>Asp 5 (4,1%)

His526>Leu 2(1,7%)

His526>Tyr 2 (1,7%)

His526>Asp 6 (5,0%)

Asp516>Val 5 (4,1%)

Gln513>Leu 1 (0,8%)

Leu511>Pro 5 (4,1%)

Del (rpoB) 1 (0,8%)

Определение лекарственной чувствительности к изониазиду 199 штаммов M.tuberculosis, выполненное методом Масшаггау, показало что 82 (41,2%) штамма не имели мутаций в генах katG, inhA, а у 117 (58,8%) выявлены мутации в этих генах. Преобладающими были штаммы с мутацией в 315 кодоне гена katG - 108 (92,3%) (табл.3). Мутации в гене inhA, двойные мутации в генах katG(315 кодон) и inhA были обнаружены каждая у 4 штаммов, а мутация в 463 кодоне гена katG выявлена у 1 штамма.

Таблица 3.

Спектр мутаций в генах katGи inhA штаммов M.tuberculosis (метод Масгоаггау).

При обобщении данных бактериологического и молекулярно-генетического анализов штаммы M.tuberculosis разделили на 4 группы: 97 (48,7%) были определены как штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (устойчивые к рифампицину и изониазиду, ^ИО/ТБ/98.258), 24

(12,1%) штамма как устойчивые только к рифампицину, 20 (10,1%) -устойчивые только к изониазиду и 58 (29,1%) как чувствительные штаммы.

Для более полной характеристики полиморфизма штаммов M. tuberculosis провели молекулярное типирование по трем генетическим маркерам.

Результаты сполиготипирования 199 штаммов, представленные в виде схематических профилей гибридизации на рис.1, показали, что штаммы относились к 34 группам. Из них 22 штамма имели индивидуальный

сполиготип. Остальные штаммы составляли 12 кластерных групп: один кластер

Схематическое изображение сполиготипа Число Класс. Класс. JOiacc.

штаммов А В C

138 R0 SI Bei|in^

II R19 Haarlem

6 R2 S29 T

3 T

2 R8 S253 T

2 T

2 T

3 ' LAMI

2 T

3 RII S42 LAMI

1 S77 T

1 R37 LAMI

1 T

1 T

1 LAMI

RI S40 T

1 LAMI

1 SI07 Haarlem

1 R51 SI48 Haarlem

1 R15

1 R30 S2J4 LAMI

R28 LAMI

1 Haarlem

1 Haarlem

1 R4I Haarlem

1 Haarlem

1 LAMI

1 LAMI

1 R14 S252 LAMI

1 LAMI

1 LAMI

1 LAMI

1 T

1 R51 S148

Схема сполиготипов контрольных штаммов

H37RV

BCGP3 •

Рис.1. Результаты сполиготипирования 199 штаммов M.tuberculosis. Примечание: класс.А - классификация по Нарвской О.В. с соавт. (2002), класс.В - по Sola С. с соавт. (2001), класс.С - по Sebban M. (2002)

включал 138 штаммов, второй по величине - 11 штаммов, 4 кластера включали по 3 штамма, 5 кластеров - по 2 штамма. Самый большой кластер, включающий 138 штаммов"(69,3%), был назван Beijing, для которого является характерным наличие положительного гибридизационного сигнала в позициях с 35 по 43.

Распределение штаммов по сполиготипам в медицинских учреждениях Самарской области показало, что в отличие от общелечебной сети, где штаммы Beijing кластера и штаммы, относящиеся к другим группам, распределились приблизительно поровну, в тюремных учреждениях соотношение штаммов Beijing и не Beijing сильно различалось (77 и 16 штаммов, соответственно), т.е. Beijing штаммы превалировали.

VNTR-типирование 199 штаммов выявило, что штаммы М. tuberculosis относились к 28 группам: 14 штаммов имели индивидуальный VNTR-тип, остальные составляли 14 кластерных групп (табл.4).

Наиболее распространенным VNTR кластером, включавшим в себя 118 штаммов (59,3%), был 42435.

Распределение штаммов по медицинским учреждениям Самарской области показало, что штаммы 42435 VNTR кластера и штаммы, не принадлежащие к этому генотипу, в медицинских учреждениях общелечебной сети распределились приблизительно поровну. В отличие от этого, среди штаммов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулезом из тюремной колонии, соотношение штаммов 42435 VNTR и не 42435 VNTR групп сильно различалось (73 и 20 штаммов соответственно), т.е. штаммы 42435 VNTR кластера преобладали в пенитенциарных учреждениях.

Таким образом, результатом типирования штаммов М.tuberculosis по вариабельному числу точных тандемных повторов явилось выявление одного большого 42435 VNTR кластера, включающего 118 штаммов (59,3%).

Типирование по RFLP IS6110 было выполнено не для всех исследованных 199 штаммов М-tuberculosis, так как для проведения этого

анализа требуется большое количество бактериальной массы, а субкультивирование части штаммов не дало достаточного роста.

Таблица 4.

Результаты VNTR-типирования 199 штаммов М. tuberculosis.

N/N Размер точных тандемных повторов в п.о. VNTR-тип Число штаммов, абс.

ETRA ETRB ETRC ETRD ETRE

1 270 235 160 286 171 12232 5

2 270 235 160 286 330 12235 3

3 270 235 218 286 277 12334 2

4 270 235 276 286 171 12432 1

5 270 235 276 286 224 12433 1

6 270 235 276 286 330 12435 2

7 270 235 334 286. 277 12534 10

8 270 235 334 286 330 12535 1

9 345 235 160 286 171 22232 16

10 345 235 218 286 224 22333 3

И 345 235 218 286 277 22334 1

12 345 235 276 286 171 22432 3

13 345 235 276 286 224 22433 2

14 345 235 276 286 277 22434 1

15 345 235 334 286 171 22532 1

16 420 235 276 286 224 32433 1

17 420 235 218 286 171 32332 1

18 420 235 218 286 224 32333 3

19 420 235 276 286 224 32433 6

20 420 235 276 286 277 32434 1

21 420 235 276 286 330 32435 1

22 495 235 160 286 277 42234 1

23 495 235 218 286 171 42332 1

24 495 235 276 286 277 42434 3

25 495 235 276 286 330 42435 118

26 495 235 276 286 383 42436 1

27 495 235 334 286 171 42532 9

28 570 235 276 286 224 52433 14

M.tub H37Rv 470 292 276 310 224 33433

M.bovis BCG. 570 406 392 233 224 55623

Результаты типирования по RFLP IS6110 103 штаммов М. tuberculosis, представленные в таблице 5, показали, что наибольшее число штаммов (76 штаммов - 73,8%) относилось к W кластеру, для которого характерно наличие от 16 до 22 копий IS61I0 и определенное взаимное расположение друг относительно друга фрагментов ДНК, несущих копии 1S6110.

Таблица 5.

Результаты типирования 103 штаммов М. tuberculosis no RFLPIS6110.

5 штаммов (4,8%) принадлежали к AI группе, для которой характерно наличие 10-12 копий IS6110, определенным образом расположенных относительно друг друга. Одна культура M.tuberculosis была представлена смесью двух штаммов, принадлежащих к AI и W, которая имела 27 полос гибридизации, по взаимному расположению характерных как для W, так и для AI штаммов. Кроме того, был выявлен 21 штамм (20,5%) с другими генотипами и по данным компьютерного анализа со степенью родства менее 60%.

Распределение штаммов W кластера по лечебным учреждениям Самарской области показало значительное преобладание штаммов данного генотипа в тюремной колонии (43 штамма из 51).

Таким образом, при генотипировании по эпидемиологическим маркерам 199 штаммов M.tuberculosis, выделенных от больных из г. Самары и Самарской области, выявлена высокая кластеризация штаммов по всем 3 генетическим маркерам: 69,3% штаммов относились к Beijing кластеру, 59,3% -к 42435 VNTR кластеру, 73,8% - к W группе по RFLP IS6U0. Штаммы с подобными характеристиками значительно превалировали в пенитенциарном учреждении. Это означает, что тюрьмы являются очагом подобных штаммов. Преобладание штаммов с одинаковыми генетическими характеристиками свидетельствует о высокой трансмиссивности этих штаммов и неблагополучной эпидемической ситуации по туберкулезу в области.

В связи с поставленной целью работы нами был проведен сравнительный анализ результатов генотипирования 97 штаммов M.tuberculosis с

множественной лекарственной устойчивостью и 58 чувствительных штаммов, как группы сравнения.

Изучение спектра сочетанных мутаций у штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), обнаруженных в генах rpoB, katG и inhA, показало, что наиболее распространенным вариантом являлся штамм с мутациями Ser531>Leu, katG315 - 70 штаммов (72,2%). Остальные варианты мутаций в генах-маркерах устойчивости к рифампицину и изониазиду представлены у единичных штаммов (рис.2).

Рис. 2. Мутации в генах rpoB, katG, inhA, характерные для МЛУ штаммов.

Несмотря на то, что в литературе проблема, связанная с изучением лекарственной устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам по точечным мутациям в генах-мишенях, широко освещена, нами не было найдено данных о характеристике спектра мутаций штаммов M.tuberculosis с МЛУ. В основном представлены данные исследований по изучению спектра мутаций в штаммах либо только рифампицин-устойчивых, либо изониазид-устойчивых [PfyfFer G. et al., 2001, Qian L. et al., 2002, Mokrousov I. et al., 2002]. Нами же были проанализированы штаммы M.tuberculosis с МЛУ и выявлены наиболее часто встречающиеся сочетания мутаций в участках генома, ответственных за устойчивость к рифампицину и изониазиду.

Распределение 97 штаммов M.tuberculosis с МЛУ и 58 чувствительных по сполиготипам представлено на рис.3. Согласно Sebban M. (2002) классификация штаммов по сполиготипам основана на происхождении

штаммов. Как видно из рисунка, наибольшее число штаммов М. tuberculosis с МЛУ (82 штамма - 84,5%) относилось к Beijing кластеру, для которого характерно наличие 9 спейсеров (35-43). 7 штаммов (7,2%) принадлежали к LAM1 группе, которая характеризуется одновременным отсутствием спейсеров 21-24 и 33-36 и присутствием хотя бы одного из спейсеров с 1 по 30.

А 7 1% 84,5% Ш Beijing О Haarlem □ LAM1 ВТ ■ Другой

В 1,7% 13,8% 10,3% ЕЭ Beijing О Haarlem □ LAM1 ВТ ■ Другой

Рис.3. Сполиготипирование штаммов M.tuberculosis. А - 97 штаммов M.tuberculosis с МЛУ, В - 58 чувствительных штаммов

5 штаммов (5,1%) относились к Haarlem группе, включающей штаммы, у которых одновременно отсутствуют спейсеры 31 и 33-36 и присутствует хотя бы один из спейсеров с 1 по 30. Два штамма принадлежали к Т группе, содержащей штаммы, у которых присутствует хотя бы один из спейсеров с 1 по 30, обязательно присутствуют 9,10 и 31 и, по крайней мере, один из спейсеров

21-24 и одновременно отсутствуют спейсеры 33-36. Для одного штамма M.tuberculosis мы не смогли найти подобного сполиготипа в известных нам базах данных.

Чувствительные штаммы, относящиеся к Beijing кластеру, оказались наиболее многочисленными (24 штамма - 41,3%). Вторыми по частоте встречаемости явились штаммы, принадлежащие к Т группе, которая была представлена 19 штаммами (32,9%). Штаммы, относящиеся к LAM1 и Haarlem группам, насчитывали, соответственно, 8 (13,8%) и 6 (10,3%) штаммов. Для одного штамма мы не смогли найти подобного сполиготипа в базах данных.

Сравнение сполиготипов штаммов M.tuberculosis с МЛУ и чувствительных позволило заключить, что наибольшее число штаммов в обеих группах относилось к Beijing кластеру. Однако, доля Beijing штаммов среди штаммов с МЛУ была в два раза больше, чем в контрольной группе (84,5% и 41,3% соответственно, р<0,001). Кроме того, в группе штаммов M.tuberculosis с МЛУ остальные сполиготипы представлены в малом количестве и приблизительно в одинаковых долях (от 2 до 7%). Распределение по сполиготипам чувствительных штаммов значительно отличалось, так как наибольшее число штаммов относились как к Beijing, так и к Т кластерам, причем в приблизительно равных долях (41% и 33% соответственно).

Результаты VNTR-типирования 97 штаммов M.tuberculosis с МЛУ выявили большой полиморфизм по этому генетическому маркеру, штаммы относились к 13 группам. Наиболее распространенным VNTR кластером являлся 42435, включавшим в себя 73 штамма (75,3%). На втором месте был 12534 VNTR кластер, представленный всего 6 штаммами (6,2%). Остальные VNTR группы присутствовали в количестве 1-4 штаммов M.tuberculosis (рис.4).

Результаты VNTR-типирования 58 чувствительных штаммов также выявили большой полиморфизм по этому генетическому маркеру, они относились к 17 группам, но наблюдалось иное распределение штаммов M.tuberculosis пo VNTR группам. Наиболее распространенным VNTR кластером, включавшим 17 штаммов (29,3%), являлся 42435. На втором месте

находился 22232 УЫТК кластер, который был представлен 10 штаммами (17,2%). Остальные УЫТК группы состояли из 1-5 штаммов (рис.4).

Рис.4. Распределение штаммов M.tuberculosis no VNTR группам. А- 97 штаммов М-tuberculosis с МЛУ, Б - 58 чувствительных штаммов.

Сравнение результатов VNTR-типирования штаммов M. tuberculosis с МЛУ и чувствительных показало, что наибольшее число штаммов в обеих группах относилось к 42435 VNTR кластеру. Однако, доля штаммов M.tuberculosis с МЛУ с 42435 кластером была гораздо выше, чем у чувствительных (76% и 30% соответственно, р<0,001). Отмечена разница и во встречаемости штаммов 22232 VNTR кластера у M.tuberculosis с МЛУ и чувствительных (3% и 17% соответственно, р<0,05). Обращено внимание на отсутствие чувствительных штаммов с 12534 VNTR группой, в то время как у M.tuberculosis с МЛУ она встречалась в 6% случаях.

Кроме того, была отмечена большая кластеризация штаммов М. tuberculosis с МЛУ (преобладание одного кластера) и большее разнообразие малых кластеров VNTR-типов в группе чувствительных штаммов.

Сравнительный анализ по RFLP IS6110 был проведен для 55 штаммов М. tuberculosis с МЛУи 27 чувствительных штаммов.

Результаты типирования по RFLP IS6110 55 штаммов M.tuberculosis с МЛУ показали, что наибольшее число штаммов принадлежало W группе (45 штаммов -81,8%). 3 штамма (5,4%) относились к AI группе. Кроме того, было выявлено 7 штаммов M.tuberculosis (12,8%) с другими генотипами.

А 12,8% 81,8% ■ W □ Al □ Другие

В 3,7% 7,8% ■ W □ Al □ другие □ W+AI

Рис.5. Распределение штаммов Mtuberculosis no RFLP IS6110 согласно базе данных PHRI, США.

А - 55 штаммов Мtuberculosis с МЛУ, В - 27 чувствительных штаммов

В группе чувствительных к рифампицину и изониазиду 27 штаммов распределились следующим образом: 12 (44.4%) штаммов относились к W группе, 2 штамма - к Л!, 12 (44,4%) штаммов - к другим генотипам. Одна

культура была представлена смесью двух штаммов - AI и W, которая имела 27 полос гибридизации при RFLPIS6U0.

Таким образом, типирование по RFLP IS6110 выявило преобладание штаммов W кластера среди штаммов M.tuberculosis с МЛУ и доля W штаммов в этой группе была выше, чем у чувствительных (81,8% и 44,4% соответственно, р<0,05).

Одновременное типирование по RFLP IS6110 и по сполиготипу показало, что штаммы W группы являются частью штаммов-Beijing сполиготипа. В последнее время их объединяют под названием W-Beijmg группа [Bifani P., 2002]. В нашем исследовании все штаммы W группы относились к штаммам Beijing сполиготипа, т.е. их тоже можно называть W-Beijing штаммами. Как следует из наших данных, большинство этих штаммов M.tuberculosis были МЛУ.

По данным мировой литературы, M.tuberculosis Beijing генотипа впервые были обнаружены в Китае, затем в других странах Азии (Вьетнам, Таиланд, Монголия, Южная Корея, Малайзия), для которых данный генотип, как предполагалось, является эндемичным. Beijing штаммы позднее были выявлены в Южной Африке, на территории Карибского бассейна и США [Bifani P., 2002]. По данным Sola С. с соавт. (2001), генотип Beijing, выявленный у 18% изолятов M.tuberculosis, вошедших в международную базу данных, является наиболее распространенным в мире. Преобладание штаммов Beijing генотипа показано и на территории России [Нарвская О.В., 2001, Шемякин И.Г., 2002].

Существуют разные мнения о взаимосвязи Beijing штаммов и лекарственной устойчивости. Была показана связь штаммов Beijing генотипа и лекарственной устойчивости M.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Нью-Йорке, Вьетнаме, Кубе и Эстонии [Sola С, 2001]. Являются ли Beijing штаммы группой, которая имеет особенно высокую вероятность приобретения лекарственной устойчивости, пока не установлено, но это предположение подтверждается тем фактом, что подобные ассоциации со штаммами этой же группы найдены во многих регионах мира.

Данные мировой литературы показали, что штаммы 42435 VNTR кластера преобладают в регионах, где распространены штаммы Beijing сполиготипа, в большинстве своем являющиеся лекарственно-устойчивыми, так как при сопоставлении результатов сполиготипирования и VNTR-типирования штаммы 42435 кластера на 90-100% относились к Beijing группе [Sola С, 2001]. Аналогичные результаты получены и в нашем исследовании. Штаммы 22232 VNTR группы, которые в представленной работе были в большинстве чувствительными (76,9%), относились в основном к LAM1 группе, но данных об их связи с лекарственной устойчивостью пока нет. Штаммы LAM1 группы на территории России являются вторыми по частоте встречаемости [Нарвская О.В. с соавт., 2001, Шемякин И.Г. с соавт., 2002].

Из-за того, что штаммы Beijing генотипа являются высоко превалирующими во многих регионах и встречаются во многих странах мира, стоит задуматься, что штаммы данного генотипа обладают избирательным преимуществом перед другими M.tuberculosis. Кроме того, взаимосвязь штаммов Beijing генотипа и лекарственной устойчивости, показанная в некоторых исследованиях, позволяет выдвинуть концепцию, что эти штаммы обладают свойством распространяться и приобретать лекарственную устойчивость.

До начала нашей работы предполагалось, что штаммы M.tuberculosis с МЛУ могут относиться к какой-либо определенной генетической группе по эпидемиологическим маркерам. Но результаты собственных исследований не подтвердили это предположение. Это означает, что штаммы M.tuberculosis с МЛУ не являются генетически однородными по исследованным маркерам. Штаммы с одинаковыми характеристиками при VNTR-, RFLP IS6110- и сполиготипировании были выявлены как среди штаммов M.tuberculosis с МЛУ, так и чувствительных штаммов.

Однако, можно отметить тенденцию к кластеризации штаммов с МЛУ (табл. 6). Так, 72,2 % штаммов M.tuberculosis с МЛУ несли сочетанные мутации в 531 кодоне гена гроВ и 315 кодоне гена katG, 84,5% штаммов относились к

Beijing кластеру, 75,3% - к 42435 VNTR кластеру, 81,8% - к W группе по RFLP IS6110, что достоверно отличало их от чувствительных штаммов, встречаемость изученных генотипов у которых была 41,3%, 30,0% и 46,2% соответственно (р<0,05).

Таблица 6.

Обобщенная характеристика штаммов М. tuberculosis с МЛУ.

Хар-ка штаммов Сочетанная мутация Ser531>Leu, katG315 (n=97) Beijing кластер (сполиготипиро-вание) (п=97) 42435 (VNTR) (п=97) W группа (RFLP IS61I0) (п=55)

Число штаммов абс.(%) 70(72,2) 82(84,5) 73(75,3) 45(81,8)

В совокупности полученные данные позволяют предположить, что циркулируют одни и те же штаммы - Beijing-W-42435-генотипа, большая часть которых лекарственно-устойчивые. Все это объясняет эпидемическое неблагополучие по туберкулезу в регионе Средней Волги.

Данные по высокому проценту принадлежности МЛУ штаммов к определенным генетическим группам имеют большое практическое значение, так как идентификация штаммов М. tuberculosis с подобным генотипом должна настораживать на возможность появления штаммов с МЛУ.

ВЫВОДЫ.

1. Анализ спектра точечных мутаций в генах, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, показал, что 60,8% штаммов Мtuberculosis имели мутации в гене гроВ, 58,8% - в генах katG и inhA. Наибольшее число рифампицин-устойчивых M.tuberculosis несли мутации в 531 кодоне гена гроВ (77,7%). Преобладающими среди изониазид-устойчивых были штаммы с мутацией в 315 кодоне гена katG (92,3%).

2. Генотипирование по эпидемиологическим маркерам M.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом из региона Средней Волги, выявило высокую кластеризацию штаммов: 69,3% из них относились к Beijing кластеру, 59,3% - к 42435 VNTR кластеру, 73,8% - к W группе по RFLP 1S6110.

Тюремные учреждения являлись очагом штаммов с выше обозначенной генетической характеристикой. Клональное распространение штаммов М. tuberculosis свидетельствует о неблагополучной эпидемической ситуации по туберкулезу в регионе Средней Волги.

3. Изучение лекарственной чувствительности штаммов к рифампицину и изониазиду показало, что 48,7% из них принадлежали к М.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (устойчивые одновременно к рифампицину и изониазиду). Анализ спектра точечных мутаций в генах гроВ, katG, inhA выявил, что 72,2% штаммов несли сочетанные мутации в 531 кодоне гена гроВ (Ser53 l>Leu) и в 315 кодоне гена katG.

4. Сполиготипирование продемонстрировало различное распределение по сполиготипам среди штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и чувствительных к рифампицину и изониазиду. 84,5% M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью относились к штаммам Beijing кластера, что достоверно (р<0,001) отличало их от чувствительных, среди которых Beijing и Т группы встречались практически с одинаковой частотой (41,0% и 33,0% соответственно).

5. VNTR-типирование показало, что доля штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, относящихся к 42435 кластеру (76,0%), была достоверно (р<0,001) выше, чем у чувствительных (30,0%). Доля штаммов 22232 VNTR группы (3,0%) была достоверно (р<0,05) ниже, чем у чувствительных (17,0%).

6. Типирование по RFLP IS6110 выявило, что среди штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью преобладали штаммы W группы (81,8%), что достоверно (р<0,05) отличало их от чувствительных (46,2%).

7. Молекулярно-генетическое типирование показало, что, несмотря на то, что эпидемиологические маркеры не связаны с лекарственной устойчивостью (штаммы Beijing кластера, 42435 VNTR и W групп были обнаружены как среди лекарственно-устойчивых, так и среди чувствительных M.tuberculosis),

выявлено значительное преобладание перечисленных генотипов среди

штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Drobniewski F., Balabanova Y., Ruddy M., Weldon L., Jeltkova K., Brown T. et al. Rifampin- and multidrug resistant tuberculosis in russian civilians and prison inmates: dominance of the Beijing strain family // Emerg. Infec. Dis.- 2002.-Vol.8.-P.1320-1326.

2. M Ruddy, Balabanova Y., Fedorin I., Weldon L., Jeltkova K, Malomanova N., Elizarova E., Melentyev A., Mutovkin E., Zakharova S., Kuznetsov S., Drobniewski F. Drug resistance of Mycobacterium Tuberculosis in Samara Oblast of the Russian Federation: results from pilot analysis for in civil and penitentiary sectors // 23 Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, Dubrovnik.-2002. -P. 17.

3. Желткова Е.А., Черноусова Л.Н., Балабанова Я., Дробниевский Ф. Генотипирование клинических изолятов Mycobacterium Tuberculosis из Самарской области // Сб. тезисов 4-й Всеросс. науч.-практ. конф. "Генодиагностика инфекционных заболеваний".- М.- 2002.- стр. 109-110.

4. Черноусова Л.Н., Ловачева О.В., Иртуганова О.А., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Желткова ЕА, Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Значение генотипирования микобактерий туберкулеза для фтизиопульмонологии // Сб. науч.-практ. симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины".- М.- 2002.- стр.305-307.

5. Желткова Е.А Анализ мутаций в гроВ гене рифампицин-устойчивых микобактерий туберкулеза на микрочипах // Сб.мат-лов научно-практ. конфер. молодых ученых "Актуальные вопросы туберкулеза и других гранулематозных заболеваний".- М.-2001.- стр.20-21.

6. Васильева И.А.,Черноусова Л.Н., Лапа С А, Грядунов Д.Л., Желткова Е.А., Кузьмин А.В. Роль экспресс-диагностики лекарственной резистентности МБТ к рифампицину в лечении туберкулеза с множественной лекарственной

устойчивостью // Мат-лы юбил. сессии "80-летие ЦНИИТ РАМН и 75 лет со дня рождения академика РАМН А.Г. Хоменко".- М.- 2001.- стр.73-74. 7. Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Андреевская Т.Г., Желткова Е.А. Молекулярное типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis из регионов России // Мат-лы II Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".- М.- 2003.- стр.293.

Список использованных сокращений.

М. tuberculosis -Mycobacterium tuberculosis МЛУ - множественная лекарственная устойчивость ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Подписано кпечатиО5 .01 .04 Г.Заказ № 7 Тираж 100 экз.

»--7 2£

РНБ Русский фонд

2004-4 25505

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Желткова, Екатерина Александровна

Страница

Перечень условных обозначений

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Механизмы возникновения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам 1О

1.1. изониазиду

1.2. рифампицину

1.3. этамбутолу

1.4. пиразинамиду

1.5. фторхинолонам

1.6. стрептомицину и другим ингибиторам синтеза протеаз

Глава 2. Проблемы в установлении лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis и роль молекулярно-генетических методов 27 Собственные исследования

Глава 3. Материалы и методы

3.1. Штаммы M.tuberculosis (МБТ) 34 3.2 Определение лекарственной чувствительности МБТ к изониазиду и рифампицину бактериологическим методом

3.3. Определение лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду молекулярно генетическими методами

3.4.Методы молекулярно-генетического типирования штаммов МБТ

3.4.1. Сполиготипирование

3.4.2. VNTR-типирование

3.4.3. RFLP IS6110 типирование

3.5. Статистическая обработка полученных результатов

Глава 4. Изучение лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду штаммов МБТ

Глава 5. Сполиготипирование штаммов МБТ по числу спейсерных последовательностей DR-локуса

Глава 6. Типирование штаммов МБТ по вариабельному числу точных тандемных повторов

Глава 7. Генотипирование штаммов МБТ по RFLPIS

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью"

Актуальность темы. В последнее время ТБ вышел на первое место по смертности (около 3 миллионов смертей в год) [59]. Из ежегодно регистрируемых новых больных более 7000 человек умирают каждый день [163]. Данные уровни смертности только частично отображают угрозу глобального распространения ТБ. Более 80% больных ТБ находятся в продуктивном возрасте от 15 до 49 лет. Хотя ТБ всегда являлся эндемичным заболеванием, в большинстве развивающихся стран его опасность увеличилась из-за распространения ВИЧ инфекции, обширной социальной реструктуризации вследствие быстрого развития промышленности и военных конфликтов [26]. Таким образом, можно предположить, что ТБ является новой мировой угрозой здоровью людей.

В России уровень заболевания ТБ увеличивался с 1950 до 1990 гг. Самые низкие показатели заболевания и смертности были рекордными в 1991 году (34.0/100000 и 8.1/100000 соответственно). К 1999 году эти показатели повысились до 85.2/100000 и 20.0/100000 соответственно [57,129]. Средний возраст больных ТБ снизился, отражая высокие уровни новых случаев трансмиссии. Данные по ЛУ для РФ в целом скудные, информация, сравнимая с международными данными, была представлена ВОЗ только для 2 из 89 областей. В Ивановской и Томской областях ТБ с МЛУ был зафиксирован в 1998-1999 гг. в 9.0% и 6.5 % соответственно [162].

Для повышения эффективности борьбы с ТБ ВОЗ выпустила рекомендации по его лечению, которых придерживаются большинство стран мира [89]. Рекомендации были созданы с тем, чтобы унифицировать курсы химиотерапии для предотвращения развития устойчивости микобактерий к ПТП, возникающей в результате использования неправильных схем лечения. Тем не менее, отмечена тенденция к увеличению уровня смертности, которая связана с появлением новых штаммов МБТ, устойчивых к нескольким или ко всем современным ПТП [59,112]. Туберкулез, вызванный штаммами МБТ с

МЛУ, сопровождается высоким уровнем смертности (50-70%) с относительно коротким интервалом (4-16 недель) от постановки диагноза до смерти [52]. В большинстве стран увеличились случаи заболевания ТБ с МЛУ, что затрудняет контролировать программы по ТБ, особенно в развивающихся странах, где достаточно высок уровень заболеваемости (48%) [40]. Высокий уровень инфицирования и смертности от ТБ требует быстрого выявления МЛУ штаммов, очагов и путей их распространения. С этой целью разрабатываются методы молекулярного типирования, позволяющие по генетическим маркерам охарактеризовать особенности штаммов, выделенных от больных ТБ. В последнее время это направление интенсивно развивается, в частности, в отношении штаммов МБТ с ЛУ. Однако практически нет публикаций по комплексному молекулярно-генетическому анализу штаммов МБТ с МЛУ, и нет однозначных выводов по этой проблеме, которая и обусловила актуальность нашего исследования.

Поэтому целью настоящего исследования являлось изучение особенностей генотипа штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью при типировании по комплексу наиболее известных молекулярно-генетических маркеров, на примере штаммов МБТ, выделенных от больных из региона Средней Волги - г. Самары и Самарской области.

Задачи работы:

1. Изучить спектр мутаций в генах rpoB, katG и inhA, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом.

2. Провести типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis по числу спейсерных последовательностей DR-локуса (сполиготипирование).

3. Выполнить типирование штаммов МБТ по вариабельному числу точных тандемных повторов (VNTR-типирование).

4. Протипировать штаммы Mycobacterium tuberculosis по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, содержащих вставочную последовательность 1S6110 (RFLP IS6110 -типирование).

5. Провести сравнительный анализ результатов комплексного генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и штаммов чувствительных к рифампицину и к изониазиду.

Научная новизна.

Анализ спектра мутаций в генах rpoB, katG, inhA в штаммах М.tuberculosis, одновременно устойчивых к рифампицину и изониазиду, выявил значительное преобладание микобактерий туберкулеза с сочетанными мутациями в 531 кодоне гена гроВ и в 315 кодоне гена katG.

Дана характеристика штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью по комплексу наиболее известных эпидемиологических маркеров - по сполиготипу, VNTR и RFLP 1S6110. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методом INNO-LiPA и Macroarray было показано, что 72,2% штаммов МБТ с МЛУ имеют сочетанные мутации в 531 кодоне гена гроВ и в 315 кодоне гена katG,

2. Сполиготипирование показало, что 84,5 % штаммов МБТ с МЛУ относятся к Beijing кластеру.

3. VNTR-типирование продемонстрировало, что 75,3 % штаммов МБТ с МЛУ относятся к кластеру 42435.

4. Типирование по RFLP 1S6110 показало, что 81,8 % штаммов МБТ с МЛУ относятся к W-кластеру.

Практическая значимость.

Комплексная молекулярно-генетическая характеристика штаммов МБТ по генетическим маркерам позволяет при выделении от больных ТБ штаммов либо Beijing, либо 42435 VNTR, либо W кластеров, либо с сочетанными мутациями в 531 кодоне гена гроВ и 315 кодоне гена katG, отнести их к МБТ, потенциально имеющим МЛУ. Регион, в котором зафиксировано преобладание штаммов с подобными особенностями генома, считать эпидемически неблагоприятным, требующим неотложных мер по проведению противотуберкулезных мероприятий.

Благодаря тому, что определение точечных мутаций в генах гроВ, kalG, inhA относится к быстрым методам анализа, а также может быть применено не только при изучении культур МБТ, но и при анализе диагностического материала от больных ТБ, внедрение в практику фтизиатрии молекулярно-генетических методов позволит ускорить выявление лекарственно-устойчивых штаммов МБТ. Все это в совокупности будет способствовать усовершенствованию комплекса мероприятий по предотвращению распространения штаммов с МЛУ.

Внедрение в практику.

Генотипирование штаммов МБТ по нескольким молекулярно-генетическим маркерам внедрено в работу отдела микробиологии ГУ ЦНИИТ РАМН. Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций аспирантам и ординаторам ГУ ЦНИИТ РАМН, а также на курсах усовершенствования врачей-лаборантов бактериологических лабораторий из различных регионов России.

Апробация работы, публикации. Основные результаты диссертации доложены: на 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (2002), на научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (2002), на конгрессе Европейского общества микробиологов в Дубровниках (2002), на заседании секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2002, 2003), на конференции молодых ученых (2003).

Работа апробирована на совместном заседании отдела микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (30.10.2003 г.)

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и 13 таблицами. Список литературы содержит 22 отечественных и 147 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Желткова, Екатерина Александровна

выводы

1. Анализ спектра точечных мутаций в генах, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, показал, что 60,8% штаммов М.tuberculosis имели мутации в гене гроВ, 58,8% - в генах katG и inhA. Наибольшее число рифампицин-устойчивых М.tuberculosis несли мутации в 531 кодоне гена гроВ {11,1%). Преобладающими среди изониазид-устойчивых были штаммы с мутацией в 315 кодоне гена katG (92,3%).

2. Генотипирование по эпидемиологическим маркерам М.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом из региона Средней Волги, выявило высокую кластеризацию штаммов: 69,3%» из них относились к Beijing кластеру, 59,3% - к 42435 VNTR кластеру, 73,8% - к W группе по RFLP 1S6110. Тюремные учреждения являлись очагом штаммов с выше обозначенной генетической характеристикой. Клональное распространение штаммов M.tuberculosis свидетельствует о неблагополучной эпидемической ситуации по туберкулезу в регионе Средней Волги.

3. Изучение лекарственной чувствительности штаммов к рифампицину и изониазиду показало, что 48,7%) из них принадлежали к M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (устойчивые одновременно к рифампицину и изониазиду). Анализ спектра точечных мутаций в генах гроВ, katG, inhA выявил, что 72,2%) штаммов несли сочетанные мутации в 531 кодоне гена гроВ (Ser53 l>Leu) и в 315 кодоне гена katG.

4. Сполиготипирование продемонстрировало различное распределение по сполиготипам среди штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и чувствительных к рифампицину и изониазиду. 84,5% M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью относились к штаммам Beijing кластера, что достоверно (р<0,001) отличало их от чувствительных, среди которых Beijing и Т группы встречались практически с одинаковой частотой (41,0% и 33,0% соответственно).

5. VNTR-типирование показало, что доля штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, относящихся к 42435 кластеру (76,0%), была достоверно (р<0,001) выше, чем у чувствительных (30,0%). Доля штаммов 22232 VNTR группы (3,0%) была достоверно (р<0,05) ниже, чем у чувствительных (17,0%).

6. Типирование по RFLP IS6II0 выявило, что среди штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью преобладали штаммы W группы (81,8%), что достоверно (р<0,05) отличало их от чувствительных (46,2%).

7. Молекулярно-генетическое типирование показало, что, несмотря на то, что эпидемиологические маркеры не связаны с лекарственной устойчивостью (штаммы Beijing кластера, 42435 VNTR и W групп были обнаружены как среди лекарственно-устойчивых, так и среди чувствительных M.tuberculosis), выявлено значительное преобладание перечисленных генотипов среди штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Желткова, Екатерина Александровна, Москва

1. Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза на северо-западе России // Пробл. туб.- 2003.-№ 5.- стр. 42-45.

2. Генерозов Э.В., Акопиан Т.А., Владимирский М.А., Шипина Л.К., Иртуганова О.А., Говорун В.М. Прямой генетический анализ резистентности к рифампицину изолятов M.tiiberculosis в образцах мокроты // Пробл. туб.- 2003.- № 4.- стр. 49-52.

3. Голышевская В.И., Мартынова Л.П., Севастьянова Э.В. Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза // Русский Мед. Журнал.-2001.-№4.-стр. 15-19.

4. Голышевская В.И., Севастьянова Э.В., Воронина Г.А. Определение лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis методами пропорций и абсолютных концентраций // Пробл. туб,- 2001.- № 3.- стр. 51-53.

5. Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.М. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг. // Пробл. туб.- 2000.- № 5.- стр. 19-23.

6. Марьяндышев А.О., Тунгусова О.С., Кауган Д., Сандвен П. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в Баренцевом регионе России и Норвегии // Пробл. туб.- 2001.- № 36.- стр. 17-19.

7. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О. Молекулярные механизмы формирования лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (обзор литературы) // Пробл. туб.- 2001.- № 6.- стр. 48-50.

8. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О. Молекулярная генетикамикобактерий туберкулеза // Пробл. туб.- 2003.- № 2,- стр. 43-46. Ю.Михайлович В.М., Лапа С.А., Грядунов Д.А., Стрижков Б.Н., Соболев

9. A.Ю. и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микрочипе для обнаружения рифампицинрезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis II Бюлл. экспер. биол. и мед.- 2001.- Т.131. № l.-стр. 112-117.

10. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных на Северо-Западе России // Пробл. туб. -1999 -№ 3. стр. 39-41.

11. Приказ №558 МЗ РФ от 08.06. 1978 г. "Об унификации микробиологических методов при туберкулезе". -М. -1978.

12. Приказ №109 МЗ РФ от 21.03.2003 г. "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации". -М. -2003.

13. Салина Т. Ю., Морозова Т. И., Федотов Э.А., Переселенцева Е.С., Завалев

14. B.И. Сравнительное изучение эффективности разных методов диагностики туберкулеза // Пробл. туб.- 2000.- № 2.- стр. 43-44.

15. Сидоренко С.В. Современные проблемы диагностики и лечения туберкулеза //Антибиотики и химиотерапия.- 1999.- № 8.- стр. 3-5.

16. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А., Маух X., Николенко Е.Н. Выявление микобактерий туберкулеза различными методами // Пробл. туб.- 2001.- № 3.- стр. 56-58.

17. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А., Маух X., Николенко Е.Н. Тестирование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулезас использованием различных методов // Пробл. туб.- 2001.- № 5.- стр. 4345.

18. Черноусова Л.Н. Современные тенденции и возможности микробиологической диагностики туберкулеза // Русский Мед. журнал -2002.-№ 10.- стр. 697-698.

19. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Коробова О.В., Анисимова В.А. Характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов //. Мол. генетика, микробиол. и вирус.- 2003.- № 1,- стр. 32-40.

20. Anh D.D., Borgdorff M., Van L.N., Lan N.T.N., van Gorkom Т., Kremer K. et al. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype emerging in Vietham // Emerg. Infect. Dis.- 2000.- Vol. 6.- P. 302-305.

21. Banerjee A., Dubnau E., Quemard A., Balasubramanian V., Um K.S., Wilson T. et al. InhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis II Science.- 1994.- Vol. 263.- P. 227-230.

22. Barnes P., Blotch A.B., Davidson B.T., Snyder Jr. D.E. Tuberculosis in patients with immuno-deficiency virus infection // N. Engl. J. Med.- 1991.- Vol. 324.- P. 1664-50.

23. Bifani P.J., Mathema В., Kurepina N.E. and Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends in Microbiol. 2002. - Vol. 10. - P. 45-52.

24. Bifani P.J., Plikaytis B.B., Kapur V., Stockbauer K., Pan X., Lutfey M.L. et al. Origin and interstate spread of a New York City multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clone family // JAMA.- 1996.- Vol. 275.- P. 452457.

25. Bloom B.R., Murray C.J.L. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer// Science.- 1992.- Vol. 257.- P. 1055-64.

26. Brown T.J., Tansel O., and French G.L. Simultaneous identification and typing of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates by analysis of pncA and rpoB // J. Med. Microbiol.- 2000.- Vol .49.- P. 651-656.

27. Canetti G. The tubercle bacillus in the pulmonary lesion of man // Springer Publishing Сотр. New York. 1955.

28. Canetti G., Rist N., Grosset J. Primary drug resistant in tuberculosis // Am. Rev. of Tuberc. and Pulmon. Dis.- 1964.- Vol. 90,- P. 792-799.

29. Canetti G., Le Lirzin M., Porven G., Rist N., and Grumbach F. Some comparative aspects of rifampin and isoniazid // Tubercle.- 1968.- Vol. 49,- P. 367-376.

30. Canetti G., Fox W., Khomenko A. et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes. // Bull. World Health Organ.- 1969.- Vol. 41P. 21-43.

31. Chae H.Z., Chung S.J., Rhee S.G. Thioredoxin-dependent-peroxidase from yeast //J. Biol. Chem.- 1994.- Vol. 269.- P. 276-280.

32. Cohn D.L., Flavia В., Raviglione M.C. Drug-resistant tuberculosis: review of the worldwide situation and the WHO/IUATLD global surveillance project // Clin. Infect. Dis.- 1997.- Vol. 24.- P. 121-130.

33. Cole S.T. Mycobacterium tuberculosis: drug-resistance mechanisms // Trends Microbiol.- 1994.- Vol. 2.- P. 411-415.

34. Dale J.W. Mobile genetic elements in mycobacteria // Eur. Respir. J. Suppl.-1995.- Vol. 20.-P. 633-648.

35. Dahle U.R., Sandven P., Heldal E., and Caugant D.A. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis in Norway // J. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol. 39.- P. 1802-1807.

36. Dale J., Nor R., Ramayah S. et al. Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia// J. Clin. Microbiol.- 1999.- Vol. 153.- P. 1265-1268.

37. Davis J. Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes // Science.- 1994.- Vol. 264.- P. 375-382.

38. De Viedma G.D. Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: review discussing molecular approaches // Clin. Microbiol. Infect. -2003.- Vol. 9.- P. 349-359.

39. Demple В., Halbrook J. Inducible repair of oxidative DNA damage in Escherichia coli II Nature. 1983.- Vol. 304.- P. 466.

40. Dessen A., Quemard A., Blanchard J.S., Jacobs W.R. Jr, Sacchettini J.C. Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacterium tuberculosis II Science. 1995.- Vol. 267.- P. 1638-1641.

41. Dooley S.W., Jarvis W.R., Martone W.J., Snyder D.E. Jr. Multi-drug resistant tuberculosis editorial. // Ann. Intern. Med.- 1992. Vol. 117.- P. 257-258.

42. Drake J.W. The distribution of rates of spontaneous mutation over viruses, prokaryotes, and eukaryotes // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1999. Vol. 870. - P. 100-107.

43. Driscoll J.R., Bifani P.J., Mathema В., McGarry M.A., Zickas G.M., Kreiswirth B.N., and Taber H.W. Spoligologos: a bioinformatic approach to displaying and analyzing Mycobacterium tuberculosis data // Emerg. Infect. Dis.- 2002. Vol. 8.- P. 1306-1309.

44. Drobniewski F.A. and Balabanova Y.M. The diagnosis and management of multiple drug resistant tuberculosis at the beginning of the new millenium // Int. J. Infect. Dis.- 2002. Vol. 6. - P. 21-31.

45. Drobniewski F.A., Caws M., Gibson A., and Yong D. Modern laboratory diagnosis of tuberculosis // Lancet 2003. - Vol. 3.- P. 141-147.

46. Dye C. Tuberculosis 2000-2010: control, but not elimination // Int. J. Tuberc. Dis.- 2000.-Vol. 4.-P. 146-152.

47. East African/ British Medical Research Councils. Controlled trial of five short course regimens of chemotherapy regimens for pulmonary tuberculosis // Am. Rev. Respir. Dis.- 1981. Vol. 123. - P. 165-170.

48. Fluit A.D., Visser M.R., and Schmitz F.J. Molecular detection of antimicrobial resistance // Clin. Microbiol. Rev.- 2001. Vol. 14. - P .836-871.

49. Filiol I., Driscoll J.R., van Soolingen D., Kreiswirth B.N., Kremer K., Valetudie G. et al. Global distribution of Mycobacterium tuberculosis spoligotypes // Emerg. Infect. Dis.- 2002 Vol. 8. - P. 1347-1350.

50. Frothingam R., and Meeker-O'Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem repeals // Microbiol. 1998.- Vol. 144.- P. 1189-1196.

51. Garg S.K., Tiwary R.P., Singh R., Malhotra D., Ramnani V.K., Prasad G.B., Chandra R. et al. Diagnosis of tuberculosis: available technologies, limitations, possibilities // J. Clin.Lab. Anal. 2003. - Vol. 17.- P. 155-163.

52. Gay J.D., Young D.R., Roberts G.D. In vitro activities of norfloxacin and ciprofloxacin against Mycobacterium tuberculosis,M. avium complex, M. chelonei, M. fortuitre, and M. kansasii II Antimicrob. Agents Chemother. -1984.-Vol. 26.-P. 94-96.

53. Gillespie S.H. Evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: Clinical and Molecular Perspective // Antimicrob. Agents and Chemother. -2002.- Vol. 46.- № 2.- P. 267-274.

54. Glynn J.R., Whiteley J., Bifani P.J., Kremer K. and Van Soolingen D. Worldwide Occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review // Emerg. Infect. Dis.- 2002. Vol. 8. - P. 843-849.

55. Grange J.M. Drug-resistance and tuberculosis elimination // Bulletin Intern. Union Against Tuberc. And Lung Dis.- 1990. Vol. 65.- P. 57.

56. Heep M., Rieger U., Beck D., Lehn N. Mutations in the beginning of the rpoB gene can induce resistance to rifamycins in both Helicobacter pylory and Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother.- 2000.- Vol. 44.- P. 1075-1077.

57. Heifets L.B., Lindohlm-Levy P.J. Pyrazinamide sterilizing activity in vitro against semidormant Mycobacterium tuberculosis populations// American Rev. of Resp. Dis.- 1992.-Vol. 145.- P. 1223-1225.

58. Heym В., Zhang Y., Poulet S., Young D., and Cole S.T. Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the isoniazid susceptibility of Mycobacterium tuberculosis II J. Bacteriol.-1993.- Vol. 175.-P. 4255-4259.

59. Неуш В., Honore N., Truffot-Pernot C., Banerjee A., Schurra C., Jacobs W.R. Jr. Et al. Implications of multidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis: a molecular study // Lancet.- 1994.- Vol. 344.- P. 293-298.

60. Heym В., Saint-Joanis В., and Cole S.T. The molecular basis of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis II Tuberc. Lung Dis.- 1999.- Vol. 79.-P. 267-271.

61. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., Van Agterveld M., Van Soolingen D. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol.- 1997,- Vol. 35.- P. 907-914.

62. Karunakaran P., and Davies J. Genetic antagonism and hypermutability in Mycobacterium smegmatis // J. Bacteriol.- 2000.- Vol.182.- P.3331-3335.

63. Kirchausen Т., Wang J.C., Harrison S.C. DNA gyrase and its complexes with DNA: direct observation by electron microscopy // Cell.- 1985.- Vol. 41.- P. 933-943.

64. Konno K., Nagayama H., Oka S. Nicotinamidase in mycobacteria: a method for distinguishing bovine type tubercle bacilli from other mycobacteria // Nature.-1959.-Vol. 184.-P. 1743-4.

65. Konno K., Feldman F.M., McDermot W., Pyrazinamide susceptibility and amidase activity of tubercle bacilli // Am. Rev. Resp. Dis.- 1967.- Vol. 95.- P. 461-467.

66. Koshi A., Vareldzis В., Styblo K. Multi-drug resistant tuberculosis and control // Res. Microbiol.- 1993.- Vol. 144.- P. 104-110.

67. Kruuner A., Hoffner S.E., Sillastu H., Danilovits M., Levina K., Svenson S.B. et al. Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia // J. Clin, Microbiol.- 2001.- Vol. 39.- P. 339-345.

68. Maggliozzo R.S., Marcinkeviciene J.A. Evidence for isoniazid oxidation by oxypressors mycobacterial catalase-oxidase // J. Am. Chem. Society.- 1996.-Vol. 118.- P. 1303-4.

69. Levin M.E., Hatfull G.F. Mycobacterium smegmatis RNA polymerase: DNA supercoling, action of rifampin and mechanism of rifampin resistance // Mol. Microbiol.- 1993.- Vol. 8.- P. 277-285.

70. Lipsitch M., and Levin B.R. Population dynamics of tuberculosis treatment: Mathematical models of the roles of non-compliance and bacterial heterogenety in the evolution of drug resistance // Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1998.- Vol. 2.- P. 187-199.

71. Masur H. Recommendations on prophylaxis and therapy for disseminated Mycobacterium avium complex disease in patients infected with HIV virus // N. Engl. J. Med.- 1993.- Vol. 329.- P. 828-833.

72. Middlebrook G. Isoniazid-resistance and catalase activity of tubercle bacilli. // Am. Rev.Tuberc.- 1954.- Vol. 69.- P. 471-472.

73. Mitchison D. The segregation of streptomycin resistant variants of Mycobacterium tuberculosis into groups with characteristic resistance // J. Gen. Microbiol.- 1951.- Vol. 5.- P. 596-604.

74. Mitchison D.A. Mechanism of drug action in short action in short course chemotherapy // Bulletin International Union Against Tuberculosis.- 1985.-Vol. 65.- P. 30-37.

75. Mitchison D.A. The action of antituberculosis drugs in short-course chemotherapy//Tubercle.- 1985.- Vol. 66.- P. 219-225.

76. Mokrousov I., Narvskaya O., Otten Т., Vyazovaya A., Limeschenko E., Steklova L., Vyshnevskyi B. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia // Res. Microbiol.- 2002.- Vol. 153.- P. 629-637.

77. Morris S.L., Bai G.H., Suffys P., Portillo-Gomez L., Fairchok M., Rouse D. Molecular mechanisms of multidrug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis H J. Infect. Dis.- 1995.- Vol. 171.- P. 954-960.

78. Moss A.R., Alland D., Telzak E., Hewlett D.Jr., Sharp V., Chiliade P., La Bombardi V. et al. A city-wide outbreak of a multiple-drug resistant strain of Mycobacterium tuberculosis in New York // Int. J. Tuberc. Lung. Dis.- Vol. 1.-P. 115-121.

79. Musser J.M. Antimicrobial agents resistance in Mycobacterium: molecular generic insignts // Clin. Microbiol. Rev. 1995.- Vol. 8. - P. 496-514.

80. Nash KA, Gaytan A, Inderlied C.B. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by use of a rapid, and specific RNA/RNA mistmatch assay//J Infect Dis.-1997.-Vol. 176.- P. 533-536.

81. Park Y-K., Bai G-H., and Kin S-J. Restriction fragment length polymorphism analysis of Mycobacterium tuberculosis isolated from countries in the Western Pacific region // J. Clin. Microbiol.- 2000.- Vol.38.- P. 191-197.

82. Perelman M.I. Tuberculosis in Russia // Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 2000.-Vol.4.-P. 1097-1103.

83. Pfyffer G.E., Strassle A., van Gorcum Т., Portaels F., Rigouts L., Mathieu C., Mirzoyev F., Traore H., and van Embden J.D.A. Multidrug-resistant tuberculosis in prison inmates, Azerbaijan // Emerg. Infect. Dis.- 2001.- Vol. 7.-P. 855-861.

84. Pyle M.M. Relative numbers of resistant tubercle bacilli in sputa of patients before and during treatment with streptomycin // Proc. Staff. Meet. Mayo. Clin.- 1947.- Vol. 22.- P. 465-473.

85. Qian L., Abe C., Lin T-P., Yu M-C., Cho S-N., Wang S., and Douglas J.T. RpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from East countries //J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol. 40.- P. 1091-1094.

86. Rattan A., Kalia A., and Ahmad N. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis', molecular perspectives // Emerg. Infec. Dis. 1998.- Vol. 4.- P. 195-209.

87. Ravins M., Bercovier H., Chemtob D., Fishman Y., and Rahav G. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis infection in Israel // J. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol. 39.- P. 1175-1177.

88. Rinder II., Dobner, P., Feldmann, K., Rifai, M., Bretzel, G., Rusch-Gerdes, S., and Loscher, T. Microb. Drug Resist.- 1997.- Vol. 3. P. 195-197.

89. Scorpio A., Zhang Y. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus // Nat. Med.- 1996.- Vol. 2.- P. 662-667.

90. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., and Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis II Bioinformatics.-2002.- Vol. 18.- P. 235-243.

91. Sherman D.R., Sabo P.J., Hickey M.J., Arain T.M., Mahairas G.G., Yuan Y. et al. Disparate responses to oxidative stress in saprophytic and pathogenic mycobacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- Vol. 92.- P. 6625-6629.

92. Sherman D.R„ Mdluli K., Hickey M.J., Arain T.M., Morris S.L., Barry S.E.III, Stover C.K. Compensatory ahpC gene expression in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis. II Science.- 1996.- Vol. 272.- P. 1641-1643.

93. Shilova M.V., Dye C. The resurgence of ТВ in Russia // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 2001.- Vol. 356.- P. 1069-75.

94. Shimao Т. Drug-resistance in tuberculosis control // Tubercle.- 1987.-Vol.68 (suppl.).- P. 5-15.

95. Shoeb H.A., Bowman B.U., Ottolenghi A.C., Merola A.J. Peroxidase-mediated oxidation of isoniazid // Antimicrob. Agenrs Chemother.- 1985,- Vol. 27.- P. 399-403.

96. Soini H., Xi Pan, Amin A., Graviss E.A., Siddiqui A., and Musser J.M. Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping // J. Clin. Microbiol.- 2000.- Vol. 38.- P. 669676.

97. Somoskovi A., Parsons L.M., and Salfinger M. The molecular basis of resistance to isoniazid, rifampin, and pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis И Respir. Res.- 2001.- Vol. 2.- P. 164-168.

98. Spratt B.G. Resistance to antibiotics mediated by target alterations // Science.- 1994.- Vol. 264.- P. 388-393.

99. Sreevatsan S., Pan X., Zhang Y., Kreisworth B.N., Musser J.M. Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of Mycobacterium tuberculosis complex organisms // Anyimicrob. Agents Chemother.- 1997.- Vol. 41.- P. 636640.

100. Sreevatsan S., Stockbauer K.E., Pan X, Kreisworth B.M., Moghazeh S.L., Jacobs W.R. Jr, et al. Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: critical role of embB mutations // Antimicrob. Agents Chemother.- 1997.- Vol. 41.- P. 1677-1681.

101. Takayama K., Armstrong E.L., Kunugi K.A., Kilburn J.O. Inhibition by ethambutol of mycolic acid transfer into the cell wall of Mycobacterium smegmatis И Antimicr. Agents Chemother.- 1979.- Vol. 16.- P. 240-242.

102. Takayama K., Kilburn J.O. Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis II Antimicr. Agents Chemother.-1989.-Vol. 33.-P. 1493-1499.

103. Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S., Colston M.J. et al. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis II Lancet.- 1993.- Vol. 341,- P. 647-650.

104. Telenti A, Imboden P, Marchesi F, Schmidheini T, and Bodmer Т., Detection of rifampin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. -1993. -Vol. 37 -P. 2054-2058.

105. Telenti A., Philipp W.J., Sreevatsan S., Bernasconi C., Stockbauer K.E., Weites B. et al. The emZ?operon, a gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol //Nat. Med.- 1997.- Vol. 3.- P. 567-570.

106. Thomas J.P., Baughan C.O., Wilkinson R.G., Stephard R.G. A new synthetic compound with anti-tuberculous activity in mice: ethambutol // Am. Rev. Respir. Dis.- 1961.- Vol. 83.- P. 891-893.

107. Van Embden J.D.A., Cave M.D., Crawford J.T., Dale J.W., Eiscnach K.D. et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recomendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol.- 1993.-Vol. 31.- P. 406-409.

108. Van Soolingen D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements // J. Intern. Med.- 2001.- Vol. 249.- P. 1-26.

109. Vareldzis B.P., Grosset J., De Kantor I., Crofton J, Laszlo A. et al. Drug-resistant tuberculosis: laboratory issues // Tubercle and Lung Dis.- 1994,- Vol. 75.- P. 1-7.

110. Victor Т. et al. Detection of mutations in drug resistance genes of Mycobacterium tuberculosis by dot-blot hybridization strategy // Tuber. Lung. Dis.- 1999. Vol. 79.- P. 343-348.

111. Watterson S.A., Wilson S.M., Yates M.D., Drobniewski F.A. // Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1998,- Vol. 36.- P. 1969-73.

112. Watterson S.A., Drobniewski F.A. Modern laboratory diagnosis of mycobacterial infections // J. Clin. Pathol.- 2000.- Vol. 53.- P. 727-732.

113. Williams D.L., Waguespack C., Eisenach K., Crawford J.T., Portaels M., Salfinger M. et al. Characterization of rifampicin-resistance in pathogenic mycobacteria // Antimicrob. Agents Chemother.- 1994.- Vol. 38.- P. 23802386.

114. Wilmont C.J.R., Critchlow S.E., Eperon I.C., Maxwell A. The complex of DNA gyrase and quinolone drugs with DNA forms a barrier to transcription by RNA polymerase // J. Mol. Biol.- 1994.- Vol. 242.- P. 351-363.

115. Winder F.G., and P.B. Collins. Inhibition by isoniazid of synthesis of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis II J. Gen. Microbiol.- 1970,- Vol. 63.-P. 41-48.

116. Winder F.G. Mode of action of the antimycobacterial agents and associated aspects of the molecular biology of the mycobacteria // -C. Ratledge and J. Stanford (ed.), The biology of the mycobacteria, Academic Press. 1982.- Vol. 1. -P. 353-438.

117. Woodley C.L., Kilburn J.O., David H.L., Silcox V.A. Susceptibility of mycobacterium to rifampin // Antimicrob. Agents Chemother.- 1972.- Vol. 2.-P. 245-249.

118. World Health Organization// International Union against tuberculosis. Antituberculosis drug resistance. Geneva: The organization; 2000.

119. World Health Organization report on ТВ epidemic. Global ТВ programme. Geneva: The organization.- 1997.

120. Yates M.D., Drobniewski F.A., Wilson S.M. Evalution of a rapid PCR-based epidemiological typing method for routine studies of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol. 40.- P. 712-714.

121. Youatt J. A review of the action of isoniazid // Am. Rev. Respir. Dis. -1969.- Vol .99.-P. 729-749.

122. Yuen L.K.W., Leslie D., and Coloe P.J. Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia// J. Clin. Microbiol.- 1999.- Vol. 37.- P. 3844-3850.

123. Zhang Y., Heym В., Allen В., Young D., and Cole S. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis II Nature.- 1992,- Vol. 358.- P. 591-593.

124. Zhang Y., Garbe Т., Young D. Transformation with katG restores isoniazid-sensitivity in Mycobacterium tuberculosis isolates resistant to a range of drug concentrations //Mol. Microbiol.- 1993.- Vol. 8,- P. 521-524.

125. Zhang Y., Telenti A. Genetics of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis II Molecular Genetics of Mycobacteria. Edited by Hatful GF, Jacobs WR Jr. Washington DC:ASM Press.- 2000.- P. 235-254.