Генетические механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium Tuberculosis

Липин, Михаил Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium Tuberculosis
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетические механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium Tuberculosis"

На правах рукописи

Липин Михаил Юрьевич

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МУСОБАСТЕМиМТиБЕКСиЬОЗШ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2004 г.

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии Государственный Научный Центр Прикладной Микробиологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат биологических наук Шемякин И.Г.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Пчелинцев С Ю. кандидат биологических наук Скотникова О.И.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт фтизио-пульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 27 мая 2004 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского

Автореферат разослан 20 апреля 2004 г.

Учбный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Комбарова С Ю.

Тираж 100 экз.

ВВЕДЕНИЕ

Распространение туберкулёза является одной из самых острых проблем здравоохранения как в экономически развитых, так и развивающихся странах. У одной трети населения Земли обнаруживаются признаки инфицированиям tuberculosis (Sreevatsan, 1997) ежегодно у 8 миллионов человек развивается активная форма туберкулёза, и почти 3 миллиона человек умирают от этой болезни (Блум, 2002). Особую опасность представляет повсеместное распространение возбудителя туберкулёза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), то есть устойчивого к изониазиду и рифампицину (Dye, 2002). Общепринятые методы определения лекарственной устойчивости (ЛУ) возбудителя: туберкулёза занимают от 3 до 12 недель (Nair, 1993), в течение которых больному не может быть обоснованно назначено адекватное лечение. В то же время устойчивость к основным противотуберкулёзным препаратам большинства клинических штаммов М. tuberculosis обусловлена мутациями в ДНК, выявить которые можно в течение нескольких часов (Viedma, 2003). Актуальность работы определяется исключительной важностью наличия данных о распространённости лекарственно-устойчивого туберкулёза и генетических механизмах лекарственной устойчивости A/, tuberculosis, а также методов быстрого выявления мутаций в ДНК микобактерий для разработки и реализации эффективных противотуберкулёзных программ.

Цель диссертационной работы - определение геномных мутаций у изониазид-, рифампицин-, пиразинамид- и стрептомицин- устойчивых клинических штаммов А/. tuberculosis и разработка метода быстрого выявления мутаций в ДНК Л/, tuberculosis.

1. Анализ распространённости лекарственно-устойчивого туберкулёза среди городского населения (Тула, Богородицк, Дзержинск, Павлово) и заключённых (Озерки).

2. Определение вклада мутаций в генах katG, rpoB, pncA, rpsL и 16SrRNA А/. tuberculosis в формирование лекарственно-устойчивого туберкулёза.

3. Разработка метода быстрого определения точечных мутаций в ДНК М. tuberculosis блокированием ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами (ПНК).

Задачи исследования:

мутаций в формирование лекарственно-устойчивого туберкулёза. Показано наличие общих механизмов устойчивости у 1,8% штаммов М tuberculosis к изониазиду и рифампицину. Разработан алгоритм фильтрации изображений секвенирования ДНК на рентгеновской плёнке. Выявлено отсутствие пониженной вирулентности у лекарственно-устойчивых клинических штаммов М. tuberculosis для мышей линии Balb/c. Разработан оригинальный метод быстрого выявления точечных мутаций в ДНКМ tuberculosis.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные о вкладе отдельных мутаций в формирование лекарственно-устойчивого туберкулёза необходимы для разработки и применения любых диагностических систем по определению мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у A/, tuberculosis. Выявление не описанных ранее мутаций в генах katG, rpoB, рпсА и штаммов с неспецифической множественной лекарственной устойчивостью дополняет известный набор механизмов возникновения лекарственной устойчивости у М tuberculosis. Разработанный метод фильтрации изображений может быть применён в системах обработки информации в разных областях науки и техники. Полученные данные о распространении лекарственно-устойчивого туберкулёза путём инфицирования людей штаммами М tuberculosis с ранее приобретённой лекарственной устойчивостью, а также о преимущественном приобретении множественной лекарственной устойчивости штаммами М. tuberculosis в процессе лечения могут служить основанием для* разработки более эффективной противотуберкулёзной программы. Разработанный метод выявления точечных мутаций в геноме М. tuberculosis посредством ПНК-блокирования ПЦР может применяться в клинической практике.

Положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что основным генетическим механизмом устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis в средней полосе России к изониазиду являются мутации в 315 кодоне гена katG (94,3±2,6%), к рифампицину - мутации в 516, 526 или 531 кодонах гена гроВ (86,7±3,8%), к стрептомицину - мутации в 43 кодоне гена rpsL (59±20%) или 516 нуклеотиде гена 16SrRNA (35±19%).

2. Разработанный метод фильтрации изображений повышает разрешающую способность ПЦР- секвенирования по Сэнгеру.

3. Разработанный метод блокирования ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами позволяет быстро выявлять мутации в ДНК Ы. tuberculosis.

Апробация работы произведена на 10" ежегодной конференции - Федерации Инфекционных Обществ (Кардиф, 19-21 ноября 2003 г.) и на научном семинаре отдела №38 ГНЦ ПМ 25 декабря 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, списка литературы из 187 наименований и двух приложений. Работа изложена на 141 странице, содержит 17 рисунков и 5 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы.

1.1. Культуральные и биохимические методы. В работе исследовано 947

клинических штаммов М tuberculosis, выделенных как от городского населения (651 - из Тульской области, 36 - из г. Павлово Нижегородской области, 38 - из г. Дзержинск Нижегородской области), так и от заключённых (124 - из тюрьмы г. Серпухов Московской области и 98 - от больных из тюрьмы п. Озерки Тульской области, которые до заключения проживали в г. Тула). Принадлежность микроорганизмов к видуМ tuberculosis определялась совместно с Коробовой О.В. культуральными (отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена при 22°С, отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена с салицилатом натрия) и биохимическими (ниациновый тест Кубика и Кильбурн в модификации Бараускене, наличие термолабильной каталазы) методами согласно приказу №558 МЗ СССР от 8 июня 1978 г. "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулёзе". Определение уровней устойчивости клинических штаммов М tuberculosis к стрептомицину (STR), изониазиду (INH), рифампицину (RIF), канамицину (KAN) и этамбутолу (ЕМВ) производилось совместно с Коробовой О.В. на среде Левенштейна-Йенсена методом абсолютных концентраций согласно приказу №558 МЗ СССР от 8 июня 1978 г.

1.2. ПЦР- секвенирование. ПЦР- секвенирование генов, обусловливающих устойчивость штаммов A/, tuberculosis к изониазиду - katG и inhA (регуляторная последовательность), рифампицину - гроВ, пиразинамиду -рпсА, стрептомицину - 16SrRNA и rpsL, канамицину - 16SrRNA производилось совместно с Онасенко А.Г. по методу Сэнгера (1977). Прочитанные нуклеотидные последовательности сравнивались с соответствующими генами пггамма H37Rv (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.3. Определение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis для

мышей линии Balb/c. Вирулентность 8 штаммов с ЛУ (6 из них - с МЛУ) и двух лекарстве!шо-ч)ъслБИтельнь1Х штаммов A/, tuberculosis изучалась на мышах линии Balb/c. Заражение мышей производилось совместно с Коробовой О.В. введением в хвостовую вену 0,2 мл суспензии A/, tuberculosis с концентрацией 5x107 КОЕ/мл. Микобактериальная культура перед заражением гомогенизировалась в физиологическом растворе с 0,01% Твин-80. Продолжительность опыта составляла 28 суток. Вирулентность штаммов оценивалась по обсеменённости лёгких и селезёнки каждого заражённого животного.

1.4. Методы теории вероятности. Статистическая значимость различия двух средних значений вычислялась с использованием t-критерия Стьюдента. Доверительный интервал с достоверностью 95% вычислялся на основании биномиального распределения.

2. Результаты.

2.1. Лекарственная устойчивость. Все 947 штаммов принадлежали виду А/. tuberculosis по данным культуральных и биохимических тестов. Устойчивость in vitro к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу штаммов А/. tuberculosis от больных из разных регионов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Лекарственная устойчивость штаммов A/, tuberculosis от больных из разных регионов

V Выборка лу\ п. Озерки, Тульская обл., заключенные, 11/200011/2001 г., 98 штаммов г.Тула, городское население, 06/2001 -06/2002 г., 265 штаммов г. Богородицк Тульская область, городское население 1998-2001 г., 67 штаммов г. Павлово, Нижегородская обл., городское население, 2001 г., 36 штаммов г. Дзержинск Нижегородская обл., городское население, 2001 г., 38 штаммов г.Тула, городское население, 19982001г., 146 ЛУ штаммов г. Серпухов, Московская обл., заклю-чгнные, 11/200012/2001 г., 124 ЛУ штамма

INH 69 (70±8%) 144<54±6%) 49 (73±10%) 25 (69±14%) 33 (87±9%) 141(97±3%) 106 (85±6%)

RIF 70 (71±8%) 145 (55±6%) 42 (63±11%) 18(50±15%) 33 (87±9%) 127 (87±5%) 102 (82±6%)

STR 83 (85±6%) 182(69±5%) 51 (76±9%) 29 (81±11%) 36 (95±7%) 142 (97±2%) 123 (99±1%)

ЕМВ 44 (43±9%) 91 (34±6%) 30(43±11%) 12 (33±14%) 5 (13±9%) 101 (69±7%) 79 (64±8%)

KAN 59 (60±9%) 108 (41 ±6%) 27(40±11%) 6(17±11%) 15 (39±14%) 104 (71±7%) 64 (52±8%)

МЛУ 64 (65±9%) 117 (44±6%) 39 (58±11%) 15 (42±15%) 30 (79±11%) 124 (85±5%) 95 (77±7%)

чувств ИТ. 11(11±6%) 65 (2!±í%) 13 (19±9%) 6(17±11%) 2 (5±5%) 0 0

2.1.1. Распространённость ЛУ туберкулёза среди городского населения (г. Тула, г. Богородицк, г. Павлово, г. Дзержинск). Частота встречаемости штаммов с МЛУ от больных из любого города составляет более 42%, а частота встречаемости штаммов, чувствительных

ко всем препаратам - менее 25% (см. табл. 1, рис. 1). Частота встречаемости INH-, RIF-, STR-устойчивых, а также МЛУ штаммов М. tuberculosis от больных из г. Дзержинск выше, чем из других городов (Р<О,ОЗ в любом случае). Частота встречаемости ЕМВ-устойчивых и чувствительных ко всем препаратам штаммов от больных из г. Дзержинск» напротив, меньше, чем из г. Павлове, г. Богородицк и г. Тула (Р от 0,0005 до 0,1). Частота встречаемости ШН-устойчивых штаммов от больных из г. Тула ниже, чем из г. Богородицк (Р=0,005) и г. Павлово (Р<0,09). Частота встречаемости KAN-устойчивых штаммов от больных из г. Павлово ниже, чем из г. Дзержинск (Р=0,03), г. Богородицк (Р=0,01) и г. Тула (Р=0,005). Частота встречаемости штаммов с МЛУ от больных из г. Богородицк выше, чем из г. Тула (Р<0,04) и г. Павлово (Р=0,1). Различия других показателей не являются значимыми (PXU).

2.1.2. Сравнениераспространённости ЛУтуберкулёза среди городского населения г. Тула и заключённых - бывших жителей г. Тула. Частота встречаемости штаммов М.

tuberculosis, устойчивых к любому препарату, от заключённых выше, чем соответствующая частота встречаемости штаммов от городских жителей: INH (70 ±8% против 54±6%, Р=0,005), RIF (71 ±8% против 55±6%, Р=0,004), STR (85±7% против 69±5%, Р=0,002), ЕМВ (45±9% против 34±6%, Р=0,06), KAN (60±9% против 41±6% Р<0,001), INH+RIF (65±9% против 44±6%, Р<0,001). Частота встречаемости штаммов М tuberculosis, чувствительных ко всем препаратам, от городских жителей больше, чем соответствующая частота встречаемости штаммов от заключённых (25±5% против 11±6%, Р=0,005) (рис. 2).

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Рис.

/ р

/ 1

/ /1 — __ — _. - — _. — L-

п городские жители

п заключенные

INII-уст. RIF-jct. STR-уст. EMB-jct. KAN-jct. INII+RIF Чувствит.

}ст. ко все м

2. Сравнение частот встречаемости ЛУ штаммов Л/, tuberculosis от городского населения и заключенных из г. Тулы

2.1.3. Лекарственная устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis от впервые выявленных больных в г. Тула, г. Богородицк и п. Озерки. Частота встречаемости STR-устойчивых штаммов от больных га г. Богородицк ниже, чем га г. Тула (33±22% против 63±17%, Р=0,09) и п. Озерки (33±22% против 60± 16%, Р=0,1). Частота встречаемости штаммов, чувствительных ко всем препаратам, от больных га г. Богородицк выше, чем га г. Тула (67±22% против 33±17%, Р=0,05) и п. Озерки (67±22% против 30±15%, Р=0,02) (рис. 3). Различия других показателей не являются значимыми (Р>0,16). Штаммы с МЯУ составляют в среднем 23±9%.

INH-уст. RIF-уст. STR-уст. ЕМВ-уст. KAN-уст. INH+RIF Чувствит.

уст. ко веем

Рис. 3. Частота встречаемости Л У штаммов Л/, tuberculosis от впервые выявленных больных Тульской области

2.1.4. Сравнение лекарственной чувствительности штаммов М. tuberculosis от впервые выявленных и хронических больных (г. Тула, г. Богородицк). Частота встречаемости штаммов, чувствительных к любому препарату, от впервые выявленных больных больше, чем соответствующая частота встречаемости штаммов от хронических больных [Р<0,05 В

любом случае) (рис. 4).

Рис. 4. Частота встречаемости лекарственно-чувствительных штаммов Л/, tuberculosis от впервые выявленных (1) и хронических (2) больных

Относительно небольшая частота встречаемости лекарственно-чувствительных штаммов от впервые выявленных больных туберкулёзом из г. Тула (33±17%) свидетельствует о преобладании в этом городе механизма распространения ЛУ туберкулёза посредством инфицирования людей штаммами A/, tuberculosis с ранее приобретённой ЛУ, а не в результате лечения. Большинство (67±22%) впервые выявленных больных из г. Богородицк, напротив, были инфицированы штаммами A/, tuberculosis, чувствительными ко всем препаратам, что указывает на преимущественное приобретение ЛУ штаммами А/. tuberculosis в этом городе в процессе лечения больных. Частота встречаемости штаммов, чувствительных к изониазиду и рифампицину, выделенных от впервые выявленных больных, значительно больше, чем соответствующая частота встречаемости штаммов от хронических больных как из г. Тула (79±14% против 13±6%, Р<0,001), так и из г. Богородицк (75±19% против 35± 13%, Р=0,01), что свидетельствует о преимущественном приобретении МЛУ штаммами М tuberculosis именно в результате лечения больных.

2.1.5. Приобретение дополнительной лекарственной устойчивости возбудителем туберкулёза в результате неудачного лечения больных. Изучены данные по лекарственной устойчивости 346 штаммов A/, tuberculosis, полученных от 173 больных (по 2 штамма от каждого больного с интервалом от 3 до 16 месяцев). У 47 пациентов как первичный, так и вторичный штамм имели устойчивость ко всем пяти препаратам. У 91 (72±7%) из 126 пациентов, первичные штаммы от которых имели устойчивость не более чем к четырём противотуберкулёзным препаратам, повторно выделенные штаммы приобрели дополнительную лекарственную устойчивость, по меньшей мере, к одному противотуберкулёзному

препарату (рис. 5). МЛУ была обнаружена у 33 (57±12%) из 58 вторичных штаммов от пациентов, первый штамм от которых не имел устойчивости к изониазиду или рифампицину. Наибольшая вероятность возникновения МЛУ выявлена у 18 (75±15%) из 24 клинических штаммов Л/, tuberculosis, ранее имевших ЛУ к двум противотуберкулёзным препаратам.

Рис. 5. Появление дополнительной ЛУ у клинических штаммов М. tuberculosis в результате неудачного лечения больных

2.2. ПЦР-секвенирование генов katG, inhA, rpoB, pncA, 16SrRNA и rpsL.

2.2.1. Фильтрация изображения данньх секвенирования. В тех случаях, когда

качество изображения на рентгеновской плёнке не позволяло однозначно различить фрагмент ДНК на фоне помех, плёнки сканировались при 600 dpi, 256 градаций яркости серого цвета. Оцифрованные данные подвергались одномерной линейной фильтрации. В процессе фильтрации изображение разлагалось на две составляющие - информационную и шумовую. В качестве информационной выбрана такая составляющая исходного сигнала, поведение которой в некоторой степени предсказуемо. Шумовая, то есть непредсказуемая, составляющая сигнала отбрасывалась. Фильтрация осуществлялась с помощью специально созданной в системе MATLAB (The MathWorks, Inc.) программы, реализующей рекурсивный цифровой фильтр размером 14 отсчётов, построенный на основе уравнения бегущей плоской электромагнитной волны. На рис. 6 приведены фрагменты оригинального и отфильтрованного изображения плёнки с данными секвенирования гена pncA.

Рис. 6. Фрагменты оригинального (слева) и отфильтрованного (справа) изображений плёнки с данными секвенирования генарпсА (CGCGGTACGCAATGGCTTGGC)

2.2.2. Гены katG (290-522 кодоны) и inhA (регуляторная последовательность с 1673291 по 1673497 нуклеотиды). Мутации в гене katG обнаружены у 251 (95,4±2,3%) из 263 INH-устойчивых штаммов М. tuberculosis от больных Тульской области и Серпуховского района Московской области (табл. 2).

Таблица 2

Мутации в katG гене 251 INH-устойчивых клинических штаммов М. tuberculosis

Набор мутаций Частота встречаемости, %

315AGC—>АСС (Ser-»Thr) 54,4±5,8%

315AGC->ACC (Ser-VThr) 463CGG->CTG (Arg-»Leu) 38,0*5,7%

463CGG->CTG (Arg->Leu) 1,1±1,1%

315AGC—»ACA (Ser->Thr) 0,8±0,8%

315AGC->AGA (Ser->Arg) 463CGG-+CTG (Arg-+Leu) 335ATC-+GTC (lie-» Val) 0,4% +0,6/-0,4%

315AGC->AGA (Scr->Arg) > 463CGG->CTG (Arg->Leu). 0,4% +0,6/-0,4%

315AGC-»AGA (Ser->Arg) 0,4% +0,6/-0,4%

Наиболее часто встречались одиночная 315АОС—>АСС (54,4±5,8%) и парная 315АСС—>АСС+4бЗССО—»СТО (38,0±5,7%)- мутации. В целом изменениям наиболее подвержены 315 (94,3±2,6%) и 463 (39,9±5,7%) кодоны гена katG.

Мутации в регуляторной последовательности гена inliA не были выявлены ни у одного (0+14%) из 20 INH-устойчивых штаммов М. tuberculosis от больных Серпуховского района Московской области, 10 из которых имели мутацию 315АСС, 3 - мутацию 463CTG, 6 - мутацию 315ACC+463CTG в гене katG, и один - фрагмент гена katG дикого типа.

2.2.3. Ген гроВ (472-585 кодоны). Мутации-в гене гроВ обнаружены у 251 (90,3±3,3%) из 278 RIF-устойчивых штаммов Л/, tuberculosis от больных Тульской области и Серпуховского района Московской области. Частоты встречаемости мутаций в кодонах 511533 гена гроВ представлены на рис. 7. Вне 511 - 533 кодонов с частотой встречаемости 0,36+0,54/-0,36% были обнаружены следующие мутации: 479ATG-»TTG (Met-»Leu), 535ССС-»СТС (Pro->Leu), 565GAG-+AGT (Glu->Ser), делеция 566AGGG (ÄLeu), 580CGG-»CAG (Arg->Gln). Изменениям наиболее подвержены 516 (36,0±5,4%), 526 (15,5±4,1%) и 531 (35,3±5,4%) кодоны, мутации в которых обнаружены у 241 (86,7±3,8%) из 278 RIF-устойчивых штаммов.

Рис. 7. Мутации в 511 - 533 кодонах гена гроВ 278 RIF-устойчивых штаммов М. tuberculosis. Над последовательностью дикого типа указаны делеции, под ней - точечные мутации. В каждом случае указана частота встречаемости мутации. Делеция CAT в кодонах 514-515 приводит к замене Phe-Met-»Leu

2.2.4. Ген рпсА (8-180 кодоны). Мутации в гене рпсА обнаружены в равных количествах (по 1,2+1,8/-1,2%) у 15 (18±8%) из 84 случайно выбранных штаммов от больных Тульской области и Серпуховского района Московской области, из них 14 (17±7%) -значимые: 22АСС-*АСТ (ТЬг-*П:1г), 630АС-»0АА (Авр-^Иу), 630АС-»ССС (А5р-*А1а),

85CTG—*CCG (Leu—Pro), 96AAG—AGG (Lys—Arg), 97GGT—AGT (Gly—Ser), 108GGA—СТА (Gly—Val), 132GGT—CGT (Gly—Arg), 134GCC—GTC (Ala—Val), 139GTG—GCG (Val—Ala), 164TCG—CCG (Ser—Pro), 175ATG—AGG (Met—Arg), 78ДО,

делеция с 87 по 148 кодоны и вставка 131GTC—GGTC.

2.2.5. Гены 16SrRNA (149-320кодоны) и rpsL (10-121 кодоны). Гены 16SrRNA и rpsL секвенированы у 17 STR-устойчивых клинических штаммов М. tuberculosis от больных Тульской области. В гене 16SrRNA обнаружена мутация в 516 нуклеотиде С—Ту 6 (35±19%) штаммов. В гене rpsL обнаружена мутация в 43 кодоне AAG—AGG (Lys-*Arg) у 10 (59±20%) штаммов. Одновременное наличие мутаций в обоих генах не выявлено ни у одного из 17 штаммов, причём вероятность такого случайного события составляет 0,0006. У одного (6+8/-6%) из 17 штаммов мутации в генах 16SrRNA и rpsL отсутствовали.

2.2.6. Ген 16SrKNA (423-51S кодоны). Мутации в гене 16SrRNA не выявлены ни у одного (0+24%) из 11 KAN-устойчивых штаммов М. tuberculosis от больных Тульской области.

2.3. Связь мутаций в генах katG и гроВ суровнялиустойчивости к изониазиду и рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis.

2.3.1. Связь мутаций в гене katG и уровня устойчивости к изониазиду. Высокий уровень устойчивости к изониазиду (25 мкг/мл) был определен у значительно меньшего относительного количества штаммов, имеющих парную мутацию в 315 и 463 ко донах по сравнению с относительным количеством штаммов, имеющих одиночную мутацию в 315 кодоне гена katG (4±3% против 40±8%, Р<10'4), либо вовсе не имеющих мутаций в гене katG (4±3% против 58±23%, Р<10'5) (рис. 8).

80% /

□ 1м кг/мл

§ 70% '

§ I 60% '

g Н 50% '" й

5 8 40% '

2 § 30%

П 5м к г/мл

■ 25мкг/мл

315 315 и 463 WT Положение мутаций в гене katG

Рис. 8. Относительное количество штаммов Л/, tuberculosis с разными уровнями устойчивости к изониазиду

2.3.2. Связь мутаций в гене гроВ и уровня устойчивости крифампицину. Высокий

уровень устойчивости к рифампицину (50 мкг/мл) был определен у меньшего относительного количества штаммов, имеющих мутацию в 516 кодоне гена гроВ по сравнению с относительным количеством штаммов, имеющих мутацию в 526 кодоне (86% против 98+2/-4%, Р=О,О35), либо в 531 кодоне гена гроВ (86±6% против 97±2%, Р=0,01), но всё же это количество оказалось большим, чем аналогичное количество штаммов с геном гроВ дикого типа (86±6% против 63±16%, Р=0,006).

2.4. Оценка количества штаммов М. tuberculosis с неспецифической МЛУ. Из 225 МЛУ штаммов с секвенированными генами katG и гроВ у 9 штаммов не выявлены мутации в katG гене, у 19 штаммов не выявлены мутаций в гроВ гене, и у 6 штаммов не выявлены мутации как в гроВ, так и в katG гене. Коэффициент корреляции отсутствия мутаций в обоих генах cov(x,y)/V(cov(x,x)*cov(y,y)) равен 0,43, что свидетельствует о наличии связи. Если предположить отсутствие корреляции между лекарственной устойчивостью штаммов к изониазиду и рифампицину, не обусловленной мутациями в генах katG и гроВ, то вероятность отсутствия мутаций в обоих генах у к штаммов была бы

где п - общее количество МЛУ штаммов, а - количество штаммов, не имеющих мутаций в гене гроВ, Ь - количество штаммов, не имеющих мутаций в гене katG, С\ - биномиальные коэффициенты. Наибольшая вероятность отсутствия мутаций в обоих указанных генах была бы при к=0, то есть ни у одного штамма, а вероятность случайного появления более двух таких штаммов равна 0,03. Следовательно, у 6 минус 2, то есть у 4 (1,8%, Р=0,03) из 225 штаммов М tuberculosis возникновение МЛУ связано с наличием общих механизмов противодействия обоим лекарственным препаратам.

2.5. Связь лекарственной устойчивости с вирулентностью. По уровню вирулентности для мышей штаммы распределились на три группы. Первая группа включала наименее вирулентные клинические штаммы: H37Rv, 1462, 1481, 155/6, 1626 и 1397 с показателем обсемененности лёгких заражённых животных (^(КОБ/мл)) от 5,6 до 6,6 (таблица 3). Вторая группа включала штамм 1486 с показателем обсемененности лёгких 7,1. В третью группу вошли наиболее вирулентные штаммы с показателем обсемененности лёгких мышей, заражённых этими культурами, от 7,7 до 8,2:1402,1544,1643 и 1540. В этой группе наряду с ЛУ оказались и лекарственно-чувствительные штаммы. Уровень смертности среди мышей, инфицированных штаммом 1540, составлял 50±31%. Какой-либо связи между вирулентностью для мышей с диагнозом пациента - источника микобактериальной культуры, лекарственной устойчивостью, либо мутациями в генах katG и гроВ у 10 клинических штаммов A/, tuberculosis выявлено не было.

Таблица 3

Вирулентность клшшческих штаммов A/, tuberculosis_

Штамм Диагноз больного -источника штамма Лекарственная устойчивость Мутации в гене гроВ Мутации в гене katG Обсеме-нСнность лёгких, lpfKOEl Обсеме-нёносгь селезёнки, lpfKOEl Падёж мышей

H37Rv . чувствителен - 5,6±0,5 5,4±0,4 0/6

1462 Фибр.-каверн. STR, INH, RIF 531TTG 463CTG 5,9±0,2 5,310,1 0/6

1481 Инфильтр. STR, INH, RIF, KAN, ЕМВ 516GTC 315АСС 6,0±0,1 5,0±0,3 0/6

155/6 Инфильтр. STR, RIF 531TTG - 6,1 ±0,2 5,2±0,1 0/6

1626 Фибр.-каверн. STR - - 6,3±0,3 5,2±0,3 0/6

1397 Диссеминир. STR, INII, RIF, KAN, ЕМВ 516GTC 315АСС 6,6±0Д 5,6±0Д 0/6

1486 Инфильтр. STR, INH, RIF, KAN 526CGC 315АСС 7,1±0,1 5,9±0,1 0/6

1402 Диссеминир. STR, ШН 315АСС 7,7±0,2 6,8±0,2 0/6

1544 Инфильтр. чувствителен 7,9±0,2 6,5±0,3 0/6

1643 Инфильтр. чувствителен 8,0±0,1 6,7±0,2 0/6

1540 Фибр.-каверн. STR, INH, RIF, KAN, ЕМВ 531TTG 315АСС 463CTG 8,2±0Д 6,6±0,3 3/6

2.6. Разработка метода определения мутаций в 463 кодоне гена katG ПНК-блокированием ПЦР.

Была выбрана следующая последовательность ПНК, соответствующая участку ДНК, включающему 463 кодон гена katG дикого типа Л/, tuberculosis: CTACGGGCCTAGACCG (подчёркнут триплет, соответствующий 463 кодону). Образец ПНК предоставлен Гаврюшкиным А.В. На основании данных по температурам плавления комплекса ПНК/ДНК (70°С; рассчитана согласно Thiede, 1996) и комплексов ДНК с прямыми и обратными праймерами генов katG и гроВ были выбраны следующие температурно-временные параметры проведения ПЦР: 1 цикл 94°С/3 мин.; 28 циклов 70°С/30 сек., 63°С/30 сек., 72°С/40 сек., 94°С/50 сек.; 1 цикл 94Т/1 мин., 63°С/30 сек., 72°С/10 мин., охлаждение до 10°С. Состав буфера для ПЦР был следующим (на 25 мкл реакционной смеси): 12 мкл воды, 2 мкл глицерина, 2,5 мкл dNTP (1,5 mM), 2,5 мкл 10х PCR буфера, по 1 мкл прямого (CTCCGCTGGAGCAGATGGGC) и обратного (TCTTCCAGGGTGCGAATGACCT) праймеров для секвенирования гена katG (10 пмоль/мкл), по 1 мкл прямого (GTCGGCGAGCTGATCCAAAAC) и обратного (GGTACGGCGTITCGATGAACC) праймеров для секвенирования гена гроВ (10 пмоль/мкл), 1 мкл ПНК (1 мг/мл), 1 мкл ДНК (5 нг/мкл), 0,25 мкл Taq-полимеразы (5 ед. активности/мкл).

Добавление глицерина в реакционную смесь приводит к более полной денатурации относительно богатой гуанином и цитозином ДНК Л/, tuberculosis, а также понижает давление паров воды над реакционной смесью, уменьшая скорость её испарения, что снижает колебания концентраций компонентов в процессе ПЦР. В случае отсутствия блокирования ПЦР в реакционной смеси должны обнаруживаться как фрагменты гена гроВ (379 п.н.о), так и фрагменты гена katG (697 п.н.о.). В случае же блокирования ПНК амплификации фрагмента гена katG на электрофорезном агарозном геле должен обнаруживаться только фрагмент гена гроВ.

Исследовано 20 клинических штаммов М. tuberculosis, не имеющих мутации в гене katG и 20 - с мутациями в 463 кодоне гена katG (по данным ПЦР- секвенирования). Фрагмент гена katG обнаруживался в ПЦР- смеси, содержавшей образцы ДНК любого из 20 клинических штаммов, имевших мутации в 463 кодоне, и не обнаруживался при исследовании образцов ДНК штаммов, не имевших мутации в 463 кодоне (рис. 9).

Рис. 9. Фотография (негатив) фрагмента 1% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР, окрашенные бромистым этидием. ПНК соответствует участку гена кШО, включающему 463 кодон.

Выводы.

1. Частота встречаемости клинических штаммов Ы. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в средней полосе России составляет более 41,6%, а лекарственно-чувствительных штаммов - менее 24,5%. Частота встречаемости клинических штаммов М. tuberculosis с первичной множественной лекарственной устойчивостью составляет 22,7%.

2. Мутации в 315 кодоне гена JcatG (94,3%) являются основным генетическим механизмом устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду.

3. Мутации в 516 (36,0%), 526 (15,5%) или 531 (35,3%) кодонах гена гроВ являются. основным генетическим механизмом устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к рифампицину.

4. Установлено наличие значимых мутаций в гене рпсА у 16,7% клинических штаммов М tuberculosis.

5. Мутации в 43 кодоне гена rpsL (58,8%) или в 516 нуклеотиде гена 16SrRNA (35,3%) являются основным генетическим механизмом устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к стрептомицину.

6. Выявлены новые мутации в генах katG (335GTC), гроВ (479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516ТТС, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG) ирпсА (22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132CGT, 164CCG, 175AGG, 78ДО, делеция с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC).

7. Разработан новый метод быстрого определения мутаций в ДНК М. tuberculosis блокированием ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Иванов И.Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое титрование методом RFLP-IS6110 клинических штаммов A/, tuberculosis, выделенных от больных заключённых // Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. - Москва. - 2003. - С. 109-110.

2. Иванов И.Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое типирование методом RFLP-IS6110 клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом в Центральном Регионе России // Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. - Москва. - 2003. - С. 109.

3. Липин М.Ю., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Лекарственная устойчивость штаммов A/, tuberculosis, выделенных от заключённых и от городского населения // Туберкулёз сегодня. Материалы W Российского съезда фтизиатров. - Москва. -2003. - С. 87.

4. Липин М.Ю., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В., Онасенко А.Г. Частота встречаемости мутаций в генах rpoB, katG и рпсА клинических штаммов А/. tuberculosis II Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. - Москва. -2003.. С. 111.

5. Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Сполиготипы клинических штаммов A/, tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом Центрального Региона России // Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. -Москва.-2003.-С. 115.

6. Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Иванов И.Ю., Шемякин И.Г., Ильина Е.А Характеристика клинических штаммов A/, tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом в Нижегородской области // Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. - Москва. - 2003. - С. 114-115.

7. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Коробова О.В., Анисимова В.А. Характеристика клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2003. - № 1. - С. 32-40.

8. Шемякин КГ., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Анисимова В.А., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Лазарев А.А., Скалдина А.И., Чернавская Л.А., Тарасова Т.И. Генетическое типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis методами сполиготипирования и геномной дактилоскопии // Журнал микробиологии, эпидемиологиии и иммунобиологии.- 2002. - № 6. - С. 30-35.

9. Shemyakin I.G., Lipin M.Y., Stepanshina V.N., Korobova O.V. Prevalence of drug resistant tuberculosis in Tula (Russia) // 10th Anniversary Conference ofthe Federation of Infection Societies. Abstract book. - Cardiff. - 2003. - P. 24.

10. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Korobova O.V., Lipin M.Y., Ivanov I.Y. Investigation of drug-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis derived from ТВ prisoners // 23 rd Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Abstract Book. -Dubrovnik. - 2002. - P. 73.

р-7340

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Липин, Михаил Юрьевич

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология лекарственно-устойчивого туберкулёза в России и за рубежом.

1.2. Методы видовой идентификации М. tuberculosis.

1.3. Противотуберкулёзные средства.

1.4. Фенотипические методы определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis.

1.5. Генотипические методы определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Источники клинических штаммов М. tuberculosis.

2.2. Определение видовой принадлежности микроорганизмов.

2.2.1. Рост на среде с салицилатом натрия.

2.2.2. Тест на наличие термолабильной каталазы.

2.2.3. Ниациновый тест.

2.3. Определение лекарственной устойчивости in vitro.

2.4. Определение вирулентности штаммов М. tuberculosis для мышей.

2.5. ПЦР- секвенирование генов katG, inhA, rpoB, pncA,16SrRNA и rpsL.

2.6. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Характеристика пациентов - источников микобакгериальных культур.

3.2. Видовая принадлежность микобактериальных культур.

3.3. Лекарственная устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis.

3.3.1. Распространённость лекарственно-устойчивого туберкулёза среди городского населения (г. Тула, г. Богородицк, г. Павлово, г. Дзержинск).

3.3.2. Сравнение распространённости лекарственно-устойчивого туберкулёза среди городского населения г. Тула и заключённых - бывших жителей г. Тула.

3.3.3. Лекарственная устойчивость штаммов М. tuberculosis от впервые выявленных больных в г. Тула, г. Богородицк и п. Озерки.

3.3.4. Сравнение лекарственной чувствительности штаммов М. tuberculosis от впервые выявленных и хронических больных (г. Тула, г. Богородицк).

3.3.5. Приобретение дополнительной лекарственной устойчивости возбудителем туберкулёза в результате лечения больных.

3.4. ПЦР-секвенирование генов katG, inhA, rpoB, рпсА, 16SrRNA и rpsL.

3.4.1. Фильтрация изображения данных секвенирования.

3.4.2. Секвенирование генов katG и inhA.

3.4.3. Секвенирование гена гроВ.

3.4.4. Секвенирование гена рпсА.

3.4.5. Секвенирование генов 16SrRNA (149-320 кодоны) и rpsL.

3.4.6. Секвенирование гена 16SrRNA (423-515 кодоны).

3.5. Связь мутаций с уровнями лекарственной устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis.

3.6. Оценка количества штаммов М. tuberculosis с неспецифической МЛУ.

3.7. Связь лекарственной устойчивости клинических штаммов

М. tuberculosis с вирулентностью для мышей линии Balb/c.

3.8. Разработка метода определения мутаций в ДНК М. tuberculosis блокированием ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Характеристика пациентов - источников микобактериальных культур.

4.2. Лекарственная устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis.

4.3. Генетические механизмы устойчивости М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину, пиразинамиду, стрептомицину и канамицину.

4.4. Связь лекарственной устойчивости с вирулентностью клинических штаммов М. tuberculosis.

4.5. Метод определения мутаций в геномной ДНК М. tuberculosis блокированием ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами.

4.6. Метод фильтрации изображения данных секвенирования.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium Tuberculosis"

Особую опасность представляет повсеместное распространение лекарственно-устойчивого (ЛУ) туберкулёза. Возникновение лекарственно-устойчивого туберкулёза является одновременно причиной и следствием неэффективного лечения больных [105]. Эффективность лечения больных туберкулёзом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) не превышает 50% [34], а стоимость - почти на два порядка выше стоимости лечения лекарственно-чувствительного туберкулёза. В экономически развитых странах распространение лекарственно-устойчивого туберкулёза достаточно эффективно сдерживается продуманными противотуберкулёзными мерами. Например, в Японии заболеваемость туберкулёзом с множественной лекарственной устойчивостью составляет 0,8% [123]. Основную угрозу для развитых стран представляет иммиграция больных туберкулёзом из развивающихся стран [104, 129] и широкое распространение ВИЧ [47, 1111. Напротив, в социально неблагополучных странах наблюдается тенденция вытеснения штаммов лекарственно чувствительного туберкулёза штаммами лекарственно-устойчивого туберкулёза. Например, распространённость туберкулёза с множественной лекарственной устойчивостью в Непале составляет 48%, а в Гуджарате (Индия) - 33,8% [157]. Такая тенденция обусловлена наличием в социально неблагополучных странах следующих факторов:

1) лечение больных ограниченным количеством противотуберкулёзных препаратов (так, например, назначение только одного препарата при лечении впервые выявленных больных [157]);

2) назначение противотуберкулёзных препаратов без учёта лекарственной устойчивости штаммов, что допускается даже в программе DOTS для впервые выявленных больных, если отсутствуют данные по лекарственной чувствительности штаммов [78];

3) отсутствие контроля со стороны лечащего персонала за приёмом препаратов пациентами, что часто приводит к досрочному прекращению курса лечения, а также широко практикующееся самолечение [61];

4) недостаточное материально-техническое обеспечение клинических лабораторий, что затрудняет не только определение лекарственной устойчивости штаммов, но и раннюю постановку диагноза [31,60];

5) недостаточное финансирование закупки дорогих и эффективных противотуберкулёзных препаратов;

6) наличие огромной системы исправительных учреждений, заболеваемость в которых зачастую в 10 - 50 раз превышает среднестатистическую, и которые служат резервуаром туберкулёзной инфекции для всего населения [31];

7) отсутствие в некоторых странах эффективной и разумной единой противотуберкулёзной стратегии в системе здравоохранения [104], что делает борьбу с туберкулёзом неэффективной даже при наличии достаточного финансирования.

8) низкий жизненный уровень населения, и, как следствие, пониженный иммунитет к туберкулёзной инфекции, что сильно облегчает селекцию и распространение лекарственно-устойчивых штаммов [31].

9) применение некачественного рифампицина с низкой биологической доступностью, произведённою в развивающихся странах [117].

10) система льгот пациентам, получившим инвалидность по туберкулёзу, не связанная с соблюдением предписаний врачей, что часто приводит к прекращению лечения сразу же после подтверждения группы инвалидности [17].

В случае с лечением туберкулёза лучше не делать ничего, чем где-то допустить небрежность, поскольку результатами просчётов в лечении являются не только невылеченные больные с интоксикациями от противотуберкулёзных средств и потраченные впустую средства налогоплательщиков, но и появление штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью [143].

Общепринятые к настоящему времени методы определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis включают процедуры выделения штаммов и выращивания их на среде, содержащей противотуберкулёзное средство, и занимают от 3 до 12 недель [127], в течение которых больному не может быть назначен обоснованный режим химиотерапии. В то же время устойчивость к основным противотуберкулёзным препаратам большинства клинических штаммов М. tuberculosis обусловлена мутациями в ДНК, выявить которые можно в течение нескольких часов.

Распространённость лекарственно-устойчивого туберкулёза имеет свои региональные особенности. Несмотря на то, что к настоящему времени в литературе имеются многочисленные данные по вкладу различных мутаций в формирование лекарственно-устойчивого туберкулёза за рубежом, аналогичных данных по регионам России нет. А такие данные важны не только для выяснения молекулярных механизмов устойчивости микобакгерий к противотуберкулёзным препаратам, но и для разработки диагностических тестов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), способных выявлять точечные мутации в геномной ДНК микобактерий, выделенных непосредственно из мокроты больных.

Актуальность. Актуальность работы определяется исключительной важностью наличия данных о распространённости лекарственно-устойчивого туберкулёза и генетических механизмах лекарственной устойчивости М. tuberculosis, а также методов быстрого выявления мутаций в ДНК микобактерий для разработки и реализации эффективных противотуберкулёзных программ.

Цель диссертационной работы - определение геномных мутаций у изониазид-, рифампицин-, пиразинамид- и стрептомицин- устойчивых клинических штаммов М. tuberculosis и разработка метода быстрого выявления мутаций в ДНК М. tuberculosis.

Задачи исследования:

2. Определение вклада мутаций в генах katG, rpoB, рпсА, rpsL и 16SrRNA М: tuberculosis в формирование лекарственно-устойчивого туберкулёза.

Научная новизна результатов. Выявлена высокая распространённость лекарственно-устойчивого возбудителя туберкулёза среди больных туберкулёзом лёгких средней полосы России: количество клинических штаммов М: tuberculosis, чувствительных ко всем препаратам, составляет менее 25±5%, а количество штаммов с множественной лекарственной устойчивостью - от 42±15% до 79±11%. Выявлены не описанные ранее мутации в генах katG, rpoB и рпсА М. tuberculosis. Получены данные о вкладе отдельных мутаций в формирование лекарственноустойчивого туберкулёза. Показано наличие общих механизмов устойчивости у 1,8% штаммов М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину. Разработан алгоритм фильтрации изображений секвенирования ДНК на рентгеновской плёнке. Выявлено отсутствие пониженной вирулентности у лекарственно-устойчивых клинических штаммов М. tuberculosis для мышей линии Ва!Ь/с. Разработан оригинальный метод быстрого выявления точечных мутаций в ДНК М. tuberculosis.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные о вкладе отдельных мутаций в формирование лекарственно-устойчивого туберкулёза необходимы для разработки и применения любых диагностических систем по определению мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у М. tuberculosis. Выявление не описанных ранее мутаций в генах katG, гроВ и рпсА и штаммов с неспецифической множественной лекарственной устойчивостью дополняет известный набор механизмов возникновения лекарственной устойчивости у М. tuberculosis. Разработанный метод фильтрации изображений может быть применён в системах обработки информации в разных областях науки и техники. Полученные данные о распространении лекарственно-устойчивого туберкулёза путём инфицирования людей штаммами М. tuberculosis с ранее приобретённой лекарственной устойчивостью, а также о преимущественном приобретении множественной лекарственной устойчивости штаммами М. tuberculosis в процессе лечения могут служить основанием для разработки более эффективной противотуберкулёзной программы. Разработанный метод выявления точечных мутаций в геноме М. tuberculosis посредством ПНК-блокирования ПЦР может применяться в клинической практике.

Положения, выносимые на защиту.

3. Разработанный метод блокирования ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами позволяет быстро выявлять мутации в ДНК М. tuberculosis.

Аннотация диссертационной работы по главам.

В первой главе представлен литературный обзор по эпидемиологии лекарственно-устойчивого туберкулёза, противотуберкулёзным средствам, механизмам лекарственной устойчивости М. tuberculosis, влиянию на вирулентность приобретённых механизмов устойчивости к противотуберкулёзным средствам и методам определения лекарственной устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis.

Во второй главе описаны использованные в работе материалы (клинические штаммы М. tuberculosis) и методы исследований (видовая идентификация микобактерий, определение уровней лекарственной устойчивости, ПЦР-секвенирование генов katG, inhA, гроВ, рпсА, 16SrRNA и rpsL, определение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis для мышей линии Balb/c, а также методы теории вероятности).

В третьей главе приведены результаты исследования:

1. Обобщённые данные по определению лекарственной устойчивости 947 клинических штаммов от больных из разных регионов, а также распространённость лекарственно-устойчивого туберкулёза среди городского населения (г. Тула, г. Богородицк, г. Павлово, г. Дзержинск), сравнение распространённости лекарственно-устойчивого туберкулёза среди городского и тюремного населения (г. Тула), лекарственной устойчивости штаммов М. tuberculosis от впервые выявленных больных (г. Тула, г. Богородицк, п. Озерки), сравнение лекарственной чувствительности штаммов М. tuberculosis от впервые выявленных и хронических больных (г. Тула, г. Богородицк), приобретение дополнительной лекарственной устойчивости возбудителем туберкулёза в результате лечения больных.

2. Данные ПЦР-секвенирования генов katG, inhA, rpoB, рпсА, 16SrRNA и rpsL, а также разработка метода фильтрации изображений данных секвенирования на рентгеновской плёнке.

3. Связь мутаций в генах katG и гроВ с уровнями устойчивости к изониазиду и рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis.

4. Оценка количества штаммов М. tuberculosis с неспецифической множественной лекарственной устойчивостью.

5. Связь лекарственной устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis с вирулентностью для мышей линии Balb/c.

6. Разработка метода определения мутаций в ДНК М. tuberculosis ПНК-блокированием ПЦР.

В четвёртой главе приведено обсуждение результатов исследования.

В приложении 1 представлены данные по лекарственной устойчивости штаммов М. tuberculosis, полученных от больных с разными интервалами времени.

В приложении 2 представлен листинг программы фильтрации изображений, написанной в системе MATLAB 5.3.11.

Благодарности

Автор очень признателен следующим сотрудникам Государственного Института Прикладной Микробиологии, без содействия и помощи которых выполнение данной работы было бы невозможным:

Шемякину И.Г. - за постоянное руководство и материально-техническое обеспечение практически всех исследований.

Степаншиной В.Н. - за ценные консультации по проведению исследований и рекомендации по интерпретации полученных результатов;

Коробовой О.В. - за неоценимую помощь при проведении культуральных и биохимических исследований;

Гаврюшкину А.В. - за предоставленные образцы ПНК;

Онасенко А. Г. - за помощь при проведении секвенирования микобактериапьной ДНК.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Липин, Михаил Юрьевич

выводы

1. Частота встречаемости клинических штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в средней полосе России составляет более 41,6%, а лекарственно-чувствительных штаммов - менее 24,5%. Частота встречаемости клинических штаммов М. tuberculosis с первичной множественной лекарственной устойчивостью составляет 22,7%.

2. Мутации в 315 кодоне гена katG (94,3%) являются основным генетическим механизмом устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду.

3. Мутации в 516 (36,0%), 526 (15,5%) или 531 (35,3%) кодонах гена гроВ являются основным генетическим механизмом устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к рифампицину.

4. Установлено наличие значимых мутаций в гене рпсА у 16,7% клинических штаммов М. tuberculosis.

6. Выявлены новые мутации в генах katG (335GTC), гроВ (479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516ТТС, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG) и рпсА (22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132CGT, 164CCG, 175AGG,' 78AG, делеция с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Липин, Михаил Юрьевич, Оболенск

1. Аминев Х.К., Азаматова М.М., Фаттахова Л.З. Динамика смертности от туберкулёза в республике Башкортостан // Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 6.

2. Андреева Т.Н., Кирилов М.Н. Рецидивы туберкулёза органов дыхания // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва, 2003. -С. 6

3. Белобородова Н.Г., Козлова А.В., Мишин В.Ю. Туберкулёз у лиц молодого возраста в период напряжённой эпидемической ситуации // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 6

4. Блум Б.Р. Туберкулёз. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Карачунского. М.: Медицина, 2002. - 676 с.

5. Бородулина Е.А., Бородулин Б.Е., Хафизова М.Б., Колганова Е.Н. Анализ смерти пациентов в противотуберкулёзном диспансере // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 7.

6. Бронштейн И.Н., Семендяев КА Справочник по математике для инженеров и учащихся ВТУЗов // 13-е издание. Москва: "Наука". - Главная редакция физико-математической литературы. -1986 г. - 544 с.

7. Винокурова М.К., Корнилов А.А., Иванов Е.А. Клиническая структура впервые выявленного туберкулёза органов дыхания в республике Саха (Якутия) // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. -2003. - С. 9.

8. Голубев Д.Н., Газизуллина Г.Х. Медико-социальная характеристика заболевших туберкулёзом органов дыхания в Удмуртии // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 10.

9. Грузевский А.А. Современные данные о роли фотохромогенных микобакгерий в патологии человека // Проблемы Туберкулёза. 1999. - №6. - С. 58-61.

10. Гурьянов В.Н., Рогожина Н.А., Гладышева И.Г. Социальный портрет больных туберкулёзом лёгких в республике Мордовия // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 12.

11. Докторова Н.П., Паролина J1.E. Социальный статус молодых больных туберкулёзом // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 12.

12. Дорожкова И.Р., И.М. Медведева. Проблема лекарственной устойчивости возбудителя туберкулёза на современном этапе // Туберкулёз и экология. -1997. №2. - С. 25-27.

13. Копылова И.Ф., Чернов М.Т., Смердин С.В. Динамика эпидемической обстановки по туберкулёзу в Кузбассе // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 17.

14. Корнеев Ю.В., Галкин В.Б., Власова Г.А. Динамика туберкулёзного бациллярного ядра в Ленинградской области // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 18.

15. Литвинов В.И., Сельцовский П.П., Кочеткова Е.Я., Сон И.М., Андрюхина Г.Я. Эпидемическая ситуация и особенности эндемии туберкулёза в Москве //

16. Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. -2003. - С. 20.

17. Мельник В.М. Туберкулез на Украине: состояние, проблемы и прогноз // Проблемы Туберкулёза. 2000. -№ 5. - С. 28-31.

18. Молофеев А.Н., Асанов Е.М., Пантелеева Н.В., Занкина Н.А., Наумова АП., Назаренко П.Н., Егорычева С.М. Туберкулёз в Ульяновской области в начале XXI века // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. -Москва. 2003. - С. 21.

19. Мурашкина Г.С., Новикова Н.М., Ревякина О.В., Алексеева Т.В., Силайкина С.Т. Туберкулёз в Сибирском Федеральном Округе // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 22.

20. Нечаев В.И., Миляев А.А., Хованов А.В., Крылов В.В., Асеев А.В. Причины роста смертности от туберкулёза // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 23.

21. Окуловская С.С., Гуревич Г.Л., Богомазова А.В. Клинико-эпидемиологическая характеристика больных с лекарственно-устойчивым туберкулезом // Проблемы Туберкулёза. -1999. № 6. - С. 6-8.

22. Ондар Э.А, Матракшин А.Г., Чаянмаа АА, Ооржак Л.Д., Месько Е.М. Современный взгляд на проблему туберкулёза в республике Тува // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 23.

23. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Инфекционные заболевания в конце XX века и санитарно-эпидемиологическая ситуация в России в XXI веке // Журнал Микробиологии. 2002. - № 3. - С. 16-23.

24. Приказ №109 МЗ РФ от 21 марта 2003 года "О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации". Москва. - 2003. -347 с.

25. Приказ №558 МЗ СССР от 8 июня 1978 г. "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулёзе". Москва. - 1978. -72 с.

26. Ракова Н.Н., Марьяндышев А.О., Низовцева Н.И., Никишова Е.И., Тоичкина Т.В. Причины смертности от туберкулёза в 2002 г. в Архангельскойобласти // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. -Москва. 2003. - С. 25.

27. Скотникова О.И., Демкин В.В., Николаева Н.П., Мороз А.М., Литвинов В.И. Использование полимеразной цепной реакции в диагностике туберкулёза лёгких //Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии. 1999. - № 4. -С. 81-84.

28. Стародубов В.И., М.И. Перельман, С.Е. Борисов. Туберкулёз в России. Проблемы и пути их решения // Большой целевой журнал о туберкулёзе. 1999. -№ 3. - С. 8-10.

29. Филиповский А.А. Значение микобактерий комплекса Avium-intracellulare в инфекционной патологии // Проблемы туберкулёза. -1999. № 5. - С. 45-48.

30. Фрейман Г.Е., Мухамбетжанов С.А. Эффективность выявления туберкулёза в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети в Тургайской области Казахстана // Туберкулёз и экология. -1997. № 2. - С. 13-14.

31. Хоменко А.Г., Чуканов В.И., Корнеев А.А. Эффективность химиотерапии туберкулеза в легких с лекарственно-устойчивыми микобактериями // Проблемы Туберкулёза. 1996. - № 6. - С. 42-44.

32. Шилова М.В. Распространение туберкулёза в России в конце XX века // Новые информационные технологии и мониторинг туберкулёза. Российская конференция с международным участием. Москва. - 2000. - С. 31-35.

33. Эль-Тайебб О. Проект "DOTS-плюс" в ЛИУ-33, Мариинск // Туберкулёз сегодня. Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. Москва. - 2003. - С. 43.

34. Bergmann J.S. and Woods G.L. Reliability of Mycobacteria Growth Indicator Tube for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Ethambutol and Streptomycin // Journal of Clinical Microbiology. 1997. - Vol. 35. - No. 12. - P. 33253327.

35. Billington, O.J., McHugh T.D., and Gillespie S.H. Physiological Cost of Rifampin Resistance Induced In Vitro in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrobial Agents and Chemotherapy. -1999. Vol. 43. - No. 8. - P. 1866-1869.

36. Bock N.N., Reeves M., LaMarre M., DeVoe B. Tuberculosis Case Detection in a State Prison System // Public Health Reports. 1998. - Vol. 113. - P. 359-364.

37. Cavenaghi R. Rifampicin raw material characteristics and their effect on bioavailability // Bull. Int. Union Tuberc. Lung Dis. -1989. Vol. 64. - P. 36-41.

38. Chaves F., Dronda F., Gonzalez L.A., Gonzalez F.F., Catalan S. Tuberculosis in the prison population: a study of 138 cases // Med. Clin. (Bare.). -1993. -Vol. 101.-P. 525-529.

39. Cohn, D.L., O'Brien R.J. The use of restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis for epidemiological studies of tuberculosis in developing countries // The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. -1997. Vol. 2. - P. 16-26.

40. Coninx R., Maher D., Reyes H., Grzemska M. Tuberculosis in prisons in countries with high prevalence // BMJ. 2000 - Vol. 320. - P. 440-442.

41. Coninx, R., Mathieu C., Debacker M., Mirzoev F., Ismaelov A., de Haller R., Meddings D.R. First-line tuberculosis therapy and drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in prisons //The Lancet. -1999. Vol. 353. - P. 969-973.

42. Coninx, R., Pfyffer G. E., Mathieu C., Savina D., Debacker M., Jafarov F., Jabrailov I., Ismailov A., Mirzoev F., de Haller R., Portaels F. Drug Resistant tuberculosis in prisons in Azerbaijan: case study // BMJ. 1998. - Vol. 316. - P. 14231425.

43. Cooksey R.C., Morlock G.P., Holloway B.P., Mazurek G.H., Abaddi S., Jackson L.K., Buzard G.S., Crawford J.T. Comparison of Two Nonradioactive, Single-Strand Conformation Polymorphism Electrophoretic Methods for Identification of rpoB

44. Mutations in Rifampin-Resistant Isolates of Mycobacterium tuberculosis II Molecular Diagnosis. -1998. Vol. 3. - No. 2. - P. 1-8.

45. Couldwell D.L., Dore G.J., Harkness J.L., Marriott D.J.E., Cooper D.A., Edwards R., Li Y., and Kaldor J.M. Nosocomial outbreak of tuberculosis in an outpatient HIV treatment room //AIDS. 1996. - Vol. 10. - P. 521-525.

46. De Cock KM., Soro В., Coulibaly I.M., and Lucas S.B. Tuberculosis and HIV infection in sub-Saharian Africa // JAMA. -1992. Vol. 268. - P. 1581-1587.

47. Douglas J., and Steyn L.M. A ribosomal mutation in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates // J. Infect. Dis. -1993. Vol. 167. - P. 1505-1506.

48. Dye С., Espinal M.A., Watt C.J., Mbiaga C., Williams B.G., Worldwide incidence of multidrug-resistant tuberculosis // J. Infect. Dis. 2002. Vol. 185. - No. 8. -P. 1197-1202.

49. Edwards К J., Metherell L.A., Yates M., and Saunders N.A. Detection of rpoB Mutations in Mycobacterium tuberculosis by Biprobe Analysis // Journal of Clinical Microbiology. 2001. - Vol. 39. - No. 9. - P. 3350-3352.

50. El-Hajj H.H., Marras S.A., Tyagi S.f Kramer F.R., Alland D. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons//Journal of Clinical Microbiology. -2001. Vol. 39. - No. 11. - P. 4131-4137.

51. Farmer P., Furin J., Shin S. Managing Multidrug-Resistant Tuberculosis. The Journal of Respiratory Diseases. 2000. - Vol. 21. - No. 1. P. 106-111.

52. Fermentas. Molecular biology // Catalogue & Application Guide. 1998/1999. -1997. Lithuania. - P. 152.

53. Frieden T.R., Sherman L.F., Maw K.L., Fujiwara P.I., Crawford J.T., Nivin В., Sharp V., Hewlett D., Brudney K., Alland DM Kreiswirth B.N. A Multi-institutional Outbreak of Highly Drug-Resistant Tuberculosis // JAMA. 1996. - Vol. 276. P. 12291235.

54. Glynn J.R. Resurgence of tuberculosis and the impact of HIV infection // British Med. Bull. 1998. - Vol. 54. - P. 579-593.

55. Glynn J.R., Whiteley J., Bifani P.J., Kremer K., and van Soolingen D. Worldwide Occurrence of Beijing/W Strains of Mycobacterium tuberculosis: A Systemaic Review II Emerging Infectious Diseases. 2002 - Vol. 8. - No. 8. - P. 843849.

56. Gonzalez N. Torres M.J., Aznar J., Palomares J.C. Molecular analysis of rifampin and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in Seville, Spain //Tubercle and Lung Disease. 1999. - Vol. 79. - No. 3. - P. 187-190.

57. Grosset J., C. Truffot-Pernot, C. Lacroix, and B. Ji. Antagonism between Isoniazid and the Combination Pyrazinamide-Rifampin against Tuberculosis Infection in Mice //Antimicrobial Agents and Chemotherapy. -1992. Vol. 36. - No. 3. - P. 548-551.

58. Heersma F.H., Kremer K., and van Embden J.D.A. Computer Analysis of IS6110 RFLP Patterns of Mycobacterium tuberculosis. From: Methods in Molecular

59. Biology, Vol. 101: Mycobacteria Protocols. Edited by: Parish T. and Stoker N.G. Humana Press Inc., Totowa, NJ, P. 395-422.

60. Heifets, L., and P. Lindholm-Levy. Pyrazinamide sterilizing activity in vitro against semidormant Mycobacterium tuberculosis bacterial populations // Am. Rev. Resp. Dis. 1992. - Vol. 145. - P. 1223-1225.

61. HellyerT.J., DesJardin L.E., Hehman G.L., Cave M.D., and Eisenach K.D. Quantitative analysis of mRNA as a marker for viability of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. -1999. Vol. 37. - P. 290-295.

62. Heym В., Saint-Joanis В., Cole S.T. The molecular basis of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis И Tubercle and Lung Disease. 1999. - Vol. 79. - No. 4. - P. 267-271.

63. Hirano K, Kazumi Y., Abe C., Mori Т., Aoki M:, Aoyagi T. Resistance to antituberculosis drugs in Japan II Tubercle Lung Disease. -1996. Vol. 77. - No. 2. - P. 130-135.

64. Holden C. Stalking a Killer in Russia's Prisons // Science. -1999. Vol. 286. -P. 1670.

65. Huebner R.E., Castro K.G. The changing face of tuberculosis // Annu. Rev. Med. 1995. - Vol. 46. - P. 47-55.

66. Jindani A., Aber V.R., Edwards E.A., and Mitchison D.A. The Early Bactericidal Activity of Drugs in Patients with Pulmonary Tuberculosis // American Review of Respiratory Disease. -1980. Vol. 121. - P. 939-949.

67. Kimerling M.E., Phillips P., Patterson P., Hall M.f Robinson C.A., and Dunlap N.E. Low Serum Antimycobacterial Drug Levels in Non-HIV-lnfected Tuberculosis Patients//Chest. 1998. - Vol. 113. - No. 5. - P. 1178-1183.

68. Kirschner P., Bottger E.C. Species Identification of Mycobacteria Using rDNA Sequencing // Methods in Molecular Biology, Vol. 101: Mycobacteria Protocols / Edited by: T. Parish and N.G. Stacker. Humana Press Inc., Totowa, NJ. - 1998. - P. 349-361.

69. Lee A.S.G., Teo A.S.M., Wong S.-Y. Novel Mutations in ndh in Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. -2001. Vol. 45. - No. 7. - P. 2157-2159.

70. Low D.E. Antimicrobial drug use and resistance among respiratory pathogenesis the community // CID. 2001. - Vol. 33 (suppl. 3). - P. 5206-5213.

71. Maclntyre C.R., Kendig N. Kummer L., Birago S., Graham N.M.H., and Plant A.J. Unrecognized transmission of tuberculosis in prisons // Clinical Infectious Diseases. -1999. 29. - P. 705-709.

72. Maclntyre C.R., Kendig N. Kummer L., Birago S., and Graham N.M.H. Impact of Tuberculosis Control Measures and Crowding on the Incidence of Tuberculosis Infection in Maryland Prisons // Clinical Infectious Diseases. 1997. - Vol. 24. - P. 1060-1067.

73. March F., Coll P., Guerrero R.A., Busquets E., Cayla J.A., Prats G. Predictors of tuberculosis transmission in prisons: an analysis using conventional and molecular methods // AIDS. 2000. - Vol. 14. - P. 525-535.

74. Martin V., Gonzalez P., Cayla J.A. Case finding of pulmonary tuberculosis on admission to a penitentiary centre // Tuberc. Lung Dis. 1994. - Vol. 74. - P. 49-53.

75. Matsiota-Bernard P., Vrioni G., and Marinis E. Characterization of гроВ mutations in rifampicin resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Greece //J. Clin. Microbiol. -1998. Vol. 36. - P. 20-23.

76. McCarthy M. Active tuberculosis boosts HIV replication II Lancet. 1996. -Vol. 348. - No. 9024. - P. 393.

77. Miesel L., Rozwarski D.A., Sacchettini T.C., Jacobs W.R.Jr. Mechanisms of isoniazid action and resistance // Genetics and tuberculosis. John Wiley and Sons. -1998. - P. 209-220.

78. Mitchison DA The action of antituberculosis drugs in short-course therapy //Tubercle. -1985. Vol. 66. - P. 219-225.

79. Mitchison, DA Role of individual drugs in the chemotherapy of tuberculosis II Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - Vol. 4. - No. 9. - P. 796-806.

80. Mitchison, D.A. Understanding the chemotherapy of tuberculosis current problems II Journal of Antimicrobial Chemotherapy. -1992. Vol. 29. - P. 477-493.

81. Mori T. Recent trends in Tuberculosis, Japan // Emerging Infectious Diseases. 2000. - Vol. 6. - No. 6. - P. 566-568.

82. Musser J.M. Antimicrobial Agent Resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights // Clinical Microbiology Review. -1995. Vol. 8. - No. 4. - P. 496-514.

83. Nachamkin I., Kang C., Weinstein M.P. Detection of Resistance to Isoniazid, Rifampin, and Streptomycin in Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis by Molecular Methods II Clinical Infectious Diseases. -1997. Vol. 24. - P. 894-900.

84. Nair J., Rouse D.A., Bai G.-H., and Morris S.L The rpsL gene and eptomycin resistance in single and multiple drug-resistant strains of Mycobacterium

85. Jberculosis II Molecular Microbiology. -1993. Vol. 10. - No. 3. - P. 521-527.

86. Nastasi A., C. Mammina. Epidemiological Study of Tuberculosis in Palermo, Italy: IS6110 Fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in the Years 1994-1998 // Infection. -1999. Vol. 27. - P. 318-322.

87. Niemann S., Rusch-Gerdes S., and Richter E. IS6110 Fingerprinting of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Germany during 1995 // Journal of Clinical Microbiology. 1997. - Vol. 35. - No. 12. - P. 3015-3020.

88. Nyangulu D.S., Harries A.D., C. Kang'ombe, A.E. Yadidi, K. Chokani, T. Cullinan, D. Maher, P. Nunn, F.M. Salaniponi. Tuberculosis in a prison population in Malawi // Lancet. -1997. Vol. 350. - P. 1284-1287.

89. Orum H., Nielsen P.E., Egholm M.t Berg R.H., Buchardt O., and Stanley C. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR champing // Nucleic Acids Res. 1993. - Vol. 21. - P. 5332-5336.

90. Park Y.-K., Cho S.-H., Na B.-K., Song C.-Y., Bai G.-H., and Kim S.-J. Evaluation of Line Probe Assay in Detecting Rifampicin Resistance of Mycobacterium tuberculosis // The Journal of Microbiology. 1997. - Vol. 35. - No. 3. - P. 177-180.

91. Patel K.B., Belmonte R., Crowe H.M. Drug malabsorbtion and resistant tuberculosis in HIV-infected patients letter. // N. Engl. J. Med. 1995. - Vol. 332. - P. 336-337.

92. Pozzi G., Meloni M., lona E., Orru G., Thoresen O.F., Ricci M.L., Oggioni M.R., Fattorini L., and Orefici G. rpoB Mutations in Multidrug-Resistant Strains of

93. Mycobacterium tuberculosis Isolated in Italy II Journal of Clinical Microbiology. -1999. -Vol. 37. No. 4. - P. 1197-1199.

94. Pym A.S., Saint-Joanis В., Cole S.T. Effect of katG mutations on the virulence of Mycobacterium tuberculosis and the implication for transmission in humans II Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - No. 9. - P. 4955-4960.

95. Ramaswamy S.V., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tubercle and Lung Disease. 1998. - Vol. 79. - No. 1. - P. 3-29.

96. Rastogi N. Goh K.S., and David H.L. Enhancement of drug susceptibility of Mycobacterium avium by inhibitors of cell envelope synthesis // Antimicrob. Agents Chemother. -1990. Vol. 34. P. 759-764.

97. Reyes H., Coninx R. Pitfalls of tuberculosis programmes in prisons // BMJ. -1997. Vol. 315. - P. 1447-50.

98. Rieder H.L. Interventions for Tuberculosis Control and Elimination // International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 2002. - Paris. France. -251 p.

99. Rouse D.A., Li Z., Bai G.-H., and Morris S.L. Characterization of the katG and inhA Genes of Isoniazid-Resistant Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis II Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1995. - Vol. 39. - No. 11. - P. 2472-2477.

100. Salfinger M., Crowle A.J. and Reller L.B. Pyrazinamide and pyrazinoic acid activity against tubercle bacilli in cultured human macrophages and in the BACTEC system // Journal of Infectious Diseases. -1990. Vol. 162. P. 201-207.

101. Sambrook J. et al. Molecular Cloning IIA Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. 1989. - Cold Spring Harbor, N.Y. - P. 342.

102. Sanger F. Nicklen S. Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. - P. 5463-5467.

103. Scorpio A., Lindholm-Levy P., Heifets L., Gilman R., Sddiqi S., Cynamon M., and Zhang Y. Characterization of pncA Mutations in Pyrazinamide-Resistant

104. Mycobacterium tuberculosis II Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1997. - Vol. 41.-No. 3.-P. 540-543.

105. Shafer R.W., Chirgwin K.D., Glatt A.E., Dahdouh M. Landesman S., and Suster B. HlV-prevalence, immunosuppression and drug resistance in patients with tuberculosis in an area endemic for AIDS // AIDS. -1991. Vol. 5. P. 399-405.

106. Slayden R.A., and Barry C.E. III. The genetics and biochemistry of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis И Microbes Infect. 2000. - Vol. 2. - P. 659669.

107. Small P.M. and Moss A. Molecular Epidemiology and the New Tuberculosis II Infection Agents and Disease. 1993. - Vol. 2. - P. 132-138.

108. Snider D.E., Caras G.J. Isoniazid-associated hepatitis death: a review of available information //American Review Respiratory Disease. -1992. Vol. 145. P. 495497.

109. Takayama K, Kilbum J.O. Inhibition of synthesis of arabinogaladan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis II Antimicrobial Agents Chemotherapy. -1989. -Vol. 33.-P. 1493-1499.

110. Taniguchi H., Aramaki H., Nikaido Y., Mizuguchi Y., Nakamura M., Кода Т., Yoshida S. Rifampicin resistance and mutation of the гроВ gene in Mycobacterium tuberculosis IIFEMS Microbiology Letters. -1996. Vol. 144. - P. 103-108.

111. Telenti A. Genetics of Drug Resistance in Tuberculosis II Tuberculosis. -1997. Vol. 18. - No. 1. - P. 55-64.

112. Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S., Colston M.J., Matter L., Schopfer K, Bodmer T. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis II The Lancet. -1993. Vol. 341. - P. 647-650.

113. Tenover F.C., Crawford J.T., Huebner R.E., Getier L.J., Horsburgh C.R. Jr., and Good R.C. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? // J. Clin. Microbiol. -1993. Vol. 31. - P. 767-770.

114. Thein S.L., Wallance R.B. Human Genetic Diseases: a practical approach // IRL Press, Herndon, Virginia. 1986. - P. 33-50.

115. Torres M.J., Criado A., Palomares J.C., and Aznar J. Use of Real-Time PCR and Fluorimetry for Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance-Associated

116. Mutations in Mycobacterium tuberculosis II Journal of Clinical Microbiology. 2000. -Vol. 38. - No. 9. - P. 3194-3199.

117. Troesch A., Nguyen H.f Miyada C.G. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays II Journal of Clinical Microbiology. 1999. - Vol. 39. - No. 1. - P. 49-55.

118. Valim A.R.M., Rossetti M.L.R., Ribeiro M.O., and Zaha A. Mutations in the rpoB Gene of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates from Brazil II Journal of Clinical Microbiology. 2000. - Vol. 38. - No. 8. - P. 3119-3122.

119. Valvay S.E., Greifinger R.B., Papania M.t Kilburn J.O., Woodley C., DiFerdinando G.T., and Dooley S.W. Multidrug-Resistant Tuberculosis in the New-York State Prison System, 1990-1991 II The Journal of Infectious Diseases. 1994. - Vol. 170.-P. 151-156.

120. Valvay S.E., Richards S.B., Kovacovich J., Greifinger R.B., Crawford J.T., and Dooley S.W. Outbreak of Multi-Drug-resistant Tuberculosis in a New-York State Prison, 1991 //American Journal of Epidemiology. 1994. - Vol. 140. P. 113-122.

121. Van Soolingen D., Borgdorff M.W., De Haas P.E.W., et. al. Molecular epidemiology of tuberculosis in the Netherlandes: a nationwide study from 1993 through 1997 // J. Infect. Dis. -1999. Vol. 180. - P. 726-736.

122. Weiler J., Gausepohl H., Hauser N., Jensen O.N., and Hoheisel J.D. Hybridisation based DNA screening on peptide nucleic acid (PNA) oligomer arrays II Nucleic Acids Research. -1997. Vol. 25. - No. 14. - P. 2792-2799.

123. Yuen L.K.W., Leslie D., and Coloe P.J. Bacteriological and Molecular Analysis of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Australia // Journal of Clinical Microbiology. -1999. Vol. 37. - No. 12. - P. 3844-3850.

124. Zhang Y., Scorpio A., Nikaido H., Sun Z. Role of Acid pH and Deficient Efflux of Pyrazinoic Acid in Unique Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide // Journal of Bacteriology. -1999. Vol. 181. - No. 7. - P. 2044-2049.

125. Zhang Y., Dhandayuthapani S., and Deretic V. Molecular basis for the exquisite sensitivity of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 13212-13216.

126. Даты выделения и лекарственная устойчивость первичных и вторичных штаммов М. tuberculosis от 173 пациентовпервый штамм второй штамм Период между выделениями штаммов, мсс. Дополнительная ЛУ Дополнительная МЛУ

Информация о работе

Липин, Михаил Юрьевич
кандидата биологических наук
Оболенск, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генетические механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium Tuberculosis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы