Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis

Афанасьев, Максим Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis"

На правах рукописи

Афанасьев Максим Владимирович

Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 5 ДЕК 2008

Москва - 2008

003454263

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна (ФГУ НИИ Физико-химической медицины)

доктор химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович (Московский Государственный Университет им Ломоносова)

Ведущая организация: ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится « ¡7- » декабря 2008 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.057.01 при ФГУ НИИ Физико-химической медицины Росздрава по адресу: 119992, г. Москва, ул. Малая Пироговская, 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ Физико-химической медицины Росздрава.

Автореферат разослан « » ноября 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

М. А. Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся поражением органов дыхания, костно-суставного аппарата, кожи, глаз, мочеполовых и некоторых других органов и систем. Широкое распространение туберкулезной инфекции в мире, большое количество случаев эпидемиологически опасных активных форм, высокий уровень смертности делают ее одной из актуальнейших проблем современной медицины и здравоохранения. Особую и весьма значительную роль в обострении ситуации с туберкулезом играет появление и все большее распространение штаммов микобактерий, устойчивых к лекарственным препаратам.

Необходимо отметить, что применяемые на сегодняшний день микробиологические методы выявления и характеристики микобактерий, являясь основными методами диагностики туберкулеза, весьма трудоемки, дороги, плохо стандартизуемы и длительны, что существенно снижает диагностическую ценность проводимых исследований, увеличивает сроки постановки и подтверждения диагноза, приводит к позднему выявлению больных - активных бактериовыделителей, вынуждает врачей эмпирически назначать противотуберкулезную терапию и не позволяет проводить своевременную коррекцию лечения в случае развития устойчивости.

Современные биохимические и генетические тесты позволяют существенно модернизировать традиционные микробиологические методики идентификации и характеристики микроба, а так же преодолеть ряд ограничений последних. Хотя расшифровкой биохимических, метаболических, генетических механизмов формирования устойчивости

М. tuberculosis длительное время занимаются многие научно-исследовательские коллективы во всем мире, данная проблема остается до конца нерешенной. Одним из важнейших направлений в этой области является разработка и внедрение новых методов ускоренной детекции антибиотикоустойчивости микобактерий. В настоящее время для экспресс-диагностики лекарственной устойчивости туберкулеза предложено большое количество методик, однако каждая из них обладает рядом недостатков и ограничений и не может полностью соответствовать требованиям современной клинической микробиологии. Кроме того, до сих пор, в силу ряда объективных причин,

современные микробиологические, биохимические и генетические методы для исследования особенностей возбудителя туберкулеза на территории Российской Федерации применяются весьма ограничено, и информация о закономерностях появления и распространения устойчивости в популяции отечественных штаммов микобактерий носит отрывочный и ограниченный характер.

В процессе работы нами разработана методика, основанная на исследовании геномной ДНК, позволяющая быстро и эффективно выявлять генетические детерминанты лекарственной устойчивости, и наиболее полно отвечающая задачам скрининга и мониторинга распространения резистентных форм туберкулезной инфекции.

Исследование крупных, фенотипически охарактеризованных групп штаммов из различных регионов РФ позволило обновить и существенно дополнить имеющуюся на сегодняшний день информацию о совокупности изменений генетического материала, присущих лекарственно устойчивому туберкулезу, и об особенностях циркулирующих в отдельных регионах штаммов.

Цель работы. Целью настоящей работы являлась разработка и адаптация методов молекулярного типирования туберкулеза, и использование этих методов для комплексной характеристики популяции М. tuberculosis, циркулирующей на территории Российской Федерации Задачи исследования:

1. Формирование коллекции образцов геномной ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов М tuberculosis, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации.

2. Разработка системы комплексной оценки лекарственной устойчивости М. tuberculosis на основе знаний о молекулярных механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

3. Разработка системы комплексной оценки молекулярно-генетического разнообразия штаммов М. tuberculosis, включающей типирование

возбудителя с использованием технологии VNTR-анализа и сполиготипирования.

4. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика группы клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории Российской Федерации, включающая:

1) анализ распространенности и вклада различных механизмов в формирование лекарственной устойчивости М. tuberculosis.

2) анализ структуры и оценку молекулярно-генетической гетерогенности исследуемой популяции М. tuberculosis.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе современные методы анализа макромолекул, в частности ДНК, применены для характеристики и типирования клинических штаммов М. tuberculosis, отдельные методики отработаны впервые.

Впервые на основе ДНК-амплификации, минисеквенирования и масс-спектрометрического анализа нуклеиновых кислот разработана система для исследования нуклеотидных полиморфизмов бактериального генома, ассоциированных с лекарственной устойчивостью М. tuberculosis.

По сравнению с другими аналогичными технологиями (ПЦР в реальном времени, ДНК-чипы), разработанная методика обладает более высокой производительностью и точностью тестирования при относительно низкой себестоимости.

С использованием разработанной технологии впервые изучены генетические основы реализации биохимических механизмов устойчивости к двум основным противотуберкулезным препаратам первого ряда (рифампицин, изониазид) у штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в трех Федеральных Округах РФ.

Результаты этой работы подтверждают возможность применения описанной технологии для масштабного скрининга и мониторинга распространения множественной лекарственной устойчивости.

Показано, что мутации в 306 и 406 кодонах гена фермента арабинозилтрансферазы, предлагаемые другими авторами в качестве детерминант устойчивости к этамбутолу, не могут быть использованы для детекции и скрининга этамбутол-устойчивых штаммов М. tuberculosis в

Центральном регионе РФ, поскольку обнаруживаются только у 54 % этамбутол-устойчивых штаммов.

В то же время впервые показана возможность тестирования этих генетических изменений как дополнительного маркера множественной лекарственной устойчивости туберкулеза.

Впервые на основании изучения особенностей структурной организации геномой ДНК проведена комплексная характеристика штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Московском регионе. Выявлено преобладание штаммов, относящихся к генетическому семейству Beijing (66,0 %), и установлена их роль в распространении множественной лекарственной устойчивости среди больных туберкулезом в Москве.

В целом результаты работы представляют несомненную практическую ценность и могут иметь значение для решения ряда прикладных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулезной инфекции.

Реализация и внедрение результатов работы в практику. Разработанная технология использована при выполнении Государственного Контракта № 06/365 от 15 марта 2006 г. на проведение работы по теме «Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Российской Федерации с использованием технологии масс-спектрометрии». Осуществляется внедрение результатов работы в клинико-лабораторную практику лаборатории молекулярных методов диагностики ЦНИИ туберкулеза РАМН.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава (Москва, 4 сентября 2008 г.), а также в ходе ряда международных конференций (55-я конференция по масс-спектрометрии Американского масс-спектрометрического общества (ASMS) (Индианаполис, 2007), 18-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Барселона, 2008), 39-я Всемирная конференция по легочным заболеваниям (Париж, 2008)).

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 8 публикациях (3 в рецензируемых журналах, 5 - тезисы сообщений на конференциях).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 11 рисунков. Состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение и выводы», «Список литературы», который включает 209 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы. В работе использовано 976 клинических штаммов М tuberculosa, выделенных от больных туберкулезом из трех федеральных округов РФ Центрального, Уральского и Сибирского, находившихся на лечении в ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН (г Москва), ФГУ Уральский НИИ фтизиопульмонологии Росздрава (г Екатеринбург) и ФГУ Новосибирский НИИ туберкулеза Росздрава (г Новосибирск) в период с 1997 по 2006 год Микробиологическая идентификация и выделение чистой культуры возбудителя проводилась в соответствии с процедурами, регламентированными Приказом № 109 МЗ РФ от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» Для контроля качества всех микробиологических и молекулярно-генетичеких процедур использовали референсный штамм М. tuberculosis H37Rv Определение устойчивости штаммов М. tuberculosis. Оценка лекарственной чувствительности штаммов к рифампицину и изониазиду методом абсолютных концентраций выполнялась в соответствии с Приказом № 109 МЗ РФ Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) рифампицина, изониазида и этамбутола для 285 штаммов, выделенных в Центральном регионе РФ, проводилось в ходе культивирования бактериальных клеток на среде Дюбо с добавлением KNOj, содержащей различные концентрации препаратов: 160,0, 80,0, 40,0, 20,0, 10,0, 5,0 мкг/мл для рифампицина, 32,0; 16,0, 8,0, 4,0, 2,0, 1,0 мкг/мл для изониазида и 8,0, 4,0, 2,0, 1,0, 0,5, 0,25 мкг/мл для этамбутола. Рост М tuberculosis определяли через 10 дней культивирования по цветной реакции с реактивом Грисса (в виде 7,5 % водного раствора) (иитратредуктазная реакция).

Генетический анализ штаммов М. tuberculosis. Выделение ДНК М tuberculosis осуществлялось при помощи набора «ДНК - экспресс» (ТУ- 9398-450-17253567-03) производства ООО НПФ Литех, в соответствии с прилагаемыми инструкциями Для амплификации фрагментов генов М tuberculosis, связанных с рассматриваемыми механизмами устойчивости, использовались праймеры MtrpoBf (5'-gaggcgatcacaccgcagac-3') и MtrpoBr (5'-ggtacggcgtttcgatgaac-3-) для локуса rpoB\ MtkatGf (5'-acccgaggctgctccgctgg-3') и

MtkatGr (5'-cagctcccactcgtagccgt-3-) для локуса katG; MtfabGf (5'-gcctcgctgcccagaaagg-3') и MtfabGr (5'-ctccggatccacggtgggt-3') для фрагмента промоторной области fabG-mhA; embBF2 (5'-aagctggcgcaccttcacc-3') и embBR2 (5'-gccagcaggttgtaatacc-3') а также MtEB406F (5'-ccatggtcttgctgacc-3') и MtEB406R (5'-cacacccagtgtgaatgc-3') для локуса етЪВ

Амплификацию фрагментов генома М tuberculosis проводили в реакционной смеси, содержащей бб мМ Tris-HCI pH 9,0, 16,6 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCb, по 250 мкМ каждого дНТФ, 1 ед Taq-лолимеразы (Promega, USA) и по 10 пмоль каждого праймера в объеме 25 мкл Реакцию проводили в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research,USA) по универсальному профилю амплификации, адаптированному для максимального выхода ПЦР

- продукта всех исследуемых локусов генома 94°С - 5 мин , 35 циклов' 94°С - 15 сек., 61°С

- 15 сек., 72°С - 15 сек., 72°С - 10 мин , 4°С - хранение

Дефосфорилнрование дНТФ и элиминацию оставшихся праймеров в пост-амлификационной смеси проводили, инкубируя образцы с 1 Ед антарктической фосфатазы (New England BioLabs, Великобритания) и 5 Ед экзонуклеазы I (Fermentas, Евросоюз) при 37°С в течение 30 минут с последующей инактивацией ферментов при 85° С в течение 10 минут. Реакцию термоциклического минисеквенирования проводили в 10 мкл реакционной смеси. 66 мМ Tris-HCI pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2; по 0,2 мМ необходимых дНТФ и/или ддНТФ; по 10 пмолей соответсвующего праймера (табл 1) и 2 Ед TermiPol DNA Polymerase (Solls Biodyne, Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты ДНК Наработку продуктов минисеквенирования осуществляли по профилю. 94°С - 20 сек, Та - 20 сек, 72° С - 15 сек, 70 циклов (где Та - температура отжига, подобранная для соответствующей системы) в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research,USA).

Таблица 1. Олигоиуклеотидные праймеры, используемые в реакции минисеквенирования для идентификации маркеров лекарственной устойчивости в анализируемых локусах геномной ДНК М. tuberculosis.

Генетический локус Мишень (кодон) Название зонда Последовательность зонда (5'-3'), Масса (Да) Смесь дНТФ/ ддНТФ Та (°С) Ожидаемые массы продуктов реакции (Да)

гроВ 531 533 Mt53lf Mt533r gacccacaagcgccgactg (5768) cagaccgccgggcccc(4814) ДАТФ, дТТФ, ДЦТФ, ддГТФ 59° 6673,5439 (Ser531,Leu533) 6688 (Ser531-Leu) 6384 (Ser531-Trp) 5126(Leu533-Pro)

526 Mt526f Mt526r gctgtcggggttgacc (4930) cgccgacagtcggcgcttg (5806) дТТФ, дГТФ, ддАТФ, ддЦТФ 53° 5203,7674 (His526) 5531, 6407 (His526-Tyr) 5227, 7649 (His526-Asn) 5556, 6383 (His526-Asp) 5203, 6079 (His526-Arg) 5203, 7700 (His526-Pro)

5203, 6102 (His526-Leu)

516 Mt516rl Mt516г2 Mt516r3 Mt516r4 acagcgggttgttctg (4928) cccgacagcgggttgttctgc (6415) cccgacagcgggttgttctgcc (6704) cccgacagcgggttgttctgtc (6719) дАТФ, дТТФ, дГТФ, ддЦТФ 49° 5834 (Asp516) 5843 (Asp516—Val) 5819 (Asp516-Val) 5530 (Asp516—Gly)

513 511 Mt513fl Mt513f2 Mt511 f ggcaccagccagctgagc (5494) ttcggcaccagccagctgagca (6705) gttcttcggcaccagccagc (6054) дЦТФ, дТТФ, дГТФ, ддАТФ 61" 6080,6984 (Gln513,Leu511) 6369 (Gln513-Pro) 6969 (Leu511-Pro)

522 514 Mt522f Mt514ins atggaccagaacaacccgctgt(6714) ccagccagctgagccaattc (6047) дАТФ, дЦТФ, ддТТФ, ддГТФ 63" 7315, 6648 (Ser522,P)ie514) 6335 (514 ms Phe)

katG 315 kG315fl kG315f2 kG315r taaggacgcgatcacc (4876) ggtaaggacgcgattaccc (5823) catacgacctcgatgcct (5420) дАТФ, дЦТФ, ддТТФ, ддГТФ 50° 5502, 5997 (Sei315) 6104 (Ser315-Asn) 5733 (Ser315—Thr)

fabGl-mhA-промоторн ая область -15 -8 MtfC15f MtfGBr cccggccgcggcgaga(4849) gtggcagtcaccccgaca (5470) дТТФ, дГТФ, ддАТФ, ддЦТФ 56° 5167, 5767 (-15C.-8T) 5824 (-15 C-T) 5849 (-8 T-C) 6047 (-8T-A) 5743 (-8T-G)

emhB 306 EB306Fn2 EB306R acgacggctacatcctgggc (6103) tggtcggcgactcgggc (5243) ддАТФ, ддТТФ, дЦТФ, ддГТФ 59° 6400,5829 (Met306) 6416, 5829 (Met306-Val) 6680, 5829 (Met306-Leu) 6400, 5845 (Met306-Thr) 6400,5540 (Met306-Ile) 6400,5556 (Met306-Iie) 6400, 5844 (Met306-Ile)

406 EB406Fn ggcctgcggccggag (4635) дТТФ, дГТФ, ддАТФ, ддЦТФ 53" 5566(Gly406) 4932 (Gly406-Ser) 4908(Gly406-Cys) 5261(Gly406—Asp) 5237(Gly406-Ala)

Очистку продуктов реакции минисеквенирования проводили следующими образом:

входящий в состав набора SpectroCLEAN Kit (Sequenom, США) сорбент в количестве 8 мг растворяли в 16 мкл ультрачистой воды (Merck, Германия), полученную суспензию в объеме 24 мкл вносили в пробирку с продуктами реакции минисеквенирования Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 15 мин Затем осаждали сорбент центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин

Для проведения масс-спектрометрического анализа продуктов реакции аликвоту образца (0,2-1 мкл) с концентрацией олигонуклеотидов 10-30 пмоль/мкл, наносили на предварительно высушенную на планшете AnchorChip (600 мкм, Bruker Daltomcs, Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, Германия) в 50% ацетонитриле (Merck, Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония

двухосновного (Fluka, Германия), и высушивали на воздухе.

Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltomcs, Германия), оснащенного азотным лазером (Х=337 нм) с частотой импульсов до 20 Гц Все измерения проводили в линейной режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением - 20 0 кВ, накапливающем электроде - 18,65 кВ, фокусирующей линзе - 9,2 кВ и временем задержки анализатора - 400 нсек Для получения каждого масс-спектра использовали 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца

По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте в данном положении

Определение нуклеотидных последовательностей локусов генома, принимающих участие в формирование устойчивости, проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABl Prism® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США, "Hitachi" Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями

Анализ числа тандемных повторов в 24 локусах генома, так называемый VNTR-анализ (от англ Variable Number Tandem Repeat), клинических штаммов M tuberculosis осуществлялся по методикам, описанным ранее [Mazars et al, 2001, Supply et al., 2006]

Построение филогенетического древа осуществлялось методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (Unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA) при помощи web-pecypca MIRU-VNTR-plus (httn Ш 198 5 195/MlRU/mdex faces, данные на июнь 2008 г.) [Allix-Béguec et al., 2008]

Спотлиготипирование осуществлялось по протоколу, описанному ранее [Kamerbeek et al, 1997] с использованием набора для сполиготипирования «Spoligotyping Kit» (Isogen Lifescience, № 1M9701) Для определения семейства, к которому относился штамм, использовалась ранее опубликованная база SpolDB4 [Brudey et al, 2006] Интернациональный сполиготип (Spohgotype International Type, SIT) каждого штамма определялся путем сравнения полученных результатов с базой данных SITVIT2 (Institut Pasteur de Guadeloupe, httpV/vvww pasteur-

guadeloupe fr 8081/S 11 VI rüemo/outilsConsiiltation isn: по состоянию на июнь 2008 г.). Статистический анализ. Все статистические тесты проводили для уровня значимости р< 0,05 Для подтверждения наличия ассоциации исследуемых фенотипических и генетических признаков использовался метод ^-квадрат и двусторонний точный критерий

Фишера. Основные статистические расчеты производили с помощью пакета Statistica 6 0. Для численной оценки вариабельности генетических локусов использовался индекс аллельного полиморфизма (h) [Selander et al., 1986] Для численной оценки дискриминирующей способности методов типироваиия использовали индекс Хантера-Гастона (HGDI) [Hunter et al, 1988] Согласно общепринятой практике, приемлемыми считаются методы типироваиия (или их комбинации), имеющие значение индекса Хантера-Гастона 0,9 и выше [Hunter et al., 1988]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом из 12 субъектов Российской Федерации. Ранее для всех штаммов (п=976) методом абсолютных концентраций определена устойчивость к рифампицину и изониазиду; для 285 штаммов, выделенных в микробиологической лаборатории ЦНИИ туберкулеза РАМН, методом серийных разведений определены значения МИК для рифампицина, изониазида и этамбутола. Объем и географическая неоднородность включенной в исследование выборки открывают возможность использования её для апробации вновь создаваемых средств молекулярно-генетического типироваиия М. tuberculosis, в частности, направленных на быстрое выявление случаев устойчивости М. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам.

С применением разработанной на основе ДНК-амплификации и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции минисеквенирования системы исследования нуклеотидных полиморфизмов бактериального генома, ассоциированных с лекарственной устойчивостью М. tuberculosis, для общей выборки из 976 клинических штаммов М. tuberculosis выполнен анализ генетических маркеров устойчивости к рифампицину и изониазиду. Анализ генетических маркеров устойчивости к этамбутолу проведен для 285 штаммов, выделенных в Центральном регионе РФ.

Группа образцов, состоящая из 115 клинических штаммов, выделенных от больных туберкулезом, постоянно проживающих в Московском регионе (Москва и Московская обл.), охарактеризована на основании оценки числа тандемных повторов в структуре геномной ДНК (VNTR-анализ и сполиготипирование). Это дало возможность наиболее полно описать выборку

M. tuberculosis, представляющую Московский регион, с молекулярно-генетической точки зрения, а также определить клинико-эпидемиологическое значение тех или иных штаммов.

Определение устойчивости к рифампицину, изониазиду, этамбутолу. По

данным бактериологического анализа, основанного на методе абсолютных концентраций, из 976 клинических штаммов М. tuberculosis 553 (56,6 %) были идентифицированы как МЛУ (устойчивые к рифампицину и изониазиду), 278 (28,5 %) - как чувствительные, и 14 (1,4 %) и 131 (13,4 %) - как устойчивые только к рифампицину или изониазиду, соответственно.

Серди 285 штаммов, для которых была определена чувствительность к этамбутолу, только 79 (28,0 %) были чувствительны к этому препарату.

При анализе значений МИК рифампицина, изониазида и этамбутола для штаммов, выделенных в Центральном регионе, обнаружено большое количество штаммов с очень высоким уровнем устойчивости - >80 мкг/мл для рифампицина, > 8.0 мкг/мл для изониазида и >8 мкг/мл для этамбутола - 154 (54,0 %), 140 (49,1 %) и 99 (34,7 %) штаммов, соответственно, что превышает критическую концентрацию, рекомендованную приказом МЗ РФ № 109 для определения устойчивости, в два - три раза.

Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости М. tuberculosis. На основании анализа данных современной литературы резюмирована информация о молекулярных механизмах формирования устойчивости М. tuberculosis к трем основным препаратам первого ряда противотуберкулезной терапии: рифампицину, изониазиду и этамбутолу. Эти данные использованы при разработке аналитического алгоритма регистрации генетических маркеров лекарственной устойчивости, представляющих собой точечные мутации в специфических локусах геномой ДНК микобактерии. Осуществлен дизайн праймерных систем для амплификации и реакции минисеквенирования 13 генетических локусов, изменения в которых ассоциированы с устойчивостью к этим противотуберкулезным препаратам.

С целью уменьшения себестоимости и повышения общей производительности анализа отработаны максимально универсальные условия проведения реакций амплификации и минисеквенирования, в цепочке последовательных технологических этапов существенно минимизировано

количество операций по переносу и разведению образцов, все процедуры приведены к формату 96-ти луночного планшета.

С использованием разработанных систем проведен комплексный анализ группы из 976 клинических штаммов М. tuberculosis, для каждого из которых был получен индивидуальный профиль из 11 генетических маркеров устойчивости к рифампицину и изониазиду [Ikryannikova et al., 2007; Афанасьев с соавт., 2007]. Для 285 клинических штаммов получены данные, включающие дополнительные генетические локусы, ассоциированные с устойчивостью к этамбутолу.

Проведен сравнительный анализ между профилем устойчивости штамма к противотуберкулезным препаратам и наличием и частотой встречаемости генетических маркеров устойчивости к ним.

В регионе, обуславливающем устойчивость к рифампицину (т.н. RRDR-регионе), гроВ-тет было выявлено семнадцать различных вариантов нуклеотидных замен в кодонах Ser513, Asp516, Ser522, His526, Ser531n Leu533, a так же один вариант инсерции между 514 и 515 кодонами. Среди 567 рифампицин-устойчивых штаммов эти мутации были обнаружены у 506 (89,2 %) штаммов. Замена TCG531—»TTG (Ser531—>Leu) пробладала; этот вариант был обнаружен у 371 (73,3 %; 371/506) штамма. Следующие по частоте встречаемости - замены в кодонах His526 (42 штамма) и Asp516 (42 штамма). Наиболее вариабельным оказался His526 кодон: в нем было выявлено пять различных вариантов однонуклеотидных замен.

Мутации в локусах, обуславливающих устойчивость к изониазиду (Ser315 кодон katG-гена и/или позиции -8 и -15 промоторной области mabA(fabG) -inhA оперона), были выявлены у 625 штаммов (91,4 % от числа всех штаммов, устойчивых к изониазиду). Большая часть штаммов - 511 (81,7%; 511/625) имела нуклеотидную замену AGC—>АСС (Ser—*Thr) в 315 кодоне katG-гена. У 101 штамма (16,1 %) мутации были обнаружены одновременно в 315 кодоне katG-гена и позициях -8 или -15 промоторной области mabA(fabG') - inhA оперона. У четырех штаммов был обнаружен новый, ранее не описанный, вариант нуклеотидной замены в -8 позиции (Т—>С).

Из 285 штаммов, для которых микробиологическими методами была определена устойчивость к этамбутолу, 117 имели нуклеотидные замены в Met306 и Gly406 кодонах етЬВ-гена. Всего в двух исследованных кодонах было

выявлено семь вариантов однонуклеотидных замен. Замены в Met306 кодоне преобладали - они были детектированы у 88 штаммов (79,2 %; 88/111). Среди мутаций в Gly406 у этамбутол-резистентных преобладал вариант GGC—»GCC (Gly—»Ala) - обнаружен у 14 штаммов. У шести штаммов, отнесенных методом абсолютных концентраций к этамбутол-чувствительным, были обнаружены мутации в Met306 (четыре штамма) и Gly406 (два штамма).

Результаты реакции минисеквенирования с последующей MALDI-ToF масс-спектрометрией были подтверждены прямым определением нуклеотидной последовательности ПЦР-фрагментов генов, включающих локусы - маркеры генетической устойчивости для 150 случайно выбранных штаммов.

Все варианты нуклеотидных замен, обнаруженных в исследуемой выборке, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Варианты нуклеотидных и аминокислотных замен, выявленных среди _нсследованных клинических штаммов М. tuberculosis1._

Колон

I Нуклеотидиая замена | Аминокислотная замена | Число штаммов (%)

Мутации в RRDR-регноне гроВ-гена

533

CTG - CCG

ТСО - TTG TCG - TGG

Ser-Leu Ser-Trp

САС - TAC САС - AAC САС - GAC САС - CGC САС - CTC

His-Туг His - Asn His - Asp His - Arg His - Leu

TCG-TTG

Ser - Leu

GAC - GTC GAC - GTA GAC - GGC GAC - TTC GAC - TAC

Asp - Val Asp-Val Asp-Gly Asp - Phe Asp - Туг

ins TTC

ins Phe

Gin-Pro

511

CTG-CCG

533 и 526

CTG - CCG и САС -AAC

Leu - Pro и His - Asn

533 и 516

CTG-CCG и GAC-GGC

Leu - Pro и Asp - Gly

531 и 526

TCG -TCG -TCG -TCG -TCG-TCG-TCO-

TTG и САС -TTG и САС -TTG и САС -TGG и САС-TGG и САС-TGG и САС ■ -TGGiiCAC

TAC GAC CGC CTC ТСС ACC AAC

Ser - Leu Ser-Leu Ser - Leu Ser - Trp Ser - Trp Ser - Trp Ser-Trp

и His - Туг и His - Asp и His - Arg и His - Leu и His - Ser и His - Thr и His - Asn

CAC-TAC и GAC-GTC

His - Туг и Asp - Val

516 и 511

GAC-GGC и CTG-CCG

Asp - Gly и Leu - Pro

Мутаций не обнаружено

Всего

Мутяции в 315 колоне Aa/fí-геня и промотроиой облясти/(/А(7-шА/1-опероня

КаЮЭ15 AGC - АСС AGC - АСА Ser - Thr Ser-Thr 509 (52,1) 2 (0,2)

KatG315 и inhA AGC-ACC и -15 С - T AGC - АСС и -8 Т - С AGC - АСС и -8 Т - А Ser-Thr Ser - Thr Ser-Thr 88 (9,0) 4 (0,4) 9 (0,9)

inhA -15 С -Т 13(1,3)

Мутаций не обнаружено 351 (36,0)

Всего 976

Мутяции в 306 и 406 кодонах етЬВ-геня

306 ATG - ATH2 ATG-GTG ATG - ACG Met-lie Met-Val Met - Thr 42(14,7) 48(16,8) 1 (0,4)

406 GGC-GCC GGC-AGC GGC-GAC GGC - TGC Gly - Ala Gly - Ser Gly - Asp Gly-Cys 16(5,6) 7 (2.4) 1 (0.4) 1 (0,4)

Мутаций не обнаружено 169 (59,3)

Всего 285

'Мутации в 306 и 406 кодонах стЬВ-гена определены для 285 клинических штаммов М tuberculosis, выделенных в Центральном ФО, ;Н - А, С или Т

Сравнительный анализ результатов фенотипического (метод абсолютных концентраций) и генетического анализа устойчивости к рифампицину и изониазиду представлен в таблице 3.

Генетические детерминанты устойчивости к рифампицину были обнаружены у 89,2 % (506/567) рифампицин-устойчивых штаммов: при этом частота встречаемости мутаций в RRDR-регионе гроВ-гена была значительно выше среди штаммов с МЛУ, чем среди штаммов, монорезистентных к рифампицину - 89,9 % и 64,3 %, соответственно(х2=9,31; р=0,0023).

Аналогичная закономерность наблюдалась и для изониазид-устойчивых штаммов - частота встречаемости мутаций в 315 кодоне katG-гена и/или inhA-промоторной области также была выше среди штаммов с МЛУ, чем среди монорезистентных штаммов - 93,6 % и 81,6 %, соответственно (%2= 19,32; р<0,0001), а в целом же генетические детерминанты устойчивости к изониазиду были обнаружены у 91,4 % (625/684) изониазид-устойчивых штаммов. Рифампицин- и изониазид-чувствительные штаммы мутаций в исследуемых локусах не имели. У 61 (10,7 %; 61/567) рифампицин-устойчивого и 59 (8,6 %; 59/684) изониазид-устойчивых штаммов изменений в соответствующих локусах также не обнаружено. Подобная закономерность наблюдалась и ранее [Wade et al., 2004] и может быть объяснена тем, что устойчивость этих штаммов М. tuberculosis обусловлена генетическими изменениями в других локусах генома и, возможно, реализуется за счет других, не известных пока механизмов.

Таблица 3. Сравнительный анализ результатов микробиологического и молекулярио-_генетического тестирования 976 клинических штаммов М. tuberculosis._

Генотип1, n (%)

rpoBnm гроВ,ш i katG mut rpoB „»,, katGmM inhAmn, kulG,m, inhA,M katG,ma rpoB„, inliA,„, inliAm[, WT3

С S н о S V © RIFr INHr (n=553) 11 (2 0) 397 (71 8) 81 (14 6) 1 (12) 24 (4 3) 8 (14) 1 (0 2) 24 (4 3)

RIFr INHs (n=14) 9 (64 3) 0 0 0 0 0 0 5 (35 7)

RIFs INIIr (n=131) 0 0 0 13 (9 9) 90 (68 7) 0 4 (3 0) 24 (18 0)

RIFs INHs (n=278) 0 0 0 0 0 0 0 278 (100)

' - 1роИт„ - выявлены мутации в ЮУЖ-регионе гроВ гена, каЮ тш - выявлены мутации в кодоне 8егЗ 15 ЫС гена,, шИАпнн - выявлены мутации в позициях -8 или -15 промоторной области/аЬ01 (пюЬА) - тИА оперона;

1 - устойчивость определялась методом абсолютных концентраций, RIFr - устойчивы к рифампииину, INHr -устойчивы к изониазиду

' - wild type (WT), мутаций в исследуемых локусах не обнаружено

В целом разработанная система продемонстрировала высокую диагностическую чувствительность, детектируя около 90% штаммов с МЛУ со 100% специфичность.

Наблюдаемый профиль мутаций среди рифампицин- и изониазид-устойчивых штаммов (преобладание замен в кодонах Ser351, His526 и Asp516 гроВ-гена и Ser315 katG-гена, соответственно) в целом достаточно характерен для многих регионов, как Российской Федерации [Gryadunov et al., 2005; Mikhailovich et al., 2001; Nikolayevsky et al., 2004], так и мира [Gegia et al., 2008; Hillemann et al., 2005; Zakerbostanabad et al., 2005].

В тоже время некоторые географические различия, регистрируемые в мире [Toungoussova et al., 2002; Tudo et al., 2004], вероятно, связаны с преобладанием в том или ином регионе штаммов М. tuberculosis, относящихся к разным генетическим семействам и циркулирующих внутри разных социальных групп человеческой популяции [Ignatova et al., 2006; Lipin et al., 2007].

В процессе сравнения частот встречаемости различных мутаций, ассоциированных с устойчивостью, в трех группах штаммов, выделенных в Центральном, Уральском и Западно-Сибирском регионах России были выявлены отличия как в частоте встречаемости мутаций в том или ином кодоне, так и в частоте встречаемости типа нуклеотидных замен в пределах одного кодона. Однако, для определения достоверности этих различий, их причин, и оценки возможности на основании полученных данных отслеживать

эпидемиологические особенности распространения штаммов, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, необходимо на протяжении нескольких лет осуществлять мониторинг выделяемых штаммов. Отметим лишь, что во всех регионах среди устойчивых штаммов преобладают мутации, приводящие к резистентности высокого уровня.

Сравнительный анализ результатов фенотипической и молекулярно-генетической характеристики выборки из 285 клинических штаммов М. tuberculosis, в которой исследовались генетические детерминанты

устойчивости к этамбутолу, представлен в таблице 4.

Таблица 4. Результаты микробиологического и молекулярно-генетичсского тестирования 285 штаммов М. tuberculosis.

Фенотип5 N (%) Генотип, N (%)

'wt 2rpoB 3katG/i nhA rpoB. katGI inhA rpoB\ 4embB katGhnhA , embB rpoB, kalG/m hA, embB

Чувствнтельн ый 43 (15,0) 43 (100,0) ■ - ■ ■ - -

RIFr 2 (0,7) - 2 (100,0) - - - - -

INHr 19 (6,7) 7 (36,8) - 11 (57,9) - - 1 (5,3) -

ЕМВг 3 (1,0) 3 (100,0) - - - -

RIFr INHr 15 (5,3) - - 1 (6,7) 9 (60,0) - 1 (6,7) 4 (26,6)

RIFr ЕМВг 1 (1,0) - 1 (100) - - - -

INHr ЕМВг 13 (4,6) 4 (30,7) - 6 (46,1) - - 3 (23,1) -

RIFr INHr ЕМВг 189 (66,3) 7 (3,7) - 3 (1,6) 71 (37,5) 2 (1,0) 8 (4,2) 98 (51,8)

Всего 285 64 (22,5) 3 (1,0) 21 (7,4) 80 (28,0) 2 (0,7) 13 (4,6) 102 (35,8)

' - wild type, отсутствие мутаций в проанализированных локусах 2 - выявлены мутации в RRDR гроВ гена,

' - выявлены мутации в кодоне Ser315 kalG гена н/или в позициях -8 или -15 промоторной области fabGl (mabA) - mhA оперона,

4 - выявлены мутации в Met306 или Gly406 кодонах етЬВ гена

5 - устойчивость определялась методом абсолютных концентраций, RIFr - устойчивы к рифампицину, INHr - устойчивы к изониазиду, ЕМВг - устойчивы к этамбутолу

На сегодняшний день данные о связи мутаций в етЬВ-геис с

устойчивостью к этамбутолу носят противоречивый характер. В ряде работ

показано, что мутации в этом гене могут встречаться и среди этамбутол-

чувствительных штаммов. В настоящее время этот вопрос окончательно не разрешен и убедительных объяснений наблюдаемых противоречий пока нет [Mokrousov et al., 2002; Plinke et al., 2006].

В выборке из 285 штаммов М. tuberculosis, для которых микробиологическими методами была определена чувствительность к этамбутолу, обнаружено 6 штаммов, имеющих мутации в етЬВ30в/406, но отнесенных методом абсолютных концентраций к этамбутол-чувствительным. Однако значение ингибирующей концентрации этамбутола для этих штаммов равнялось 2 мкг/мл (пороговое значение для метода абсолютных концентраций). Более того, у 50 штаммов с МИК этабутола < 1 мкг/мл и у оставшихся 24 штаммов с МИК этамбутола, равной 2 мкг/мл, мутаций в исследуемых локусах обнаружено не было. Можно предположить, что замены в 306 и 406 кодонах етЬВ-гена у этих штаммов привели к формированию умеренной (промежуточной) устойчивости. Поскольку современные микробиологические методы используют для определения устойчивости к этамбутолу разные критические концентрации препарата, варьирующие в диапазоне от 2 мкг/мл до 7,5 мкг/мл, существует возможность не совсем корректно идентифицировать мутантные штаммы с промежуточным уровнем устойчивости, как этамбутол-чувствительные. Необходимо учитывать возможность формирования у таких штаммов клинически значимой устойчивости, которая может привести к неэффективности проводимой терапии.

Частота встречаемости мутаций в 306 и 406 кодонах етЬВ-тта. среди этамбутол-резистентных штаммов, циркулирующих в Центральном регионе, показана относительно низкой - около 54 % (111/206). С учетом литературных данных, демонстрирующих широкий диапазон частот встречаемости этих нуклеотидных замен у этамбутол-резистентных штаммов - от 95,5 % (США [Parsons et al., 2005]) до 30,0 % (Кувейт [Ahmad et al., 2007]) - использование этих мутаций в качестве маркеров этамбутол-устойчивости в некоторых регионах мира, в том числе и в Центральном регионе Российской Федерации, может оказаться затруднительным и недостаточно эффективным.

Тем не менее, была установлена достоверная связи между частотой встречаемости мутаций в етЬВ306/406 и числом препаратов, к которым

фенотипически устойчив штамм (Таблица 5). В частности, мутации встречались достоверно чаще среди МЛУ-штаммов (113/204; 55,4 %), чем среди моноустойчивых и чувствительных (4/81; 4,9%) (х2 = 60,99; Р<0,0001).

Несмотря на низкую диагностическую чувствительность етЬВ306/406 локуса (около 55,4 %; 113/204) на фоне высокой специфичности (95,0 %; 77/81), была предпринята попытка оценить возможности использования данного генетического локуса в комбинации локусами гроВ и каIС/тйЛ-промоторной области для быстрой диагностики МЛУ. Такой подход позволил добиться увеличения диагностической чувствительности выявления МЛУ до 94,6 %.

Таблица 5. Частоты встречаемости мутаций в 306 и 406 кодоиах егпЬВ-гена в зависимости от профиля лекарственной устойчивости.

Фенотипическая устойчивость' Число штаммов Число штаммов с мутациями в етЬ306/406 (%) X2 Р

Чувствительные 43 0 референсная группа для сравнення

Устойчивые к одному препарату, RIF или INH или ЕМВ 24 1 (4,1 %) 1,8 0,1775

Устойчивые к двум препаратам, RIF.INH (МЛУ) или RIF.EMB или INH, ЕМВ 29 8 (27,5 %) 13,34 0,0003

Устойчивые к трем препаратам, RIF, INH и ЕМВ 189 108 (57,1 %) 45,97 <0,0001

Устойчивые к одному или более препаратов 242 117 (48,3 %) 35,27 <0,0001

'Устойчивость определена методом абсолютных концентраций. RIF - рифампицин, 1NH -изониазид, ЕМВ - этамбутол

Молекулярное типирование клинических штаммов М. tuberculosis и оценка гетерогенности популяции.

VNTR-анализ. Для 115 штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных легочным туберкулезом в Москве и Московской области, установлено число тандемных повторов в 24 описанных ранее VNTR-локусах (MIRU-2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40; ETR-A, В, С; Mtub-04, 21, 29, 30, 34, 39; QUB-1 Ib, 26, 4156). Таким образом, для каждого штамма был получен аллельный профиль, представленный набором аллельных вариантов по всем 24 локусам,

где номер аллельного варианта соответствовал числу тандемных повторов в данном локусе.

Из обнаруженных различных VNTR-профилей (п=71) 59 (83,0 %) были уникальными (встречались только у одного штамма в выборке).

Оставшиеся штаммы были объединены в 12 кластеров (от 2 до 13 штаммов): из них три наиболее крупных, включающих 13 (11,3 %), 12 (10,4 %) и 9 (7,8 %) штаммов, имели VNTR-профили 223325173533424454433672, 223325153533424454433682 и 22332513533424454433662, соответственно.

Значение дискриминирующего индекса Хантера-Гастона (HGD1), рассчитанное на основании анализа аллельного полиморфизма 24 локусов, составило 0,968, что демонстрирует достаточно высокую разрешающую способность метода VNTR-типирования по 24 локусам.

Анализ аллельного полиморфизма каждого из 24 локусов в отдельности продемонстрировал разную степень изменчивости исследованных локусов. Семь локусов - MIRU-4, MIRU-20, MIRU-23, MIRU-27, ETR-B, М tub29 и М tub34 - были практически мономорфны (0< h <0,1). Локус MIRU-24 был абсолютно не вариабелен - все штаммы, попавшие в нашу выборку, имели один и тот же аллельный вариант. Шесть локусов - MIRU-26, MIRU-31, ETR-A, М tub21, QUB-llb и QUB-26 - отличались наибольшим полиморфизмом (И > 0,5). Самый большой полиморфизм наблюдался по локусу QUB-llb (h = 0,74). Изменчивость остальных локусов варьировала в диапазоне от 0,11 (локус QUB-4156) до 0,48 (локусы MIRU-40 и М tub04). Сполиготипирование.

Определена структура DR-региона для 115 штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных легочным туберкулезом в Москве и Московской области, осуществлено сравнение полученных гибридизационных паттернов с представленными в базах данных SITVIT и SpolDB4. На основании проведенного сравнительного анализа каждому штамму присвоен соответствующий номер SIT и определен тип генетического семейства, к которому относится данный штамм.

Всего выявлено 20 генотипов, входящих в состав 15 генетических семейств. Шесть обнаруженных в нашей выборке генотипов (шесть штаммов) в имеющихся базах данных не представлены.

На основании результатов сполиготипирования было выделено семь кластеров, содержащих от 2 до 73 штаммов, имеющих идентичный номер SIT. Восемнадцать штаммов (включая шесть штаммов с ранее не описанными сполиготипами) имели уникальные сполиготипы.

Наибольший кластер - 76 (66,0 %) штаммов - был образован штаммами, относящимися к семейству Beijing. Гораздо меньше штаммов входило в состав двух следующих по величине семейств - LAM и Т - 12 (10,4 %) и 10 (8,7 %) штаммов, соответственно.

В целом, разрешающая способность метода сполиготипирования оказалась весьма низкой (HGDI=0,591), особенно для штаммов семейства Beijing. Сравнительный анализ использованных методов и их комбинаций представлен в таблице 6. При этом рассматривались разные варианты VNTR анализа - традиционный по 12 локусам, расширенный - 24 локуса, и редуцированный, включающий шесть наиболее полиморфных для данной выборки локусов.

Таблица 6. Сравнительный анализ использованных методов молекулярно-генетического типирования клинических штаммов М. tuberculosis н оценка их _ дискриминирующей способности._

Метод, исследуемая Общее Число Число Размеры Значение

группа штаммов число уникальных кластеров кластеризов HGDI

генотипов генотипов1 анных групп

Сполиготипирование

Все штаммы 26 19 7 2-73 0.591

Штаммы семейства

Beijing 3 1 2 2-73 0 077

Штаммы, не

относящиеся к 23 18 5 2-8 0 935

семейству Beipng

VNTR-анализ, все

штаммы

24-VNTR2 71 59 12 2-13 0 968

12-MIRU-VNTR3 48 36 12 2-27 0 900

6-VNTR4 49 36 13 2-20 0 940

Сполиго+24-VNTR

Все штаммы 74 63 11 2-13 0 973

Штаммы семейства 36 26 10 2-13 0 953

Beijing

Сполиго+12- VNTR

Все штаммы 53 42 11 2-25 0 913

Штаммы семейства 17 11 8 2-25 0 801

Beijing

Сполиго+6-VNTR

Все штаммы 56 44 12 2-20 0.945

Штаммы семейства 22 14 8 2-20 0 880

Beijing

Уникальный генотип - генотип, представленный в исследуемой выборке одним штаммом 2 24-VNTR - типирование с использованием 24 локусов MIRU-2,4, 10, 16,20,23, 24, 26, 27, 31,39, 40, ETR-A, В, С, Mtub-04, 21, 29, 30,34, 39, QUB-llb, 26,4156

112-M1RU-VNTR-типирование с использованием 12 локусов MIRU MIRU-2,4, 10,16,20,23,24,26, 27,31,39, 40

4 6-VNTR - типирование с использованием шести наиболее полиморфных локусов MIRU-26, MIRU-31, ETR-A, М tub21, QUB-llb и QUB-26

Очевидно, что максимальная разрешающая способность (даже в пределах семейства Beijing) достигается при сочетанном использовании метода сполиготипирования с VNTR-анализом по 24 локусам. Эта комбинация может рассматриваться как наиболее эффективный инструмент молекулярно-генетического типирования и длительного эпидемиологического мониторинга туберкулезной инфекции.

Рассмотренная нами комбинация из шести наиболее вариабельных VNTR-локусов, за счет возможной генетической нестабильности и гипервариабельности, не отвечает в полной мере задачам длительного молекулярно-эпидемиологического мониторинга. В то же время, за счет уменьшения объема работы, при сохранении высокой дискриминирующей способности, этот подход может использоваться для эпидемиологического исследования локальных вспышек, позволяя в кратчайшие сроки и с минимальными затратами исследовать эпидемический процесс и принимать меры по предотвращению распространения туберкулезной инфекции в человеческой популяции.

В целом, популяция М. tuberculosis Московского региона оказалась весьма гетерогенна. Выявленное распределение по генотипам (с преобладанием генотипа Beijing) характерно для Российской Федерации. При этом обнаружена значимая связь МЛУ с Beijing-генотипом; МЛУ-штаммы встречались достоверно чаще среди семейства Beijing (59/76; 77,6 %), чем среди штаммов других семейств (17/39; 43,6 %) (х2 = 13,3; р= 0,0003). Также генетические детерминанты МЛУ достоверно чаще обнаруживались среди штаммов Beijing, чем среди штаммов других семейств (х2 = 4,87; р= 0,0274).

Таким образом, очевидно, что штаммы семейства Beijing играют ведущую роль в распространении МЛУ М. tuberculosis в Московском регионе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокий уровень заболеваемости туберкулезом, сохраняющийся в Российской Федерации обусловлен множеством факторов. Одним из важнейших условий продолжающегося распространения туберкулезной инфекции является неэффективность терапии, связанная с появлением и широкой диссеминацией в человеческой популяции лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя. Кроме того, слабо развитая в Российской Федерации система эпидемиологического мониторинга не позволяет разрабатывать и реализовывать системные эпидемиологические мероприятия, направленные на предотвращение распространения туберкулезной инфекции (в т.ч. и устойчивых форм) среди населения. Очевидно, что разработка и применение методов молекулярного типирования штаммов М. tuberculosis для российской популяции возбудителя весьма актуальная задача, которая может иметь важное практическое клинико-микробиологическое и эпидемиологическое значение.

В настоящей работе предложен комплексный подход оценки клинически и эпидемиологически значимых свойств возбудителя, основанный на изучении особенностей структурной организации геномной ДНК М. tuberculosis.

В ходе апробации разработанных методик проанализировано региональное распространение среди штаммов М. tuberculosis детерминант устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Показана возможность использования для скрининга МЛУ-штаммов М. tuberculosis высокопроизводительной системы генетического анализа, основывающейся на технологии минисеквенирования с последующей MALDI-ToF - масс-спектрометрией.

Разработанная нами высокоинформативная производительная система генетического скрининга лекарственной устойчивости М. tuberculosis нашла практическое применение в рамках выполнения Государственного Контракта № 06/365 от 15 марта 2006 г. на проведение работы по теме «Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Российской Федерации с использованием технологии масс-спектрометрии».

противотуберкулезным препаратам в Московском регионе. Нами изучены и показаны возможности этих методов молекулярно-генетического анализа, взаимодополняющих и компенсирующих недостатки друг друга, для решения задач клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулеза.

Результаты представленной работы способствуют осуществлению на территории Российской Федерации мониторинга туберкулезной инфекции на современном методологическом и техническом уровне.

ВЫВОДЫ

1. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК 976 клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных легочным туберкулезом из более чем 12 субъектов Российской Федерации, входящих в состав трех Федеральных округов: Центрального, Уральского и Сибирского.

2. На основе MALDI-ToF масс-спектрометрического анализа нуклеиновых кислот, являющихся продуктами специфической ферментативной реакции минисеквенирования, разработан и реализован подход обнаружения лекарственно-устойчивого туберкулеза, в том числе МЛУ с точностью 90 %.

3. Тестирование генетических изменений в 306 и 406 кодонах гена арабинозилтрансферазы, обнаруженных у 54 % этамбутол-устойчивых штаммов, повышает эффективность выявления МЛУ до 95 %, однако не может служить маркером устойчивости к этамбутолу.

4. Показана высокая дискриминирующая способность молекулярного типирования туберкулеза на основании анализа числа тандемных повторов в структуре геномной ДНК (D=0,973), в том числе для штаммов, относящихся к одному генетическому семейству (D=0,953).

5. Изменения в геномной ДНК, обуславливающие формирование МЛУ фенотипа, обнаружены в исследованной выборке клинических штаммов М tuberculosis с высокой частотой (49,8 %), с преобладанием мутаций, приводящих к устойчивости высокого уровня к рифампицину и изониазиду.

6. Впервые для выборки клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от пациентов, постоянно проживающих в Москве и Московской области, показано биологическое разнообразие со значительным преобладанием штаммов, относящихся к семейству Beijing (66,0 %), и продемонстрирована

ведущая роль штаммов этого семейства в распространении МЛУ в Московском регионе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Afanas'ev М., Ikryannikova L., Il'ina Е., Sidorenko S.V., Kuz'min A.V., Larionova E.E., Smirnova T.G., Chernousova L.N., Kamaev E.Y., Skorniakov S.N., Kinsht V.N., Cherednichenko A.G., Govorun V.M. Molecular characteristics of rifampicin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation// J. Antimicrob. Chemother. -2007. -Vol. 59. -P. 1057-1064.

2. Ikryannikova L., Afanas'ev M., Akopian T.., Il'ina E.N., Kuz'min A.V., Larionova E.E., Smirnova T.G., Chernousova L.N., Govorun V.M. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis!I J. Microbiol. Methods. -2007. -Vol. 70 (3). -P. 395-405.

3. Афанасьев M.B., Икрянникова Л. H., Ильина Е. Н., Смирнова Т. Г., Ларионова Е. Е., Кузьмин А. В., Черноусова Л. Н., Камаев Е. Ю., Скорняков С. Н., Киншт В. Н., Чередниченко А. Г., Говорун В. М. Применение реакции мини-секвенирования с последующим MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом для оценки устойчивости к рифампицину и изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis!'/ Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2007. -№7. -С. 37-42.

4. Ikryannikova L.N., M.V. Afanas'ev, E.N. Ilina, V.M.Govorun. Rapid detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis using maldi-tof mass-spectrometry based minisequencing method// In the International conference «Development of new generation anti-tuberculosis therapeutic agents. Problems, approaches, perspectives», Abstracts book. -2006. - P. 32.

5. Ilina E.N., L.N. Ikryannikova, V.A. Vereshchagin M. V. Afanas'ev. The universal high-throughput technology platform based on MALDI TOF MS as a tool for microbial typing// In the 3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine" Abstracts. -2006, p. 60

6. Govorun V. M., E. N. Il'ina, M. V. Afanas'ev, L. N. Ikryannikova. MALDI-ToF mass-spectrometry based minisequencing method for rapid detection

Mycobacterim tuberculosis resistance to rifampicin, isoniazid and ethambutol// In 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry, 2007.

7. Afanas'ev M.V., E. N. Il'ina, T. G. Smirnova, E. E. Larionova, A. V. Kuz'min, S.N. Andreevskaya, L. N. Chernousova and V. M. Govorun. Genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Central region of Russia by VNTR-M1RU genotyping// In 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Clinical Microbiology and Infection, -2008.-Vol. 14. -P. S1-S815.

8. Afanas'ev M. V., E. N. Il'ina, T. G. Smirnova, E. E. Larionova, A. V. Kuz'min, S. N. Andreevskaya, L. N. Chernousova and V. M. Govorun. Prevalence of drug-resistance associated mutations for Mycobacterium tuberculosis strains circulated in Russia// In 39th Union World Conference on Lung Health, Abstracts book. -Paris, 2008.

Список использованных сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

дцНТФ - дидезоксинуклеотидтрифосфат

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость (англ. MDR - Multi-Drug

Resistance)

п.о. - пар оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

MALDI-TOF масс-спектрометрия - времяпролётная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass-Spectrometry)

MIRU - Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (Микобактериальные

рассеянные повторяющиеся единицы)

ETR - Exact Tandem Repeats (Точные тандемные повторы)

VNTR - Variable Number of Tandem Repeats (полиморфизм числа тандемных

повторов)

QUB - Queen University of Belfast (Королевский Университет Белфаста)

/ A v

Заказ № 98/11/08 Подписано в печать 12 11.2008 Тираж 90 экз Уел пл 1,5

. . . ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 "/><> '! ' www.cfr.ru; е-таИ:'т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Афанасьев, Максим Владимирович

Список используемых сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Общая характеристика Mycobacterium tuberculosis.

1.2 Туберкулезная инфекция 16 1.2.1 Основные факторы патогенности и патогенез туберкулеза.

1.2.2. Эпидемиология туберкулеза

1.2.3. Лечение туберкулеза

1.3. Лекарственная устойчивость М. tuberculosis

1.3.1. Формирование устойчивости к различным противотуберкулезным препаратам

1.3.2. Методы оценки лекарственной устойчивости М. tuberculosis

1.4. Современные подходы молекулярно-генетического и эпидемиологического типирования популяции М. tuberculosis

1.5. Общие замечания

2 Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы

2.1.1 Определение устойчивости штаммов

М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам

2.2 Генетический анализ

2.2.1. Выделение ДНК

2.2.2. Амплификация фрагментов геномаМ tuberculosis

2.2.3. Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа

2.2.4. Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции

2.2.5. Секвенирование и анализ фрагментов генома

2.2.6. Анализ числа тандемных повторов в геноме (VNTR-типирование)

2.2.7. Сполиготипирование

2.3. Анализ данных

3 Результаты

3.1. Коллекция образцов клинических штаммов М tuberculosis

3.2. Определение устойчивости к рифампицину, изониазиду, этамбутолу

3.3. Анализ генетических маркеров устойчивости М. tuberculosis

3.4. Типирование клинических штаммов М. tuberculosis и оценка гетерогенности популяции

3.4.1. VNTR-типирование

3.4.2. Сполиготипирование 90 4. Обсуждение

4.1. Коллекция образцов клинических штаммов М. tuberculosis

4.2. Определение устойчивости к рифампицину, изониазиду, этамбутолу

4.3. Анализ генетических маркеров устойчивости М tuberculosis

4.3.1. Генетические маркеры устойчивости к рифампицину и изониазиду

4.3.2. Генетические маркеры устойчивости к этамбутолу

4.4. Типирование клинических штаммов М. tuberculosis и оценка гетерогенности популяции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis"

Последние десятилетия XX века и первые годы XXI характеризовались неуклонным ростом заболеваемости туберкулезом во многих странах мира, независимо от их экономического статуса и социального уровня жизни. Так, например, в 2004 году в мире было выявлено 9 миллионов новых случаев активного туберкулеза, около 2 миллионов ранее выявленных больных погибли. По предварительным оценкам каждый третий житель нашей планеты является инфицированным. Наиболее неблагополучно ситуация складывается в Юго-Восточной Азии и Африке (государства, расположенные южнее Сахары): эти регионы лидируют как по абсолютному числу больных и инфицированных лиц, так и по относительному показателю заболеваемости (300 человек и более на 100 тыс. населения). В мире в целом, среди причин смертности от инфекционных заболеваний, туберкулез занимает лидирующие позиции [191].

В Российской Федерации туберкулез также является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения и социального развития страны. Только за последний период общая заболеваемость туберкулезом легких увеличилась с 56,6 вновь выявленных случаев на 100 000 населения в 1997 году до 83,2 в 2003 [6].

В настоящее время можно говорить о наметившейся тенденции к стабилизации, но заболеваемость, в том числе и детская, продолжает оставаться на высоком уровне (Рис. 1 и 2).

Такое положение дел во многом связано с трудной экономической ситуацией в 1991 - 2000 гг., обусловившей ухудшение условий жизни, наличием большого резервуара инфекции в учреждениях пенитенциарной системы, интенсивными миграционными потоками населения, ростом числа ВИЧ-инфицированных, а так же со снижением уровня организации эффективной системы противотуберкулезной помощи населению [126, 171].

Рисунок 1. Динамика общей заболеваемости туберкулезом в Российской Федерации (1997-2006 гг.) (по данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии

Роспотребнадзора)

100 80 60 40 20 0

90,3

56,6

60,9

73,44

1997 1998 2000 2002 2003 2004 2005 и Общая заболеваемость туберкулезом (на 100 тыс. населения)

2006

Рисунок 2. Динамика заболеваемости туберкулезом легких в Российской Федерации среди детей и подростков до 14 лет (1998-2006 гг.) (по данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора)

Особую и весьма значительную роль в обострении ситуации с туберкулезом играет появление и все большее распространение штаммов микобактерий, устойчивых к лекарственным препаратам. Наибольшую опасность представляют штаммы М. tuberculosis, обладающие множественной лекарственной устойчивостью (т.н. Multi-Drug Resistant, MDR - т.е., устойчивые к двум основным противотуберкулезным препаратам: рифампицину и изониазиду) или широкой лекарственной устойчивостью (т.н. Extensively Drug-Resistant, XDR - т.е., устойчивые к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам и одному из инъекционных противотуберкулезных препаратов второй группы или XXDR - т.е., устойчивые ко всем существующим на сегодняшний день препаратам). По некоторым данным, в мире около 4% случаев туберкулеза вызываются MDR-штаммами, а среди ранее леченных больных частота выявления MDR-штаммов доходит до 40% [208]. XDR-штаммы распространены пока не столь широко, однако в мире наблюдается устойчивая тенденция их распространения. Таким образом, в недалеком будущем современная медицина, лишенная эффективных химиотерапевтических средств, воздействующих на микобактерии, может оказаться безоружна перед лицом возрастающей угрозы повсеместного распространения устойчивых штаммов М. tuberculosis.

Очевидно, что в сложившейся ситуации весьма актуальны исследования, направленные на решение проблемы быстрой диагностики заболевания, своевременного выявления устойчивых форм, а так же на проведение адекватных противоэпидемических мероприятий, ориентированных на предупреждение распространения штаммов микобактерий (в том числе и устойчивых) в человеческой популяции.

Большие перспективы и возможности в этом направлении открывают современные достижения молекулярной биологии. На их основе в настоящее время активно разрабатываются и внедряются в клиническую практику новые молекулярно-генетические методы, позволяющие осуществлять быструю диагностику туберкулеза, характеризовать как отдельные штаммы М. tuberculosis, так и целые популяции.

Необходимо отметить, что применяемые на сегодняшний день микробиологические методы выявления и характеристики микобактерий, являясь основными методами диагностики туберкулеза, весьма трудоемки, дороги, плохо стандартизуемы и занимают в исполнении от 3 недель до 3 месяцев [4]. Такое положение дел существенно снижает диагностическую ценность проводимых исследований, увеличивает сроки постановки и подтверждения диагноза, приводит к позднему выявлению больных -активных бактериовыделителей, вынуждает врачей эмпирически назначать противотуберкулезную терапию и не позволяет проводить своевременную коррекцию лечения в случае развития устойчивости. Таким образом, чрезвычайно актуальными преимуществами молекулярно-генетических методов диагностики и характеристики туберкулеза является высокая, по сравнению с классическими микробиологическими методами, скорость получения результатов тестирования, большая чувствительность и информативность анализа. Использование молекулярно-генетических подходов для обнаружения генетических детерминант устойчивости М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам позволяет своевременно выявлять устойчивые штаммы и на основе полученной информации подбирать индивидуальную схему противотуберкулезной терапии для конкретного больного, с учетом профиля лекарственной устойчивости.

В то же время необходимо учитывать, что генетические методы не обладают 100 % чувствительностью, т.е., не способны выявлять все резистентные штаммы по причине разнообразия механизмов устойчивости. Поэтому очевидна необходимость дальнейшего изучения как возможностей использования для диагностики устойчивости уже известных генетических детерминант, так и поиск новых механизмов устойчивости и сопряженных с ними генетических изменений.

Для разработки и реализации эффективных превентивных мероприятий, направленных на предупреждение распространения инфекции и, особенно, устойчивых к терапии форм туберкулеза в человеческой популяции все шире используются современные молекулярно-генетические методы эпидемиологического типирования. Помимо фундаментальных научных задач, посвященных изучению генетической неоднородности микробной популяции, пластичности генома, происхождения и эволюции патогена, молекулярно-генетическое типирование позволяет решать целый ряд прикладных медицинских вопросов, таких, например, как эпидемиологический мониторинг чувствительных и устойчивых штаммов, изучение динамики и закономерностей распространения туберкулеза, как в популяции в целом, так и среди определенных групп населения. Появляется возможность планирования и эффективного управления материальными и кадровыми ресурсами (необходимые объемы иммунизации, запасы лекарственных средств, обеспеченность медицинским персоналом и специализированными медицинскими учреждениями), а так же быстрой оценки эффективности проводимых профилактических мероприятий. Получение однозначных результатов, вне зависимости от места и времени выполнения молекулярно-эпидемиологического анализа, перевод данных в цифровой формат, создание открытых общедоступных информационных баз дают возможность исследователям, врачам и организаторам здравоохранения сравнивать собственные результаты с данными других лабораторных центров и клиник и прилагать консолидированные усилия, направленные на борьбу с туберкулезом.

К сожалению, необходимо отметить, что в Российской Федерации единая система эпидемиологического типирования клинических штаммов М. tuberculosis фактически отсутствует, не существует национальной системы мониторинга распространения устойчивости, а информация о региональных особенностях лекарственной устойчивости крайне скудна, разрознена и зачастую неактуальна, поскольку носит ретроспективный характер.

Кроме того, необходимо обязательно учитывать тот факт, что, несмотря на большое количество существующих на сегодняшний день подходов молекулярно-генетического анализа, универсальных методов, отвечающих всем потребностям современной клинической микробиологии, не существует. Учет недостатков и ограничений этих методов при их использовании должны являться неотъемлемой частью научно-исследовательской и практической лабораторной работы.

Таким образом, разработка и адаптация методов молекулярного типирования туберкулеза и использование этих методов, с учетом их возможностей и ограничений, для комплексной характеристики популяции М. tuberculosis, циркулирующей на территории Российской Федерации, представляются весьма актуальными задачами, решение которых подразумевает как фундаментальные, так и прикладные медицинские аспекты исследования.

Целью настоящей работы являлась разработка и сравнительный анализ различных методов молекулярно-генетического типирования М. tuberculosis и их использование для характеристики популяции возбудителя, распространённой на территории Российской Федерации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Формирование коллекции образцов ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации.

2. Разработка системы комплексной оценки лекарственной устойчивости М. tuberculosis на основе знаний о генетических механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.

3. Разработка системы комплексной оценки молекулярно-генетического разнообразия штаммов М. tuberculosis, включающей типирование возбудителя с использованием технологии VNTR-анализа и сполиготипирования.

2) анализ структуры и оценка молекулярно-генетической гетерогенности исследуемой популяции М. tuberculosis.

1 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Афанасьев, Максим Владимирович

Выводы

5. Изменения в геномной ДНК, обуславливающие формирование МЛУ фенотипа, обнаружены в исследованной выборке клинических штаммов М. tuberculosis с высокой частотой (49,8 %), с преобладанием мутаций, приводящих к устойчивости высокого уровня к рифампицину и изониазиду.

5 Заключение

Высокий уровень заболеваемости туберкулезом, сохраняющийся в Российской Федерации обусловлен множеством факторов. Одним из важнейших условий продолжающегося распространения туберкулезной инфекции является неэффективность терапии, связанная с появлением и широкой диссеминацией в человеческой популяции лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя. Кроме того, отсутствие в Российской Федерации системы эпидемиологического мониторинга не позволяет разрабатывать и реализовывать системные эпидемиологические мероприятия, направленные на предотвращение распространения туберкулезной инфекции (в т.ч. и устойчивых форм) среди населения. Очевидно, что разработка и применение методов молекулярного типирования штаммов М. tuberculosis для российской популяции возбудителя весьма актуальная задача, которая может иметь важное практическое клинико-микробиологическое и эпидемиологическое значение.

В настоящей работе нами предложен комплексный подход оценки клинически и эпидемиологически значимых свойств возбудителя, который апробирован на большой выборке клинических штаммов М. tuberculosis.

Так же было проанализировано региональное распространение среди штаммов М. tuberculosis детерминант устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Показана возможность использования для скрининга MDR-штаммов М. tuberculosis высокопроизводительной системы генетического анализа, основывающейся на технологии минисеквенирования с последующей MALDI-ToF — масс-спектрометрией.

При помощи двух методов - VNTR-анализа и сполиготипирования -получены обновленные данные по молекулярно-генетическому разнообразию клинических штаммов М. tuberculosis, оценен вклад тех или иных генотипов в формирование и распространение устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам в Московском регионе. Нами изучены и показаны возможности этих методов молекулярно-генетического анализа, взаимодополняющих и компенсирующих недостатки друг друга, для решения задач клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афанасьев, Максим Владимирович, Москва

1. Голышевская В.И. Ускоренный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза/ Методические рекомендации. 2003г.

2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И.Покровский, О.К.Поздеев. -М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 1200 с.

3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология/ Гл. ред. А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. СПб.: СпецЛит, 2002. - 591 с.

4. Министерство здравоохранения РФ. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.// Приказ № 109 от 21 марта 2003 г.

5. Мишин В.Ю. Лекарственно-устойчивый туберкулез легких.//Учебное пособие для врачей. М.: ГОУ ВПО МГМСУ - 2005. - 142 с.

6. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2003 году.// Государственный доклад. — М. Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2004. 240 с.

7. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2006 году/ Государственный доклад. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. - 360 с.

8. Определитель бактерий Берджи/ Гл. ред. Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит. М: Мир, 1997.-317 с.

9. Туберкулез. Руководство для врачей/ Ред. А.Г. Хоменко. М: Медицина, 1996.-496 с.

10. Mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation// J. Antimicrob. Chemother. -2007. -Vol. 59. -P. 1057-1064.

11. Ahmad S., Jaber A.A., Mokaddas E. Frequency of embB codon 306 mutations in ethambutol-susceptible and -resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Kuwait// Tuberculosis. -2007. -Vol. 87. -P. 123— 129.

12. Ahmad S., Mokaddas E., Jaber A.-A. Rapid detection of ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by PCR-RFLP targeting embB codons 306 and 497 and iniA codon 501 mutations// Mol. Cell. Probes. -2004. -Vol. 18. -P. 299-306.

13. Allix~Beguec C., P. Supply, and M. Fauville-Dufaux. Utility of fast mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat genotyping in clinical mycobacteriological analysis// Clin. Infect. Dis. -2004. -Vol. 39. -P. 783-789.

14. Banerjee A., E. Dubnau, A. Quemard, V. Balasubramanian, S. K. Um, T. Wilson, D. Collins, G. De Lisle & W. R. Jacobs. inhA, a gene encoding atarget for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis!7 Science. -1994. -Vol. 263. -P. 227-230.

15. Baneijee, A., M. Sugantino, J. C. Sacchettini & W. R. Jacobs. The mabA gene from the inhA operon of Mycobacterium tuberculosis encodes a 3-ketoacyl reductase that fails to confer isoniazid resistance// Microbiol. -1998. -Vol. 144. -P. 2697-704.

16. Bifani P. J., B. Mathema, N. E. Kurepina and B. N. Kreiswirth. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains// Trend. Microbiol. -2002. -Vol. 10(1). -P. 45 52.

17. Brennan P.J. The envelope of Mycobacteria// Ann. Rev. Biochem. -1995. -Vol. 62. -P. 29-6321a. Brosch R., S. V. Gordon, M. Marmiesse, P. Brodin, C. Buchrieser, K.

18. Eiglmeier, T. Gamier, C. Gutierrez, G. Hewinson, K. Kremer, L. M. Parsons,

19. A. S. Pym, S. Samper, D. van Soolingen, and S. T. Cole. A new evolutionaryscenario for the Mycobacterium tuberculosis complex// PNAS. -2002. -Vol 99.-P. 3684-3689.

20. Brudey K., J. R. Driscoll, L. Rigouts, W. M. Prodinger, A. Gori, S. A. Al-Hajoj, C. Allix, L. Aristimuno, J. Arora, V. Baumanis, L. Binder, P.

21. Caminero J. A. Treatment of multidrug-resistant tuberculosis: evidence and controversies// Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2006. -Vol. 10(8). -P. 829-837.

22. Camus J.-C., M. J. Pryor., Medigue C. and S. T. Cole. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv// Microbiology. -2002. -Vol. 148. -P. 2967-2973.

23. CDC. Anon. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs—worldwide, 2000-2004// Morb. Mortal. Wkly. Rep. -2006. -Vol. 55. -P. 301-05.

24. CDC. Notice to Readers: Revised Definition of Extensively Drug-Resistant Tuberculosis// Morb. Mortal. Wkly. Rep. -2006. -Vol. 55(43). -P. 1176.

25. CDC. Treatment of Tuberculosis, American Thoracic Society, CDC, and Infectious Diseases Society of America// Morb. Mortal. Wkly. Rep. -2003. -Vol. 52(11).-P. 26.

26. Chan J., X. Ran, S. W. Hunter, P. J. Brennan, and B. R. Bloom. Lipoarabinomannan, a possible virulence factor involved in persistence of Mycobacterium tuberculosis within macrophages// Infect. Immun. -1991. — Vol. 59.-P. 1755-1761.

27. Chouchane S., I. Lippai & R. S. Magliozzo. Catalaseperoxidase {Mycobacterium tuberculosis KatG) catalysis and isoniazid activation// Biochemistry. -2000. -Vol. 39. -P. 9975-9983.

28. Cohn D. L., Bustreo F., Raviglione M. C. Drug-resistant tuberculosis: review of the worldwide situation and the WHO/IUATLD global surveillance project// Clin. Infect. Dis. -1997. -Vol. 24. -P. S121-S130.

29. Collins D. M. In search of tuberculosis virulence genes// Trends Microbiol. -1996. -Vol. 4. -P. 426^130.

30. Cooksey R., Morlock G., Glickman S. Evaluation of a line probe assay kit for characterization of rpoB mutations in rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from New York City// J. Clin. Microbiol. -1997. -Vol. 35.-P. 1281-3.

31. Crofton J. and D. A. Mitchison. Streptomycin Resistance in Pulmonary Tuberculosis// Br. Med. J. -1948. -Vol. 2(4588). -P. 1009-1015.

32. Crowle A. J., Sbarbaro J. A., May M. H. Inhibition by pyrazinamide of tubercle bacilli within cultured human macrophages// Am. Rev. Respir. Dis. -1986.-Vol. 134.-P. 1052-1055.

33. De Cock, K. & Chaisson, R. Will DOTS do it? A reappraisal of tuberculosis control in countries with high rates of HIV infection// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1999. -Vol. 3. -P. 457-465.

34. Dickinson J.M., Mitchison D.A. Experimental models to explain the high sterilizing activity of rifampin in the chemotherapy of tuberculosis// Am. Rev. Respir. Dis. -1981. -Vol. 123. -P. 367-371.

35. Drlica K. & M. Malik. Fluoroquinolones: action and resistance// Curr. Top. Med. Chem. -2003. -Vol. 3. -P. 249-82.

36. Dubnau E., P. Fontan, R. Manganelli, S. Soares-Appel, and I. Smith. Mycobacterium tuberculosis genes induced during infection of human macrophages// Infect. Immun. -2002. -Vol. 70. -P. 2787-2795.

37. East African/ British Medical Research Councils. Controlled clinical trial of short-course (6-month) regimens of chemotherapy for treatment of pulmonary tuberculosis//Lancet. -1972. -Vol. 1. -P. 1079-85.

38. Escribano I., Rodríguez J.C., Llorca B., García-Pachón E., Ruiz M., Royo G. Importance of the Efflux Pump Systems in the Resistance of Mycobacterium tuberculosis to Fluoroquinolones and Linezolid// Chemother. -2007. -Vol. 53.-P. 397-401.

39. Falkinham J. O. and J. T. Crawford. Plasmids, p. 185 199, In Bloom, B. R. (ed). Tuberculosis: Pathogenesis, Protection, and Control. American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1994.

40. Farmer PE, Kim J.Y. Community-based approaches to the control of multidrug-resistant tuberculosis: introducing "DOTS-plus."// British Med. J. -1998.-Vol. 317.-P. 671-674.

41. Feng W., C. Huan, R. Perng. Increasing Drug Resistance of Mycobacterium tuberculosis Isolates in a Medical Center in Northern Taiwan// J. Formos. Med. Assoc. -2008. -Vol. 107(3). -P. 259-264.

42. Fox W., Ellard G.A., Mitchison D.A. Studies on the treatment of tuberculosis undertaken by the British Medical Research Council Tuberculosis Units, 1946-1986, with relevant subsequent publications// Int. J. Tuber. Lung Dis. -1999. -Vol. 3. -P. S231-79.

43. Frothingham R., Meeker-O'Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats// Microbiol. -1998. -Vol. 144. -P. 1189-1196.

44. Gagneux S., P.M. Small. Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development// Lancet Infect. Dis. -2007. -Vol. 7. -P. 328-37.

45. Gale, E. F., E. Cundliffe, P. E. Reynolds, M. H. Richmond, and M. J. Waring. 1981. The molecular basis of antibiotic action. John Wiley & Sons, Inc., New York.

46. Gangadharam P. R., P. F. Pratt, V. K. Perumal & M. D. Iseman. The effects of exposure time, drug concentration, and temperature on the activity of ethambutol versus Mycobacterium tuberculosis// Am. Rev. Respir. Dis. -1990.-Vol. 141.-P. 1478-82.

47. Garvin R. T., D. K. Biswas & L. Gorini. The effects of streptomycin or dihydrostreptomycin binding to 16S rRNA or to 30S ribosomal subunits// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974. -Vol. 71. -P. 3814-3818.

48. Glickman M.S., J.S. Cox, W.R. Jacobs. A novel mycolic acid cyclopropane synthetase is required for coding, persistence, and virulence of Mycobacterium tuberculosis// Mol. Cell. -2000. -Vol. 5. -P. 717-727.

49. Glynn J. R ., Whiteley J., Bifani P. J., Rremer K. & D. van Soolingen. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review// Emerg. Infect. Dis. -2002. -Vol. 8. -P. 843-849.

50. Goguet de la Salmoniere Y. O., C. C. Kim, A. G. Tsolaki, A. S. Pym, M. S. Siegrist, and P. M. Small. High-throughput method for detecting genomicdeletion polymorphisms// J. Clin. Microbiol. -2004. -Vol. 42. -P. 29132918.

51. Gross P.A., Barrett T.L., Dellinger E.P., Krause P.J., Martone W.J., McGowan J.E. Jr, Sweet R.L., Wenzel R.P. Purpose of quality standards for infectious diseases.Infectious Diseases Society of America// Clin. Infect. Dis.-1994.-Vol. 18.-P. 421.

52. Guillemin V., V. Jarlier and E. Cambau. Correlation between quinolone susceptibility patterns and sequences in the A and B subunits of DNA gyrase in mycobacteria// Antimicrob. Agents Chemother. -1998. -Vol. 42. -P. 2084-2088.

53. Guwatudde D., Nakakeeto M., Jones-Lopez E.C., Maganda A., Chiunda A., Mugerwa R.D., Ellner J.J., Bukenya G., Whalen C.C. Tuberculosis in household contacts of infectious cases in Kampala, Uganda// Am. J. Epidemiol. -2003. -Vol. 158. -P. 887- 898.

54. Hoffner S.E., Svenson S.A., Norberg R., Dias F., Ghebremichael S. and G. Kallenius. Biochemical heterogeneity of Mycobacterium tuberculosis complex isolates in Guinea-Bissau// J. Clin. Microbiol. -1993. -Vol. 31. -P. 2215-2217.

55. Honore N., G.Marchal & S. T. Cole. Novel mutation in 16S rRNA associated with streptomycin dependence in Mycobacterium tuberculosis!I Antimicrob. Agents Chemother. -1995. -Vol. 39. -P. 769-70.

56. Hu Y., A. R. Coates & D. A. Mitchison. Sterilizing activities of fluoroquinolones against rifampin-tolerant populations of Mycobacterium tuberculosis!/ Antimicrob. Agents. Chemother. -2003. —Vol. 47. -P. 653-7,

57. Huitric E., Werngren J., Jureen P., Hoffher S. Resistance Levels and rpoB Gene Mutations among In Vitro-Selected Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Mutants// Antimicrob. Agent. Chemother. -2006. -Vol. 50. P. 2860-2862.

58. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol.26(l 1). - P. 2465-2466.

59. Jiao W., I.Mokrousov, G. Sun, Y. Guo, A. Vyazovaya, O. Narvskaya and A. Shen. Evaluation of New Variable-Number Tandem-Repeat Systems for

60. Typing Mycobacterium tuberculosis with Beijing Genotype Isolates from Beijing, China// J. Clin. Microbiol. -2008. -Vol. 46(3). -P. 1045-1049.

61. Jindani A., Aber V.R., Edwards E.A., Mitchison D.A. The early bactericidal activity of drugs in patients with pulmonary tuberculosis// Am. Rev. Respir. Dis. -1980. -Vol. 121. -P. 939-949.

62. Jones, W.D. Jr. Phage typing of M. tuberculosis cultures from incidents of suspected laboratory cross-contamination// Tubercle. -1988. -Vol. 69. -P. 43-46.

63. Jun Y., Shi W., Xie J. Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from China// J. Clin. Microbiol. -2003. -Vol. 41.-P. 2209-12.

64. Jureen P., Engstrand L., Eriksson S., Alderborn A., Krabbe M., Hoffner S. E. Rapid Detection of Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis by Pyrosequencing Technology// J. Clin. Microbiol. -2006. -Vol. 44. -P. 1925-1929.

65. Kimerling M., Kluge H., Vezhnina N., Iacovazzi T., Demeulenaere T. and Portaels F. Inadequacy of the current WHO re-treatment regiment in central Siberian prisons: treatment failure and MDR-TB// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1999.-Vol. 3.-P. 451-453.

66. Kong Y., Cave M. D., Zhang L., Foxman B., Marrs C. F., Bates J. H., Yang Z. H. Association between Mycobacterium tuberculosis Beijing/W Lineage Strain Infection and Extrathoracic Tuberculosis: Insights from

67. Epidemiologic and Clinical Characterization of the Three Principal Genetic Groups of M. tuberculosis Clinical Isolates// J. Clin. Microbiol. -2007. -Vol. 45.-P. 409-414.

68. Kovalev S. Y., E. Y. Kamaev, M. A. Kravchenko, N. E. Kurepina, S. N. Skorniakov. Genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping// Int. J.

69. Tuberc. Lung Dis. -2005. -Vol. 9(7). -P. 746-752.

70. Kumar S. S., R. Verma, D. H. Shah. Molecular fingerprinting of clinical isolates of Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis from India by restriction fragment length polymorphism (RFLP)// J. Vet. Sei. -2004. — Vol. 5(4).-P. 331-335.

71. Laszló A., P. Gill, V. Handzel, M.M. Hodgkin and D.M. Helbecque. Conventional and radiometric drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex// J. Clin. Microbiol. -1983. -Vol. 18. -P. 1335-1339.

72. Le Fleche P., M. Fabre, F. Denoeud, J.-L. Koeck and G. Vergnaud. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacterium tuberculosis complex based on tandem repeat typing// BMC Microbiol. -2002. -Vol. 2. -P. 37-49.

73. Lee A. S., A. Teo & S. Y. Wong. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates// Antimicrob. Agents. Chemother. -2001. -Vol. 45. -P. 2157-2159.

74. Lee A.S., Othman S., Ho Y. Wong SY. Novel mutations within the embB gene in ethambutol-susceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis!I Antimicrob. Agents Chemother. -2004. -Vol. 48. -P. 44474449.

75. Lee H.Y, Myoung H.J., Bang H.E. Mutations in the embB locus among Korean clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to ethambutol// Yonsei Med. J. -2002. -Vol. 43. -P. 59-64.

76. Martinez J. L., F. Baquero and D. I. Andersson. Predicting antibiotic resistance//Nat. Rev. Microbiol. -2007. -Vol. 5. -P. 958-965.

77. Maus C. E., B. B. Plikaytis, and T. M. Shinnick. Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis// Antimicrob. Agents Chemother. -2005. -Vol. 49. -P. 571-577.

78. Maus C. E., Plikaytis B. B., Shinnick T. Molecular Analysis of Cross-Resistance to Capreomycin, Kanamycin, Amikacin, and Viomycin in Mycobacterium tuberculosis// Antimicrob. Agents Chemother. -2005. —Vol. 49.-P. 3192-3197.

79. McCammon M.T., Gillette J.S., Thomas D.P. Detection of rpoB mutations associated with rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis using denaturing gradient gel electrophoresis// Antimicrob. Agents Chemother. -2005. -Vol. 49. -P. 2200-2209.

80. McHugh, T. D., and S. H. Gillespie. Nonrandom association of IS6110 and Mycobacterium tuberculosis: implications for molecular epidemiological studies// J. Clin. Microbiol. -1998. -Vol. 36. -P. 14101413.

81. Miesel L., D. A. Rozwarski, J. C. Sacchettini and W. R. Jacobs Jr. Mechanisms for isoniazid action and resistance// Novartis Found Symp. -1998.-Vol. 217.-P. 209-21.

82. Miller M., L. Thibert, F. Desjardins, S. Siddiqi & A. Dascal. Testing of susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide: comparison of Bactec method with pyrazinamidase assay// J. Clin. Microbiol. -1995. -Vol. 33. -P. 2468-2470.

83. Minnikin D. E., Kremer L., Dover L. G., and Besra G. S. The Methyl-Branched Fortifications of Mycobacterium tuberculosis// Chemistry & Biology. -2002. -Vol. 9. -P. 545-553.

84. Miotto P., Piana F., Penati V. Use of genotype MTBDR assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated in Italy// J. Clin. Microbiol. -2006. -Vol. 44.-P. 2485-91.

85. Mitchison D. The action of antituberculosis drugs in short course chemotherapy// Tubercle. -1985. -Vol. 66. -P. 219-225.

86. Murray J. F. A Century of Tuberculosis// Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2004.-Vol. 169.-P. 1181-1186.

87. Netesov S.V. Emerging infectious diseases in Russia, 1990-1999// Emerg. Infect. Dis. -2001. -vol 7. P. 1-5.

88. Nicod L. P. Immunology of tuberculosis// Swiss Med Wkly. -2007. -Vol. 137. -P. 357-362

89. Nikaido H and M Vaara. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability// Microbiol Rev. -1985. -Vol. 49(1). -P. 1-32.

90. Parsons L.M., Salfinger M., Clobridge A. Phenotypic and Molecular Characterization of Mycobacterium tuberculosis Isolates Resistant to both Isoniazid and Ethambutol// Antimicrob. Agents Chemother. -2005. -Vol. 49. -P. 2218-2225.

91. Plinke C., Rüsch-Gerdes S., Niemann S. Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates// Antimicrob. Agents Chemother. -2006. -Vol. 50. -P. 1900-1902.

92. Poynten M., D. N. Andresen, T. Gottlieb. Laboratory cross-contamination of Mycobacterium tuberculosis: an investigation and analysis of causes and consequences// Intern. Med. J. -2002. —Vol. 32. -P. 511-512.

93. Quemard A., J. C. Sacchettini, A. Dessen, C. Vilcheze, R. Bittman, W. R. Jacobs, Jr. and J. S. Blanchard. Enzymatic characterization of the target for isoniazid i^Mycobacterium tuberculosis// Biochemistry. -1995. -Vol. 34.-P. 8235-41.

94. Ragoussis J. , G. P. Elvidge, K. Kaur, and S. Colella. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation, Time-of-Flight Mass Spectrometry in Genomics Research// PLoS Genet. -2006. -Vol. 2(7). -P. el00.

95. Ramaswamy S., J. Musser. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis'. 1998 update// Tuber. Lung Dis. -1998. -Vol. 79. -P. 3-29.

96. Raynaud C., C. Guilhot, J. Rauzier, Y. Bordat, V. Pelicic, R. Manganelli, I. Smith, B. Gicquel, and M. Jackson. Phospholipases C are involved in the virulence of Mycobacterium tuberculosis/! Mol. Microbiol. -2002. -Vol. 45. -P. 203-217.

97. Raynaud C., K. G. Papavinasasundaram, R. A. Speight, B. Springer, P. Sander, E. C. Bottger, M. J. Colston, and P. Draper. The functions of OmpATb, a pore-forming protein of Mycobacterium tuberculosis// Mol. Microbiol. -2002. -Vol. 46. -P. 191-201.

98. Rengarajan J., C. M. Sassetti, V. Naroditskaya, A. Sloutsky, B. R. Bloom, E. J. Rubin The folate pathway is a target for resistance to the drug para-aminosalicylic acid (PAS) in mycobacteria// Mol. Microbiol. -2004. -Vol. 53(1).-P. 275-282.

99. Rliee J. T., M. M. Tanaka, M. A. Behr, C. B. Agasino, E. A. Paz, P. C. Hopewell, and P. M. Small. Use of multiple markers in populationbased molecular epidemiologic studies of tuberculosis// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2000.-Vol. 4.-P. 1111-1119.

100. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Academ. Sei. USA. 1977. - Vol.74. - P. 5463-5467.

101. Scoipio A. & Y. Zhang. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus//Nat. Med. -1996. -Vol. 2. -P. 662-667.

102. Seiander R. K., Caugant D. A., Ochman H., Musser, J. M., Gilmour M. N. and T. S. Whittam. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematic// Appl. Environ. Microbiol. -1986.-Vol. 51.-P. 873-884.

103. Shafer R. W., Edlin B. R. Tuberculosis in patients infected with human immunodeficiency virus: perspective on the past decade// Clin. Infect. Dis. -1996. -Vol. 22. -P. 683-704.

104. Shen X, Shen G, Wu J., Gui X.H., Li X., Mei J., DeRiemer K., Gao Q. Association between embB Codon 306 Mutations and Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosisII Antimicrob. Agents Chemother. -2007. —Vol. 51.-P. 2618-2620.

105. Shi R., J. Zhang, K. Otomo, G. Zhang and I. Sugawara. Lack of Correlation between embB Mutation and Ethambutol MIC in Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from China// Antimicrob. Agents Chemother. -2007. -Vol. 51(12). -P. 4515-4517.

106. Siddiqi S.H., Rusch-Gerdes S. MGIT™ Procedure Manual for BACTEC™ MGIT 960™ TB System. 2006.

107. Skuce R.A., McCony T.P., McCarroll J.F., Roring S.M., Scott A.N., Brittain D., Hughes S.L., Hewinson R.G., S.D. Neill. Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTRPCR targets//Microbiol. -2002. -Vol. 148. -P. 519-528.

108. Slama K., Chiang C-Y., Enarson D.A., Hassmiller K., Fanning A., Gupta P., Ray C. Tobacco and tuberculosis: a qualitative systematic review and meta-analysis// Int. J. Tuber. Lung Dis. -2007. -Vol. 11(10). -P. 1049-1061.

109. Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence// Clin. Microbiol. Rev. -2003. -Vol. 16(3). -P. 463-496.

110. Srivastava S., Garg A, Ayyagari A., Nyati K.K., Dhole T.N., Dwivedi S.K. Nucleotide Polymorphism Associated with Ethambutol Resistance in Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis!7 Current Microbiol. -2006. -Vol. 53.-P. 401^105.

111. Storm N., Darnhofer- Demar B., van den Boom D., Rodi C.P. MALDI- TOF Mass Spectrometry- Based SNP Genotyping // Meth. Mol. Biol. 2002. - Vol. 212. - P. 241- 262.

112. Supply P., S. Lesjean, E. Savine, K. Kremer, D. van Soolingen, and

113. C. Locht. Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units// J. Clin. Microbiol. -2001. -Vol. 39. P. 35633571.

114. D. van Soolingen. Proposal for Standardization of Optimized Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem Repeat Typing of Mycobacterium tuberculosis!I J. Clin. Microbiol. -2006. -Vol. 44. -P. 44984510.

115. Supply P., E. Mazars,S. Lesjean,V. Vincent, B. Gicquel and C. Locht. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome//Mol. Microbiol. -2000. -Vol. 36(3) -P. 762-771.

116. Suresh N., J. Arora, H. Pant, T. Rana and U. B. Singh. Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis DNA from Archival Ziehl-Neelsen-stained sputum smears// J. Microbiol. Meth. -2007. -Vol. 68(2). -P. 291-295.

117. Takayama K. & J. O. Kilburn. Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis// Antimicrob. Agents Chemother. -1989. -Vol. 33. -P. 1493-1499.

118. Talavera W., R. Miranda, K. Lessnau, and L. Klapholz. Extrapulmonary tuberculosis, p. 139-190. In L. N. Friedman (ed.), Tuberculosis: current concepts and treatment, 2nd ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 2001.

119. Telenti A., P. Imboden, F. Marchesi, L. Matter, K. Schopfer, T. Bodmer, D. Lowrie, M. J. Colston and S. Cole. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis// Lancet. -1993. -Vol. 341 (8846).-P. 647-651.

120. Telenti A., Philipp W.J., Sreevatsan S., Bernasconi C., Stockbauer K.E., Wieles B., Musser J.M., Jacobs W.R Jr. The emb operon, a gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol// Nat. Med. -1997. -Vol. 3. -P. 567-570.

121. Microbiol. -2006,-VoI. 48. -P. 159-178.

122. Toungoussova O., Bjune G. and D. Caugant. Epidemic of tuberculosis in the former Soviet Union: Social and biological reasons// Tuberculosis. -2006.-Vol. 86(1). -P. 1-10.

123. Tracevska T., Lansone I., Broka L., Marga O., V. Baumanis. Mutations in the rpoB and katG genes leading to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Latvia//J. Clin. Microbiol. 2002. -Vol. 40. -P. 3789-3792.

124. Tsukamura M., S. Mizuno, and H. Toyama. Taxonomic studies on the Mycobacterium tuberculosis series// Microbiol. Immunol. -1985. -Vol. 29. -P. 285-299.

125. Tudo G., Gonzalez J., Obama R. Study of resistance to antituberculosis drugs in five districts of Equatorial Guinea: rates, risk factors, genotyping of gene mutations and molecular epidemiology// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2004. -Vol. 8. -P. 15-22.

126. Wada T., S. Maeda, A. Hase and K. Kobayashi. Evaluation of variable numbers of tandem repeat as molecular epidemiological markers of Mycobacterium tuberculosis in Japan// J. Med. Microbiol. -2007. -Vol. 56. — P. 1052-1057.

127. Wade M, Zhang Y. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis// Front Biosci. -2004. -Vol. 9. -P. 975-94.

128. Waksman SA. Suppressive effect of streptomycin on the growth of tubercle bacilli in laboratory animals// Am. J. Public. Health. -1944. -Vol. 34. -P. 358.

129. WHO. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis. Second edition. Geneva, Switzerland: WHO, 2003.

130. William R. Berrington, Thomas R. Hawn Mycobacterium tuberculosis, macrophages, and the innate immune response: does common variation matter?// Immunological Reviews. -2007. -Vol. 219. -P. 167-186.

131. World Health Organization. Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing. Geneva, Switzerland. WHO. 2007, p. 273.

132. World Health Organization. Global Tuberculosis Programme. Global Tuberculosis Control. Geneva, Switzerland, WHO, 1998.

133. World Health Organization. Guidelines for establishing DOTS-Plus pilot projects for the management of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). Geneva, Switzerland. WHO, 2000.

134. World Health Organization. Laboratory Services in Tuberculosis Control Part III: Culture. Geneva, Switzerland. WHO, 1998.

135. World Health Organization. The World Health Organization Global Tuberculosis Program. Geneva, Switzerland. WHO, 2006.

136. World Health Organization. Treatment of tuberculosis. Guidelines for National Programmes, 3rd ed. Geneva, Switzerland. WHO, 2003.

137. Zager E. M. and R. McNerney. Multidrug-resistant tuberculosis// BMC Infect. Dis. -2008. -Vol. 8. -P. 10.

138. Zahrt T. C. Molecular mechanisms regulating persistent Mycobacterium tuberculosis infection// Microbes and Infection. -2003. -Vol. 5.-P. 159-167.

139. Zhang M., Yue J., Yang Y., Zhang H., Lei J., Jin R., Zhang X., H. Wang. Detection of Mutations Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from China// J. Clin. Microbiol. -2005. -Vol. 43.-P. 5477-5482.

140. Zhang Y, M. M. Wade , A. Scorpio , H. Zhang and Z. Sun. Mode of action of pyrazinamide: disruption of Mycobacterium tuberculosis membrane transport and energetics by pyrazinoic acid// J. Antimicrob. Chemother. -2003. -Vol. 52. -P. 790-795.

141. Zhang Y. & D. Mitchison. The curious characteristics of pyrazinamide: a review// Int. J. Tuberc. Lung. Dis. -2003. -Vol. 7. -P. 6-21.

142. Zhang Y. and A. Telenti. Genetics of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. -P. 235-254. In Hatfull G, Jacobs W R (ed). Molecular genetics of mycobacteria. American Society of Microbiology Press, Washington D.C. -2000.

143. Zhang Y. Isoniazid. -P. 739-758. In Rom W. N., Garay S. M., Lippincott W. and Wilkins (ed). Tuberculosis. A Wolters Kluwer Company, New York. 2003.

144. Zhang Y., B. Heym, B. Allen, D. Young and S. Cole. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis!'/ Nature. -1992. -Vol. 358. -P. 591-593.

145. Zhao J.R., Bai Y.J., Wang Y. Development of a pyrosequencing approach for rapid screening of rifampin, isoniazid and ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosisII Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2005. -Vol. 9. -P. 328-332.

146. Zignol M, Hosseini MS, Wright A, Weezenbeek C.L., Nunn P., Watt C.J., Williams B.G, Dye C. Global incidence of multidrug-resistant tuberculosis// J. Infect. Dis. 2006. - Vol. 194. - P. 479-85.

147. Zoltan B, Somoskovi A., Kodmon C. Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the line probe assay// J. Clin. Microbiol. -2001. -Vol. 39.-P. 3736-9.

Информация о работе

Афанасьев, Максим Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Афанасьев, Максим Владимирович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Афанасьев, Максим Владимирович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афанасьев, Максим Владимирович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия