Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка молекулярных маркеров для эпидемиологического анализа клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка молекулярных маркеров для эпидемиологического анализа клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis"

На правах рукописи

ЛИХОШВАЙ Екатерина Юрьевна

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

03.00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2006

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН (г. Иркутск) и в Центре исследования туберкулеза при Научно-исследовательском институте здравоохранения, г.Ньюарк, Нью Джерси, США (Public Health Research Institute TB Center, Newark, NJ, USA ).

Научный руководитель

доктор биологических наук Беликов Сергей Иванович

Научный консультант

кандидат биологических наук, с.н.с. Курепина Наталия Евгеньевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

кандидат химических наук Татьков Сергей Иванович

Ведущая организация

Центральный научно-исследовательский институт

туберкулеза РАМН, г. Москва

Защита состоится « 7 » апреля 2006 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 3 » марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

10Q6 А-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем практического здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн случаев. В Российской Федерации показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза в несколько раз превышают значения по странам Западной Европы (http://www.euro.who.int). Сложные социально-экономические условия жизни населения, военные конфликты, миграция, увеличение числа штаммов возбудителя заболевания, устойчивых к действию противотуберкулезных препаратов, являются одними из основных причин напряженной эпидемической ситуации в России (Шевченко, 2000; Перельман, 2001). Особую актуальность приобретает проблема совершенствования противотуберкулезной помощи на территориях Сибири с различной плотностью населения, где показатели, характеризующие распространенность туберкулезной инфекции, в 1,5 раза превышают среднероссийские (Краснов и др., 2002).

Особенности природы заболевания, в частности длительность инкубационного периода, лекарственная устойчивость и отсутствие надежных методов идентификации штаммов возбудителя затрудняют диагностику и лечение, а также эпидемиологические исследования в очагах. Последние достижения молекулярной биологии в сочетании с успехами в области молекулярной генетики микобактерий позволили разработать способы надежной дифференцировки штаммов Mycobacterium tuberculosis (М. tuberculosis) на уровне хромосомной ДНК, которые существенно повышают эффективность микробиологической диагностики и эпидемиологических исследований при туберкулезе. Однако подавляющее большинство методов, используемых для молекулярного типирования туберкулеза, отличается многоступенчатостью проведения, недостаточной дискримина-тивной способностью и высокой стоимостью. Проведение исследований, направленных на поиск молекулярных маркеров специфичных для отдельных эпидемиологически значимых групп микобактерий, особенно имеющих лекарственную устойчивость, и разработка простых в исполнении, точных и недорогих методов идентификации групп штаммов М. tuberculosis, а также применение этих методов в комплексе являются необходимым условием успешной организации противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости и смертности от

туберкулеза.

Цель исследования. Разработка молекулярных маркеров и оптимизация методик их использования для идентификации отдельных групп штаммов M. tuberculosis, в том числе представителей W-Beijing филогенетической линии, среди клинических изолятов микобактерий туберкулеза. Основные задачи:

1. Используя данные ранее проводимых исследований, разработать од-ноэтапный метод для идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов микобактерий.

2. Разработать молекулярные маркеры, специфичные для интактного и ( измененного, в связи с микроделецией, фрагмента гена pks 15/1, от- ^ вечающего за продукцию фенолгликолипидов (ФГЛ) - факторов вирулентности M. tuberculosis, с использованием метода «molecular beacons».

3. Разработать гибридизационные зонды, специфичные для фрагментов ДНК M. tuberculosis TbDl, RD6, pksl5/l.

4. Провести анализ делеций TbDl, RD6,pksl5/l с использованием ПЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода «molecular beacons» клинических изолятов M. tuberculosis.

5. Провести исследование, базирующееся на секвенировании фланкирующих последовательностей различных по локализации и размеру делеций, представленных в геноме для дифференциации различных кластеров W-Beijing группы, а также представителей других филогенетических линий M tuberculosis

Научная новизна и практическая значимость работы. На сегодняшний день в литературных источниках описано множество молекуляр-но-биологических методов для генотипирования штаммов M. tuberculosis. Наиболее широко используемыми методами, относящимися к «золотому стандарту» является IS6//0-RFLP генотипирование (Restriction fragment length polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК) и сполиготипирование (spoligotyping), а также такие методы, как !

sSNPs типирование (single nucleotide polymorphism - полиморфизм единичных нуклеотидных последовательностей), включая определение точечных мутаций ассоциированных с лекарственной устойчивостью, и MIRU-VNTR анализ (полиморфизм тандемов повторяющихся фрагментов ДНК). Учитывая особенности некоторых эпидемиологически значимых групп возбудителей (таких как W-Beijing штаммы): широкую распространенность, высокий уровень смертности при заражении данными штаммами и часто встречающуюся лекарственную устойчивость, идентификация изолятов W-Beîjing филогенетической линии имеет большое практическое значение.

Только единичные лаборатории имеют возможность применения нескольких методов генотипирования в виду высокой стоимости проведения исследований. Типирование с использованием нескольких методов занимает в лучшем случае 5-10 дней, больной с активной формой туберкулеза способен заразить в течение месяца 15-100 человек. Исходя из этого, возникает необходимость в разработке быстрых, недорогих и эффективных методов, способных определить микобактерии, принадлежащие к W-Beijing группе. В настоящем исследовании впервые разработан метод генотипирования штаммов W-Beijing, с применением техники RFLP гибридизации, основанный на комплексном использовании нескольких специфичных апробированных маркеров. Метод высокочувствительный, быстрый и удобный для выделения различных групп представителей W-Beijing, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью, среди любых штаммов микобакте-рий, ранее типированных IS6770-RFLP методом. В представленной работе проведен анализ хромосомных делеций TbDl, RD6 и pksl5/l при сопоставлении результатов с данными IS6770-RFLP типирования клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных в различных регионах мира. Впервые описан IS6//0-RFLP кластерный состав «ancestral» (не имеющих TbDl де-лецию) группы штаммов. Показано распределение исследуемых штаммов по ранее известным и выявленным в процессе исследования признакам. Помимо этого, метод детекции штаммов с 7 п.н. делецией в генах pksl5/l с использованием методики оценки кинетики ПЦР (RT-PCR, real-time PCR) со специфическими молекулярными зондами - «molecular beacons», позволяет выделить особо вирулентные микобактерии туберкулеза. В работе показаны перспективы совместного комплексного применения простых и апробированных методик для более точной выявления путей распространения инфекции. Описаны делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии, что в дальнейших исследованиях позволит разработать молекулярные маркеры, с помощью которых, в совокупности с другими методами типирования, можно будет идентифицировать различные подгруппы данной филогенетической линии, тем самым ускорить выявление эпидемиологических очагов заболевания и с большей достоверностью выявлять цепочки распространения инфекции.

Основные защищаемые положения:

1. Метод гибридизации с многокомпонентным зондом W-Beijing прост, удобен в применении и способен эффективно идентифицировать W-Beijing штаммы среди любых клинических изолятов ми-кобактерий, ранее типированных IS6770-RFLP методом.

2. Распределение делеций TbDl, RD6 и pksl5/1 у клинических штаммов М. tuberculosis различных генетических групп и кластеров по-

зволяет выяснить связь возникновения данных делеций с другими маркерными генетическими событиями.

3. Идентификация М. tuberculosis с интактными генами pksl5/l позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных штаммов среди клинических изолятов.

4. Штаммы линии W-Beijing характеризуются наличием специфических делеций, которые в дальнейшем могут использоваться в качестве молекулярных маркеров для выявления отдельных групп ми-кобактерий W-Beijing.

Личный вклад соискателя. В основу диссертации положены исследования, выполненные автором в лаборатории аналитической и биоорганической химии, Лимнологического института СО РАН, г. Иркутска и в лаборатории молекулярной эпидемиологии Центра исследования туберкулеза при Научно-исследовательском институте здравоохранения (PHRI TBC, г. Нью-Джерси, США) в период 2002-2004 г.г. Разработка молекулярных маркеров велась автором самостоятельно под руководством Натальи Куре-пиной, Елены Шашкиной, Беликова Сергея Ивановича, Бэрри Крэйсвирта.

Апробация результатов диссертации и публикации. Результаты работы были представлены на конференции в г. Кейстоуне, 2-7 апреля, 2005 г. (Keystone, США) и Всероссийской научно-практической конференции в г. Санкт-Петербурге, 21-23 апреля, 2005 г. Основные результаты диссертации опубликованы в 5 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 124 источника (из них 117 на иностранных языках) и пяти приложений. Диссертация изложена на 137 стр., содержит б табл., иллюстрирована 10 рис. и 4 схемами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы штаммы микобактерий туберкулезного комплекса из коллекции Центра исследования туберкулеза при Научно-исследовательском институте здравоохранения, г. Ньюарк, Нью-Джерси, США (Public Health Research Institute ТВ Center; PHRI TBC). В коллекции представлены около 20000 клинических штаммов микобактерий, выделен-

ных за период 1992-2004 гг. в различных географических регионах мира, в том числе в Сибири.

Для выделения ДНК из культур микобактерий применяли методику, отработанную и успешно используемую в лаборатории Центра исследования туберкулеза. Методика включает этапы предварительной термической обработки при 80°С, лизирования и депротеинизации с использованием 10% SDS и протеиназы К, инкубации с 1% СТАВ, экстракции смесью хлороформ гизоамиловый спирт (24:1); последовательным осаждением изо-пропанолом и отмывкой 70% этанолом.

В ходе исследования были созданы гибридизационные зонды, специфичные к различным локусам хромосомной ДНК М tuberculosis (\S>6110, dnaA-dnaN, NTF, DR, TbDl, RD6, pks 15/1). При использовании гибридиза-ционных зондов для RFLP анализа применяли предложенную ранее методику с люминесцентной меткой (Enhanced Chemiluminescent kit, ECL, Am-ersham Biosciences, England) (van Embden, 1993). Зонды, специфичные к региону pks 15/1, созданы по методике «molecular beacons» (Marras et al., 1999). Многокомпонентный W-Beijing зонд, был сконструирован как комбинация ПЦР-ампликонов специфических геномных локусов, описанных ранее (Plikaytis et al., 1994; Kurepina et al., 1998; Kremer et al., 1999).

В работе применялись гибридизационные методы, такие как RFLP-гибридизация по Саузерну согласно методике, описанной ранее (van Embden, 1993). Для регибридизации с W-Beijing - зондом использовались мембраны предварительно гибридизованные с \%61Ю-У специфическим зондом в ходе RFLP генотипирования без дополнительного этапа промывания мембраны после проведения последней гибридизации.

Гибридизацию с молекулярными зондами «molecular beacons» проводили согласно методике предложенной ранее (Marras et al., 2002) на ам-плификаторе Мх4000 (Stratagene, США), позволяющем проследить повышение уровня флюоресценции в процессе реакции в режиме реального времени.

При секвенировании полученные ПЦР фрагменты, нуклеотидную последовательность которых необходимо определить, выделяли из реакционной смеси и проводили сиквенсную ПЦР согласно методике, отработанной при рутинном секвенировании фрагментов тандемов нуклеотидных повторов в гене протеина А (s/ад-типирование) штаммов St. aureus, с использованием набора CEQ dye terminator cycle sequencing-Quick Start kit (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, США) на амплификаторе GenAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Определение последовательности нуклеотидных оснований проводили на секвенаторе CEQ

8000 genetic analysis system (Beckman Coulter) с использованием программного обеспечения для последующего анализа полученных последовательностей CEQ 8000 genetic analysis system software (Beckman Coulter).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методики быстрой идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов микобактерий, ранее типированных IS6770-RFLP методом

Одной из эпидемиологически значимых групп микобактерий являются штаммы W-Beijing. Члены семейства W-Beijing широко распространены в Азиатском регионе, странах бывшего Советского Союза и согласно данным многих исследователей, представляют доминирующий клон в этих регионах (van Soolingen et al., 1995; Glynn et al., 2002). W-Beijing штаммы часто имеют множественную лекарственную устойчивость, выявляются в очагах инфекции и характеризуются быстрым и обширным распространением (van Soolingen et al., 1995; Bifani et al., 2002; Glynn et al., 2002). Помимо этого, часто обнаруживаются при исследовании рецидивирующих случаев заболевания (Lan et al, 2003), обладают высокой вирулентностью и приспособляемостью, в том числе и благодаря способности угнетать иммунный ответ хозяина (Manca et al., 2001; Lopez, 2003).

Для идентификации определенных групп возбудителей туберкулеза, имеющих сходные биомедицинские и эпидемиологические характеристики, может применяться методика RFLP-гибридизации со специфичными молекулярными маркерами. Ранее были описаны различные специфические генетические маркеры, специфичные для W-Beijing штаммов (Kurepi-na et al., 1998; Bifani et al., 2002; Glynn et al., 2002; Filliol et al., 2002; Gutacker, et al., 2002; Mokrousov et al., 2004; Kremer et al., 2004; Kovalev et al., 2005). По результатам IS6//0-RFLP типирования W-Beijing штаммы имеют 15-24 копий IS6110 элемента. Данные штаммы могут быть охарактеризованы, основываясь на наличие уникальной вставки IS6110 элемента в область инициации репликации (OriC), также для них характерен специфический сполиготип (spoligotype, NY_S00034; type 1, SpolDB3), соответствующий отсутствию 1-34 спейсеров в регионе прямых повторов (Direct Repeat - регион прямых повторов) (Kremer et al, 1999; Bifani et al., 2002; Filliol et al., 2002). W-Beijing штаммы с множеством копий \Ъ6110 элемента (15-24), имеющие сходный (>65% идентичности) профиль IS67/0-RFLP гибридизации, и имеющие, по меньшей мере, одну специфическую вставку IS6110 элемента в NTF локусе, определены, как относящиеся к W-Beijing семейст-

ву штаммов (Bifani et al., 2002). Наличие второй вставки в NTF локусе характерно для имеющих множественную лекарственную устойчивость W штаммов, вызвавших множественные локальные вспышки туберкулеза в Нью-Йорке в начале 1990 годов (Plikaytis et al., 1994; Bifani et al., 1996; Munsiff, 2003).

В процессе выполнения данной работы был разработан простой и точный метод идентификации штаммов семейства W-Beijing. Метод основан на повторной гибридизации мембран, используемых в ходе рутинного IS6//0-RFLP Саузерн-блот анализа ДНК микобактерий, с сконструированным многокомпонентным W-Beijing гибридизационным зондом. Зонд представляет собой набор специфических молекулярных маркеров, полученных на основе ПЦР-амплифицикации фрагментов, специфичных для трех хромосомных локусов М. tuberculosis: dnaA-dnaN (oriC, область инициации репликации), NTF и DR. Данные локусы были выбраны не случайно, так как характеризуются специфической структурой, свойственной штаммам W-Beijing группы. Выбор фрагментов для последующей амплификации и создания компонентов W-Beijing-зонда основан на анализе результатов гибридизации более 1560 штаммов независимо с каждым из известных специфических зондов для хромосомных локусов dnaA-dnaN, DR, NTF и данных секвенирования фрагментов ДНК исследуемых локусов. При проведении RFLP гибридизации клинических штаммов микобактерий с W-Beijing зондом был разработан алгоритм интерпретации получаемых профилей гибридизации (рис. 1).

Для оценки данного метода было регибридизованно 526 клинических изолятов (32 мембраны) с W-Beijing-зондом, с последующим анализом полученных профилей гибридизации. Используя представленный алгоритм, было выделено три основные группы. Первая группа состояла из 104 изолятов с профилями гибридизации, имеющими полосы 3,65 kb, 3,36 и 1,6 kb (соответственно DR, dnaA-dnaN и NTF фрагментам) и 2 изолята с 3,65 kb, 3,36 kb и 1,1 kb полосами (представители этой группы показаны на рисунке 2, линии 13-17). Эти 106 штаммов были распознаны как члены семейства W-Beijing, что было подтверждено проводимым ранее компьютерным анализом IS6//0-RFLP профилей гибридизации (идентичность профилей >65%). По данным компьютерного анализа, данные 106 штаммов представляют 46 независимых кластеров, которые отличаются друг от друга, по крайней мере, на одну вставку IS6110 или имеют сдвиг в размере гибриди-зационных полос. Вторая группа из 42 изолятов с размерами полос гибридизации 3,65 kb, 3,36 kb и 1,4 kb соответственно для членов W-Beijing филогенетической линии (предшествующие или «ancestral» штаммы) (рис. 2,

линии 3-12). Эти изоляты были ранее охарактеризованы в PHRI TBC как члены N, HD, CI, KY, LB (классификация PHRI TBC) и других семейств.

Рис. 1. Алгоритм интерпретации профилей гибридизации клинических штаммов М tuberculosis с W-Beijing-зондом

Предшествующие (ancestral) штаммы не могут быть распознаны по IS6110 профилям, при компьютерном анализе они имеют менее 65% сходства IS6//0-RFLP профилей с изолятами, относящимися к W-Beijing семейству. Эти две группы вместе являются представителями W-Beijing филогенетической линии (п=148). Третья группа состояла из 378 изолятов, которые демонстрировали одну или две гибридизационные полосы различного размера дополнительно к 10,85 kb и 1,4 kb гибридизационным полосам. Как показано, эти 378 изолятов характеризуются отсутствием IS6110 вставок в dnaA-dnaN и NTF локусах и как минимум, наличием одной копии IS6110 в DR области хромосомы и, таким образом, не принадлежат к W-Beijing филогенетической линии или семейству (представители этой группы представлены на рисунке 2, линии 1-2).

При наличии двух ложноотрицательных и одного ложноположи-тельного определения, чувствительность и специфичность W-Beijing-зонда была определена как 98,7% (п=526) (147/149) и 99,7% (377/378), соответственно.

fc t н

f í »~ ?|* *f »■

bseestr-Mr:

DR, А тейсеров 1-У ■ 1S6J10B oriC

N

1S6110B NTF

1 г Я 3 4 5 6 7 > 9 1011 121314 15 lí lJC$t 12Я345<>7«9 10111213И 15 16 17

.......' NYCWMDR

<-— 2» К<ЯЛ?в NTF t

J W-Beijing семейство

<—- 1™ \S6110i NTF

t

J Beijing филогенетическая линия

*— Делеция в DR, Sp.1-34 отсутствуют

<— Al позиция вставки YS611ÚB oriC

Рис. 2. Схематическое филогенетическое дерево, построенное по результатам гибридизации W-Beijing штаммов М. tuberculosis с IS6110- зондом (А) и повторной гибридизации с W-Beijing многокомпонентным зондом (В).

Линии 1 - H37Rv; линии 2 - CDC1551; линии 3 - HD3; линии 4 - АМ; линии 5 - CI6; линии 6 - CI7; линии 7 - HD21; линии 8 - HD23; линии 9 - СК; линии 10 - KY; линии 11 - N2; линии 12 - N; линии 13 - W82; линии 14 - W99; линии 15 - W14; линии 16 - W148; линии 17 - NYC W МЛУ. Линии 3-8 и 10-12 соответствуют W-Beijing предковым «ancestral» штаммам, и линии 9 и 13-17 соответствуют штаммам W-Beijing семейства (имеющим 265% идентичность IS6770-RFLP гибридиза-ционных профилей). На линиях 4-6 и 10, DR-специфичные полосы гибридизации сдвинуты вверх по причине наличия вставки IS6110 в фрагменте Pvull рестрикции; в линиях 13 и 14 ол'С-специфические полосы гибридизации сдвинуты вниз из-за наличия второй копии IS6710 элемента в dnaA-dnaN регионе.

Таким образом, использование хорошо изученных маркеров в комплексе дает эффективную и просто интерпретируемую картину регибриди-зационных профилей, и позволяют выделить представителей W-Beijing филогенетической линии, W-Beijing семейства, а также штаммы с множественной лекарственной устойчивостью W NYC - МЛУ, вызвавшие

вспышку лекарственно устойчивого туберкулеза в г. Нью-Йорке в 90-х годах.

Техническими преимуществами разработанной методики являются:

• регибридизация с W-Beijing-зондом может проводиться с мембранами, ранее использованными для рутинного IS6770-RFLP генотипирова-ния, проводимого согласно стандартному протоколу, и не требует дополнительного этапа отмывания блотов;

• гибридизация W-Beijing-зонда с мембранами, хранившимися при комнатной температуре, дает хорошо читаемый и легко интерпретируемый результат вне зависимости от времени ее хранения (4-8 лет);

• время регибридизации может быть ограничено 4 часами, W-Beijing-зонд в ECL буфере может быть повторно использован для гибридизации как минимум дважды, при хранении при -20°С;

Достоинства методики:

• обладает высокой дискриминативной способностью;

• основана на специфических генетических характеристиках и не лимитирована референтной панелью IS6770-RFLP профилей;

• дает однозначную интерпретацию полученных результатов;

• может использоваться для подтверждения идентификации редких вариантов штаммов микобактерии туберкулеза, не имеющих IS6110 элемента (определяются как "не W-Beijing штаммы");

• W-Beijing многокомпонентный зонд содержит маркеры, специфичные для представителей комплекса микобактерий туберкулеза (М. afri-сапит, М. bovis, М. canettii, М. microti и М. tuberculosis) и не дает положительной гибридизации с другими видами микобактерий (М avium, М. for-tuitum, М. xenopi, М. intracellulare, М. marinum, М. phleí).

Разработанная методика в настоящее время успешно применяется в Центре исследования туберкулеза (PHRI TBC, г. Ньюарк, США) для идентификации представителей W-Beijing группы микобактерий среди клинических изолятов, поступающих для рутинного типирования. В течение 1 рабочего дня по результатам типирования с W-Beijing зондом можно определить принадлежность исследуемых образцов к W-Beijing филогенетической линии, семейству или группе лекарственно-устойчивых штаммов NYC. Гибридизация с W-Beijing-зондом также проводится в спорных случаях, когда по данным IS67/0-RFLP типирования сложно дать однозначный ответ о степени сходства исследуемых штаммов, принадлежащих одной предполагаемой цепочке передачи возбудителя. Данная методика, помимо этого, может быть использована для ретроспективного анализа имеющихся гибридизационных блотов при эпидемиологических исследо-

ваниях и для выяснения филогенетических взаимоотношений среди мико-бактерий. Разработанная методика быстро выполнима, надежна и удобна в применении, позволяет сэкономить время и средства и получить необходимую информацию и может быть рекомендована для использования в различных лабораториях, владеющих техникой RFLP-гибридизации.

Анализ делеций TbDl, RD6 и pks 15/1 клинических штаммов М. tuberculosis

Данное направление работы посвящено изучению вариабельности регионов различия TbDl, RD6 и pks 15/1 у широко географически представленных клинических штаммов М. tuberculosis и сопоставлению полученных результатов с результатами IS6//0-RFLP, sSNPs анализа и типиро-вания анализируемых штаммов по основным генетическим группам (ОГТ, PGG - Principle Genetic Group - Sreevatsan, 1997). Проводимое исследование позволяет выявить различные группы клинических штаммов по наличию или отсутствию TbDl, RD6 и pks 15/1 делеций и определить возможность использования указанных хромосомных фрагментов для создания молекулярных маркеров, специфичных для отдельных эпидемиологически значимых групп микобактерий туберкулеза, в том числе характеризующихся повышенными вирулентными свойствами, а также выяснить хронологическую последовательность возникновения данных делеции относительно других генетических событий, что является важным показателем при анализе филогенетического родства штаммов.

TbDl делеция. В исследовании было проанализировано 122 штамма, принадлежащих к различным генетическим группам и кластерам и выделенных от больных туберкулезом в различных географических регионах. По результатам исследования показано, что все штаммы М. tuberculosis с интактным TbDl фрагментом являлись представителями первой основной генетической группы. Отрицательные результаты гибридизации, свидетельствующие о наличии делеции, отмечались у 83 изолятов. В последнюю группу вошли представители всех трех основных генетических групп (принадлежащих к II-X SNPs кластерам); распределение штаммов по кластерам и основным генетическим группам представлено в таблице 1.

Среди штаммов первой OIT встречались как имеющие данную деле-цию, так и бактерии с интактным регионом (табл. 1). Все штаммы, имеющие интактный TbDl, были представителями первого SNPs кластера. Это семейства, характеризующиеся наличием 1-12 копий IS6110 элемента, такие, как BE, AT, IK, IP, NR, NC, MC (классификация PHRI TBC), а также штаммы M bovis, M. bovis BCG, M. africanum и один штамм, не имеющий

вставок IS 6110. Показано, что штаммы, относящиеся к 1 ОГТ, но принадлежащие к SNPs кластерам II и IIA (X) претерпели делецию хромосомного фрагмента TbDl.

Результаты проведенного исследования полностью соответствуют представленной ранее филогенетической схеме (Brosch et al., 2002) и подтверждают предположение, что данное генетическое событие (делеция региона TbDl) произошло у предкового штамма, не имеющего мутации в гене каталазы-пероксидазы katG*61 (Leu-Arg), характерной для второй и третьей OTT (рис. 3). Наличие консервативных последовательностей, фланкирующих делецию, свидетельствует, что данное событие произошло '

однократно, и делеция наследовалась без дальнейших изменений.

RD6 делеция. В работе был проанализирован 61 клинический штамм микобактерий. Из них у 15 штаммов наблюдались отрицательные результаты гибридизации, а 44 штамма М. tuberculosis и 2 M africanum имели данный фрагмент интактным. В таблице 1 представлено распределение штаммов дикого типа и штаммов, имеющих делецию, по кластерам. У всех тестируемых представителей четвертого и пятого sSNPs кластеров RD6 фрагмент был делегирован. В некоторых sSNPs кластерах (III, VI, VII) наблюдались как представители с делецией, так и имеющие интактным данный фрагмент. Среди исследуемых штаммов I, II, X и VIII sSNPs кластеров отмечалось отсутствие делеции RD6 региона, что определялось положительными результатами гибридизации. По результатам исследования наличие делеции RD6 у анализируемых клинических штаммов характеризует представителей I, II, X, VIII sSNPs кластеров, в том числе и представителей W-Beijing семейства, отличающихся высокой вирулентностью. Тем не менее, утверждать, что наличие или отсутствие RD6 делеции является строгой характеристикой определенной группы микобактерий, выделенной IS6110-RFLP и sSNP методами преждевременно, т. к. некоторые sSNPs кластеры представлены в настоящем исследовании небольшим количеством изоля-тов. Полученное по результатам гибридизации с зондом RD6 кластерное распределение анализируемых штаммов позволяет предположить, что делеция RD6 у М. tuberculosis могла впервые произойти до формирования второй и третьей основных генетических групп (рис. 3). Учитывая структуру данного локуса (наличие высоко полиморфных генов группы РРЕ и мобильного элемента IS1532, различные размеры и фланкирующие последовательности делеции (Manabe etal., 2003)), RD6 делеция могла возникать неоднократно.

Группы микобак- тернй Кластеры по (Сшаскег Результаты гибридизации с зондом Ш>1 Результат гибридизации с зондом №6 Результаты гибридизации с зондами рЫУ/

2002) Положительные Отрицательные Положительные Отрицательные Положите тьные, с зондом рк/5 1 специфичным к инта!стном> региону Положительные, с зоилом рк$15/1 специфичным к региону с 7 п н лслецией Отрицательные, с используемыми рк\15 /зондами

1 огг 1 36 - 10 42 1 -

II 20 12 41 - -

X II 10 24 - -

н т * • - 2 - -

2 ОГГ III 14 2 1 18 -

IV 12 - 2 7

V 5 - 4 11

VI 10 3 4 78

н т* - - - 26

ЗОГГ VII 8 4 4 32

VIII 3 3 - 6

н. т.* - - - 6

М Ьочи 1 - н.а." н а.** - 6

А/ Ьот ВСС 1 - и а." н.а" - 3

М а/гкапшп 1 - 2 - - 3

Всего штаммов 83 46 15 109 179 12

проанализировано 122 61 300

- не типировались по бЗЫРб, *

не входили в анализируемую группу

В настоящее время как интактный фрагмент, так и фрагмент, имеющий делению ТШ6, выявляются гибридизацией в изолятах второй и третьей основных генетических групп и одних и тех же эБЫРз кластерах и Кб! 10 семействах.

М. tuberculosis:

sSNPs кластеры

I, II, X (IX, IIA) -ОГГ1 III, IV, V, VI -ОГГ 2 VII, VIII -ОГГЗ

TbD1

H. bovis-

10 sSNPs

6 n.H. делеция генов pks¡5/l Constant P. 2002

VIII

VII

7 пл. делеция генов

рШ5П

Mamúesse M., 2004

Рис. 3. Модифицированное NJ филогенетическое дерево на основе sSNPs анализа клинических штаммов М.tuberculosis (Gutacker et al, 2002,) ОГГ 1, 2, 3 - Основные генетические группы (Sreevatsan et al, 1997); римскими цифрами обозначены соответствующие SNPs кластеры (Gutacker et al., 2002, 2006); W-Beijing, H37Rv, CDC1551 - группы штаммов и отдельные штаммы, характерные для соответствующих ОГГ и sSNPs кластеров Стрелками указаны возможные события, приведшие к делеции анализируемых фрагментов ДНК (TbD1, RD6, 7 п.н. делеция генов pks15/1).

Микроделеция в генах pkslS/l. Гены pksl5/l участвуют в синтезе микобактериями фенольных гликолипидов (ФГЛ, phenolic glycolipids, PGL). ФГЛ микобактерий туберкулеза, по данным многих исследователей, считаются важными факторами вирулентности, их действие связано с угнетением Th-1 опосредованного иммунного ответа хозяина (Reed et al., 2004). Показано, что у большинства распространенных клинических штаммов, так же как и у лабораторного штамма H37Rv, отмечается сниженный синтез ФГЛ. Это обусловлено делецией 7 п.н. со сдвигом рамки считывания в гене поликетид синтетазы (pks!5/l) (Constant et al., 2002). Однако, штаммы W-Beijing семейства, характеризующиеся способностью вызывать тяжелые, трудно поддающиеся лечению случаи туберкулеза, с высоким уровнем

смертности при заражении, имеют интактным кластер генов рк.ч 15/1 и способны синтезировать значительное количество ФГЛ (Reed et al, 2004). Таким образом, идентификация штаммов, имеющих полноценные гены pksl5/l, позволяет выявить штаммы с потенциально высокой вирулентностью, в том числе представителей W-Beijing филогенетической линии.

В ходе работы было протестировано 300 генетически различных клинических штаммов. Среди тестируемых штаммов 109 дали положительные результаты гибридизации с молекулярным зондом, специфичным к интактному региону pksl5/l\ у 179 штаммов отмечены положительные результаты гибридизации с зондом специфичным к фрагменту с 7 п.н. деле-цией; 9 штаммов М. bovis и M bovis BCG не давали положительных результатов с используемыми зондами, в виду характерной для этой группы делеции 6 п.н. (Constant et al., 2002), 3 штамма M. africanum также не давали положительных результатов гибридизации с зондом, специфичным к фрагменту с 7 п.н. делецией, хотя не имели данный регион интактным (Constant et al., 2002) (см. табл. 1).

Таким образом, по результатам проводимого типирования, все тестируемые штаммы, относившиеся ко второй и третьей основным генетическим группам, имели 7 п.н. делецию генов pksl5/l, что соответствует данным ранее проводимых исследований (Constant et al., 2002; Marmiesse et al., 2004). Штаммы, имеющие полноценные гены pksl5/l, являлись представителями первой основной генетической группы I, И, X sSNPs кластеров (табл. 1). В процессе анализа нами был обнаружен уникальный штамм М. tuberculosis (TN10445) с характеристиками первой основной генетической группы katGA63 (Leu) и gyrA95 (Thr), имеющий 7 п.н. делецию кластера генов pksl5/l, который по результатам гибридизации также имел TbDl делецию.

Результаты данного исследования подтверждают ранее опубликованные предположения, что 7 п.н. делеция в генах рЫ5/1 появилась у предковых штаммов до возникновения мутаций в генах katG463 (Leu-Arg) и gyrA95 (Thr-Ser), характерных для представителей второй и третьей ОГГ. Однако обнаружение штамма TN10445 позволяет предположить, что данный штамм может быть представителем переходной ветви с «ancestral» типом гена katG463 (Leu) уже имеющих ТЬ01делецию и с 7 п.н. в генах pksl5/l. Тем не менее, повреждение генов рЫ5/1 - не единственный путь нарушения синтеза фенольных гликолипидов. Синтез ФГЛ микобактерия-ми представляет собой многоступенчатый комплексный процесс, требующий взаимодействия продуктов многих генов (Reed et al, 2004). Многие

стадии этого процесса остаются еще не до конца выясненными и требуют проведения дальнейших исследований.

Анализ делеций, характерных для W-Be¡jing штаммов

Данная часть исследовательской работы посвящена выявлению и описанию делеций, характерных для штаммов относящихся к W-Beijing группе, и поиску возможных маркерных делеций для идентификации штаммов различных кластеров внутри W-Beijing филогенетической линии.

Геномные перестройки являются основным механизмом эволюции микобактерий в отсутствии внутри- и межвидового генетического обмена. Штаммы, выделенные от больных туберкулезом в различных эпидемиологических условиях и различных географических регионах, могут существенно отличаться друг от друга, вплоть до потери ~ 10% генома (Tsolaki etal., 2004). В связи с этим, исследование генетических делеций клинических изолятов может дать ценную информацию, как в отношении эволюционного родства штаммов, так и в определении наличия генов, детерминирующих патогенные свойства возбудителя. Анализ делеций у представителей W-Beijing семейства позволит более точно определить место этих штаммов в рамках структуры генетической популяции видов МТК, а также выяснить роль данной группы М. tuberculosis в распространении заболевания.

Для проведения работы была составлена схема предполагаемых делеций. При построении схемы были использованы данные ранее проводимых исследований по изучению регионов различия (RD) у штаммов МТК (Brosch et al., 2002; Mostowy et al., 2002; Hirsh et al., 2004; Tsolaki et al., 2004). Известные данные были сопоставлены с результатами проведенного микрочипового анализа, с использованием генома штамма H37Rv и клинических штаммов - представителей W-Beijing филогенетической линии, а также соотнесения с данными по геномным последовательностями, представленным в электронной on-line версии для штаммов H37Rv (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/genome cgi), CDC 1551 íhttpV/www.tiqr orq/tiqr-scnpts/CMR2/GenomePaqe3 spl?database=qmt). 210 (http.//tiqrblast tiqr.org/ufmq/). Помимо этого были использованы результаты типирования имеющихся в коллекции PHR1 ТВС W-Beijing штаммов, применяемыми в лаборатории методами (описание делеций представлено в таблице 2). RFLP-гибридизацию проводили с зондами, специфичными к различным локусам ДНК, по результатам гибридизации были выявлены различия в структуре многих локусов, некоторые предположительно обуславливались делециями фрагментов.

Таблица 2 Описание предполагаемых делеций, характерных для штаммов М. tuberculosis - представителей W-Beijing группы

Название делеции Локализация в геноме H37Rv (TuberculJsí) Размер делеции, П.Н. Гены входящие в делецию Представители W-Beijing филогенетической линии, для которых характерны делении

D 1 79570-83036 3465 Rv0071, Rv0072,Rv0073. Rv0074,(MTV030) W4.W148, W587, KY, N2

D2* 336370-336556 185 Rv0278c, Rv0279c(MTV035) W587, KY, N2

D 3 1332334-1335142 2807 Rvl 190, Rvl 191, (Rvl 192) W4

D 4 1541175-1543925 2749 lprF, Rvl369c, Rvl370c,Rvl371 N2

D 5 1690876-1691323 446 Rvl500 W4

D 6 1779278-1788526 9247 Rvl572c-Rv 1587c W4, WI48, W587, KY.N2

D 7* 1986553-1996106 9552 Rvl754c, plcD, Rvl756c, Rvl757c, Cutí, Wag22, Rv 1760-Rv 1763 W587, W4, W148, KY.N2

D 8 2128273-2129454 1180 glnA3, Rvl879 KY

D 9 2190598-2194778 4179 Rvl937, ephB, Rvl939, ribAl, Rvl941, Rvl942c N2

D 10 2535433-2536141 707 Rv2262c, Rv2263 W587

DU 2629050-2632837 3786 plcC1527, plcB 1539 W 587, KY

D 12 3004426-3006584 2157 Rv2687c, Rv2688c N2

D 13 3112216-3112766 549 Rv2803, Rv2802c W 587

D 14* 3119943-3127896 7952 DR-region W4.W148, W587.KY, N2

* - делеции, размер которых варьирует у различных представителей \Л/-Ведтд группы, данные приведены для штамма \Л/587

Для подтверждения локализации вероятных делеций были выбраны прай-меры, комплементарные участкам последовательностей, фланкирующих делеции, и проведены ПЦР с представителями различных IS6//0-RFLP кластеров, относящихся к W-Beijing филогенетической линии. В качестве контролей использовались ДНК референтных штаммов из коллекции TBC PHRI (М tuberculosis H37Rv АТСС 35286, CDC 1551 и 210).

При локализации делеции 01были проведены ПЦР с разработанными праймерами, по результатам были получены фрагменты амплификации у всех тестируемых штаммов W-Beijing филогенетической линии, в то время как референтные штаммы H37Rv, CDC 1551, М bovis данной делеции не имели. В случае делеции D1 размер ампликонов варьировал среди различных штаммов, однако разница в размерах ПЦР продуктов, как было выяснено по результатам секвенирования, была обусловлена не размером делеций, а наличием во фланкирующих делецию последовательностях 9 п.н. повторов, варьирующих по количеству у разных штаммов. Таким образом, у тестируемых штаммов были определены делегированные участки ДНК, и размер делеций у представителей W-Beijing группы оказался идентичным, что подтверждено результатами секвенирования. При анализе хромосомного фрагмента, в котором были обнаружены делеции, специфичные для W-Beijing линии, было показано, что аминокислотная последовательность продукта гена Rv0071 имеет сходство с таковой у белков групп II матуразы интронов (Matsuura, 2001). Тандем 9 нуклеотидных повторов располагается на 21 позицию далее от ATG стартового кодона Rv0071 гена и за 26 нук-леотидов до начала делеции. У тестируемых штаммов встречалось от 3 до 9 копий повторов. Повторы не прерывали рамку считывания гена Rv0071. Функции данных повторов остаются невыясненными, однако, подобные варьирующие повторы у многих патогенных бактерий, предположительно, принимают участие в регуляции транскрипции генов (van der Woude et al., 2004).

D6 включает фрагмент ДНК, несущий гены Rvl572c-Rv 1587с, размером 9247 п.н., что соответствует позиции 1779278-1788526 в геноме H37Rv. По результатам ПЦР были получены ампликоны порядка ~ 450 п.н. При последующем секвенировании данные, фланкирующие делецию фрагменты, оказались гомологичными.

В дальнейшем полученные в ходе проводимой работы данные могут быть использованы для проведения более объемного исследования с применением полученных ПЦР продуктов в качестве гибридизационных зондов, для проведения скринингового исследования, с целью выявления воз-

можных специфических характеристик именно для определенных кластеров микобактерий W-Beijing.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика генотипирования с использованием многокомпонентного W-Beijing гибридизационного зонда для прямой идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов микобактерий, ранее типированных IS6110 - RFLP методом.

2. Проведен анализ делений TbDl, RD6, pksl5/l с использованием ГГЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода «molecular beacons» 460 клинических изолятов М. tuberculosis. По результатам анализа этих делеций выявлены распределение и филогенетические взаимоотношения анализируемых штаммов микобактерий.

3. Разработаны молекулярные маркеры «molecular beacons», специфичные для интактного и измененного в связи с микроделецией фрагмента генов pksl5/l, отвечающих за продукцию ФГЛ - факторов вирулентности М. tuberculosis.

4. Выявлены и локализованы делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии. Получены нуклеотидные последовательности фланкирующих некоторые делеции фрагментов.

5. Использование разработанных молекулярных маркеров в практике позволяет увеличить скорость и эффективность выявления эпидемиологически значимых штаммов М tuberculosis.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРИАЦИИ:

l.Sinsimer D., Kurepina N., Marras S.A.E, Mathema В., Likhoshvay K.. Kreiswirth В., Kaplan G. High-throughput detection of an intact pksl5/l gene cluster in diverse clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis II Thesises (poster session), Keystone Simposia, Whistler, British Columbia, 2-7 April 2005, (http://www.keystonesvmposia.org/Meetings).

2.Курепина H.E., Лихошвай Е.Ю., Шашкина E., Мэтэма Б., Кремер К., Ван Сулинджэн Д., Бифэни П., Крэйсвирт Б. Использование специфиче-

ских молекулярных маркеров для гибридизации IS6//0-RFLP блотов с целью быстрой идентификации штаммов W-Beijing среди клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis // Научные труды Всероссийской научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 21-22 апреля 2005.

3.Kurepina N., Likhoshvay Е., Shashkina Е., Mathema В., Kremer К., van Soolingen D., Bifani P., Kreiswirth B. Targeted hybridization of \S6110 fin -gerprints identifies the W-Beijing Mycobacterium tuberculosis strains among clinical isolates // J . Clin. Microbiol. - 2005. - V.43, №5. P.2148-54.

4. Лихошвай Е.Ю.. Курепина H.E., Синсаймер Д., Беликов С.И., Крэйс-вирт Б.Н. Анализ хромосомных делеций TbDl, RD6 и pks 15/1 клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis» II Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2006. - №3. - С.28-32.

5. Said-Salim В., Mathema В., Braughton К., Davis S., Sinsimer D., Eisner W., Likhoshvay Y., Deleo F.R., Kreiswirth B.N. Differential distribution and expression of panton-valentine leukocidin among community-acquired methi-cillin resistant Staphylococcus aureus // J. Clin. Microbiol. - 2005. - V.43, №7. P.3373-9.

-C. 255.

Список сокращений:

ВОЗ

PHRI TBC

W-Beijing

ДНК

RD

ПЦР

pksl5/l

МЛУ

SDS

СТАВ

sSNPs

РРЕ

мтк

кь

- Всемирная Организация Здравоохранения

- Tuberculosis Center of the Public Health Research Institute (Центр исследования туберкулеза при Научно-исследовательском институте здравоохранения, США)

- (Пекинские штаммы) эпидемиологически значимая группа штаммов микобактерий, имеющая сходные биомедицинские и эпидемиологические характеристики

- дезоксирибонуклеиновая кислота

- region of difference (регион различия ДНК)

- полимеразная цепная реакция

- группа генов поликетид синтетазы

- множественная лекарственная устойчивость

- sodium dodecyl sulfate

- cetyltrimethylammoniumbromid

- полиморфизм синонимичных единичных нуклеотидных последовательностей

- группа белков, большинство из которых имеют Pro-Pro Glu (РРЕ) аминокилоты с N - конца

- микобактериотуберкулезный комплекс (Mycobacterium tuberculosis complex), группа микобактерий со сходными свойствами и характеристиками, включающий

М. tuberculosis

- kilo base - lxlO3 нуклеотидных оснований

2,0 QCj d" 4 5 6 t

f i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лихошвай, Екатерина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микобактерий.

1.2. Молекулярно-биологические методы, используемые в эпидемиологических исследованиях возбудителей туберкулеза.'.

1.3. Анализ филогенетических взаимоотношений среди представителей комплекса микобактерий туберкулеза.

1.4. Характеристика эпидемиологически значимой группы микобактерий W/Beijing.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микобактерий, используемые в исследовании.

2.2. Выделение ДНК из культур микобактерий.

2.3. Праймеры, используемые для ПЦР амплификации и секвенирования.

2.4. Приготовление гибридизационных зондов.

2.5. Реактивы для гибридизации по Саузерну.

2.6. Методика RFLP гибридизации.

2.7. Секвенирование фрагментов ДНК.

2.8. Методика гибридизации с молекулярными бикэнами

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ БЫСТРОЙ

ИДЕНТИФИКАЦИИ W-BEIJING ШТАММОВ.

3.1. Анализ результатов гибридизации клинических штаммов с W- Beijing зондом.

3.1.1. dnaA-dnaN межгенный район хромосомы микобактерий.

3.1.2. DR-область хромосомы М. tuberculosis.

3.1.3. Хромосомный локус NTF, (регион В).

3.2. Интерпретация результатов гибридизации с многокомпонентным W-Beijing зондом.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ ХРОМОСОМНЫХ ДЕЛЕЦИЙ TBD1, RD6, PKS15/1 КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ

М. TUBERCULOSIS.

4.1. Гибридизация хромосомных ДНК с TbDl зондом

4.2. Гибридизация с RD6 зондом.

4.3. Гибридизация с зондамиpks 15/1.

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЛЕЦИЙ, СПЕЦИФИЧНЫХ

ДЛЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ W-BEIJING ГРУППЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка молекулярных маркеров для эпидемиологического анализа клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis"

Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем практического здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн. случаев. В Российской Федерации показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза в несколько раз превышают значения по странам Западной Европы (база данных Европейского регионального комитета ВОЗ, <http://data.euro.who.int/hfadb/>). Россия входит в число стран с высокими уровнями заболеваемости (85,4 на 100 тысяч населения -2004 г.) и смертности (21,4 на 100 тысяч населения - 2004 г.) по туберкулезу. Сложные социально-экономические условия жизни населения, военные конфликты, миграция, увеличение числа штаммов возбудителя заболевания, устойчивых к действию противотуберкулезных препаратов, являются одними из основных причин напряженной эпидемической ситуации в России (Перельман, 2001; Шевченко, 2000). Заболеваемость туберкулезом среди населения стала нарастать быстрыми темпами за период 1990-2001 гг. (с 34,2 до 90,7 на 100 тысяч населения соответственно), отмечалось утяжеление клинических форм туберкулеза с реверсией распространенных, генерализованных, остро прогрессирующих случаев, сопровождавшихся обильным бактериовыделением, деструктивным характером поражений, снижением эффективности лечебных мероприятий (Шилова, 1999). Следует отметить, что после 1999 года темпы роста основных эпидемиологических показателей снизились, по сравнению с 1991-1995 гг. Однако тенденции к продолжению накопления резервуара инфекции остаются и по сей день (Шилова, 2001). Особо настораживает увеличение распространенности случаев заболевания с первичной лекарственной устойчивостью (Балабанова с соавт., 2005).

Иркутск является одним из неблагополучных городов по туберкулезу, основные показатели такие, как заболеваемость и смертность превышают среднестатистические показатели по России и составляют 84,9 на 100 ООО и 22,6 на 100 ООО населения соответственно (данные на 2004 г.) (Губанова, 2005). Серьезная эпидемиологическая ситуация в регионе объясняется низким (по сравнению с Европейской частью России) благосостоянием населения, высокой концентрацией мест лишения свободы, ростом числа лиц без определенного места жительства и беспризорных детей, активизацией неконтролируемых миграционных процессов (особенно из эпидемически неблагополучных регионов с высокой распространенностью туберкулеза с МЛУ).

В условиях сложившейся эпидемической ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перспективных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов, что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги туберкулеза.

Актуальность проблемы

Особенности природы заболевания, в частности длительность инкубационного периода, лекарственная устойчивость и отсутствие надежных методов идентификации штаммов возбудителя затрудняют диагностику и лечение туберкулеза, а также эпидемиологические исследования в очагах. Последние достижения молекулярной биологии в сочетании с успехами в области молекулярной генетики микобактерий позволили разработать способы надежной дифференцировки штаммов Mycobacterium tuberculosis (М tuberculosis) на уровне хромосомной ДНК, которые существенно повышают эффективность микробиологической диагностики и эпидемиологических исследований при туберкулезе. Однако подавляющее большинство методов, используемых для молекулярного типирования туберкулеза, отличается многоступенчатостью проведения, недостаточной дискрими-нативной способностью, высокой стоимостью. Проведение исследований, направленных на поиск молекулярных маркеров специфичных для отдельных эпидемиологически значимых групп микобактерий, особенно имеющих лекарственную устойчивость, и разработка простых в исполнении, точных и недорогих методов идентификации групп штаммов М. tuberculosis, а также применение этих методов в комплексе являются необходимым условием успешной организации противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза.

Цели и задачи исследования

Целью исследования являлась разработка молекулярных маркеров и оптимизация методик их использования для идентификации отдельных групп особо вирулентных штаммов М. tuberculosis, в том числе представителей W-Beijing филогенетической линии, среди клинических изолятов микобактерий.

Основные задачи:

• Используя данные ранее проводимых исследований, разработать од-ноэтапный метод для идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов М. tuberculosis:

- учитывая структуру геномных локусов, подобрать соответствующие специфичные праймеры для амплификации фрагментов ДНК;

- создать многокомпонентный гибридизационный зонд для последующего RFLP-анализа;

- применить полученный гибридизационный зонд для идентификации представителей различных кластеров в коллекции PHRI ТВС клинических штаммов М. tuberculosis-, - оценить специфичность и практические преимущества предлагаемого метода.

• Разработать молекулярные маркеры, специфичные для интактного и измененного, в связи с микроделецией, фрагмента гена pks 15/1, отвечающего за продукцию фенолгликолипидов - факторов вирулентности М. tuberculosis, с применением метода RT-PCR с зондами -«molecular beacons».

• Разработать гибридизационные зонды, специфичные для фрагментов TbDl, RD6, pks 15/1.

• Провести анализ делеций TbDl, RD6, pks 15/1 с использованием ПЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода RT-PCR с зондами - «molecular beacons» клинических изолятов М. tuberculosis.

• Провести исследование, базирующееся на секвенировании фланкирующих последовательностей различных по локализации и размеру делеций, представленных в геноме для дифференциации различных кластеров W-Beijing штаммов, а также представителей других филогенетических линий М. tuberculosis.

Научная новизна и практическая значимость работы

На сегодняшний день в литературных источниках описано множество молекулярно-биологических методов для генотипирования штаммов М. tuberculosis. Наиболее широко используемыми методами, относящимися к «золотому стандарту» являются IS5770-RFLP (Restriction fragment length polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК) генотипирование и сполиготипирование (spoligotyping), определение точечных мутаций ассоциированных с лекарственной устойчивостью, а также MIRU-VNTR (полиморфизм тандемов повторяющихся фрагментов и

ДНК) анализ. Учитывая особенности некоторых эпидемиологически значимых групп возбудителей, таких как W-Beijing штаммы: широкую распространенность, высокий уровень смертности при заражении данными штаммами и часто встречающуюся лекарственную устойчивость, идентификация изолятов W-Beijing филогенетической линии имеет большое практическое значение. Только единичные лаборатории имеют возможность применения нескольких методов генотипирования в виду высокой стоимости проведения исследований. Проведение типирования с использованием нескольких методов занимает в лучшем случае 5-10 дней. Больной с активной формой туберкулеза способен заразить в течение месяца от 15 до 100 человек.

Исходя из этого, возникает необходимость в разработке быстрого недорогого и эффективного метода, способного определить микобактерии, принадлежащие к W-Beijing группе. В настоящем исследовании впервые разработан метод генотипирования штаммов W-Beijing, с применением техники RFLP гибридизации, основанный на комплексном использовании нескольких специфичных апробированных маркеров. Метод высокочувствительный, быстрый и удобный для выделения различных групп представителей W-Beijing, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью среди любых штаммов микобактерий. Проведен анализ хромосомных де-леций TbDl, RD6, pksl5/l при сопоставлении результатов с данными IS<5//0-RFLP типирования у анализируемых клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных в различных регионах мира. Впервые описан IS6//0-RFLP кластерный состав предковой («ancestral» - не имеющих TbDl делецию) группы штаммов. Показано распределение исследуемых штаммов по выявленным и ранее известным признакам. Помимо этого, метод детекции штаммов с делетированным pksl5/l фрагментом с использованием методики оценки кинетики ПЦР (RT-PCR, real-time PCR) со специфическими молекулярными зондами - «molecular beacons», позволяет выделить особо вирулентные микобактерии туберкулеза. В работе показаны перспективы совместного комплексного применения простых и апробированных методик для более точного выявления путей распространения инфекции. Описаны делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии. Использование полученных данных в дальнейших исследованиях позволит разработать специфичные молекулярные маркеры. Применение которых, в совокупности с другими методами типи-рования, даст возможность идентифицировать различные подгруппы W-Beijing филогенетической линии, тем самым ускорить выявление эпидемиологических очагов заболевания и с большей достоверностью выявлять цепочки распространения инфекции.

Основные защищаемые положения:

1. Метод гибридизации с многокомпонентным зондом W-Beijing прост, удобен в применении и способен эффективно идентифицировать W-Beijing штаммы среди любых клинических изолятов М. tuberculosis.

2. Распределение делеций TbDl, RD6,pfo75/7 у клинических штаммов М. tuberculosis различных генетических групп и кластеров позволяет выяснить связь возникновения данных делеций с другими маркерными генетическими событиями.

3. Идентификация М. tuberculosis с интактными генами pks 15/1 позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных штаммов среди клинических изолятов.

4. Штаммы линии W-Beijing характеризуются наличием специфических делеций, которые могут использоваться в качестве молекулярных маркеров для выявления отдельных групп микобактерий W-Beijing.

Личный вклад соискателя

В основу диссертации положены исследования, выполненные автором в лаборатории молекулярной эпидемиологии, в Научно-исследовательском институте здравоохранения (PHR1 ТВС, г. Ньюарк, Нью-Джерси, США) в период 2002-2004 г.г. Разработка молекулярных маркеров велась автором самостоятельно под руководством сотрудников лаборатории: Натальи Ку-репиной и Елены Шашкиной, Бэрри Крэйсвирта и научным руководством Беликова Сергея Ивановича (Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск).

Апробация результатов диссертации и публикации

Результаты работы были представлены на конференции в Кейстоуне, 2-7 апреля, 2005 г. (Keystone, США ) и Всероссийской научно-практической конференции в г. Санкт-Петербурге, 21-23 апреля, 2005 г. Основные результаты диссертации опубликованы в 5 печатных работах.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, содержащего 124 источника и 5 приложений. Диссертация изложена на 137 страницах, содержит 6 таблиц, 4 схемы, иллюстрирована 10 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лихошвай, Екатерина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика генотипирования с использованием многокомпонентного W-Beijing гибридизационного зонда для прямой идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов, ранее типиро-ванных IS<5/i0-RFLP методом.

2. Проведен анализ делеций TbDl, RD6, pks 15/1 с использованием ПЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода RT-PCR с зондами-«molecular beacons» 460 клинических изолятов М. tuberculosis. По результатам анализа этих делеций выявлены распределение и филогенетические взаимоотношения анализируемых штаммов микобактерий.

3. Разработаны молекулярные маркеры "molecular beacons", специфичные для интактного и измененного в связи с микроделецией фрагмента генов pks 15/1, отвечающих за продукцию ФГЛ - факторов вирулентности М. tuberculosis.

4. Выявлены и локализованы делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии. Получены нуклеотидные последовательности фланкирующих некоторые делеции фрагментов.

5. Использование разработанных молекулярных маркеров в практике позволяет увеличить скорость и эффективность выявления эпидемиологически значимых штаммов М. tuberculosis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проводимой работы были проанализированы многие участки генома М. tuberculosis. Была создана методика идентификации W-Beijing штаммов, основанная на использовании многокомпонентного W-Beijing гибридизационного зонда (комбинации трех зондов) для регибридизации мембран ранее типированных IS6770-RFLP методом. Мишенями этих зондов являются различные специфичные геномные локусы уникальные для W-Beijing штаммов; предлагаемые маркеры хорошо изучены, дают эффективную и просто интерпретируемую картину регибридизационных профилей и позволяют выделить представителей W-Beijing филогенетической линии, W-Beijing семейства, а также штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, такие как NYC MDR, вызвавший вспышку лекарственно устойчивого туберкулеза в г. Нью-Йорке в 90-х годах.

Техническими преимуществами разработанной методики являются:

• регибридизация с W-Beijing - полизондом может проводиться с мембранами, ранее использованными для рутинного 1S6170-RFLP гено-типирования, проводимого согласно стандартному протоколу, и не требует дополнительного этапа отмывания блотов;

• гибридизация W-Beijing-полизонда с мембранами, хранившимися при комнатной температуре, дает хорошо читаемый и интерпретируемый результат вне зависимости от сроков хранения (до 4-8 лет);

• процедура регибридизации может быть ограничена 4 часами, W-Beijing-зонд в ECL буфере может быть повторно использован для гибридизации как минимум дважды, при хранении при -20°С.

Достоинства методики:

• обладает высокой дискриминативной способностью;

• основана на специфических генетических характеристиках, не лимитирована референтной панелью 1S61 ifl-RFLP профайлов;

• дает однозначную интерпретацию полученных результатов;

• может использоваться для идентификации редких вариантов штаммов микобактерии туберкулеза, не имеющих IS6770 элемента (определяются как «не W-Beijing штаммы»);

• W-Beijing многокомпонентный зонд специфичен для представителей МТК (М africanum, М. bovis, М. canettii, М. microti и М. tuberculosis) и не дает положительной гибридизации с другими видами микобактерий (М avium, М. fortuitum, М. xenopi, М. intracellular, М. marinum, М. phlei).

Разработанная методика на сегодняшний день успешно применяется в лаборатории молекулярной эпидемиологии Научно-исследовательского института здравоохранения (PHRI ТВС, г. Ньюарк, штат Нью Джерси, США) для идентификации представителей W-Beijing группы микобактерии, среди клинических изолятов, поступающих для рутинного типирования. В течение одного рабочего дня по результатам типирования с W-Beijing зондом можно определить принадлежность исследуемых образцов к W-Beijing филогенетической линии. Гибридизация с W-Beijing полизондом также проводится в спорных случаях, когда по данным IS6770-RFLP типирования сложно дать однозначный ответ о степени сходства исследуемых штаммов, принадлежащих одной предполагаемой цепочке передачи. Данная методика, помимо этого, может быть использована для ретроспективного анализа имеющихся гибридизационных блотов, при эпидемиологических исследованиях и выяснении филогенетических взаимоотношений среди микобактерий. Разработанная методика быстро выполнима, надежна и удобна в применении, позволяет сэкономить время и средства и получить необходимую информацию и может быть рекомендована для использования в различных лабораториях, владеющих техникой RFLP гибридизации.

По результатам анализа локусов TbDl, RD6, pks 15/1 методом RFLP гибридизации с разработанными зондами были выявлены штаммы М. tuberculosis, как имеющие делеции в исследуемых локусах, так и с ин-тактными регионами. При сопоставлении полученных данных с результатами типирования исследуемых штаммов по IS6110 элементу, принадлежности к sSNPs кластерам и основным генетическим группам было обнаружено, что все штаммы М. tuberculosis, имеющие интактным TbDl фрагмент являются представителями sSNPs кластера 1, основной генетической группы 1. Таким образом, была охарактеризована группа предшествующих «ancestral type» штаммов М. tuberculosis. Также было показано, что возникновение данной делеции предшествует мутациям, определяющим принадлежность штаммов к 2 и 3 основным генетическим группам и sSNPs кластерам II, X первой основной генетической группы, что подтверждает и дополняет результаты ранее проводимых исследований.

RD6 регион имеет сложную структуру, характеризующуюся наличием вставочных элементов и множественных повторов, свойственных РЕ-РРЕ группам генов. Данный регион очень интересен тем, что делеции в этой области могут быть связаны с проявлением вирулентных свойств микобак-териями (Manabe 2004). По результатам проводимого исследования было выявлено, что делеция данного фрагмента встречается у М. tuberculosis, относящихся к различным кластерам по 1S6110-RFLP, sSNPs анализам. Отдельные кластеры представлены штаммами только с делецией или с интактным регионом, а другие включают как штаммы с делецией, так и штаммы без нее. Однако утверждать о связи RD6 делеции с другими генетическими событиями, определяющими принадлежность к IS6770-RFLP, sSNPs кластерам преждевременно. Так среди высоко вирулентных штаммов W-Beijing филогенетической линии встречались изоляты как с делецией данного фрагмента, так и с интактным регионом. Полученные в ходе исследования данные по некоторым кластерам дают только предварительное представление, т.к. выборка штаммов недостаточна для характеристики всей группы. Таким образом, наличие RD6 делеции у исследуемых штаммов не является строгой характеристикой какой-либо определенной группы М. tuberculosis, выделенной IS6/70-RFLP и sSNPs методами. Однако, для выяснения роли RD6 делеции и вариантов ее локализации и размеров в проявлении вирулентных свойств необходимы дальнейшие исследования данного региона ДНК.

Идентификация штаммов с интактными генами pksl5/l позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных изолятов, в том числе и представителей W-Beijing семейства. Что может быть использовано в эпидемиологических исследованиях и своевременном выявлении вспышек туберкулеза, вызванных наиболее опасными вариантами микобактерий.

В представленной работе были описаны предполагаемые делеции, характерные для различных групп W-Beijing филогенетической линии. Как было сказано ранее, геномные перестройки являются основным механизмом эволюции микобактерий в отсутствии внутри- и межвидового генетического обмена. Штаммы, выделенные от больных туберкулезом в различных эпидемиологических условиях и различных географических регионах, могут существенно отличаться друг от друга, вплоть до потери порядка 10% генома. В связи с этим, исследование генетических делеций клинических изолятов может дать ценную информацию, как в отношении эволюционного родства штаммов, так и в определении наличия генов, детерминирующих патогенные свойства возбудителя. Анализ делеций у представителей W-Beijing семейства позволит более точно определить место этих штаммов в рамках структуры генетической популяции видов комплекса микобактерии туберкулеза, а так же выяснить роль данной группы М. tuberculosis в распространении заболевания.

В дальнейшем полученные в ходе проводимой работы данные могут быть использованы для проведения более объемного исследования с использованием полученных ПЦР продуктов в качестве гибридизационных зондов, а также для проведения скринингового исследования с целью выявления возможных специфических характеристик именно для определенных кластеров микобактерий W-Beijing.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лихошвай, Екатерина Юрьевна, Иркутск; Нью-Джерси

1. Перельман М. И. Ситуация с туберкулезом в России и выполнение Федеральной программы по борьбе с ним // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 8. - С. 3.

2. Шевченко Ю. Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге XXI века // Проблемы туберкулеза. -2000. №3. - С.2-6.

3. Шилова М. В. Эпидемиология туберкулеза в Российской Федерации // Вестник научно-исследовательского института фтизиопульмонологии. -1999.-№ 1.-С. 14.

4. Шилова М. В. Туберкулез в России в конце XX века // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 5. - С. 8.

5. Banu S., Honore N., Saint-Joanis В., Philpott D., Prevost M. C., Cole S. T. Are the PE-PGRS proteins of Mycobacterium tuberculosis variable surface antigens? // Mol. Microbiol. 2002. - V. 44, № 1. - P. 9-19.

6. Barnes P. F., Yang Z., Preston-Martin S., Pogoda J. M., Jones В. E., Otaya M., Eisenach K. D., Knowles L., Harvey S., Cave M. D. Patterns of tuberculosis transmission in Central Los Angeles // Jama. 1997. - V. 278, № 14.-P. 1159-1163.

7. Bauer J., Andersen А. В., Kremer K., Miorner H. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark // J. Clin. Microbiol. 1999. -V. 37, № 8. - P. 2602-2606.

8. Beggs M. L., Eisenach K. D., Cave M. D. Mapping of IS6110 insertion sites in two epidemic strains of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. -2000. V. 38, № 8. - P. 2923-2928.

9. Behr M. A., Wilson M. A., Gill W. P., Salamon H., Schoolnik G. K., Rane S., Small P. M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray // Science. 1999. - V. 284, № 5419. - P. 1520-1523.

10. Bifani P. J., Mathema В., Kurepina N. E., Kreiswirth B. N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends. Microbiol. 2002. - V. 10, № 1. - P. 45-52.

11. Bifani P. J., Shopsin В., Alcabes P., Mathema В., Kreiswirth B. N., Liu Z., Driscoll J., Frothingham R., Musser J. M. Molecular epidemiology and tuberculosis control // Jama. 2000. - V. 284, № 3. - P. 305-307.

12. Brosch R., Pym A. S., Gordon S. V., Cole S. T. The evolution of mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics // Trends. Microbiol. 2001. - V. 9, № 9. - P. 452-458.

13. Cave M. D., Eisenach K. D., Templeton G., Salfinger M., Mazurek G., Bates J. H., Crawford J. T. Stability of DNA fingerprint pattern produced with IS6110 in strains of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1994. -V. 32, № 1.- P.262-266.

14. Clark-Curtiss J. E., Haydel, Sh. E. Molecular Genetics of Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis // Annu. Rev. Microbiol. 2003. - № 57. - P. 517-49.

15. Cole S. Т. Comparative mycobacterial genomics // Curr. Opin. Microbiol. -1998.-V. 1, № 5. P. 567-571.

16. Cole S. T. Comparative and functional genomics of the Mycobacterium tuberculosis complex // Microbiology. 2002. - V. 148, - P. 2919-2928.

17. Driscoll J. R., McGarry M. A., Taber H. W. DNA typing of a nonviable culture of Mycobacterium tuberculosis in a homeless shelter outbreak // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37, № 1. - P. 274-275.'

18. Eisenach K. D., Crawford J. Т., Bates J. H. Repetitive DNA sequences as probes for Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26, № 11.-P. 2240-2245.

19. Fang Z., Forbes K. J. A Mycobacterium tuberculosis IS6110 preferential locus (ipl) for insertion into the genome // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35, №2.-P. 479-481.

20. Fang Z., Morrison N., Watt В., Doig C., Forbes K. J. IS6110 transposition and evolutionary scenario of the direct repeat locus in a group of closely related

21. Mycobacterium tuberculosis strains // J. Bacteriol. 1998. - V. 180, № 8. -P. 2102-2109.

22. Frothingham R., Hills H. G., Wilson К. H. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32, № 7. - P. 1639-1643.

23. Frothingham R., Meeker-O'Connell W. A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats // Microbiology. 1998. - V.144, Pt 5. - P. 1189-96.

24. Glynn J. R., Whiteley J., Bifani P. J., Kremer K., van Soolingen D. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8, № 8. - P. 843-849.

25. Goguet de la Salmoniere Y. O., Kim С. C., Tsolaki A. G., Pym A. S., Siegrist M. S., Small P. M. High-throughput method for detecting genomic-deletion polymorphisms // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42, - P. 2913-2918.

26. Gordon S. V., Brosch R., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Cole S. T. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays // Mol. Microbiol. 1999. - V. 32, № 3. -P. 643-655.

27. Hancock J. The contribution of slippage-like processes to genome evolution // J. Mol. Evol. 1995. - V. 41, № 6. - P. 1038-1047.

28. Hirsh A. E., Tsolaki A. G., DeRiemer K., Feldman M. W., Small P. M. Stable association between strains of Mycobacterium tuberculosis and their human host populations // PNAS. 2004. - V. 101. - P. 4871-4876.

29. Huard R. C., Lazzarini L. C., Butler W. R., van Soolingen D., Ho J. L. PCR-Based Method To Differentiate the Subspecies of the Mycobacterium tuberculosis Complex on the Basis of Genomic Deletions // J. Clin. Microbiol. -2003.-V. 41.-P. 1637-1650.

30. Kapur V., Whittam T. S., Musser J. M. Is Mycobacterium tuberculosis 15,000 years old? //J. Infect. Dis. 1994. - V. 170, № 5. - P. 1348-1349.

31. Soolingen. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes. // Clin. Exp. Immunol. -2003.-V. 133.-P. 30-37.

32. Mahairis G. G., Sabo, P. J., Hickey, M. J., Singh, D. C., Stover, С. K. Molecular analisis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis // J. Bacteriol. 1996. - № 178. - P. 1274-1282.

33. Marras S. A., Kramer F. R., Tyagi S. Multiplex detection of single-nucleotide variations using molecular beacons // Genet. Anal. 1999. - V. 14, №5-6.-P. 151-156.

34. Maus С. E., В. В. Plikaytis, and Т. М. Shinnick Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 571-577.

35. McAdam R. A., Hermans P. W., van Soolingen D., Zainuddin Z. F., Catty D., van Embden J. D., Dale J. W. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence belonging to the IS3 family // Mol. Microbiol. -1990. V. 4, № 9. - P. 1607-1613.

36. Mostowy S., Cousins D., Brinkman J., Aranaz A., Behr M. A. Genomic Deletions Suggest a Phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis Complex // J. Infect. Dis. 2002. - V. 186, № 1. - P. 74-80.

37. Munsiff S. S., B. Nivin, G. Sacajiu, B. Mathema, P. Bifani, and B. N. Kreiswirth Persistence of a highly resistant strain of tuberculosis in New York City during 1990-1999. // J. Infect. Dis. 2003. - V. 188. - P. 356-363.

38. Musser J. M., Amin A., Ramaswamy S. Negligible genetic diversity of mycobacterium tuberculosis host immune system protein targets: evidence of limited selective pressure // Genetics. 2000. - V. 155, № 1. - P. 7-16.

39. Plikaytis В. В., Marden J. L., Crawford J. Т., Woodley C. L., Butler W. R., Shinnick Т. M. Multiplex PCR assay specific for the multidrug-resistant strain W of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32, № 6. -P. 1542-1546.

40. Ramaswamy S., Musser J. M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tuber. Lung. Dis. 1998. - V. 79, № 1. - P. 3-29.

41. Reed M. В., Domenech, P., Manca, C., Su, H., Barczak, A.K., Kreiswirth, B.N., Kaplan, G., Вапу, C.E. // Nature. 2004. - V. 431. - P. 84-87.

42. Rengarajan J., С. M. Sassetti, V. Naroditskaya, A. Sloutsky, B. R. Bloom, Rubin E. J. The folate pathway is a target for resistance to the drug para-aminosalicylic acid (PAS) in mycobacteria // Mol. Microbiol. 2004. - V. 53. -P. 275-282.

43. Rhee J. Т., Tanaka M. M., Behr M. A., Agasino С. В., Paz E. A., Hopewell P. C., Small P. M. Use of multiple markers in population-based molecularepidemiologic studies of tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - V. 4, № 12. - P. 1111-1119.

44. Ross В. C., Raios K., Jackson K., Dwyer B. Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and its use as an epidemiological tool //J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30, № 4. - P. 942-946.

45. Salamon H., Kato-Maeda M., Small P. M., Drenkow J., Gingeras T. R. Detection of deleted genomic DNA using a semiautomated computational analysis of GeneChip data // Genome. Res. 2000. - V. 10, № 12. - P. 20442054.

46. Sampson S. L., Warren R. M., Richardson M., van der Spuy G. D., van Helden P. D. Disruption of coding regions by IS6110 insertion in Mycobacterium tuberculosis // Tuber. Lung. Dis. 1999. - V. 79, № 6. - P. 349359.

47. Skuce R. A., McCorry T. P., McCarroll J. F., Roring S. M. M., Scott A. N., Brittain D., Hughes S. L., Hewinson R., Glyn N. D. S. Discrimination of

48. Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets //Microbiology. -2002. -V. 148, №2. P. 519-528.

49. Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - V. 16. - P. 463496.

50. Stead W. W. Pathogenesis of the sporadic case of tuberculosis // N. Engl. J. Med. 1967. - V. 277, № 19. - P. 1008-1012.

51. Supply P., Mazars, E., Lesjean, S., Vincent, V., Gicquel, В., Locht, C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome // Mol. Microbiol. 2000. - V. 36, № 3. - P. 762-771.

52. Supply P., Warren R. M., Banuls A. L., Lesjean, S., Van Der Spuy G. D., Lewis L. A., Tibayrenc, M., Van Helden, P. D., Locht, C. Linkage disequilibrium between minisatellite loci supports clonal evolution of

53. Mycobacterium tuberculosis in a high tuberculosis incidence area // Mol. Microbiol. 2003. - V. 47. - P. 529-538.

54. Thierry D., Cave, M. D., Eisenach, K. D., Crawford, J. Т., Bates, J. H., Gicquel, В., Guesdon, J. L. IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex // Nucleic. Acids. Res. 1990. - V. 18, № 1. - P. 188.

55. F., Qing H. Z., Enkhsaikan D., Nymadawa P., van Embden J. D. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33, № 12. - P. 3234-3238.

56. Warren R. M., Victor, T.C., Streicher, E.M., Richardson, M., van der Spuy,

57. G.D., Johnson, R., Chihota, V.N., Locht, C., Supply, P., van Helden, P.D. Clonal expansion of a globally disseminated lineage of Mycobacterium tuberculosis with low IS6110 copy numbers // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. - P. 5774-5782.

58. Yang Z. H., Bates,J. H., Eisenach, K. D., Cave, M. D. Secondary typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with matching IS6110 fingerprints from different geographic regions of the United States // J. Clin. Microbiol. 2001. -V. 39.-P. 1691-1695.

59. Yeh R. W., Ponce de Leon, A., Agasino, C.B., Hahn, J.A., Daley, C.L., Hopewell, P.C., Small, P.M. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes// J. Infect. Dis. 1998. - V. 177, № 4. - P. 1107-1 111.

60. Zainuddin Z. F., Dale J. W. Polymorphic repetitive DNA sequences in Mycobacterium tuberculosis detected with a gene probe from a Mycobacterium fortuitum plasmid // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, № 9. - P. 2347-2355.

61. Zainuddin Z. F., Dale J. W. Does Mycobacterium tuberculosis have plasmids? // Tubercle. 1990. - V. 71, № 1. - P. 43-49.

62. Zhang M., Gong J., Yang Z., Samten В., Cave M. D., Barnes P. F. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. 1999. - V. 179, № 5. - P. 12131217.