Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое изучение клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis"

На правах рукописи

ИВАНОВ Иван Юрьевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МУСОВЛСТЕМиМТиВЕКСиЬОБт

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научный центр прикладной микробиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель:

кандидат биологических наук Шемякин ИТ.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Поспелова В.В.

доктор биологических наук Черноусое* JLBL

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «_»_2004 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.046.01 при Московском Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан

2004 года

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке МНИИЭМ им. Г Л. Габричевского.

Учёный секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук

С Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Туберкулёз остаётся одним из наиболее распространённых и опасных заболеваний человека. Возбудителем туберкулеза инфицировано около трети (2 млрд.) • населения земного шара. [Туберкулёз, М, 2002]. Тяжелое положение, связанное с ростом заболеваемости туберкулёзом, наблюдается в последние годы и в России. По данным литературы, заболеваемость им возросла с 34 в 1991 г. до 48,7 в 1998 г. на 100000 населения и ситуация продолжает ухудшаться [Перельман М.И. и др., 2001; Shilova M.V.4, Dye С,

В сложившейся ситуации для эффективного осуществления эпидемиологического анализа необходимы данные, получаемые при использовании молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации клинических штаммов М. tuberculosis. Они позволяют быстро установить источник инфекции, пути передачи возбудителя инфекции и ареал его распространения [Туберкулёз, М., 2002]. К настоящему времени за рубежом по рекомендации ВОЗ на основании результатов, полученных с применением молекулярно-генетических методов типирозания клинических штаммов микобактерий, создаётся база данных, содержащих результаты RFLP-IS6/70 и сполиготипирования [WHO, Geneva and IUATLD, Paris, 1994]

На данный момент опубликовано большое количество работ по молекулярно-генетическому типированию штаммов М. tuberculosis, проводимому в большинстве развитых стран и во многих развивающихся странах. В то же время в России такие работы только начали проводиться. Данные по молекулярно-генетическому типированию штаммов М tuberculosis получены лишь для некоторых регионов РФ [Нарвская О.В. и др., 2000; Черноусова Л.Н. и др., 2001; Toungoussova OS. et al., 2002].'Кроме этих исследований было проведено совместное исследование Центральным НИИ туберкулеза РАМН с PHRI (Нью-Йорк, США) по генотипированию микобактерий, выделенных на отдельных территориях России [Черноусова Л.Н. и др., 2001]. Для такой большой страны по территории и численности населения как Россия этого явно недостаточно.

Таким образом, молекулярно-генетические исследования штаммов М. tuberculosis в России находятся на начальных этапах развития. Это обусловлено как экономическими причинами, так и отсутствием ~ нормативной базы для проведения исследований с использованием молекулярно-генетических методов, что и определяет актуальность

2001].'

проведённого нами исследования.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Определить- спектр клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих среди больных туберкулёзом в средней полосе Европейской части России.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Охарактеризовать штаммы М. tuberculosis с использованием микробиологических и

молекулярно-генетических методов (сполиготипирования, RFLP-IS6//0, RFLP-.PGRS И VNTR).

2. Определить генетические различия между штаммами М. tuberculosis, выделенными

от больных из городов Тулы, Калуги, Нижнего Новгорода и от заключённых больных тюрем г. Серпухова (Московская область) и пос..Озерки (Тульская область).

3. Создать коллекцию клинических штаммов М. tuberculosis

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

С помощью современных методов выявлен спектр штаммов М. tuberculosis, циркулирующих среди больных в городах Тула, Калуга, Нижний. Новгород и среди заключённых больных в тюрьмах г. Серпухова и пос. Озерки

Охарактеризован новый генотип клинических штаммов М tuberculosis - AI. Показано его широкое распространение среди больных, проживающих на изученных территориях. Выяснено, что среди изолятов генотипа AI - преобладают штаммы, устойчивые к лекарственным препаратам.

Выявлена низкая степень кластеризации штаммов М. tuberculosis. Это свидетельствует о том, что в исследованных группах больных имеет место реактивация эндогенной инфекции.

ПРАКТИЧЕСКОЕЗНАЧЕНИЕРАБОТЫ.

Сформирована коллекция, состоящая из 527 штаммов Д/, tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом с 1999 по 2001 год. Создана компьютерная база данных, содержащая информацию о микробиологических свойствах, лекарственной устойчивости и принадлежности штаммов hi. tuberculosis к разным генетическим группам Получен акт № 16 от 19 декабря 2003г. о внедрении результатов диссертации в научно-исследовательскую работу Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» Минздрава Российской Федерации.

Генотипирование штаммов М. tuberculosis по всем молекулярно-генетическим маркерам с 2002 гола внедрена в работу отдела белковой инженерии №38 Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» МЗРФ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Среди больных туберкулёзом городов Тулы, Калуги, Нижнего Новгорода и среди заключенных больных г. Серпухова и пос. Озерки преобладают штаммы М. tuberculosis генотипов W и AI.'

2. Штаммы генотипа AI обладают следующими характеристиками: сполиготип LAM,' RFLP-IS6/70 профиль содержит характерный набор из 11 рестрикционных-фрагментов молекулярной массой от 6010 до 920 пар нуклеотидных оснований, и ETR- локусы А, В, С, D, Е и F содержат по 2 тандемных повтора:

3. Лекарственной устойчивостью к пяти (STR; RTF, INH, KAN, EMB) противотуберкулезным препаратам первого ряда по отдельности, обладают 93,0 % клинических штаммов охарактеризованного генотипа AI. Множественную лекарственную устойчивость проявляют 66,0 % клинических штаммов этого генотипа.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. По материалам работы были сделаны сообщения: на 32-ой-Всемирной конференции по заболеваниям лёгких в г. Париже (32л IUATLD world conference on Lung Health, Organised by the International Union against Tuberculosis & Lung Decease,1 Paris, France, November 1-4, 2001); на 23-ем-ежегодном конгрессе Европейского общества микобактериологов в г. Дубровник (23rd Annual Congress ofthe European Society of Mycobacterium, Dubrovnik, Croatia, June 23-26, 2002); на VII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2003). Диссертация обсуждена и одобрена на лабораторном научном семинаре отдела белковой инженерии №38 Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» МЗ РФ.' (протокол № 35 от 11.12.2003 г.)

ПУБЛИКАЦИИ, Основное содержание диссертации опубликовано в десяти печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 24 работьь отечественных и 218 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 13 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. Бактериальные штаммы. Исследованы клинические штаммы М. tuberculosis выделенные из мокроты больных туберкулезом легких. Образцы мокроты были получены из областного противотуберкулезного диспансера г. Тулы, тюрьмы, расположенной в пос. Озерки Тульской области, противотуберкулёзного диспансера г. Калуги, тюрьмы г.

Серпухова и противотуберкулёзных диспансеров Павловского и Дзержинского районов г. Нижнего Новгорода. Для культивирования микобактерий использовали питательную среду Левенштейна-Йенсена. Референс-штаммы: A/, tuberculosis H37Rv и H37Ra (ГИСК им. Л А.Тарасевича) A, tuberculosis H37Rv ATCC (предоставлен доктором В. Clifton, National Institutes of Heah, U.S.A.) и A/, bovis BCG ^^M им. Н.Ф. Гамалеи PAM^. Штаммы хранятся в лактозно-глицериновой защитной среде при -70°С.

1.2. ВИДОВАЯ идентификация клинических штаммов М. tuberculosis.

Видовую идентификацию штаммов Af. tuberculosis проводили совместно с Корбовой О.В [«Mетодические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез», M., 2001; Приказ №109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», M, 2003]. При идентификации штаммов проводили бактериоскопию мазков, учитывали скорость роста культуры при 37°С, способность к росту при 22°С, 45°С, а так же морфологию и цвет колоний. Кроме этого использовали тест на определение способности M tuberculosis к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 500-1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия и ниациновый тест. При определении активности и термостабильности каталазы в дополнение к вышеуказанным методическим материалам была использована методика Kent P.T. et al, 1985. При определении лекарственной устойчивости Д/, tuberculosis к стрептомицину (STR), изониазиду (INH), канамицину (KAN), этамбутолу (ЕMВ) и рифампицину (RIF) методом абсолютных концентраций in vitro к вышеуказанным методическим материалам была использована методика Canetti G. et al., 1963.

1.3. Молекулярно-генетические методы типирования клинических штаммов М tuberculosis.

Выделение хромосомной ДНК, амплификация инсерционного элемента IS61J0 и RFLP-IS6770 осуществлялась по методикам, приведённым в работе van Embden J.D.A. et al., 1993. Сполиготипирование выполняли по методике описанной Kamerbeek J. et al., 1997. RFLP-PGRS проводили по методике, изложенной van Soolingen D. et al., 1993 и Ross В. С. et al, 1992, a VNTR (ETR A-F) - no Frothingham R., Meeker-O'Connell W., 1998 Полученные данные анализировали с помощью программы GelCompar П (Windows 98, version 2,5; Applied Maths, Belgium) и визуально. Была вычислена значимость различия двух средних значешш с использованием /-критерия Стьюдента и доверительный интервал с достоверностью 95% на основании биномиального распределения [Ашмарин, Воробьев, Л, 1962; пакет программ MATLAB 5.3.11 (MathWorks Inc., USA)]. Mатематическyю обработку полученных результатов осуществляли совместно с Липииым M.Ю.

1500а.в.а

>-IS61Í0

tuberculosis, группе W

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ.

.2.1. Характеристика штаммов М tuberculosis, выделенных'от заключённых, больных туберкулёзом, из тюрьмы г, Серпухова (Московская-область).

По одному штамму было выделено от 85 больных, от 27 больнык было выделено по 2

штамма и от одного больного было выделено 3 ;:¡-y>.4íKlf,""'> штамма М tuberculosis. В тех случаях, когда

несколько штаммов, выделенных от одного j «■.Г"* — больного с интервалом не менее трёх месяцев,

— — •» имели идентичные КЕЬР-186/70»паттерны, при

' '.—.„v- ■ ■ •" — •■V* дальнейшем анализе учитывался только один из

* / лМт ЯГ Л " ж

i .... . ~--"* них. Этот подход к анализу штаммов применялся

во всех исследованиях.

Методом RFLP-IS5//0 проанализировано 142 клинических штамма М. tuberculosis. Штаммы. с коэффициентом подобия,- равным- единице/ объединяли в кластеры. 51,6% (п 64) штамма образовали 15 кластеров и 48,4% штаммов имели

семействам, г w-стащарты молекулярных - уникальные RFLP-профили. масс.

Выявлено наличие четырёх больших групп штаммов (рис. I). Штаммы, одной группы имели коэффициент подобия Sr=0,67 и характерный набор рестрикционных фрагментов 6010, 5280, 5020, 4780, 4320, 3750, 3230, 2850, 2180, 2080, 1920, 1240, 1150, 1090 п.н.о. Среднее арифметическое - количество фрагментов на один штамм; равно 15. Штаммы четвертой • группы - имели Sr=0,78 и характерный набор рестрикционных фрагментов ДНК 9130, 7250, 5280, 4780, 4320, 3750, 3230, 2850, 2450, 2180, 2080, 1920, 1380, 1240, 1150, 1090 п. н. о. Среднее арифметическое количество рестрикционных фрагментов на один штамм равно 17. Характерные наборы рестрикционных фрагментов изолятов третьей и четвёртой групп указывают на их принадлежность к описанному ранее генотипу W (Рис. 1, профили 1 и 2) |l5if;ini P.J. et al., 1996; Agerton T. et al., 1999]. W-генотипу принадлежали 48,4% (n=60) исследованных штаммов.

Штаммы двух других групп имели Sk=0,47 и Sk=0,68 и характерный- набор рестрикционных фрагментов ДНК 6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 п.н о. Среднее арифметическое количество фрагментов ДНК на один штамм равно 11 (рис. 1, профиль 4). Штаммы с такими характеристиками были объединены в генотип AI, в который попало 27 % (п=34) исследованных штаммов.

Для пяти штаммов (4,0%) были получены RFLP-IS61I0 профили с рестрикционными фрагментами, характерными. как для генотипа AI, так и для W генотипа. Это свидетельствовало о том, что анализируемые образцы содержали хромосомную ДНК нескольких штаммов Остальные 21,8% (п=27) штаммов не попали ни в одну из трёх вышеназванных групп (рис. 2).

Методом RFLP-PGRS дополнительно были- исследованы кластеры, сформировавшиеся при RFLP-IS6//0 генотипировании (табл. 1).

Таблица 1.

Данные RFLP-PGRS генотипирования трех из пятнадцати RFLP-1S67/0 кластеров, включающих 39* штаммов М. tuberculosis.

RFLP-ВбШ кластер RFLP-PGRS генотнпирование алши RFLP-PGRS подкластер>

1 ilmlit'i iifl '»•"» i IIIIII i i mi llllllll 1111 «••»« llllllll 1 lili '•«» IIIIIIII lllll <•««• llllllll lllll 1 lililí 1 1 lili •»'«• llllllll lllll. . llllllll lllll .'»•"» llllllll IM ' НЧИ1 1 1 lllllllll 1 II 1 w» A

' 8 . IIIIÍIIIIIDIIIII II M"« • lllíllllllllllllll IIP"« lili «111 ПИШИ! III'«« ПИШИ llllllll II I"""« lili я. II \ . .,. «»«' 1 lllll 1 ' lililí II «">"« llllllll «e» lllll II 35/73 H I унтами! профмь yimiMirt профиль

12 —I MI • ll> H til II «1 u III H lll II l'l II lll H lll II lll n lll II lll lj lll lll I lili III 9 III 1 lj •»» II "" II 1IM/I* II . 1Я1Л1 II ИЛ1 II 4« I IMI II «"■ II II. . |S oii'H lili II lll Mil ll lll "» lililí lll"« : N-. м

•Примечание: нет данных по ЯГи-РО^ гснотштроваигао дм ппаммов: 1481 (ВДЫЧ!>б//0 кластер №1), 3022/4 оиим^/О кластер № 8) и 1437, 155/6 (НШЧ&ШО кластер № 12).

Этот метод применяется для более тонкой дифференциации штаммов попадающих в один кластер при их генотипировании методом RFLP-IS6//0. Было исследовано 15 кластеров включающих 64 штамма. По 2 штамма содержали 11 кластеров; кластер № 10 содержал три штамма; кластер №8 содержал десять штаммов; кластер № I содержал 12 штаммов; и кластер № 12 содержал 17 штаммов. Из данных, приведённых в таблице 1 видно, что кластеры •№№ 1, 8 и 12, при их исследовании методом RFLP-PGRS распадались на подкластеры. RFLP-1S6//0 кластер №1 содержал 11 штаммов. Он состоял из подкластера А,

содержавшего 10 штаммов, и штамма 7/25, имеющего уникальный PGRS профиль (табл. 1). RFLP-IS6V./0 кластер №8 содержал 9 штаммов и состоял из двух подкластеров: подкластера Н, содержавшего 4 штамма, и подкластера I, содержавшего 3 штамма Два штамма (5/23 и 35/23) имели уникальные PGRS-профили (табл. 1). RFLP-IS67/0 кластер №12 состоял из двух подкластеров: подкластера М, содержавшего 3 штамма и подкластера N, содержавшего 12 штаммов (табл. 1). Кластеры №№ 2-7, 9-11 не дифференцировались на подкластеры

Таким образом, при дополнительном анализе 15 кластеров методом RFLP-PGRS выявлено, что штаммы, образовавшие три RFLP-IS6//0 кластера №№ 1, 8 и 12 генетически различны (табл. 1).

124- клинических штамма были- исследованы- методом сполиготипирования. Девяносто девять (80,0±6,6 %) клинических штаммов М. tuberculosis распределились на 8 сполиготипов. Двадцать пять (20,0±6,6%) штаммов имели уникальные сполиготипы. Наиболее многочисленный сполиготип, включающий 55 (44,4±8,3 %) штаммов, относился к группе сполиготипов Beijing. В эту же группу сполиготипов включены три штамма со сполиготипами 000000000003371 и 000000000003731 [Filliol I. et al., 2002; Mokrousov I. et al., 2002] (табл. 2)..

К группе сполиготипов LAM1 (Latino-American and Mediterranean) относились 15 (12,1±5,1 %) штаммов. Сполиготип LAM9 имели. 9 (7,3±4,1 %) штаммов. Уникальные сполиготипы в группе LAM1 были у 8 штаммов.

Группа сполиготипов Haarlem включала. 10 сполиготипов, девять из которых были уникальны (табл. 2). Всего в группу сполиготипов Haarlem попали 12 (9,8±4,1 %) штаммов.

Сполиготипы R57 и R15 [Нарвская О.В. и др.; 2002] включали 1 и.2 штамма, соответственно.

Пять сполиготипов, один из которых - 777777777763771 включал шесть (4,8±2,9%) штаммов, не были идентифицированы согласно международной базе данных (табл. 2).

Согласно результатам, полученным методом сполиготипирования, среди заключённых больных туберкулёзом в Серпухове наиболее часто встречались штаммы групп Beijing (48,4 ±8,4 %), LAM (29,0±7,4 %) и Haarlem (9,8 ±4,1 %) (табл. 2).

При сравнении данных, полученных методами сполиготипирования и KFLP-IS61J0 выявлено, что все штаммы генотипа W имели сполиготип Beijing, а штаммы генотипа AI обладали сполиготипом LAM.

Таблица 2.

Сполиготипы штаммов М. tuberculosis, выделенных от заключенных больных в г. Серпухов.

Группа сиолнголию» Fillio!. я «1, 2002. Восьмеричный год сполиготипа по Dale И al., 2002. Сполнгограмма (□ - отсутствие сигнала, ■ - наличие сигнала при гибридизации). Количество штаммов -

Beijrng 000000000003771 епшхшхпшнххшшлооооогм 55

000000000003371 □UUUJLaiXILJLlJLJUU^ " 4

000000000003731 ПГГЛПГК К П ГГ'ГТ"УУ;'СУТПРППГГ юопппгп rranirm 1

LAMI 777477607760771 ■■■■«•••«аюзатмтяопсхлвмааааасхславаам 15

775740003760771

003777607760771 1

777401607760771 1

777760001560771 1

777760007760771

777740003760771 1

777763007760771 1

777677003420771 ■••■•■■■■•■UM««««QULAJLjaC«S«aQC«CX3CX3««UMI« 1

LAM9 777777607760771 ■амппмиамтмшяпятяаоасмит

Haarkan . 774777777420771

777777700020731

674777377420771 1

777737777420771 1

777737777423771 ■■»■■■■«■■■ааааааааипнмазояоомшмм 1

777007774020771

774777774000771 ■■инжлпиитиамнисшзйэхойааваааа 1

777777774020771

R15 000000004020771 □адцгядцшл i ■ гтгтаошаддшдмааим

RÍ7 777777607763771 ■1«||импнаа«тяааосим«п«астиИ11

Т 777477607763771 ссдаамаиишмм—ааиосимааи 1

TI 777777777760771 1

737776777760771 1

- 777777777763771

- 777777707760771 ■«»■■■■■■«■■■■■■■»■В' 1 • 'Ш j : ;

- 777737777423771 1

- 777677637763771 ■■тмпмстаткппмппйминма

774777777423771 1

Таким образом, по данным метода RFLP-IS6//0 среди заключённых больных туберкулёзом в г. Серпухов превалировали штаммы М. tuberculosis, относящиеся к W (48,4 ±8,4%) и А1(27,4±7,4%) генотипам (рис. 2).

Методом RFLP-PGRS три кластера были дифференцированы на подкластеры и, следовательно, они образованы генетически различными штаммами (табл. 1).

2.2. Характеристика штаммов Л/, tuberculosis, выделенных от заключённых, больных туберкулезом, тюрьмы пос. Озерки (Тульская область).

Исследовано 115 клинических штаммов A/, tuberculosis От 96 пациентов было выделено по одному штамму и от 4 пациентов было выделено 11 штаммов с интервалом не менее одного месяца. Все пациенты были разделены на группы; группу А, которая включает 32 больных, являющихся бацилловыделителями и никогда .ранее не принимавших противотуберкулезных препаратов или принимавших их менее 1 месяца и группу В (п 71), k пациенты которой принимали более одного месяца один или несколько лекарственных препаратов и при этом продолжали выделять микобактерий с мокротой.

Методами RFLP-IS6//0 и сполиготипирования было исследовано 103 штамма. При типировании методом RFLP-IS6//0 65 (63,1±8,8%) клинических штаммов М. tuberculosis распределились по 15 кластерам и 38 (36,9 ±8,8 %) имели уникальные паттерны.

К генотипу AI принадлежали 8,7±4,8 % (п 9) штаммов, полученных от больных группы А и 46,5±10,8 % (п 33) штамма - от больных группы В, а к генотипу W - 8,7±4,8 % (п 9) штаммов, полученных от больных группы А и 31,1±10,8 % (п 32) штамма - от больных группы В Двадцать (19,4±7,1 %) штаммов не принадлежали ни к одному из выше названных генотипов

При исследовании методом сполиготипирования 103 штаммов микобактерий обнаружено/ что 93,2±4,3% (п 96) штаммов распределились в семь

сполиготипов и семь штаммов 6,8±4,9 %) имели уникальные паттерны. К сполиготипу Beijing относятся 39,8±8,9% (п 41). Штаммы, принадлежащие к AI семейству при rflp-is6//o типировании, сгруппированы преимущественно в двух сполиготипах LAM1 и LAM9.

Таблица 3.

Сполиготипы штаммов М tuberculosis, выделенных от заключённых больных в пос. Озерки.

Класснфижа щи по FillioL « al., 2002. Восьмеричный код сполвгопша по Dale ct al, 2002. Сподигограмма (а • отсутствие сигнала, ■ - наличие сигнала при гибрилтцяи). Количества иггаммов

Beijing 000000000003771 41

LAMI 777477607760771 30

775740003760771 ■ииплптгааоашстяннистлиин 1

777740000360771 1

LAM2 7700007Т7760771 3

774000000760771 1

LAM4 777777607760731 1

LAM9 777777607760771 13

Haarlem 774777777420771 з •

777777777600771 •■■■■ппваншататимктпглтаю 1

776377777420771 1

774777717420771 ■■•■»■□□■■•■■■■■■■тоопяаасссяшисвввян«« 1

T 777777777760771 •■«■■■■■■■■•■■■■■■■■■■■■■■■■•■■■□□□□■■■аавв 3

Среди заключённых больных туберкулезом в пос. Озерки преобладали штаммы М. tuberculosis, относящиеся к AI (40,8±8,9 %) и W/Beijing (39,8±8,9 %) генотипам (Рис. 2).

При сравнительном анализе штаммов выделенных от больных групп А и В показано, что заболеваемость, вызываемая штаммами генотипов AI и W в три раза ниже у больных группы А (Рис.3)

При сравнительном анализе выявлено, что частота встречаемости штаммов М tuberculosis генотипа AI среди заключённых больных в Серпухове (27,4±7,4 %) и Озерках (41±9 %) достоверно различна (р<0,05) (рис. 2).

При исследовании соотношения RFLP-IS6//0-reHonmoB и сполиготипов микобактериальных штаммов для двух тюрем показано, что все штаммы генотипа W относятся к сполиготипу Beijing, а штаммы генотипа А1 имеют сполиготип LAM.

2.3. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом в г. Тула.

Методом RFLP-IS6//0 проанализировано 233 клинических штамма A/, tuberculosis От 99 больных выделено по одному штамму, от 55 больных - по два и более штаммов с интервалом не менее одного месяца Сто двадцать (69,8±б,6%) штаммов из 172 распределились в 16 кластеров и 52 (30,2±6,6%) штамма имели уникальные RFLP-IS6//0 профили. Генотипу AI принадлежали 55,2±7,1 % (п 95) штаммов. Генотипу W принадлежали 30,8±6,6% (п 53) исследованных штаммов. У семи (4,1±7,1 %) штаммов RFLP-профили содержали фрагменты, характерные как для генотипа AI, так и для генотипа W, что свидетельствовало о присутствии в анализируемых образцах хромосомной ДНК нескольких штаммов. Остальные 9,9±4,1 % (п 17) штаммов не относились ни к одной из трёх выше названных групп (Рис. 2).

Таким-образом, в Тульской области среди больных туберкулёзом превалировали клинические штаммы- A/, tuberculosis, относящиеся к AI (55,2%) и W/Beijing (30,8%) генотипам (Рис. 2)

2.4. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом в г. Калуга.

Методом RFLP-IS6U0 проанализировано 62 клинических штамма Л/, tuberculosis. Двадцать семь (47,4±12,0 %) из 57 штаммов распределились в 8 кластеров. Тридцать штаммов (52,6±12,6%) имели уникальные RFLP-паттерны AI генотипу принадлежали 35,1±11,4 % (п 20) исследованных штаммов. W генотипу принадлежали 43,8±11,9 % (п 25) исследованных штаммов. Штаммы не относящиеся ни к одному из двух генотипов составили 21,1 ±9,5 % (п 12) (Рис. 2).

Следовательно, по распространенности среди больных туберкулезом в Калуге преобладали штаммы, относящиеся к W генотипу (43,8%) Вторым по распространенности были штаммы генотипа AI (35,1%).

2.5. Характеристика штаммов Л/, tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом в г. Нижний Новгород.

Методом RFLP-IS6110 проанализирован 71 штамм Д/, tuberculosis, выделенный от 38 больных Дзержинского и 33 больных Павловского районов Нижнего Новгорода.

Сорок четыре штамма (62,0± 10,0%) распределились в 9 кластеров Двадцать семь штаммов (38,0± 11,0%) имели уникальные RFLP-паттерны. AI-генотипу принадлежали 7

(9,9±6,1 %) штаммов W-генотипу принадлежали сорок (56,3±10,8 %) штаммов К генотипу W также принадлежали пятнадцать (21,1±8,7 %) штаммов имеющих RFLP-IS677O профили с фрагментами ДНК молекулярной массой 13000, 6010, 5090, 3230, 2750, 2620, 2180, 1380, 1240,1150 и 1090 п н о и средним арифметическим количеством фрагментов на один штамм равным 11 Исследование этис штаммов методом сполиготипирования показало, что все они имели сполиготип Beijing Они были обозначены как NN-rpynna W-генотипа Девять (12,7±6,9 %) штаммов не относились ни к одной из выше названных групп (Рис 2) При проведении анализа частоты встречаемости штаммов, полученных от больных туберкулезом в Павловском (п 33) и Дзержинском районах (п 38) города Нижний Новгород обнаружено, что в Павловском районе генотипу AI принадлежали пять (15,2± 10,4%) штаммов W генотипу принадлежали шестнадцать (48,5±15,4 %) штаммов К NN-подгруппе W-генотипа относились семь (21,2±12,2 %) штаммов Всего к W-генотипу принадлежали 23 (69,6±14,0 %) штамма Пять (15,2± 10,4%) штаммов не относились ни к одному из вышеназванных генотипов (PHCI 2) В Дзержинском районе AI-генотипу принадлежали 2 (5,3±7,0 %) штамма W-генотипу принадлежали 24 (63,2± 13,9%) штамма Восемь (21,0±11,5%) штаммов относились к NN-подгруппе W-генотипа Всего к W-генотипу принадлежали 32 (84,2±10,0%) штамма. Четыре (10,5±8,2%) штамма не относились ни к одному из вышеназванных генотипов (Рис 2) Таким образом, в Нижнем Новгороде подавляющее большинство больных туберкулезом являлись носителями штаммов генотипа W (77,4±8,9 %%)

Сравнительным анализом распространённости штаммов генотипа AI среди больных в Туле (55,2±7,1%) и Калуге (35,1 ±11,5%) (р<0,05), в Калуге (35,1 ±11,5%) и Нижнем Новгороде (9,9 ±6,1%) (р<0,001), Туле (55,2 ±7,1%) и Нижнем Новгороде (9,9 ±6,1%) (р<0,05), а так же штаммов генотипа W в Туле (30,8 ±6,6 %) и Калуге (43,8 ±11,9 %) (р<0,05), Калуге (43,8 ±11,9%) и Нижнем Новгороде (77,4 ±8,9%) (р<0,001), Туле (30,8 ±6,6%) и Нижнем Новгороде (77,4 ±8,9%) (р«0,001) показано, что частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулеза этих генотипов различна (рис 2)

При анализе распространенности штаммов среди населения и заключённых больных в исследованных регионах выявлено, что частота встречаемости штаммов генотипа W в этих двух группах больных одинакова и составляет 44,3±5,4 % и 43,6±6,2 %, соответственно Встречаемость штаммов генотипа AI (40,7±5,4 % - среди населения и 33,5±5,2 % - среди заключённых) различна (р<0,1) (рис 4)

При исследовании степени кластеризации 300 штаммов коллекции выделенных от 276 пациентов, больных туберкулезом выявлено, что 40,2±5,4 % штаммов имеют уникальные RFLP-профили и 59,8±5,4 % штаммов кластеризовано, а из 227 штаммов, выделенных от 127 заключенных больных туберкулезом -_42,7±6,2 % и 57,3±6,2 %, соответственно

2.6. Характеристика штаммов М. tuberculosis RFLP-IS6110 семейства AL Характерные наборы рестрикционных фрагментов RFLP-IS6//0 профилей и сполиготип Beijing у 234 (44,4±4,2%) из 527 штаммов указывают на их принадлежность к генотипу W. Генотип W хорошо охарактеризован в ряде работ отечественных и зарубежных исследователей [ Нарвская О В и др, 1999, Черноусова Л Н и др, 2001; Toungoussova О S. et al, 2002, Agerton В Т. et al, 1997, 1999, Anh D. et al, 2000, Bifani P. et al, 1996, Glim J R. etal.2002]

К AI-генотипу относились 198 (37,б±4,1 %) из 527 исследованных штаммов штаммов RFLP-IS6/70 профили штаммов этого генотипа имели характерный набор рестрикционных фрагментов ДНК молекулярной массой 6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 п н о. (Рис 1). При исследовании методом сполиготипирования штаммов этого генотипа выявлено, что все они обладали сполиготипом LAM Исследование методом VNTR 112 (56,6±5,9%) из 198 штаммов выявило, что все они имели VNTR-профиль - 222222 (табл. 4)

Таблица. 4

Число тандемных повторов в шести локусах у 112 исследованных штаммов генотипа AI.

ETR-локус А В С D Е F

Размер ПЦР продукта (п. н. о,). 340 235 160 233 171 397

Число тандемных повторов в локусе. 2 2 . 2 2 2 2

Исследование лекарственной устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis, описанного нами генотипа AI, выявило, что штаммы этого семейства в 5,О±3,О % случаев обладали устойчивостью к одному, 7,0±3,0% - к двум, 11,2±4,1% - к трем, 29,3±6,1 % - к четырём и 45,5±6,1 % к 5 лекарственным препаратам Всего устойчивостью к лекарственным препаратам обладали 93,0±3,0 % штаммов (Рис. 5)

Исследование лекарственной устойчивости к 5 индивидуальным препаратам показало, что к стрептомицину (STR) устойчивы 93,4±3,2 %, к рифампицину (RIF) - 92,4±3,4 %, к изониазиду (INH) - 88,4+4,5 %, к канамицину (KAN) - 73,7±5,9 % и этамбутолу (ЕМВ) -60,6±6,5 % штаммов МЛУ (INH+RIF) обладали 65,7±6,4 % штаммов (Рис 6)

1«)%

5W 25%

0%

93,4%

92,4%

88,4%

73.7%

•"60,6%

, 65,7%

STR

RIF

INH

KAN

EMB RIF+INH

;. Рис.6. Устойчивость к индивидуальным лекарственным ' препаратам клинических штаммов Л/, ub'mubsís генотипа Al.

В результате- проведённого исследования впервые охарактеризован молекулярно-генетическими методами генотип AI, а так же изучена лекарственная устойчивость штаммов этого генотипа.

ВЫВОДЫ:

1. Определены генотипы 527 штаммов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулезом средней полосы Европейской части России с использованием метода RFLP-IS6/70. Штаммы с генотипом W составляют 44,4 %, с генотипом AI - 37,5 %. Остальные 18,1 % штаммов не относятся ни к одному из двух генотипов. <

2. Кластеризованность штаммов, полученных от больных, составляет 60,0 %, а 40,0 % штаммов имеют уникальные RFLP-IS6//0 профили. Среди заключенных больных кластеризованность составляет 57,0 %. Уникальные RFLP-IS67/0 профили имеют 43,0 % штаммов.

3. Среди заключённых больных в тюрьме г. Серпухова (Московская область) преобладают штаммы генотипов W/Beijing (48,0 %) и AI (27,0 %). Штаммы не относящиеся к этим семействам составляют 25,0 %. В пос. Озерки (Тульская область) преобладают штаммы генотипа AI (41,0 %) и W/Beijing (40,0 %) генотипов. Штаммы не относящиеся к этим семействам составляют 19,0 %.

4. В г. Тула, среди больных, преобладают штаммы генотипа AI (55,0 %) и W/Beijing (31,0 %), в г. Калуга - штаммы W/Beijing (44,0 %) и AI (35,0 %). Штаммы не относящиеся к этим семействам составляют 19,0 % и 21,0 %, соответственно. В г. Нижний Новгород превалируют штаммы W/Beijing (77,0 %) генотипа.

5. Частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулеза генотипа AI выше -среди больных в г. Тула чем в городах Калуга и Нижний Новгород (р<0,05). Частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулеза. генотипа 'AI среди больных в г. Калуга выше чем в г. Нижний Новгород (р<0,001).

6. Частота встречаемости штаммов генотипа W выше среди больных в г. Нижний Новгород чем в городах Тула (р«0,001) и Калуга (р<0,001). Частота встречаемости штаммов генотипа W выше среди больных в г. Калуга чем в г. Тула (р<0,05).

7. Штаммы М. tuberculosis генотипа AI обладают следующими характеристиками: RFLP-IS6//0 профиль • содержит набор из 11 рестрикционных фрагментов молекулярной массой 6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 пар нуклеотидных оснований. Штаммы имеют сполиготип LAM. По 2 тандемных повтора содержат ETR - локусы А, В, С,' D, Е и F.

8. Штаммы М tuberculosis генотипа AI обладают устойчивостью к пяти противотуберкулёзным препаратам в 45,5 % случаев, в 29,0 % - к четырём, в 11,0% - к трем, в 7,0 % - к двум и в 5,0 % случаев - к одному препарату. Всего устойчивостью к противотуберкулезным препаратам обладают 93,0% штаммов. Среди штаммов М tuberculosis генотипа AI обладают устойчивостью к STR - 93,0 %, к R1F - 92,0 %, к ПМН - 88,0%, к KAN - 74,0% и ЕМВ '-61,0% штаммов. Множественной лекарственной устойчивостью обладают 66,0 % штаммов.

9. Создана коллекция клинических штаммов М tuberculosis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАПИИ.

1. Иванов И. Ю., Степаншина В. Н., Липин М. Ю., Шемякин И. Г. Молекулярно-генетическое типирование, методом RFLP-IS6//0 клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных; от больных туберкулёзом в Центральном Регионе России // В сб.: Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. Москва, 2003, С. 109.

2. Иванов И. Ю., Степаншина В. Н., Липин М. Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое типирование методом RFLP-6110 клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных-заключённых // В сб.: Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. Москва, 2003, С. 109-110.

3. Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Сполиготипы клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis выделенных от больных туберкулёзом Центрального Региона России // В сб.: Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. Москва, 2003, С. 115.

4. Степаншина В.Н., Липин М.Ю.,'Иванов И.Ю., Шемякин И.Г., Ильина ЕА Характеристика клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Нижегородской области // В сб.: Туберкулёз сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. Москва, 2003, с. 114-115.

5. Шемякин И.Г., Степаншнна В.Н., Коробова О.В., Иванов И.Ю. Клинические штаммы Mycobacterium tuberculosis - оценка вирулентности // В сб. тезисов докладов: Нозокомиальная туберкулёзная инфекция. (Москва, 14-16 июня), 2001, С. 38.

6. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Иванов И.Ю., Лазарев АА., Скалдина АА, Левачёва ВА Биологические свойства клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis II Журнал микроб, эпид. и иммунобиол., 2002, №1, С. 7-11.

7. Шемякин ИХ., Степаншина В.Н.; Коробова О.В., Анисимова ВА, Иванов И.ГО., Липин М.Ю., Лазарев АА, Скалдина А.И., Чернавская ЛА, Тарасова Т.И. Генетическое типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis методами сполиготипирования и геномной дактилоскопии //Журнал микроб, эпид, и иммунобиол., 2002, №6, С.ЗО-35.

8. Шемякин ИГ., СтепаншинаВ.Н., ИвановИ.Ю., Липин М.Ю.; Коробова О.В., Анисимова В.А Характеристика клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов // Мол. генетика, микробиол. вирус. 2003, №1, С. 32-40.

9. Shemyakin I. G., Stepanshina V. N., Ivanov I. Y. Characterization of M. tuberculosis strains isolated from Russian prisoners // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2001, vol. 5, № И (Suppl.), P. 237-238.

10. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Korobova O.V., Lipin MY., Ivanov I.Y. Investigation ofdrug-iesistant clinical isolates ofMycobacterium tuberculosis derived from ТВ prisoners // 23rd Annual Congress of the European Society of Mycobacterium. Dubrovnik, Croatia, June 23-26, 2002, P. 73.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость, одновременная устойчивость к

изониазиду и рифампицину.

п.н.о. - пар нуклеотидных оснований

ЕМВ - этамбутол

ETR (exact oftandem repeats) • прямой парный повтор. INn - изониазид. KAN - канамицин

RFLP-1S6110 (restriction fragment length polymorphism) - метод типирования штаммов по полиморфизму длин фрагментов рестрикции, содержащих вставочную последовательность IS6II0

RFLP-PGRS (polymorphic GC-reach sequins) - метод типирования штаммов по полиморфизму длин фрагментов рестрикции, содержащих Гуанин - Цитозин богатые последовательности MF - рифампицин. STR - стрептомицин.

VNTR (variable numbers of tandem repeats) - метод дифференцирования штаммов по вариабельному число парных повторов

Подписано в печать 16.04.2004 г. Формат 60x847,,.

Объем 1,125 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 1269.

ГУЛ Серпуховская типография Министерства по делай печати и информации Московской области

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Иван Юрьевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Эпидемическая ситуация по заболеваемости туберкулёзом за рубежом и в России.

1.2. Молекулярно-генетические методы, применяемые при исследованиях эпидемиологии туберкулёза.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Микробиологические методы.

2.2.1. Бактериоскопический метод.

2.2.2. Культуральный метод.

2.2.3. Рост на среде с салицилово-кислым натрием.

2.3. Биохимические методы.

2.3.1. Ниациновый тест.

2.3.2. Определение каталазной активности.

2.3.3. Определение термостабильности каталазы.

2.4. Определение чувствительности к противотуберкулёзным препаратам методом абсолютных концентраций на плотных средах.

2.5. Молекулярно-генетические методы типирования.

2.5.1. Метод RFLF-IS6110.

2.5.2. Метод RFLP-PGRS.

2.5.3. Метод сполиготипирования.

2.5.4. Метод VNTR.

2.5.5 Статистические методы.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от заключённых больных туберкулёзом в тюрьме г. Серпухова (Московская область).

3.2. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от заключённых больных туберкулёзом в тюрьме пос. Озерки (Тульская область).

3.3. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Тула.

3.4. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Калуга.

3.5. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Нижний Новгород.

3.6. Характеристика штаммов М. tuberculosis RFLP- IS6110 семейства AI.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных заключённых тюрем г. Серпухов и пос. Озерки (Тульская область).

4.2. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Тулы и заключённых тюрьмы пос. Озерки.

4.3. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Тулы, Калуги и

Нижнего Новгорода.

4.4. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Дзержинского и

Павловского районов Нижнего Новгорода.

БЫБОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое изучение клинических штаммов Mycobacterium Tuberculosis"

Туберкулёз остаётся одним из наиболее распространённых и опасных заболеваний человека. Возбудителем туберкулёза инфицировано около трети (2 млрд.) населения земного шара [16]. Тяжёлое положение, связанное с ростом заболеваемости туберкулёзом, наблюдается в последние годы и в России. По данным литературы, заболеваемость им возросла с 34 в 1991 г. до 48,7 случаев в 1998 г. на 100 ООО населения и ситуация продолжает ухудшаться [11, 186].

В сложившейся ситуации для эффективного осуществления эпидемического анализа необходимы данные по идентификации и дифференциации клинических штаммов М. tuberculosis. Они позволяют быстро установить источник инфекции, пути передачи возбудителя инфекции и ареал его распространения [16]. К настоящему времени по рекомендации ВОЗ за рубежом на основании результатов, полученных с применением молекулярно-генетических методов типирования клинических штаммов микобактерий, создаётся база данных, содержащих результаты RFLP-IS6/./0 и сполиготипирования [231].

На данный момент опубликовано большое количество работ по молекулярно-генетическому типированию штаммов М. tuberculosis, проводимому в большинстве развитых стран и во многих развивающихся странах. В то же время в России такие работы только начинаются. Данные по молекулярно-генетическому типированию штаммов М. tuberculosis получены лишь для некоторых регионов РФ [7, 19, 208]. Кроме этих исследований было проведено совместное исследование Центральным НИИ туберкулёза РАМН с PHRI (New-York, U.S.A.) по генотипированию микобактерий, выделенных на отдельных территориях России [19]. Для такой большой по территории и численности населения страны как Россия этого явно недостаточно.

Таким образом, молекулярно-генетические исследования штаммов М. tuberculosis в России находятся на начальных этапах развития. Это обусловлено как экономическими причинами, так и отсутствием нормативной базы для проведения исследований с использованием молекулярно-генетических методов, что и определяет актуальность проведённого нами исследования.

Цель исследования. Определить спектр клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих среди больных туберкулёзом в средней полосе Европейской части России.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать штаммы М. tuberculosis с использованием микробиологических и молекулярно-генетических методов (сполиготипирования, RFLP-IS&//0, RFLP-PGRS и VNTR).

2. Определить генетические различия между штаммами М. tuberculosis, выделенными от больных из городов Тулы, Калуги, Нижнего Новгорода и от заключённых больных тюрем г. Серпухова (Московская область) и пос. Озерки (Тульская область).

3. Создать коллекцию клинических штаммов М. tuberculosis. Научная новизна.

С помощью современных методов выявлен спектр штаммов М. tuberculosis, циркулирующих среди больных в городах Тула, Калуга, Нижний Новгород и среди заключённых больных в тюрьмах г. Серпухова и пос. Озерки.

Охарактеризован новый генотип клинических штаммов М. tuberculosis - AI. Показано его широкое распространение среди больных, проживающих на изученных территориях. Выяснено, что среди изолятов генотипа AI преобладают штаммы, устойчивые к лекарственным препаратам.

Выявлена низкая степень кластеризации штаммов М. tuberculosis. Это свидетельствует о том, что в исследованных группах больных имеет место реактивация эндогенной инфекции.

Практическое значение работы.

Сформирована коллекция, состоящая из 527 штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом с 1999 по 2001 год. Создана компьютерная база данных, содержащая информацию о микробиологических свойствах, лекарственной устойчивости и принадлежности штаммов М. tuberculosis к разным генетическим группам. Получен акт №16 от 19 декабря 2003г. о внедрении результатов диссертации в научно-исследовательскую работу Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» Минздрава Российской Федерации.

Генотипирование штаммов М. tuberculosis по всем молекулярно-генетическим маркерам с 2002 года внедрено в работу отдела белковой инженерии №38 Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» Минздрава Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди больных туберкулёзом городов Тулы, Калуги, Нижнего Новгорода и среди заключённых больных г. Серпухова и пос. Озерки преобладают штаммы М. tuberculosis генотипов W и AI.

2. Штаммы генотипа AI обладают следующими характеристиками: сполиготип LAM, RFLP-IS6770 профиль содержит характерный набор из 11 рестрикционных фрагментов молекулярной массой от 6010 до 920 пар нуклеотидных оснований, и ETR - локусы А, В, С, D, Е и F содержат по 2 тандемных повтора.

3. Лекарственной устойчивостью к пяти (STR, RIF, INH, KAN, ЕМВ) противотуберкулёзным препаратам первого ряда обладают 93,0 % клинических штаммов охарактеризованного генотипа AI. Множественную лекарственную устойчивость проявляют 66,0 % клинических штаммов этого генотипа.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Иванов, Иван Юрьевич

ВЫВОДЫ.

1. Определены генотипы 527 штаммов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулёзом средней полосы Европейской части России с использованием метода RFLP-IS6J10. Штаммы с генотипом W составляют 44,4 %, с генотипом AI - 37,5 %. Остальные 18,1 % штаммов не относятся ни к одному из двух генотипов.

2. Кластеризованность штаммов, полученных от больных, составляет 60,0 %, а 40,0 % штаммов имеют уникальные RFLP-IS6//0 профили. Среди заключённых больных кластеризованность составляет 57,0 %. Уникальные RFLP-IS<5770 профили имеют 43,0 % штаммов.

3. Среди заключённых больных в тюрьме г. Серпухова (Московская область) преобладают штаммы генотипов W/Beijing (48,0 %) и AI (27,0 %). Штаммы, не относящиеся к этим генотипам, составляют 25,0 %. В пос. Озерки (Тульская область) преобладают штаммы AI (41,0 %) и W/Beijing (40,0 %) генотипов. Штаммы, не относящиеся к этим генотипам, составляют 19,0 %.

4. В г. Тула, среди больных, преобладают штаммы генотипа AI (55,0 %) и W/Beijing (31,0 %), в г. Калуга - штаммы W/Beijing (44,0 %) и AI (35,0 %). Штаммы, не относящиеся к этим генотипам, составляют 19,0 % и 21,0 %, соответственно. В г. Нижний Новгород превалируют штаммы W/Beijing (77,0 %) генотипа.

5. Частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулёза генотипа А! выше среди больных в г. Тула, чем в городах Калуга и Нижний Новгород (р<0,05). Частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулёза генотипа AI среди больных в г. Калуга выше, чем в г. Нижний Новгород (р<0,001).

6. Частота встречаемости штаммов генотипа W выше среди больных в г. Нижний Новгород, чем в городах Тула (р«0,001) и Калуга (р<0,001). Частота встречаемости штаммов генотипа W выше среди больных в г. Калуга, чем в г. Тула (р<0,05).

7. Штаммы М. tuberculosis генотипа AI обладают следующими характеристиками: RFLP-IS6770 профиль содержит набор из 11 рестрикционных фрагментов молекулярной массой 6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 пар нуклеотидных оснований. Штаммы имеют сполиготип LAM. По 2 тандемных повтора содержат ETR - локусы А, В, С, D, Е и F.

8. Штаммы М. tuberculosis генотипа AI обладают устойчивостью к пяти противотуберкулёзным препаратам в 45,5 % случаев, в 29,0% - к четырём, в 11,0% - к трём, в 7,0 % - к двум и в 5,0 % случаев - к одному препарату. Всего устойчивостью к противотуберкулёзным препаратам обладают 93,0 % штаммов. Среди штаммов М. tuberculosis генотипа AI обладают устойчивостью к STR - 93,0 %, к RIF - 92,0 %, к INH -88,0%, к KAN - 74,0% и ЕМВ - 61,0% штаммов. Множественной лекарственной устойчивостью обладают 66,0 % штаммов.

9. Создана коллекция клинических штаммов М. tuberculosis.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Иван Юрьевич, Оболенск

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JI. - 1962. - 176 с.

2. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: - Наука. - 1980. - 268 с.

3. Донченко А.С., Пузырёв А.Т. Геномная дактилоскопия в эпидемиологии и эпизоотологии туберкулёза // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1998. - № 2. - С. 2-7.

4. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б. Мигрирующие генетические элементы и их роль в эволюции бактерий. // В сб.: Итоги науки и техники, сер. Микробиол. 1979. - С. 99-153.

5. Маянский А. Н. Туберкулёз (Микробиологические и иммунопатогенетические аспекты). // Иммунология. 2001. - № 2. - С. 53-63.

6. Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулёз. М.: - 2001. - 68 с.

7. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В., Стеклова JI.H., Оттен Т.Ф., Гращенкова О.В., Вишневский Б.И. Молекулярная эпидемиология туберкулёза // БЦЖ о туберкулёзе. -2000.-№7-8.-С.4-6.

8. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных на Северо-Западе России // Проблемы туберкулёза. 1999. - № 3. - С. 39-41.

9. Пелли М. Наблюдение за туберкулёзом в уязвимых группах в объединённом королевстве, опыт и рекомендации // В сб.: Новые информационные технологии и мониторинг туберкулёза: Материалы Российской конференции с международным участием. М. -2000. - С. 55-56.

10. П.Перельман М.И. Ситуация с туберкулёзом в России и выполнение федеральной программы по борьбе с ним // Проб, туберкулёза 2001. - №8. - С. 3-5.

11. Приказ №109 от 21 марта 2003 г. О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации. М. - 2003.- 347 с.

12. Скалдина А.И. Основные показатели противотуберкулезной работы органов и учреждений здравоохранения Тульской области за 1999 год // Деп. здравохран. админ. Тульской обл. Тула. - 2000. - 50 с.

13. Сон И. М. Заболеваемость туберкулёзом // ВИНИТИ.-1997.- № 6.- С. I-XIV.

14. Туберкулёз. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Барри Р. Блума. М.: Медицина. - 2002. - 696 с.

15. Хоменко А.Г. Туберкулёз как международная и национальная проблема. // Пробл. Туб.-1994.-№ 2.- С. 2-4.

16. Хоменко А.Г., Дорожкова И.Р., Макаревич Н.М., Дубина Й., Шлосарек М. Коллективный опыт фаготипирования и идентификации микобактерий туберкулеза, выделенных на территории СССР и ЧССР // Проблемы туберкулеза. 1987. - № 11. - С. 51-56.

17. Черноусова JI.H., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Катулина Н.И., Шудрова М.А. Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулёзом из пенитенциарного учреждения // Проблемы туберкулёза. 2001. - №7. - С. 60-62.

18. Шагинян И.А. Геномный порлиморфизм в решении фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и эпидемиологии // Журн. микробиол. 1996. - № 3. - С. 21-24.

19. Шагинян И.А., Нестеренко JI.H., Гришина Т.Д., Сафонова С.Г., Голышевская В.И., Гинцбург А.Л., Хоменко А.Г., Прозоровский А.В. Исследование геномного полиморфизма штаммов Mycobacterium tuberculosis II Журн. микробиол. 1996. - №3. - С. 65-68.

20. Швебель В. Эпидемиологический надзор за туберкулёзом в Европе. // В сб.: Новые информационные технологии и мониторинг туберкулёза: Материалы Российской конференции с международным участием. М. - 2000. - С. 35.

21. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Коробова О.В., Анисимова

22. B.А. Характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов // Мол. генетика, микробиол. вирус. 2003. - № 1.1. C. 32-40.

23. Шилова М.В. Распространённость туберкулёза в России в конце XX века. // В сб.: Новые информационные технологии и мониторинг туберкулёза: Материалы российской конференции с международным участием. М. - 2000. - С. 31-35.

24. Agasino C.B., A. Ponce de Leon, B. Jasmer, and P.M. Small. Epidemiology of M. tuberculosis which do not contain IS6110 in San Francisco // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. Vol.2. - P. 518-520.

25. Aita J., L. Barrera, A. Reniero, B. Lopez, J. Biglione, G. Weisburd, J.C. Rajmil, C. Largacha, V. Ritacco. Hospital transmission of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Rosario, Argentina // Medicina. 1996. - Vol. 56. - P.48-50.

26. Anastasis D., Pillai G., Rambiritch V., Abdool Karim S.S. A retrospective study of human immunodeficiency virus infection and drug-resistance tuberculosis in Durban, South Africa // Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1997.- Vol.1.- p. 220-224.

27. Anderson E. S. Use of phages in epidemiological studies // In: Bacteriphages Adams M.H-, Interscience. - New York. - 1959. - P. 395.

28. Anh Dang Due, M.W. Borgdorff, L.N. Van, N.T.N. Lan, T. van Gorkom, K. Kremer, and D. van Soolingen. Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype Emerging in Vietnam // Emerg. Infect. Dis. 2000. - Vol. 6. - No. 3. - P. 302-305.

29. Baess I. Subdivision of Mycobacterium, tuberculosis by means of bacteriophages. With special reference it epidemiological studies // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1969. - Vol. 76. - P. 464474.

30. Bates J.H., Mitchison D.A. Geographic distribution of bacteriophage types of Mycobacterium tuberculosis II Am. Rev. Respir. Dis. 1969. - Vol. 100. - P. 189-193.

31. Bauer J., A. B. Andersen, K. Kremer, and H. Miorner. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS 6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - No. 8. - P. 2602-2606.

32. Behr M.A., and P.M. Small. Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis: how can it help the clinician? // Clin. Infect. Dis. 1997. - No. 25. - P. 806-810.

33. Benson С. A. Disease due to the Mycobacterium complex in patients with AIDS: epidemiology and clinical symptoms // Clin. Infect. Dis.- 1994. -Vol. 18. (Suppl. 3). - P. 218-222.

34. Bercion R., Kuaban C. Initial resistance to antituberculosis drugs in Yaounde, Cameroon in 1995 // Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1997. Vol.1. - P. 110-114.

35. Bloom B. R., Murray C. J. L. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. // Science. -1992. Vol. 257. - P. 1055-1064.

36. Brock N.N., Reeves M., La Marre M., De Voe B. Tuberculosis case detection in a State prison system // Public Health Reports.-1998,- Vol. 113.- No. 4. P. 359-364.

37. Canetti G., Froman S., Grosset J., Handuroy P., Langerova M., Mahler H.T., Meissner G., Mitchison D.A., and Sula L. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance // Bull. WHO. -1963. P.565.

38. Carpels, K. Fissette, V. Limbana, A. Van Deun, W. Vandenbulcke, F. Portaels. Drug resistant tuberculosis in sub-Saharan Africa: an estimation of incidence and cost for the year 2000 // Tubercle and Lung Disease 1995. - Vol. 76 - No. 6. - P. 480-486.

39. Centres for Disease Control and Prevention. Multidrug-resistant tuberculosis outbreak on an HIV. Ward Madrid Spain, 1991-1995 // MMWR.- 1996.-Vol. 45.-P.330-333.

40. Chaulet P., Bonlahbal F., Crosset S. Surveillance of drug resistance for tuberculosis control: Why and How? // Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1996.-Vol.- 78.-P. 487-492.

41. Cohn D. L., O'Brien R. J. The use of restriction fragment lenght polymorphism (RFLP) analysis for epidemiological studies of tuberculosis in developing countries // Int. Journ. of Tuber, and Lung Desiase. 1998. - Vol. 2. - No. 1. - P. 16-26.

42. Collins D. M., Stephens D. M. Identification of insertion sequence, IS 1081, in Mycobacterium bovis IIFEMS Microbiol. 1991. - Vol. 31. - P. 11-16.

43. Coninx R., C. Mathieu, M. Debacker, F. Mirzoev, A. Ismaelov, R. de Haller, D. R. Meddings. First-line tuberculosis therapy and drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in prisons // The Lancet 1999. - Vol. 353. - P. 969-973.

44. Conix R., G. E. Pfyffer, C. Mathieu, D. Savina, M. Debacker, F. Jafarov, I. Jabrailov, A. Ismailov, F Mirzoev, R. de Haller, F. Portaels. Drug resistant tuberculosis in prisons in Azerbaijan: case study // BMJ 1998. - Vol. 316. - P. 1423-1425.

45. Dalcolm M., Fraga H., Hijar M.A. AIDS is taking on the same profile as ТВ, increasingly reaching the poor in Brazil // ТВ and HIV 1995. - No. 5. - P. 20-22.

46. Demissie М., Gebeyehu M., Berhane Y. Primary resistance to anti-tuberculosis drugs in Addis-Ababa, Ethiopia// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol.1. - P. 64-67.

47. Driscoll R. Jeffrey, McGarry M. A., Taber H. W. Letters to the editor. DNA typing of a nonviable culture of Mycobacterium tuberculosis in a homeless shelter outbreak // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - No. 1. - P. 274 -275.

48. Drobniewsky F., Tayler E., Ignatenko N., Paul J., Connolly M., Nye P., Lyagoshina Т., Besse C. Tuberculosis in Sibiria: I. An epidemiological and microbiological assessment // Tuberc. Lung Dis. 1996. - Vol. 77. - P. 199-206.

49. Feizabadi M. M., L D. Robertson, R. Edwards, D. V. Couslas, snd D. J. Hampson. Genetic differentiation of Australian isolates of Mycobacterium tuberculosis by pulsed-field gel electrophoresis // J. Med. Microbiol. 1997. 46. - P. 501-505.

50. Filliol I., С. Sola and N. Rastogi. Detection of a previously unamplified spacer within the DR locus of Mycobacterium tuberculosis: Epidemiological implications // J. Clin. Microbiol. -2000. Vol. 38. - No. 3. - P. 1231-1234.

51. Frieden T. R., Barron H. Lerner, Bret R. Rutherford. Lessons from the 1800s: tuberculosis control in the new millennium // The Lancet. 2000. - Vol. 355. - P. 1085-1092.

52. Friedman C.R., M.Y. Stoeckle, W. D. Johnson, Jr., and L.W. Riley. Double-repetitive-element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J. Clin. Microbiol. —1995. Vol. 33. - No. 5. - P. 1383-1384.

53. Friedman C.R., Stoeckle K.Y., Kreiswirth B.N., et al. Transmission of multidrug-resistant tuberculosis in a large urban setting // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996. - 152. - P. 355359.

54. Frothingham R. Differentiation of strains in Mycobacterium tuberculosis complex by DNA sequence polymorphisms, including rapid identification of Mycobacterium bovis BCG // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - No. 4. - P. 840-844.

55. Frothingham R., W. A. Meeker O'Connel. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats // Microbiology. 1998. - 144. - P. 1189-1196.

56. Genewein A., A. Telenti, C. Bernasconi, C. Mordasini, S. Weiss, Anne-Marie Maurer, H. L Rieder, K. Schopfer, Thomas Bodmer. Molecular approach to identifying route transmission of tuberculosis in the community // Lancet 1993. - Vol. 342. - P. 841-844.

57. Gillespie S.H., A. Dickens, and T.D. McHugh. False Molecular Clusters due to Nonrandom Association of IS6110 with Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. -No. 6. - P.2081-2086.

58. Glynn J. R., J. Whiteley, P. J. Bifani, K. Kremer, and D. van Soolingen. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: A systematic review // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol.8. - No. 8. - P. 843-849.

59. Glynn R, J. Bauer, A. S. de Boer, M. W. Borgdorff, P.E.M. Fine, P. Godfrey-Faussett, E„ Vynnycky. Interpreting DNA fingerprint clusters of Mycobacterium tuberculosis И Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - Vol.3. - No.12. - P. 1055-1060.

60. Godfrey-Faussett P., N. G. Stoker. Aspects of tuberculosis in Africa. 3. Genetic 'fingerprinting' for clues to the pathogenesis of tuberculosis // The Royal Society Of Tropical Medicine and Hygiene. 1992. - Vol. 86. - P.472-475.

61. Godlee F. Tuberculosis "A global emergency" // Brit. Med. J. - 1993. - Vol. 306. - P. 1147.

62. Gordon S. V., B. Heym, J. Parkhill, B. Barrell and S. T. Cole. New insertion sequences and a novel repeated sequence in the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv // Microbiology -1999.-No. 145.-P. 881-892.

63. Grange J.M., Collins C.H., McSwiggan D. Bacteriophage typing of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in South East England // Tubercle. 1976. - Vol. 57. - P. 59-66.

64. Granich R. M., Balandrano S., Santaella A.J., Binkin N.J., Castro K.G., A. Marques-Fiol, G. Anzaldo, M. Zarate, M. L. Jaimes, O. Velasques-Monroy, L. Salazar, C. Alvares-Lucas, P. Kuri,

65. A. Flisser, J. Santos-Preciado, С. Ruiz-Matus, R. Tapia-Conyer, J.W. Tappero. Survey of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in 3 Mexican states, 1997 // Arch. Intern. Med. -2000. Vol. 160. - P. 639-582.

66. Gutierrez M.C., V. Vincent, D. Aubert, J. Bizet, O. Gaillot, L. Lebrun, C. Le Pendeven, M.r

67. Hayward A.C. Restriction fragment length polymorphism typing of Mycobacterium tuberculosis. II Thorax 1995. - 50. -P. 1211-1218.

68. Hayward A.C., J.M. Watson. Typing of mycobacteria using spoligotyping // Thorax 1998.- Vol. 53. P. 329-330.

69. Hellyer T.J., L.E. Des Jardin, M.K. Assaf, J.H. Bates, M. D. Cave, and K.D. Eisenach, specificity of IS6J 10-based amplification assays for Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - No. 11 P. 2843-2846.

70. Iseman M. D. Evolution of drug-resistant tuberculosis: A tale of two species // Proc. Natl. Acad. Sci. -1994. Vol. 91. - P. 2428-2429.

71. Jensen M. A., Webster J.A., Straus N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - Vol. 59. - P. 945-952.

72. Jones W.D. Further studies of mycobacteriophage 33 D (Warsaw) for differentiation of BCG from Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis // Tubercle. -1979. Vol. 60. - P. 55-58.

73. Kam К. M., C. W. Yip. Surveillance of Mycobacterium tuberculosis drug resistance in Hong Kong, 1986-1999, after the implementation of directly observed treatment // IUTLD -2001. Vol. 5. - No. 9. - P. 815-823.

74. Kato-Maeda M., P. J. Bifani, B. N. Kreiswirth, and P. M. Small. The nature and consequence of genetic variability within Mycobacterium tuberculosis II J. of Clinic. Invest.2001. Vol. 107. - No. 5. - P. 533-537.

75. Kato-Maeda M., J. T. Rhee, T. R. Cingeras, H. Salamon, J. Drenkow, N. Smittipat, P. M. Small. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis II Genome Research -2001.-11.-P. 547-554.

76. Kato-Maeda M., Qian Gao, P. M. Small. Microarray analysis of pathogens and their interaction with hosts // Cell. Microbiology 2001. - No. 3. - P. 1-8.

77. Kent P. Т., G. P. Kubica. Public health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory // U. S. Department of Health Human Services. Public Health Service. - Center for Disease Control. - Atlanta. - Georgia 30333. - 1985. - 210 P.

78. Kim S.J., Bai G.H., Hong Y.P. Drug-resistant tuberculosis in Korea, 1994 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol. 1. - P. 302-308.

79. Kruuner A., S.E. Hoffner, H. Sillastu, M. Danilovits, K. Levina, S.B. Svenson, S. Ghebremichael, T. Koivula, and G. Kallenius. Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - No. 9. - P. 3339-3345.

80. Laszlo A., I. N. de Kantor. A random sample survey of initial drug-resistance among tuberculosis cases in Latin America // Bui. WHO. -1994. 72 (4). - P. 603-610.

81. Legrand E., I. Filliol, C. Sola, and N. Rastogi. Use of spoligotyping to study the evolution of the direct repeat locus by IS61J0 transposition in Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - No. 4. - P. 1595-1599.

82. Loytonen M. and Maasilta P. Multi-Drug resistant tuberculosis in Finland a forecast // Soc. Sci. Med., 1998, vol. 46, No. 6, p. 695-702.

83. Mankiewicz E. Bacteriophages types of mycobacteria // Can. J. Public Health. 1972. - Vol. 63. - P. 342-354.

84. Manns B. J., Fanning E. A., Cowie R. L. Antituberculosis drug resistance in immigrants to Alberta, Canada, with tuberculosis, 1982-1994 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol. 1. - P. 225-230.

85. March F., Pere Coll, Rafael A. Cuerrero,Esther Busquets, Joan A. Cayla, and Guillem Prats. Predictors of tuberculosis transmission in prisons: an analysis using conversational and molecular methods // AIDS 2000. - Vol. 3. - No. 5. - P. 525-535.

86. Mathema В., P. J. Bifani, J. Driscoll, L. Steinlein, N. Kurepina, S. L. Moghazeh, E. Shashkina, S. A. Marras, S. Campbell, B. Mangura, K. Shilkret, J. T. Crawford, R.

87. Frothingham, and В. N. Kreiswirth. Identification and evolution of an IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis cluster // J. Int. Dis. 2002. - Vol. 185. - P. 641-649.

88. McHugh T.D., L.E. Newport, and S.H. Gillespie. IS6110 homologs are present in multiple copies in mycobacteria other than tuberculosis-causing mycobacteria // J. Clin. Microbiol. -1997. Vol. 35. - No. 7. - P. 1769-1771.

89. Miles В. M., В. I. Truman, B. Maguire, G. T. DiFerdinando, G. Wormser, R. Broaddus, D. L. Morse. Increasing incidence of tuberculosis in a prison inmate population association with HIV infection // JAMA. 1989. - Vol. 261. - No. 3. - P. 393-397.

90. Moss A.R., Alland D., Telzak E., Hewlett, Jr., D., Sharp V., Chiliade P., Labombardi V., Kabus D., Hanna В., Palumbo L., Brudney K., Weltman A., Stoeckle K., Chirgwin K.,

91. Simberkoff M., Moghazeh S., Eisner W., Lutfey M., Kreiswirth B. A city-wide outbreak of multiple-drug-resistant strain of Mycobacterium tuberculosis in New York // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997.-Vol. 1(2).-P. 115-121.

92. Moss A.R., J.A. Hahn, J.P. Tulsky, C.L. Daley, P. M. Small, and P.C. Ropewell. Tuberculosis in the homeless a prospective study // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. -Vol. 162. - No.3 - P. 460-464.

93. Niemann S., E. Richter, S. Rusch-Gerdes. Stability of IS6110 restriction fragment length polymorphism patterns of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - No. 9. - P. 3078-3079.

94. Niemann S., S. Rusch-Gerdes, E. Richter. IS6110 fingerprinting of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strain isolated in Germany during 1995 // J. Clin. MicrobioL-1997. Vol. 35. - No. 12. - P. 3015-3020.

95. Nunn P., M. Felten. Surveillance of resistance to antituberculosis drugs in developing countries. // Tubercle and Lung Disease. 1994. - 75. -P. 163-167.

96. Olson, E. S., K. J. Forbes, B. Watt, and Т. H. Pennington. Population genetics of Mycobacterium tuberculosis complex in Scotland analysed by pulsed-field gel electrophoresis // Epidemiol. Infect. 1995. - 114. - P. 153-160.

97. Otal I., Martin C., Vincent-Levy-Frebault V., Thierry D., Gicquel B. Restriction fragment length polymorphism analysis using IS6110 as an epidemiological marker in tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1991. -Vol. 29.-P. 1252-1254.

98. Outbreak of multidrug-resistant tuberculosis at a hospital New York City, 1991. // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1993. - Vol. 42. - P. 427-434.

99. Palittapongarnpim P., P. Luangsook, S. Tansuphaswadicul, C. Chuchottaworn, R. Prachaktam, B. Sathapatayavongs. Restriction fragment length polymorphism study of

100. Mycobacterium tuberculosis in Thailand using IS6110 as probe // J. Tuberc. Lung Dis. 1997. -Vol. 1 (4). - P. 370-376.

101. Peffer N. J., Hanvey J. C., Bisi J. E., Thomson S. A., Hassman C. F., Noble S. A., Babiss S. E. Strand-invasion of duplex DNA by peptide nucleic acid oligomers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 10648-10652.

102. Peters M., Schiirmann D., Mayr A.C., Hetzer R., Pohle H.D., Ruf B. Immunosuppression and mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis: results from patients with and without HIV infection // Epidemiol. Infect. 1989. - Vol. 103. - P. 293-300.

103. Pineda-Garcia L., A. Ferrera, and S.E. Hoffner. DNA Fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains from patients with pulmonary tuberculosis in Honduras // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - No. 9. - P. 2393-2397.

104. Pitchenik A.E., Burr J., Laufer M., Miller G., Cacciatore R., Bigler W.J., Witte J.J., Cleary T. Outbreaks of drug-resistant tuberculosis at AIDS center. Letter // Lancet. 1990. - Vol. 336. -P. 440-441.

105. Plikaytis B.B., J.T. Crawford, C.L. Woodley, W.R. Batler, K.D. Eisenach, M.D. Cave, and T.M. Shinnick. Rapid, amplification-based fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis II J. General Microbiol. 1993. - Vol. 139. - P. 1537-1542.

106. Plikaytis B.B., Marden J.L., Crawford J. T. Multiplex PCR asssay specific for the multidrug-resistant strain W of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 1994. - 32. -P. 1542-1546.

107. Raviglione M. С., H. L. Rieder, K. Styblo, A. G. Khomenko, K. Esteves, A. Kochi. Tuberculosis trends in Eastern Europa and the former USSR // Tuberc. & Lung Disease. 1994. -75.-P. 400-416.

108. Reyes H., Coninx R. Pitafalls of tuberculosis programmes in prisons // BMJ. 1997. - Vol. 315.-P. 1447-1450.

109. Rodrigues L. C. Smith P. G. Tuberculosis in developing countries and methods for its control // Tans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. -Vol. 84. - P. 739-744.

110. Ross В. C., Raios K., Jackson K., Dwyer B. Molecular cloning of highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and it use as an epidemiological tool // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 942-946.

111. Salamon, H., M. R. Segal, A. Ponce de Leon, and P. M. Small Accommodating error analysis in comparison and clustering of molecular fingerprints // Emerg. Infect. Dis. 1998. -4.-P. 159-168.

112. Saunders N. A., Metherell L., Patel S. Investigation of an outbreak of multidrug resistant tuberculosis among renal patients using rpoB gene sequencing and IS6110 inverse PCR // J. Infect. -1997. Vol. 35(2). - P. 129-133.

113. Sebban M., I. Mokrousov, N. Rastogi, C. Sola. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis II Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. -No. 2. - P. 235-243.

114. Shilova M. V., C. Dye. The resurgence of tuberculosis in Russia // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2001. - 356. - P. 1069-1075.

115. Small P., P.I. Fujiwara. Management of tuberculosis in the United States // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 345. - No.3. - P. 189-200.

116. Soini H., Pan X., Amin A., Graviss E.A., Siddiqui A., and Musser J.M. Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - No. 2. - P. 669-676.

117. Soini H., Xi Pan, L. Teeter, J.M. Musser, and E.A. Ggraviss. Transmission Dynamics and Molecular characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110II J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39 - No. 1. - P. 217-221.

118. Sola C., Devallois A., Horgen L., Maisetti J., Filliol I., Legrand E., Rastogi N. Tuberculosis in the Caribbean: using spacer oligonucleotide typing to understand strain, origin and transmission // Emerg. Infect. Dis. 1999. - Vol. 5. - P. 404-414.

119. Steinlein L. M. and J.T. Crauford. Reverse dot blot assay (insertion site typing) for precise detection of sites of IS61 JO insertion in the Mycobacterium tuberculosis genome // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - No. 3. - P. 871-878.

120. Stepanshina V.N., Panfertsev E.A., Korobova O.V., Shemyakin I.G., Stepanshin Yu.G., Medvedeva I.M., Dorozhkova I.R. Drug-resistant-strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Russia // Int. J. Tuber. Lung Dis. 1999. - Vol. 3(1). - P. 149-152.

121. Takeya K., Koike M., Mori R., Yuga Y. and Toda T. Light and electron microscope studies of Mycobacterium mycobacteriophage interactions. II. Electron Microscope Studies // J. Bacterid. - 1959. - V.78. - No 3. - P.313-319.

122. Tanaka M. Т., P. M. Small, H. Salamon, and M. W. Feldman. The dynamics of repeated elements: Applications to the epidemiology of tuberculosis // PNAS. 2000. - Vol. 97. - No. 7. - P. 3532-3537.

123. Telenti A. Genetics of drug resistance in tuberculosis // Clinics in Chest Medicin. 1997. -Vol. 18.-P. 55-64.

124. Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S., Colston M.J., Matter L., Schopfer K., Bodmer T. Detection of rifampicin-resistance mutation in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 1993. - Vol. 341. - P. 647-650.

125. Telenti A., Persing D.H. Novel strategies for the detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis II Res. Microbiol. 1996. - Vol. 147. - P. 73-79.

126. Telzak E.E., Sepcowitz K., Alpert P., Mannheimer S., Medard F., El-Sadr W., Blum S., GagliardiA., Salomon N., Turett G. Multydrug-resistant tuberculosis in patients without HIV infection // N. Engl. J. Med. 1995. - Vol. 333. - P. 907-911.

127. Thierry D., M.D. Cave, K.D. Eisenach, Jack T. Crawford, J.H. Bates, B. Gicquel, J.L. Guesdon. IS 6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex // Nucleic Acids Research 1990. - Vol. 18, - No. 1, - P. 188.

128. Tokunaga Т., Maruyama Y., Murohashi T. Classification of subtypes of human tubercle bacilli by phage susceptibility //Am. Rev. Respir. Dis. 1968. - Vol. 97. - P. 469-471.

129. Vandra E., Fodor T. Phage typing of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Hungary // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. -1971. Vol. 18. - P. 155-158.

130. Viskum K., Кок-Jensen A. Multidrug-resistant tuberculosis in Denmark 1993-1995 // Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1997.-Vol. l.-P. 299-301.

131. Wiid I. J., C. Werely, N. Beyers, P. Donald, and P. D. van Helden. Oligonucleotide (GTG)5 as a marker for Mycobacterium tuberculosis strain identification // J. Clin. Microbiol. 1994. -Vol. 32.-No. 5.-P. 1318-1321.

132. Williams, D. L, T. P. Gillis, and W. G. Dupree. Ethanol fixation of sputum sediments for DNA-based detection of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 1995. 33:1558-1561.

133. Winder F.G., Mode of action of the antimycobacterial agents and associated aspects of the molecular biology of the Mycobacteria II In Ratledge C., Stanford J. (ed.): The Biology of the Mycobacteria. New York. - Academic Press. - 1982. - P. 354-438.

134. Wittung P., Nielsen P.E., Buchardt O., Egholm M., Norden B. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid // Nature.-1994. Vol. 368. - P. 561-563.

135. Woods G.L., Washington J.A. Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis: a review of microbiologic and clinical aspects // Rev. Infect. Dis.-1987. Vol. 9. - P. 275-294.

136. World Health Organization Tuberculosis Programme and International Union Against Tuberculosis and Lung Disease // Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis. Document WHO/TB/94. 178. - Geneva. - 1994.

137. Yeh R. W., A. P. de Leon, C.B. Agasino, J.A. Hahn, C.L. Daley, P.C. Hopewell, and P.M. Small. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes // J. Infect. Dis. 1998. - Vol. 177.-P. 1107-1111.

138. Yeh R.W., P.C. Hopewell, C.L. Daley. Simultaneous infection with two strains of Mycobacterium tuberculosis identified by restriction fragment length polymorphism analysis // IUATLD. 1999. - 3 (6). - P. 537-539.

139. Young-Kil P., Gill-Han Bai, and Sang-Jae Kim. Restriction fragment length polymorphism analysis of Mycobacterium tuberculosis from countries in the Western Pacific region // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - No. 1. - P. 191-197.

140. Yuen L.K. W., B.C. Ross, K.M. Jackson, and B. Dwyer. Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnamese patients by Southern blot hybridization // J. Clin. Microbiol. -1993. Vol. 31 - P. 1615-1618.

141. Yuen L. K. W., D. Leslie, P.J. Coloe. Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol. 37. - No. 12. - P. 3844 -3850.

142. Yusuf H. R., Braden C. R., Greenberg A. J., Weltman A. C., Onorato I. M., Valway S. E. Tuberculosis transmission among five school bus drivers and students in two New York counties // Pediatrics. 1997. - 100 (3) - P. 6-9.