Выявление генетического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на территории стран СНГ

Дымова, Майя Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление генетического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на территории стран СНГ
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выявление генетического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на территории стран СНГ"

На правах рукописи

ДЫМОВА Майя Александровна

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS НА ТЕРРИТОРИИ СТРАН СНГ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2011

005001494

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.б.н. Филипенко Максим Леонидович

Официальные оппоненты:

д.б.н, профессор, академик РАМН Ляхович Вячеслав Валентинович к.б.н. Фоменко Наталья Владимировна

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Защита состоится 28 сентября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-т Акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан 26 августа 2011 г.

РАМН

Ученый секретарь Диссертационного совета, к.х.н., доцент

Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез до сих пор остается серьезным инфекционным заболеванием, от которого ежегодно умирают более трех миллионов человек. Его инфекционным началом являются микобактерии туберкулезного комплекса, включающего Mycobacterium tuberculosis, М. bovis, М. africanum, М. canettii, М. microti, М. pinnipedii и М. саргае и другие. К настоящему времени использование секвенирования геномов микобактерий и их отдельных генов, применение разнообразных методов определения однонуклеотидного, делеционного и микросателлитного полиморфизма показало, что микобактерии туберкулеза более полиморфны, чем предполагалось ранее. Учитывая, что эволюция микобактерий проходила в постоянном взаимодействии с инфицированным им макроорганизмом, можно предположить, что генетическая вариабельность микобактерий могла бы реализовываться в различии как фенотипических свойств разных семейств микобактерий туберкулеза, так и в характере протекания заболевания.

Молекулярно-эпидемиологические исследования позволили выделить несколько относительно генетически гомогенных семейств М. tuberculosis, характеризующихся специфическими генетическими маркерами. Среди них семейство Beijing, которое представляют собой одну из самых «успешных» клад в современной всемирной эпидемии туберкулеза. Показано, что штаммы Beijing более вирулентны, и вызывают большие гистопатологические изменения, более быстрый рост и большую смертность. Семейство Beijing является наиболее распространенным среди новых случаев заболевания туберкулезом в разных регионах Российской Федерации и странах ближнего зарубежья. Сегодня часть эпидемиологических исследований показывают также связь между принадлежностью микобактерий семейству Beijing и наличием мутаций определяющих лекарственную устойчивость, а иногда и их типом. Отчасти это подтверждает гипотезу, что в эпоху активной химиотерапии туберкулеза, лекарственная устойчивость может способствовать распространению определенного генотипа M.tuberculosis. Однако пока экспериментальные исследования не смогли выявить основные механизмы, лежащие в основе этой связи. Таким образом, утверждение об ассоциации принадлежности микобактерии тому или иному семейству с вероятностью возникновения лекарственной устойчивости, а также с особенностями патогенности микобактерий, требует дальнейших исследований.

Появление микобактерий семейства Beijing может отражать тотальную тенденцию изменения в структуре популяции М. tuberculosis, вероятно, обусловленную антропогенными факторами (лечением антибиотиками и вакцинацией). Семейство Beijing изучено наиболее

подробно, но другие превалирующие семейства, такие как Haarlem и Africans могут также претерпеть подобные изменения.

Эволюционное движение микобактерий туберкулеза к новой популяции бактерий, которые труднее поддаются лечению и имеют более широкие возможности, чтобы обойти вакцинацию, будет являться основным препятствием нашим усилиям по борьбе с туберкулезом. Поэтому существует настоятельная необходимость более полного понимания механизмов, лежащих в основе появления «успешных» семейств М. tuberculosis, изучения популяционной структуры и ее динамики в отягощенных по туберкулезной инфекции районах, к которым относятся страны СНГ: Казахстан, Украина, Киргизия, а также в некоторых регионах Российской Федерации (РФ): Архангельской, Санкт-Петербургской, Самарской, Кемеровской, Новосибирской областях, республике Тыва, в Приморском крае, где наблюдаются высокая заболеваемость, смертность от туберкулеза и большой процент лекарственно устойчивых форм туберкулеза. Этот анализ должен быть распространен и на мониторинг лекарственной устойчивости на фенотипическом и генотипическом уровнях. Результаты таких исследований могут иметь чрезвычайно важные последствия для лечения туберкулеза и привести к нашему тотальному перевооружению для борьбы с этим заболеванием.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение генетического разнообразия изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных, проживающих на территории стран СНГ, в том числе определение спектров и частот мутаций, ассоциированных с возникновением устойчивости к противотуберкулезным препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Выявить региональные особенности встречаемости различных семейств M.tuberculosis.

2. Изучить частоты встречаемости мажорных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину)

3. Провести поиск ассоциаций между наличием мутаций, множественной лекарственной устойчивостью и принадлежностью исследуемых изолятов к тем или иным семействам M.tuberculosis.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые подробно охарактеризована коллекция изолятов М. tuberculosis, циркулирующих на территории стран СНГ. Сделан сравнительный анализ частот встречаемости различных семейств М. tuberculosis, циркулирующих на данных территориях и вызывающих основные эпидемиологические

вспышки. У данных генотипов выявлен профиль устойчивости, определены спектры и частоты мутаций, ассоциированных с возникновением устойчивости к противотуберкулезным препаратам первого ряда, что способствует более эффективному выбору режима противотуберкулезной терапии. Проведен поиск ассоциаций принадлежности к определенному генотипу, наличию мутаций, определяющих устойчивость к рифампицину, и к множественной лекарственной устойчивости.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей. Результаты работы также вошли в виде отдельной главы в коллективном сборнике «Роль микроорганизмов в функционировании живых систем: фундаментальные проблемы и биоинженерные приложения». Материалы диссертации представлены на 7 Международных конференциях: International Scientific Conference of students, post-graduate students and young scientists - Lomonosov - 2004 (г. Москва, Россия, 2004); International scientific conference «Development of international collaboration in field of study infectious diseases» (г. Новосибирск, Россия, 2004); International Conference on Chemical Biology (г. Новосибирск, Россия, 2005); 3rd Young Medics' International Conference (г. Ереван, Армения, 2005); Международная конференция «Фундаментальные науки - Биотехнологии и медицине» (г. Новосибирск, Россия, 2006); III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, Россия, 2006); Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и индустрии» (г. Долгопрудный, Россия, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту.

• Структура популяции микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории стран бывшего СНГ гетерогенна с преобладанием изолятов семейства Beijing. На территории г. Владивостока циркулируют разнообразные изоляты семейства Beijing, нигде больше не встречающиеся. Повышенная частота встречаемости изолятов данного семейства в выборке больных с тяжелыми формами в г. Новосибирске потверждает его повышенную вирулентность.

• Мажорными мутациями, обуславливающими возникновение устойчивости к рифампицину и изониазиду, являются нуклеотидные замены Ser315Thr в гене katG и Ser53 lLeu в гене гроВ.

• Сравнительный анализ профилей семейств микобактерий туберкулеза в исследуемых регионах показывает статистически значимое отличие выборки г. Владивостока от всех других изучаемых регионов.

Наличие ассоциаций между отдельными семействами, мутациями и наличием множественной лекарственной устойчивости варьирует между исследуемыми региональными выборками.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 136 страницах, иллюстрирован 11 рисунками, включает 14 таблиц, список литературы содержит 225 библиографических источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Определение генетического разнообразия М. tuberculosis, циркулирующих на территории г. Харькова, Украина

В работе использовано 98 образцов ДНК изолятов М. tuberculosis. В сформированной выборке преобладали мужчины - 81 (83%). Средний возраст пациентов составлял 40 лет, наиболее часто встречался инфильтративный туберкулез легких. Впервые выявленный туберкулез встретился у 36 больных (37%), вторично выявленный - у 62 (63%).

При MIRU-типировании данных образцов идентифицировано 75 генетических типов. По результатам типирования с использованием 15 полиморфных локусов, 67 изолятов имели уникальный для этой выборки профиль, остальные (31 изолят) входили в состав кластеров разного размера, с коэффициентом различия менее 0,125.

Индекс дискриминации Гюнтера-Хадсона (HGDI) данного метода составил 0.98. Процент кластеризации составил 31%. С помощью методов UPGMA и NJ, на основе MIRU-типирования была построена дендрограмма кластеризации изолятов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулезом легких г. Харькова (рис.1).

На данной дендрограмме видно три больших ветви, которые состоят из более мелких кластеров или, в большинстве случаев, включают в себя уникальные по аллельному профилю изоляты. Две больших ветви соответствуют изолятам семейств Beijing и LAM. Средняя ветвь содержит изоляты семейств Ural и S, а также изоляты, имеющие уникальный для данной выборки генетический профиль, которые мы не смогли отнести ни к одному известному семейству; здесь и в дальнейшем данная группа обозначена как «other».

Семейство Beijing представлено в изучаемой выборке 32 изолятами (32,6 %). Из них 18 вошли в кластеры различного размера, 14 изолятов имели уникальный аллельный профиль, таким образом, внутри данной ветви процент кластеризации составил 56%.

Типы изолятов семейства Beijing мы определяли согласно классификации, разработанной И. Мокроусовым. В результате, среди изолятов семейства Beijing наиболее часто встречались тип М2 - 13 изолятов (40%), и тип МЗЗ - 6 изолятов (19%). Помимо типов М2 и МЗЗ, по одному изоляту встретилось: Ml22, М37, М5, МП, М89, М52, М39 типов. Известно, что изоляты М2 и Mil типов обладают повышенной

относительной

приспособленностью и ростом в макрофагальных клетках ТНР-1, высокой способностью

индуцировать непротективный синтез цитокинов и некроз макрофагов. Шесть изолятов (19%) мы не смогли отнести ни к одному известному типу, согласно вышеуказанной классификации, и они были обозначены как «beijing».

Таким образом, показано, что представители данного семейства в значительной степени генетически гетерогенны, что вряд ли свидетельствует об их недавней трансмиссии и высокой эпидемиологической значимости для данного региона.

Рис. 1 Дендрограмма кластеризации

98 изолятов МЛиЬегси1о$1$, выделенных

от больных, проживающих в г. Харькове (Украина).

Большой кластер образовали представители семейства LAM - 27 изолятов (27,5%). Стоит отметить большое количество уникальных генетических профилей у изолятов данного генотипа, лишь 7 изолятов из 27 вошли в кластеры по 5 и 2 изолятов каждый. Процент кластеризации внутри данной ветви составил 26%. Выявление таких больших кластеров с наличием многочисленных ветвей на дендрограмме кластеризации может свидетельствовать о том, что данные изоляты распространились и циркулируют на этой территории давно. Частота встречаемости штаммов М.tuberculosis семейства LAM в Харькове сравнима со многими регионами России, где она составляет от 10% до 19%. В исследованных выборках она варьировала от 11% до 16%. Кластер, образованный семейством Haarlem, состоял из 7 изолятов (7,2%), семейством Ural - 8 изолятов (8,2%), семейством S - 4 изолятов (4,1 %), семейством «H37Rv - like» - 2 изолятов (2%). Остальные 18 изолятов (18,4%) мы не смогли отнести ни к одному известному ранее семейству, и они были обозначены как "other".

Определение генетического разнообразия М.tuberculosis, циркулирующих на территории г. Астана, Казахстан

В данной работе были использованы 46 образцов ДНК изолятов М. tuberculosis. В выборку входили пациенты как женского (13 больных), так и мужского пола (33 больных), средний возраст которых составлял 40 лет. Преобладали больные с диагнозом инфильтративный туберкулез легких. Впервые выявленный туберкулез встретился у 14 больных (30%), вторично выявленный - у 32 (70%).

При MIRU-типировании 46 образцов ДНК М. tuberculosis было идентифицировано 22 генетических типа. По результатам типирования 28 изолятов входили в кластеры различного размера (с коэффициентом различия < 0,1), остальные 18 изолятов имели уникальный для данной выборки аллельный профиль и были обозначены как "other". На основе результатов MIRU-типирования была построена дендрограмма кластеризации изолятов М. tuberculosis (рис.2). Индекс дискриминации Гюнтера - Хадсона (HGDI) данного метода составил 0,86, процент кластеризации - 61%. На данной дендрограмме видна одна большая ветвь, состоящая из изолятов М. tuberculosis семейства Beijing, и несколько мелких, которые включают в себя изоляты семейства LAM, Ural, S, а также уникальные по аллельному профилю изоляты. Кластер, содержащий изоляты генотипа Beijing, состоял из 29 изолятов (63%), и был гомогенным, процент кластеризации внутри семейства Beijing составил 95%. К типу М2 семейства Beijing принадлежало 22 изолята (76% от всех изолятов Beijing), 4 изолята (14%) принадлежало к МП типу, 2 изолята (7%) - к МЗЗ типу.

Beijing

В ш н

-El

_—ёШ —н —Е .

—¡ж

-Ё§

_—¡йк§

-щ

-Щ

Один изолят имел уникальный для данной выборки аллельный профиль, и мы не смогли отнести его к какому -либо известному типу семейства Beijing.

В целом, кластер, содержащий изоляты генотипа Beijing, был генетически гомогенным - 76% изолятов Beijing принадлежало к М2 типу, что, возможно, свидетельствует в пользу их недавней трансмиссии, и может говорить об активном эпидемическом процессе.

Полученные результаты совпадают с литературными данными: так, при

генотипировании изолятов,

циркулирующих в других областях Казахстана, 70,4% составляли изоляты,

принадлежащие к семейству Beijing, причем их кластеризация составила 81%, что также подтверждает их высокую степень трансмиссивное™. В западной части Китая частота встречаемости данного генотипа составляет 84,6%. Частота встречаемости изолятов типа М2 и Mil в выборке г. Астаны совокупно составила 56%. Это согласуется с литературными данными: в соседней с Казахстаном Киргизии изоляты типа М2 составили 50%, a Ml 1 -2%.

Совокупно тип М2 и тип Ml 1 составляют около 88% всех изолятов семейства Beijing, циркулирующих на территории азиатской части РФ, и 77% — в европейской части РФ.

• S Ural

LAM

Рис. 2. Дендрограмма кластеризации 46 изолятов, выделенных от больных, проживающих в г. Астана (Казахстан).

Пять изолятов (11%) принадлежали к семейству LAM. Данные изоляты имели уникальный для выборки генетический профиль. Три изолята (6%) принадлежало к семейству Ural, 2 изолята (4%) - к семейству S. Остальные 6 изолятов не вошли ни в один кластер, и имели уникальный для данной выборки генетический профиль; мы также не смогли отнести их ни к одному известному семейству, данные изоляты обозначены как «other».

Определение генетического разнообразия M.tuberculosis, циркулирующих на территории г. Новосибирска, СФО, РФ

В работе было исследовано 106 образцов ДНК изолятов М. tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом легких. В сформированной выборке преобладали мужчины -84 (79%) в возрасте 21-71 лет (средний возраст - 41 лет), наиболее частой формой был инфильтративный туберкулез легких.

При MIRU-типировании 106 образцов ДНК М. tuberculosis идентифицировано 69 генетических типов. 56 изолятов М. tuberculosis имели уникальный для данной выборки профиль, остальные 50 изолятов входили в состав кластеров различного размера, с коэффициентом различия от 0.04 и выше. Индекс дискриминации Гюнтера-Хадсона (HGDI) данного метода составил 0.98.

На основе MIRU-типирования была построена дендрограмма кластеризации изолятов M.tuberculosis, полученных от больных туберкулезом легких г. Новосибирска (рис. 3).

На дендрограмме имеется одна крупная ветвь и несколько мелких, с коэффициентом различия от 0,04 до 0,36. Процент кластеризации составил 47%. Семейство Beijing представлено в данной выборке 45 изолятами (42%). Изоляты типа М2 составили 33% (15 изолятов) из общего числа изолятов семейства Beijing. Девять изолятов (20%) принадлежало к типу Ml 1, 6 изолятов (13%) - к типу М5, 4 (9%) - к типу МЗЗ, 3 (7%) - к типу М37, 2 изолята (4%) принадлежало к типу М89, и столько же - к типу М87; 4 изолята мы не смогли отнести ни к одному известному типу изолятов семейства Beijing.

Изоляты семейства LAM составили 16% от всей выборки (17 изолятов), 5 изолятов входили в кластеры небольшого размера (по 2 и 3 изолята в каждом), остальные имели уникальный профиль.

Рис. 3. Дендрограмма кластеризации 106 изолятов, выделенных от больных, проживающих в г. Новосибирске (РФ).

Семейство Haarlem в данной выборке было представлено 5 изолятами (6%), 3 из которых кластеризовались, остальные два имели уникальный аллельный профиль. Помимо этого нам встретились 12 изолятов (12%) семейства Ural, 7 изолятов (7%) -семейства S. Два изолята имели VNTR - профиль, схожий с H37Rv, в связи с этим мы обозначили их как «H37Rv-like» семейство (http://miru-

vntrplus.org/MIRU/index.faces). Восемнадцать изолятов мы отнесли к группе «other».

Изоляты М. tuberculosis из выборки г. Новосибирска были выделены от больных с первичным туберкулезом легких, при этом, как было уже сказано выше, семейство Beijing составило 42 %. Отдельная работа сделана в 2008 году по типированию изолятов

М.tuberculosis, выделенных от больных с тяжелыми формами туберкулеза, проживающих на территории г. Новосибирска.

Сравнительный анализ двух выборок из г. Новосибирска (выборки больных с тяжелыми формами туберкулеза и

популяционной выборки) показал статистически значимые отличия в частоте встречаемости изолятов семейства Beijing (84% vs 42%, OR 7.1, 95%CI [2,93-17,53], P <0,0001), что подтверждает данные о повышенной вирулентности

данного семейства микобактерий.

Определение генетического разнообразия М. tuberculosis, циркулирующих на территории г. Владивостока (ДФО, РФ)

Beijing

Haarlem

Ural

LAM

В работе были использованы 104 образца ДНК изолятов М. tuberculosis. В выборку входили пациенты как женского (17 больных), так и мужского пола (87 больных), средний возраст которых составлял 41 год. Преобладали больные с диагнозом фиброзно-кавернозный туберкулез. Впервые выявленный туберкулез составил 76 случаев (73%), вторично выявленный туберкулез - 28 (27%).

При MIRU-типировании

данных изолятов было

идентифицировано 60 генетических профилей. В кластеры различного размера вошли 56 изолятов, остальные имели уникальный для данной выборки аллельный профиль (рис.4). Процент кластеризации, таким образом, составил 54%. HGDI был достаточно высоким и составил 0,97. К семейству Beijing принадлежало 48 (46%) изолятов.

Среди них наибольший процент составили изоляты типа М2 -14 изолятов (29%). Помимо этого встретились 9 изолятов (19%) типа МЗЗ, 7 изолятов (14%) - типа МП, 5 изолятов (10%) - типа М37, 1 изолят (2%) - типа М5, и один изолят (2%) -типа М89. Уникальный для данной выборки генетический профиль имели 10 изолятов (21%), и мы не смогли отнести их ни к одному известному типу семейства Beijing. Процент кластеризации внутри данного кластера был достаточно высоким (81 %).

Рис. 4. Дендрограмма кластеризации 104 изолятов, выделенных от больных, проживающих в г. Владивостоке (РФ).

К семейству Haarlem принадлежало 14 изолятов (13%) из всей выборки, к семейству LAM - 13 изолятов (12,5%), к семейству Ural - 4 изолята (4%), 3 изолята (3%) - к семейству S. Мы не смогли отнести к каким бы то ни было известным семействам 22 изолята (21%), они были обозначены как «other».

Таким образом, особенностью изолятов семейства Beijing из выборки г. Владивостока стало нахождение разнообразных его типов, не встречающихся в других исследуемых регионах, что может быть обусловлено большими миграционными потоками людей из Китая, откуда берет свое происхождение данное семейство. Предпологают, что изначально распространение изолятов Beijing имело место в Китае более 2000 лет назад. Проникновение штаммов Beijing в Россию могло быть связано с евразийской экспансией монгольской империи Чингисхана в 1315 веках, долгим и тесным взаимодействием Руси и Орды.

Сравнительный анализ распределения генетических профилей в исследуемых выборках

В результате MIRU-типирования по 15 MIRU-локусам 354 ДНК изолятов M.tuberculosis были получены 183 генетических профиля. Двести изолятов M.tuberculosis вошли в кластеры различного размера, 154 изолята имели уникальный для данной выборки профиль. Индекс дискриминации Гюнтера-Хадсона (HGDI) составил 0,97. Согласно принятой номенклатуре 286 изолятов M.tuberculosis были отнесены к различным семействам, 68 изолятов, которые мы не смогли определить в уже известные семейства были обозначены как «other». В таблице 1 приведены результаты MIRU-типирования с помощью 15-полиморфных локусов. Таблица 1. Частоты встречаемости различных генотипов в исследуемых регионах.

Регион Beijing Other LAM Ural Haarlem S H37Rv-like Всего

Астана 29 63% 7 15,20% 5 10,90% 3 6,50% 0 2 4,30% 0 46

Владивосток 48 46,20% 22 21,20% 13 12,50% 4 3,80% 14 13,50% 3 2,90% 0 104

Новосибирск 45 42,50% 18 17% 17 16% 12 11,30% 5 4,70% 7 6,60% 2 1,90% 106

Харьков 32 32,70% 18 18,40% 27 27,60% 8 8,20% 7 7,10% 4 4,10% 2 2% 98

Всего 154 43,50% 65 18,40% 62 17,50% 27 7,60% 26 7,30% 16 4,50% 4 1,10% 354

Наиболее часто встречаемыми были изоляты семейства Beijing, LAM и изоляты, не вошедшие в какое-либо определенное семейство, обозначенные как «other». Изоляты семейства Ural и Haarlem имели примерно одинаковую частоту встречаемости - 7,63% и 7,34%, соответственно. За ними по частоте встречаемости следовало семейство S (4,52 %), и H37Rv-like (1,1%).

Изоляты семейства Beijing имеют огромную эпидемиологическую значимость на территории, как Российской Федерации, так и бывшего СНГ. Среди 154 изолятов семейства Beijing наиболее распространенными являлись типы М2 (64 изолята, 41%). Изолятов типа Mil и МЗЗ было равное количество в суммарной выборке - по 21 изоляту (17%). Большой процент составили изоляты, относящиеся к семейству Beijing, которые мы не смогли отнести ни к одному изветному типу согласно данной классификации- 23 изолята (15%). Они были обозначены как «beijing».

Нами был проведен сравнительный анализ распределения генетических профилей на исследуемых территориях. Было показано, что статистически достоверно отличается от совокупной выборки распределение генотипов в выборке из г. Владивостока (х2=35,93, р<0,001). Возможно, в г. Владивостоке нахождение других генотипов или уже известных, но с другими частотами обусловлено большими миграционными потоками со странами неблагополучными по туберкулезу.

Изучение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам

Следующим этапом нашей работы было изучение частоты встречаемости мажорных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину).

С помощью метода абсолютных концентраций (МАК), выполненного в соотвествующих медицинских учреждениях, были получены следующие результаты: монорезистентный туберкулез наблюдался у 8% (29 больных), полирезистентный - у 11,5% (41 больного). Изоляты с устойчивостью к изониазиду в данной выборке составили 55,6% (197), к рифампицину - 34% (122), стрептомицину - 55,3% (196), этамбутолу - 28,2% (100), канамицину - 20% (72). У 5% (17 изолятов) не было приведено данных по устойчивости к стрептомицину и этамбутолу. У 28,5% (101 изолят) не была приведена устойчивость к канамицину. 22,5% (80 изолятов) были чувствительными ко всем препаратам. Изоляты М. tuberculosis, имеющие множественную лекарственную устойчивость (МЛУ), т.е. устойчивость к изониазиду и рифампицину, составили 31,3%, 111 изолятов.

Далее все образцы ДНК изолятов М. tuberculosis были протестированы на наличие мутаций, определяющих устойчивость к изониазиду и рифампицину. Выбор генетических мишеней, а именно мутаций Ser315Thr в гене katG и Ser531Leu в гене гроВ, был обусловлен наибольшей частотой встречаемости данных мутаций среди изолятов М.tuberculosis, устойчивых к изониазиду и рифампицину, соответственно, циркулирующих на территории Российской Федерации.

По результатам типирования был построен график типа «форест-плот», где обозначены частоты встречаемости данной мутации и доверительные интервалы (рис.5). При этом тест на гетерогенность показал отсутствие статистически значимых отличий в частотах встречаемости исследуемой мутации в изучаемых регионах (у2 = 2.71, р-value 0.43).

Астана Владивосток Новосибирск Карьков

Summarv

0.75 0.80 0.95 0.Э0 0 95

Рис. 5. График типа «форест-плот» частот встречаемости мутации Ser315Thr в гене katG, в исследуемых выборках.

Наибольшая частота встречаемости данной мутации среди изониазид-устойчивых изолятов наблюдалась в Харькове, где она составила 93%; наименьшая - в г. Астана (87,1%). Помимо этого мы не обнаружили мутации в 315 кодоне гена katG у 9,6% процента изолятов совокупной выборке, определенных с помощью фенотипического теста, как устойчивые к изониазиду. Данный процент не превышал 12,9% (по выборке из г. Астаны). Часть изолятов, определенных с помощью фенотипического теста как чувствительные, также несли нуклеотидную замену в 315 кодоне. Например, в выборке г. Владивостока эта частота достигала 18,6%. Так как нахождение мутации Ser315Thr в гене katG генома микобактерии облигатно определяет ее устойчивость к изониазиду, то, скорее всего, в данном случае мы имеем дело с ложноотрицательными случаями при проведении МАК. Мы не нашли достоверно значимых отличий в частотах встречаемости данной мутации у INH- устойчивых и у INH-чувствительных изолятов в исследуемых регионах при сравнении друг с другом. В совокупной выборке, состоящей из 354 изолятов

M. tuberculosis, было показано, что среди 197 INH- устойчивых изолятов 178 изолятов (90,4%) имело нуклетидную замену в данном кодоне. Среди 157 INH - чувствительных изолятов - 18 изолятов (11,5%) также имели мутацию в 315 кодоне гена katG.

Исследование частоты встречаемости мутаций в «коровом» регионе гена гроВ, кодирующего Р-субъединицу ДНК-зависимой РНК-полимеразы, проводилось с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа и секвенирования. Известно, что мутации в «коровом регионе» гена гроВ ассоциированы с возникновением устойчивости к рифампицину. По литературным данным, наиболее часто встречается мутация в 531 кодоне гена гроВ («50%).

По результатам типирования был также построен график типа «форест-плот» (рис.6); максимальная частота встречаемости мутации в 531 кодоне гена гроВ среди RIF- устойчивых изолятов наблюдалась в выборке г. Владивостока и составила 87,0%.

Астана Владивосток

Новосибирск Харьков

Рис. 6. График типа «форест-плот» частот встречаемости мутации 8ег531Ьеи в генегроВ, в исследуемых выборках.

При этом тест на гетерогенность показал, что полученные частоты встречаемости данной замены у - устойчивых изолятов статистически достоверно отличались в изучаемых выборках (%2 = 14,35, р= 0,0025).

Далее образцы, фенотипически устойчивые к рифампицину, но не имеющие мутации в 531 кодоне гена гроВ, были исследованы на предмет наличия других мутаций в «коровом регионе» гена гроВ. Данные мутации также ассоциированы с возникновением устойчивости к рифампицину, однако частота их возникновения меньше, чем в 531-м кодоне. Это связано с пониженной относительной приспособленностью изолятов, несущих данные мутации в гене гроВ, по сравнению с аллелем «дикого типа». В результате секвенирования «корового региона» гена гроВ были выявлены следующие нуклеотидные замены (табл. 2):

город AGC509ACC CTG511CCG CTG511CCG ATG515ATA GAC516GTC САС526СТС САС526ТАС САС526ААС 526 САССТТ TTG53ÍTCG CTG533CCG

Астана 0 0 1 5% 1 5% 1 5% 2 10% 2 10% 0 0 12 60% 0

Владивосток 0 0 0 0 0 1 4% 1 4% 0 0 20 87% 0

Новосибирск 0 0 0 0 2 6% 0 1 3% 1 3% 0 19 61.3% 1 3%

Харьков 1 2% 1 2% 0 0 4 8% 1 2% 4 8% 0 1 2% 35 72.5% 2 4%

Всего 1 0.8% 1 0.8% 1 0.8% 1 0.8% 7 6% 4 3% 7 6% 1 0.8% 1 0.8% 86 70.5% 3 2%

Нами была подсчитана средняя частота встречаемости конкретной мутации относительно всех 122 RIF-устойчивых изолятов (последняя строка таблицы 2). В образцах из г. Харькова, устойчивых к рифампицину, наблюдалось наибольшее разнообразие различных нуклеотидных замен в «коровом» регионе, что может быть обусловлено гетерогенностью изолятов М.tuberculosis в этой выборке, уровень кластеризации которых составил всего 31%.

Поиск ассоциаций между принадлежностью к определенному семейству и наличием нуклеотидной замены (TCG->TTG) в 531 кодоне гена гроВ

С помощью статистического анализа нами была найдена ассоциация между принадлежностью к семейству Beijing и наличием мутации в 531 кодоне гена гроВ у изолятов, принадлежащих к выборкам из г. Новосибирска ("/=14,225, р< 0,001) и г. Харькова (/=4,224, р= 0,04) (табл.3). В остальных выборках и в отношении других семейств такой взаимосвязи выявлено не было.

Таблица 3. Ассоциация между принадлежностью к определенному семейству и наличием нуклеотидной замены в 531 кодоне гена гроВ у ШГ -устойчивых изолятов.

Семейства г. Харьков г. Астана г. Новосибирск г. Владивосток Всего

Beijing /2=4,22, р= 0,04 /2=1,49, р= 0,22 /2=14,22, р< 0,001 /2=0,11, р= 0,73 /2=5,13, р= 0,02

LAM /2=2,51, р= 0,11 /2=2,21, р= 0,14 /2=2,23, р= 0,13 /2=0,07, р= 0,78 /2=0,94, р= 0,33

Haarlem #=1,51, р= 0,22 - /2=1,22, р= 0,27 /2=0,01, р= 0,90 /2=0,23, р= 0,63

S /2=2,32, р= 0,13 /2=0,82, р= 0,36 /2=0,10, р= 0,75 /2=0,33, р= 0,56 /2=0,02, р= 0,88

Ural /2=2,04, р= 0,15 /2=0,04, р= 0,84 /2=0,98, р= 0,32 - /2=2,72, р= 0,09

other *2=1,75, р= 0,19 /2=0,00, р= 0,98 /2=1,69, р= 0,19 /2=0,70, р= 0,40 /2=1,26, р= 0,26

Это согласуется с литературными данными - показано наличие ассоциации между принадлежностью к семейству Beijing и наличием мутации в гене гроВ в 531 кодоне в выборках из из Казахстана, из Украины, Южной Африки. Следует отметить, что были найдены противоположные результаты при исследовании выборок из Восточной Азии, а также в Латвии. Таким образом, нахождение ассоциаций между принадлежностью к данному семейству и наличием мутаций, вызывающих резистентность к ПТП, зависят от региона, где циркулируют данные изоляты.

Помимо мутаций в генах определяющих устойчивость у изолятов генотипа Beijing были найдены уникальные нуклеотидные замены в предполагаемых генах (mutT и ogt), вовлеченных в репарацию ДНК, что отчасти может объяснить ускоренную адаптацию к противотуберкулезным препаратам или к неблагоприятным условиям внутриклеточной среды. При анализе суммарной выборки нами была найдена ассоциация между принадлежностью к семейству Beijing и наличием мутации в 531 кодоне гена гроВ (х2=5,131, р= 0,023) у RIF - устойчивых изолятов, что еще раз подтверждает описанные выше результаты. В отношении других семейств таковой ассоциации найдено не было.

Выявление ассоциаций между наличием множественной лекарственной устойчивости и принадлежностью к тому или иному семейству

Поиск ассоциаций между наличием МЛУ и принадлежностью к определенному семейству проводили с помощью критерия %2 и уровня значимости р, причем в каждом случае рассматривали одну из изучаемых выборок (табл. 4).

Таблица 4. Ассоциация между принадлежностью к определенным семействам

и МЛУ.

Семейства г. Харьков г. Астана г. Новосибирск г. Владивосток Всего

Beijing /2=3,47 р= 0,06 /2=0,40 р= 0,52 /2=1,83 р= 0,18 /2=1,44 р= 0,23 /2=1,18 р= 0,27

LAM /2=4,66 р= 0,03 /2=0,004 р= 0,95 /2=0,01 р= 0,92 /2=0,34 р= 0,56 /2=5,19 р= 0,02

Haarlem /2=3,63 р= 0,06 - /2=1,70 р= 0,19 /2=1,43 р= 0,23 /2=1,91 р= 0,16

S - /2=0,06 р= 0,79 /2=0,42 р= 0,51 /2=0,64 р= 0,42 /2=2,76 р= 0,09

Ural /2=0,004, р= 0,95 /2=0,08 р= 0,77 /2=1,91 Р= 0,17 - /2=1,13 р= 0,28

other - /2=0,55 р= 0,46 /2=3,96 р= 0,04 /2=1,43 р= 0,23 /2=0,49 р= 0,48

Выявлена ассоциация между семейством LAM и наличием МЛУ среди изолятов, относящихся к выборке г. Харькова (/2=4,66, р= 0,03). Однако, мы не нашли такой ассоциации у изолятов из других выборок. При анализе суммарной выборки мы также обнаружили наличие ассоциации (/2=5,19, р= 0,02).

При анализе группы изолятов «other» найдены следующие особенности: была обнаружена ассоциация между принадлежностью к группе «other» и отсутствием МЛУ у изолятов из выборки г. Новосибирска (/2=3,96, р= 0,04). Остальные группы и семейства мы не анализировали ввиду их малочисленности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе представлены результаты исследований, направленных на изучение генетического разнообразия изолятов M.tuberculosis, циркулирующих в странах бывшего СНГ. Во всех регионах выявлено доминирование изолятов семейства Beijing, характеризующихся повышенной трансмиссивностью и вирулентностью.

Показано, что метод MIRU-типирования, использованный в данной работе для определения принадлежности изолятов M.tuberculosis к генетическому семейству, обладает высокой дискриминационной способностью. В результате проведенных исследования еще раз подтверждена возможность применения MIRU- типирования для решения комплекса эпидемиологических и клинико-лабораторных задач.

Сопоставлен генетический профиль выделенных изолятов с профилем их антибиотикоустойчивости и наличем мутаций, определяющих возникновение резистентности к основным противотуберкулезным препаратам, изониазиду и рифампицину. Результаты собственных исследований и литературные данные свидетельствуют о перспективности использования испытанных молекулярно-генетических подходов мониторинга туберкулезной инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Определено генетическое разнообразие клинических изолятов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных, проживающих на территории стран СНГ:

• Показано, что особенностью распределения генотипов в выборке г. Харькова было значительное количество генетически гетерогенных изолятов семейства LAM, что может свидетельствовать о том, что данные изоляты распространились и циркулируют на этой территории достаточно давно.

• Выявлено доминирование семейства Beijing M.tuberculosis во всех исследуемых выборках, частота встречаемости которого варьировала от 33% до 63%. Наибольшее разнообразие его подтипов, не встречающихся в других исследуемых регионах, обнаружено в г. Владивостоке. Это может быть обусловлено миграционными потоками людей из Китая, откуда данное семейство берет свое происхождение.

• Обнаружено, что частота встречаемости изолятов семейства Beijing у больных с тяжелыми формами туберкулеза легких в г. Новосибирске статистически значимо отличается от таковой популяционной, полученной в данном исследовании (84% vs 42%, OR 7.1, 95%CI [2,93-

17,53], Р < 0,0001), что подтверждает данные о повышенной вирулентности данного семейства микобактерий.

• Показано преобладание генетически гомогенных изолятов семейства Beijing (63%) в г. Астана, что может говорить об активном эпидемическом процессе на данной территории. Наибольшую частоту встречаемости имел тип М2 (76%), также наиболее распространенный в РФ.

• Во всех выборках выявлены изоляты М.tuberculosis с уникальным генетическим профилем, которые не относятся ни к одному известному семейству (от 15% до 21%). Наибольшее количество таких изолятов обнаружено в г. Владивостоке.

2. В исследуемых выборках замены Ser315Thr в гене katG и Ser531Leu в гене гроВ являются мажорными мутациями, вызывающими устойчивость к изониазиду и рифампицину (87,1 - 93% и 60 - 87%, соответственно). В г. Харькове выявили наибольшее разнообразие вариантов мутаций в «коровом регионе» гена гроВ, что может быть обусловлено гетерогенностью изолятов M.tuberculosis в этой выборке, уровень кластеризации которых составил всего 31%.

3. Найдена ассоциация между принадлежностью к семейству Beijing и наличием мутации Ser531Leu гена гроВ у изолятов, в совокупной выборке (Х2=5,13,р=0,02).

4. С помощью сравнительного анализа профилей семейств микобактерий туберкулеза в исследуемых регионах показано, что только выборка г. Владивостока статистически значимо отличалась от всех других изучаемых регионов (х2=35,94; р<0,001). Наличие ассоциаций между отдельными семействами, мутациями и наличием множественной лекарственной устойчивости варьировало между исследуемыми региональными выборками. В частности, ассоциация семейства LAM с множественной лекарственной устойчивостью была найдена только в выборке г. Харькова (^2=4,66, р=0,031), ассоциация семейства Beijing с мутацией в 531 кодоне гена гроВ обнаружена у изолятов, принадлежащих к выборкам г. Новосибирска (%2= 14,22, р<0,001) и г. Харькова (%2 =4,22, р= 0,04).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Дымова М.А., Никонов С.Д., Акулинушкин А.И., Огиренко А.П., Филипенко М.Л. Преобладание Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing у больных с тяжелыми формами туберкулеза // Вестник НГУ. -2008. -Т. 6. -С. 106-110.

2. Дымова М.А., Филипенко М.Л. «Молекулярная эпидемиология туберкулеза». Коллективная монография «Роль микроорганизмов в функционировании живых систем: фундаментальные проблемы и биоинженерные приложения». Под редакцией: Власова В.В., Дегерменджи А.Г., Колчанова Н.А.,Пармона В.Н., Репина В.Е. Издательство СО РАН. Новосибирск. -2010. -С. 247-259.

3. Дымова М.А., Кушугулова А.Р., Рахимова С.Е., Раманкулов Е.М., Жусупова Р.Ж., Храпов Е.А., Филипенко М.Л. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов m.tuberculosis у больных туберкулезом легких г. Астана // Бюллетень СО РАМН. -2011. -Т. 31. -С.107-112.

4. Дымова М.А., Ляшенко А.А., Потейко П.И., Кашуба Д.А., Стадникова А.В., Крутько B.C., Филипенко М.Л. Генетическое разнообразие штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории Харьковской области в Украине // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2011. -№1.-С. 19-23

5. Dymova М.А., Liashenko О.О., Poteiko P.I., Krutko V.S., Khrapov E.A., Filipenko M.L. Genetic variation of Mycobacterium tuberculosis circulating in Kharkiv Oblast, Ukraine // BMC Infect Dis. -2011. -V. 11:77. - doi: 10.1186/1471-2334-11-77

6. Dymova M.A., Kinsht V.N., Cherednichenko A.G., Khrapov E.A., Svistelnik A. V., Filipenko M.L. Highest prevalence of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype isolates in patients newly diagnosed for tuberculosis in the Novosibirsk oblast, Russian Federation // J Med Microbiol. -2011. -V.60. -P. 1003-1009

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит ближайших коллег и друзей, персонально, к.б.н. Сукоян М.А., к.б.н. Воронину Е.Н., к.г.-м.н. Павлову М.А., оказавших помощь в подготовке данной работы и заведующего гр. Фармакогеномики, к.б.н. Филипенко М.Л. за научное руководство.

Технический редактор E.B. Бекренёва Подписано в печать 08.06.2011 Формат 60x84/16. Бумага офсет №1. Гарнитура Тайме _Печ. л. 0,9. Тираж 100. Зак. № 61а_

ИНТТ СО РАН, пр-т Акад. Коптюга 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дымова, Майя Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА.

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТИПИРОВАНИЯ М. TUBERCULOSIS.

Полиморфизм длин рсстрикционных фрагментов IS6110 (RFLP-типиропание).

Методы выявления М. tuberculosis, основанные на ПЦР.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ и МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

ФИЛОГЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА.

ВЕТВЬ М. TUBERCULOSIS.

ДРУГИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЛИНИИ M. TUBERCULOSIS COMPLEX

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА В РОССИИ.

СЕМЕЙСТВО BEIJING М. TUBERCULOSIS.:.

Молекулнрно-генетинеские признаки семейства Beijing.

Особенности патогенеза и патологической анатомии туберкулеза, вызванного штаммами генотипа Beijing.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ.

МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

1.1 Определение генетического разнообразия изолятов M.íuberculosis, циркулирующих на территории г. Харькова, Украина.

1.2 Определение генетического разнообразия МЛиЬегсиШ^я, циркулирующих на территории г. Астана, Казахстан.

1.3.Определение генетического разнообразия МЛиЬегси1оз'к, циркулирующих на территории г. Новосибирска, СФО, РФ.

1.4 Определение генетического разнообразия МЛиЬегсМозЬ, циркулирующих на территории г. Владивостока (ДФО, РФ).

1.5 Сравнительный анализ распределения генетических профилей в исследуемых выборках.

2. ИЗУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ.

2.1. Выявление ассоциаций между наличием множественной лекарственной устойчивости и принадлежностью к тому или иному семейству.

2.2. Изучение частоты встречаемости мажорных мутаций, определяющих резистентное 1Ь к изониазиду и рифампицину.

2.3. Поиск ассоциаций между принадлежностью к определенному семейству и наличием нуклеотидной замены (ТСС->ТТС) в 531 кодоне гена гроВ.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление генетического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на территории стран СНГ"

С древнейших времен и по наше время туберкулез остается серьезным инфекционным заболеванием, от которого ежегодно умирают более трех миллионов человек. Его инфекционным началом являются микобактерии туберкулезного комплекса (МБТ), включающего Mycobacterium tuberculosis, М. bovis, M.kanetti, I

M. africanum, M. canettii, M. microti, M. pinnipedii и M. саргае и другие [1]. Долгое время считалось, что геномы этих видов исключительно консервативны. Микобактерий туберкулёзного комплекса характеризует отсутствие выраженного горизонтального переноса в процессе их эволюции, которая имеет выраженный «клональный» характер. Тем не менее, к настоящему времени использование секвенирования геномов микобактерий и их отдельных генов, применение разнообразных методов определения однонуклеотидного, делеционного и микросателлитного полиморфизма показало, что микобактерии туберкулеза более полиморфны, чем предполагалось ранее [2]. Сегодня мы можем выделить близкородственные семейства М. tuberculosis, характеризующиеся особенностями генома, выявляемые различными молекулярно-генетическими методами. Учитывая, что эволюция микобактерий проходила в постоянном взаимодействии с инфицированным им макроорганизмом, можно предположить, что генетическая вариабельность микобактерий могла бы реализовываться в различии как фенотипических свойств разных семейств микобактерий туберкулеза, так и в характере протекания заболевания.

Молекулярно-эпидемиологические исследования, выполненные разными авторами в разных географических регионах, позволили в настоящий момент времени выделить несколько относительно генетически гомогенных семейств (линий) М. tuberculosis, характеризующихся специфическими генетическими маркерами [3,4].

Среди них семейство Beijing, которое было впервые описано в 1995г. и представляют собой одну из самых «успешных» клад в современной всемирной эпидемии туберкулеза [5, 6]. Различные эксперименты на животных показали, что штаммы Beijing более вирулентны, и вызывают большие гистопатологические изменения, более быстрый рост и большую смертность [7]. Семейство Beijing является наиболее распространенным среди новых случаев заболевания туберкулезом в разных регионах Российской Федерации и странах ближнего зарубежья. Сегодня часть эпидемиологических исследований показывают также связь между принадлежностью микобактерий семейству Beijing и наличием мутаций определяющих лекарственную устойчивость, а иногда и их типом. Отчасти это подтверждает гипотезу, что в эпоху активной химиотерапии туберкулеза, лекарственная устойчивость может способствовать распространению определенного генотипа М. tuberculosis. Однако, пока экспериментальные исследования не смогли выявить основные механизмы, лежащие в основе этой связи. Таким образом, утверждение об ассоциации принадлежности микобактерии тому или иному семейству с вероятностью возникновения лекарственной устойчивости, а также с особенностями патогенности микобактерий, требует дальнейших исследований.

Появление штаммов семейства Beijing может отражать тотальную тенденцию изменения в структуре популяции М. tuberculosis, вероятно, обусловленную антропогенными факторами (лечением антибиотиками и вакцинацией). Семейство Beijing изучено наиболее подробно, но другие превалирующие семейства, такие как Haarlem и Africans могут также претерпеть подобные изменения [8].

Эволюционное движение микобактерий туберкулеза к новой популяции бактерий, которые труднее поддаются лечению и имеют более широкие возможности, чтобы обойти вакцинацию, будет являться основным препятствием нашим усилиям по борьбе с туберкулезом. Поэтому существует настоятельная необходимость более полного понимания механизмов, лежащих в основе появления «успешных» семейств М. tuberculosis, изучения популяционной структуры и ее динамики в отягощенных по «туберкулезной инфекции районах, к которым относятся бывшие страны СНГ: Казахстане, Украине, Эстонии, Киргизии, а также в некоторых .регионах Российской Федерации (РФ): Архангельской, Санкт-Петербургской, Самарской, Кемеровской, Новосибирской области, республике Тыва, в Приморском крае, где наблюдаются высокая заболеваемость, смертность от туберкулеза и большой процент лекарственно устойчивых форм туберкулеза [9]. Этот анализ должен быть распространен и на мониторинг лекарственной устойчивости на фенотипическом и генотипическом уровнях.

Молекулярная эпидемиология в сочетании с традиционными методами исследования позволят выявить наиболее вирулентные и патогенные штаммы возбудителя туберкулеза. Результаты таких исследований могут иметь чрезвычайно важные последствия для лечения туберкулеза и привести к нашему тотальному перевооружению для борьбы с этим заболеванием.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение генетического ' разнообразия изолятов M.tuberculosis, выделенных от больных, проживающих на территории стран СНГ, в том числе определение спектров и частот мутаций, ассоциированных с возникновением устойчивости к противотуберкулезным препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи.

1. Выявить региональные особенности встречаемости различных семейств М. tuberculosis.

3. Провести поиск ассоциаций между' наличием мутаций, множественной лекарственной устойчивостью и принадлежностью исследуемых изолятов к тем или иным1 семействам M.tuberculosis.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые подробно охарактеризована коллекция изолятов M.tuberculosis, циркулирующих на территории стран бывшего СНГ. Сделан-сравнительный анализ частот встречаемости различных семейств M.tuberculosis, циркулирующих на данных территориях и вызывающих основные эпидемиологические вспышки. У данных генотипов выявлен профиль устойчивости, определены спектры и частоты мутаций, ассоциированных с возникновением устойчивости к противотуберкулезным препаратам первого ряда, что способствует более эффективному выбору режима противотуберкулезной терапии. Проведен поиск ассоциаций принадлежности к определенному генотипу, наличию мутаций, определяющих устойчивость к рифампицину, и к множественной лекарственной устойчивости.

2004 (г. Москва, Россия, 2004); International scientific conference «Development of international collaboration in field of study infectious diseases» (г. Новосибирск, Россия, 2004); International Conference on Chemical Biology (г. Новосибирск, Россия, 2005); 3rd Young Medics' International Conference (г. Ереван, Армения, 2005); Международная конференция «Фундаментальные науки - Биотехнологии и медицине» (Новосибирск, Россия, 2006); III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, Россия, 2006); Международная. конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и индустрии» (г. Долгопрудный, Россия, 2011).

Вклад автора. Проведение генотипирования изолятов M.tuberculosis с помощью VNTR-типирования и RFLP-типирования, построение дендрограмм кластеризации, определение мутаций в генах katG и гроВ с помощью ПЦР - ПДРФ - анализа, пробоподготовка образцов для последующего секвенирования и статистический анализ полученных данных сделаны лично автором.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дымова, Майя Александровна

Выводы

• Показано, что особенностью распределения генотипов в выборке г. Харькова'было значительное количество генетически гетерогенных изолятов семейства LAM, что может свидетельствовать о том, что данные изоляты распространились и циркулируют на этой территории достаточно давно.

• Выявлено доминирование семейства Beijing M.tuberculosis во всех исследуемых выборках, частота встречаемости которого варьировала от 33% до 63%. Наибольшее разнообразие его. подтипов, не встречающихся в других исследуемых регионах, обнаружено в г. Владивостоке. Это может быть обусловлено миграционными потоками людей из Китая, откуда данное семейство берет свое происхождение.

• Во всех выборках выявлены изоляты M.tuberculosis с уникальным генетическим профилем, которые не относятся ни к одному

122 известному семейству (от 15% до 21%). Наибольшее количество таких изолятов обнаружено в г. Владивостоке.

2. В исследуемых выборках замены Ser315Thr в гене katG и Ser531Leu в гене гроВ являются мажорными мутациями, вызывающими устойчивость к изониазиду и рифампицину (87,1 - 93% и 60 - 87%, соответственно). В г. Харькове выявили наибольшее разнообразие вариантов мутаций в «коровом регионе» гена гроВ, что может быть обусловлено гетерогенностью изолятов М. tuberculosis в этой выборке, уровень кластеризации которых составил всего 31%.

3. Найдена ассоциация между принадлежностью к семейству Beijing и наличием мутации Ser531Leu гена гроВ у изолятов, в совокупной выборке (х2=5,13, р= 0,02).

4. С помощью сравнительного анализа профилей семейств микобактерий туберкулеза в исследуемых регионах показано, что только выборка г. Владивостока статистически значимо отличалась от всех других изучаемых регионов (х2=35,94; р<0,001). Наличие ассоциаций между отдельными семействами, мутациями и наличием множественной лекарственной устойчивости варьировало между исследуемыми региональными выборками. В частности, ассоциация семейства LAM с множественной лекарственной устойчивостью была найдена только в выборке г. Харькова (%2~4,66, р=0,031), ассоциация семейства Beijing с мутацией в 531 кодоне гена гроВ обнаружена у изолятов, принадлежащих к выборкам г. Новосибирска (%2= 14,22, р<0,001) и г. Харькова (х2 =4,22, Р= 0,04).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дымова, Майя Александровна, Новосибирск

1. Brosch, R., et al., A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sei USA, 2002. 99(6): p. 3684-9.

2. Tsolaki, A.G., et al., Functional and evolutionary genomics of Mycobacterium tuberculosis: insights from genomic deletions in 100 strains. Proc Natl Acad Sei USA, 2004. 101(14): p. 4865-70.

3. Sola, C., et al., Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics. Infect Genet Evol, 2003. 3(2): p. 125-33.

4. Bifani, P.J:, et al., Global'dissemination of the Mycobacterium tubercidosis W-Beijing family strains. Trends Microbiol, 2002.10(1): p. 45-52.

5. Mokrousov, I., et al., Origin and primary dispersal of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: clues from human phylogeography. Genome Res, 2005.15(10): p. 1357-64.

6. Lopez, В., et al., A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tubercidosis genotypes. Clin Exp Immunol, 2003. 133(1): p. 30-7.

7. Brudey, K., et al., Molecular epidemiology of Mycobacterium tubercidosis in western Sweden. J Clin Microbiol, 2004. 42(7): p. 3046-51.

8. Borrell, S. and S. Gagneux, Infectiousness, reproductive fitness and evolution of drug-resistant Mycobacterium tubercidosis Int J Tuberc Lung Dis, 2009. 13(12): p. 1456-66.

9. Mathema, В., et al., Molecular epidemiology of tuberculosis: current insights. Clin Microbiol Rev, 2006,-19(4): p. 658-85.

10. Barnes, P.F. and M.D. Cave, Molecular epidemiology of tuberculosis. N Engl J Med, 2003. 349(12): p. 1149-56.

11. Cole, S.T., et al., Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 1998. 393(6685): p. 537-44.

12. Frothingham, R., H.G. Hills, and K.H. Wilson, Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol, 1994. 32(7): p. 1639-43.

13. Aranaz, A., et al., Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae subsp. nov.: a taxonomic study of a new member of the Mycobacterium tubercidosis complex isolated from goats in Spain. Int J Syst Bacteriol, 1999. 49 Pt 3: p. 1263-73.

14. Cousins, D.V., et al., Tuberculosis in imported hyrax (Procavia capensis) caused by an unusual variant belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex. Vet Microbiol, 1994. 42(2-3): p. 135-45.

15. Fleischmann, R.D., et al., Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol, 2002. 184(19): p. 547990.

16. Van Soolingen, D., Molecular epidemiology of tubercidosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements. J Intern Med, 2001. 249(1): p. 1-26.

17. Overduin, P., et al., Use of multilocus variable-number tandem-repeat analysis for typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J Clin Microbiol, 2004. 42(11): p. 5022-8.

18. Kanduma, E., T.D. McHugh, and S.H. Gillespie, Molecular methods for Mycobacterium tuberculosis strain typing: a users guide. J Appl Microbiol, 2003.94(5): p. 781-91.

19. Goguet de la Salmoniere, Y.O., et al., Evaluation*of spoligotyping in a study of the transmission of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 1997. 35(9): p. 2210-4.

20. Mostrom, P., et al., Methods used in the molecular epidemiology of tuberculosis. Clin Microbiol Infect, 2002. 8(11): p. 694-704.

21. Kremer, K., et al., Discriminatory power and reproducibility of novel DNA typing methods for Mycobacterium tuberculosis complex strains. J Clin Microbiol, 2005. 43(11): p. 5628-38.

22. Kremer, K., et al., Definition of the Beijing/W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers. J Clin Microbiol, 2004. 42(9): p. 4040-9.

23. Frothingham, R. and W.A. Meeker-O'Connell, Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. Microbiology, 1998.144 ( Pt 5): p. 1189-96.

24. Ed. G.F. Hatfull, W.R.J.J., Molecular Genetics of Mycobacteria Washington, D.C.: ASM Press, 2000: p. 69-84.

25. Supply, P., et al., Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome. Mol Microbiol, 2000. 36(3): p. 762-71.

26. Mazars, E., et al., High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology. Proc Natl Acad Sei U S A, 2001. 98(4): p. 1901-6;

27. Skuce, R.A., et al., Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets. Microbiology, 2002. 148(Pt 2): p. 51928.

28. Allix-Beguec, C., et al., Standardised PCR-based molecidar epidemiology of tuberculosis. Eur Respir J, 2008. 31(5): p. 1077-84.

29. Kwara, A., et al., Evaluation of the epidemiologic utility of secondary typing methods for differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol, 2003. 41(6): p. 2683-5.

30. Ramaswamy, S. and J.M. Musser, Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuber Lung Dis, 1998. 79(1): p. 3-29.

31. Baylan, O.', Extensively Drug Resistant and Extremely Drag Resistant Tuberculosis Forms'After Multi-Drug Resistant Tubercidosis: New Faces of the Old Disease.. Mikrobiyol Bui. 45(1): p. 181-195.

32. Telenti, A., et al., Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet, 1993. 341(8846): p. 647-50.

33. Musser, J.M., Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular j genetic insights. Clin Microbiol Rev, 1995. 8(4): p. 496-514. i

34. Donnabella, V., et al., Isolation of the gene for the beta subunit of RNA ' polymerase from rifampicin-resistant Mycobacterium tubercidosis and identification of new mutations. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994. 11(6): p. 63943.

35. Altamirano, M., et al., Mutations in the catalase-peroxidase gene from isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. J Infect Dis, 1994. 169(5): p. 1162-5.

36. Wengenack, N.L., et al., Recombinant Mycobacterium tuberculosis KatG(S315T) is a competent catalase-peroxidase with reduced activity toward isoniazid. J Infect Dis, 1997. 176(3): p. 722-7.

37. Voronina, E.N., et al., KatG Ser3 15Thr mutation as the main reason of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolated in the Novosibirsk and Kemerovo Regions. Mol Gen Mikrobiol Virusol, 2004(3): p. 8-11.

38. Дымова M.A., Н.С.Д., Акулинушкин.А.И., Огиренко А.П., Филипенко M.JI. , Преобладание Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing у больных с тяжелыми формами туберкулеза. Вестник НГУ: Биология, клинич. мед. , 2008. Т. 6(3): р. С. 106-109.

39. Cockerill, F.R., 3rd, et al., Rapid identification of a point mutation of the Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (katG) gene associated with isoniazid resistance. J Infect Dis, 1995. 171(1): p. 240-5.

40. Johnsson, K., W.A. Froland, and P.G. Schultz, Overexpression, purification, and characterization of the catalase-peroxidase KatG from Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem, 1997. 272(5): p. 2834-40.

41. Loevven, P.C., et al., Molecular characterization of three mutations in katG affecting the activity of hydroperoxidase I of Escherichia coli. Biochem Cell Biol, 1990. 68(7-8): p. 1037-44.

42. Pelletier, H. and J. Kraut, Crystal structure of a complex between electron transfer partners, cytochrome c peroxidase and cytochrome c. Science, 1992. 258(5089): p. 1748-55.

43. Basso, L.A., et al., Mechanisms of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis: enzymatic characterization of enoyl reductase mutants identified in isoniazid-resistant clinical isolates. J Infect Dis, 1998. 178(3): p. 769-75.

44. Banerjee, A., et al., inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis. Science, 1994. 263(5144): p. 22730.

45. Deretic, V., et al., Mycobacterium tuberculosis is a natural mutant with an inactivated oxidative-stress regulatory gene: implications for sensitivity to isoniazid. Mol Microbiol, 1995.17(5): p. 889-900.

46. Sherman, D.R., et al., Disparate responses to oxidative stress in saprophytic and pathogenic mycobacteria. Proc Natl Acad Sei USA, 1995. 92(14): p. 6625-9.

47. Wilson, T.M. and'D.M. Collins, ahpC, a gene involved in isoniazid resistance of the Mycobacterium tuberculosis complex. Mol Microbiol, 1996. 19(5): p. 102534.

48. Ramaswamy, S.V., et al., Single nucleotide polymorphisms in genes associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(4): p. 1241-50.

49. Alland, D., et al., Characterization of the Mycobacterium tuberculosis iniBAC promoter, a promoter that responds to cell wall biosynthesis inhibition. J Bacteriol, 2000.182(7): p. 1802-11.

50. Wilson, M., et al., Exploring drug-induced alterations in gene expression in Mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization. Proc Natl Acad Sei U S A, 1999. 96(22): p. 12833-8.

51. Miesel, L., et al., NADH dehydrogenase defects confer isoniazid resistance and conditional lethality in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol, 1998. 180(9): p. 2459-67.

52. Payton, M., et al., Cloning and characterization of arylamine N-acetyltransferase genes from Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis: increased expression results in isoniazid resistance. J Bacteriol, 1999.181(4): p. 1343-7.

53. Upton, A.M., et al., Arylamine N-acetyltransferase of Mycobacterium tuberculosis is a polymorphic enzyme and a site of isoniazid metabolism. Mol Microbiol, 2001. 42(2): p. 309-17.

54. Argyrou, A., et al., Mycobacterium. tuberculosis dihydrofolate reductase is a target for isoniazid. Nat Struct Mol Biol, 2006.13(5): p. 408-13.

55. Ho, Y.M., et al., Contribution of dfrA and inhA mutations to the detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother, 2009. 53(9): p. 4010-2.

56. Pagan-Ramos, E., et al., Oxidative stress response and characterization of the oxyR-ahpC and furA-katG loci in Mycobacterium marinum. J Bacteriol, 1998. 180(18): p. 4856-64.

57. Pym, A.S., B. Saint-Joanis, and S.T. Cole, Effect of katG mutations on the virulence of Mycobacterium tuberculosis and the implication for transmission in humans. Infect Immun, 2002. 70(9): p. 4955-60.

58. Rouse, D.A., et al., Site-directed mutagenesis of the katG gene of Mycobacterium tuberculosis: effects on catalase-peroxidase activities and isoniazidresistance. Mol Microbiol, 1996. 22(3): p. 583-92.

59. Jiao, W.W., et al., Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, China. Chin Med J (Engl), 2007.120(9): p. 814-9.

60. Bakonyte, D:, et al., Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in Lithuania. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(6): p. 2009-11.

61. Zhang, M., et al., Detection of mutations associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. J Clin Microbiol, 2005. 43(11): p. 5477-82.

62. Cardoso, R.F., et al., Screening and characterization of mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates obtained in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, 2004. 48(9): p. 3373-81.

63. Kelley, C.L., D.A. Rouse, and S.L. Morris, Analysis of ahpC gene mutations in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 1997. 41(9): p. 2057-8.

64. Lee, A.S., A.S. Teo, and S.Y. Wong, Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother, 2001. 45(7): p. 2157-9.

65. Billington, O.J., T.D. McHugh, and S.H. Gillespie, Physiological cost of rifampin resistance induced in vitro in Mycobacterium tubercidosis. Antimicrob Agents Chemother, 1999. 43(8): p. 1866-9.

66. Gagneux, S., et al., The competitive cost of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. Science, 2006. 312(5782): p. 1944-6.

67. Cohen, T. and M. Murray, Modeling epidemics of multidrug-resistant M. tubercidosis of heterogeneous fitness. Nat Med, 2004. 10(10): p. 1117-21.

68. Burgos, M., et al., Effect of drug resistance on the generation of secondary cases of tuberculosis. J Infect Dis, 2003.188(12): p. 1878-84.

69. Dubiley, S., E. Kirillov, and A. Mirzabekov, Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucleic Acids Res, 1999. 27(18): p. el9.

70. Pretorius, G.S., et al., Mutations in katG gene sequences in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis are rare. Antimicrob Agents Chemother, 1995. 39(10): p. 2276-81.

71. Felmlee, T.A., et al., Genotypic detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance: comparison of single-strand conformation polymorphism and dideoxyfingerprinting. J Clin Microbiol, 1995. 33(6): p. 1617-23.

72. Hazbon, M.H., Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis. Biomedica, 2004. 24 Supp 1: p. 149-62.

73. El-Hajj, H.H., et al., Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tubercidosis in a single tube with molecular beacons. J Clin Microbiol, 2001. 39(11): p. 4131-7.

74. Troesch, A., et al., Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol, 1999. 37(1): p. 49-55.

75. Brow, M.A., et al., Differentiation of bacterial 16S rRNA genes and intergenic regions and Mycobacterium tuberculosis katG genes by structure-specific endonuclease cleavage. J Clin Microbiol, 1996. 34(12): p. 3129-37.

76. Agaev, F.F., et al., Molecular genetic and bacteriological methods for the diagnosis of multidrug resistant M. tuberculosis. Probl Tuberk Bolezn Legk, 2009(9): p. 32-5.

77. Nachamkin, I., C. Kang, and M.P. Weinstein, Detection of resistance to isoniazid, rifampin, and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods. Clin Infect Dis, 1997. 24(5): p. 894-900.

78. Gagneux, S. and P.M. Small, Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tubercidosis product' development. Lancet Infect Dis, 2007. 7(5): p. 328-37.

79. Mahairas, G.G., et al., Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J Bacteriol, 1996. 178(5): p. 1274-82.

80. Gordon, S.V., et al., Genomics of Mycobacterium bovis. Tuberculosis (Edinb), 2001. 81(1-2): p. 157-63.

81. Philipp, W.J., et al., Physical mapping of Mycobacterium bovis BCG pasteur reveals differences from the genome map of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and from M. bovis. Microbiology, 1996. 142 ( Pt 11): p. 3135-45.

82. Behr, M.A., et al., Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science, 1999. 284(5419): p. 1520-3.

83. Chen, J., et al., Rv1985c, a promising novel antigen for diagnosis of tuberculosis infection from BCG-vaccinated controls. BMC Infect Dis. 10: p. 273.

84. Behr, M.A. and S. Mostowy, Molecular tools for typing and branding the tubercle bacillus. Curr Mol Med, 2007. 7(3): p. 309-17.

85. Gordon, S.V., et al., Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays. Mol Microbiol, 1999. 32(3): p. 643-55.

86. Kato-Maeda, M., et al., Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis. Genome Res, 2001.11(4): p. 547-54.

87. Sampson, S., et al., IS6110 insertions in Mycobacterium tubercidosis: predominantly into coding regions. J Clin Microbiol, 2001. 39(9): p. 3423-4.

88. Hovav, A.H., et al., The Mycobacterium tuberculosis recombinant 27-kilodalton lipoprotein induces a strong Thl-type immune response deleterious to protection. Infect Immun, 2003. 71(6): p. 3146-54.

89. Parsons, L.M:, et al., Rapid and simple approach for identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates by PCR-based genomic deletion analysis. J.Clin Microbiol, 2002. 40(7): p. 2339-45.

90. Mokrousov, I., et al., At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia. FEMS Immunol Med Microbiol, 2009. 55(1): p. 13-22.

91. Baker, L., et al., Silent nucleotide polymorphisms and a phylogeny for Mycobacterium tuberculosis. Emerg Infect Dis, 2004.10(9): p. 1568-77.

92. Gagneux, S., et al., Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sei USA, 2006. 103(8): p. 2869-73.

93. Brudey, K., et al., Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. BMC Microbiol, 2006. 6: p. 23.

94. Ernst, J.D., G. Trevejo-Nunez, and N. Banaiee, Genomics and the evolution, pathogenesis, and diagnosis of tuberculosis. J Clin Invest, 2007. 117(7): p. 1738-45.107.108.109.110. 111.112.113.114.115.116.117.118.

95. Rothschild, B.M., et al., Mycobacterium tuberculosis complex DNA from an extinct bison dated 17,000 years before the present. Clin Infect Dis, 2001. 33(3): p. 305-11.

96. Bruford, M.W., D.G. Bradley, and G. Luikart, DNA markers reveal the complexity of livestock domestication. Nat Rev Genet, 2003. 4(11): p. 900-10.

97. Andersen, P. and T.M. Doherty, The success and failure of BCG implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol, 2005. 3(8): p. 656-62.

98. Fine, P.E., Variation in protection by BCG: implications of andfor heterologous immunity. Lancet, 1995. 346(8986): p. 1339-45.

99. Mostowy, S., et al., Genomic deletions suggest a phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis complex. J Infect Dis, 2002.186(1): p. 74-80.

100. Shaginian, I.A., et al., Genomic polymorphism in Mycobacterium tuberculosis strains. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1996(3): p. 65-8.

101. Perelman, M.I., Tuberculosis in Russia. Int J Tuberc Lung Dis, 2000. 4(12): p. 1097-103.

102. Stepanshina, V.N., et al., Drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Russia. Int J Tuberc Lung Dis, 1999. 3(2): p. 149-52.

103. Marttila, H.J., et al., pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from northwestern Russia. Antimicrob Agents Chemother, 1999. 43(7): p. 1764-6.

104. Mikhailovich, V., et al., Identification of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips. J Clin Microbiol, 2001. 39(7): p. 2531-40.

105. Mokrousov, I., et al., High prevalence of KatG Ser315Thr substitution amongi isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from< northwestern Russia, 1996 to 2001. Antimicrob Agents Chemother, 2002. 46(5): p. 1417-24.

106. Toungoussova, O.S., et al., Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia. J Clin Microbiol, 2002. 40(6): p. 1930-7.

107. Drobniewski, F., et al., Rifampin- and multidrug-resistant tuberculosis in Russian civilians and prison inmates: dominance of the beijing strain family. Emerg Infect Dis, 2002. 8(11): p. 1320-6.

108. Matrakshin, A.G., et al., Genotypic characteristics of Mycobacterium tuberculosis strains from the Republic of Tyva. Probl Tuberk Bolezn Legk, 2004(3): p. 37-40.

109. Mokrousov, I., et al., PCR-based methodology for detecting multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis Beijing family circidating in Russia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2003. 22(6): p. 342-8.

110. Toungoussova, S., et al., Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients with pidmonary tuberculosis in Archangels, Russia. Int J Tuberc Lung Dis, 2002. 6(5): p. 406-14.

111. Tungusova, O.S., et al., Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis of the genotype Beijing in imprisonment places in the Arkhangelsk Region. Probl Tuberk Bolezn Legk, 2004(8): p. 35-41.

112. Drobniewski, F., et al., Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia. Jama, 2005. 293(22): p. 272631.

113. Surikova, O.V., et al., Efficient differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family from Russia using highly polymorphic VNTR loci. Eur J Epidemiol, 2005. 20(11): p. 963-74.

114. Mokrousov, I., et al., Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: in search of informative variable-number tandem-repeat loci. J Clin Microbiol, 2008. 46(11): p. 3576-84.

115. Migliori, G.B., et al., Resistance to second-line injectables and treatment outcomes in multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis cases. Eur Respir J, 2008. 31(6): p. 1155-9.

116. Milan; S.J., et al., Expanded geographical distribution of the N family of Mycobacterium tuberculosis strains within the United States. J Clin Microbiol, 2004. 42(3): p. 1064-8:

117. Kruuner, A., et al., Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia. J Clin Microbiol, 2001. 39(9): p. 3339-45.

118. Rindi, L., et al., Evolutionary pathway of the Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis based on genomic deletions and mutT genes polymorphisms. Infect Genet Evol, 2009. 9(1): p. 48-53.

119. Beijing/W genotype Mycobacterium tubercidosis and drug resistance. Emerg Infect Dis, 2006. 12(5): p. 736-43.

120. Balabanova, Y., Drobniewski, F., Fedorin, I. et al. , The Directly Observed Therapy Short-Course (DOTS) strategy in Samara Oblast, Russian Federation Respir. Res., 2006. 7(1): p. 53-44.

121. Jou, R., C.Y. Chiang, and W.L. Huang, Distribution of the Beijing family genotypes of Mycobacterium tuberculosis in Taiwan. J Clin Microbiol, 2005. 43(1): p. 95-100.

122. Almeida, D., et al., High incidence of the Beijing genotype among multidrug-resistant isolates of Mycobacterium tubercidosis in a tertiary care center in Mumbai, India. Clin Infect Dis, 2005. 40(6): p. 881-6.

123. Malik, A.N. and P. Godfrey-Faussett, Effects of genetic variability of Mycobacterium tuberculosis strains on the presentation of disease. Lancet Infect Dis, 2005. 5(3): p. 174-83.144.145.146.147.148.149.150.151.152.153.154.155.

124. Glynn, J.R., et al., Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype, northern Malawi. Emerg Infect Dis, 2005. 11(1): p. 150-3.

125. Manca, C., et al., Hypervirulent M. tuberculosis W/Beijing strains upregidate type I IFNs and increase expression of negative regulators of the Jak-Stat pathway. J Interferon Cytokine Res, 2005. 25(11): p. 694-701.

126. Abebe, F. and G. Bjune, The emergence of Beijing family genotypes of Mycobacterium tubercidosis and low-level protection by bacille Calmette-Guerin (BCG) vaccines: is there a link? Clin Exp Immunol, 2006: 145(3): p. 389-97.

127. Chacon-Salinas, R., et al., Differential pattern of cytokine expression by macrophages infected in vitro with different Mycobacterium tuberculosis genotypes. Clin Exp Immunol, 2005.140(3): p. 443-9.

128. McShane, H., Susceptibility to tuberculosis—the importance of the pathogen as well as the host. Clin Exp Immunol, 2003.133(1): p. 20-1.

129. Manca, C., et al., Differential monocyte activation underlies strain-specific Mycobacterium tubercidosis pathogenesis. Infect Immun, 2004. 72(9): p. 55114.

130. Parwati, I., R. van Crevel, and D. van Soolingen, Possible underlying mechanisms for successful emergence of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains. Lancet Infect Dis, 2010. 10(2): p. 103-11.

131. Anh, D.D., et al., Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype emerging in Vietnam. Emerg Infect Dis, 2000. 6(3): p. 302-5.

132. Li, Q., et al., Differences in rate and variability of intracellular growth of a panel of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates within a human monocyte model. Infect Immun, 2002. 70(11): p. 6489-93.

133. Borgdorff, M.W., et al., Mycobacterium tuberculosis, Beijing genotype strains not associated with radiological presentation of pulmonary tuberculosis. Tuberculosis (Edinb), 2004. 84(5): p. 337-40.

134. Sun, Y.J., et al., Tuberculosis associated with Mycobacterium tuberculosis Beijing and non-Beijing genotypes: a clinical and immunological comparison. BMC Infect Dis, 2006. 6: p. 105.

135. Sun, Y.J., et al., Association of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype with tuberculosis relapse in Singapore. Epidemiol Infect, 2006. 134(2): p. 32932.

136. Kocagoz, Т., et al., Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure. J Clin Microbiol, 1993. 31(6): p. 1435-8.

137. Supply, P., et al., Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 2006. 44(12): p. 4498-510.

138. Benson, G., Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Res, 1999. 27(2): p. 573-80.

139. Drobniewski, F.A. and S.M. Wilson, The rapid diagnosis of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis—a molecular story. J Med Microbiol, 1998. 47(3): p. 189-96.

140. Nikolayevskyy, V.V., et al., Molecular epidemiology and prevalence of mutations conferring rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains from the southern Ukraine. Clin Microbiol Infect, 2007. 13(2): p. 129-38.

141. Bumburidi, E., et al., Progress toward tubercidosis control and determinants of treatment outcomes—Kazakhstan, 2000-2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2006. 55 Suppll:p. 11-5.

142. Mokrousov, I., et al., Penitentiary population of Mycobacterium tuberculosis in Kyrgyzstan: exceptionally high prevalence of the Beijing genotype and its Russia-specific subtype. Infect Genet Evol, 2009. 9(6): p. 1400-5.

143. Kubica, Т., et al., The Beijing genotype is a major cause of drug-resistant tuberculosis in Kazakhstan. Int J Tuberc Lung Dis, 2005. 9(6): p. 646-53.

144. Hillemann, D., et al., Rifampicin and isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients in Kazakhstan. Int J Tuberc Lung Dis, 2005. 9(10): p. 1161-7.

145. Murashkina G.S., A.T.V., Novikova N.M., Silaikina S.T., Reviakina O.V.„ Antituberculosis measures in the Siberian and Far Eastern Federal Districts in Figures. Novosibirsk Research Institute of Tuberculosis., 2010.

146. Lillebaek, Т., et al., Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype. Emerg Infect Dis, 2003. 9(12): p. 1553-7.

147. Lari, N., et al., Beijing/W Mycobacterium tuberculosis in Italy Emerg Infect Dis, 2004. 10(5): p. 958-9.

148. Caminero, J.A., et al., Epidemiological evidence of the spread of a Mycobacterium tuberculosis strain of the Beijing genotype on Gran Canaria Island Am J Respir Crit Care Med, 2001. 164(7): p. 1165-70.

149. Zhou, A., et al., Molecular genotyping of Mycobacterium tuberculosis in XVan, China, usingMIRU-VNTR typing. Int J Tuberc Lung Dis. 15(4): p. 517-22.

150. Татьков С.И., С.А.Ю., Кузьмичева Г.А., Смирнова О.Ю., Филипенко М.Л., Рот М.А., Свистельник A.B., Лисиченко Г.М., Краснов В.А., Eisenach K.D.,ч

151. Wang, J., et al., Genotypes and Characteristics of Clustering and Drug Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis Isolates Collected in Heilongjiang Province, China. J Clin Microbiol. 49(4): p. 1354-62.

152. Шемякин И.Г., С.В.Н., Коробова О.В., Анисимова В.А. , Генетическое типирование штаммов Mycobacterium Tuberculosis методами сполиготипирования и геномной дактилоскопии. Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунологии, 2003(№2): р. 30 35.

153. Kurepina, N.E., et al., Characterization of the phylogenetic distribution and chromosomal insertion sites of five IS6110 elements in Mycobacterium tuberculosis: non-random integration in the dnaA-dnaN region Tuber Lung Dis, 1998. 79(1): p. 31-42.

154. Medvedeva, T.V., et al., MIRU-VNTR genotyping of Mycobacterium tuberculosis strains from East Siberian: Beijing family versus Kilimanjaro family. Mol Gen Mikrobiol Virusol, 2004(4): p. 33-8.

155. Kovalev, S.Y., et al., Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping. Int J Tuberc Lung Dis, 2005. 9(7): p. 746-52.

156. Niemann; S., et al., Mycobacterium tubercidosis Beijing lineage favors the spread of multidrug-resistant tubercidosis in the Republic of Georgia. J Clin Microbiol. 48(10): p. 3544-50.

157. Sola, C., et al., Mycobacterium tuberculosis molecular evolution in western Mediterranean Islands of Sicily and Sardinia. Infect Genet Evol, 2005. 5(2): p. 145-56^

158. Lee, A.S., et al., Contribution ofkasA analysis to detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in Singapore. Antimicrob Agents Chemother, 1999. 43(8): p. 2087-9.

159. Piatek, A.S., et al., Genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis in two distinct populations using molecular beacons: implications for rapid susceptibility testing. Antimicrob Agents Chemother, 2000. 44(1): p. 103-10.

160. Fang, Z., et al., Molecular evidence for heterogeneity of the multiple-drug-resistant Mycobacterium tuberculosis population in Scotland (1990 to 1997). J Clin Microbiol, 1999. 37(4): p. 998-1003.

161. Marttila, H.J., et al., katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients. Antimicrob Agents Chemother, 1996. 40(9): p. 2187-9.

162. Dobner, P., et al., Usefulness of Mycobacterium tuberculosis genomic mutations in the genes katG and inhA for the prediction of isoniazid resistance. Int J Tuberc Lung Dis, 1997. 1(4): p. 365-9.

163. Escalante, P., et al., Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru. Tuber Lung Dis, 1998. 79(2): p. 111-8.

164. Taniguchi, H., et al., Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiol Lett, 1996. 144(1): p. 103-8.

165. Bodmer, T., et al., Mutation position and type of substitution in the beta-subunit of the RNA polymerase influence in-vitro activity of rifamycins in rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob Chemother, 1995. 35(2): p. 345-8.

166. Ohno, H., et al., Relationship between rifampin MICsfor and rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Japan. Antimicrob Agents Chemother, 1996. 40(4): p. 1053-6.

167. Zhou, Y.N. and D.J. Jin, The rpoB mutants destabilizing initiation complexes at stringently controlled promoters behave like "stringent" RNA polymerases in Escherichia coll Proc Natl Acad Sei USA, 1998. 95(6): p. 2908-13.

168. Mokrousov, I., et al., Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(7): p. 2231-5.

169. Tracevska, T., et al'., Mutations in the rpoB and katG genes leading to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Latvia. J Clin Microbiol, 2002. 40(10): p. 3789-92.

170. Van Rie, A., et al., Analysis for a limited number of gene codons can predict drug resistance of Mycobacterium tubercidosis in a high-incidence community. J Clin Microbioh, 2001. 39(2): p. 636-41.

171. Mokrousov, I., et al., Evaluation of the rpoB macroarray assay to detect rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in Beijing, China. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2006. 25(11): p. 703-10.

172. Tracevska, T., et al., Prevalence of Beijing genotype in Latvian multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Int J Tuberc Lung Dis, 2003. 7(11): p. 1097-103.

173. Ebrahimi-Rad, M., et al., Mutations in putative mutator genes of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family. Emerg Infect Dis, 2003. 9(7): p. 838-45.

174. Lari, N., et al., Mutations in mutT genes of Mycobacterium tubercidosis isolates of Beijing genotype. J Med Microbiol, 2006. 55(Pt 5): p. 599-603.

175. Werngren, J. and S.E. Hoffher, Drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype does not develop mutation-conferred resistance to rifampin at an elevated rate. J Clin Microbiol, 2003. 41(4): p. 1520-4.

176. Gillespie, S.H., Evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: clinical and molecular perspective. Antimicrob Agents Chemother, 2002. 46(2): p. 267-74.

177. Ignatova, A., et al., Predominance of multi-drug-resistant LAM and Beijing family strains among Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from prison inmates in Tula Region, Russia. J Med Microbiol, 2006. 55(Pt 10): p. 1413-8.

178. Toungoussova, O.S., et al., Molecular epidemiology and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates in the Archangel prison in Russia: predominance of the W-Beijing clone family. Clin Infect Dis, 2003. 37(5): p. 665-72.

179. Qian, L., et al., rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from East Asian countries. J Clin Microbiol, 2002. 40(3): p. 1091-4.

Информация о работе

Дымова, Майя Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Выявление генетического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на территории стран СНГ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы