Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis W кластера

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis W кластера"

На правах рукописи

Андреевская Софья Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS W КЛАСТЕРА

03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

00316GS74

Москва 2008

Работа выполнена в Государственном учреждении Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Черноусова Лариса Николаевна доктор медицинских наук, профессор Земскова Зоя Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Баснакьян Ирина Арташесовна доктор медицинских наук, профессор Дорожкова Инна Рафаиловна

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт фтизиопульмонодогии Московской медицинской академии им ИМ Сеченова

Защита состоится "_"_ 2008 г в _ на заседании

диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, д 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им ГН Габричевского"

Автореферат разослан "__"_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

С Ю Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем здравоохранения во всем мире По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн случаев Для улучшения мероприятий по контролю и предотвращению туберкулеза необходимо идентифицировать клинически важные штаммы, характеризующиеся повышенной трансмиссивностью или вызывающие тяжелое течение болезни Благодаря внедрению в область эпидемиологии туберкулеза молекулярных подходов было показано, что вид М tuberculosis имеет строго клональную популяционную структуру и свойства штамма передаются без значительных изменений [Sreevatsan S , 1997] Поэтому представляется важной характеристика фенотипических свойств штаммов, составляющих генотипический кластер, которые, возможно, влияют на особенности распространения данной группы штаммов

В настоящее время существуют лишь единичные работы, описывающие влияние возбудителя на течение экспериментального туберкулеза, которые показали, что штаммы М tuberculosis обладают разной способностью вызывать заболевание и влиять на тяжесть его течения Накопление данных об особенностях -генотипов и фенотипическом разнообразии штаммов М tuberculosis сделало актуальной проблему определения биологических свойств возбудителя в связи с его принадлежностью к генотипическому кластеру

Наиболее разрешающим методом дифференциации штаммов М tuberculosis признано типирование по ПДРФ IS 6110 Благодаря стандартизации этого метода J D Van Embden с соавт в 1993 г и разработке программного обеспечения, стало возможно создание международных баз данных, содержащих информацию о IS67 /0-профилях гибридизации штаммов М tuberculosis, циркулирующих в различных регионах мира, что позволило, во-первых, проследить пути миграции штаммов, и, во-вторых, на основании сходства профилей гибридизации, сгруппировать известные штаммы в кластеры

Наибольший интерес в последнее время вызывают штаммы М tuberculosis W кластера, которые широко распространены во всем мире и, попадая в человеческую популяцию, способны быстро распространяв""

[Anh D D , Borgdorff M W, Van L N et al, 2000, Bifani P J , Plikaytis В В , Kapur V et al 1996, Bifani P J , Mathema В , Kurepma N E et al 2002, Pfyffer G E , Strassle A, van Gorkum T et al 2001] Причем, если в работах западных исследователей описаны отдельные вспышки, вызванные единичными представителями М tuberculosis W кластера [Bifani Р J., Mathema В , Kurepina N Е et al 2002], то в Российской Федерации и в странах Юго-Восточной Азии штаммы этого кластера преобладают (более 40%) [Khomenko A G, Chernousova L N, Kurepma N Е et al, 1998, van Soolmgen D , Qian L , de Haas P E, 1995] Факторы, способствующие успешному распространению штаммов W кластера, все еще не достаточно изучены [Bifani Р J, Mathema В , Kurepma NE etal 2002]

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение генетического полиморфизма и биологических свойств штаммов М tuberculosis W кластера в условиях in vitro, ex vivo и in vivo

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Исследование генетического полиморфизма штаммов М tuberculosis W кластера по маркеру IS6110

2 Изучение репликации in vitro штаммов М tuberculosis W кластера по сравнению с клиническими штаммами М tuberculosis, относящимися к другим генотипическим кластерам по ПДРФIS6110

3 Определение роста ex vivo в перитонеальных макрофагах (МФ) мыши клинических штаммов М tuberculosis разных генотипических кластеров

4 Изучение влияния генотипа штаммов Мtuberculosis на время жизни и динамику потери массы при заражении мышей 5x106 КОЕ

5 Характеристика экспериментального туберкулеза при заражении 4x105 КОЕ М tuberculosis кластеров W, AI, HD

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на ex vivo модели было проведено сравнительное изучение роста в МФ клинических штаммов М tuberculosis, генотипированных и кластеризованных по специфическому маркеру IS6110 Использование метода включения 5,б-[3Н]-урацила в жизнеспособные М tuberculosis позволило количественно оценить, статистически обработать полученные данные и определить достоверность отличий разных кластеров М tuberculosis по исследованным показателям

Сопоставление роста in vitro и ex vivo каждого штамма М tuberculosis способствовало оценке выживаемости популяции М tuberculosis разных кластеров в клетках хозяина (МФ) С помощью впервые изученной зависимости роста в МФ от величины бактериальной нагрузки на МФ было выделено две группы штаммов, взаимодействие с МФ которых зависело и не зависело от величины бактериальной нагрузки

Сравнительная характеристика туберкулезного процесса, вызванного несколькими штаммами М tuberculosis W кластера и группой штаммов других генотшгаческих кластеров, позволила выявить разнообразие штаммов W кластера по биологическим свойствам и впервые опровергнуть мнение о гипервирулентности W штаммов М tuberculosis

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1 Выявлен генетический полиморфизм внутри W кластера М tuberculosis с преобладанием в России штаммового варианта W148

2 При культивировании на питательной среде штаммы М tuberculosis W кластера имели скорость репликации, сравнимую с рядом штаммов, принадлежащих к другим генотипическим кластерам

3 Фагоцитированные макрофагами штаммы М tuberculosis W кластера обладали большей жизнеспособностью по сравнению с М tuberculosis других генотипических кластеров

4 В модели экспериментального туберкулеза у мышей штаммы М tuberculosis W кластера обладали разной вирулентностью, но не являлись высоко вирулентными по сравнению с другими штаммами М tuberculosis

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1 Охарактеризованы модели для оценки вирулентности и приспособляемости штаммов М tuberculosis для выживания в клетках хозяина

2 Повышенная способность штаммов W кластера приспосабливаться к внутриклеточному росту в МФ позволит использовать штаммы этого кластера в модели изучения взаимодействия патоген - хозяин

3 Штамм М tuberculosis, вызывающий казеозную пневмонию при заражении мышей, может быть использован в модельных исследованиях остро прогрессирующего туберкулеза

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Генотипирование штаммов внедрено в работу ГУ ЦНИИТ РАМН для контроля за нозокомиальной инфекцией и внутрилабораторной кросс-контаминацией

Материал настоящего исследования используется в цикле лекций для ординаторов и аспирантов, а также врачей из курируемых территорий РФ в учебном центре ГУ ЦНИИТ РАМН

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Работа апробирована на совместном заседании отделов микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (06 03 2007 г ) Материалы диссертации доложены на I Национальном конгрессе «Клинической иммунологии, аллергологии и иммунореабилитации» (Алмааты, 1999), на 9 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), на научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН "Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких", (Москва, 2006), на конференциях молодых ученых, посвященных Всемирному дню борьбы с туберкулезом (Москва, 2001, 2003,

2005), на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001, 2003, 2004,

2006)

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в 5 рецензионных изданиях, рекомендованных ВАК России

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 27 отечественных и 209 зарубежных источников Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 34 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 2 лабораторных и 18 клинических штаммов М tuberculosis из музея отдела микробиологии ГУ ЦНИИТ РАМН, собранных из разных регионов РФ в период 1998-2003 гг Для изучения генетического полиморфизма штаммов М tuberculosis проводили

генотипирование штаммов М tuberculosis по ПДРФ IS6110 по стандартной методике [van Embden JD, Cave MD, Crawford JT et al, 1993], включающей выделение ДНК М tuberculosis, ее рестрикцию PvuII, электрофоретическое разделение фрагментов в агарозном геле, их перенос на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизацию с зондом к правому плечу IS6770 Результаты визуализировали проявлением на рентгеновской пленке хемилюминесцентного свечения метки, прикрепленной к гибридизационному зонду В работе были использованы штаммы М tuberculosis наиболее распространенных в России кластеров W и AI, малых кластеров - HD, KQ и ^кластеризованные штаммы с уникальным генотипом (001) Чтобы исключить влияние лекарственной устойчивости на течение экспериментальной туберкулезной инфекции, в выборку вошли только чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы В качестве контроля были использованы лабораторные штаммы вирулентный М tuberculosis H37Rv и аттенуированный М tuberculosis H37Ra (табл 1)

Культуры микобактерий, хранящиеся в музее при -70°С, размораживали и пассировали на бульоне Дюбо при 37°С (2 цикла по 7 дней) Для заражения макрофагов культуры М tuberculosis были переведены в полную среду RPMI 1640 (среда RPMI 1640 с 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 2% ЭТС, Sigma), а для заражения мышей - в стерильный физиологический раствор Подготовленные для заражения культуры были профильтрованы через 5-микронный фильтр (Millipore) Для определения концентрации микобактерий в фильтрате серийные 5-кратные разведения суспензии наносили в виде капли по 20 мкл на чашки Петри с агаром Дюбо (Difco) Чашки Петри культивировали при 37°С, а исходную суспензию хранили при 4°С Через 3 суток культивирования производили подсчет микроколоний (Olympus, х200) Концентрацию жизнеспособных микобактерий в суспензии выражали числом колониеобразующих единиц микобактерий на мл (КОЕ/мл)

Макрофаги выделяли из клеток перитонеального экссудата мыши через 5-6 дней после внутрибрюшинного введения 3% пептона (2 мл на мышь) Адгезию макрофагов осуществляли на пластиковые чашки Петри, после отмывания прикрепившиеся макрофаги переводили из монослоя в суспензию раствором Версена

Таблица 1

Штаммы М. tuberculosis, использованные в работе

Кластер Обозначение штамма Штаммовый вариант по ПДРФ IS6 i 10

У/ R806 W48

R64 W148

R284 W148

R535 W148

R101 W186

R123 W200

R270 W270

R882 W336

А1 R33 AI8

R427 AI68

R429 AI 16

НО R120 HD6

КО R125 KQ4

R826 KQ13

R827 KQ19

Некластеризованые штаммы R504 001

R807 OOl

R275 001

Контрольные лабораторные штаммы H37Rv

H37Ra

Рис. 1. Профили гибридизации ПДРФ 156110 штаммов \f.tuberculosis \У кластера с обозначением трех блоков основных полос гибридизации. - стандарт молекулярных масс (размер фрагментов указан в т.п.о.)

Определение ex vivo роста проводили, заражая макрофаги штаммами М tuberculosis в плоскодонных 96-луночных планшетах (Costar) в полной среде RPMI 1640 в трипликатах в соотношении МБТМФ 2,5 1, 5 1 и 10 1, что соответствовало 12,5х104, 25х104 и 50х104 КОЕ М tuberculosis на лунку

В качестве контроля каждый штамм М tuberculosis культивировали в трипликатах in vitro в полной среде RPMI 1640 без МФ в количестве 12,5х104, 25x104 и 50x104 КОЕ М tuberculosis на лунку

Оценку жизнеспособности Мtuberculosis проводили по включению 5,6-[3Н]-урацила в микобактериальные клетки [McLeod R , Remington J S , 1979, Stach J L, Gros P , Skamene E , 1984, Majorov К В , Lyadova IV, Kondratieva T К, 2003]

Исследования in vivo выполнены на мышах инбредной линии С57В1/6 Всего в работе было использовано 270 мышей В эксперименте использовали самцов в возрасте 3-4 месяцев Для индукции туберкулезной инфекции мышам в латеральную хвостовую вену вводили 5х106 или 4х105 КОЕ Мtuberculosis в 0,5 мл физиологического раствора В группу мышей, зараженных каждым штаммом М tuberculosis в дозе 5x106 КОЕ, входило 10 животных, кроме того, еще 10 животных было оставлено интактными При заражении дозой 4x105 КОЕ М tuberculosis, в группу входило 15 животных, по 3 из которых подвергали эвтаназии через 30 и 41 день Выживаемость мышей контролировали ежедневно, начиная с 15 дня после заражения Измерение массы мышей проводили каждые 10 дней, начиная с момента заражения

Высеваемость М tuberculosis из легкого на 30 и 41 день после инфицирования М tuberculosis в дозе 4x105 КОЕ определяли взвешивая целое легкое и верхнюю часть левого легкого, которую в дальнейшем использовали для культуральных исследований Ткань легкого гомогенизировали в 6% серной кислоте для деконтаминации неспецифической флоры, после чего гомогенат отмывали стерильным физиологическим раствором до достижения pH осадка 5,5 - 7 и сеяли серию 10-кратных разведений по 100 мкл на чашку Петри с агаром Дюбо (в трипликатах) Чашки Петри культивировали при 37°С, подсчет макроколоний проводили на 18 день культивирования и пересчитывали число КОЕ на весь орган

Патоморфологические изменения легкого мышей были изучены на 30 и 41 день после заражения 5х104 КОЕ М tuberculosis Патологический материал (верхняя часть правого легкого) был фиксирован в 12% нейтральном формалине, вырезан на пластины во фронтальной плоскости органов и после стандартной проводки [Сапожников А Г, Доросевич А Е, 2000] и заключения в парафин разрезан на санном микротоме на серийные срезы толщиной 5-7 микрон, окрашен гематоксилином и эозином Гистотопография легкого исследована с использованием лупы х16 Гистопатология исследована с использованием микроскопа "Zeiss" при увеличении хЮО и х400

Для подтверждения развития туберкулезного процесса у погибших мышей проводили посев паренхиматозных органов (легкие и селезенка) с бактериоскопией полученной культуры согласно Приказа № 109 МЗ РФ от 21 03 2003 Кроме того, для идентификации штаммов проводили генотипирование по ПДРФ IS61J0

Для оценки статистической значимости различий средних величин использовали критерий Стьюдента Полученные данные обсчитывали с помощью программы БИОСТАТ 3 03 («Практика», Москва, 1998)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Генотипирование 1244 штаммов М tuberculosis из различных регионов России, проведенное по ПДРФ IS6110 в сотрудничестве с PHRI TBC в период 1998-2003 гг, выявило 413 штаммов Мtuberculosis W кластера, характеризующихся определенной картиной расположения полос гибридизации с числом копий IS6110 от 15 до 21 Анализ профилей гибридизации показал, что, несмотря на похожую картину, между ними существовали тонкие различия по числу и расположению полос На основании этого было выделено 114 штаммовых вариантов, внутри которых штаммы обладали идентичными профилями гибридизации

Профили гибридизации ПДРФ 1S61J0 штаммов М tuberculosis W кластера имели характерную картину с наличием трех блоков основных гибридизационных полос размером 1,09, 1,15, 1,175, 1,24, 1,92, 2,08, 2,18, 2,85, 3,23, 3,75, 4,32, 4,78, 5,28 т п о (рис 1)

Полиморфизм среди штаммовых вариантов достигался за счет наличия помимо основных, еще и дополнительных полос Наиболее часто (не менее,

чем у 15 % штаммовых вариантов) визуализировались фрагменты размером 1,12, 5,02, 1,38, 2,45, 7,25, 9,13, 6,01 т п о

Штаммовые варианты были обозначены согласно базы данных PHRI ТВС Из 114 штаммовых вариантов наиболее распространенным был W148 (32,93% штаммов W кластера) Также достаточно часто (от 2 до 6 %) встречались штаммовые варианты W217, W48, W186, W147, W200, W153, W187 и W263

Анализ геномного полиморфизма штаммов W кластера показал, что штаммы разделялись на 2 группы, одна с дополнительными полосами 6,01 и 5,02 тпо, другая - 9,13 и 7,21 тпо, что согласуется с данными, полученными И Ю Ивановым при генотипировании штаммов из центральной России [Иванов, 2004] Кроме того, нами был выявлен один штамм, на профиле гибридизации которого присутствовали дополнительные полосы, характерные для той и другой группы, что было показано для штаммов, выделяемых из Юго-Восточной Азии [van Soolingen D , Qian L , de Haas P E , et al, 1995]

Изучение биологических свойств штаммов М tuberculosis W кластера проводили в опытах in vitro, ex vivo при заражении перитонеальных МФ мыши, и т vivo, при заражении мышей линии С57В1/6

На основании распространенности в популяции для исследований были отобраны следующие штаммы 3 штамма из наиболее распространенного варианта W148 (штаммы R64, R284, R535), распространенные варианты W48 (штамм R806), W186 (штамм R101) и W200 (штамм R123), а также 2 штамма из редко встречающихся штаммовых вариантов - W270 (штамм R270) и W336 (штамм R882) В группу сравнения были взяты штаммы М tuberculosis AI, HD и KQ кластеров, а также 3 некластеризованных штамма, которые не встречали в известных базах данных и обозначенных 001 В качестве контроля были использованы лабораторные штаммы H37Rv (вирулентный) и H37Ra (атенуированный) (рис 2)

На первом этапе был изучен рост 8 штаммов W кластера и 10 клинических штаммов других генотипических вариантов, а также двух лабораторных штаммов H37Rv и H37Ra на полной среде RPMI 1640, который тестировали по включению 5,6-[3Н]-урацила Штаммы при равном исходном числе КОЕ через 90 часов культивирования in vitro показали разнообразие по включению 5,6-[3Н]-урадила, отражающему уровень

Кластеры штаммов M.tuberculosis

Рис. 2. Профили гибридизации ПДРФ IS6110 штаммов M.tuberculosis, взятых в исследование

синтеза РНК и репликацию М tuberculosis Штаммы W кластера не отличались по этому показателю от ряда других штаммов, в том числе контрольных лабораторных H37Rv и H37Rv, в то время как были выявлены штаммы с более высоким уровнем репликации in vitro (рис 3)

Наиболее приближенной к условиям т vivo является модель культивирования микобактерий в МФ (ex vivo) Заражение МФ проводили в соотношении МБТ МФ 2,5 1, 5 1 и 10 1, что соответствовало 12,5x104 КОЕ, 25x104 КОЕ и 50x104 КОЕ М tuberculosis Рост М tuberculosis в МФ также тестировали по включению 5,6-[3Н]-урацила Измерение включения 5,6-[3Н]-урацила через 90 часов инкубации показало снижение уровня синтеза РНК для всех штаммов, по сравнению с инкубированными тот же период времени без МФ {in vitro) При этом штаммы М tuberculosis W и AI кластеров, некластеризованные штаммы и М tuberculosis H37Rv имели более высокий уровень включения 5,6-[3Н]-урацила, а штаммы KQ и HD кластеров и М tuberculosis H37Ra - достоверно более низкий уровень включения 5,6-[3Н]-урацила При этом штаммы W кластера при всех соотношениях МБТ МФ входили в группу с высоким и очень высоким уровнем репликации (рис 4)

По нашему мнению, изучение роста в МФ без сравнения с ростовыми характеристиками штамма на средах не полностью характеризует особенности выживания М tuberculosis внутри фагоцитирующей клетки Принимая во внимание, что репликация in vitro исследованных штаммов различалась, при оценке способности штаммов М tuberculosis выживать в МФ нами был введен коэффициент, учитывающий исходную способность штаммов к репликации и репликацию в МФ

Для этого нами был введен коэффициент, отражающий процент выживших М tuberculosis после фагоцитоза

Уровень включения МБТ 5,6 - [ЗН] - урацила ex vivo xjqqo/ Уровень включения МБТ5,6-[ЗН]-урацила ш vitro

Сравнение жизнеспособности популяции М tuberculosis, фагоцитированной макрофагами, с М tuberculosis, инкубировавшимися такой же срок in vitro, показало, что штаммы W кластера имели наибольшую приспособляемость к выживанию в МФ (рис 5) Вирулентный штамм Мtuberculosis H37Rv и авирулентный штамм М tuberculosis H37Ra почти в

в

но | ко

II

Рис. 3. Уровень включения 5,6-["Н]-урацила в М./ибегси/озм через 90 часов культивирования в полной среде ЯРМ] 1640 при исходном числе А) 12,5-104 КОЕ МЛиЪегсиШь, Б) 25-Ю4 КОЕ М.1иЬегсиШ$, В) 50-Ю4 КОЕ МЛиЬггсиШъ.

ДЙ.

i А

i I S £ . § 0 £

001 j НО W Al | OOI jK вир. |

группа III фуппа

ñü

ко к

ÉTTÍ

*i А

lis

Al 001 W OOI Kbi

IV группа

Рис. 4. Уровень включения 5,6-[3Н]-урацила в М.tuberculosis через 90 часов культивирования в МФ при соотношении МБТ:МФ А) 2,5:1, Б) 5:1, В) 10:1

Рис. 5. Относительная жизнеспособность М. tuberculosis фагоцитирования МФ по сравнению с культивированием в среде 1640 при соотношении МБТ:МФ А) 2,5:1, Б) 5:1, В) 10:1.

после RPMI

5 раз отличались по способности выживать в МФ (46,51 и 8,76%, соответственно)

Известно, что для возникновения заболевания немаловажную роль играет инфицирующая доза возбудителя [Воробьев А А, Быков А С, Пашков Е П, 1994] Нами в эксперименте ex vivo были использованы 3 разные соотношения МБТ МФ, и было показано, что для М tuberculosis W кластера способность выживать внутри МФ практически не зависела от величины бактериальной нагрузки на МФ В то время как для других штаммов с увеличением бактериальной нагрузки на МФ увеличивалась способность выживать в МФ, штаммы W кластера начинали максимально проявлять свою способность уже при низкой бактериальной нагрузке (рис 5А) Можно предположить, что в этом свойстве заключается одна из причин успеха штаммов W кластера, так как, возможно, при заражении штаммами М tuberculosis W кластера достаточно минимальной дозы возбудителя, которая позволяет выжить в МФ и запустить инфекционный процесс, в то время как такая же инфицирующая доза М tuberculosis других кластеров может оказаться недостаточной

Таким образом, было показано, что штаммы М tuberculosis W кластера имели общие свойства, способствующие выживать в клетках хозяина, то есть высокий уровень репликации в МФ и приспособляемость по сравнению с исследованными штаммами других генотипов И хотя был выявлен штамм (R807) с подобными свойствами, для него, в отличие от штаммов W кластера, прослеживалась зависимость выживаемости в МФ от бактериальной нагрузки, то есть его приспособляемость при низкой бактериальной нагрузке на МФ была невысокой

Поскольку исследования ex vivo на МФ служат моделью только ранней стадии инфекции, которая начинается с фагоцитоза микобактерий, для изучения особенностей туберкулезного процесса, вызываемого штаммами W кластера, и заключения об их вирулентности необходимо проведение экспериментов in vivo, когда в процессе развития заболевания включается иммунная система хозяина

Были использованы 2 модели острого туберкулезного процесса - при заражении высокой дозой 5x106 КОЕ М tuberculosis и хронического - при заражении более низкой дозой 4x105 КОЕ М tuberculosis

Таблица 2

Срок жизни мышей после заражения 5х106 КОЕ М tuberculosis

Кластер Штамм Время жизни (дни)

М СО

R806 55 2

R64 58 4

W R535 48 3

R101 39 2

R270 39 2

R882 46 2

AI R33 40 1

R427 40 2

HD R120 28 1

ко R125 76 6

некластеризованные R807 28 1

штаммы R504 37 1

лабораторные штаммы H37Rv 46 1

H37Ra не погибли

Интактные мыши не погибли

Таблица 3

Динамика изменения массы мышей, зараженных 5х10б КОЕ Мtuberculosis*

Тип изменения массы животного Кластер Штамм М tuberculosis Скорость подъема массы (% за 10 дней) Скорость снижения массы (% за 10 дней) Изменение массы на момент гибели (%)

I W R806 - 4,3 -24,6

R64 - 4,7 -29,1

R535 - 5,4 -27,1

R270 - 7,1 -30,7

R882 - 6,6 -31,6

R101 - 6,9 -28,8

AI R33 - 7,1 -28,5

R427 - 6,8 -28,4

HD R120 - 9,7 -27,1

некластеризованные штаммы R807 - 10,1 -29,3

R504 - 8,3 -31,7

лаб штамм H37Rv - 5,0 -23,7

II ко R125 5,0 8,3 -33,4

III лаб штамм H37Ra 5,6 - 16,8**

интактные мыши 4,7 - 19 4**

* - Степень изменения массы приводится в процентах по отношению к массе мыши

в день заражения (день 0) Масса в день 0 принята за 100%

I тип - снижение массы, начиная с первого дня наблюдения

II тип - первоначальное увеличение массы с выходом на плато, затем резкое снижение массы в терминальной стадии

III тип - увеличение массы с выходом на плато

** - в день гибели последней мыши, зараженной вирулентным штаммом

Заражение высокой дозой было проведено 12 клиническими штаммами М tuberculosis (6 штаммов W кластера, 2 - AI, 1 - HD, 1 KQ, 2 некластеризованных штамма) и 2 контрольными лабораторными штаммами H37Rv и H37Ra с оценкой срока жизни мышей и динамики изменения массы Результаты представлены в таблицах 2 и 3 Сравнение данных по срокам жизни мышей и динамики изменения массы при заражении 5x106 КОЕ М tuberculosis разными штаммами М tuberculosis позволило заключить, что штаммы R120, R807 вызывали быстрое снижение массы животных, начиная с первого дня наблюдения, а срок жизни мышей, зараженных ими был 27-29 дней, штаммы R101, R270, R33, R427, R504 вызывали более медленное снижение массы, а срок жизни мышей составил 35-43 дня Еще более медленное снижение массы мышей вызывали штаммы R535, R882, H37Rv, а срок жизни составил 45-50 дней С наименьшей скоростью снижалась масса у мышей, зараженных штаммами R64, R806, а время их жизни составило 5363 дня Мыши, зараженные штаммом R125 KQ кластера первоначально набирали вес, затем масса выходила на плато и в терминальной фазе процесса наблюдалось резкое снижение массы Аттенуированный штамм H37Ra не вызывал гибели животных, причем масса животных сначала увеличивалась, а потом держалась приблизительно на одном уровне до конца эксперимента Таким образом, проведенные исследования показали, что вирулентность штаммов была различной и наиболее вирулентными были М tuberculosis кластеров HD и некластеризованный штамм R807, далее следовали штаммы AI кластера, штаммы W кластера обладали различной вирулентностью, как большей, так меньшей, так и сравнимой с H37Rv Наименьшей вирулентностью из клинических штаммов обладали штаммы KQ кластера

По результатам заражения мышей 5x106 КОЕ М tuberculosis была отобрана группа штаммов разных кластеров с разной степенью вирулентности W (R101, R64), AI (R33, R427), HD (R120), а также H37Rv и H37Ra Особенности туберкулезного процесса при заражении 5x104 КОЕ М tuberculosis были изучены по времени жизни мышей, динамике снижения массы, высеваемости М tuberculosis из легких мышей и патоморфологической картине легкого на 30 и 41 день после заражения

Анализ срока жизни животных, зараженных вирулентными штаммами М tuberculosis, позволил выделить 2 группы штаммов Штаммы первой

R64 R101 R33 R427 R120 H37Rv

Рис. 6. Срок жизни мышей после внутривенного заражения 4x105 КОЕ М.шЬегси1о$1$.

Таблица 4

Динамика изменения массы мышей, зараженных 4x1 CP КОЕ М.tuberculosis*

Тип изменения массы животного Кластер Штамм М.tuberculosis Скорость подъема массы (% за 10 дней) Скорость снижения массы (% за 10 дней) Изменение массы на момент гибели (%)

I AI R33 - -4,4 -25,0

R427 - -4,7 -28,4

HD R120 - -6,0 -25,9

II W R64 6,1 -9,8 -31,0

R10I 4,8 -12,2 -33,1

лаб. штамм H37Rv 5,2 -10,8 -28,6

III лаб. штамм H37Ra 6,2 - 32,4**

интактные мыши 6,8 - 29,8*

* - Степень изменения массы приводится в процентах по отношению к массе мыши в день заражения (день 0). Масса в день 0 принята за 100%.

I тип - снижение массы, начиная с первого дня наблюдения

II тип - первоначальное увеличение массы с выходом на плато, затем резкое снижение массы в терминальной стадии

III тип - увеличение массы с выходом на плато

** - в день гибели последней мыши, зараженной вирулентным штаммом

группы (R33, R427, R120) вызывали гибель мышей в срок до 60 дней, т е были более вирулентными, при этом снижение массы у животных этой группы происходило с начала наблюдения Штаммы второй группы - R64, R101, H37Rv вызывали гибель животных в срок более 90 дней, те были менее вирулентными, а масса животных, зараженных этими штаммами, первоначально увеличивалась, затем выходила на плато и резко падала в терминальной фазе процесса Штамм H37Ra не вызывал гибели лабораторных животных, а динамика изменения массы была такой же, у интактных животных (рис 6, табл 4)

Высеваемость Мtuberculosis из легких зараженных мышей на 30 день достоверно отличалась для всех штаммов По высеваемости из легких на 30 день заражения штаммы распределились следующим образом (от наибольшей к меньшей) R120, принадлежащий к HD кластеру, R33, R427 принадлежащие к AI кластеру, R101, принадлежащий к W кластеру, H37Rv, R64, принадлежащий к W кластеру, H37Ra Такое же распределение штаммов М tuberculosis из легких сохранилось и на 41 день после заражения Достоверные различия в высеваемости М tuberculosis из легкого на 30 и 41 день были показаны только для штамма R120 (увеличение с108 до 109 КОЕ) и для H37Ra (снижение с 102 до единичных КОЕ на орган) Разница высеваемости Мtuberculosis из легких на 30 и 41 день после заражения для остальных штаммов не была достоверной и наблюдалась стабилизация процесса, причем обсемененность легкого при заражении штаммом R64 составила порядка 105, R101 и H37Rv - 106, R33 и R427 - 107 КОЕ М tuberculosis (табл 5)

Таблица 5

Высеваемость М tuberculosis из легкого мышей, зараженных М tuberculosis

(КОЕ/орган)

Кластер Штамм 30 день 41 день

М СО М СО

W R64 5,00х105 9,64x10" 4,80x105 6,56х104

R101 5,70х106 7,55х105 9,80x106 2,69х106

А R33 7,30x10' 1,01x10' 7,80x10' 1,25x10'

R427 4,60x107 1,05x107 6,40x10'' 7,94x106

HD R120 3,80x10" 5,20x10' 5,10x10' 6,24x108

лабораторные штаммы H37RV 3,80х106 5,29x105 5,30x10'' 8,54х103

H37Ra 3,20x102 6,24x10' 2,33x10" 2,52x10°

интактные мыши нет нет

Анализ патоморфологической картины экспериментального туберкулеза при заражении мышей штаммами М tuberculosis, принадлежащими к 3 генотипическим кластерам (W, AI, HD), и лабораторными контрольными штаммами М tuberculosis H37Rv и H37Ra, показал, что все штаммы, в том числе и аттенуированный штамм H37Ra, имели патогенные свойства, характерные для М tuberculosis, т е были способны вызывать специфический туберкулезный процесс Однако динамика патоморфологических изменений в легких, оцененная на 30 и 41 день после заражения, различалась и характеризовалась четырьмя типами течения туберкулезного процесса 1) острым развитием, 2) прогрессированием, 3) стабилизацией, 4) регрессированием

Острое развитие туберкулезного процесса в легких наблюдалось при заражении штаммом HD кластера Через 30 дней после заражения в легких мышей наблюдались крупные фокусы пневмонии с обширными зонами некробиоза и творожистого некроза, который заполнял просветы альвеол В некоторых участках пневмонии обнаруживались единичные раздутые полости, в стенке которых имел место некробиоз На 41 день крупные фокусы казеозной пневмонии, сливаясь, занимали целые доли. Формировались множественные пневмониогенные полости, в стенках и просвете некоторых полостей сохранялись массы некробиоза и творожистого некроза Были выражены плазматизация и отек

Прогрессирование процесса в легких было характерно при заражении штаммом R101 W кластера, обоими штаммами AI кластера и H37Rv Так, при заражении штаммом W кластера в легких через 30 дней формировались достаточно крупные фокусы пневмонии с некробиозом в глубине очагов Наблюдалась лимфоидно-плазмоцитарная реакция, микроциркуляторные нарушения, стаз К 41 дню крупные экссудативные очаги в легких сливались и образовывали более крупные фокусы туберкулезной пневмонии В глубине очагов имел место некробиоз, усиливались лимфоидно-гистиоцитарная реакция, васкулит и микроциркуляторные нарушения Этот штамм W кластера близок по своей характеристике к H37Rv, который также обладал выраженной вирулентностью, и в легких мышей наблюдался прогрессирующий туберкулез с формированием к 41 дню крупных экссудативных и экссудативно-альтеративных очагов

У мышей, зараженных обоими штаммами AI кластера, наблюдались сходные изменения в легких, выявлялись очаги пневмонии, состоящих из экссудативных и экссудативно-альтеративных бугорков, имеющих эпителиоидно-клеточную и макрофагальную структуру, с единичными гигантскими клетками Пирогова-Лангханса Характерно появление инфильтрации полинуклеарными лейкоцитами с их распадом и некробиозом

Стабилизация процесса была характерна для второго штамма W кластера - R64, при заражении которым через 30 дней в легких формировались множественные сливные экссудативные бугорки, которые, сливаясь, формировали очаги туберкулезной пневмонии Вокруг очагов выявлялся отек и микроциркуляторные нарушения К 41 дню крупные очаги пневмонии не выявлялись Бугорки были более изолированными, в перифокальной зоне преобладали лимфоидно-гистиоцитарная реакция, стаз Такая картина говорит о стабилизации туберкулезного воспаления в легких с наличием параспецифической лимфоидно-плазмоцитарной и лимфоидно-гистиоцитарной реакции

Для штамма H37Ra было характерно регрессирование процесса, что выражалось в наличии единичных продуктивных бугорков через 30 дней после заражения, которые к следующему сроку наблюдения рассасывались с формированием лимфоидно-гистиоцитарных узелков, т е наблюдалась картина регрессии с сохранением параспецифической реакции

По степени патологических изменений в легких штаммы распределились следующим образом (от наибольшей к меньшей) R120, принадлежащий к HD кластеру, R427 и R33, принадлежащие к AI кластеру, R101, принадлежащий к W кластеру, H37Rv, R64, принадлежащий к W кластеру, H37Ra

Таким образом, развитие туберкулезного процесса, вызванного штаммами различных генотипических кластеров, различалось и характеризовалось (табл 6)

1) острым туберкулезным процессом в легких с формированием казеозной пневмонии с некробиозом и пневмониогенными полостями с достоверным увеличением обсемененности легкого с 108 до 109 КОЕ с 30 по 41 день после заражения (штамм М tuberculosis R120 HD кластера),

2) прогрессированием процесса с увеличением признаков специфического воспаления ткани легкого и обсемененностью легкого до 106

- 107 КОЕ (штаммы М tuberculosis R101 W кластера, R427 и R33 AI кластера, H37Rv),

3) стабилизацией процесса с сохранением продуктивного туберкулезного воспаления и обсемененностью легкого до 105 КОЕ (штамм М tuberculosis R64 W кластера),

4) регрессированием процесса с заживлением туберкулезных изменений в легком и снижением обсемененности легкого с 102 до единичных колоний на орган (штамм М tuberculosis H37Ra)

Таблица 6

Вирулентность штаммов М tuberculosis разных генотипических кластеров

в эксперименте in vivo при заражении 4x105 КОЕ М tuberculosis

Кластер Штамм Время жизни Тип изменений массы Динамика с 30 по 41 день

высеваемости из легкого патоморфологических изменений

М СО степень изменений к 41 дню* характеристика процесса

W R64 157 5 II стабилизация 2 стабилизация

R101 104 7 II стабилизация 4 прогрессирование

AI R33 55 1 I стабилизация 5 прогрессирование

R427 56 3 I стабилизация 5 прогрессирование

HD R120 37 7 I увеличение 6 острое развитие

лаб штаммы H37Rv 138 5 II стабилизация 3 прогрессирование

H37Ra не погибли III снижение 1 регрессирование

интактные мыши не погибли III - - -

*6 баллов - наибольшие изменения, 1 - наименьшие изменения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для характеристики биологических свойств М tuberculosis W кластера нами были проведены эксперименты in vitro, ex vivo и in vivo Было показано, что in vitro штаммы W кластера имели среднюю скоростью размножения, при этом обладали высокой жизнеспособностью в МФ Результаты экспериментов in vivo показали, что штаммы W кластера различались по вирулентности и были как более вирулентными, так и менее вирулентными, чем лабораторный штамм H37Rv При этом были выявлены 2 штамма (HD кластера и один некластеризованный штамм) более вирулентные, чем представители W кластера, что опровергло точку зрения, что штаммы W кластера являются самыми вирулентными Однако, нами было описано свойство, отличающее штаммы М tuberculosis W кластера от других исследованных штаммов - повышенная способность выживать в МФ вне

зависимости от инфицирующей дозы Возможно, эта способность является причиной широкого распространения штаммов W кластера и может быть объяснена особенностями экспрессии ряда генов, ответственных за взаимодействие патогена и хозяина

ВЫВОДЫ

1 Генотипирование по ПДРФ IS6110 413 штаммов М tuberculosis W кластера выявило 114 штаммовых вариантов, из которых преобладал W148 (32,9%)

2 Штаммы М tuberculosis W кластера при культивировании in vitro не отличались по скорости роста от клинических штаммов М tuberculosis HD и KQ кластеров и лабораторных штаммов М tuberculosis H37Rv и М tuberculosis H37Ra, но имели более низкую скорость по сравнению с некластеризованными и штаммами М tuberculosis AI кластера

3 Жизнеспособность фагоцитированных макрофагами штаммов М tuberculosis всех генотипических кластеров снижалась по сравнению с культивированием штаммов in vitro Штаммы М tuberculosis W кластера имели сравнимый уровень репликации ex vivo со штаммами М tuberculosis AI кластера, некластеризованными штаммами и М tuberculosis H37Rv и более высокий, чем у штаммов М tuberculosis KQ и HD кластеров и М tuberculosis H37Ra

4 Сравнение жизнеспособности М tuberculosis, растущих в макрофагах и на среде (in vitro), показало, что штаммы М tuberculosis W кластера обладали наибольшей приспособляемостью к переживанию в клетках хозяина вне зависимости от бактериальной нагрузки на макрофаг

5 Изучение срока жизни и динамики потери массы мышей, зараженных 5x106 КОЕ, показало, что штаммы М tuberculosis W кластера обладали большей, меньшей и сравнимой с М tuberculosis H37Rv вирулентностью, но были менее вирулентными, чем штамм М tuberculosis кластера HD и некластеризованный штамм

6 Анализ особенностей туберкулезного процесса при заражении мышей 4x105 КОЕ, показал, что штаммы Мtuberculosis W кластера вызывали как прогрессирование процесса с увеличением бактериальной нагрузки в легких до 10б-107 КОЕ и усилением патоморфологических изменений в легком, так и стабилизацию процесса с сохранением продуктивного туберкулезного воспаления и обсемеиенности легкого 105 КОЕ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИИССЕРТАЦИИ

1 Савинкова (Андреевская) С Н , Смирнова Т Г , Мартынова Л П, Николаева Г М , Ларионова Е Е , Никоненко Б В , Черноусова Л Н Биологические свойства генотипических вариантов микобактерий туберкулеза // I национальный конгресс «Клиническая иммунология, аллергология и иммунореабилитация» Казахстан, Алматы - 1999 -стр 42

2 Савинкова (Андреевская) С Н , Смирнова Т Г , Николаева Г М , Масленикова Ю В , Голышевская В И, Черноусова Л Н Изучение вирулентности штаммов М tuberculosis наиболее распространенных в России // 9 национальный конгресс по болезням органов дыхания, Москва -1999 - стр 166

3 Черноусова Л Н , Андреевская С Н, Смирнова Т Г, Катулина Н И , Шудрова М А Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулезом из пенитенциарного учреждения // Пробл Туб -2001 - № 7 - стр 60-62

4 Черноусова Л Н , Кривонос П С , Андреевская С Н , Смирнова Т Г, Кузьмин А В, Кривонос А П Молекулярное типирование микобактерий туберкулеза в пенитенциарных учреждениях России и Беларуси П Вестник пенитенциарной медицины - Минск - 2001 - №2 -стр 29-33

5 Васильева И А , Андреевская С Н , Смирнова Т Г , Черноусова Л Н, Чуканов В И Эффективность химиотерапии туберкулеза у больных выделяющих лекарственно устойчивые штаммы М tuberculosis с различными генотипами // Пробл туб и болезн легк - 2004 - №8 -стр 25-28

6 Андреевская С Н , Черноусова Л Н , Смирнова Т Г , Ларионова Е Е , Кузьмин А В Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) // Пробл туб и болезн легк - 2006 - №1 - стр 29-35

7 Андреевская С Н , Черноусова Л Н , Смирнова Т Г , Ларионова Е Е Влияние генетического полиморфизма штаммов Mycobacterium tuberculosis на взаимодействие с перитонеальными макрофагами мыши

// Мат-лы научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН «Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких» - 2006 -стр 43-44

8 Андреевская С Н , Черноусова ЛН , Смирнова Т Г , Ларионова Е Е , Кузьмин А В Изучение ex vivo роста в макрофагах штаммов Mycobacterium tuberculosis разных генотипических кластеров // Пробл тубиболезн легк -2006 -№ 12 - стр 43-48

9 Андреевская С Н , Черноусова Л Н , Смирнова Т Г , Ларионова Е Е , Кузьмин А В Влияние генотипа М tuberculosis на выживаемость мышей при экспериментальном туберкулезе // Пробл туб и болезн легк - 2007 - № 7 - стр 45-50

10 Андреевская С Н Изучение биологических свойств штаммов Mycobacterium tuberculosis W кластера // Новейшие технологии в эпидемиологии, диагностике, профилактике и лечении больных туберкулезом и других заболеваний легких Сборник материалов научно-практической конференции молодых ученых, посвященных Всемирному дню борьбы с туберкулезом - Москва - 2007 - стр 47-50

Список использованных сокращений

имп/мин - импульсов в минуту

КОЕ - колониеобразующая единица

М - среднее значение МБТ - микобактерии туберкулеза МФ - макрофаг

ПДРФ IS6110 полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, - содержащих вставочную последовательность 6110 СО - стандартное отклонение т п о - тысяча пар оснований PHRI ТВС - (Tuberculosis Center of the Public Health Research Institute) -Центр исследования туберкулеза при Научно-исследовательском институте здравоохранения, г Ньюарк, шт Нью-Джерси, США ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

Заказ № 157/03/08 Подписано в печать 18 03 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,75

\V -'J

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Андреевская, Софья Николаевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Природа и значение фенотипической и генотипической вариабельности штаммов М. tuberculosis.

1.1.1.Фенотипическое разнообразие штаммов М. tuberculosis и модели для его изучения.

1.1.2.Генотипическая вариабельность штаммов M.tuberculosis и методы ее выявления.

1.2. Филогения M.tuberculosis и наиболее распространенные штаммовые кластеры M.tuberculosis.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis W кластера"

Актуальность проблемы

Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн. случаев. Россия входит в число стран с высоким уровнем заболеваемости (85,4 на 100 тысяч населения - 2004 г.) и смертности (21,4 на 100 тысяч населения — 2004 г.) по туберкулезу. Сложные социально-экономические условия жизни населения, миграция, увеличение числа штаммов, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, являются одними из основных причин напряженной эпидемической ситуации в России [16, 26]. Следует отметить, что после 1999 года темпы роста основных эпидемиологических показателей снизились, по сравнению с 1991-1995 гг. Однако тенденция к продолжению накопления резервуара инфекции остается и по настоящее время [27]. Особо настораживает увеличение распространенности случаев заболевания с первичной лекарственной устойчивостью [3, 7, 22].

Для улучшения мероприятий по контролю и предотвращению туберкулеза необходимо идентифицировать клинически важные штаммы, характеризующиеся повышенной трансмиссивностью или вызывающие тяжелое течение болезни.

Благодаря внедрению в область эпидемиологии туберкулеза молекулярных подходов и разнообразию применяемых методов типирования, стало возможным проследить пути распространения определенных штаммов, оценить недавнюю передачу возбудителя, определить факторы риска для заболеваемости, отличить эндогенную реактивацию от экзогенной реинфекции, а также кластеризовать циркулирующие в популяции штаммы [43, 59, 66, 197, 198, 207, 223, 226].

Было показано, что штаммовые полиморфизмы, полученные с разными маркерами, тесно связаны между собой, что свидетельствует о том, что вид M.tuberculosis имеет строго клональную популяционную структуру и, с учетом того, что геном M.tuberculosis крайне консервативен, считается, что свойства штамма передаются без значительных изменений [200]. Поэтому представляется важной характеристика фенотипических свойств штаммов, составляющих генотипический кластер, которые, возможно, влияют на особенности распространения данной группы штаммов.

Известно, что при контакте человека с возбудителем исходы туберкулеза существенно варьируют: из 95% инфицированных только у 10% развивается болезнь; среди заболевших существуют различия- по длительности болезни, тяжести течения и по локализации поражения. На данный момент больше изучено влияние факторов окружающей среды и факторов организма хозяина, которые вносят несомненный вклад в клиническое и эпидемиологическое поведение штаммов> M.tuberculosis. Это было показано иммунологическими исследованиями человеческой популяции и убедительно доказано экспериментальными работами на инбредных мышах чувствительных (I/St) и резистентных (A/Sn) к туберкулезу линий [41, 80, 121, 132, 163, 166, 179]. В экспериментах при заражении МФ было подтверждено влияние генотипа хозяина на рост M.tuberculosis в МФ. При этом было показано, что микобактерии, в свою очередь, оказывают цитопатогенное действие на МФ. Однако в этих работах были использованы микобактерии только вирулентного лабораторного штамма M.tuberculosis H37Rv [143].

В настоящее время существуют лишь единичные работы, описывающие влияние возбудителя на особенности течения туберкулезного процесса, и в основном эти работы касаются штаммов1 с лекарственной устойчивостью без связи с определенным генотипическим кластером. Этими исследованиями было показано, что штаммы M.tuberculosis обладают разной способностью вызывать заболевание и влиять на тяжесть его течения. Накопление данных об особенностях генотипов и фенотипическом; разнообразии штаммов М. tuberculosis сделало актуальной проблему определения биологических свойств возбудителя в связи с его принадлежностью к генотипическому кластеру. Доказательства этого могут быть получены в экспериментах in vivo при заражении лабораторных животных и в наиболее приближенной к in vivo модели с заражением МФ микобактериями туберкулеза.

Наибольший интерес в последнее время вызывают штаммы М. tuberculosis W кластера, которые широко распространены во всем мире и, попадая в человеческую популяцию, способны.быстро распространяться^ [34,47,51, 177].

Генотипирование более 10005 штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных из России, проведенное ЦНИИТ РАМН совместно t с PHRI ТВС в 1998-2003 г.г., показало широкое разнообразие генотипических вариантов Ml tuberculosis. Типированием по ПДРФ IS6110 было выявлено 42 штаммовых группы. Были определены преобладающие кластеры М.tuberculosis, в том числе и W (до 40-50%) и описана группа М. tuberculosis, названная AI, штаммы которой до 2000 г. циркулировали только на территории России (название кластеров приведены, по номенклатуре PHRI ТВС). Кроме того, было выявлено 20% штаммов, с уникальным, ранее не встречавшимся, генотипом [130]. Изучение лекарственной чувствительности М. tuberculosis различных генотипических кластеров показало, что устойчивость штаммов к основным противотуберкулезным препаратам не зависит от генотипа по IS6110. Однако почти 70% штаммов W кластера были устойчивы одновременно к рифампицину и изониазиду (МЛУ) [94].

Нашими работами; было также продемонстрировано широкое распространение (до 70%) микобактерий этого кластера в тюрьмах [245, 25]. Факторы, способствующие успешному распространению? штаммов; W кластера, все еще не известны.

Целью исследования являлось изучение генетического полиморфизма и биологических свойств штаммов M.tuberculosis W кластера в условиях in vitro, ex vivo и in vivo.

Задачи исследования

1. Исследование генетического полиморфизма штаммов M.tuberculosis W кластера по маркеру IS6110.

2. Изучение репликации in vitro штаммов M.tuberculosis W кластера по сравнению с клиническими штаммами M.tuberculosis, относящимися к другим генотипическим кластерам по ПДРФ IS6110.

3. Определение роста ex vivo в перитонеальных макрофагах (МФ) мыши клинических штаммов M.tuberculosis разных генотипических кластеров.

4. Изучение влияния генотипа штаммов M.tuberculosis на время жизни и динамику потери массы при заражении мышей 5x106 КОЕ.

5. Характеристика экспериментального туберкулеза при заражении 4х105 КОЕ M.tuberculosis кластеров W, AI, HD.

Научная новизна

Впервые на ex vivo модели было проведено сравнительное изучение роста в МФ клинических штаммов M.tuberculosis, генотипированных и кластеризованных по специфическому маркеру IS6110. Использование о метода включения 5,6-[ Н]-урацила в жизнеспособные M.tuberculosis позволило количественно оценить, статистически обработать полученные данные и определить достоверность отличий разных кластеров M.tuberculosis по исследованным показателям.

Сопоставление роста in vitro и ex vivo каждого штамма M.tuberculosis способствовало оценке выживаемости популяции M.tuberculosis разных кластеров в клетках хозяина (МФ). С помощью впервые изученной зависимости роста в МФ от величины бактериальной нагрузки на МФ ij было выделено две группы штаммов, взаимодействие с МФ которых зависело и не зависело от величины бактериальной нагрузки.

Сравнительная характеристика туберкулезного процесса, вызванного несколькими штаммами М. tuberculosis W кластера и группой штаммов других генотипических кластеров, позволила выявить разнообразие штаммов W кластера по биологическим свойствам и впервые опровергнуть мнение о гипервирулентности W штаммов М. tuberculosis.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлен генетический полиморфизм внутри W кластера M.tuberculosis с преобладанием в России штаммового варианта W148.

2. При культивировании на питательной среде штаммы M.tuberculosis W кластера имели скорость репликации, сравнимую с рядом штаммов, принадлежащих к другим генотипическим кластерам.

3. Фагоцитированные макрофагами штаммы M.tuberculosis W кластера обладали большей жизнеспособностью по сравнению с M.tuberculosis других генотипических кластеров.

4. В модели экспериментального туберкулеза у мышей штаммы M.tuberculosis W кластера обладали разной вирулентностью, но не являлись высоко вирулентными по сравнению с другими штаммами M.tuberculosis.

Научно-практическая значимость

1. Охарактеризованы модели для оценки вирулентности и приспособляемости штаммов M.tuberculosis для выживания в клетках хозяина.

2. Повышенная способность штаммов W кластера приспосабливаться к внутриклеточному росту в МФ позволит использовать штаммы этого кластера в модели изучения взаимодействия патоген — хозяин.

3. Штамм M.tuberculosis, вызывающий казеозную пневмонию при заражении мышей, может быть использован в модельных исследованиях остро прогрессирующего туберкулеза.

Апробация диссертационной работы.

Работа апробирована на совместном заседании отделов микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (06.03.2007 г.). Материалы диссертации доложены на I Национальном конгрессе «Клинической иммунологии, аллергологии и иммунореабилитации» (Алмааты, 1999), на 9 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), на научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН "Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких", (Москва, 2006), на конференциях молодых ученых, посвященных Всемирному дню борьбы с туберкулезом (Москва, 2001, 2003, 2005), на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001, 2003, 2004, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 5 в рецензионных изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 27 отечественных и 209 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 34 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Андреевская, Софья Николаевна

выводы

1. Генотипирование по ПДРФ IS6110 413 штаммов M.tuberculosis W кластера выявило 114 штаммовых вариантов, из которых преобладал W148 (32,9%).

2. Штаммы M.tuberculosis W кластера при культивировании in vitro не отличались по скорости роста от клинических штаммов M.tuberculosis HD и KQ кластеров и лабораторных штаммов M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis H37Ra, но имели более низкую скорость по сравнению с некластеризованными и штаммами M.tuberculosis AI кластера.

3. Жизнеспособность фагоцитированных макрофагами штаммов M.tuberculosis всех генотипических кластеров снижалась по сравнению с культивированием штаммов in vitro. Штаммы M.tuberculosis W кластера имели сравнимый уровень репликации ex vivo со штаммами M.tuberculosis AI кластера, некластеризованными штаммами и M.tuberculosis H37Rv и более высокий, чем у штаммов M.tuberculosis KQ и HD кластеров и M.tuberculosis H37Ra.

4. Сравнение жизнеспособности M.tuberculosis, растущих в макрофагах и на среде (in vitro), показало, что штаммы M.tuberculosis W- кластера обладали наибольшей приспособляемостью к переживанию в клетках хозяина вне зависимости от бактериальной нагрузки на макрофаг.

5. Изучение срока жизни и динамики потери массы мышей, зараженных 5x106 КОЕ, показало, что штаммы M.tuberculosis W кластера обладали большей, меньшей и сравнимой с M.tuberculosis H37Rv вирулентностью, но были менее вирулентными, чем штамм M.tuberculosis кластера HD и некластеризованный штамм.

6. Анализ особенностей туберкулезного процесса при заражении мышеи 4x105 КОЕ, показал, что штаммы M.tuberculosis W кластера вызывали как прогрессирование процесса с увеличением бактериальной нагрузки в

А 7 легких до ЮЧО' КОЕ и усилением патоморфологических изменений в легком, так и стабилизацию процесса с сохранением продуктивного туберкулезного воспаления и обсемененности легкого 105 КОЕ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В комплекс методов для изучения биологических свойств штаммов M.tuberculosis необходимо включить проведение опытов по оценке роста штаммов ex vivo в макрофагах.

2. При оценке роста штаммов M.tuberculosis в макрофагах должна учитываться способность к репликации в условиях in vitro.

3. Вирулентность штаммов M.tuberculosis в скрининговых исследованиях может быть оценена в опытах in vivo по динамике изменения массы животного.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Андреевская, Софья Николаевна, Москва

1. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г. Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Изучение ex vivo роста в макофагах штаммов разных генотипических кластеров // Пробл. туб. 2006. - №12. - С. 43-48.

2. Бландова З.К., Малашенко A.M., Крышкина В.П., Семенов Х.Х., Шмидт Е.Ф. Правила разведения инбредных лабораторных животных (методическое указание). Москва. - 1979. - 17 с.

3. Васильева И.А., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Черноусова Л.Н., Чуканов В.И. Эффективность химиотерапии туберкулеза у больных выделяющих лекарственно устойчивые штаммы M.tuberculosis с различными генотипами // Пробл. туб. 2004. - №8. - С. 25-28.

4. Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. Микробиология. М: "Медицина". - 1994. - 288 с.

5. Голышевская В.И., Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Домотенко Л. В. Сравнение нитратредуктазного и автоматизированного ВАСТЕС MGIT 960 AST методов определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулёза // Пробл. туб. 2003. - №8. - С.34—37.

6. Зильбер А.А. Основы иммунологии — М.: Медицина. 1958. - 599 с.

7. Киншт В.Н. Молекулярно-эпидемиологический анализ штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в Западно-Сибирском регионе // Автореф. дисс. канд. мед. наук. Новосибирск. - 2002. - 22 с.

8. П.Иванов И.Ю. Молекулярно-генетическое изучение клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis II Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. - 2004. - 20 с.

9. Корнеев А.А., Голышевская В.И., Севастьянова Е.В., Сафонова С.Г., Пузанов В.А. Биологические свойства лабораторных штаммов и клинических изолятов микобактерий, мультирезистентных кпротивотуберкулезным препаратам // Пробл. туб. 1999. — № 2. — С.44^7.

10. МакМаррей Д.Н. Модель туберкулеза у морских свинок / Туберкулез. Патогенез, защита, контроль / Под ред. Барри Р. Блума. М: Медицина. - 2002. - 696 с.

11. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса Том 2. - М.: Мир. - 1997. - 368 с.

12. Перельман М. И. Ситуация с туберкулезом в России и выполнение Федеральной программы по борьбе с ним // Пробл. туб. 2001. - № 8. -С. 3.

13. Приказ № 109 МЗ РФ от 21.03.2003. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации — 2003. — 347 с.

14. Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника. Руководство. Смоленск: САУ. - 2000. — 476 с.

15. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О., Каугант Д.А., Сандвен П., Бьюне Г. Влияние лекарственной устойчивости на фитнес микобактерий туберкулеза генотипа W-Beijing // Пробл. туб. 2005. - № 8. - С. 4650.

16. Хоменко А. Г., Мишин В. Ю., Чуканов В. И. Выявление, диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания в современных эпидемиологических условиях. Методическое пособие для врачей. М. -2000.

17. Хоменко А.Г. Туберкулёз органов дыхания М.: Медицина. - 1988 — 355 с.

18. Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Катулина Н.И., Шудрова М.А. Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулезом из пенитенциарного учреждения // Пробл. туб. -2001.-№7.-С. 60-62.

19. Черноусова Л.Н., Кривонос А.П., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Кривонос П.С. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах // Акт. пробл. пенитенциарной медицины. Мат—лы международной научно-практич. конференции. — Минск. — 2001. — С. 48—50.

20. Шевченко Ю. Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге XXI века // Пробл. туб. 2000. - №3. - С. 2-6.

21. Шилова М. В. Туберкулез в России в конце XX века // Пробл. туб. — 2001.-№5.-С. 8-12.

22. Akaki Т., Sato K., Shimizu Т., Tomioka H. Changes in antibacterial activity of murine peritoneal macrophages against Mycobacterium tuberculosis after prolonged in vitro precultivation. // Kekkaku. 2000. — Vol. 75(7) - P. 477-482.

23. Alsaadi A.I., Smith D.W. The fate of virulent and attenuated1 Mycobacteria in guinea pigs infected by the respiratory route // Am. Rev. Respir. Dis. -1973.-Vol. 107.-P. 1041-1046.

24. Andersson D. I., B. R. Levin. The biological cost of antibiotic resistance // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - Vol. 2. - P. 489-493.

25. Anh D.D., Borgdorff M.W., Van L.N., Lan N.T., van Gorkom Т., Kremer K.', van Soolingen D. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype emerging in Vietnam II Emerg. Infect. Dis. 2000. - Vol. 6. - P. 302-305.

26. Baess I. Deoxyribonucleic acid relatedness among species of slowly-growing mycobacteria. // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. 1979. -Vol. 87.-P. 221-226.

27. Baker L., Brown Т., Maiden M.C., Drobniewski F. Silent nucleotide polymorphisms and a phylogeny for Mycobacterium tuberculosis II Emerg. Infect. Dis.-2004.-Vol. 10.-P. 1568-1577.

28. Balcewicz-Sablinska M.K., Keane J., Kornfeld H., Remold H.G. Pathogenic Mycobacterium tuberculosis evades apoptosis of host macrophages by release of TNF-R2, resulting in inactivation of TNF-alpha // J. Immunol. -1998.-Vol. 161.-P. 2636-2641.

29. Barczak A.K., Domenech P., Boshoff H.I., Reed M.B., Manca C.5 Kaplan G., Barry C.E. 3rd. In vivo phenotypic dominance in mouse mixed infections with Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J. Infect. Dis.- 2005. Vol. 192. P. - 600-606.

30. Bellamy R., Ruwende C.5 Corrah Т., McAdam K.P., Whittle H.C., Hill A.V. Assessment of the interleukin 1 gene cluster and other candidate gene polymorphism in host susceptibility to tuberculosis // Tuber. Lung. Dis.1998.-Vol. 79.-P. 1055-1064.

31. Barnes P.F., Yang Z., Preston-Martin S.5 Pogoda J.M., Jones B.E., Otaya M.5 Eisenach K.D., Knowles L., Harvey S., Cave M. D. Patterns of tuberculosis transmission in Central Los Angeles // J.A.M.A. 1997. - Vol. 278.-P. 1159-1163.

32. Bauer J., Andersen A.B., Kremer K., Miorner H. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark // J. Clin. Microbiol.1999. Vol. 37. - P. 2602-2606.

33. Beggs M.L., Eisenach K.D., Cave M.D. Mapping of IS6110 insertion sites in two epidemic strains of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol.- 2000. — Vol. 38 P. 2923-2928.

34. Bermudez L.E., Goodman J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. -P. 1400-1406.

35. Bhanu N.V., van Soolingen D., van Embden J.D., Dar L., Pandey R. M.5 Seth P. Predominace of a novel Mycobacterium tuberculosis genotype in the Delhi region of India // Tuberculosis (Edinb) 2002. - Vol. 82. - P. 105112.

36. Bifani P.J., Plikaytis B.B., Kapur V., Stockbauer K., Pan X.5 Lutfey M.L., Moghazeh S.L., Eisner W.5 Daniel T.M., Kaplan M.H., Crawford J.T., Musser J.M., Kreiswirth B.N. Origin and interstate spread of a New York

37. City multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clone family // J.A.M.A. 1996. - Vol. 275. - P. 452-457.

38. Bifani P. J., Shopsin В., Alcabes P., Mathema В., Kreiswirth B.N., Liu Z., Driscoll J., Frothingham^ R., Musser J.M. Molecular epidemiology and tuberculosis control // J.A.M.A. 2000. - Vol. 284. - P. 305-307.

39. Bifani P.J., Mathema В., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends Microbiol. 2002. - Vol. 10. - P. 45-52.

40. Billington O.J., McHugh T.D., Gillespie S.H. Physiological cost of rifampin resistance induced in vitro in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 1866-1869.

41. Birkness K.A., Deslauriers M., Bartlett J.H., White E.H., King C.H., Quinn F.D. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection // Infect. Immun. — 1999. — Vol. 67. — P. 653-658.

42. Blot M. Transposable elements and adaptation of host bacteria // Genetica — 1994.-Vol. 93.-P. 5-12.

43. Blower S.M., Chou T. Modeling' the emergence of the 'hot zones': tuberculosis and the amplification dynamics of drug resistance // Nat. Med. -2004.-Vol. 10. -№ 10.-P. 1111-1116.

44. Blower S.M., McLean A.R., Porco T.C., Small P.M., Hopewell P.C., Sanchez M.A., Moss A.R. The intrinsic transmission^ dynamics of tuberculosis epidemics // Nat. Med. 1995. - Vol. 1 - P. 815-821.

45. Brosch R., Pym A.S., Gordon S.V., Cole S.T. The evolution of mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics // Trends Microbiol. 2001. - Vol. 9 - P. 452-458.

46. Browning C.N., Gulbransen R. Studies on experimental tuberculosis in mice. The susceptibility of mice to inoculation with tubercle bacilli // J. Hyg. 1926. - Vol. 25. - P. 323-332.

47. Burgos M., DeRiemer K., Small P.M., Hopewell P.C., Daley C.L. Effect of drug resistance on the generation of secondary cases of tuberculosis // J. Infect. Dis.-2003.-Vol. 188.-P. 1878-1884.

48. Cardona P.J., Llatjos R., Gordillo S. Evolution of granulomas in lungs of mice infected aerogeniclly with Mycobcterium tuberculosis // Scand. J. Immunol.-2000.-Vol. 52.-P. 156-163.

49. Cave M. D., Eisenach K.D., Templeton G., Salfinger M., Mazurek G., Bates J.H., Crawford' J.T. Stability of DNA fingerprint pattern produced with IS6110 in strains of Mycobacterium,' tuberculosis II J. Clin. Microbiol. -1994. Vol. 32. - P. 262-266.

50. Cave M.D., Murray M., Nardell E. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis II Tuberculosis and the tubercle bacillus / Edited by S.T. Cole. Washington, ASM Press. - 2005. -P. 33^6.

51. Chandler, M., J. Mahillon. Insertion sequences revisited // Mobile DNA II / Edited by N.E. Craig, R. Craigie, M. Gellert, A.M. Lambowitz. -Washington, ASM Press. 2002.- P. 1250.

52. Charlesworth В., Sniegowski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes // Nature. 1994. - Vol. 371. - P. 215-220:

53. Chaves F., Dronda F., Alonso-Sanz M., Noriega A.R. Evidence of exogenous reinfection and mixed infection with more than one strain of Mycobacterium tuberculosis among Spanish HIV-infected inmates // AIDS 1999.-Vol'. 13.-P. 615-620.

54. Chiang C.Y., Riley L.W. Exogenous reinfection in tuberculosis // Lancet Infect. Dis. 2005. - Vol. 5. - P. 629-636.

55. Codina G., Vidal R., Martin-Casabona N., Miravitlles M., Martin C. Multidrug-resistant tuberculosis caused by 'W'-related strains in three immunocompetent foreign-born patients // Int. J. Tuberc. Lung Dis. — 1999. -Vol. 3.-P. 82-84.

56. Cohen Т., Sommers В., Murray M. The effect of drug resistance on the fitness of Mycobacterium tuberculosis II Lancet Infect. Dis. 2003. — Vol. 3.-P. 13-21.

57. Cohen Т., Becerra M.C., Murray M.B. Isoniazid resistance and the future of drug-resistant tuberculosis // Microb. Drug Resist. 2004. - Vol. 10. — P. 280-285.

58. Cohen Т., Murray. M. Modeling epidemics of multidrug-resistant M.tuberculosis of heterogeneous fitness // Nat. Med. 2004. - Vol. 10. - P. 1117-1121.

59. Squares S., Sulston J.E., Taylor K., Whitehead S.5 Barrell B.G. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence //Nature. 1998. - Vol. 393. - P. 537-544.

60. Comstock G.W. Tuberculosis in twins; re-analysis of the Prophit survey // Am. Rev. Respir. Dis. 1978. - Vol. 117. - P. 621-626.

61. Growle A. J., Elkins N. Relative permissiveness of macrophages from black and white people for virulent tubercle bacilli // Infect. Immun. 1990. -Vol. 58.-P. 632-638.

62. Dale J.W., Rohana M.N., Ramayah S., Tang Т.Н., Zainuddin Z.F. Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol. 37.-P. 1265-1268.

63. Danelishvili L., McGarvey J., Li Y.J., Bermudez L.E. Mycobacterium tuberculosis infection causes different levels of apoptosis and necrosis in human macrophages and alveolar epithelial cells // Cell Microbiol. 2003. -Vol. 5(9).-P. 649-660.

64. Dannenberg A.M. Jr. Delayed-type hypersensitivity and cell-mediated immunity in the pathogenesis of tuberculosis // J. Immunol. Today. 1991 — Vol. 12.-P. 228-233.

65. Dannenberg A.M. Jr. Immunopathogenesis of pulmonary tuberculosis // J. Hosp. Pract- 1993.-Vol. 28.-P. 33-40.

66. Doroudchi M., Kremer K., Basiri E.A., Kadivar M.R., Van Soolingen D., Ghaderi A.A. IS6770-RFLP and spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis isolates in Iran // Scandl J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 32(6) - P. 663-668.

67. Douglas, J.T., Qian L., Montoya J.C., Musser J.M:, Van Embden J.D., Van Soolingen D., Kremer K. Characterization of the Manila family of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 2723-2726.

68. Drobnewski F., Balabanova Y., Ruddy., Weldon L., Jeltkova K., Brown T. Rifampin- and-Multidrug resistant tuberculosis in Russian civiliancs and prison inmates: dominance of the Beijing strain family // Emerg. Infect. Dis.- 2002. -Vol.8. -P. 1320-1326.

69. Dubnau, E., Chan J., Raynaud C., Mohan-V. P., Laneelle M: A., Yu K., Quemard A., Smith I., Daffe M. Oxygenated mycolic acids are necessary for virulence of Mycobacterium tuberculosis in mice // Mol. Microbiol. — 2000. -Vol. 36.-P. 630-637.

70. Dubos R.J. Properties and structures of tubercle bacilli concerned in their pathogenicity. // Proceedings of the Symposia of the Society for General Microbiology. 1955. - P. 103-125.

71. Dubos R.J., Pierce C.H. Differential characteristics in vitro and in vivo of several substrains of BCG. IV Immunizing effectiveness // 'Am. Rev. Tuberc.- 1956.-Vol. 74.-P. 699-717.

72. Dye C., Williams B.G., Espinal M.A., Raviglione M.C. Erasing the world's slow stain: strategies to beat multidrug-resistant tuberculosis // Science. -2002. Vol: 295. - P. 2042-2046.

73. Escalante P., Ramaswamy S., Sanabria H., Soini H., Pan X., Valiente-Castillo O., Musser J.M. Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru // Tuber. Lung. Dis. — 1998. -Vol. 79(2).-P. 111-118.

74. Jacobs W. R. Jr, Venter J.C., Fraser C.M. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains // J. Bacteriol. — 2002. Vol. 184. - P. 5479-5490.

75. Fraser C.M., Eisen J., Fleischmann R.D., Ketchum K.A., Peterson S. Comparative genomics and understanding of microbial biology // Emerg. Infect. Dis. 2000. - Vol. 6. - P. 505-512.

76. Frothingham R., Hills H. G., Wilson К. H. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1639-1643.

77. Frothingham R., Meeker-O'Connel W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. Microbiology 1998.- Vol. 144. - P. 1189-1196.

78. Glickman M. S., Jacobs W. R., Jr. Microbial pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis: dawn of a discipline // Cell. 2001. - Vol. 104.-P. 477-485.

79. Glynn J. R., Whiteley J., Bifani P. J., Kremer K., van Soolingen D. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P.843-849.

80. Goguet de la Salmoniere Y. O., Kim С. C., Tsolaki A. G., Pym A. S., Siegrist M. S., Small P. M. High-throughput method for detecting genomic-deletion polymorphisms. J. Clin. Microbiol. 2004 - Vol. 42. - P. 29132918.

81. Gordon S.V., Brosch R., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Cole S.T. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilliusing bacterial artificial chromosome arrays // Mol. Microbiol. — 1999. — Vol. 32. P. 643-655.

82. Gut I. G. Automation in genotyping of single nucleotide polymorphisms // Hum. Mutat. 2001. - Vol. 17. - P. 475-492.

83. Gutierrez M. C., Brisse S., Brosch R., Fabre M., Omais В., Marmiesse M., Supply P., Vincent V. Ancient origin and gene mosaicism of the progenitor of Mycobacterium tuberculosis II PLoS Pathog. 2005. — Vol. 1 (1). - e5.

84. Heersma H. F., Kremer K., van Embden J. D. Computer analysis of IS6110 RFLP patterns of Mycobacterium tuberculosis. Methods Mol. Biol. - 1998.-Vol. 101.-P. 395-422.

85. Hickman S. P., Chan J., Salgame. P. Mycobacterium tuberculosis induces differential cytokine production from dendritic cells and macrophages with divergent effects on naive T cell polarization // J. Immunol. 2002. - Vol. 168. - P. 4636-4642.

86. Hill A.V.S. Genetics of infectious disease resistance // Curr.Opin.Genet.Dev. 1996. - Vol. 6. - P. 348-360.

87. Hirsh A.E., Tsolaki A.G., DeRiemer K., Feldman M.W., Small P.M. Stable association between strains of Mycobacterium tuberculosis and their human host populations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101. -P. 4871-4876.

88. Kapur V., Whittam T.S., Musser J.M. Is Mycobacterium tuberculosis 15,000 years old? // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 1348-1349.

89. Karunakaran P., Davies J. Genetic antagonism and hypermutability in Mycobacterium smegmatis II J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 33313335.

90. Kato-Maeda M., Bifani P.J., Kreiswirth B.N., Small P.M. The nature and consequence of genetic variability within Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Investigation. 2001. - Vol 107 (5). - P. 533-537.

91. Kato-Maeda M., Rhee J. Т., Gingeras T. R., Salamon H., Drenkow J., Smittipat N., Small P. M. Comparing genomes within the species

92. Mycobacterium: tuberculosis II Genome Res. 2001. - Vol. 11. - P. 547- . 554.

93. Khomenko A.G, Chernousova L.N, Kurepina N.E. et all Molecular fingerprint M.tuberculosis from Russia ТВ patients // Int. J. Tub. Lung. Dis. 1998.-Vol. 11 (2).-P. 280.

94. Kimura M. The neutral theory of molecular evolution and; the: world-view of the neutralists // Genome. 1989. - Vol: 31(1). - P. 24-31.

95. Kramnik I., Dietrich W. F., Demant P., Bloom B. R; Genetic control of resistance to experimental infection with virulent M tuberculosis II Proc. Natl. Acad; Sci. USA. 2000. - Vol: 97. - P: 8560-8565. ^

96. Levin B. R., Lipsitch M., Bonhoeffer S. Population biology, evolution, and infectious disease: convergence and synthesis // Science. — 1999. Vol: 283. - P. 806-809.

97. Lillebaek Т., Dirksen A., Baess I., Strunge В., Thomsen V. O., Andersen A. B. Molecular evidence of endogenous reactivation of Mycobacterium tuberculosis after 33 years of latent infection // J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 185. - P. 401-404.

98. Lurie M.B. The correlation between the histological changes and the fate of living tubercle bacilli by rabbit pulmonary alveolar macrophages and its relation to native resistance to tuberculosis •// J. Immunol 1932 - Vol. 91.-P. 553-556.

99. Lurie M.B. Nature of inherited resistance to tuberculosis // Rroc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1938.-Vol. 39.-P. 181-187.

100. Mariam D. H., Mengistu Y., Hoffner S. E., Andersson D. I. Effect of rpoB mutations conferring rifampin resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis. II Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - Vol. 48. - P. 1289-1294.

101. Mathema В., Kurepina N.E., Bifani P.J., Kreiswirth B.N. Molecular Epidemiology of Mycobacterium tuberculosis: current insights // Clin. Microbiol. Rev. 2006. - Vol. 19. - P. 658 - 685.

102. Maus C.E., Plikaytis В.В., Shinnick T.M. Mutation of tlyA confers capreomycin- resistance in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - Vol. 49. - P. 571-577.

103. McDonough K.A., Kress Y., Bloom B.R. Pathogenesis of tuberculosis: interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P: 2763-2773.

104. McHugh T. D., Gillespie S. H. Nonrandom association of IS6110 and Mycobacterium tuberculosis: implications for molecular epidemiological studies // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 1410-1413.

105. McLeod R., Remington J.S. A method to evaluate the capacity of monocytes and macrophages to inhibit multiplication of an intracellular pathogen // J. Immun. Methods. 1979. - Vol. 27. - P. 19-29.

106. McMurray D.N. Disease model: pulmonary tuberculosis // Trends in Molecular Medicine.-2001.-Vol. 7 (3).-P. 135-137.

107. Melo M.D., Stokes R.W. Interaction of Mycobacterium tuberculosis with MH-S, an immortalized murine alveolar macrophage cell line: a comparison with primary murine macrophages // Tubercle Lung Dis. -2000. Vol. 80. - P. 35-46.

108. Mostowy S., Cousins D., Brinkman J., Aranaz A., Behr M.A. Genomic Deletions Suggest a Phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis Complex // J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 186. - P. 74-80.

109. Murray M. Determinants of cluster distribution in the molecular epidemiology of tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. - Vol. 99.-P. 1538-1543.

110. Musser J.M. Molecular population genetic analysis of emerged bacterial pathogens: selected insights // Emerg. Infect. Dis. 1996. — Vol. 2. -P. 1-17.

111. Musser J. M., Amin A., Ramaswamy S. Negligible genetic diversity of mycobacterium tuberculosis host immune system protein targets: evidence of limited selective pressure // Genetics. 2000. - Vol. 155. — P. 7-16.

112. Nerlich A.G., Zink A., Szeimies U., Hagedorn H.G. Ancient Egyptian prosthesis of the big toe // Lancet. 2000. - Vol. 356. - P. 2176-2179.

113. Newport M., Levin M. Genetic susceptibility to tuberculosis // J.Infect.- 1999.-Vol. 39.-P. 117-121.

114. Niemann S., Richter E., Rusch-Gerdes S., Schlaak M., Greinert U. Double infection with a resistant and a multidrug-resistant strain of Mycobacterium tuberculosis II Emerg. Infect. Dis. 2000. - Vol. 6. — P. 548-551.

115. Nikonenko B.V., Apt A.S., Moroz A.M, Averbakh M.M. Genetic analysis of susceptibility of mice to H37Rv tuberculosis infection: sensitivity versus relative resistance // Prog. Leukocyte Biol. 1985 — Vol. 3.-P. 291-299.

116. Nikonenko B.V., Averbakh M.M., Lavebratt C., Schurr E., Apt A.S. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St andresistant Л/Sn inbred mice // Tuber. Lung Dis. 2000. - Vol: 80. - P. 1525.

117. Nikonenko B.V., Samala R., Einck L., Nacy C.A. Rapid, simple in vivo screen for new drugs active against Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - Vol. 48 (12)- P. 4550-4550.

118. Nolte F. S., Metchock B. Mycobacterium // Manual of Clinical: Microbiology / Edited by P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. G. Tenover, L. H. Yolken. Washington, ASM Press. - 1995. - P. 400-437.

119. North R.J., Ryan L., LaCource R, Mogues Т., Goodrich M.E. Growth rate of mycobacteria in mice as an unreliable indicator of mycobacterial virulence // Infect. Immun. 1999.- Vol- 67. - P. 5483-5485.

120. Pfyffer G.E., Strassle A., van Gorkum Т., Portaels F., Rigouts L., Mathieu C., Mirzoyev F., Traore H., van Embden J.D. Multidrug-resistant tuberculosis in prison inmates, Azerbaijan // Emerg. Infect. Dis. 2001. -Vol. 7.-P. 855-861.

121. Portaels F., Rigouts L., Bastian I. Addressing multidrugresistant tuberculosis in penitentiary hospitals and in the general population of the former Soviet Union // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - Vol. 3". - P. 582588.

122. Prodinger W.M., Bunyaratvej P., Prachaktam R., Pavlic M. Mycobacterium tuberculosis isolates of Beijing genotype in Thailand. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7. - P. 483-484.

123. Pym A.S., Saint-Joanis В., Cole S.T. Effect of katG mutations on-the virulence of Mycobacterium tuberculosis and the implication for transmission in humans // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 4955-4960.

124. Ramaswamy S., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tuber. Lung. Dis. 1998. - Vol. 79(1). -P. 3-29.

125. Ravins M., Bercovier H., Chemtob D., Fishman Y., Rahav G. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis infection in Israel // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39(3). - P. 1175-1177.

126. Reed M.B., Domenech P., Manca C., Su H., Barczak A.K., Kreiswirth B.N., Kaplan G., Barry C.E. A glycolipid of hypervirulent tuberculosis strains that inhibits the innate immune response // Nature. -2004. Vol. 431.-P. 84-87.

127. Reid S.D., Hoe N.P., Smoot L.M., Musser J.M. Group A streptococcus: allelic variation, population genetics, and host-pathogen interactions. // J. Clin. Invest. 2001 - Vol. 107. - P. 393-399.

128. Rengarajan J., Sassetti C.M., Naroditskaya V., Sloutsky A., Bloom

129. B.R., Rubin E.J. The folate pathway is a target for resistance to the drug para-aminosalicylic acid (PAS) in mycobacteria. // Mol. Microbiol. 2004. -Vol. 53.-P. 275-282.

130. Rhee J.T., Tanaka M.M., Behr M.A., Agasino C.B., Paz E.A., Hopewell P.C., Small P.M. Use of multiple markers in population-based molecular epidemiologic studies of tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2000. - Vol. 4. - P. 1111-1119.

131. Richardson M., van Lill S.W., van der Spuy G.D., Munch Z., Booysen

132. C.N., Beyers N., van Helden P.D., Warren R.M. Historic and recent events contribute to the disease dynamics of Beijing-like Mycobacterium tuberculosis isolates in a high incidence region // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. — 2002. Vol. 6. - P. 1001-1011.

133. Ross B.C., Raios K., Jackson K., Dwyer B. Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium• tuberculosis and its use as an epidemiological tool // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 942946.

134. Salo W.L., Aufderheide A.C., Buikstra J., Holcomb T.A. Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA in a Pre-Columbian-Peruvian mummy // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. - - Vol. 91. - P. 2091-2094.

135. Schork N. J., Fallin D. Lanchbury J. S. Single nucleotide polymorphisms and the future of genetic epidemiology // Clin. Genet. -2000 Vol. 58. - P. 250-264.

136. Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence I I Clin. Microb. Rev. 2003. - Vol. 16 (3). - P. 463-496.

137. Stach J.L., Gros P., Skamene E., Forget A. Phenotypic expression of genetically controlled natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG) // J. Immunol. 1984. - Vol: 132. - P. 888-892.

138. Stead W. W. The origin and erratic global spread of tuberculosis. How the past explains the present and is the key to the future // Clin. Chest Med. 1997. - Vol. 18. - P. 65-77.

139. Supply P., Mazars E., Lesjean S., Vincent V., Gicquel В., Locht C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome // Mol. Microbiol.- 2000. - Vol. 36. - P. 762-771.

140. Theus S.A., Cave M. D., Eisenach K.D. Intracellular macrophage growth rates and cytokine profiles of Mycobacterium tuberculosis strains with different transmission dynamics // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 191. — P. 453-460.

141. Thierry D., Cave M.D., Eisenach K.D., Crawford"J.T., Bates J.H., Gicquel В., Guesdon J.L. IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex // Nucleic. Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 188.

142. Toungoussova O.S., Caugant D.A., Sandven P., Mariandyshev A.O., Bjune G. Impact of drug resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing genotype // FEMS Immunol» Med Microbiol. 2004. - Vol. 42(3). - P. 281-290.

143. Tsuchiya S., Kobayashi Y., Goto Y., Okumura H., Nakae S., Konno Т., Tada K. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester // Cancer Res. 1982. - Vol. 42. - P. 1530-1536.

144. Valway S.E., Greifinger R.B., Papania M., Kilburn J.O., Woodley С ,

145. DiFerdinando G.T., Dooley S.W. Multidrug-resistant tuberculosis in the " New York State prison system, 1990-1991 II J. Infect. Dis. 1994. - Vol.170.-P. 151-156.

146. Vynnycky E., Nagelkerke N., Borgdorff M.W., van Soolingen D., van

147. Wei J., Dahl J.L., Moulder J.W., Roberts E.A., O'Gaora P., Young D.B., Friedman R.L. Identification of a Mycobacterium tuberculosis gene that enhances mycobacterial survival in macrophages // J. Bacteriol. 2000. -Vol. 182.-P. 377-384.

148. Yang Z., Barnes P.F., Chaves F., Eisenach K.D., Weis S.E., Bates J.H., Cave M.D. Diversity of DNA fingerprints of Mycobacteriumtuberculosis isolates in the United States // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36(4).-P. 1003-1007.

149. Yang Z.H., Ijas K., Bates J.H., Eisenach K.D., Cave M.D. Spoligotyping and PGRS fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains having few copies IS6110 II J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. -P. 3572-3576.

150. Yang Z.H., Bates J.H., Eisenach K.D., Cave M.D. Secondary typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with matching IS6110 fingerprints from different geographic regions of the United States // J. Clin. Microbiol. -2001.-Vol. 39.-P. 1691-1695.

151. Yeh R. W., Ponce de Leon A., Agasino C.B., Hahn J.A., Daley C.L., Hopewell P.C., Small P.M. . Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes // J. Infect. Dis. 1998. - Vol. 177. - P. 1107-1 111.

152. Zhang M., Gong J., Yang Z., Samten В., Cave M.D., Barnes P.F. Enhanced Capacity of a Widespread Strain of Mycobacterium tuberculosis to Grow in Human Macrophages // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179. - P. 1213-1217.