Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области"

На правах рукописи

00345Б017 Сивков Антон Юрьевич

Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области

03.00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово-2008

003456017

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна, ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

кандидат биологических наук, Катохин Алексей Вадимович, ИЦиГ СО РАН

Ведущая организация

г. Новосибирск, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Защита состоится «19» декабря 2008 года в 09-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан «//» ноября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета

д.б.н. Л.И.Карпенко

Общая характеристика работы

Актуальность темы

На сегодняшний день около трети населения инфицировано микобактериями туберкулеза. Особенно опасными являются микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). МЛУ штаммы, устойчивы как минимум к изониазиду и рифампицину. Каждый год во всем мире МЛУ формами туберкулеза заболевают около 400 тыс. лиц.

При неправильном лечении больных МЛУ-формами противотуберкулезными препаратами второй линии у пациентов могут быть отселектированы штаммы М. tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). Такие штаммы устойчивы не только к рифампицину и изониазиду, но и ко всем фторхинолонам и, как минимум, к одному из трех инъекционных препаратов второй линии (капреомицину, канамицину или амикацину). В развитых странах с наилучшими на сегодня системами диагностики и лечения туберкулеза удалось добиться излечения больных ШЛУ-туберкулезом лишь в 30% случаев.

По данным ВОЗ, на конец 2007 года уже в 41 стране были обнаружены ШЛУ штаммы М. tuberculosis. В России эти штаммы также получили распространение. Только в Томской области в течение 2002-2005 гг. было выявлено 30 ШЛУ штаммов среди исследованных 458 МЛУ изолятов (6,6%). Дальнейшее распространение ШЛУ и МЛУ штаммов угрожает возникновением эпидемии туберкулеза, для лечения которого доступных на сегодняшний день лекарственных средств будет недостаточно.

В 2007 г ВОЗ приняла программу борьбы с распространением МЛУ и ШЛУ туберкулеза в мире. Среди важнейших целей программы - усиление и расширение надзора за МЛУ и ШЛУ туберкулезом, и поддержка исследований, направленных на создание новых тест-систем для быстрого выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование распространенности МЛУ штаммов М. tuberculosis в Новосибирской области.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Оценить возможность определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с помощью биочипа.

2. Определить доминирующие механизмы возникновения и распространения МЛУ-штаммов.

3. Выявить очаги заболеваемости лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза на территории Новосибирской области.

Научная новизна

• Впервые в Новосибирской области при параллельном исследовании лекарственной устойчивости к рифампицину чистых культур микобактерий туберкулеза бактериологическим методом и с помощью биочипа было установлено, что результаты совпадают в 86% случаев.

• На примере штаммов, циркулирующих в Новосибирской области, впервые продемонстрирована возможность использования биочипа, определяющего только устойчивость к рифампицину, для выявления МЛУ-изолятов М. tuberculosis.

• Показано, что в Новосибирской области доминируют Пекинские штаммы, доля которых составляет не менее 48%.

• Впервые комбинацией двух методов генотипирования - IS6110 и MIRU - среди Пекинских штаммов в Новосибирской области выявлены две генетических группы, в которых доминировали МЛУ изоляты (89 и 100% соответственно).

• В ходе изучения механизмов возникновения и распространения МЛУ штаммов М. tuberculosis молекулярно-генетическими методами установлено, что устойчивые изоляты селектировались в ходе лечения и к 2001-2003 гг получили значительное распространение среди населения Новосибирской области, где сформировали очаги заболеваемости МЛУ формами туберкулеза.

Практическая значимость

Разработан и запатентован способ регенерации биочипов, позволяющий использовать один биочип до семи раз.

Путем совмещения двух стадий ПЦР в одной пробирке разработан метод определения устойчивости к рифампицину, позволяющий снизить вероятность кросс-контаминации при проведении исследований, значительно удешевить стоимость и резко повысить производительность анализа.

Показано, что положительный результат определения лекарственной устойчивости биочипом может быть использован при принятии решения о выборе противотуберкулезных препаратов, а отрицательный - нет. Если биочипом изолят определяется, как чувствительный, необходимы дополнительные исследования его лекарственной устойчивости. Апробация работы и публикации

Полученные результаты исследований были представлены: на «Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова» (Томск, Россия, 2003), XIV научной конференции-конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск, Россия, 2003), симпозиуме «Интегративная медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, Россия, 2004), Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», (Новосибирск, Россия, 2005), «26th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology», (Istanbul, Turkey, 2005), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, Россия, 2006), III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова (Томск, Россия, 2007).

По материалам диссертации был получен патент № 2270870 от 25.12.2003 «Способ регенерации нуклеотидных биочипов» Болдырев А.Н. Сивков А.Ю. Татьков С.И.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа была выполнена соискателем в 2002-2006 гг. в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проектов МНТЦ №2019 и №1980, а также госпрограммы РФ (договор № 03/2512/1).

На разных этапах в работе принимали участие Татьков С.И., Болдырев А.Н., Боднев С.А., Туманов Ю.В., Кузьмичева Г.А., Азаев М.Ш., Смирнова О.Ю., Ивлев-Дунтау А.П., Филипенко М.Л., Рот М.А., Цильковская И., Ильичев A.A. Всем им автор приносит искреннюю благодарность. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 160 работ: 18 - отечественных авторов и 142 - зарубежных. Работа иллюстрирована 55 рисунками и включает 6 таблиц.

Основное содержание работы

Для решения поставленных задач были сформированы две выборки клинических изолятов.

1. Коллекция из 272 штаммов была создана из устойчивых к рифампицину изолятов, выделенных от впервые выявленных или ранее лечившихся больных туберкулезом из г. Новосибирска с 2000 по 2005 гг.

Устойчивость к рифампицину определяли биочипом, для подтверждения точности детекции мутаций в гене биочипом у 60 изолятов была определена нуклеотидная последовательность высоковариабельной области гена гроВ. На данной выборке были опробованы модификации анализа мутаций биочипом.

170 изолятов из 272, выбранные методом случайных чисел, были генотипированы методом IS6110 ПЦР. Также 170 изолятов были использованы для анализа механизмов распространения лекарственно-устойчивых изолятов в г. Новосибирске.

2. Репрезентативная коллекция была образована из штаммов, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом из 30 районов Новосибирской области и городов Новосибирск, Бердск, Обь за период с 1 января 2003 по 1 января 2004 гг.

Сбор мокроты, исследование мазков, бактериологические посевы, производились в противотуберкулезном диспансере города Новосибирска и Новосибирском НИИ туберкулеза Росздрава. На каждый изолят М. tuberculosis, были составлены паспорта, включающие бактериологические характеристики, социально-демографические и основные клинические параметры больных.

Всего за 2003 год было выявлено 1699 первичных больных, от 762 пациентов удалось выделить чистую культуру М. tuberculosis, у всех выделенных культур определялась устойчивость к противотуберкулезным препаратам микробиологическим методом. Результаты определения лекарственной устойчивости удалось получить лишь для 607 культур.

Данные обо всех 1699 первичных случаях использовались для анализа географического распределения лекарственно-устойчивых форм туберкулеза по районам области.

Для оценки генетического разнообразия штаммов М. tuberculosis в Новосибирской области из 607 изолятов были выбраны методом случайных чисел 230 изолятов, которые анализировались методами IS6110 ПДРФ и MIRU VNTR.

Обе коллекции штаммов исследовались в рамках проекта МНТЦ №1980 «Эпидемиология лекарственно-устойчивого туберкулеза в Западной Сибири: генетическая характеристика лекарственно-устойчивых изолятов М. tuberculosis и анализ их распределения в Новосибирской области», руководитель проекта Ильичев A.A. Проведение проекта №1980 было одобрено этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор» 28 мая 2001 г (протокол №2 от 28 мая 2001 г.).

Географическое распределение заболеваемости лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза по территории Новосибирской области

В среднем, заболеваемость в сельских районах Новосибирской области 132 случая на сто тыс. населения в 1,6 раза выше, чем средняя заболеваемость по городу Новосибирску (82 случая на сто тыс. населения).

Мы исследовали данные, предоставленные НИИ туберкулеза, и проводили распределение заболеваемости и множественной лекарственной устойчивости по районам Новосибирской области (рис. 1).

Рисунок 1. Заболеваемость туберкулезом по районам Новосибирской области в 2003 году на 100000 населения. Цветом показан уровень заболеваемости по районам области.

Распределение заболеваемости по районам варьирует от 46 в Кочковском до 235 (рис. 1) случаев заболевания на сто тысяч населения в Тогучинском районах. При переходе на районный уровень анализа отчетливо выявляется очаги заболеваемости: в четырех районах (Венгеровском, Колыванском, Коченевском и Тогучинском) заболеваемость выше 200 случаев на сто тысяч населения, причем три из четырех районов примыкают к областному центру.

□ 200-250 ю50-100 ■ 150-200 ^<50

□ 100-150

Характеристика спектра лекарственной устойчивости среди впервые заболевших туберкулезом

При исследовании устойчивости циркулирующих штаммов микобактерий туберкулеза у 607 изолятов, (35% случаев), были определены профили резистентности выделенных штаммов.

В 2003 г. в Новосибирской области было выявлено 89 МЛУ-штаммов, что составило 14,7% от всей проанализированной выборки. Выявляемость МЛУ значительно варьировала в зависимости района области (рис. 2).

Рисунок 2. Заболеваемость в процентах МЛУ туберкулезом по районам Новосибирской области за 2003 г. Цветом отмечено распределение заболеваемости по районам области.

Было показано, что в Сузунском и Северном районах сложилась критическая ситуация и уровень МЛУ-штаммов у впервые выявленных пациентов, превысил 25%.

Устойчивые к рифампицину изоляты в 91% были устойчивы и к изониазиду, т.е. являлись изолятами с МЛУ. Следовательно, в нашем регионе выявление устойчивости к рифампицину любым методом с вероятностью около 90% поможет быстро определить МЛУ-штаммы М. tuberculosis.

МЛУ МЛУ МЛУ МЛУ

Применение биочипа, определяющего устойчивость к рифампицину, для

массового скрининга МЛУ-изолятов микобактерий туберкулеза

Замена двух-пробирочного метода наработки меченого фрагмента для гибридизации на биочипе на однопробирочный

Ранее в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта был разработан чип «ТБ-биочип (RIF)», позволяющий определять 30 типов мутаций в гене гроВ, который может быть использован для скрининга рифампицин- и МЛУ-устойчивых штаммов М. tuberculosis.

В инструкции к биочипу, предложенной разработчиками предлагалось проводить синтез меченого фрагмента гена гроВ, используя две реакции ГГЦР. Продукт первой из них переносился в новую пробирку, и проводилась вторая стадия ПЦР, в результате которой синтезировался анализируемый фрагмент вариабельной области гена гроВ.

Стадия переноса ПЦР-продукта из одной пробирки в другую является потенциальным источником кросс-контаминаций и получения ложных результатов при проведении ПЦР-анализа.

Риск контаминации можно уменьшить, если исключить стадию переноса ПЦР-продукта, совместив обе реакции в одной микропробирке.

Мы разработали способ совмещения двух последовательных ПЦР в одной. Были подобраны соотношения праймеров и температурно-временной профиль совмещенной ПЦР, позволяющие получать совпадение флуоресцентных изображений чипов, полученных как по протоколу, рекомендованному разработчиками, так и по протоколу, разработанному нами (рис. 3).

1 2

Рисунок 3. Сравнение изображений биочипов, полученных по протоколу «ТБ-биочип (МР)». 1- в две стадии, 2 - в одну стадию.

Для проверки разработанного протокола, мы определили мутации во всех образцах ДНК, выделенных из 272 изолятов М. tuberculosis, с помощью биочипа параллельно по обоим протоколам и установили, что во всех случаях оба метода приводили к получению одинаковых результатов. Совмещение обоих раундов ПЦР в одной микропробирке позволило снизить риск возникновения контаминации при проведении ПЦР, снизить расход пластиковых пробирок, носиков, значительно уменьшить трудозатраты при анализе. Применение разработанного нами протокола представляется более предпочтительным, чем использование методики, предложенной создателями набора «ТБ-биочип (RIF)», особенно при массовых анализах в ПЦР-лабораториях.

Многократное использование биочипов путем их регенерации

Для снижения стоимости исследования лекарственной устойчивости М. tuberculosis мы разработали способ многократного использования биочипов.

Для проверки методики регенерации был использован ТБ-биочип. Мы проверили на нем ДНК №150 из банка изолятов М. tuberculosis лаборатории. Изолят имел мутацию Ser531-Leu, которая проявлялась четким сигналом в соответствующей ячейке биочипа (рис. 4А). После регенерации сигналы в ячейках биочипа не проявились даже при экспозиции 5000 мс (рис. 4Б).

А Б

Рисунок 4. Фотография изображения прогибридизованного биочипа. А - до регенерации, экспозиция 150 мс; Б - после проведения регенерации, экспозиция 5000 мс.

Применение регенерации позволило 7 раз использовать I биочип без потери качества результатов (рис.5.). При проведении регенерации больше семи раз ячейки биочипа деградируют.

Методика регенерации была проверена на МЛУ-биочипах, также разработанных в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта. В результате было показано, что регенерация работает и на МЛУ-биочипах.

На выборке из 50 изолятов мы сравнивали результаты анализа мутаций с помощью ТБ-биочипов до, и после проведения регенерации. Мутации, выявленные биочипами после регенерации, совпали с мутациями, выявленными по протоколу производителей биочипов.

А Б В

ГДЕ

Рисунок 5. Фотографии изображений многократного применения биочипа после регенерации и повторной гибридизации. А - двукратное применения биочипа; Б - трехкратное применения биочипа; В - четырехкратное применения биочипа; Г - пятикратное применения биочипа; Д - шестикратное применения биочипа; Е - семикратное применения биочипа.

Таким образом, разработанная технология регенерации применима для нуклеотидных биочипов и позволит резко снизит затраты на проведение исследований лекарственной устойчивости М. tuberculosis.

Сравнение результатов определения лекарственной устойчивости при массовом скрининге биочипами и микробиологическим методом

Чтобы определить возможность определения устойчивости микобактерий

туберкулеза к рифампицину с помощью биочипа мы исследовали резистентность

изолятов, выделенных от больных в Новосибирской области двумя методами.

Лекарственная устойчивость была выявлена у всех изолятов методом абсолютных

12

концентраций на твердой питательной среде Левенштейна - Иенсена. Параллельно выделялась ДНК всех изолятов, и анализировалась 'ГБ-биочипами. Оказалось (Рис.6), что в 86% случаев мутация в гене гроВ маркировала случаи наличия у микобактерии устойчивости к рифампицину.Наиболее часто встречающейся мутацией, оказалась Ser531-Leu. Также были выявлены мутации L51 IP, D516V, H526Y и L533P (рис.6.).

□ SER531>LEU

15„0 и LEU511 >PRO

13°□HIS526>TYR

□ ASP516>VAL

4°«57 °о

■ Остальные мутации

□ нет мутаций но есть устойчивость

Рисунок 6. Выявленные с помощью биочипа мутации в гене гроВ.

На основании распространенности мутаций среди рифампицин-устойчивых изолятов можно заключить, что подавляющее большинство (83,2%) штаммов обладает настолько высокой лекарственной устойчивостью к рифампицину, что включение этого антибиотика в различные схемы лечения туберкулеза становится бесполезным.

Для проверки надежности определения мутаций с помощью биочипа, из 272 образцов ДНК были случайным образом отобраны 60, у которых была определена последовательность ДНК вариабельной области гена i-poB. Полученные данные показали, что все мутации, присутствующие в гроВ генах исследованных изолятов, были определены биочипом без ошибок.

Ранее различными исследователями было показано, что у 95% устойчивых штаммов присутствует мутация в гене гроВ. Мы показали, что у 15% устойчивых к рифампицину изолятов не обнаруживались мутации в гене. Это на 10% больше, чем можно было бы ожидать.

15 °о

У культур М. tuberculosis, для которых обоими методами были получены противоречивые результаты по резистентности, была повторно определена устойчивость к рифампицину. Полученные результаты совпали с первоначальными. В результате анализа изображений биочипов «сомнительных культур» было выявлено, что в них присутствуют как сильные сигналы в мутантных кодонах, так и, сравнимые с ними по интенсивности сигналы в немутантных кодонах (Рис. 7.).

Такие образы биочипов можно объяснить присутствием в культуре смеси двух штаммов: чувствительного и резистентного типа (смешанной культурой) и соответствующей геномной ДНК в анализируемом с помощью биочипа образце.

Смешанные культуры могли возникнуть либо в результате кросс-контаминации в лаборатории, либо изначально присутствовать в образце мокроты, полученной от больного. В настоящее время для выявления смешанных культур применяются генотипирование по IS6110 - локусам, сполиготипирование или VNTR. Доля кросс-контаминаций в лабораториях изменяется в широких пределах - до 65%. Однако для лабораторий развитых стран она значительно ниже: в Лондоне - 0,93%, в Дэнвере (США) - 12-14%. В Российских лабораториях, доля кросс-контаминаций может быть еще выше, достигать 33%.

Другим источником появления устойчивых штаммов в организме больного может служить спонтанный мутагенез. Резистентность к рифампицину может появляться с частотой 10"s на одно клеточное делении, причем частота мутирования различных кодонов гена гроВ одинакова и не зависит от генотипа микобактерий.

Ele 4n»víe Seut tet>

i*k¡ fiLOl .i-:*"*" tt Bl #

Рисунок 7. Пример фотографии биочипа с одинаковыми сигналами дикого типа и мутации. Красным отмечены сигналы, маркирующие дикий тип и мутацию Ser-Leu в 531 кодоне гена гроВ.

Возникновение мутаций в гене гроВ влияет на фитнес микобактерии, т.е. на ее способность к росту и распространению в популяции. Так, например, мутации His526—>Туг и His526—>Arg уменьшают скорость деления, a Ser531 -Leu - пет. Причем, влияние мутаций на фитнес не зависит от генотипа М. tuberculosis.

Микробиологические методы «настроены» на выявление даже 1% устойчивых микобактерий в анализируемом образце, а биочип, видимо, её не обнаруживает. В результате возникает разночтение данных по резистентности культур клинических изолятов. В.А. Фирсовой было показано, что при определении устойчивости М. tuberculosis напрямую из мокроты биочипом результаты совпадают с методом абсолютных концентраций только в 50% случаев.

Таким образом, если биочипом показано отсутствие устойчивости, то изоляг необходимо подвергать дополнительному исследованию с помощью ПЦР реального времени или иным методом для детектирования небольшой примеси устойчивого штамма в образце.

Анализ генотипов микобактерий туберкулеза методом IS6110 ПЦР типирования в г. Новосибирске

Для определения генотипов устойчивых изолятов из 272 изолятов методом случайных чисел были отобраны 170 изолятов. Они были прогенотипированы методом IS6110 ПЦР-типирования. В результате анализа результатов генотипирования было построено филогенетическое древо. Выборка разделилась на две части (Рис. 8.). Изоляты, входящие в группу ABCDEFGHI, составляют 68,83% от всей выборки. Эта группа имеет клональную структуру и генотипы, входящие в нее, демонстрируют большую гомологию между собой. Генотипы В и G доминируют в популяции, на их долю приходится 19,4 и 38,24% выборки соответственно. Вторая группа, состоящая из генотипов, не вошедших в кластер ABCDEFGHI, продемонстрировала небольшую гомологию между входящими в нее генотипами. Эти группа скорее всего состоит из недавно появившихся штаммов, либо имевших распространение в прошлом.

С помощью метода ПДРФ по IS6110, а также в результате соотнесения профилей IS6110 ПЦР с данными, опубликованными Мокроусовым И.В. было

показано, что рифампицин-устойчивые изоляты в Новосибирске, входящие в кластера В, БиМ, по ряду генетических признаков относятся к Пекинским штаммам.

£3,93%

2,95%

5,93%

1.77%

1,18%

1,77%

4.12%

1,13%

13,4®

;,аэ%

2,35%

1,13е.:

3.53%

33,83%

40, €%

0,53%

i«, кв. и:.пз. ta es. с. но

131.133. 131,13?, 1С. 1«. 146,117 ■IV, Е. 1-2.1*1. К. УЛ.

-gs.». tasi -чТгга^Р

—iF-

íl.'53.í<,'H,í>¡.ó7.( Й.Г-.Тс, Ti. 85. С.

о,».«.«i ,«,«. вс, ra, L т.кг.|11.|1б. ir. из. и?, ir. i:í. ^

I», CS, VE. 153, I», III,IV?,Ш,1В, II». 131. 155, IJ9. I®. 163.161. 1«. ■ KT.KM^S.S_

Ч£ЖНЖЖ?_|М I й 'iN

[PiO

-(в.— о;. I;i')R

i!'4iV

{jS S. 121 IW

Рисунок 8. Сводное филогенетическое древо 170 изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске. Латинскими буквами справа обозначены генотипы изолятов. В процентах на ветвях древа указан процент гомологии между изолятами, находящимися в ветви.

Исследование механизмов возникновения и распространения МЛУ-штаммов М. tuberculosis

Увеличение доли резистентных изолятов М. tuberculosis среди циркулирующих штаммов может происходить либо в результате селекции устойчивых мутантов при лечении, либо при инфицировании устойчивыми штаммами. При преобладании селекционного механизма следует ожидать равномерного распределения мутаций Ser531-^Leu (ген гроВ) среди кластеров изолятов М. tuberculosis. В случае преобладания инфицирования устойчивыми мутантами М. tuberculosis, должны выделяться некоторые кластеры, в которых доля штаммов с данными мутациями будет статистически достоверно выше.

Для определения механизмов распространения МЛУ-штаммов М. tuberculosis нами было проанализировано распределение частоты встречаемости мутаций в генах гроВ среди генотипов, выявленных при анализе 170 изолятов из Новосибирска. Достоверность различия частот встречаемости мутаций в различных кластерах оценивали по критерию хи-квадрат.

В результате анализа достоверности различия частот появления мутации Ser531 ->Leu в гене гроВ в популяции больных из Новосибирска, установлено:

- частота появления мутации среди кластеризующихся штаммов М. tuberculosis (66,7%, кластер ABCDEFGHI, рис. 8.) достоверно выше, чем частота у некластеризующихся изолятов (35,9%, кластер JKLMNOPQRSTUVWXYZ, рис. 8.), устойчивых к рифампицину (критерий хи-квадрат, Р=0,05);

- в кластере G встречаемость данной мутации достоверно выше, чем в среднем по выборке - 75% (критерий хи-квадрат, Р=0,001);

- в кластере В частота мутации Ser53ILeu достоверно не отличается от средних значений по выборке (хи-квадрат, Р=0,45). Аналогично и для остальных малочисленных кластеров.

Следовательно, мутация Ser531Leu в гене гроВ встречается у изолятов всех идентифицированных генотипов, однако намного чаще в кластере G. Такой характер распределения мутации согласуется с предположением о доминировании распространения, а не селекции, в формировании популяции рифампицин-

устойчивых изолятов и мы можем предположить, что штаммы М. tuberculosis из этого кластера ранее приобрели маркерную мутацию резистентности к рифампицину и теперь активно распространяются в популяции города Новосибирска.

Популяционное исследование лекарственно-устойчивого туберкулеза в Новосибирской области

Генотипирование выборки методом IS6110 ПДРФ

Для оценки генетического разнообразия штаммов М. tuberculosis в Новосибирской области была создана рандомизированная выборка из 230 изолятов, из которой в результате генотипирования удалось проанализировать 173 изолята.

По полученным результатам типирования с использованием критерия UPGMA и метода объединения ближайших соседей было построено древо филогенетического родства штаммов М. tuberculosis, (рис. 9).

Рисунок 9. Распределение типов лекарственной устойчивости по кластерам ПДРФ древа. Черными квадратами показаны устойчивость штамма к противотуберкулезному препарату. В первой строке - устойчивость к изониазиду, во второй - к рифампицину, в третьей - к стрептомицину, в четвертой - к канамицину, в пятой - к этамбутолу, в шестой - к протионамиду. Красным цветом отмечено расположение на древе генотипов с МЛУ. Желтым отмечен кластер МЛУ-штаммов.

Было выявлено 157 генотипов. 24% изолятов кластеризованы. Ветвь № 2, образована штаммами, имеющими типичный для штаммов Beijing ПДРФ - профиль. В среднем по выборке встречаемость МЛУ-штаммов равна 21,4%. В составе ветви №2, был выявлен кластер с содержанием в нем МЛУ-штаммов 60,7%. Генотип этого кластера статистически значимо чаще ассоциирован с множественной лекарственной устойчивостью (р<0,00001, по критерию хи-квадрат).

18

Генотипирование выборки методом У1ЧТ11

Чтобы проверить, не являются ли обнаруженные на ми кластеры на древе генетически неоднородными, мы воспользовались вторым методом генотипирования по 12 МИШ и 3 ЕТЯ локусов дополнительно. В результате было построено филогенетическое древо (рис. 10.).

5

Рисунок 10. Распределение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью по ветвям УКТИ древа. Черными квадратами показаны устойчивость штамма к противотуберкулезному препарату. В первой строке - устойчивость к изониазиду, во второй - к рифампицину. в третьей - к стрептомицину, в четвертой - к канамицину, в пятой - к этамбутолу. в шестой - к протионамиду. Красным цветом отмечено расположение на древе генотипов с МЛУ. Желтым отмечен кластер МЛУ-штаммов.

В популяции было выявлено 117 генотипов. 32% изолятов кластеризовано. Древо содержит 17 кластеров. В результате распределения были выявлены 2 кластера в древе, в которых встречаемость МЛУ-штаммов статистически значимо отличалась от среднего по выборке.

Кластер, в который входят УЖИ генотипы 2023325 1 831524|ши334524 (индексами обозначены возможные значения кода в данном локусе) содержит 71,4% штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Среднее по выборке содержание МЛУ-штаммов - 21,4%. Частота встречаемости МЛУ в этом кластере значимо отличается от среднего (р<0,00001, по критерию хи-квадрат).

Второй кластер - генотип 223325177535424. В этом кластере содержится 75% штаммов с МЛУ, что более чем в 3 раза превышает среднее значение по всей выборке (р<0,00001, по критерию хи-квадрат).

Таким образом, наличие данных генотипов позволяет ожидать с вероятностью 0,71 или 0,75 соответственно у клинических изолятов наличие множественной лекарственной устойчивости.

Выявление штаммов Beijing сполиготипированием

Для оценки наличия в исследуемой выборке штаммов Beijing, были случайным образом отобраны 24 изолята и определены их сполиготипы. Было показано, что 18 изолятов относятся к группе Пекинских штаммов, а 6 - нет. Изучая расположение Пекинских и не Пекинских штаммов на ветвях дендрограммы было установлено, что ветвь №2 в IS6110 ПДРФ древе и ветви №2 и 4 в VNTR древе, скорее всего, состоят из Пекинских штаммов.

Ранее выявленные нами кластеры с высоким содержанием МЛУ (71 и 75% по VNTR, или 60,7% по ISöllO-ПДРФ) также входят в ветви, сформированные Пекинскими штаммами.

Мы не обнаружили достоверного различия между частотами встречаемости МЛУ у Пекинских и остальных штаммов. Тем не менее, Пекинские штаммы неоднородны и в них есть генотипы, однозначно ассоциированные с высоким уровнем МЛУ-изолятов в них.

Анализ выборки двумя методами генотипирования одновременно

В работе были использованы VNTR и IS6110 ПДРФ: эти методы оценивают вариабельность разных участков тенома, а значит, построение филогенетического древа по результатам обоих методов увеличит дискриминирующую силу анализа.

При построении древа использовался пакет Bionumerics (Applied Math) и статистические веса результатов обоих методов генотипирования считались равнозначными. В результате исследуемая выборка разбилась на 5 ветвей (рис. 11.).

Анализ распределения изолятов с установленными сполиготипами по ПДРФ-VNTR древу выявил, что ветвь №2 (рис. 11.), которая содержала 83 изолята (48%), видимо, образована Пекинскими штаммами.

Рисунок 11. Распределение лекарственной устойчивости и места жительства по ветвям ПДРФ-УМТЛ древа. Черными квадратами показаны устойчивость штамма к противотуберкулезному препарату. В первой строке - устойчивость к изониазиду, во второй - к рифампицину, в третьей - к стрептомицину, в четвертой - к канамицину, в пятой - к этамбутолу, в шестой - к протионамиду. Красным цветом отмечено расположение на древе генотипов с МЛУ. Желтым отмечен кластер МЛУ-штаммов. Светло-синим цветом помечены изоляты, совпавшие по генотипу, профилю лекарственной устойчивости и району проживания.

Исследование распределения лекарственной устойчивости по ветвям объединенного дерева позволило выявить две ветви, в которых уровень МЛУ был статистически выше, чем в среднем по выборке (89% и 100%, критерий хи-квадрат, р<0,00001). В этих ветвях относительная доля МЛУ-штаммов была выше, чем в аналогичных ветвях, выявленных 186110- или УЫТЯ-методами.

Таким образом, для штаммов М шЬегЫоягз, циркулирующих в Новосибирской области, недостаточно использовать для исследования эпидемиологических связей только один метод типирования. Необходимо применять не менее двух методов геногшшрования, использующих разные системы маркеров, и учитывать дополнительную информацию (место проживание больного, спектр лекарственной устойчивости и т.п.).

Выводы:

1. Установлено, что в 86% образцов чистых культур М. tuberculosis результаты определения устойчивости «ТБ-биочипом» совпадают с результатами определения микробиологическим методом.

2. Показано, что «ТБ-биочип» может быть использован для выявления МЛУ-штаммов, так как 91% изолятов, устойчивых к рифампицину, также резистентен и к изониазиду.

3. Усовершенствована технология использования биочипа за счет совмещения двух последовательных стадий ПЦР в одной пробирке, многократной регенерации, позволяющая значительно удешевить процесс.

4. В ходе изучения механизмов возникновения и распространения МЛУ штаммов М. tuberculosis молекулярно-генетическими методами установлено, что устойчивые изоляты селектировались в ходе лечения и к 2001-2003 гг получили значительное распространение среди населения Новосибирской области, где сформировали очаги заболеваемости МЛУ формами туберкулеза.

5. Различными методами типирования установлено, что в Новосибирской области доминируют штаммы Пекинского семейства, и их доля превышает 48%.

6. Выяснено, что Пекинские штаммы, циркулирующие в Новосибирской области, генетически неоднородны. Впервые комбинацией двух методов генотипирования - 1S6110 и VNTR - среди Пекинских штаммов выявлены две генетических группы, в которых частота встречаемости МЛУ (89 и 100% соответственно) была достоверно выше, чем в среднем по выборке.

7. Показано, что для выявления эпидемиологических связей между больными недостаточно использовать только один из методов генотипирования. В Новосибирской области комбинация IS6110 и MIRU дает достаточное разрешение для определения эпидемиологических связей между конкретными больными.

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Попова А.Г., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Татьков С.И., Ильичев А.А. // Генетический полиморфизм клинических штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории Новосибирской области, Вестник РАМН, №1, 2005. с.20-23.

2. Татьков С.И., Норкина О.В., Филипенко M.JL, Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Киншт В.Н., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Медведева Е.В., Баранова О.И., Ивлев-Дунтау А.П., Боднев С.А., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д. // Молекулярно-генетическая характеристика устойчивых к рифампицину и/или изониазиду изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных в Новосибирской и Томской областях, Вестник РАМН, №7,2005, с. 26-36.

3. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Боднев С.А., Медведева Е.В., Баранова О.И., Ивлев-Дунтау А.П., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д., Татьков С.И // Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции рифампицин- и/или изониазид-устойчивых изолятов М. tuberculosis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №2,2006, с. 20-25.

4. Татьков С.И., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Медведева Е.В., Ивлев-Дунтау А.П., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. // Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis в Новосибирской и Томской областях. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №4, 2007, с. 9-15.

5. Воронкова О.В., Новицкий В.В., Уразова О.И., Татьков С.И., Сивков А.Ю., Рябова Е.А., Хасанова P.P. // Генетическая гетерогенность штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Томской области. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика, №2,2007, с. 21-27.

Список патентов, оформленных по теме диссертации: Болдырев А.Н. Сивков А.Ю. Татьков С.И. Способ регенерации нуклеотидных биочипов. Патент № 2270870 от 25.12.2003

Доклады и тезисы конференций:

1. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Татьков С.И. Анализ популяции рифампицин устойчивых изолятов М. tuberculosis модифицированным методом определения мутаций в гене гроВ с помощью биочипов. Труды конф. «Межрегиональная научная конференция посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова», Томск 7-10 октября 2003 г.

2. Сивков А.Ю., Цильковская И.В., Болдырев А.Н., Татьков С.И. Исследование филогенетических связей между изолятами М. tuberculosis в г. Новосибирске с помощью метода обратной IS6110 ПЦР. Труды конф. «Межрегиональная научная конференция посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова», Томск 7-10 октября 2003 г.

3. Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Использование полимеразной цепной реакции для одновременного определения инфицированное™ пациента туберкулезом и устойчивости к рифампицину. Труды конф. «Межрегиональная научная конференция посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова», Томск 7-10 октября 2003 г.

4. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Медведева Е.В., Дунтау А.П., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Оценка эффективности применения биочипа для определения изолятов устойчивых к рифампицину. Труды конф. «Межрегиональная научная конференция посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова», Томск 7-10 октября 2003 г.

5. Сивков А.Ю. Анализ популяции рифампицин устойчивых изолятов М. tuberculosis модифицированным методом определения мутаций в гене гроВ с помощью биочипов. XIV научная конференция-конкурс молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» 26-27 июня 2003г.

6. Боднев С.А., Сивков А.Ю. Метод ЦбПОПЦР: Быстрый и доступный способ эпидемиологического исследования распространения и циркуляции штаммов М. tuberculosis. XIV научная конференция-конкурс молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» 26-27 июня 2003г.

7. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Ивлев-Дунтау А.П., Блинова JI.H., Пасечников А.Д., Татьков С.И. Система для быстрого выявления лекарственно-устойчивых изолятов M. tuberculosis с помощью биочиповой технологии. Симпозиум «Интегративная медицина в XXI веке», Судак 2004 г.

8. С.И.Татьков, А.Н.Болдырев, А.Ю.Сивков, С.А.Боднев, Г.А.Кузьмичева, О.Ю.Смирнова, М.Ш.Азаев, Ю.В.Туманов, А.П.Дунтау, Е.В.Медведева, Г.М.Лисиченко, Ю.Н.Курунов, В.А.Краснов, О.И.Уразова, А.К.Стрелис, О.В.Сурикова, М.Л.Филиппенко, Л.Н.Блинова, А.Д.Пасечников Генотипический анализ MDR-штаммов M. tuberculosis, распространенных на территории Новосибирской и Томской областей. Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», 8-10 сентября 2004 г. ГНЦ ВБ «Вектор».

9. Sivkov A.Yu., Tatkov S.I, Evaluation oligonucleotide chips for détection rifampin and isoniazid résistant M. tuberculosis 26lh Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology Istanbul, Turkey in June 26-29, 2005.

10.С.И. Татьков, А.Ю. Сивков, Г.A. Кузьмичева, О.Ю. Смирнова, М.Л. Филипенко, М.А. Рот, А.В. Свистельник, Г.М. Лисиченко, В.А. Краснов, K.D. Eisenach Изучение разнообразия штаммов M. tuberculosis, распространенных в сельских районах Новосибирской области, методами RFLP6110, MIRU и сполиготипирования // Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирская обл., санаторий «Сосновка», 25-27 октября 2005 г.

И.А.Ю. Сивков, А.Н. Болдырев, Е.В. Медведева, А.П. Ивлев-Дунтау, С.И. Татьков Применение олигонуклеотидных чипов для определения штаммов M. tuberculosis, устойчивых к рифампицину и/или изониазиду // Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирская обл., санаторий «Сосновка», 25-27 октября 2005 г.

12. А.Ю. Сивков, А.Н. Болдырев, Е.В. Медведева, А.П. Ивлев-Дунтау, Л.Н. Блинова,

С.И. Татьков Определение причин распространения MDR-штаммов на основе

анализа популяции рифампицин- и/или изониазид-устойчивых изолятов М.

tuberculosis II Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика

25

инфекционных болезней», Новосибирская обл., санаторий «Сосновка», 25-27 октября 2005 г.

13.А.Ю. Сивков, О.Ю. Смирнова, M.JI. Филипенко, М.А. Рот, С.И. Татьков. Исследование структуры популяции микобактерий туберкулеза в Новосибирской области // III Российская конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г.Новосибирск, 27-29 сентября 2006 г.

14. С.И. Татьков, А.Ю. Сивков, А.Н. Болдырев, О.Ю. Смирнова, Ю.В. Туманов Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis в Новосибирской и Томской областях// III Российская конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г.Новосибирск, 27-29 сентября 2006 г.

15.Воронкова О.В., Новицкий В.В., Уразова О.И., Стрелис А.К., Татьков С.И., Сивков А.Ю., Рябова Е.А., Наследникова И.О., Колоколова О.В. Особенности молекулярной эпидемиологии туберкулеза в Томской области // Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова 9-12 сентября 2007, Томск, с.8-9.

16. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis в Новосибирской и Томской областях // Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова 9-12 сентября 2007, Томск, с.12-13.

17.Татьков С.И., Сивков А.Ю. Оценка распространенности генотипа Beijing микобактерий туберкулеза в Новосибирской области и его вклад в формирование пула лекарственно-устойчивых изолятов // Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова 9 -12 сентября 2007, Томск, с.14-15.

18. Филипенко М.Л., Рот М., Штейгер Н., Татьков С.И., Сивков А.Ю. Сравнительный анализ различных методов идентификации штаммов Mycobacterium tuberculosis пекинской семьи // Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова 9-12 сентября 2007, Томск, с.238-239.

Сивков Антон Юрьевич

Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 10.11.2008. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сивков, Антон Юрьевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР "ИЗУЧЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

ТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДАМИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ".

Общая характеристика микобактерий туберкулеза.

Применение генотипирования микобактерий.

Генотипирование на основе изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Генотипирование по IS6110.

PGRS-генотипирование.

Двойная ПЦР повторяющихся элементов (double - repetitive - element PCR).

GTG)5-THnnpoBaHHe.

AFLP.

IS6110 ПЦР.

Полугнездовая IS6110 ПЦР.

VNTR.

Сполиготипирование.

Сравнительная характеристика различных методов генотипирования.

Филогенетический анализ результатов генотипирования.

Методы кластерного анализа.

Меры расстояния между нзолятами.

Методы определения расстояния между кластерами.

Методы кластеризации данных.

Интерпретация результатов генотипирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование распространенности штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Новосибирской области"

Актуальность проблемы

На сегодняшний день около трети населения инфицировано микобактериями туберкулеза (WHO, 2008). Особенно опасными являются микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), устойчивые к двум самым мощным противотуберкулезным препаратам - изониазиду и рифампицину. Появляются такие штаммы как следствие неправильного употребления противотуберкулезных препаратов в ходе лечения заболевания (WHO, Nov. 2007). Каждый год во всем мире заболевают МЛУ-формами туберкулеза около 400 тыс. лиц (WHO, June 2007). Для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью требуется более длительная терапия препаратами второй линии, которые стоят дороже и вызывают больше побочных эффектов (WHO, 2008).

При неправильном лечении больных МЛУ-формами туберкулеза противотуберкулезными препаратами второй линии у них могут быть отселектированы штаммы М. tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) (WHO, 2008). Такие штаммы устойчивы не только к рифампицину и изониазиду, но и ко всем фторхинолонам и, как минимум, к одному из трех инъекционных препаратов второй линии (капреомицину, канамицину или амикацину). Они способны распространяться воздушно-капельным путем в популяции и с трудом поддаются лечению (WHO, June 2007). Особенно опасно то, что течение заболевания после инфицирования ШЛУ или МЛУ штаммами не отличается от обычного туберкулеза. В развитых странах с наилучшими на сегодня системами диагностики и лечения туберкулеза удалось добиться излечения больных ШЛУ-туберкулезом лишь в 30% случаев (WHO, 2008).

По данным ВОЗ, на конец 2007 года уже в 35 странах были обнаружены ШЛУ-штаммы М. tuberculosis (WHO, Nov. 2007). В России, по-видимому, эти штаммы также получили распространение. Только в Томской области в течение 2002-2005 гг. было выявлено 30 ШЛУ-штаммов среди исследованных 458 МЛУ-изолятов (6,6%) (WHO, 2008). Дальнейшее распространение ШЛУ- и МЛУ-штаммов угрожает, по мнению ВОЗ, возникновением эпидемии туберкулеза, для лечения которого доступных на сегодняшний день лекарственных средств будет недостаточно (WHO, 2008).

В ВОЗ была принята программа борьбы с распространением МЛУ- и ШЛУ-туберкулеза в мире. Программа начала осуществлятся с 2008 года. Общий бюджет на 2008-2009 гг. сотавляет около 2,15 млрд долларов США (WHO, June 2007). Среди важнейших целей программы находятся усиление и расширение надзора за МЛУ- и ШЛУ-туберкулезом; и поддержка исследований, направленных на создание новых тест-систем для быстрого выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза (WHO, June 2007).

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование распространенности МЛУштаммов М. tuberculosis в Новосибирской области.

Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач.

1. Оценить возможность определения устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с помощью биочипа.

2. Определить доминирующие механизмы возникновения и распространения М Л У-штам мов.

3. Выявить очаги заболеваемости лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза на территории Новосибирской области.

Научная новизна

• При параллельном исследовании лекарственной устойчивости к рифампицину чистых культур микобактерий туберкулеза бактериологическим методом и с помощью биочипа было установлено, что результаты совпадают в 86% случаев.

• Одной из возможных причин несовпадения результатов может быть присутствие в клинических изолятах смеси устойчивых и чувствительных штаммов. Следовательно, положительный результат определения лекарственной устойчивости может быть использован при принятии решения о выборе противотуберкулезных препаратов, а отрицательный -нет. Если биочипом изолят определяется, как чувствительный, необходимы дополнительные исследования его лекарственной устойчивости.

• Продемонстрирована на примере штаммов, циркулирующих в Новосибирской области, возможность использования биочипа, определяющего только устойчивость к рифампицину, для выявления МЛУ-изолятов М. tuberculosis, поскольку в 91% случаев устойчивость к рифампицину ассоциирует с множественной лекарственной устойчивостью.

• Показано, что в Новосибирской области доминируют штаммы Пекинского семейства. Их доля составляет не менее 48%.

• Показано, что Пекинские штаммы, циркулирующие в Новосибирской области, генетически неоднородны. Впервые комбинацией двух методов генотипирования - IS6110 и MIRU - среди Пекинских штаммов выявлены две генетических группы, в которых доминировали МЛУ-изоляты (89 и 100% соответственно).

• Впервые молекулярно-генетическими методами были исследованы причины распространения лекарственно-устойчивых штаммов в регионе. Установлено: МЛУ-штаммы возникают в специализированных противотуберкулезных учреждениях, оттуда они попадают в популяцию, где и формируют очаги заболевания МЛУ-формами туберкулеза. Очаги МЛУ-туберкулеза не совпадают с очагами заболевания лекарственно-чувствительным туберкулезом.

Практическая значимость

Разработан и запатентован способ регенерации полинуклеотидных биочипов, который с успехом был применен и для регенерации объемных полиакриламидных чипов. С его помощью удалось до восьми раз регенерировать полинуклеотидные биочипы.

Удалось усовершенствовать методику применения биочипа для определения устойчивости к рифампицину путем совмещения двух стадий ПЦР в одной пробирке. Разработанная методика может быть использована при массовых скрининговых исследованиях устойчивости к рифампицину и выявлении МЛУ-штаммов М. tuberculosis.

Использование разработанного нами усовершенствованного метода определения устойчивости к рифампицину с помощью биочипа поможет снизить вероятность кросс-контаминации при проведении массовых исследований, значительно удешевляет стоимость анализа и резко повышает его производительность. Предложенная нами методика может быть использована при массовом мониторинге штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и изучения их географического распространения в регионе.

Положения, выносимые на защиту

1. Использование ТБ-Биочипа позволяет определять устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину.

2. Предложенный метод наработки одноцепочечного меченого фрагмента ДНК позволяет совместить две стадии ПЦР в одной пробирке без изменений в специфичности и чувствительности анализа мутаций с помощью биочипа.

3. Полиакриламидные биочипы могут быть регенерированы до 8 раз.

4. Среди изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске и Новосибирской области, преобладают штаммы, относящиеся к Пекинскому семейству.

5. Среди Пекинских штаммов выделяются генетические группы, в которых встречаемость МЛУ выше, чем в среднем по семейству.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 160 работ: 18 - отечественных авторов и 142 - зарубежных. Работа иллюстрирована 55 рисунками и включает 6 таблиц.

Апробация работы и публикации

Полученные результаты исследований были представлены: на «Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова» (Томск, Россия, 2003), XIV научной конференции-конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск, Россия, 2003), симпозиуме «Интегративная медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, Россия, 2004), 8

Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», (Новосибирск, Россия, 2005), «26lh Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology», (Istanbul, Turkey, 2005), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущиио, Россия, 2006), III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова (Томск, Россия, 2007).

Работа «Оценка вклада генотипа Beijing в формирование лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Новосибирской области» была представлена на конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007) и награждена медалью Конгресса.

По материалам диссертации был получен патент № 2270870 от 25.12.2003 «Способ регенерации нуклеотидных биочипов» Болдырев А.Н. Сивков А.Ю. Татьков С.И.

По материалам диссертации было опубликовано 5 статей, все в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа была выполнена соискателем в 2002-2006 гг. в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проектов МНТЦ №2019 и №1980, а также госпрограммы РФ (договор № 03/2512/1).

На разных этапах в работе принимали участие Татьков С.И., Болдырев А.Н., Боднев С.А., Туманов Ю.В., Кузьмичева Г.А., Азаев М.Ш., Ивлев-Дунтау А.П., Филипенко М.Л., Рот М.А., Цильковская И. Всем им автор приносит искреннюю благодарность.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сивков, Антон Юрьевич

Выводы:

1. Как было установлено, в 86% образцов чистых культур М. tuberculosis результаты определения устойчивости биочипом совпадают с результатами определения микробиологическим методом. В 10% чистых культур, выделенных из мокроты больных, биочип детектировал смесь устойчивых и чувствительных штаммов, вследствие чего результаты определения лекарственной устойчивости не совпадали с полученными на среде Левенштейна-Йенсена.

122

2. «ТБ-биочип» может быть использован для выявления МЛУ-штаммов, так как 91% изолятов, устойчивых к рифампицину, также резистентен и к изониазиду,

3. Усовершенствование методики использования биочипа - совмещение двух последовательных стадий ПЦР в одной пробирке и многократная регенерация биочипа - позволяет значительно удешевить применение биочипа и использовать его для скрининга больших популяций.

4. В ходе изучения механизмов возникновения и распространения МЛУ-штаммов М. tuberculosis молекулярно-генегическими методами было установлено, что устойчивые изоляты, хотя и селектируются в ходе лечения, уже к 2001-2003 гг получили значительное распространение среди населения Новосибирской области, где к этому времени уже были сформированы очаги заболевания МЛУ-формами туберкулеза.

5. Различными методами типирования установлено, что в Новосибирской области доминируют штаммы Пекинского семейства. Их доля составляет не менее 48%.

6. Пекинские штаммы, циркулирующие в Новосибирской области, генетически неоднородны. Впервые комбинацией двух методов генотипирования - IS6110 и VNTR - среди Пекинских 'штаммов выявлены две генетических группы, в которых частота встречаемости МЛУ (89 и 100% соответственно) была достоверно выше, чем в среднем по выборке.

7. Показано, что для выявления эпидемиологических связей между больными недостаточно использовать только один из методов генотипирования. Необходимо применять как минимум два. Комбинация IS6110 и MIRU дает очень высокое разрешение и может быть использована для изучения эпидемиологических связей между конкретными больными.

Заключение

Итак, изучение распределения новых случаев заболевания по районам Новосибирской области позволило выявить очаги эпидемии туберкулеза. В четырех районах области (Венгеровском, Колыванском, Коченевском и Тогучинском) уровень заболеваемости туберкулезом превысил 200 случаев на сто тысяч населения в 2000-2005 гг.

Также неравномерно были распределены случаи заболевания туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью. В Сузунском и Северном районах доля МЛУ-туберкулеза среди впервые выявленных больных, составила 25-30%. Очевидно, в Новосибирской области существуют два типа очагов заболевания туберкулезом. В первом доминируют штаммы, чувствительные к противотуберкулезным препаратам или имеющие спектр лекарственной устойчивости, не относящийся к МЛУ. Во втором - преобладают МЛУ-штаммы. Таким образом, в Новосибирской области к 2004 году уже сформировались очаги с заболеваемостью туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью.

Большинство впервые выявленных больных туберкулезом относилось к категориям неработающих (62,8%) и рабочих (23,2%).

В нашем регионе устойчивость к рифампицину является надежным признаком наличия множественной лекарственной устойчивости, и выявление устойчивости к рифампицину любым экспресс-методом с вероятностью 91% поможет быстро определить МЛУ-штаммы М. tuberculosis.

Как нами было установлено, одним из эффективных методов определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis является биочиповый метод. Особенно эффективен этот метод для определения устойчивости к рифампицину, поскольку обе стадии полимеразной цепной реакции могут быть проведены в одной пробирке, а биочип после анализа может быть многократно регенерирован. Использование разработанного нами усовершенствования метода определения устойчивости к рифампицину снижает вероятность кросс-контаминаций, значительно удешевляет стоимость анализа и резко повышает его производительность. Предложенная нами методика может быть использована при массовом мониторинге штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и изучения их географического распространения в регионе.

Вместе с тем было установлено, что биочип приблизительно в 10% случаев дает иные значения лекарственной устойчивости к рифампицину, чем микробиологический метод. Согласно нашим наблюдениям, причиной такого разночтения является присутствие в анализируемых культурах смеси резистентных и чувствительных штаммов. В этой связи важно подчеркнуть, что результат определения лекарственной чувствительности с помощью биочипа следует принимать во внимание тогда, когда биочип выявляет лекарственную устойчивость. В противном же случае необходимо дополнительные исследования, например, с помощью ПЦР реального времени, которая может выявлять присутствие в смеси культур 1% лекарственно-устойчивого штамма.

Исследование генетического многообразия популяции М. tuberculosis в

Новосибирской области выявило доминирование штаммов, относящихся к

Пекинскому семейству. По нашим данным, на их долю приходится не менее 48%.

Штаммы Пекинского семейства, выявленные на территории Новосибирской области, также неоднородны. Среди них методами генетического тппированпя

121 были выявлены как в Новосибирске, так и в области, высоко гомологичные группы, которые ассоциируют с высокой встречаемостью среди них МЛУ. Другие группы Пекинских штаммов не ассоциированы с наличием множественной лекарственной устойчивости. Полученные данные позволяют предположить, что генетические особенности некоторых близкородственных групп штаммов благоприятствуют приобретению ими множественной лекарственной устойчивости. В дальнейшем, представляется крайне интересным исследовать более подробно генетические свойства этих штаммов, их вирулентность, трансмиссивность и фитнес, чтобы понять причины, почему именно среди них так часто встречаются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.

Среди генетических причин возникновения устойчивости к рифампицину оказался тот же набор мутаций, который был описан в литературе. Также как и в других регионах, наиболее часто выявлялась мутация Ser531Leu.

Применение для анализа гетерогенности популяции Новосибирской области одновременно нескольких методов типирования показало, что для надежного определения эпидемиологических связей между больными молекулярно-генетнческими методами одного метода генотипирования недостаточно. Кластеры, выделяемые методом ПДРФ-186110, или MIRU-VNTR, при совместном использовании обоих методов для типирования разрешаются на индивидуальные штаммы или малочисленные кластеры (2 изолята). Таким образом, поскольку в нашем регионе широкое распространение получили штаммы Пекинского семейства, которые образуют хотя и дивергентную, но генетически однородную группу, для выявления эпидемиологических связей необходимо применять не менее двух методов генотипирования, использующих разные системы маркеров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сивков, Антон Юрьевич, Кольцово

1. Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Татьков С.И. // Способ регенерации одноразовых нуклеотидных биочипов, используемых в анализах с флуоресцентными метками. Патент РФ №2270870 от 25 декабря 2003 г.

2. Генерозов Э.В., Акопиан Т.А., Говорун В.М. и др. // Генодиагностика в современной медицине. Материалы 3-ей всероссийской конференции.-2000.-С.273-274.

3. Генерозов Э.В., Т.А. Акопян, М.А. Владимирский, Л.К. Шипина, О.А. Пртуганова, В.М. Говорун. Прямой генетический анализ резистентности к рифампицину изолятов М. tuberculosis в образцах мокроты. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2003.-№4.-С.49-52.

4. Краснов В. А. Состояние противотуберкулезной помощи населению Сибирского и Дальневосточного федеральных округов // 2004.

5. Литвинов В.И., Сельцовский П.П. Туберкулез: проблемы и перспективы. // Сборник.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы.-2000.-№9-С.13.

6. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В. . Молекулярно-генетическая характеристика микобактерий туберкулеза, выделенных в северо-западном регионе России. // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы.-2000.-С.210-211.

7. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Огген Т.Ф., Вишневский Б.И. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов М. tuberculosis, выделенных на северо-западе России. // Проблемы туберкулеза.-1999.-№3.-С.39-41.

8. Норкина О.В., Филипенко М.Л., Никонова А.А., Татьков С.И. и др. Молекулярно-генетическая характеристика устойчивых к рифампицину изолятов М. tuberculosis, выделенных в Новосибирске. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2003.-№12.-С.22-26.

9. Самойлова А.Г., А.О. Марьяндышев. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза актуальная проблема фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2005.-№7.-С.3-9.

10. Тунгусова О.С., А.О. Марьяндышев. Молекулярная генетика туберкулеза. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2003.-№11.-С.39-42.

11. Тунгусова О.С., А.О. Марьяндышев. Использование математических моделей для интерпретации эпидемеческой ситуации по туберкулезу. // Проблемы туберкулеза и болезни легких.-2006.-№9.-С.23-26.

12. Урсов И.Г. Эпидемиология туберкулёза. // Эпидемиология туберкулёза.-1997.-С.170.

13. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика.-1995, № 5.-С.600-610.

14. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Манзенюк О.Ю. и др. Использование молекулярно-биологических методов для индивидуальной характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Журн. микробиол.-2000.-№2.-С.6-11.

15. Albert H., Trollip A. P., Mole R. J., Hatch S. J., Blumberg L. Rapid indication of multidrug-resistant tuberculosis from liquid cultures using FASTPlaqueTB-RIF, a manual phage-based test. // Int J Tuberc Lung Dis.-2002.-Vol.6.-P.523-8.

16. Avkan Oguz V., C. Eroglu, S. Guneri, N. Yapar, A. Oztop, A. Sanic, A. Yuce. RpoB gene mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in the Aegean region of Turkey. 11 J Chemother.-2004.-Vol.l6.-P.442-5.

17. Billington О. J., Т. D. McHugh, S. H. Gillespie. Physiological Cost of Rifampin Resistance Induced In Vitro in Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemother.-1999.-Vol.43 .-P. 1866-1869.

18. Bottger E. С., M. Pletschette, D. Andersson. Drug resistance and fitness in Mycobacterium tuberculosis infection. // J Infect Dis.-2005.-Vol. 191.-P.823-4.

19. Bottger EC Springer B, Pletschette M, Sander P. Fitness of antibiotic-resistant microorganisms and compensatory mutations. // Nat Med.-1998.-VoI.Dec;4(12).-P.1343-4.

20. Breese P. E., Burman W. J., Hildred M., Stone В., Wilson M. L., Yang Z., Cave M. D. The effect of changes in laboratory practices on the rate of false-positive cultures for Mycobacterium tuberculosis. // Arch Pathol Lab Med.-2001.-Vol.125.-P.1213-1216.

21. Zaman, F. Portaels, N. Rastogi C. Sola. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. // BMC Microbiol.-2006.-Vol.6.-P.23.

22. Burgos M.V., A. S. Pym. Molecular epidemiology of tuberculosis. // Eur Respir J Suppl.-2002.-Vol.36.-P.54-65.

23. Cave M. D., K. D. Eisenach, P. F. McDermott, J. H. Bates, J. T. Crawford. IS6110: conservation of sequence in the Mycobacterium tuberculosis complex and its utilization in DNA fingerprinting. // Mol Cell Probes.-1991.-Vol.5.-P.73-80.

24. Cave M. D., K. D. Eisenach, G. Templeton, M. Salfinger, G. Mazurek, J. H. Bates, J. T. Crawford. Stability of DNA fingerprint pattern produced with IS6110 in strains of Mycobacterium tuberculosis. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P.262-6.

25. Chaves F., M. Alonso-Sanz, M. J. Rebollo, J. C. Tercero, M. S. Jimenez, A. R. Noriega. RpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. // Int J Tuberc Lung Dis.-2000.-Vol.4.-P.765-70.

26. Cole S. T. Comparative mycobacterial genomics. // Curr. Opin. Microbiol.-1998.-Vol.l.-P.567-571.

27. Collins D. M., D. M. Stephens. Identification of an insertion sequence, IS 1081, in Mycobacterium bovis. // FEMS Microbiol Lett.-1991.-Vol.67.-P.l 1-5.

28. Cummings M. P., M. R. Segal. Few amino acid positions in rpoB are associated with most of the rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. // BMC Bioinformatics.-2004.-Vol.5.-P. 137.

29. Dahle U. R., P. Sandven, E. Heldal, D. A. Caugant. Continued low rates of transmission of Mycobacterium tuberculosis in Norway. // J Clin Microbiol.-2003.-Vol.41.-P.2968-73.

30. Dahle U. R., P. Sandven, E. I-Ieldal, T. Mannsaaker, D. A. Caugant. Deciphering an outbreak of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. // J Clin Microbiol.-2003.-Vol.41.-P.67-72.

31. Dale J. W., R. M. Nor, S. Ramayah, Т. H. Tang, Z. F. Zainuddin. Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.1265-8.

32. Deng J. Y., X. E. Zhang, Y. Mang, Z. P. Zhang, Y. F. Zhou, Q. Liu, H. B. Lu, Z. J. Fu. Oligonucleotide ligation assay-based DNA chip for multiplex detection of single nucleotide polymorphism. // Biosens Bioelectron.-2004.-Vol.l9.-P.1277-83.

33. El-Hajj H., Salvatore A. E., Marras S., Tyagi F., R. Krame, D. Alland. Detection of Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis in a Single Tube with Molecular Beacons. //J. Clin. Microbiol.-2001.-Vol.39.-P.4131-4137.

34. Fang Z., N. Morrison, B. Watt, C. Doig, K. J. Forbes. IS6110 transposition and evolutionary scenario of the direct repeat locus in a group of closely related Mycobacterium tuberculosis strains. // J Bacteriol.-1998.-Vol.l80.-P.2102-9.

35. Fredricks D. N., D. A. Relman. Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. // Clin Infect Dis.-1999.-Vol.29.-P.475-86.

36. Friedman C. R., M. Y. Stoeckle, W. D. Johnson, Jr.L. W. Riley. Double-repetitive-element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. // J Clin Microbiol.-1995.-Vol.33.-P. 1383-4.

37. Frothingham R., H. G. Hills, К. H. Wilson. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P. 1639-43.

38. Frothingham R.W., A. Meeker-O'Connell. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. // Microbiology.-1998.-Vol. 144.-P. 1189-96.

39. Gagneux S., C. D. Long, P. M. Small, T. Van, G. K. Schoolnik, B. J. Bohannan. The competitive cost of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. // Science.-2006.-Vol.312.-P. 1944-6.

40. Garcia de Viedma D., Marin M., Ruiz M. J., Bouza E. Analysis of clonal composition of Mycobacterium tuberculosis isolates in primary infections in children. // J Clin Microbiol.- 2004.-Vol.42.-P.3415-3418.

41. Godfrey-Faussett P., N. G. Stoker, J. A. Scott, G. Pasvol, P. Kelly, L. Clancy. DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis do not change during the development of rifampicin resistance. // Tuber Lung Dis.-l993.-Vol.74.-P.240-3.

42. Goguet de la Salmoniere У. О., H. M. Li, G. Torrea, A. Bunschoten, J. van Embden, B. Gicquel. Evaluation of spoligotyping in a study of the transmission of Mycobacterium tuberculosis. // J Clin Microbiol.-1997.-Vol.35.-P.2210-4.

43. Gordon S. V., B. Heym, J. Parkhill, B. Barrell, S. T. Cole. New insertion sequences and a novel repeated sequence in the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. // Microbiology.-1999.-Vol.l45(Pt 4).-P.881-92.

44. Greifinger R., Grabau J., Quinlan A. et al. . Transmission of multidrug-resistant tuberculosis among immunocompromised persons in a correctional system. New York. 1991. //Morbid. Mortal.Weekly Rep.-1992.-Vol.V.41.-P.507-509.

45. Horgen L., C. Sola, A. Devallois, K. S. Goh, N. Rastogi. Follow up of Mycobacterium tuberculosis transmission in the French West Indies by IS6110-DNA fingerprinting and DR-based spoligotyping. // FEMS Immunol Med Microbiol.-1998.-Vol.21 .-P.203-12.

46. Huitric E., J. Werngren, P. Jureen, S. Hoffner. Resistance levels and rpoB gene mutations among in vitro-selected rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis mutants. // Antimicrob Agents Chemother.-2006.-Vol.50.-P.2860-2.

47. Ichiyama S., K. Suzuki. Clinical application of testing methods on acid-fast bacteria. // Kekkaku.-2005.-Vol.80.-P.95-111.

48. Jin D. J., C. A. Gross. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. // J Mol Biol.-1988.-Vol.202.-P.45-58.

49. Jones W. D. Bacteriophage typing of Mycobacterium tuberculosis cultures from incidents of suspected laboratory cross-contamination // Tubercle.-1988.-Vol.69.-P.43-46

50. Mani C., N. Selvakumar, S. Narayanan, P. R. Narayanan. Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India. // J Clin Microbiol.-2001.-Vol.39.-P.2987-90.

51. Mariam D. II., Y. Mengistu, S. E. Hoffner, D. I. Andersson. Effect of rpoB mutations conferring rifampin resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis. //Antimicrob Agents Chemother.-2004.-Vol.48.-P. 1289-94.

52. Mikhailovich V. M., S. A. Lapa, D. A. Gryadunov, B. N. Strizhkov, A. Y. Sobolev, О. I. Skotnikova, O. A. Irtuganova, A. M. Moroz, V. I. Litvinov, L. K.

53. Miller L. P., J. T. Crawford, Т. M. Shinnick. The rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemother.-1994.-Vol.38.-P.805-811.

54. Mokrousov I., E. Limeschenko, A. Vyazovaya, O. Narvskaya. Corynebacterium diphtheriae spoligotyping based on combined use of two CRISPR loci. // Biotechnol J.-2007.-Vol.2.-P.901-6.

55. Mokrousov I., T. Otten, B. Vyshnevskiy, O. Narvskaya. Allele-Specific rpoB PCR Assays for Detection of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Sputum Smears. //Antimicrob. Agents Chemother.-2003.-Vol.47.-P.2231-2235.

56. Morlock G. P., В. B. Plikaytis, J. T. Crawford. Characterization of spontaneous, In vitro-selected, rifampin-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv. // Antimicrob Agents Chemother.-2000.-Vol.44.-P.3298-301.

57. Murray M. Sampling bias in the molecular epidemiology of tuberculosis. // Emerg Infect Dis.-2002.-Vol.8.-P.363-9.

58. Murray M. Determinants of cluster distribution in the molecular epidemiology of tuberculosis. // Proc Natl Acad Sci U S A.-2002.-Vol.99.-P. 1538-43.

59. Murray M.D. Alland. Methodological problems in the molecular epidemiology of tuberculosis. //Am J Epidemiol.-2002.-Vol.l55.-P.565-71.

60. Murray M. B. Molecular epidemiology and the dynamics of tuberculosis transmission among foreign-born people. // Cmaj.-2002.-Vol.l67.-P.355-6.

61. Narvskaia О. V., I. V. Mokrousov, E. V. Limeshchenko, N. Steklova, T. F. Otten, В. I. Vishnevskij Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains prevalent in North-West of Russia by spoligotyping. // Probl Tuberk.-2002.-Vol.44-8.

62. Otal I., S. Samper, M. P. Asensio, M. A. Vitoria, M. C. Rubio, R. Gomez-Lus, C. Martin. Use of a PCR method based on IS6110 polymorphism for typing Mycobacterium tuberculosis strains from BACTEC cultures. // J Clin Microbiol.-1997.-Vol.35.-P.273-7.

63. Patel S., S. Wall, N. A. Saunders. Heminested inverse PCR for IS6110 fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains. // J Clin Microbiol.-1996.-Vol.34.-P. 1686-90.

64. Pym A.S., P. Domenech, N. Honore, J. Song, V. Deretic, S.T. Cole. Regulation of catalase-peroxidase (KatG) expression, isoniazid sensitivity and virulence by furA of Mycobacterium tuberculosis. // Molecular Microbiology.-2001.-Vol.40.-P.879-889.

65. Pym A.S., B. Saint-Joanis, S.T. Cole. Effect of katG Mutations on the Virulence of Mycobacterium tuberculosis and the Implication for Transmission in Humans. // Infect. Immun.-2002.-Vol.70.-P.4955-4960.

66. Ramos de, H. Soini, G. C. Roscanni, M. Jaques, M. C. Villares, J. M. Musser. Extensive cross-contamination of specimens with Mycobacterium tuberculosis in a reference laboratory. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.916-9.

67. Raviglione M.C., Snider D.R.jr., Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic. // JAMA.-1995.-Vol.273.-P.220-226.

68. Rigouts L., F. Portaels. DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis do not change during the development of resistance to various antituberculous drugs. // Tuber Lung Dis.-1994.-Vol.75.-P.160.

69. Ritacco V., Lopez В., Paul R., Reniero A., Di Lonardo M., Casimir L., Togneri A., Kaufman S., Barrera L. False-positive cultures due to cross contamination in tuberculosis laboratories. // Rev Argent Microbiol.- 2002.-Vol.34.-P. 163-166

70. Ross В. С., K. Raios, K. Jackson, B. Dwyer. Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and its use as an epidemiological tool. // J Clin Microbiol.-1992.-Vol.30.-P.942-6.

71. Ross В. С., B. Dwyer. Rapid, simple method for typing isolates of Mycobacterium tuberculosis by using the polymerase chain reaction. // J Clin Microbiol.-1993.-Vol.31.-P.329-34.

72. Sharma M., S. Sethi, B. Mishra, C. Sengupta, S. K. Sharma. Rapid detection of mutations in rpoB gene of rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis strains by line probe assay. // Indian J Med Res.-2003.-Vol.117.-P.76-80.

73. Small P., van Embden J. Molecular epidemiology of tuberculosis. // In: B. Bloom (Ed.) Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control. ASM press. Washington D.C.-1994.-P.569- 582.

74. Soini H., X. Pan, A. Amin, E. A. Graviss, A. Siddiqui, J. M. Musser. Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping. //J Clin Microbiol.-2000.-Vol.38.-P.669-76.

75. Sola C., A. Devallois, L. Horgen, J. Maisetti, I. Filliol, E. Legrand, N. Rastogi. Tuberculosis in the Caribbean: using spacer oligonucleotide typing to understand strain origin and transmission. // Emerg Infect Dis.-1999.-Vol.5.-P.404-14.

76. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. //Mol. Biol.-1975.-Vol.98.-P.503-517.

77. Surikova О. V., Voitikh D. V., Kurnov I., Filipenko M. L. Clinical application of VNTR-typing of Mycobacteria tuberculosis strains: monitoring of ^treatment quality and of laboratory service. // Mol Gen Mikrobiol Virusol 2005.;Vol.2.-P.21-24

78. Taniguchi H., H. Aramaki, Y. Nikaido, Y. Mizuguchi, M. Nakamura, T. Koga, S. Yoshida. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis. //FEMS Microbiol Lett.-1996.-Vol.144.-P. 103-8.

79. Telenti A., P. Imboden, F. Marchesi, D. Lowrie, S. Cole, M. J. Colston, L. Matter, K. Schopfer, T. Bodmer. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. // Lancet.-1993.-Vol.341.-P.647-50.

80. Thierry D., A. Brisson-Noel, V. Vincent-Levy-Frebault, S. Nguyen, J. L. Guesdon, B. Gicquel. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. // J Clin Microbiol.-1990.-Vol.28.-P.2668-73.

81. Troesch A., H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R. Gingeras, P. M. Kaplan, P. Cros, C. Mabilat. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.49-55.

82. Tungusova О. S., А. О. Mar'iandyshev, D. A. Kaugant, P. Sandven, G. Bjeune. Impact of drug resistance on the fitness of Mycobacteruim tuberculosis of the genotype W-Beijing. // Probl Tuberk Bolezn Legk.-2005.-Vol.2.-P.46-50.

83. Vos P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiperet al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. //Nucleic Acids Res.-1995.-Vol.23.-P.4407-14.

84. W. Takayuki, S. Maeda, A. Tamaru, S. Imai, A. Hase, K. Kobayashi. Dual-Probe Assay for Rapid Detection of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis by Real-Time PCR. // J. Clin. Microbiol.-2004.-Vol.42.-P.5277-5285.

85. Werngren J.S., E. Hoffner. Drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype does not develop mutation-conferred resistance to rifampin at an elevated rate. // J Clin Microbiol.-2003.-Vol.41.-P. 1520-4.

86. Wiid I. J., С. Werely, N. Beyers, P. Donald, P. D. van Helden. Oligonucleotide (GTG)5 as a marker for Mycobacterium tuberculosis strain identification. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P. 1318-21.

87. World Health Organization. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with Extencive Resistance to Second-Line Drugs Worldwide, 2000-2004. // Morbid. Mortal. Weekly Rep.-2006.-Vol.55.-P.301-306.

88. World Health Organization. XDR tuberculosis. // 2007.-Nov.

89. World Health Organization. 2007-2008 XDR and MDR Tuberculosis Global Responce Plan. // 2007 .-June.

90. World Health Organization. Anti-tuberculosis drug resistance in the world. // 2008.-Fourth Global Report.

91. Wu X., J. Zhang, Y. Zhuang, X. Zhang, G. Li, X. He. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. // Chin Med J (Engl).-1999.-Vol.l 12.-P.524-8.

92. Yeh R. W., Hopewell P. C., Daley C. L. Simultaneous infection with two strains of Mycobacterium tuberculosis identified by restriction fragment length polymorphism analysis. // Int J Tuberc Lung Dis.- 1999.-VoI.3.-P.537-539f