Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза

Низова, Анастасия Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза"

003484450

На правах рукописи С1

Низова Анастасия Валерьевна

Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза

03.00.07 - Микробиология 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 6 НОЯ 2009

Москва-2009

003484450

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич кандидат биологических наук Степаншина Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимирский Михаил Александрович доктор медицинских наук, Денисов Александр Александрович

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Защита состоится «_/£_» декабря 2009 г. в 12 — часов на заседании Диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии.

Автореферат разослан « (2,» н«я&ря 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Фурсова Н.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Туберкулез остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Возбудителем туберкулеза инфицировано около трети населения планеты [Bloom B.R., 2002, Никитин А.В., 2006]. Ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек. В Российской Федерации показатель заболеваемости населения туберкулезом составляет около 86 случаев на 100 000 населения [Вартанян Ф.Е. и др., 2007; Цыбикова Э.Б. и др., 2007]. Примерно третья часть от общего числа больных являются бактериовыделителями, т.е. существует огромный резервуар распространителей инфекции [Дмитриев В.А., 2008].

Одной из причин сохранения сложной эпидемической ситуации по туберкулезу является увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к специфическим химиопрепаратам. Особую тревогу вызывает рост числа штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. одновременно устойчивых к наиболее активным противотуберкулезным препаратам - изониазиду и рифампицину). Туберкулезный процесс, вызванный микобакте-риями, устойчивыми к данным препаратам, трудно поддается лечению и приводит к развитию хронических форм заболевания [Хоменко А.Г. и др., 1996].

Повсеместное распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза требует пересмотра стандартных схем противотуберкулезной терапии. Для лечения больных туберкулезом наряду с препаратами первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, пиразинамид), все чаще применяют новые режимы химиотерапии с использованием препаратов второй линии (про-тионамид, канамицин, амикацин, капреомицин, циклосерин, рифабутин, ПАСК, офлоксацин). Для достижения эффективных результатов лечения необходимо знание спектра и уровня лекарственной устойчивости клинических штаммов М. tubercvlosis к этим препаратам.

При оценке лекарственной устойчивости микобактерий учитывают критические концентрации противотуберкулезных препаратов. Для разных по со-

ставу питательных сред критическая концентрация одного и того же лекарственного препарата может быть различна. Значения критических концентраций существенно отличаются и при использовании разных методов определения лекарственной устойчивости [Kim S.J., 2005]. В России для тестирования устойчивости микобактерий к химиопрепаратам традиционно используют метод абсолютных концентраций и плотную яичную питательную среду Левенштейна-Йенсена. В настоящее время используемые в данном методе критические концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии определены, тогда как критические концентрации лекарственных препаратов второй линии для М. tuberculosis носят лишь рекомендательный характер и требуют дополнительных исследований с использованием современных клинических штаммов [Приказ № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., 2003 г.].

Известно, что при неадекватной химиотерапии в очаге поражения у больного туберкулезом создаются условия для селекции лекарственно-устойчивых микобактерий, что в значительной степени снижает эффективность лечения, увеличивает его стоимость, повышает риск смертельного исхода заболевания. Помимо этого, пациенты, страдающие лекарственно-устойчивым туберкулезом, являются потенциально опасными для окружающих. Поэтому определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет большое значение для оптимизации тактики химиотерапии больных туберкулезом, контроля эффективности лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий.

Цель работы

Анализ устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением заболевания, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации.

Задачи исследования

1. Создать панель современных клинических штаммов М. tuberculosis, "предположительно" чувствительных и "предположительно" устойчивых к противотуберкулезным препаратам второй линии: канамицину, капрео-мицину и офлоксацину.

2. Определить критические концентрации канамицина, капреомицина и оф-локсацина, используемые для оценки лекарственной устойчивости М tuberculosis методами абсолютных концентраций на среде Левенштей-на-Йенсена и пропорций на среде Middlebrook 7Н10.

1. Впервые определены критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций с использованием охарактеризованной микробиологическими и молекулярно-биологическими методами панели современных клинических штаммов М. tuberculosis.

2. Проведен мониторинг устойчивости штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных хронической формой туберкулеза (Центральный и Приволжский регионы, 2003-2005 гг.), к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.

3. Методом ПЦР-секвенирования в гене рпсА выявлены ранее не описанные мутации, детерминирующие устойчивость М. tuberculosis к гшразинами-ду.

Практическое значение работы

Разработаны методические рекомендации "Определение критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левенштейна-Йенсена". Данные рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательских институтах, проводящих работы по определению лекарственной устойчивости микроорганизмов и разрабатывающих новые методы ее тестирования; в бактериологических лабораториях фармацевтических производственных учреждений, выполняющих работы по определению противотуберкулезной активности лекарственных препаратов.

Разработан универсальный алгоритм, который может быть использован при определении критических концентраций других противотуберкулезных химиопрепаратов. Это особенно важно, так как существуют резервные препараты и ряд препаратов второй линии, для которых показатели критических концентраций остаются пока неизвестными, что ограничивает возможность их использования в клинической практике.

Проведена оценка вклада отдельных мутаций в формировании устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Полученные данные имеют существенное значение при разработке молекулярно-биологических диагностических систем. Информация о впервые выявленных мутациях в гене рпсА внесена в базу данных генетических последовательностей (GenBank).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Критические концентрации канамицина и капреомицина, определенные для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов М. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.

2. Критическая концентрация офлоксацина, определенная для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов М. tuberculosis, равна 3 мкг/мл, для метода пропорций - 2 мкг/мл.

3. Выявлено 15 новых мутаций в гене рпсА детерминирующих устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31АСС, 49СЛС, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-А-9, Ins 64-А-65, Ins 86GA-GA-C, Ins 176-ACCG-177, Del 40-45_TG, Del 151-153TT_CC.

4. Среди штаммов М. tuberculosis, выделенных из мокроты больных с хронической формой туберкулеза легких (п=325), проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации в течение 2003-2005 гг., 62,5% штаммов устойчивы к изониазиду, 54,2%-к рифампицину, 61,8% - к стрептомицину, 37,2% - к этамбутолу, 30,5% - к пиразинамиду, 32,3% - к канамицину, 24,0% - к капреоми-цнну и 7,7% - к офлоксацину.

5. Установлено, что устойчивость штаммов М. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев - в гене гроВ, к стрептомицину в 52,7% случаев - в гене lóSrRNA и в 22,4% - в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев - в гене етЬВ, к пиразинамиду в 100% случаев - в гене рпсА, к канамицину в 87,6% случаев - в гене lóSrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев - в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев - в гене gyrA.

Апробация работы Результаты работы доложены на: 36-й Международной конференции "Здоровье легких" Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Париж, 2005), II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" (Москва, 2007), Проблемном симпозиуме по молекулярной и кле-

точной биологии "Патогенез и контроль распространения лекарственно-устойчивых организмов" (Бангкок, 2008), 5-м конгрессе Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Дубровник, 2009).

Публикации По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, включающего 100 работ отечественных и 119 работ зарубежных авторов. Работа содержит 14 рисунков и 15 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использованы штаммы М. tuberculosis, выделенные из мокроты больных хроническим туберкулезом легких. Штаммы получены из противотуберкулезных диспансеров городов Москва, Тула, Серпухов, Иваново и Нижний Новгород. Лабораторный референс-штамм М. tuberculosis H37Rv поступил из ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Референс-штамм М. bovis BCG получен из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Принадлежность бактериальных культур к виду М. tuberculosis подтверждена культуральными и биохимическими методами согласно приказу № 109 от 21 марта 2003 г. "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации". При идентификации микобактерий учитывали скорость роста, пигментацию и морфологию колоний, а так же способность к росту на среде Левенштейна-Иенсена, содержащей 500-1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия [Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез М., 2001]. Ниациновый тест проводили согласно методике, предложенной Кубиком и Кильбурном, в модификации Ба-раускене. Активность и термостабильность каталазы определяли по методике Kent Р. Т. et al., 1985. Для определения устойчивости микобактерий к пирази-

намиду использовали тест на наличие пиразинамидазной активности. Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Грисса [Приказ №558 "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе" М., 1978]. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам тестировали методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и методом пропорций на среде Middlebrook 7Н10 [Приказ МЗ РФ № 109 М., 2003]. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) канамицина, капрео-мицина и офлоксацина определяли методом серийных разведений на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7Н10. Критические концентрации противотуберкулезных препаратов второй линии были установлены в результате анализа МПК препаратов, обработанных с помощью графических ресурсов программы Microsoft Office Excel 2003.

Для RFLP-lSó7-/0-THnHpoBaHM М tuberculosis использовали методику Van Embden J.D.A. et al., 1995. Компьютерный анализ полученных данных проводили методом UPGMA с помощью пакета программ GelCompar II (version 2.5, для Windows 98, Бельгия). Штаммы сполиготипировали по классической методике Kamerbeek J. et al., 1997.

Метод гибридизации на нуклеотидных биочипах использовали для выявления мутаций в гене гроВ, детерминирующих устойчивость микобактерий к рифампицину. ПЦР-секвенирование генов katG, гроВ, rpsL, 16SrRNA, embB, pncA, tlyA, gyrA и gyrB, обуславливающих устойчивость штаммов М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, определяли при помощи автоматического секвенатора MegaBase 750. При поиске гомологии нуклеотидных последовательностей использовали программу Vector NTI ("InforMax", США).

Результаты исследования и их обсуждение

Создание панели клинических штаммов М. tuberculosis

Была сформирована стандартная панель современных клинических штаммов М. tuberculosis, включающая 24 "предположительно" чувствительных

штаммов и 70 "предположительно" устойчивых к изучаемым лекарственным препаратам штаммов. "Предположительно" чувствительные культуры были выделены из мокроты больных, не принимавших изучаемый препарат, и не имеющих мутации в целевых генах М. tuberculosis. "Предположительно" устойчивые культуры выделены из мокроты больных, принимавших изучаемый препарат, и имеющих мутации в целевых генах М. tuberculosis.

Для исключения возможного изогенного происхождения клинические штаммы М. tuberculosis были тестированы методом сполиготипирования. Полученные данные представлены в виде восьмеричного кода и схематических

профилей гибридизации в Табл 1.

Таблица 1

Сполиготипы клинических штаммов М. tuberculosis

Сполигограмма (■ - наличие сигнала, □ - отсутствие сигнала при гибридизации) Саолигогштерн (восьмеричный код) Cnojwro-ceMeficTBO Количество штаммов

□□□ооаааайоаасоораопапооопппппппасвишш*«"«" 000000000003771 Beijing

□□□□□ооооиаоооосаоооааоааааааппаапмо«*"«" 000000000003371 Beijing 1

аааааапооиоапапоаааапаааапаааааааатшаашяии 000000000003171 Beijing 1

777477607760771 LAM9 27

407777607760771 LAM9 1

775741003760771 LAM 1

777457607760771 LAM 1

777777607760731 LAM4 1

■■■■■laiHHiiHiauanniMMnDODOiaflnaB 777777777760771 T1

777740003760771 T1 1

777777737760571 T 1

777775077760771 T 1

777777377760771 T4

777760007760771 T5 RUS1 I

770000777760771 T1 RUS2 2

774777777420771 Haarjem4 4

610000777720771 Haarlem 1

774777717420771 Haarlem 1

774777177420771 Haarlem 1

■■■■■■■■■вяншшнннававмввнвав 777777777720771 Haarlem3 1

777477607763771 MANU2 3

777776777760771 XI 1

777777377560771 u 1

000002000003771 u 2

Примечание: U - сполигосемейство не идентифицировано

В результате исследования было выявлено 24 сполиготипа. Уникальный профиль гибридизации имели 17,02% (п=16) штаммов. Клинические штаммы с идентичными сполигопаттернами составили 82,98% (п=78).

Метод RI'LP-756/70-типирования позволяет произвести более тонкую дифференциацию микобактериальных штаммов чем сполиготипирование. Поэтому штаммы, имеющие одинаковые сполигопаттерны, были дополнительно протестированы этим методом. В результате RFLP-186/./О-типирования у 42 из 78 штаммов М. tuberculosis выявлен индивидуальный RFLP-IS6//0 профиль. Для дальнейшей характеристики клональности штаммов микобактерий был использован подход, основанный на определении мутаций в генах katG, inhA, rpoB, rpsL и lóSrRNA. В результате ПЦР-секвенирования 36 штаммов у девяти из них обнаружены разные типы мутаций.

Таким образом, использование в работе молекулярно-биологических методов исследования позволило выявить генетическую гетерогенность для 71,3% (п=67) штаммов, включенных в стандартную панель.

Определение критических концентраций противотуберкулезных препаратов: канамицина, капреомицииа и офлоксацина

Для этой работы использовали сформированную нами стандартную панель клинических штаммов М. tuberculosis, 24 из которых являются "предположительно" чувствительными, 23 - "предположительно" канамицин-устойчивыми, 28 - "предположительно" капреомицин-устойчивыми и 25 -"предположительно" офлоксацин-устойчивыми.

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов для метода абсолютных концентраций были определены в результате математического анализа минимальных подавляющих концентраций препаратов, выявленных методом серийных разведений на среде Левенштейна-Йенсена. Результаты определения МПК лекарственных препаратов представлены в Табл. 2-4 и в виде диаграмм (рис. 1).

Таблица 2

Определение МПК канамицина для штаммов М. tuberculosis

Концентрация канамицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, не леченных канамицином Концентрация канамицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, леченных канамицином

0,469 1 30,0 0

0,938 2 60,0 0

1,875 0 120,0 2

3,75 3 240,0 1

7,5* 10 480,0 0

15,0 8 960,0 0

30,0 1 3840,0 20

Таблица 3

Определение МПК капреомицина для штаммов М. tuberculosis

Концентрация капреомицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, не леченных капреомицином Концентрация капреомицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, леченных капреомицином

30,0 2 30,0 0

15,0* 18 60,0 2

7,5 3 120,0 10

3,75 1 240,0 15

1,88 0 480, 1

0,94 0 960, 0

0,47 0 1 920,0 0

Таблица 4

Определение МПК офлоксацина для штаммов М tuberculosis

Концентрация офлоксацина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, не леченных офлоксацином Концентрация офлоксацина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, леченных офлоксацином

0,03 0 2,0 0

0,06 0 4,0 1

0,125 2 8,0 9

0,25 1 16,0 8

0,5 4 32,0 4

1,0 15 64,0 3

2,0* 3 128,0 0

Примечание: * - концентрация, которая соответствует МПК лекарственного препарата для штаммаМ tuberculosis H37RV

б)

Рис. 1. Определение критической концентрации канамицина

Рис. 2. Определение критической концентрации капреомицина

б)

Рис. 3. Определение критической концентрации офлоксацина Примечание: а - метод абсолютных концентраций, б - метод пропорций

На диаграммах значения, отложенные на оси Y, соответствуют проценту штаммов с данным значением МПК из полной выборки клинических штаммов, использованных в работе.

Согласно данным, полученным при анализе значений МПК противотуберкулезных препаратов, установлено, что критические концентрации канами-цина и капреомицина для метода абсолютных концентраций равны 50 мкг/мл. Для офлоксацина этот показатель равен 3 мкг/мл.

Для подтверждения корректности использованного нами алгоритма исследования были определены критические концентрации изучаемых лекарственных препаратов для метода пропорций на питательной среде Middlebrook 7Н10 с использованием того же подхода и той же панели штаммов. Критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода пропорций оказались равными 5, 10 и 2 мкг/мл, соответственно. Именно эти концентрации антибиотиков используются для определения лекарственной чувствительности методом пропорций, в частности в Центре по контролю за заболеваниями (США), Национальном Центре микробиологии (Швейцария). Распределение МПК "предположительно" лекарственно-чувствительных и "предположительно" лекарственно-устойчивых штаммов, установленных методом серийных разведений на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7Ш0, имели общую закономерность (рис. 1). При анализе результатов определения устойчивости к канамицину, капреомицину и офлоксацину большой выборки клинических штаммов М. tuberculosis методами абсолютных концентраций с использованием установленных нами значений критических концентраций препаратов и пропорций показано, что результаты тестирования совпали в 100% случаев.

Установленные значения критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций мы использовали при оценке лекарственной устойчивости 325 клинических штаммов М. tuberculosis.

Определение устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии методами абсолютных концентраций и пропорций

Устойчивость клинических штаммов М tuberculosis к изониазиду, ри-фампицину, стрептомицину, этамбутолу, канамицину, капреомицину и офлок-сацину определяли методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Иенсена. Для оценки устойчивости клинических штаммов к пиразинамиду использовали тест на наличие пиразинамидазной активности.

Установлено, что 33,54% (п=109) штаммов являются лекарственно-чувствительными. Устойчивость к одному из изучаемых противотуберкулезных препаратов обнаружена у 10,77% (п=35) штаммов. Количество полирезистентных штаммов, т.е. устойчивых к любым двум и более противотуберкулезным препаратам без одновременной устойчивости к изониазиду и рифампицину равно 10,15% (п=33). Уровень МЛУ штаммов составил 45,54% (п=148). Устойчивость к изониазиду наблюдалась в 62,46% случаев (п=203), к стрептомицину - в 61,85% (п=201), к рифампицину - в 54,15% (п=176), к этамбутолу - в 37,23% (п=121), к канамицину - в 32,31% (п=105), пиразинамиду - в 30,46% (п=99), к капреомицину - в 24,0% (п=78), к офлоксацину - в 7,69% (п=25). Результаты представлены на Рис 4.

INH STR RIF EMB KAN PZA CAP OFX

Рис. 4. Лекарственная устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis

Примечание: INH - изониазид, STR - стрептомицин, R1F - рифампицин, ЕМВ - этамбугол, PZA - пиразинамид, KAN - канамицин, САР - капреомицин, OFL - офлоксацин

ПЦР-секвенирование генов, мутации в которых детерминируют устойчивость к противотуберкулезным препаратам

Формирование антибиотико-устойчивости у микобактерий в подавляющем числе случаев связано с накоплением хромосомных мутаций в генах, кодирующих мишени действия препаратов. Наиболее информативным методом, позволяющим максимально полно охарактеризовать весь спектр возможных мутаций, а в ряде случаев и их эпидемиологические особенности, является ПЦР-секвенирование. Поэтому для определения мутаций, детерминирующих устойчивость штаммов к противотуберкулезным препаратам, использовали данный метод. Результаты представлены в Табл. 5.

Таблица 5

Генетические мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью

клинических штаммов М. tuberculosis

Ген Номер позиции (кодон) и нуклеотидная замена Замена аминокислот Количество штаммов

ша 315AGC—АСС Ser-»Thr 184

315AGC—»ACG Ser—»Thr 2

3I5AGC—AGA Ser—»Arg 1

гроВ 516GAC—»GTC Asp—»Val 87

531TCG—»TTG Ser—»Leu 37

516GAC—TAC Asp-»Tyr 11

526САС—GAC His-» Asp 9

526САС->ТАС His—»Tyr 7

511CTG-»CCG Leu-»Pro 3

522TCG—CAG Ser—»Gin 2

531TCG—»TGG Ser—»Тф 1

rpsL 43AAG—AGG Lys—»Arg 41

88AAG—AGG Lys-» Arg 4

JóSrRNA 513A—C - 94

(427-980) 516C-»T - 9

515C-»T - 2

514G—»T - 1

етЬВ 306ATG—ATA Met—»lie 64

306ATG—GTG Met—»Val 11

406GGC—»GAC Gly—»Asp 8

306ATG—ATT Met-»lle 3

306ATG—»ATC Met—»lie 2

406GGC-»GCC Gly—»Ala 2

406GGC—AGC Gly—»Ser 1

16SrRNA 1400A—»G - 88

(1288-1543) 1401C-»T - 4

il у А Del 23 GCC - 1

gyrA 94GAC-»GGC+95AGC—ACC Asp—»Gly, Ser—* Thr 17

90GCG—GTG+95AGC—ACC Ala—»Val, Ser-»Thr 7

Для определения устойчивости клинических штаммов к рифампицину дополнительно использовали метод гибридизации на олигонуклеотидных биочипах "ТБ-биочип (РИФ)", поскольку данный метод считается перспективным для тестирования лекарственной чувствительности штаммов М. tuberculosis в клинической практике [Михайлович В.М. и др., 2001, Caoili J. С. et al., 2006].

Из 325 клинических штаммов М. tuberculosis 189 штаммов были протестированы методом гибридизации на биочипах. При анализе мутаций, детерминирующих устойчивость М. tuberculosis к рифампицину, этим методом были получены результаты, совпадающие с результатами ПЦР-секвенирования в 98,40% случаев (табл. 6).

Таблица 6

Данные ПЦР-секвенирования и гибридизации на биочипах гена гроВ

для 189 клинических штаммов М. tuberculosis

Номер позиции и кодон Количество штаммов, шт. Интерпретация результатов определения лекарственной чувствительности: секвенирования//гибридизации на чипах

Данные ПЦР-секвенирования кнагроВ Данные гибридизации на чипах

516GTC 516Val 87 устойчивый//устойчивый

531TTG 531Leu 37 усгойчивый//устойчивый

526GAC 526Asp 9 устойчивый//устойчивый

526ТАС 526Туг 7 устойчивый//устойчивый

516ТАС 516Туг 11 устойчивый//устойчивый

51ICCG 511Pro 3 устойчивый//устойчивый

522CAG ND 2 устойчивый// не определена чувствительность

531TGG 53 Игр 1 устойчивый//устойчивый

WT LD 1 чувствительный// не определена чувствительность

WT WT 31 чувствительный // чувствительный

Примечание: LD - низкая дискриминация, ND - нет данных, WT - дикий тип

У пиразинамид-устойчивых штаммов М. tuberculosis методом ПЦР-секвенирования выявлено 44 типа мутаций, локализованных в 28 кодонах гена рпсА (табл. 7).

Таблица 7

ПЦР-секвенирование генарпсА штаммов М. tuberculosis

Замена нуклеотидов Замена аминокислот Количество штаммов

-И A—G - 6

1 ATG—ACG Met—Thr 1

4 TTG—>TCG Leu—Ser 3

4 TTG—TGG Leu—Тгр 1

6 АТС—CTC Ile—Leu 2

8 GAC—GAG Asp—Glu 1

8 GAC—GGC Asp—Gly 2

12GAC—GCC Asp—Ala 3

12 GAC—GGC Asp—Gly 2

19 CTG—CCG Leu—Pro 4

27 CTG—CCG Leu—Pro 2

31 АТС—ACC lie—Thr 1

31 АТС—AGC lie—Ser 1

41 TAC—TA A Туг—Тег 1

49 GAC—CAC Asp—His 1

57 CAC—CAG His—Gin 6

57 CAC—CGC His—Arg 7

62 CCG—CTG Pro—Leu 1

63 GAC—GAA Asp—Glu 7

63 GAC—GCC Asp—Ala 1

73 GTC—GGC Val—Gly 1

76 ACT—CCT Thr—Pro 1

85 CTG—CCG Leu—Pro 1

96 AAG—AGG Lys—Arg 1

97GGT—AGT Gly-Ser 4

97 GGT—GAT Gly—Asp 4

103 TAC—TAG Tyr—Ter 7

105 GGC—GAC Gly—Asp 1

119 TGG—CGG Trp—Arg 1

130 GTG—GAG Leu—Glu 1

132 GGT—GAT Gly—Asp 1

139 GTG—GCG Val—Ala 1

141 CAG—CCG Gin—Pro 3

160 АСА—CCA Thr—Pro 2

171 GCG—GTG Ala—Val 1

175 ATG-AGG Met—Arg 1

175 ATG—ATA Met—lie 3

Ins 8-9GACAGTG - 1

Ins 64-65TATATCC - 3

Ins 86GAGAC - 1

Ins 130GTGGG - 2

Ins 176-177CGCACCGACC - 2

Del 40-45 GACTACCATCACGTCGT - 2

De! 151-153TTGGCCACC - 1

Примечание: Жирным шрифтом выделены инсерции (Ins) и делеции (Del)

Ранее описанные аминокислотные замены, приводящие к развитию устойчивости к пиразинамиду, определены нами у 65,66% (п=65) штаммов. У 34,34% (п=34) штаммов М. tuberculosis обнаружено 17 новых мутаций.

Семнадцать штаммов, у которых определены новые нуклеотидные замены, были проверены на устойчивость к пиразинамиду при помощи автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 (табл. 8).

Таблица 8

Устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis к пиразинамиду,

наличие пиразинамидазной активности и мутаций в гене рпсА

№ Пиразинамидазная активность Мутации в гене рпсА (номер кодона и замет) Чувствительность к РгА, определенная методом ВАСТЕС 960 МИТ

1 отсутствует 6 АТС—»CTC нет данных

2 отсутствует 12 GAC—»GGC устойчивый

3 отсутствует 31 АТС—AGC устойчивый

4 отсутствует 31 АТС—»ACC устойчивый

5 отсутствует 49 GAC—>САС устойчивый

6 отсутствует 57 САС—>CAG устойчивый

7 отсутствует 57 САС—>CGC устойчивый

8 отсутствует 73 GTC—>GGC устойчивый

9 отсутствует 105 GGC-+GAC устойчивый

10 отсутствует 130GTG—»GAG устойчивый

11 отсутствует 175 ATG—ATA чувствительный

12 отсутствует Ins 8-9GACAGTGK устойчивый

13 отсутствует Ins 64-65TATATCC устойчивый

14 отсутствует Ins 86GAGAC устойчивый

15 отсутствует Ins 176-177CGCACCGACC устойчивый

16 отсутствует Del 40-45 GACTACCATCACGTCGTG устойчивый

17 отсутствует Del 151-153TTGGCCACC устойчивый

Примечание: Жирным шрифтом выделены инсерции (Ins) и делеции (Del)

Устойчивость к пиразинамиду выявлена у 15 из 17 клинических штаммов. В одном случае не удалось определить лекарственную чувствительность в системе ВАСТЕС МИТ 960 в связи с плохим ростом микобактерий. Для одного штамма обнаружено несовпадение результатов определения пиразинамидазной активности и результатов определения устойчивости штамма к пиразинамиду методом ВАСТЕС МИТ 960.

ВЫВОДЫ

1. Критические концентрации канамицина и капреомицина, определенные для метода абсолютных концентраций с использованием панели генетически гетерогенных клинических штаммов М. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.

2. Критическая концентрация офлоксацина, определенная для метода абсолютных концентраций с использованием панели генетически гетерогенных клинических штаммов М. tuberculosis, равна 3 мкг/мл, для метода пропорций - 2 мкг/мл.

3. Выявлено 15 новых мутаций в гене рпсА, детерминирующих устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31АСС, 49САС, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-А-9, Ins 64-А-65, Ins 86GA-GA-C, Ins 176-ACCG-177, Del 40-45_TG, Del 151-153TT_CC.

4. Обнаружено, что среди клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных с хронической формой туберкулеза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации (2003-2005 гг.), устойчивость к изониазиду составляет 62,5%, к рифампицину - 54,2%, к стрептомицину - 61,8%, к этамбутолу - 37,2%, к пиразинамиду - 30,5%. к канамицину - в 32,3%, к капреомицину - в 24,0%, к офлоксацину - в 7,7%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Lipin M.Y., Ivanov I.Y., Nizova A.V., Blagodatskikh S.A. The distribution of families of drug-resistant mycobacterium II 26th Annua} Congress of the European Society of Mycobacteri-ology. Abstract Book. - Istanbul, - 2005. - P. 35.

2. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Lipin M.Y., lvanov I.Y., Nizova A.V. Molecular Characteristics of LAM/A1 Lineage of Mycobacterium tuberculosis II 36th World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (The Union). Abstract Book. - France. - 2005. - P. 119.

3. Степаншина B.H., Шемякин И.Г., Лилин М.Ю., Иванов И.Ю., Низова A.B. AI/LAM семейство Mycobacterium tuberculosis, // Тез. докл. И Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". - 2005. - М., -2005. - С. 263.

4. Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Иванов И.Ю., Низова A.B., Благодатских С.А., Шемякин И.Г. Распределение лекарственно-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, относящихся к различным генетическим семействам, является регион-зависимым в Центральной части России. И Тез. докл. II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". - 2005. - Мм -2005.-С. 264.

5. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Низова A.B., Благодатских С.А. Распределение лекарственно-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis в Центральной части России // Тез. докл. Международной конференции "Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию". -Химки,-2006.-С. 30.

6. Благодатских С.А., Степаншина В.Н., Низова A.B., Шемякин И.Г. Социальный портрет больных туберкулезом легких в городе Тула II Тез. докл. Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств". - Оболенск, - 2006. - С. 18.

7. Низова A.B., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Определение чувствительности клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к изониазиду методом Деплиторной Аллель-Специфической ПЦР // Тез. докл. Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств- Оболенск, - 2006. - С. 116.

8. Низова A.B., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Богун А.Г., Майорова A.A., Шемякин И.Г. Анализ устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 4. - С. 7-11.

9. Низова A.B., Степаншина В.Н., Майорова A.A., Майская Н.В., Благодатских С.А., Мухина Т.Н., Шемякин И.Г. Анализ результатов определения чувствительности к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis микробиологическими и молекулярно-биологическими методами // Тез. докл. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" - М„ - 2007. - Т.З. - С. 39-40.

10. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майорова А.А., Майская Н.В., Шемякин И.Г., Борисов С.Е., Смирнова Н.С., Попов С. А. Определение чувствительности к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты методами гибридизации на биочипах и Вас tec 960 // Тез. докл. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" - М., - 2007. -Т.З. - С. 41-42.

11. Низова А-В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразкнамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosisИ Тез. докл. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" - М., -2007. - Т.З. - С. 43-44.

12. Степаншина В.Н., Низова А.В., Майорова А.А., Липин Ю.М., Майская Н.В., Шемякин И.Г., Борисов С.Е., Смирнова Н.С., Попов С.А. Определение чувствительности к рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis с помощью микробиологических и молекулярно-биологических методов// Биотехнология. - 2008. - № 1. - С. 83-91.

13. DubiJey S., Stepanshina V., Nizova A,, Blagodatsky S., Moukhina Т., Shemyakin I. Molecular epidemiology and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis strains in Centra! Russia // Pathogenesis and Control of Emerging and Drug-Resistant Organisms. Abstract Book. - Bangkok, - 2008. - P. 68.

14. Низова А-В., Степаншина B.H., Майская H.B., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к пи-раз инамиду // Молекулярная генетика, Микробиология и Вирусология. - 200S. - № 4. — С. 23-26.

15. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская В.Н., Миронова Р.И., Мухина Т.Н. Шемякин И.Г. Определение устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда // Тез. докл Научно-практической конференции СМУиС Росгготребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" - Оболенск, - 2009. - С. 246-248.

16. Низова А.В., Степаншина В.И., Миронова Р.И., Мухина Т.Н., Николаева О.Н., Благодатских С.А., Майская Н.В., Шемякин И.Г. Определение критической концентрации канамицина для Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций // Тез. докл Научно-практической конференции СМУиС Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" - Оболенск, - 2009. - С. 248249.

17. Мухина Т.Н., Степаншина В.Н., Миронова Р.И., Низова А.В., Шемякин И.Г. Характеристика лекарственной устойчивости штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом легких // Тез. докл Научно-практической конференции СМУиС Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" - Оболенск, - 2009. - С. 244-245.

18. Stepanshina V., Popov S., AparinaN., Mironova R., MukhinaT., Nizova A., Maiskaya N., Nikolaieva O., Bo-gun A., Blagodatskikh S., Shemyakin I., Cegielski P. MGIT BACTEC 960 - based determination of kanamy-cin critical concentration for Mycobacterium tuberculosis U 5th Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Abstract Book. - Dubrovnik, - 2009. - P. 88.

Подписано в печать:

11.11.2009

Заказ № 2997 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Низова, Анастасия Валерьевна

Принятые обозначения и сокращения.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации.

1.2. Анализ причин сохранения сложной эпидемической ситуации по туберкулезу.

1.3. Распространенность лекарственно-устойчивого туберкулеза на территории Российской Федерации.

1.4. Химиопрепараты, используемые для лечения туберкулеза.

1.5. Методы определения устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

1.6. Критерии оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза"

Туберкулез остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Возбудителем туберкулеза инфицировано около трети населения планеты. Ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек [85]. В Российской Федерации показатель заболеваемости населения туберкулезом составляет около 86 случаев на 100 ООО населения [9, 90]. Примерно третья часть от общего числа больных являются бактериовыделителями, т.е. существует огромный резервуар распространителей инфекции.

Одной из причин сохранения сложной эпидемической ситуации по туберкулезу является увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis устойчивых к специфическим химиопрепаратам. Особую тревогу вызывает рост числа штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. одновременно устойчивых к наиболее активным противотуберкулезным препаратам - изониазиду и рифампицину). Туберкулезный процесс, вызванный микобакте-риями, устойчивыми к данным препаратам, трудно поддается лечению и приводит к развитию хронических форм заболевания.

При оценке лекарственной устойчивости микобактерий учитывают критические концентрации противотуберкулезных препаратов. Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же лекарственного препарата может быть различна. Значения критических концентраций существенно отличаются и при использовании разных методов определения лекарственной устойчивости [147]. В России для тестирования устойчивости ми-кобактерий к химиопрепаратам традиционно используют метод абсолютных концентраций и плотную яичную питательную среду Левенштейна-Йенсена. В настоящее время используемые в данном методе критические концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии определены, тогда как критические концентрации лекарственных препаратов второй линии для М. tuberculosis носят лишь рекомендательный характер и требуют дополнительных исследований с использованием современных клинических штаммов [70].

Цель исследования. Анализ устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением заболевания, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации. Задачи исследования.

2. Определить критические концентрации канамицина, капреомицина и оф-локсацина, используемые для оценки лекарственной устойчивости М. tuberculosis методами абсолютных концентраций на среде Левенштей-на-Йенсена и пропорций на среде Middlebrook 7Н10.

3. Провести мониторинг штаммов М. tuberculosis, полученных от больных с хронической формой туберкулёза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации, обратившихся за медицинской помощью в течение 2003-2005 гг., для определения устойчивости их к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Научная новизна работы. Впервые определены критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций с использованием охарактеризованной микробиологическими и молеку-лярно-биологическими методами панели современных клинических штаммов М. tuberculosis. Проведен мониторинг устойчивости штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных хронической формой туберкулеза (Центральный и Приволжский регионы, 2003-2005 гг.), к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Методом ПЦР-секвенирования в гене рпсА выявлены ранее не описанные мутации, детерминирующие устойчивость М tuberculosis к пиразинамиду.

Практическая значимость работы. Полученные результаты по критическим концентрациям канамицина, капреомицина и офлоксацина оформлены в виде методических рекомендаций. Данные рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательских институтах, проводящих работы по определению лекарственной устойчивости микроорганизмов и разрабатывающих новые методы ее тестирования; в бактериологических лабораториях фармацевтических производственных учреждений, выполняющих работы по определению противотуберкулезной активности лекарственных препаратов. Разраt еботан универсальный алгоритм, который может быть использован при определении критических концентраций других противотуберкулезных химиопрепа-ратов. Это особенно важно, так как существуют резервные препараты и ряд препаратов второй линии, для которых показатели критических концентраций остаются пока неизвестными, что ограничивает возможность их использования в клинической практике. Проведена оценка вклада отдельных мутаций в формировании устойчивости клинических штаммов М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Полученные данные имеют существенное значение при разработке молекулярно-биологических диагностических систем. Информация о впервые выявленных мутациях в гене рпсА внесена в базу данных генетических последовательностей (GenBahk).

Положения, выносимые на защиту.

М. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.

3. Выявлено 15 новых мутаций в гене рпсА, детерминирующих устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31AGC, 49САС, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-А-9, Ins 64-А-65, Ins 8GA-GA-C, Insl76-ACCG-177, Del 40-45TG, Del 151-153TTCC.

4. Среди штаммов M. tuberculosis, выделенных из мокроты больных с хронической* формой туберкулеза легких (п=325), проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации в течение 2003-2005 гг., 62,5% штаммов устойчивы к изониазиду, 54,2% к рифампицину, 61,8% - к стрептомицину, 37,2% - к этамбутолу, 30,5% - к пиразинамиду, 32,3% - к канамицину, 24,0% - к капреоми-цину и 7,7% - к офлоксацину.

5. Установлено, что устойчивость штаммов М. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев — в гене гроВ, к стрептомицину в 52,7% случаев — в гене 16SrRNA и в 22,4% - в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев — в гене етЬВ, к пиразинамиду в 100% случаев — в гене рпсА, к канамицину в 87,6% случаев - в гене 16SrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев - в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев - в гене gyrA.

Аннотация диссертационной работы по главам.

В первой главе представлен литературный обзор по эпидемиологии туберкулеза в Российской Федерации, используемым противотуберкулезным средствам, механизмам лекарственной устойчивости М. tuberculosis, основным методам определения лекарственной устойчивости микобактерий и факторам, влияющим на оценку лекарственной устойчивости.

Во второй главе описаны используемые материалы (клинические штаммы М. tuberculosis) и методы исследований (видовая идентификация микобактерий, определение лекарственной устойчивости, выявление минимальных подавляющих концентраций (МПК) клинических штаммов М. tuberculosis).

В третьей главе охарактеризованы штаммы М. tuberculosis с различным уровнем лекарственной устойчивости к канамицину, капреомицину и офлоксацину. Определены МПК противотуберкулезных препаратов второй линии для М. tuberculosis методом серийных разведений. Приведены результаты по установленным значениям критических концентраций для противотуберкулезных препаратов. Представлены данные по определению лекарственной устойчивости 325 штаммов М. tuberculosis, полученных из мокроты больных с хроническим течением туберкулеза, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации.

В четвертой главе представлен анализ полученных результатов.

В приложении 1 приведены сведения о пациентах, являющихся источниками микобактериальных культур.

В приложении 2 представлены результаты анализа нуклеотидных последовательностей рпсА гена М. tuberculosis.

В приложении 3 описан алгоритм исследования по определению критических концентраций противотуберкулезных препаратов, используемых для оценки лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левенштейна-Йенсена.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям: профессору, д. б. н. Шемякину И.Г. и к. б. н. Степаншиной В.Н. за ценные консультации при выполнении данной работы и ее материально-техническое обеспечение. Особую благодарность автор приносит Мироновой Р.И. за неоценимую помощь при проведении микробиологических исследований, а так же Николаевой О.Г. за содействие при математической обработке данных. Автор выражает признательность всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии, в особенности: Майской Н.В., Богуну А.Г., Мухиной Т.Н., Благодат-ских С.А. - за оказанное содействие в проведении необходимых экспериментов и за моральную поддержку.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Низова, Анастасия Валерьевна

Выводы

3. Выявлено 15 новых мутаций в гене рпсА, детерминирующих устойчивость клинических штаммов М. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31 АСС, 49САС, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-А-9, Ins 64-А-65, Ins 8GA-GA-C, Insl76-ACCG-177, Del 40-45TG, Del 151-153TTCC.

4. Обнаружено, что среди клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных с хронической формой туберкулеза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации (2003-2005 гг.), устойчивость к изониазиду составляет 62,5%, к рифампицину — 54,2%, к стрептомицину - 61,8%, к этамбутолу -37,2%, к пиразинамиду — 30,5%. к канамицину - в 32,3%, к капреоми-цину - в 24,0%, к офлоксацину - в 7,7%.

5. Установлено, что устойчивость штаммов М. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев — в гене rpoB, к стрептомицину в 52,7% случаев - в гене 16SrRNA и в 22,4% - в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев - в гене етЬВ, к пиразинамиду в 100% случаев — в гене рпсА, к канамицину в 87,6% случаев - в гене 16SrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев — в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев — в гене gyrA.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Низова, Анастасия Валерьевна, Оболенск

1. Арсенин C.JL, Никулин Б.А., Кишкун А.А., Половой A.M., Коленкин С.М. Лабораторная диагностика туберкулеза // Клиническая лабораторная диагностика. — 2001. — № 3. — С. 51-53.

2. Бабаева И.Ю., Земскова З.С., Гедымин Л.Е., Демихова О.В. Патоморфологические особенности туберкулеза легких на разных стадиях ВИЧ-инфекции // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2007.-№12.-С. 39-42.

3. Богородская Е.М., Стерликов С.А., Попов С.А. Проблемы формирования эпидемиологических показателей по туберкулезу // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2008. — № 7. — С. 8-13.

4. Вартанян Ф.Е., Шаховский К.П. Туберкулез, ассоциированный с ВИЧ-инфекцией, в странах мира // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. - № 4. - С. 42-44.

5. Ю.Васильева И.А., Черноусова Л.Н., Заседателев А.С., Соболев А.Ю., Михайлович В.М. Клиническое значение микрочиповой технологии в определении лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 2002. - № 6. - С. 21-24.

6. П.Вишневская Е.Б., Бобченок А.П., Мельникова Н.Н., Вишневский Б.И. Идентификация L-форм микобактерий туберкулезного комплекса с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 4. - С.38-40.

7. Вишневская Е.Б., Кочеровец В.И., Вишневский Б.И. Фторхинолоны как антимикобактериальные препараты и их применение в лечении туберкулеза // Антибиотики и химиотерапия. 2002. - Том 47. - № 6. — С. 42-47.

8. З.Вишневский Б.И., Стеклова Л.И. Частота и структура лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза при различных локализацияхзаболевания, // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2008. —4.-С. 5-8.

9. Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Варламов Д.А., Алексеев-Я.И., Шипина Л.К., Шульгина М.В., Домотенко Л.В., Быкадорова К.Р:,

10. Гергерт В.Я., Русакова Л.И. Индивидуальные подходы к комплексному лечению распространенных туберкулезных процессов у подростков // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2006. - № 8. -С.33-37.

11. Глумная Т.В. Влияние активного выявления и лечения больных туберкулезом на летальные исходы // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2006. — № 7. - С. 22-26.

12. Голышевская В.И., Севастьянова Э.В., Воронина Г.А. Определение лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis методамипропорций и абсолютных концентраций // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2001. -№ 3. С. 51-53.

13. Гришко А. И. Эпидемиологические тенденции туберкулеза в Санкт-Петербурге на современном этапе // Туберкулез как объект научных исследований: Сб. науч. тр. 1994. - С. 23-31.

14. Грядунов Д.А., Михайлович В.М., JIana С.А., Рудинский Н.И., Барский

15. Дмитриев В.А. Глобальная проблема туберкулеза и современная стратегия ВОЗ борьбы с ним // Антибиотики и химиотерапия. 2008. -Том. 53.-№5-6.-С. 3-6.

16. Дубилей С. А., Игнатова А.Н., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетические методы идентификации лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2005. — № 1. С. 3-7.

17. Егоров A.M. Достижения фундаментальных наук и новые подходы к химиотерапии туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезней легких.-2000.-№5.-С. 11-15.

18. Ерохин В.В. Основные итоги и перспективы работы сотрудничающего центра ВОЗ по борьбе с туберкулезом в Российской Федерации // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. - № 8. - С. 3-7.

19. ЗО.Зюзя Ю.Р., Лепеха Л.Н., Гедымин Л.Е., Бурцева С.А., Ерохин В.В. Тканевые и клеточные реакции легких при лекарственно-устойчивом туберкулезе // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. -№8.-С. 53-56.

20. Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Слогоцкая Л.В., Мороз A.M., Литвинов В.И. Автоматизированные методы культурального определения М. tuberculosis на жидких средах // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2001. - № 3. - С. 53-55.

21. Исмаилов Ш.Ш., Аленова А.Х., Чакликов Т.Е., Трумова Ж.З. // ВИЧ-инфекция и туберкулез в республике Казахстан // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2001. — № 5. — С. 36-39.

22. Казенный Б.Я., Золотарева JI.B., Золотарев Ю.В., Меркулова Н.В. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Орловской области // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. - № 3. - С. 19-22.

23. Кононец А.С., Сидорова С.В., Сафронова С.Г. Организация противотуберкулезной помощи в пенитенциарных учреждениях // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. - №11. - С. 18-20.

24. Краснов В.А., Урсов И.Г. Бактерицидная терапия больных туберкулезом // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. -№3.-С. 21-26.

25. Лазарева Н.Б., Хайменова Т.Ю., Хайменов А.Я. Роль респираторных фторхинолонов в лечении туберкулеза легких при неэффективности препаратов первой линии // Антибиотики и химиотерапия. 2008. -Том. 53.-№5-6.-С. 14-19.

26. Левашев Ю.Н., Шеремет А.В., Гришко А.Н. Динамика развития эпидемической ситуации с туберкулезом на территориях СевероЗападного Федерального Округа РФ в 2001-2006 гг. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2008. — № 4. — С. 3-4.

27. Липин М.Ю. Генетические механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis.: дис. . канд. биол. наук: 03.00.07.: защищена 27.05.04: утв. 15.11.04 / Липин Михаил Юрьевич. — М., 2004. 141 с.

28. Ломакин А.В., Ягудина Р.И., Соколова Г.Б. Обзор фармакоэкономических исследований, посвященных проблеме лекарственно-устойчивого туберкулеза // Антибиотики и химиотерапия. 2006. — № 12. - С. 51-53.

29. Маркелов Ю.М., Дородная И.А. Лекарственно-устойчивый туберкулез в республике Карелия // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2007.-№8.-С. 8-10.

30. Медицинская микробиология / Под. ред. Покровского В.И. М.: ГЭОТАР-МЕД. - 2001. - 768 с.

31. Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез. М., 2001. — 68 с.

32. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2004. - Том 6. - № 4. - С. 306359.

33. Мишин В.Ю., Борисов С.Е., Аксенова В.А., Васильев И.А., Дорожкова И.Р., Сафонова С.Г., Сидорова С.В. Диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005. - № 3. - С. 47-64.

34. Мишин В.Ю., Чуканов В.И., Васильева И.А. К проблеме оптимизации и доказательности современных режимов химиотерапии туберкулеза легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2004. № 8. — С. 7-11.

35. Молофеев А.Н., Шелудько А.П., Жукова JLA. Анализ эпидемической ситуации по туберкулезу и пути оптимизации борьбы с ним в пенитенциарных учреждениях Ульяновской области // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. — № 3. — С. 3-6.

36. Морозова Т.И., Завалев В.И., Троицкий В.В. Программа выявления и лечения больных туберкулезом в Саратовской области // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. — № 8. — С. 19-20.

37. Муканбаев К., Владимирский М.А., Шипина JI.K., Александров А.А. Значение молекулярно-биологических методов в диагностике мочеполового туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 4. — С.40-42.

38. Наркевич М.И., Фролова О.П., Кочетков Н.М. Основные пути оптимизации профилактики туберкулеза у ВИЧ-инфицированных // ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 1998. - Том 2. - № 1. — С. 76-79.

39. Нечаев В.И., Крылов В.В., Хованов А.В., Лебедев В.М., Бакуленков М.Н. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Тверской области // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2004. № 9. - С. 18-22.

40. Нечаева О.Б., Скачкова Е.И. Фибриозно-кавернозный туберкулез легких в Свердловской области // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. - № 9. - С. 22-25.

41. Никишова Е.И., Низовцева Н.И., Марьяндышев А.О. Анализ случаев смерти от туберкулеза в Архангельской области в 2004г. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2006. - № 12. - С. 54-57.

42. Панова Л.В., Овсянкина Е.С. Лечение и исходы туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью МБТ у детей и подростков // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007. - № 5. -С. 20-25.

43. Панова Л.В., Овсянкина Е.С., Стахеева Л.Б. Эпидемическая ситуация по лекартвенно-устойчивому туберкулезу среди детей и подростков жителей Москвы // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2006. — №7.-С. 21-22.

44. Перельман М.И., Хомяков Ю.Н., Киселев В.И., Северин Е.С., Пальцев М.А Молекулярная медицина1 и лечение туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2001. — № 3. — С. 20-25.

45. Приймак А.А. Туберкулез и миграция // Туберкулез и экология. — 1994.-№ 1.-С. 4-6.

46. Приказ №558 МЗ СССР от 8 июня 1978 г. "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе". — Москва. 1978.-72 с.

47. Приказ № 109 от 21 марта 2003 г. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации. — М.: Министерство здравоохранения РФ.

48. Саенко Г.И. Показатель заболеваемости населения туберкулезом в Ростовской области в период ухудшения эпидемической ситуации // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005. - № 4. — С. 14-17.

49. Сазыкин B.JL, Сон И.М. Комплексная оценка эпидемической ситуации по туберкулезу в России // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2006:10.-С. 65-69.

50. Севастьянова Э.В., Петрова JI.B. Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Республике Марий Эл // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2008. № 9. — С. 13-16.

51. Сидоренко С.В. Современные проблемы диагностики и лечения туберкулеза // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Том 8. — № 44. — С. 3-5.

52. Скотникова О.И., Носова Е.Ю., Галкина К.Ю. Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-биологическими методами // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2006. - № 7. - С. 57-60.

53. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А., Маух X., Николенко Е.Н. Тестирование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с использованием различных методов // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2001. - № 5. — С. 43-45.

54. Соколова Г.Б., Куничан А.Д., Можокина Г.Н., Цыбанев А.А., Лазарева Я. В., Ел истратова Н.А. Новые технологии химиотерапии туберкулезной инфекции // Антибиотики и химиотерапия. — 2000. — Том 9.-№45.-С. 30-37.

55. Стародубов В.И., Литвинов В.И., Сон И.М., Сельцовский П.П. Туберкулез у мигрируещего населения и его влияние на эпидемическую ситуацию в крупном мегаполисе // Проблемы туберкулеза. 2002. - № 6. - С. 5-7.

56. Стародубов В.И., Перельман М.И., Борисов С.Е. Туберкулез в России. Проблемы и пути их решения // БЦЖ. 1999. — № 3. - С. 8-10.

57. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - № 4. — С. 39-42.

58. Туберкулёз. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Барри Р. Блума. М.: Медицина. - 2002. - 696 с.

59. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О., Бьюне Г., Сандвен П., Каугант Д.А. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза генотипа BEIJING в местах лишения свободы Архангельской области // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2004. — № 8. С. 35-40.

60. Фролова О.П. Эпидемическая ситуация по туберкулезу среди больных ВИЧ-инфекции в России и система мер его профилактики // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2001. - №5. — С. 31-34.

61. Хауадамова М.М., Аденов Э.А., Берикова A.M., Алтаева Г.Т. Лечение рецидивов туберкулеза легких препаратами резервного ряда при наличии резистентности / В сб.: Медицина и жизнь: Материалы юбилейной сессии. — М. 2001. - С. 235.

62. Цыбикова Э.Б., Сон И.М. Динамика показателей заболеваемости и смертности от туберкулеза в России в 2005г. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007. - № 3. - С. 8-11.

63. Чуканов В.И., Каминская Г.О., Ливчане Э. Частота и характер побочных реакций при лечении больных туберкулезом легких противотуберкулезными препаратами резервного ряда // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. — № 10. — С.6-9.

64. Чуканов В.И., Комисарова О.Г., Мишин В.Ю., Абдуллаев Р.Ю., Кононец А.С. Эффективность нового стандартного режимахимиотерапии при лечении больных с рецидивами туберкулеза легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2006. - № 8. - С. 9-12.

65. Чучалин А.Г. Новое поколение противотуберкулезных препаратов // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2000. - № 5. - С. 6-8.

66. Шаханина И.Л., Игонина Е.П., Брико Н.И. Смертность от инфекционных болезней в различных регионах мира // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. - № 3. — С. 59-61.

67. Шемякин П.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Иванов И.Ю., Лазарев А.А., Скалдина А.А., Левачева В.А. Изучение вирулентности клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. — № 1. — С. 7-11.

68. Шилова М.В. Туберкулез в России в конце XX века // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2001. — № 5. — С. 8-13.

69. Шилова М.В., Хрулева Т.С. Эффективность лечения больных туберкулезом на современном этапе // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2005. -№ 3. С. 3-11.99,Энциклопедыя лекарств / Под. ред. Вышковского Г.Л. М.: ООО РЛС. -2003.-1437 с.

70. Якубовяк В., Коробицын А., Малахов К. Рекомендации по снижению заболеваемости туберкулезом среди населения с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005. - № 4. - С. 40-63.

71. Asian G., Tezcan S., Serin M.S., Emekdas G. Genotypic analysis of isoniazid and rifampin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in Southern Turkey // J. Infect. Dis. 2008. -Vol. 61.-P. 255-260.

72. Aubry A., Pan X.S., Fisher L.M., Jarlier V., Cambau E. Mycobacterium tuberculosis DNA gyrase: interaction with quinolones and correlation with antimycobacterial drug activity // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. -Vol. 48. -Р.128Ы288.

73. Augustynowicz-Kope E., Sekiguchi J.-I., Miyoshi-Akiyama T. Detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis II J. Clin; Microbiol. -2007. -Vol. 45.-No 1.-P. 179-192.

74. Bishop K. S., Blumberg L., Trollip A. P., Smith A. N., Roux L., York D. F., Kiepiela P. Characterisation of the pncA gene in Mycobacterium tuberculosis isolates from Gauteng, South Africa // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2001.-Vol. 5.-No. 10.-P. 952-957.

75. Bobrik A., Danishevski K., Eroshina К., McKee M. Prison health in Russia: the larger picture // J. Public Health Policy 2005. - Vol. 26. -No 1.-P. 30-59.

76. Brunello F., Fontana R. Reliability of the MB/BacT system for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis complex isolated to antituberculosis drugs // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - No. 6. -P. 872-873.

77. Cave D.M., Murray M., Nardell E. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis // Tuberculosis and the tubercle bacillus. / Ed.by: Cole S.T., Eisenach K.D., Mc Murray D.N., Jacobs W.R., Jr. -Washington: ASM Press. 2000. - P. 33-46.

78. Duman N., Cevikbas A., Johansson C. The effects of rifampicin and fluoroquinolones on tubercle bacilli within human macrophages // Int. J. Antimicrob. Agents. 2004. - Vol. 23. - No. 1. - P. 84-87.

79. Escalante P., Ramaswamy S., Sanabria H., Soini H., Pan X., Valiente-Castillo O., Musser J.M. Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru // Tuber. Lung Dis. 1998. -Vol. 79. — No. 2.-P. 111-118.

80. Ferraro M.J. Should We Reevaluate Antibiotic Breakpoints? // Clinical Infectious Diseases. -2001. Vol. 33. -No.3. - P. 227-229.

81. Freixo I.M., Caldas P.C.S., Martins F., Brito R.C., Ferreira R.M.C., Fonseca L.S., Saad M.H.F. Evaluation of E test strips for rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. — 2002. Vol. 40. - No. 6. - P. 2282-2284.

82. Fu L. M., Shinnick Т. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips // J. of Infection 2007. - No. 54. - P. 277-284.

83. Garg A., Srivastava S., Ayyagari A., Katoch V.M., Dhole T.N. embB gene mutations associated with ethambutol resistance in Indian strains of Mycobacterium tuberculosis II Current Science. — 2006. — Vol. 91. — No. 11.-P. 1512-1517.

84. Ginsburg A.S., Grosset J.H., Bishai W.R. Fluoroquinolones, tuberculosis, and resistance // Lancet Infect. Dis. 2003. Vol. 3. - No. 7. -P. 432-42.

85. Gordon S.V., Heym В., Parkhill J., Barrell В., Cole S.T. New insertion sequences and a novel repeated sequence in the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv II Microbiology. 1999. - Vol. 145. - P. 881-892.

86. Gould I.M. Towards a common susceptibility testing method? // J. of Antimicrobal Chemotherapy. 2000. - Vol. 45. - P. 757-762.

87. Habeenzu C., Mitarai S., Lubasi D., Mudenda V., Kantenga Т., Mwansa J., Maslow J. N. Tuberculosis and multidrug resistance in Zambian prisons, 2000-2001 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - Vol. 11. - No. 11. -P. 1216-1220.

88. Johnson R., Jordaan A.M., Pretorius L., Engelke E., Spuy G., Kewley C., Bosman M., Helden P.D., Warren R., Victor T.C. Ethambutol resistance testing by mutation detection // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006. - Vol. 10. - No. l.-P. 68-73.

89. Johnson R., Streicher E.M., Louw G.E., Warren R.M., Helden P.D., Victor T.C. Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis II Curr. Issues Mol. Biol.-2005.-No. 8.-P. 97-112.

90. Kamerbreek J., Schouls L., Kollc A. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. // J. Clin. Microbiol. 1997. - No. 35. - P.907-914.

91. Kent P. Т., Kubica G.P. Public health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Atlanta: Center for Disease Control, PHS, HEW, 1985.-210 p.

92. Kim S.J. Drug-susceptibility testing in tuberculosis: methods and reliability of results // European Respiratory Journal. — 2005. Vol. 25. — No. 3.-P. 564-569.

93. Kovalev S.Y., Kamaev E.Y., Kurepina N.E. Genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian

94. Federation, by MIRU-VNTR genotyping // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2005. Vol. 9. - No. 7. - P. 746-752.

95. Lee A.S.G., Lim I.H.K., Tang L.L.H., Telenti A., Wong S.Y. Contribution of kasA analysis to detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in Singapore // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - No. 8. - P. 2087-2089.

96. Lee A.S.G., Teo A.S.M., Wong S.-Y. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates // Antimicrob. Agents Chemother. -2001. Vol. 45. -No. 7. -P. 2157-2159.

97. Lee K.W., Lee J.-M., Jung K.-S. Characterization of pncA mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis in Korea I I J. Korean Med. Sci. -2001. No. 16. - P. 537-543.

98. Leegaard T.M., Caugant D.A., Froholm L.O. Hoiby E.A. Apparent differences in antimicrobial susceptibility as a consequence of national guidelines // Clinical Microbiology and Infection. 2000. - Vol. 6. - No. 6. -P. 290-293.

99. Legrand J., Sanchez A., Pont F.L., Camacho L., Larouze B. Modeling the impact of tuberculosis control strategies in highly endemic overcrowded prisons // PLoS ONE. 2008. - Vol. 3. -No. 5. - P. 2100.

100. Mani C., Selvakumar N., Narayanan S., Narayanan P.R. Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - No. 8. -P. 2987-2990.

101. Maus C.E., Plikaytis B.B., Shinnick T.M. Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - Vol. 49. - No. 2. - P. 571-577.

102. Maus C.E., Plikaytis B.B., Shinnick T.M. Molecular analysis of cross-resistance to capreomycin, kanamycin, amikacin, and viomycin in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. — 2005. — Vol. 49. No. 8.-P. 3192-3197.

103. Molecular genetics of Mycobacteria II Ed. by: Hatfull G.F. and Jacobs W.R., Jr. Washington: ASM Press. - 2000. - 363 p.

104. Morlock G.P., Crawford J.T., Butler W.R., Brim S.E., Sikes D., Mazurek G.H., Woodley C.L., Cooksey R.C. Phenotypic characterization of pncA mutants of Mycobacterium tuberculosis I I Antimicrob. Agents Chemother. -2000.-Vol. 44.-No. 9.-P. 2291-2295.

105. Nair J., Rouse D.A., Bai G.H., Morris S.L. The rpsL gene and streptomycin resistance in single and multiple drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis II Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 10. - No. 3. -P. 521-527.

106. Peffer N.J., Hanvey J.C., Bisi J.E., Thomson S.A., Hassman C.F., Noble S.A., Babiss S.E. Strand-invasion of duplex DNA by peptide nucleic acid oligomers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. -P. 10648-10652.

107. Pfyffer G.E., Strassle A., van Gorkum Т., Portaels F., Rigouts L., Mathieu C., Mirzoyev F., Traore H., van Embden J.D.A. Multidrug-resistant tuberculosis in prison inmates Azerbaijan // Emerging Infection Diseases.-2001.-Vol. 7.-No. 5.-P. 855-861.

108. Plinke C., Rusch-Gerdes S., Niemann S. Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates // Antimicrob. Agents Chemother. — 2006. Vol. 50. - No. 5. - P. 1900-1902.

109. Ramaswamy S. V., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tubercle and Lung Dissease. 1998. - Vol. 79. - No. 1. - P. 3-29.

110. Scorpio A., Lindholm-Levy P., Heifets L., Gilman R., Siddiqi S., Cynamon M., Zhang Y. Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 1997. - Vol. 41. - No. 3. - P. 540-543.

111. Scorpio A., Zhang Y. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drugpyrazinamide in tubercle bacillus // Nat. Med. 1996. - Vol. 2. - No. 6. — P. 662-667.

112. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Ivanov I.Y. Characterization of M. tuberculosis strains isolated from Russian prisoners // Int. J. Tuberc. Lung Dis.-2001.-No. 5.-P. 237.

113. Somoskovi A., Parsons L.M., Salfinger M. The molecular basis of resistance to isoniazid, rifampin, and pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis // Respir. Res 2001. - Vol. 2. - No. 3. - P. 164-168.

114. Sugawara I., Otomo K., Yamada H., Wang G., Du C., Shi R., Zhang G. The molecular epidemiology of. etambutol-resistant Mycobacteriumtuberculosis in Henan Province, China // Jpn. J. Infect. Dis. — 2005. Vol. 58.-No. 6.-P. 393-395.

115. Suzuki Y., Katsukawa C., Tamaru A., Abe C., Makino M., Mizuguchi Y., Taniguchi H. Detection of kanamycin-resistant Mycobacterium tuberculosis by identifying mutations in the 16S rRNA gene // J. Clin. Microbiol. 1998.-Vol. 36.-No. 5.-P. 1220-1225.

116. Suzuki Y., Suzuki A., Tamaru A., Katsukawa C., Oda H. Rapid detection of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis by a PCR-based in vitro system // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - No. 2. -P. 501-507.

117. Turnidge J., Paterson D.L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 20. - No. 3. -P. 391-408.

118. Whitney J.B., Wainberg M.A. Isoniazid, the frontline of resistance in Mycobacterium tuberculosis // MJM. — 2002. — Vol. 6. — No. 2. — P. 114-123.

119. Zhang Y., Scorpio A., Nikaido H., Sun Z. Role of acid pH and deficient efflux of pyrazinoic acid in unique susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide // J. of Bacteriology. 1999. - Vol. 181. — No. 7.-P. 2317-2319.

120. Zignol M., Hosseini M.S., Wright A., Lambregts van Weezenbeek C., Nunn P., Watt C.J., Williams B.G., Dye C. Global Incidence of Multidrug-Resistant Tuberculosis // The Journal of Infectious Diseases. — 2006. — Vol. 194.-P. 479-485.

121. CN-36 2006 Inh, Rif, Emb, Sm, Cap, Oix безуспешно 2006 Eth, Ofx, PAS, Cap 1988 M фиброзно-кавернозный нет

122. CN-7 1997 Rif, PAS, Ofx, Cap, Pza, Eth безуспешно 2007 PAS, Ofx, Cap, Pza 1958 M фиброзно-кавернозный нет6CN-185 2004 Inh, Rif, Sm, Emb безуспешно 2007 PAS, Ofx, Cap, Pza, Inh, Eth,Rif 1964 M фиброзно-кавернозный нет

123. MS-52 2001 Inh, Rif, Emb, Sm безуспешно 2007 PAS, Ofx Pza, Cap 1965 M фиброзно-кавернозный почечнокамешшая болезь

124. CN-21 2001 Inh, Rif, Emb, Sm безуспешно 2007 Sm, Inh, Rif, Eth, Ofx, Cap, PAS 1961 M фиброзно-кавернозный нет

125. CN-30 1995 Rif, Emb, Sm безуспешно 2007 Eth, Ofx, PAS, Rif, Pza, Cap 1952 M фиброзно-кавернозный ишемическая болезнь сердца

126. CN-36 2006 Inh, Rif, Emb, Sm, Ofx, Pza безуспешно 2007 Eth, Ofx, Amk, Cap, PAS 1988 M фиброзно-кавернозный нет

127. CN-14 2005 Inh, Rif, Emb, Sm, Cap, Pza, Ofx безуспешно 2007 Pza, Eth, Cap, Ofx, PAS 1969 M фиброзно-кавернозный гепатит Б

128. CN-37 2004 Inh, Rif, Emb, Pza безуспешно 2007 Inh, PAS, Pza, Eth, Cap, Ofx 1986 ж фиброзно-кавернозный альвеолярный протеиноз

129. CN-15 2006 Кпацнд безуспешно 2007 Inh, Rif, Emb, Amk, Ofx 1988 M инфнльтративный нет

130. MS-8 2003 Inh, Rif, Emb, Sm безуспешно 2007 PAS, Cap, Amk, Ofx, Inh, Rif, Sm, Emb 1959 M фиброзно-кавернозный гастрит

131. MS-43 2005 нет данных безуспешно 2007 Rif, Ofx, Inh, Sm, Emb 1951 M диссеминированный нет

132. CN-11 2004 Inh, Rif, Emb, Sm безуспешно 2007 Ofx, PAS, Pza, Amk, Cap 1979 M инфильтративный нет

133. CN-22 1995 Inh, Rif, Emb, Sm безуспешно 2007 Ofa, PAS, Pza, Amk, Cap 1952 M фиброзно-кавернозный ишемическая болезнь сердца

134. CN-23 2002 Inh, Rif, Emb, Sm, Cap, Pza безуспешно 2007 Inh, PAS, Cap, Ofx 1981 M фиброзно- кавернозный нет

135. CN-31 2002 Inh, Rif, Emb, Sm, Pza безуспешно 2007 Inh, Ofx, Eth, PAS, Cap 1981 M фиброзно-кавернозный нет6CN-200 2006 Ofx, Emb, Pza, Amk безуспешно 2007 Inh, Eth, PAS, Cap, Ofx 1955 M фиброзно-кавернозный нет

136. MS-54 2005 Rif, Inh, Sm, Emb, Ofx, Pza безуспешно 2007 Eth, Ofa, PAS, Sm 1970 M инфильтративный нет

137. CN-3 2004 Inh, Rif, Pza безуспешно 2007 PAS, Ofa, Cap, Eth 197 M диссеминированный бронхиальная астма

138. MS-56 2004 нет данных безуспешно 2007 Inh, Ofx, Emb, Km, Pza 1977 M туберкулема бронхит

139. MS-61 2001 Inh, Rif, Emb, Pza безуспешно 2007 Amk, Ofx,Lev, Pza PAS, Cs 1960 ж фиброзно- кавернозный нет

140. CN-2 2005 Inh, Rif, Pza, Eth безуспешно 2007 Pza, Ofx, PAS, Cap 1985 M инфильтративный нет данных

141. CN-8 1996 Emb, Pza, Ofx, Amk безуспешно 2007 Pt, Ofx, PAS, Pza, Cs, Cap 1955 M кавернозный нет6CN-240 2004 нет данных безуспешно 2007 Sm, Inh, Rif, Eth, Pza, Pt, Cs, Ofx 1986 M инфильтративный нет

142. CN-10 1999 Pza, Ofx, PAS, Pt, Cs безуспешно 2007 Pza, Ofx, PAS, Pt, Cs 1969 M фиброзно-кавернозный гепатит В2122/41 1980 Inh, Rif, Emb, Sm, PAS безуспешно 2007 Eth, Ofx, PAS, Pza 1974 M фиброзно-кавернозный нет

143. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена рпсА различных штаммов М. tuberculosis

144. H37RV GGTTGGGTGGCCGCCGCTCAGCTGGTCATGTTCGCGATCGTCGCGGCGTCATGGACCCTATATCTGTGGCTG-CCGCGTC 79

145. H37RV GGTAGG-CAAACTGCCCGGGCAGTCGCCCGAACGTATG-GTGGACGTATGCGGGCGTTGATCATCGTCGAC-GTGCAGAA 156

146. H37RV TCCTCGTC--------GTGGCCACCGCATTGCGTCAGCGGTACTCCCGGCGCGGACTTCCATCCCAGTCTGGA- -CACGT 386

147. H37RV CGGCAATCGAGGCGGTGTTCTACAAGGGTGCCTACACCGGAGCGTACAGCGGCTTCGAAGGAGTCGACGAGAACGGCACG 466

148. H37RV CCACTGCTGAATTGGCTGCGGCAACGCGGCGTCGATGAGGTCGATGTGG—TCGGTATTGCCACCGATCATTGTGTGCGC 544

149. H37RV CAGACGGCCGAGGACGCGGTACGCAATGGCTTGGCCACCAGGGTGCTGGTGGACCTGACAGCGGGTGTGTCGGCCGATAC 624

150. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

151. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

152. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCGCC

153. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

154. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG-- -CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG—-CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG—

155. CACCGTC G С CGCACTGGA GGAGATGCGCACCG--

156. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG-- -CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG—-CACCATCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCAC

157. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

158. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

159. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

160. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

161. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

162. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--

163. CACCGTCGCCGCGCCGGAGGAGATGCGCACCG--

164. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG-- -CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG—-CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG— -CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG--1. CACCGT С

165. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCGACCGCCAGCGTCGAGTTGGTTTGCAGCTCCTGATGGCACCGCCGAAC

166. CACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCG----CCAGCGTCGAGTTGGTTTGCAGCTCCTGATGGCACCGCCGAACC639667 636 643 643638639 647 639 657 606668 669665 664666 638643 638 646 654644 173246 66230 273234235 214 214 193247 249247 243 251248 248 700

167. H37RV GGGATGAACTGTTGGCGGCGGTGGAGCGCTCGCC-GCAAG------С667667 681671672 666 677 679 685 704 606668 669665 664666 666671 666 674 700672 173246 66230 273234235 214 214 193247 249247 243 251248 248 740

Информация о работе

Низова, Анастасия Валерьевна
кандидата биологических наук
Оболенск, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы