Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность

Маничева, Ольга Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность"

Маничева Ольга Алексеевна

На правах рукописи ф

III!! II III III II!

ÜÜ34G5731

ПРОБЛЕМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: УСКОРЕННОЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ, КОНТРОЛЬ АДЕКВАТНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ, ВИРУЛЕНТНОСТЬ

03.00.07. - микробиология

- 3 ПЕН 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2009

Диссертация выполнена в Федеральном Государственном учреждении "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства высоких медицинских технологий"

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор

Вишневский Борис Израилсвич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кокряков Владимир Николаевич

доктор биологических наук, профессор Заикина Надежда Александровна

доктор медицинских наук Кафтырева Лидия Алексеевна

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится "Л " Л^л) 2009 г. в _часов на заседании диссертационного совета ДМ иО1.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан " $ " / _2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурова Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Mycobacterium tuberculosis продолжает оставаться "успешным" патогеном и в ÍXI веке, так как, несмотря на достижения медицины, проблема туберкулеза остался актуальной для большинства стран. Высокую адаптивную способность вида 4ycobactcrium tuberculosis доказывает и очень быстрое его приспособление к новым 'словиям в эру применения антибактериальных препаратов - селекция и распро-траненис лекарственноустойчивых штаммов. Наблюдающийся в последние годы юдъем лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, а также утяжеле-ше ее структуры за счет роста множественной лекарственной устойчивости (Виш-[евский Б.И. и др., 1997: Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., 2003; Дорожкова И.Р.и ip., 2000; Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999; Goldman R.C., et al., 2007; Dye С., 000; Su W.J., et al., 2008) значительно усложняет задачу лечения туберкулеза. Хи-гаотерапия остается основным методом лечения больных туберкулезом, который |беспечиваст прекращение бактериовыделения и прерывает распространение возбу-[ителя. Широкое распространение в последние годы штаммов M.tuberculosis, ири-[адлежащих к семейству Beijing, которое часто ассоциировано с высокой трансмис-ивностью, множественной лекарственной устойчивостью и более тяжелыми и рас-[ространенными формами туберкулезного процесса (Кондакова М.Н., 2005; Нарв-кая О.В., 2003; Сапожникова Н.В., 2003; Drobnicwski F. et al., 2005; Park Y.К. et al., ,005), еще более актуализирует задачу быстрого выявления наиболее эпидемиоло-ически опасных M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. В тих условиях возрастает роль бактериологических лабораторных методов опреде-ения резистентности M.tuberculosis и контроля адекватности химиотерапии.

Сегодня как никогда раньше, клиницисты заинтересованы в получении результатов определения лекарственной устойчивости в кратчайшие сроки. Учет результатов определения резистентности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам стандартным методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левен-штейна-Йснссна производится на 21 сутки после посева культуры. На жидких средах микобактерии растут быстрее, но есть проблема визуализации их роста. В настоящее время для быстрого определения лекарственной устойчивости разработаны

и используются системы бульонного культивирования, основанные на радиометрической, манометрической, колориметрической или флуоресцентной индикации роста M.tuberculosis в жидких средах - ВАСТЕС 460, МВ-ВАСТ, BBL-MGIT, ВАСТЕС MGIT 960, Versa Trek System (Иртуганова О.А. и др., 2000, 2001, а, б.; Palomino J.C. et al., 1999; Siddiqi S.H. et al., 1981; Zwolska Z. et al, 1999). С помощью этих систем спектр устойчивости может быть определен на 3-16 сутки прямым или непрямым методом. Молекулярно-генетические методы позволяют определить устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, ниразинамиду по наличию мутаций в ДНК микобакгерий, по сути, в день поступления патологического материала. Но перечисленные выше методы требуют дорогостоящего аппаратурного оснащения и значительного финансирования и потому доступны лишь большим централизованным референс-лабораториям. Кроме того, наличие мутаций в генах не всегда проявляется фенотипически и на сегодняшний день выявлены не все мутации (Грядунов Д.А. и др., 2001; Литвинов В.И., 2001; Скрягина Е.М. и др., 2001; Bcrgval I.L. et al., 2007; Cardoso R.F. et al., 2007; Sekiguchi J. et al., 2007). Существующие фе-нотипичсские микрометоды определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis на основе жидких сред небезопасны, требуют дополнительного оснащения реактивами, расходными материалами, оборудованием (Cavicdes L. et al., 2002; Collins L.A., Franzblau S.G., 1997; Banfi E. et al., 2003). В связи с этим чрезвычайно актуальной проблемой является разработка дешевых, безопасных, простых и доступных для лабораторий любого уровня методов ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бакгериостатической активности крови (БАК), или туберкулостатической пробы, гак как это позволит клиницистам в короткие сроки выработать оптимальную тактику химиотерапии туберкулеза в зависимости от свойств возбудителя.

ги факторы, происходит только в адекватных условиях внутренней среды макроор-анизма-хозяина, а рост бактерий на искусственных питательных средах в отсутст-ие атак иммунной системы не требует реализации действия этих генов (Сидоренко ХВ., 1999; Caviedes L. et al., 2002; Srivastava V. et al., 2007). Кроме того, изучение ;акторов вирулентности в основном проводится при сравнении вирулентных и ави-улентных (лабораторных или мутантных, полученных с помощью делеции генов) ггаммов, сильно отличающихся друг от друга по степени патогенности. Все клини-еские изоляты безусловно вирулентны, коль скоро вызвали болезнь, однако, разли-ия между штаммами, принадлежащими к генетическим кластерам разных объемов, югут быть менее отчетливы. В связи с этим актуальной является проблема адек-атной оценки вирулентности М.tuberculosis разных генотипов. Существующие ме-оды исследования вирулентности М.tuberculosis на различных моделях с использо-анием животных или молекулярно-генетических методов и их комбинаций очень ороги, длительны, доступны очень немногим лабораториям, оснащенным высоко-ехнологичным оборудованием, и не позволяют провести исследование достаточно ольшого числа штаммов различных генотипов с целью их сравнительной оценки, [спользование тканевой культуры макрофагоподобных клеток человека в качестве юдели для изучения одного из свойств вирулентности M.tuberculosis - способности ызывать некроз макрофагов (цитотоксичности), помогает решить проблему в трех ланах. Во-первых, исследовать достаточно большое число клинических штаммов, о-вторых, уменьшить влияние видовой и индивидуальной генетической гетеро-гнности, которое весьма существенно влияет на оценку вирулентности при исполь-эвании животных и макрофагов ex vivo, и, в-третьих, количественно оценить, об-азно говоря в "чистом виде", вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis азличных генотипов и ее связь (или ее отсутствие) с лекарственной устойчивостью. 1ценить пригодность такого метода для поставленной цели представляется возмож-ым при сравнительном исследовании вирулентности M.tuberculosis генотипов Being и иных генотипов.

Цель работы: обосновать применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови для лабораторного контроля адекватности терапии, изучить вирулентность (цито-

токсичность) M.tuberculosis в зависимости от генотипа и лекарственной устойчивости возбудителя.

Задачи исследования:

1. Исследовать возможность определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis посредством биохимической индикации метаболической активности микобактерий.

2. Разработать питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Провести сравнительное исследование лекарственной устойчивости клинических штаммов M.tuberculosis с помощью ускоренного и стандартного методов.

3. Исследовать бактериостагическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью стандартных методов, используя выделенные аутош-таммы M.tuberculosis, сопоставить полученные результаты с устойчивостью M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам и течением туберкулезного процесса. Дать оценку туберкулостатической пробе как методу бактериологического контроля адекватности химиотерапии.

4. Разработать ускоренный метод определения бактериостатической активности крови с помощью полужидкой питательной среды. Исследовать бактериостатиче-скую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью ускоренного метода, сопоставить полученные результаты с клиническими и бактериологическими данными.

5. Исследовать вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis по их способности активировать гибель макрофагов (цитогоксические свойства), сопоставить уровень вирулентности с генотипом и устойчивостью возбудителя.

Научная новизна

Впервые разработана полужидкая питательная среда, позволяющая получить визуально наблюдаемый рост культуры M.tuberculosis на 3-5 сутки после инокуляции суспензии. Разработанный ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину дает возможность иметь данные об устойчивости культуры к этим препаратам на 3-5-е сутки, о чувствительности - на 7-е после посева суспензии штамма M.tuberculosis.

предложенный метод позволяет на 2 недели раньше в сравнении со стандартным методом на плотной яичной среде Левенштейна-Иенсена изменить терапию, что зсобенно важно в связи со значительным увеличением множественной лекарствен-юй устойчивости. 1

Впервые методом вертикальной диффузии показана четкая зависимость вели-шны бактериостатической активности крови от устойчивости клинического изолята с изониазиду. С помощью разработанного ускоренного метода сопоставлены ре-(ультаты определения туберкулостатической пробы как лабораторного метода контроля адекватности терапии и течения процесса у больных туберкулезом органов 1ыхания, и выявлена корреляция степени бактериостатической активности крови и |ффективности химиотерапии.

Впервые на модели in vitro при инфицировании дифференцированных клеток шнии ТНР-1 микобактериями туберкулеза разных генотипов показано: наибольшая шрулентность (цитотоксичность) характерна для М.tuberculosis генотипа Beijing ва-шанта ВО; штаммы сборной группы других генотипов, обладали меньшей способ-юстью активировать некроз макрофагов; M.tuberculosis семейства LAM обладали юлярными по отношению к Beijing свойствами, вызывая некроз макрофагов в наименьшей степени; высокие цитотоксические свойства обнаружены у M.tuberculosis : множественной лекарственной устойчивостью. Положения, выносимые на защиту

1. Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов и выявить M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в течение 3-7 суток.

2. С помощью метода вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена показана корреляция величины бактериостатической активности крови больных туберкулезом и чувствительности M.tuberculosis к изониазиду. Применение плотных сред для определения бактериостатической активности крови некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к препарату, однако метод информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения:

показано увеличение концентрации препарата в крови и тканях и пролонгация эффекта при эндолимфатическом введении в сравнении с внутримышечным.

3. Величина бактериостатической активности крови, определяемой с помощью полужидкой среды, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса: наиболее тяжелые формы заболевания отмечаются при низких и нулевых значениях бактериостатической активности и множественной лекарственной устойчивости М.tuberculosis. Определение бактериостатической активности с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяют в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии.

4. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing ВО проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагонодобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-fi и уменьшать -нровоспалительного цитокина TNF-a. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитоток-сичностью, гак и с низкой.

Научно-практическая значимость работы

Разработанный на основе использования полужидкой среды ускоренный метод определения устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампи-цину, прост, дешев, безопасен и потому доступен любой практической фтизиобак-териологической лаборатории.

Метод ускоренного определения бактериостатической активности крови также может использоваться любой лабораторией и является надежным способом лабораторной оценки адекватности химиотерапии. Применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности крови дает возможность сократить сроки получения необходимых данных в 2-3 раза в сравнении со стандартными методами на плотных средах.

Вирулентность M.tuberculosis различных генотипов можно оценивать по их способности активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1.

Реализация результатов работы

Получен патент на изобретение "Питательная среда для ускоренного определена лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза" № 2226398 от 0.04.2004 .

Результаты исследования внедрены в практику работы Курского областного [ротивотуберкулезного диспансера, используются в клинике легочного туберкулеза [>ГУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмоно-югии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи", а акже в учебном процессе на кафедре фт изиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская 1едицинская академия последипломного образования Росздрава».

Апробация диссертационной работы

Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской онференции по внелегочному туберкулезу (Санкт-Петербург, 1997); заседаниях |бщества микробиологов г.Санкт-Пстсрбурга (2000, 2002); VIII Российском съезде зтизиатров (Москва, 2007); 17-ой Международной конференции "СПИД, рак и об-цественной здоровье" (Санкт-Петербург, 26.05-29.05.2008); Межрегиональном се-шнаре для заведующих бактериологическими лабораториями Северо-Западного Федерального Округа РФ (Санкт-Петербург, 29.09-01.10.2008), Всероссийской на-гчно-практической конференции "Актуальные вопросы лечения туберкулеза раз-шчных локализаций" (Санкт-Петербург, 29.09-31.09.2008).

Публикации

По материалам работы опубликовано 26 печатных работ, из них 9 статей в из-.аниих, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 72 отечественных и 202 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

1. Методы биохимической индикации роста М.tuberculosis С целью индикации роста М.tuberculosis в жидкой среде исследовали способность бактериальных суспензий обесцвечивать красители метиленовый синий и малахитовый зеленый. Вследствие нестабильности полученных результатов в последующих опытах в качестве индикатора жизнеспособности М.tuberculosis использовали другое соединение - 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид. В общей сложности в опытах использовали 5 музейных штаммов M.tuberculosis и 193 клинических. Суспензию M.tuberculosis концентрацией 0,5 мг/мл инкубировали в термостате в течение 7 суток. Затем вносили по 0,1 мл 2% раствора 2,3,5-1рифснилтетразолия хлорида и в течение 3, 6, 24 ч осуществляли повторное термостатирование для проявления окраски индикатора. В качестве второго контроля использовали осадок убитых автоклавированием микобактсрий. Учет реакции проводили визуально по трехбалльной системе от + до +++. Конечные концентрации противотуберкулезных препаратов в среде Сотона соответствовали таковым при стандартном определении лекарственной устойчивости M.tuberculosis за исключением рифампицина, активность которого в жидкой среде была выше, чем в плотной: - изониазид 1 мкг/мл, рифам-пицин - 2 мкг/мл стрептомицин - 5 мкг/мл, эгамбутол - 2 мкг/мл. Появление розового осадка на средах с противотуберкулезными препаратами свидетельствует о наличии резистентности M.tuberculosis к препарату.

2. Метод ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis с помощью полужидкой среды.

Исследование скорости роста клинических штаммов на разрабатываемой полужидкой среде проводили при помощи модифицированной среды Сотона (Щеголева P.A., 1989) с добавлением 0,35% питательного агара и 10% (52 штамма) или 25% лошадиной сыворотки (114 штаммов).

При отработке ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину, этамбутолу исследовали 4 музейных штамма - H37Rv-M, HivRv-fHCK, Academia, Erdman и в общей сложности 804 штамма M.tuberculosis, выделенных из материала больных туберкулезом

различных локализаций, противотуберкулезные препараты вносили в среды в конечных концентрациях: изониазид - 1мкг/мл, стрептомицин - 10 или 7 мкг/мп, ри-фампицин - 20 или 40 мкг/мл, этамбутол - 5 мкг/мл. Параллельно определяли лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштсйна-Йенсена. Для контроля качества стандартной и полужидкой сред использовали музейные штаммы M.tuberculosis: H37Rv, Erdman, Academia.

Пропись среды, разработанной для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis, приведена ниже.

Калия двухосновного фосфорнокислого - 0,5 г.

Магнезии сернокислой - 0,5 г.

Железа лимоннокислого аммиачного - 0,05 г.

Натрия лимоннокислого - 2,0 г.

L-аспарагина - 4,0 г.

Глицерина - 60 мл.

Питательного агара - 3,5 г.

Дистиллированной воды до 1 л.

Смесь подогревали до полного растворения солей, разливали в колбы и стерилизовали в автоклаве при 1 атм (120°С) 30 мин. В остывшую полужидкую основу асептически добавляли 25% лошадиной сыворотки. Затем в полужидкую среду вносили разведения противотуберкулезных препаратов конечных концентрациях, указанных выше.

Во всех опытах с использованием полужидкой среды готовили суспензии штаммов M.tuberculosis по стандарту мутности 5 ед., разводили в 10 раз и засевали в объеме 0,2 мл методом поверхностного наслоения (по стенке пробирки на поверхность полужидкой среды так, чтобы сохранялась фазность суспензии M.tuberculosis и среды) без перемешивания и встряхивания. Посевы инкубировали при 37°С. В первой серии опытов учет результатов производили на 3 - 22 сутки для выявления оптимального срока наблюдения, в последующих экспериментах - на 3-7 сутки после посева культуры M.tuberculosis.

M.tuberculosis растут в верхней части полужидкой среды в виде взвеси или облачка мелких или более крупных крошковидных колоний. При чувствительности M.tuberculosis к препарату среда остается равномерно прозрачной. Обязательное условие исследования при использовании полужидкой среды: микроскопия мазка по Циль-Нильсену исследуемой культуры M.tuberculosis. Верификация штамма по кислотоустойчивое™ необходима, чтобы исключить получение ложных данных при росте неспецифической микрофлоры в случае микст-культуры.

3. Методы определения бактериостатической активности крови

3.1. Метод серийных разведений сыворотки с использованием стандартной среды Левенштейна-Йенсена.

При отработке ускоренного метода определения бактериостатической активности крови в качестве метода сравнения использовали метод серийных двукратных разведений сыворотки К.П.Алексеевской (1979) с использованием стандартной плотной яичной среды Левенштейна-Йенсена. Всего проведено 48 исследований.

В 11 пробирок со средой Левенштсйна-Йенссна вносили 1 мл физиологического раствора. Сыворотку крови, взятой на пике концентраций вводимых противотуберкулезных препаратов, вводили в физраствор и разводили последовательно двукратно. Готовили суспензию M.tuberculosis, выделенных от данного больного, плотностью 5 ед. по стандарту мутности, разводили в 10 раз и вносили в разведения сыворотки в объеме 0,2 мл. Пробирки укладывали горизонтально так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность косяка среды. Посевы инкубировали ири 37°С в течение 14-21 дня.

3.2. Метод вертикальной диффузии.

Поверхность среды Левенштейна-Йенсена в пробирках Шмиделя (Schmiedel А., 1959) засевали 0,2 мл суспензии штамма M.tuberculosis, выделенного из материала обследуемого больного (аутоштамма). Суспензию готовили обычным способом. Посев термостатировали при стандартной температуре в течение суток. Затем вносили сыворотку крови в объеме 0,5 мл и вновь помещали посевы в термостат, располагая пробирки при этом строго вертикально. После 2-х недель инкубации при 37°С измеряли в мм зону задержки роста M.tuberculosis. Бактериостатическую активность оценивали как нулевую, если задержки роста не было, низкую - если зона

задержки роста была менее 24 мм, среднюю - от 25 до 40 мм, высокую - более 40 мм (Вишневский Б.И. и др., 1986). Всего исследовано 129 штаммов М.tuberculosis, выделенных из различного патологического материала, а также использовали чувствительные музейные штаммы M.tuberculosis H37Rv-rHCK и H37Rv-M для определения бактериостатической активности больных без бактсриовыделения.

Всего обследовано 174 больных туберкулезом органов дыхания, у которых провели 188 определений бактериостатической активности.

В исследованиях с использованием метода вертикальной диффузии в зависимости от бактериовыделения и чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам всс больные ретроспективно были разделены на 4 фуппы. I группа - 45 человек с туберкулезом органов дыхания без бактериовыделения. II группу (22 чел.) составили больные, выделяющие M.tuberculosis чувствительные ко всем противотуберкулезным препаратам. III группа была представлена 57 пациентами, у которых выделены штаммы, устойчивые к 1-3 противотуберкулезным препаратам за исключением изониазида. IV группа состояла из 50 больных с культурами, устойчивыми к изониазиду или устойчивыми к изониазиду в составе поли- или мультирезистентности. В каждой группе больных туберкулезом органов дыхания после определения бактериостатической активности и проведения соответствующей коррекции химиотерапии оценивали динамику специфического процесса на основании клинико-рентгено-лабораторных данных как "значительное улучшение", "улучшение", "стабилизацию" и "прогрессирование".

Метод вертикальной диффузии также применяли при исследовании фармакоки-нетики изониазида при различных способах его введения - внутримышечного и эн-долимфатического, в крови больных туберкулезом мочеполовой системы, а также для определения концентрации изониазида в послеоперационном материале больных туберкулезным эпидидимитом. Во всех исследованиях при этом использовали музейный штамм M.tuberculosis H37Rv. Патологический материал измельчали в ступке с песком, заливали 5% спиртом в соотношении 1 мл/100мг ткани. Взвесь помещали в стерильную пробирку и оставляли на 24 ч при комнатной температуре для экстракции изониазида. Затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. 0,5 мл супернатанта вносили в пробирку и проводили исследование описанным вы-

ше способом. Концентрацию препарата в экстракте ткани вычисляли с помощью калибровочной кривой, которую строили по данным, полученным при внесении в пробирки разведений изониазида от 0,15 мкг/мл до 4 мкг/мл. (Вишневский Б.И. и др., 1986).

Всего проведено 160 определений бактериостатической активности и бактериостатической активности ткани у 60 больных мочеполовым туберкулезом. В клиническом отделении мочеполового туберкулеза ФГУ СПб НИИ фтизиопульмоноло-гии Росмедтехнологий обследовали больных двух групп: в первой (25 пациентов) использовали внутримышечное введение изониазида, во второй (35 пациентов) эн-долимфатическое.

3.3. Метод ускоренного определения бактериостатической активности с помощью полужидкой среды.

С целью сравнительной оценки определяли бактериосгатическую активность при помощи различных сред: двух плотных - яичной Левенштейна -Йенсена (48 исследований, метод К.П.Алексеевской, 1979) и агаризованной Middlebrook 7Н10 с ростовой добавкой OADC (фирма Becton Dickinson, 19 исследований), одной жидкой - модифицированной среды Сотона (Щеголева P.A., 1989) с добавлением 10% лошадиной сыворотки (10 исследований) и параллельно во всех исследованиях использовали разработанную полужидкую среду. Сыворотку крови больных разводили последовательно двукратно средой Сотона, полужидкой средой или физраствором при использовании плотных сред (объем 1 мл). Готовили суспензию М.tuberculosis по стандарту мутности 5 ед., разводили ее в 10 раз и вносили в объеме 0,2 мл в разведения сыворотки. Посевы инкубировали при 37°С на иолужидкой среде 7 дней, на остальных средах - 14-21 день. Результат учитывали на среде Сотона по росту поверхностной пленки (Ягафарова Р.К. и др., 1986), на полужидкой среде -по появлению в верхней части среды облачка или взвеси мелких или более крупных крошковидных колоний, на плотных средах - стандартно. Бактериосгатическую активность считали высокой, если сыворотка задерживала рост M.tuberculosis в 5-10 разведении (1:32 - 1:1024), средней - 3-4 (1:8 - 1:16), низкой - 1-2 (1:2 - 1:4), нулевой - если сыворотка не задерживала рост M.tuberculosis ни в одном из разведений.

С помощью полужидкой среды бактериостатическую активность исследовали

в общей сложности у 101 больного туберкулезом органов дыхания с различными его формами. Бактериостатическую активность определяли в начале лечения, сразу после выделения культуры M.tuberculosis. Проводили ретроспективный анализ результатов определения бактериостатнческой активности в сопоставлении с бактериологическими данными и с клиническим течением специфического процесса. Больных разделяли на группы: 1 группа - высокие значения бактериостатнческой активности и чувствительность к изониазиду, 2- высокая бактериостатическая активность и резистентность к изониазиду (в составе moho-, поли- или мультирезист-нтности). Остальные - аналогичная устойчивость и значения бактериостатнческой активности: средние - 3 группа, низкие - 4, нулевые - 5. В каждой группе больных рассчитывали средний показатель длительности бактериовыделения и оценивали динамику специфического процесса на основании клинико-рентгено-лабораторных данных как "значительное улучшение", "улучшение", "стабилизацию" и "прогресси-рование", которым присвоили условные единицы, соответственно 4, 3, 2 и 1. Величину бактериостатнческой активности количественно оценивали в условных единицах, соответствующих номеру разведения сыворотки, например, если сыворотка задерживала рост M.tuberculosis в 6-ом разведении (1:64), то бактериостатическую активность считали равной 6. Лекарственную устойчивость M.tuberculosis определяли стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (Приказ № 109).

4. Методы исследования вирулентности M.tuberculosis in vitro

В течение 2005-2007 г.г. было исследовано в общей сложности 39 штаммов, выделенных от больных туберкулезом органов дыхания, и 4 музейных штамма: H37Ra, H37Rv, Erdman, M.bovis Ravenel. Информация о генотипах выделенных штаммов была представлена сотрудниками лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН СПб НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (руководитель лаборатории д.м.н. О.В.Нарвская). Принадлежность к генетическому семейству определяли путем сполиготипирования (Kamerbeek J. et al, 1997); штаммы генотипа Beijing далее типировали методом IS67/О-RFLP (Van Embden J.D. et al., 1993).

Таблица 1

Генотипы исследованных штаммов

Сполнготип IS-6110-RFLP Число штаммов

профиль

Beijing Во 12

Ао 5

В, 2

Со 1

неизвестный 1

LAM 9 R 11/42 7

Другой R 67/137, R30/254, 11

R19/269, и др.

Несколько штаммов из приведенного списка использовали только для отработки дозы заражения, сроков наблюдения.

Лекарственную устойчивость штаммов изучали непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Иенсена (Приказ № 109).

Больных туберкулезом органов дыхания, выделявших исследованные штаммы, объединяли в группы в соответствии с принадлежностью M.tuberculosis к тому или иному генотипическому кластеру: 1 группа - семейство Beijing тип АО, 2 группа -Beijing, тип ВО, 3 группа - сборная, 4 - LAM9. Ретроспективно пациентов характеризовали по диагнозу, возрастному составу, давности заболевания, бактериоскопии, длительности бактериовыделения, лекарственной устойчивости возбудителя.

Исследуемые штаммы M.tuberculosis пересевали на среду Левенштейна-Иенсена, в опытах использовали 2-ю - 5-ю генерации, возраст культуры - 3 недели. Готовили взвесь M.tuberculosis с помощью стеклянных бус и встряхивателя "Вор-текс", добавляя питательный бульон Middlebrook 7Н9 с ростовой добавкой OADC и 0,02% Tween 80. Затем суспензию оставляли на 1 час для осаждения крупных частиц, супернатант обрабатывали ультразвуком (ультразвуковая ванна УЗВ7-0,063/37), чтобы избавиться от агрегатов клеток M.tuberculosis. Затем взвесь клеток доводили до 5 ед. по стандарту мутности, разводили бульоном Миддлбрука в 10 раз и термостатировали при 37°С 3 суток. Полученную субкультуру обрабатывали ультразвуком повторно, доводили до оптической плотности, равной 0,066 и 0,033 при 600 нм (спектрофотометр "Ultraspcct 2000") с целью получения суспензии мико-бактерий заданной концентрации для последующего заражения клеток ТНР-1 в оп-

ределенной пропорции. Для измерения скорости роста посевы инкубировачи в течение 6 суток при 37°С, затем вновь измеряли оптическую плотность. Скорость роста вычисляли по формуле: v = OD6 : OD„cx, где v - скорость роста (размножения) штамма, OD6 - оптическая плотность суспензии на 6 сутки инкубации, OD„„ - оптическая плотность суспензии исходно.

В опытах использовали клетки ТНР-1 - человеческой моноцитоподобной клеточной линии. Клетки засевали в питательную среду DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров и выращивали при 37°С в 5% С02 (С02 -инкубатор МСО 5АС фирмы "Sanyo"). Затем моноциты помещали в 96-луночный планшет для культур клеток, по 50мкл/лунку. Конечное число клеток/лунку - 3x104. Диффсрен-цировку и адгезию клеток осуществляли форболовым эфиром (Sigma), добавляя его в конечной концентрации 50 нМ. Затем клетки инкубировали 48 ч при 37°С в 5% СС>2, среду меняли на свежую без форболового эфира и культивировали еще 24 ч часа в тех же условиях. Суспензии культур М.tuberculosis готовили описанным выше образом. Дифференцированные клетки ТНР-1, заражали микобакгериями в пропорции 1:1 бактерий/макрофаг. Через 2 часа инкубации при 37°С в 5% С02, клеточную культуру отмывали от нефагоцитированных М.tuberculosis (однократная отмывка стерильным фосфатным буферным раствором), добавляли свежую питательную среду и клетки культивировали в течение 6 суток. Затем макрофаги лизировали 10% раствором Triton (4 мкл/лунку) через 2 часа после заражения (0 сутки, контроль фагоцитоза) и через 6 суток. Серийные разведения лизатов (пул 2-х лунок) иноку-лировали в полужидкую среду Сотона (с добавлением 20% лошадиной сыворотки и 2 г/л глюкозы) для определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Результат учитывали на 21-28 сутки. Скорость роста М.tuberculosis в макрофагах вычисляли по формуле: v = logKOE6- 1о§КОЕф, где v - скорость роста (размножения) М.tuberculosis в ТНР-1, logKOE6 - десятичный логарифм числа КОЕ М.tuberculosis, высеянных из макрофагов на 6 сутки опыта, logKOE,», - десятичный логарифм числа КОЕ M.tubcrculosis, высеянных через 2 часа после заражения макрофагов (фагоцитированные М.tuberculosis). При исследовании цитотоксических свойств M.tuberculosis клетки ТНР-1 заражали в соотношении 50:1. Жизнеспособность макрофагов оценивали, используя тест с окрашиванием трипановым синим, выявляю-

щим мертвые (некротические) клетки (0,2% водный раствор, 100 мкл на лунку). С помощью инвертированного микроскопа подсчитывали процент мертвых клеток через 96 часов после заражения. Для исследования продукции цитокинов ТНР-1 заражали микобактериями в пропорции 10:1. Супернатант собирали через 24 и 96 ч после заражения. Концентрацию цитокинов (TNF-a и TGF-ß) в супернатанте определяли методом ELISA с помощью парных антител (тсст-система CytoSet фирмы "Biosource") на ридерс "Stat Fax 2100". С помощью калибровочной кривой вычисляли концентрацию цитокинов, которую выражали в пкг/мл.

Всс данные, полученные в экспериментах, обрабатывали статистически с помощью критериев t, г или %2.

Результаты исследований Разработка методов ускоренного определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis была начата с исследования красителей - метиленового синего, малахитового зеленого в качестве индикаторов роста M.tuberculosis, которое выявило их непригодность для решения поставленной задачи. Более стабильные результаты получены при использовании 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида. Тем не менее, низкая специфичность и чувствительность метода в отношении изониазида, стрептомицина, этамбутола ограничивает применение индикатора только для предварительного определения чувствительности M.tuberculosis к рифамиицину. Выявлена зависимость активности комплекса ферментов, изменяющих цвет индикатора, от свойств M.tuberculosis: у микобактерий, выделенных при внелегочных локализациях туберкулеза, доля штаммов с низкой ферментативной активностью составляет 47,2% против 20,7% при легочной локализации процесса (р=0,03). Полученные данные свидетельствуют о необходимости разработки ускоренных фенотипичсских методов определения лекарственной устойчивости, основанных на регистрации роста визуальным, а не биохимическим способом.

С целью создания ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis была разработана полужидкая питательная среда на основе жидкой модифицированной среды Сотона. В ходе исследований провели определение скорости роста возбудителя на полужидкой среде Сотона с добавлением 10% и 25%

лошадиной сыворотки. На среде с 10% лошадиной сыворотки средний срок появле-

ния колоний М.tuberculosis составлял 5,2+0,6 суток, с 25% - 3,8+0,4 суток (различия достоверны при р< 0,01). Среда с 10% лошадиной сыворотки кроме меньшей скорости роста микобактсрий показала и больший процент расхождений при определении чувствительности культур к стрептомицину. Чувствительность и специфичность метода с использованием этой среды соответственно колеблется от 55,0% до 80,6% для разных препаратов, В дальнейшем исследования проводили при использовании полужидкой среды Сотона с добавлением 25% лошадиной сыворотки. В целом сроки роста М.tuberculosis на данной среде в 2,8-3,2 раза меньше, чем на стандартной плотной среде Левенштейна-Иенсена. Уже на 3 сутки признаки роста наблюдаются у 42,1% штаммов, на 4-5 сутки у 95,2% штаммов, и на 7 сутки - у 98,3%. Из 804 исследованных штаммов лишь 4 дали рост позже 10 суток, причем у 3 из них отмечался замедленный рост и на плотной среде. Быстрый рост М.tuberculosis на разработанной среде обусловлен рядом факторов. Во-первых, среда по консистенции близка к жидкой (содержание агар-агара 0,08%), а на жидких средах микобакте-рии растут быстрее. Во-вторых, рост активизирует внесение сыворотки. В-третьих, содержащийся в среде в небольшом проценте агар-агар способствует повышению локальной концентрации микроорганизмов, не давая взвеси клеток опускаться на дно пробирки. Эта же особенность среды обеспечивает и хорошую аэрацию иноку-лята. Таким образом, разработанная среда сочетает преимущество жидких питательных сред в скорости роста, плотных сред - в его визуализации.

Исследование чувствительности МБТ к рифампицину провели в 3-х сериях опытов, в которых использовали препарат в 2-х концентрациях - 20 и 40 мкг/мл (табл. 11). В первой серии и исследуемая среда и среда сравнения (Левенштейна-Иенсена) содержали 20 мкг/мл рифампицина. Получено 100%-ное совпадение результатов. Но, поскольку по Приказу № 109 от 21.03.03 МЗСР РФ рекомендуется концентрация 40 мкг/мл, во 2-ой серии опытов содержание рифампицина в обеих средах - полужидкой и плотной - повысили до указанного уровня, что привело к 9,1%-ному расхождению результатов. Учитывая эти данные, в 3-ей серии концентрацию рифампицина уменьшили вдвое в полужидкой среде, сохранив ее на уровне 40 мкг/мл в стандартной среде. Частота совпадения результатов возросла до 96,3%. Изучение лекарственной устойчивости М.tuberculosis к стрептомицину в концентра-

ции 10 мкг/мл показало удовлетворительные параметры чувствительности и специфичности метода - 89,9% и 97,1%. Уменьшение концентрации препарата до 7 мкг/мл повысило показатель чувствительности до 96,6%. С целью определения критической концентрации препарата в предлагаемой среде изучали минимальную ин-гибирующую активность этамбугола. Средние значения минимальной ингибирую-щей активности препарата для чувствительных и устойчивых штаммов составляли соответственно 4,5+1,4 и 8,5+1,6 мкг/мл. Более того, крайние значения минимальной ингибирующей активности для чувствительных и устойчивых штаммов перекрывают друг друга: 2-5 мкг/мл и 2 -10 мкг/мл. По данным литературы, при изучении активности этамбутола в среде Лсвенштейна-Йенсена у гюлирезистентных штаммов также выявлен разброс крайних значений минимальной ингибирующей активности - от 2 до 8 мкг/мл, средняя степень устойчивости (медиана) составляла 4 мкг/мл (Севастьянова Э.В. и др., 2002). Концентрация препарата в полужидкой среде, дающая наибольший процент совпадений со стандартным методом (концентрация этамбугола в среде Левенштейна-Йенсена 2 мкг/мл), равна 5 мкг/мл. В начальных опытах выявили близкое совпадение результатов определения лекарственной устойчивости 242 штаммов на стандартной и испытуемой средах: в 90,1% случаев для стрептомицина, 96,7% - для изониазида, 96,3% - для рифампицина. В дальнейшем эти результаты были подтверждены при исследовании еще 407 штаммов. Параметры метода ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis для изониазида, рифампицина, стрептомицина достаточно высоки (табл. 1), что позволяет рекомендовать его для применения в практике фтизиобакте-риологических лабораторий. Однако определение устойчивости МБТ к этамбутолу ускоренным и стандартным методом выявило более низкий в сравнении с другими препаратами процент совпадений для чувствительных и устойчивых штаммов -77,6 (для стрептомицина - 90,9%, для изониазида - 92,1%), для рифампицина -95,0%). Чувствительность метода составляет 65,8%, специфичность - 89,2%. На полужидкой среде частота выявления чувствительных штаммов составляет 69,3%, на стандартной - 50,2%, разница составляет 19,1%, критерий %2 превышает критические значение при р<0,001. Различия в результатах определения чувствительности

к этамбутолу с помощью полужидкой среды и среды Левенштейна-Йенсена, воз-

можно, объясняются особенностями препарата (небольшой разницей между критической концентрацией и средней минимальной ингибирующей концентрацией его у устойчивых штаммов M.tuberculosis), наличием или отсутствием глюкозы в составе среды, а также рН среды (Акимова и др., 2003). Таким образом, особенности среды не позволяют применять ее для определения чувствительности МБТ к этамбутолу.

Одно из достоинств предлагаемого метода - простота учета результатов, так как он визуальный и не требует дорогостоящего оборудования для индикации роста. Кроме того, все ингредиенты питательной среды отечественного производства (кроме L-аспарагина), доступны и недороги. Главное преимущество метода - быстрое, в течение 3-5 дней после посева культуры выявление множественной лекарственной устойчивости у 80,2% таких штаммов M.tuberculosis и через 7 дней - у 90,2%. Как известно, M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью особенно опасны в эпидемиологическом отношении.

Таблица 1.

Параметры ускоренного метода определения лекарственной устойчивости

M.tuberculosis

Препарат, концентрация, число штаммов (П) Чувствительность Специфичность Положительная прогностическая эффективность Отрицательная прогностическая эффективность Общая эффективность

Стрептомицин 10 м кг/мл, п=494 7 мкг/мл, п=155 89,9% 96,6% 97,1% 94,7% 99,5% 93,3% 55,5% 90,0% 88,9% 96,1%

Изониазид, 1 мкг/мл, п= 519 96,3% 87,4% 95,5% 89,4% 92,1%

Рифампи-цин 20 мкг/мл, п=416 95,8% 93,1% 96,8% 91,1% 95,0%

Этамбутол 5 мкг/мл, п=241 65,8% 89,2% 85,9% 63,9% 77,6%

Таким образом, впервые разработан фенотипический ускоренный простой, дешевый и доступный для любой практической фтизиобактериологической лаборатории метод определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis к изониазиду, рифампицину, стрептомицину с помощью полужидкой среды, которая сочетает преимущество жидких и агаризованных сред, заключающееся в скорости роста и его непосредственной визуализации. На питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза получен патент на изобретение № 2226398 от 10.04.2004.

При исследовании бактериостатической активности больных туберкулезом органов дыхания методом вертикальной диффузии впервые выявлена четкая зависимость между величиной бактериостатической активности крови и чувствительностью культуры, выделяемой больным, к изониазиду. У 96,2% больных с культурами, чувствительными к изониазиду наблюдали среднюю и высокую бактериостатиче-скую активность, у 4% - среднюю и отсутствие нулевых показателей. При устойчивости к данному препарату распределение значений бактериостатической активности крови иное: средние и высокие у 2,0% больных, низкие - у 54,0%, нулевые - у 44,5% (в сумме низкие и нулевые составляли 98,0%). Прослежена зависимость между частотой высоких и средних значений бактериостатической активности крови и частотой благоприятного течения туберкулеза. Так, при сохраненной чувствительности к изониазиду при средних и высоких значениях бактериостатической активности крови у 100,0-96,5% больных (процент зависит от группы) отмечаются значительные улучшения и улучшения. У больных с низкими и нулевыми значениями бактериостатической активности крови в 22% случаев имело место прогрессирова-ние процесса. Однако, у 52,6% больных с изониазидоустойчивыми штаммами отмечается "улучшение" и у 26,0% - "значительное улучшение", хотя величины бактериостатической активности крови у них низкие. Данное обстоятельство навело нас на мысль, что плохая диффузия в яичной среде препаратов с большой молекулярной массой приводит к занижению значений бактериостатической активности крови в случае, когда культура чувствительна к такому препарату. Вследствие этого приме-

нение метода вертикальной диффузии (и в целом плотных сред) не корректно в случае устойчивости аутоштамма к изониазиду.

Тем не менее, метод был высоко информативен при использовании с целью изучения фармакокинетики изониазида при различных путях введения препарата -внутримышечном и эндолимфатическом. В случае применения эндолимфатического введения высокие значения бактериостатической активности крови регистрировали в 2 раза чаще, чем при внутримышечном, более чем в половине случаев получали высокую концентрацию в крови без увеличения дозы изониазида, причем с четким эффектом пролонгации - до 9 часов против 4 при обычном способе введения.

С целью разработки адекватного метода исследования бактериостатической активности крови у больных с устойчивостью к изониазиду использовали полужидкую питательную среду, применявшуюся для определения лекарственной устойчивости. В ходе сравнительного исследования бактериостатической активности крови с применением плотных (яичной и агаризованной) и полужидкой среды показано, что в случае устойчивости клинического штамма M.tuberculosis к изониазиду на плотных средах частота низких и нулевых значений бактериостатической активности составляла 100% (Левенштсйна-Иенсена) и 91,7% (среда Миддлбрука) против 58,3% на полужидкой. Полученные данные свидетельствуют о некорректности использования плотных сред для определения бактериостатической активности при наличии резистентности возбудителя к изониазиду, так при этом показатели туберкул остатичсской пробы занижаются. Вероятно, это обусловлено особенностями диффузии противотуберкулезных препаратов в среду при нанесении разведений сыворотки и из среды - при росте M.tuberculosis. Оптимальными для определения бактериостатической активности крови больных туберкулезом органов дыхания являются жидкие и полужидкие среды.

Подтверждена зависимость между величиной бактериостатической активности крови и чувствительностью аутоштамма к изониазиду: при чувствительности изоля-та к препарату отмечаются высокие значения, при устойчивости - значения зависят от того, какие среды - плотная или жидкая (полужидкая) используются. Полужидкая среда rio результатам не отличается от жидкой, но позволяет получать данные о

бактериостатической активности крови в недельный срок. Достоинством метода является и то, что по величине бакгериостатической активности крови можно судить о чувствительности аутоштамма в изониазиду: у всех больных с бактериостатической активностью, равной 9, отмечается чувствительность к изониазиду, при 7 или 8 -высокая чувствительность к 1 -2 препаратам при пероральном их приеме, или чувствительность к препаратам, вводимым парэнтерально. Значения бактериостатической активности крови, равные 5, 6 или менее, сочетаются с множественной лекарственной устойчивостью. Следовательно, по величине бактериостатической активности крови можно в определенной степени судить о чувствительности или устойчивости культуры М.и1Ьегси1оз1н больного к назначаемым препаратам еще до получения результатов лабораторного определения лекарственной устойчивости стандартным методом на среде Левенштейна-Йенсена.

С помощью ускоренного метода впервые выявлена обратная корреляция между значениями бактериостатической активности крови и длительностью бактерио-выделения (степень - средняя, г=-0,65, р=0,01) (рис. 1 и рис. 2). При обследовании в клинике терапии туберкулеза легких 101 пациента впервые получены данные о корреляции между значениями бактериостатической активности крови и динамикой туберкулезного процесса (рис.3). В случае высоких значений бактериостатической активности крови у 93,8% больных с сохраненной чувствительностью к изониазиду и у 80,0% с устойчивостью к нему наблюдали "значительное улучшение" и "улучшение" (рис.4). В целом, снижение показателей бактериостатической активности крови от высоких к низким и к нулевым характеризуется ухудшением клинико-лабораторных показателей эффективности лечения. К примеру, снижение показателей бактериостатической активности крови до нулевых сопровождается уменьшением частоты благоприятного течения процесса до 18,2%. В группе больных с нулевыми значениями бактериостатической активности крови, кроме того, наблюдали наиболее высокий процент тяжелых форм процесса (казеозная пневмония, кавернозный, фиброзно-кавернозный, циррогический туберкулез, х2 =13,34, р=0,001). Различалось соотношение больных с впервые выявленным туберкулезом, рецидивом и хроническим туберкулезом: при наличии поли- или мультирезистенности процент впервые выявленных больных составлял 78,6% в группе больных со сред-

ней бактериостатической активностью против 27,3% в группе с нулевыми ее значениями (х2 =4-80, р=0,03). Следует подчеркнуть, что нулевые значения бактериоста-тической активности крови четко соотносятся с наиболее неблагоприятным течением процесса и, следовательно, требуют незамедлительной и обязательной коррекции химиотерапии.

Таким образом, определение бактериостатической активности больных с использованием аутоштамма МЛиЬегси1оз15 и полужидкой среды, является быстрым и надежным лабораторным методом контроля адекватности химиотерапии.

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа

0 БАК ■ Длительность бактериовыделения

Рисунок I. Корреляция бактериостатической активности крови и длительности бактериовыделения.

По оси ординат: для бактериостатической активности крови - условные единицы, для бактериовыделения - месяцы. Коэффициент корреляции г=-0,576. Статистически достоверна разница между группами I и 2, 3, 4, 5; 2 и 4, 5; 3 и 5; 4 и 5 (р<0,05). I группа - высокие значения бактериостатической активности крови и чувствительность к изониазиду, 2- высокая бактериостатическая активность крови и резистентность к изониазиду (в составе moho-, поли- или мультирезистентности), остальные -аналогичная устойчивость и значения бактериостатической активности крови: средние - 3 группа, низкие - 4, нулевые - 5.

через 3 месяца

через 6 месяцев

В! 1 гр., БАК высокая,

чувствительность к Н

Ш2 гр., БАК высокая, устойчивость к Н

□ 3 гр., БАК средняя, устойчивость к Н

04 гр., БАК низкая, устойчивость к Н

Рисунок 2. Процент больных с бактериовыделением через 3 и 6 месяцев лечения. БАК - бактериостатическая активность крови, Н - изониазид. Статистически достоверна разница в числе больных с бактериовыделением:

а) через 3 месяца лечения между группами 2 и 5 (х = 13,28, р<0,001), 3 и 5 (х~= 12,41, р<0,001), 4 и 5 (х2=7,94, р=0,005); б) через 6 месяцев лечения между группами 3 и 5 (Х2=17,72, р<0,001).

Рисунок 3. Корреляция значений бактериостатической активности крови и динамики процесса (в усл.ед.)

БАК - бактериостатическая активность крови. Коэффициент корреляции г = 0,532. Статистически достоверна разница: а) в значениях бактериостатической активности крови между всеми группами (р<0,05); б) в динамике процесса между группами 1 и 3, 4, 5, между 5 и 2, 3, 4 ( р<0,05). Группы - см. примечания к рис. 1

В Значения БАК (в усл.ед.)

И Частота улучшений (в

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа

| Рисунок 4. Корреляция значений бактериостатической активности крови и частоты "значительных улучшений" и "улучшений" БАК - бактериостатическая активность крови. Статистически достоверна разница в частоте "значительных улучшений" и "улучшений" между группами 1 и 3 (х2=4,27, р=0,04); 1 и 4 (х2=9,П, р=0,002); 1 и 5 (%2=27,64, р <0,0001); 2 и 5 (f =11,60, р=0,0006); 3 и 5 (х2 =8,57, р=0,003); 4 и 5 (х2 =7,84, р=0,005). Группы - см. примечания к рис. 1.

Использование одновременно двух методов - ускоренного определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности крови позволяет в короткие сроки - в течение недели, во-первых, выявить множественную лекарственную устойчивость, и, во-вторых, оценить адекватность химиотерапии и в случае необходимости откорректировать ее.

Преимущества методов - простота, дешевизна, короткий срок получения результатов - очевидны в условиях постоянного роста лекарственной устойчивости, и, I в особенности, множественной лекарственной устойчивости, так как они позволяют I клиницистам в более короткие сроки с помощью индивидуализированной химиотерапии прервать цепочку распространения эпидемиологически более опасных М.tuberculosis.

Изменение свойств Mycobacterium tuberculosis, проявляющееся в широком распространении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, циркуляции на территории РФ штаммов генотипа Beijing, доля которых составляет от 34 до 66% (Нарвская О.В., 2003; Иванов и др., 2004; Маракшин и др., 2004; Медведева и др., 2005 Drobniews'ki F. et al., 2005; Kovalev S.Y. et al., 2005) требует решить во-

прос о соотношении лекарственной устойчивости, вирулентности, жизнеспособности и генотипа возбудителя.

В среднем наиболее высокая скорость роста обнаружена у штаммов М.tuberculosis генотипа Beijing АО - 17,09+2,75, затем в порядке убывания: ВО -13,7+2,7, музейные - 13,7+2,0, другие генотипы - 12,9+2,0, LAM - 7,6+2,4. Скорость роста штаммов, принадлежащих к семейству LAM ниже таковой у микобак-терий иных генотипов и у музейных культур (рис. 6).

Штаммы, которые принадлежат к семейству Beijing (типы ВО и АО) и сборной группе иных генотипов, проявляют тенденцию к повышению скорости внутриклеточного роста в макрофагоподобных клетках ТНР-1 по сравнению с М.tuberculosis семейства LAM (рис. 7), что может отражать их повышенную вирулентность и трансмиссивность.

Рисунок 6.Скорость роста М.tuberculosis различных генотипов в питательной среде По оси ординат - кратность увеличения оптической плотности суспензии М.tuberculosis за 6 суток инкубации. Приведен доверительный интервал при р=0,05.

Рисунок 7. Различия между М.tuberculosis разных генотипов по выживаемости

в макрофагах.

По оси ординат - десятичные логарифмы числа КОЕ М.tuberculosis на 6 сутки роста в макрофагах. Ромбы - значения для штаммов Beijing АО, квадраты -Beijing ВО, х - LAM, треугольники - M.tuberculosis генотипов He-Beijing, Ж -стандартных, линии трендов - сплошная - Beijing ВО, пунктирная - Beijing АО, тонкая сплошная - генотипы He-Beijing, пунктир-точка-пунктир - LAM, пунктир-две точки-пунктир - стандартные штаммы.

Отмечали значительное различие у M.tuberculosis различных генотипов в способности индуцировать гибель макрофагов. M.tuberculosis, принадлежащие к семейству Beijing, индуцировали значительно более раннюю и массированную гибель клеток ТНР-1 по сравнению с микобактериями других генотипов. Через 4 суток после заражения при ПБМ 50:1 наибольший цитотоксический эффект оказывали M.tuberculosis генотипа Beijing ВО, затем в порядке убывания: музейные, Beijing АО, сборная ipynna иных генотипов, LAM (рис.8).

Рисунок 8. Цитотоксичность M.tuberculosis различных генотипов. По оси ординат - процент погибших макрофагов (тест окраски трипановым синим). 29

M.tuberculosis генотипа Beijing и LAM обладали полярными свойствами в отношении влияния на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов клетками линии ТНР-1. M.tuberculosis группы ВО оказывали супрессорный эффект, a LAM - стимулирующий на выработку провоспалительного цитокина TNF-a через 96 ч после заражения. Противовоспалительный цитокин TGF-J3 продуцировался культурой клеток достоверно выше при инфицировании генотипом Beijing, чем LAM (рис. 9 и 10). В целом можно говорить, что M.tuberculosis семейства Beijing "направляют" ответ макрофагов в сторону уменьшения воспаления, что, вероятно, может способст-ввовать диссеминации инфекции.

Рисунок 9. Продукция TNF-a макрофагами через 24 и 96 ч после заражения M.tuberculosis разных генотипов. По оси ординат - концентрация цитокина в пг/мл

Рисунок 10. Продукция TGF-fi макрофагами после 24 и 96 ч после заражения M.tuberculosis разных генотипов. По оси ординат - концентрация цитокина в пг/мл

Таким образом, при исследовании на модели in vitro инфицирования дифференцированных клеток линии ТНР-1 M.tuberculosis разных генотипов наибольшая вирулентность выявлена у M.tuberculosis генотипа Beijing варианта ВО. Количественно она проявляется относительно высокой скоростью роста и высокой цитотоксиче-ской активностью, стимуляцией индукции противовоспалительного цитокина TGF-p и супрессией провоспалительного TNF-a. Штаммы сборной группы, нс-Beijing, при схожей выживаемости обладали статистически достоверно меньшей способностью активировать некроз макрофагов. M.tuberculosis семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, т.е. имели меньшую скорость роста в макрофагах и в меньшей степени вызывали их некроз обратную картину в отношении цитокинов. Полученные данные коррелируют с рядом клинических характеристик пациентов: - возрастным составом, длительностью заболевания и бактериовы-деления. Наиболее неблагоприятная картина наблюдается у больных, выделяющих М.tuberculosis генотипа Beijing.

M.tuberculosis любого генотипа обладают вирулентностью, так как относятся к безусловным патогенным микроорганизмам. Все исследованные штаммы были выделены из патологического материала больных туберкулез органов дыхания и, следовательно, были вирулентны. Высокотрансмиссивные штаммы в большей степени цитогоксичны, модулируют ответ макрофагов в сторону продукции цитокинов, уменьшающих воспалительную защитную реакцию, что может приводить к диссе-мннации инфекции, характерной для туберкулеза органов дыхания, вызванного M.tuberculosis генотипа Beijing, и к возможности передачи жизнеспособного возбудителя другому хозяину. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis генотипа Beijing ВО, сочетающаяся с высокой вирулентностью, свидетельствует о том, что мутации в геноме возбудителя, которые обеспечивают устойчивость к противотуберкулезным препаратам, не сказываются на патогенных свойствах возбудителя туберкулеза.

Для более точного, количественного сопоставления значимости в туберкулезном процессе генетических и фенотииических особенностей организма-хозяина и организма-паразита необходимы дальнейшие исследования. Использованная в настоящей работе модель in vitro изучения вирулентности (цитотоксичности) с помощью

клеточной линии ТНР-1, может позволить провести эти исследования. Кроме того, данная модель перспективна для поиска препаратов влияющих на вирулентность, ингибирующих или снижающих способность M.tuberculosis вызывать некроз макрофагов.

ВЫВОДЫ

1. 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид пригоден для ускоренного (8 дней) предварительного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к рифампици-ну.

2. Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов M.tuberculosis в течение 3-7 суток.

3. На основе полужидкой среды разработан ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, который выявляет штаммы с множественной лекарственной устойчивостью в короткие сроки (3-5-7 суток).

4. Методом вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Иенсена доказана корреляция величины бактериостатической активности крови и чувствительности M.tuberculosis преимущественно к изониазиду. Применение плотных сред для проведения туберкулостатической пробы некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к изониазиду.

5. Метод вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: в сравнении с внутримышечным эндолимфатическое введение приводит к увеличению концентрации препарата в крови и тканях и пролонгации эффекта.

6. Определение бактериостатической активности крови с использованием аутош-таммов и полужидкой питательной среды позволяет в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии. Степень бактериостатической активности крови, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса.

7. Нулевая бакгериостатическая активность сочетается с множественной лекарственной устойчивостью М.tuberculosis, наиболее тяжелыми формами заболевания, наибольшей длительностью бактериовыделения, наименьшей частотой благоприятных исходов.

8. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing ВО проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-p и уменьшать -провоспалительного цитокина TNF-a. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитоток-сичностью, так и с низкой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вишневский Б.И., Маничева О.А. Определение дегидрогеназной активности как

метод ускоренной индикации жизнеспособности M.tuberculosis // Пробл. туб. -1992.-№7-8.-с.42-44.

2. Вишневский Б.И., Маничева О.А., Вишневская Е.Б., Оттен Т.Ф. Биологические

особенности и проблемы выявления возбудителя туберкулеза внелегочной локализации // Пробл. туб. - 1998 . № 2. - с. 34-36.

3. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Маничева О.А. Оценка эффективности комплекс-

ной терапии туберкулеза мочеполовых органов. // Пробл. туб. -1998. - № 2. - с. 38-40.

4. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Мякотина Е.Н. Ускоренное определение лекар-

ственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis с помощью полужидкой среды // Клинич. и лабораторн. диагностика. - 2003. - №7. - С.50-52.

5. Маничева О.А. Ускоренное определение бактериостатической активности крови у

больных туберкулезом с помощью полужидкой питательной среды // Пробл. туб. и болезней легких. - 2003. - № 9. - С.26-29.

6. Маничева O.A. Некоторые аспекты определения чувствительности микобактерий туберкулеза к этамбутолу при использовании полужидкой среды // Пробл. туб. и болезней легких. - 2003. - №10. - С.47-49.

7. Маничева O.A. Ускоренное выявление полирезистентности Mycobacterium tuber-

culosis при использовании полужидкой питательной среды // Пробл.туб. и болезней легких. - 2005. -№11.- С.40-43.

8. Маничева O.A., Павлова М.В., Сапожникова Н.В., Арчакова Л.И., Скворцова

Л.А., Вишневский Б.И.. Контроль химиотерапии больных туберкулезом органов дыхания с помощью БАК-пробы // Пробл.туб. и болезней легких. - 2008. - № 5. -С. 14-17.

9. Маничева O.A., Ласунская Е.Б., Журавлев В.Ю., Оттен Т.Ф., Барнаулов А.О.,

Мокроусов И.В., Павлова М.В., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Лекарственная чувствительность Mycobacterium tuberculosis в сопоставлении с их жизнеспособностью, цитотоксичностью, генотипом и течением процесса у больных туберкулезом органов дыхания // Пробл.туб. и болезней легких. - 2008. - № 12. - С. 1821.

10. Ribeiro S.C.M. Suffys Р., Narvskaya O., Manichcva O., Lasunskaia E. Characterization of M. tuberculosis strains isolated in different geographic regions of the world: association of genotype with virulence and macrophage response to the bacteria// Jornal Brasileiro de Pneumologia. - 2006. - Vol.32. - Suppl.3. - P.138.

11. Маничева O.A. Ускоренное определение лекарственной устойчивости и бакте-риостатической активности крови на основе биохимической индикации жизнеспособности M.tuberculosis // "Туберкулез как объект научных исследований": Тр. СПб НИИФ. - СПб., 1994. - Т.2. - С.75-78.

12. Маничева O.A., Вишневский Б.И., Мякотина E.H. Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Патент на изобретение № 2226398, зарегистрирован 10.04.2004 .

13. Вишневский Б.И., Маничева O.A. Новые ускоренные методы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза и бактериостатичсской активности крови // Материалы IV съезды фтизиатров Казахстана. - Алма-Ата, 1992. -С.127-128.

14. Вишневский Б.И., Маничева O.A. Исследование микобактериальных экзофер-ментов в целях ускоренного определения БАК и лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // "Социально-эпидемические проблемы туберкулеза в территории Крайнею Севера": Мат. конф. - Якутск, 1992. - С.92

15. .Ягафарова Р.К., Биспен А.И., Гамазков Р.В., Курашкин Г.А., Маничева O.A. Новые направления в терапии мочеполового туберкулеза // «Внелегочн. туберкулез

- актуальная проблема здравоохранения»: Тр. Всерос. науч.-практич. конф. -СПб., 1997.-С.56-57.

16. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Маничева O.A., Курашкин Г.А. Фармакокинетика тубазида в зависимости от способа введения у больных мочеполовым туберкулезом // «Человек, окружающая среда и туберкулез»: Матер, конф. - Якутск, 1997.

- С.88-89.

17. Маничева O.A.. Вишневский Б.И., Соловьева Н.С., Мельникова H.H. Бактсрио-статическая активность крови больных туберкулезом органов дыхания с чувствительными и лекарственноустойчивыми культурами M.tuberculosis // «Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем»: Науч. тр. и матер. Всерос. конф. - СПб., 1998. - Т.1. - С. 162-164.

18. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В.. Маничева O.A. Изучение фармакокинетики изо-ниазида при различных способах его введения у больных туберкулезом органов мочеполовой системы. // "Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем». Науч. тр. и матер. Вссроссийск. конф. - СПб. -1998. -Т.1. - С.194-197.

19. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Маничева O.A. Особенности фармакокинетики при эндолимфатическом введении препаратов у больных туберкулезом мочеполовой системы // Матер, региональн. науч.-практ. конф.урологов Республики Башкортостан, посвящен. 100-летию со дня рождения проф. Л.П.Крайзельбурга. -Уфа, 1999. -С.76-79.

20. Маничева O.A., Вишневский Б.И., Иванова Л.А., Павлова М.В., Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Арчакова Л.И. Значение БАК-пробы в лечении больных туберкулезом органов дыхания и мочеполовой системы // "Химиотерапия туберкулеза" / под ред. М.И.Перельмана. - М., 2000. - С.91-92.

21. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Мякотина Е.Н. Ускоренное определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза и бактериостатической активности крови с использованием полужидкой среды // Матер. VIII съезда Всс-рос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. - М., 2002. - Т.З - С.196-197.

22. Маничева О.А. Использование полужидкой питательной среды для ускоренного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis // «Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза»: Науч.тр. Всерос. науч.-иракт. конф..- СПб., 2005. - С.255-259.

23. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Калинина И.Б. Исследование чувствительности Mycobacterium tuberculosis к офлоксацину за период 2004-2005 гг. у больных туберкулезом легочной и внелегочной локализации // «Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза»: Науч. тр. Всерос. науч.-практ. конф. / Под ред. Ю.Н.Левашева). - СПб., 2006. - С.229-231.

24. Е. Lasunskaia, S.Ribeiro, O.Manicheva, P.Suffis, O.Narvskaya, I.Mokrousov, B.Vishnevsky. Characterization of M.tuberculosis strains isolated in different geographic regions of the world: association of genotype with virulence and macrophage response to the bacteria // Keystone Symposia "Tuberculosis: From Lab research to field trials". March 20-25, 2007. Vancouver, British Columbia, Canada. Poster abstract 280, p.106.

25. О.А.Маничева, Л.А.Скворцова, M.B. Павлова, Н.В.Сапожникова, Л.И.Арчакова, Б.И.Вишневский. Бактериостатическая активность крови у больных туберкулезом органов дыхания // «Туберкулез в России. Год 2007»: Мат. VIII Рос. съезда фтизиатров. - М., 2007. - С .124.

26. О.А.Маничева, Е.Б.Ласунская, Т.Ф.Оттен, И.В.Мокроусов, Б.И.Вишневский, О.В.Нарвская. Вирулентность Mycobacterium tuberculosis различных генотипов в ранней фазе инфекции in vitro // «Туберкулез в России. Год 2007»: Мат. VIII Рос. съезда фтизиатров. - М., 2007. - С .142.

Подписано в печать 28.10.09 Формат 60x90/16. Объем 1.25 усл. п.л. Печать ризографическая. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 264.

Отпечатано в типографии ООО «Фирма «Стикс» 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская, 19

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Маничева, Ольга Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Проблема быстрого определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis.

1.2. Проблема лабораторного контроля адекватности химиотерапии.

1.3. Проблема оценки вирулентности Mycobacterium tuberculosis.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Метод биохимической индикации роста МБТ.

2.2. Метод ускоренного определения ЛУ МБТ с помощью полужидкой среды.

2.3. Методы определения бактериостатической активности крови.

2.3.1. Метод серийных разведений сыворотки с использованием стандартной среды Левенштейна-Йенсена.

2.3.2. Метод вертикальной диффузии.

2.3.3. Метод ускоренного определения БАК с помощью полужидкой среды.

2.4. Методы исследования вирулентности МБТ in vitro.

2.4.1.Определение скорости роста (размножения) МБТ в питательной среде.

2.4.2. Определение скорости роста (размножения) МБТ в макрофагах.

2.4.3. Исследование индукции клеточной гибели (цитотоксичности)

2.4.4. Исследование продукцие цитокинов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МБТ.

3.1. Индикация роста МБТ и определение ЛУ МВТ по восстановлению трифенилтетразолийхлорида.

3.2. Определение лекарственной устойчивости МБТ с помощью полужидкой питательной среды с разным содержанием лошадиной сыворотки.

3.3. Определение чувствительности МБТ к этамбутолу с помощью полужидкой среды.

3.4. Определение лекарственной устойчивости МБТ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу с помощью полужидкой среды в сравнении со стандартным методом.

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ПЛОТНОЙ СРЕДЫ.

4.1. Исследование БАК у больных туберкулезом с помощью метода вертикальной диффузии в среде Левенштейна-Йенсена.

4.2. Изучение с помощью метода вертикальной диффузии фармакокинетики изониазида в крови и тканях больных туберкулезом органов мочеполовой системы.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

КРОВИ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ УСКОРЕННЫМ МЕТОДОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ.

5.1. Разработка ускоренного метода определения БАК.

5.2. Исследование БАК у больных туберкулезом органов дыхания, сопоставление с клиническими и бактериологическими данными.

Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO ВИРУЛЕНТНОСТИ МБТ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ.

6.1. Скорость роста МБТ в жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9.

6.2. Скорость роста МБТ в макрофагах клеточной линии ТНР -1.

6.3. Индукция клеточной гибели в культурах макрофагов, зараженных МВТ различных генотипов.

6.4. Продукция цитокинов клетками ТНР-1, зараженными МБТ разных генотипов.

6.5. Характеристика больных туберкулезом органов дыхания и биологических свойств МБТ различных генотипов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность"

Возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis — один из наиболее "успешных" патогенных микроорганизмов, так как, несмотря на достижения медицины, проблема туберкулеза остается актуальной для большинства стран. "Успешность" патогена подтверждается данными ВОЗ: палочкой Коха инфицирована треть населения Земли, ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек. Высокую адаптивную способность вида М. tuberculosis доказывает и очень быстрое его приспособление к новым условиям в эру применения антибактериальных препаратов - селекция и распространение лекарст-венноустойчивых штаммов. Наблюдающийся в последние годы подъем лекарственной устойчивости М. tuberculosis (микобактерий туберкулеза, МВТ), а также утяжеление ее структуры за счет роста множественной лекарственной устойчивости (Алексеева Г.И., Кравченко А.Ф., 2007; Вишневский Б.И. и др., 1997; Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., 2003; Дорожкова И.Р. и др., 2000; Ильина Т.Я. и др., 2003; Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999) значительно усложняет задачу подбора средств химиотерапии. Последняя остается основным методом лечения больных туберкулезом, который обеспечивает прекращение бактериовыделения и прерывает распространение возбудителя. Широкое распространение в последние годы штаммов МБТ, принадлежащих к семейству Beijing, которое часто ассоциировано с высокой трансмиссивно-стью, множественной лекарственной устойчивостью и более тяжелыми и распространенными формами туберкулезного процесса (Нарвская О.В., 2003), еще более актуализирует задачу быстрого выявления наиболее эпидемиологически опасных штаммов возбудителя. В этих условиях возрастает роль бактериологических лабораторных методов определения резистентности МБТ и контроля адекватности лечения.

В связи с изложенным, сегодня как никогда раньше, клиницисты заинтересованы в быстром получении результатов определения лекарственной устойчивости. Учет результатов определения лекарственной устойчивости МБТ стандартным методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Иенсена производится на 21 сутки после посева культуры. По данным J.-SJoh и соавторов (2007) интервал между началом лечения пациентов с бактериоскопически положительной мокротой и получением результатов определения лекарственной устойчивости МБТ достигает в среднем 80,5 дней. В связи с этим чрезвычайно актуальной проблемой является разработка простых и доступных для лабораторий любого уровня методов ускоренного определения лекарственной устойчивости МБТ и бактериоста-тической активности крови (БАК), или туберкулостатической пробы, так как это позволит клиницистам в короткие сроки выработать оптимальную тактику химиотерапии туберкулеза в зависимости от свойств возбудителя.

Известный метод ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий по нитратредуктазной активности (Корнеев А.А., 1997; Голы-шевская В.И. и др., 20016) применим только для M.tuberculosis и неприменим для M.bovis. Кроме того, некоторые штаммы МБТ с устойчивостью к большинству противотуберкулезных препаратов показывают отрицательный результат в данном тесте.

В настоящее время для быстрого определения лекарственной устойчивости разработаны и используются системы, основанные на радиометрической, манометрической, колориметрической или флуоресцентной индикации роста МБТ в жидких средах - ВАСТЕС, МВ-ВАСТ, BBL-MGIT, Versa Trek System (Иртуганова О.А. и др., 2000, 2001 а, б.; Palomino J.C. et al., 1999; Sid-diqi S.H. et al., 1981; Tortoli E. et al., 1998; Zwolska Z. et al., 1999). С помощью этих систем спектр устойчивости может быть определен на 5-16 сутки после прямого посева патологического материала, и на 3-10 сутки непрямым методом, то есть при посеве изолята. Существующие микрометоды определения лекарственной устойчивости МБТ или минимальной ингибирующей концентрации требуют дополнительного оснащения реактивами, питательными средами и расходными материалами. Молекулярно-генетические методы позволяют определить устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду по наличию мутаций в ДНК МБТ, по сути, в день поступления патологического материала (Михайлович В.М. и др., 2001; Скотникова О.И. и др., 2004; Скрягина Е.М. и др., 20016). Но перечисленные выше методы требуют хорошего дорогостоящего аппаратурного оснащения и значительного финансирования и потому доступны лишь большим централизованным референс-лабораториям. Кроме того, наличие мутаций в генах не всегда проявляется фенотипически и на сегодняшний день выявлены не все мутации. Таким образом, остается актуальной проблема разработки быстрого, недорогого и доступного для любой практической фтизиобактериологи-ческой лаборатории способа определения лекарственной устойчивости МВТ, а также контроля адекватности химиотерапии с помощью определения бак-териостатической активности крови.

Широкое распространении штаммов генотипа Beijing, для которых характерна высокая частота поли- и мультирезистнтности (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Park Y.K. et al., 2005), поднимает вопрос о соотношении лекарственной устойчивости и вирулентности МВТ, тем более, что эта проблема до сих пор остается дискуссионной. Сложность изучения факторов вирулентности МВТ, обусловлена, в частности, тем, что экспрессия генов, кодирующих эти факторы, происходит только в адекватных условиях внутренней среды макроорганизма-хозяина, а рост бактерий на искусственных питательных средах в отсутствие атак иммунной системы не требует реализации действия этих генов (Сидоренко C.B., 1999). Кроме того, изучение факторов вирулентности в основном проводится при сравнении вирулентных и авирулентных (лабораторных или мутантных, полученных с помощью делеции генов) штаммов, сильно отличающихся друг от друга по степени патогенности. Все клинические изоляты безусловно вирулентны, коль скоро вызвали болезнь, однако, различия между штаммами, принадлежащими к генетическим кластерам разных объемов, могут быть менее отчетливы. В связи с этим актуальной является проблема адекватной оценки вирулентности МВТ разных генотипов. Существующие методы исследования вирулентности МВТ на различных моделях с использованием животных или молекулярно-генетических методов и их комбинации очень дороги, длительны, доступны очень немногим лабораториям, оснащенным высокотехнологичным оборудованием, и не позволяют провести исследование достаточно большого числа штаммов различных генотипов с целью их сравнительной оценки. Использование тканевой культуры макрофагоподобных клеток человека в качестве модели для изучения некоторых факторов вирулентности МБТ помогает решить проблему в трех планах. Во-первых, исследовать достаточно большое число клинических штаммов, во-вторых, уменьшить влияние видовой и индивидуальной генетической гетерогенности, которое весьма существенно влияет на оценку вирулентности при использовании животных и макрофагов ex vivo, и, в-третьих, количественно оценить, образно говоря в "чистом виде", вирулентность клинических штаммов МБТ различных генотипов и различной лекарственной чувствительности. Оценить пригодность такого метода для поставленной цели представляется возможным при сравнительном исследовании вирулентности МБТ генотипа Beijing и других генотипов.

Задачи исследования:

3. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью стандартных методов, используя выделенные аутоштаммы М.ШЬегси1оз18, сопоставить полученные результаты с устойчивостью М.ШЬегси1оз1з к противотуберкулезным препаратам и течением туберкулезного процесса. Дать оценку туберкулостатической пробе как методу бактериологического контроля адекватности химиотерапии.

4. Разработать ускоренный метод определения бактериостатической активности крови с помощью полужидкой питательной среды. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью ускоренного метода, сопоставить полученные результаты с клиническими и бактериологическими данными.

5. Исследовать вирулентность клинических штаммов М.ШЬегси1оз1з по их способности активировать гибель макрофагов (цитотоксические свойства), сопоставить уровень вирулентности с генотипом и устойчивостью возбудителя.

Научная новизна

Впервые разработана полужидкая питательная среда, позволяющая получить визуально наблюдаемый рост культуры МВТ на 3-5 сутки после инокуляции суспензии. Разработанный ускоренный метод определения лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду, стрептомицину, рифампицину дает возможность иметь данные об устойчивости культуры к этим препаратам на 3-5-е сутки, о чувствительности — на 7-е после посева суспензии штамма МБТ. Предложенный метод позволяет на 2 недели раньше в сравнении со стандартным методом изменить терапию, что особенно важно в связи со значительным увеличением множественной лекарственной устойчивости.

Впервые методом вертикальной диффузии показана четкая зависимость величины БАК от устойчивости клинического изолята к изониазиду. С помощью разработанного ускоренного метода сопоставлены результаты определения туберкулостатической пробы как лабораторного метода контроля адекватности терапии и течения процесса у больных туберкулезом органов дыхания, и выявлена корреляция степени БАК и эффективности химиотерапии.

Впервые на модели in vitro при инфицировании дифференцированных клеток линии ТНР-1 микобактериями туберкулеза разных генотипов показано: наибольшая вирулентность (цитотоксичность) характерна для МБТ генотипа Beijing варианта ВО; штаммы сборной группы других генотипов, обладали меньшей способностью активировать некроз макрофагов; МБТ семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, вызывая некроз макрофагов в наименьшей степени; высокие цитотоксические свойства обнаружены у МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Практическая значимость работы

Разработанный на основе использования полужидкой среды ускоренный метод определения устойчивости МБТ к изониазиду, стрептомицину и ри-фампицину, прост, дешев, безопасен и потому доступен любой практической фтизиобактериологической лаборатории. Метод ускоренного определения бактериостатической активности крови также может использоваться любой лабораторией и является надежным способом лабораторной оценки адекватности химиотерапии. Применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности дает возможность сократить сроки получения необходимых данных в 2-3 раза в сравнении со стандартными методами.

Положения, выносимые на защиту

2. С помощью метода вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена показана корреляция величины бактериостатической активности крови и чувствительности M.tuberculosis к изониазиду. Применение плотных сред для проведения туберкулостатической пробы некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к препарату, однако метод информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: показано увеличение концентрации препарата в крови и тканях и пролонгация эффекта при эндолимфатическом введении в сравнении с внутримышечным.

3. Величина бактериостатической активности крови, определяемой с помощью полужидкой среды, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса: наиболее тяжелые формы заболевания отмечаются при низких и нулевых значениях бактериостатической активности и множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Определение бактериостатической активности с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяют в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии.

4. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing ВО проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-p и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-a. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается как у штаммов с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.

Реализация результатов работы

Получен патент на изобретение "Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза" № 2226398 от 10.04.2004 .

Результаты исследования внедрены в практику работы Курского областного противотуберкулезного диспансера, используются в клинике легочного туберкулеза ФГУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи", а также в учебном процессе на кафедре фтизиатрии ГОУ ДПО "Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава".

Апробация диссертационной работы

Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции по внелегочному туберкулезу, С-Петербург, 1997 г.; заседаниях общества микробиологов г.Санкт-Петербурга в 2000 г., 2002 г., VIII Российском съезде фтизиатров, 17-ой Международной конференции "СПИД, рак и общественной здоровье" (СПб. 26.05-29.05.2008 г.), Межрегиональном семинаре для заведующих бактериологическими лабораториями СевероЗападного Федерального Округа РФ (29.09-01.10.2008 г.), Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций" (юбилейная к 85-летию СПб НИИФтизиопульмоно-логии, 29.09-31.09.2008 г.).

Публикации

По материалам работы опубликовано или находится в печати 26 печатных работы, из них 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Маничева, Ольга Алексеевна

144 Выводы

1. 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид пригоден для ускоренного (8 дней) предварительного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к рифампицину.

6. Определение бактериостатической активности крови с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяет в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии. Степень бактериостатической активности крови, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса.

7. Нулевая бактериостатическая активность крови сочетается с множественной лекарственной устойчивостью M.tuberculosis, наиболее тяжелыми формами заболевания, наибольшей длительностью бактериовыделения, наименьшей частотой благоприятных исходов. 8. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing ВО проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-P и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-a. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.

146

Заключение

Актуальность проблемы быстрого выявления ЛУ МБТ и быстрой оценки адекватности химиотерапии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, более пристального исследования биологических свойств возбудителя обусловлена продолжающимся ростом лекарственной устойчивости патогена и утяжелением ее структуры, появлением высокотрансмиссивных штаммов генотипа Beijing.

Существующие методы определения ЛУ МБТ либо очень длительны, либо очень дороги, либо требуют высоких трудозатрат и персонала высокой квалификации. В связи с этим были поставлена задача разработки нового метода - быстрого, дешевого, доступного лаборатории любого уровня, не требующего специального оборудования, простого для выполнения и считывания результата, позволяющего в короткие сроки выявить наиболее опасные с эпидемиологической точки зрения МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Поскольку спектр постоянно нарастающей ЛУ весьма разнообразен, возникает необходимость лабораторного контроля адекватности химиотерапии, так как, во-первых, нет строгой корреляции между ЛЧ МБТ к препаратам и их терапевтической эффективностью, во-вторых, препараты, назначаемые в комплексе, могут проявлять как синергизм, так и антагонизм по отношению друг к другу. Таким методом контроля может быть определение бактериостатической активности крови, так как величина БАК является результирующей действия многих факторов: пути введения препаратов, их фармакокинетики и фармакодинамики в организме конкретного больного, а при использовании аутоштамма - чувствительностью или устойчивостью данного штамма МБТ к данному набору препаратов. Разработка быстрого и корректного метода определения БАК - одна из задач работы.

Широкое распространение на территории РФ штаммов генетического семейства Beijing, для которых характерна высокая частота МЛУ (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005), приводит к выводу об изменении свойств возбудителя в последние десятилетия. В связи с этим возникает задача оценки соотношения вирулентности МВТ, циркулирующих в регионах РФ, с другими биологическими свойствами патогена — генотипом, ЛУ, жизнеспособностью.

Разработка методов ускоренного определения ЛЧ МВТ была начата с исследования красителей - метиленового синего, малахитового зеленого в качестве индикаторов роста МВТ, которое выявило их непригодность для решения поставленной задачи. Более стабильные результаты получены при использовании ТТХ. Тем не менее, низкая специфичность метода в отношении этамбутола (58,3%) и низкая чувствительность в отношении стрептомицина (57,1%), низкие параметры в отношении изониазида ограничивает применение индикатора только для предварительного определения чувствительности МБТ к рифампицину.

С целью создания ускоренного метода определения ЛУ МБТ была разработана полужидкая питательная среда на основе жидкой модифицированной среды Сотона. Данная среда позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов МБТ на 3-5 сутки, что в 2,8-3,2 раза быстрее, чем на стандартной плотной среде Левенштейна-Йенсена. Уже на 3 сутки у 42,1% штаммов наблюдаются признаки роста, на 4-5 сутки у 95,2% штаммов, и на 7 сутки - у 98,3%. Из 804 исследованных штаммов лишь 4 дали рост позже 10 суток, причем у 3 из них отмечался замедленный рост и на плотной среде. Быстрый рост МБТ на разработанной среде обусловлен рядом факторов. Во-первых, среда по консистенции близка к жидкой, а на жидких средах мико-бактерии растут быстрее. Во-вторых, рост активизирует внесение сыворотки. В-третьих, содержащийся в среде в небольшом проценте агар-агар способствует повышению локальной концентрации микроорганизмов, не давая взвеси клеток опускаться на дно пробирки. Эта же особенность среды обеспечивает и хорошую аэрацию инокулята. В начальных опытах выявили близкое совпадение результатов определения ЛУ 242 штаммов на стандартной и испытуемой средах: в 90,1% случаев для стрептомицина, 96,1% - для изониазида, 96,3% - для рифампицина. В дальнейшем эти результаты были подтверждены при исследовании еще 407 штаммов. В целом чувствительность и специфичность метода для изониазида составляет 96,3% и 87,4%, для рифампицина -95,8% и 93,1%, для стрептомицина - 96,6% и 94,7%, для этамбутола - 65,8% и 89,2%. Различия в результатах определения чувствительности к этамбуто-лу, возможно, объясняются особенностями препарата (небольшой разницей между критической концентрацией и средней МПК его у устойчивых штаммов МБТ), наличием или отсутствием глюкозы в составе среды, а также влиянием рН среды (Акимова и др., 2003).

Одно из достоинств предлагаемого метода — простота учета результатов, так как он визуальный и не требует дорогостоящего оборудования для индикации роста. Кроме того, все ингредиенты питательной среды отечественного производства (кроме Ь-аспарагина), доступны и недороги. Главное преимущество метода - быстрое, в течение 3-5 дней после посева культуры выявление множественной лекарственной устойчивости у 80,2% штаммов МБТ, и через 7 дней - у 90,2%. Как известно, МБТ с множественной лекарственной устойчивостью особенно опасны в эпидемиологическом отношении.

Таким образом, впервые разработан ускоренный метод определения лекарственной устойчивости МБТ - простой, дешевый и доступный для любой практической фтизиобактериологической лаборатории. На питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобакте-рий туберкулеза получен патент на изобретение № 2226398 от 10.04.2004.

При исследовании бактериостатической активности крови (БАК) больных туберкулезом органов дыхания методом вертикальной диффузии впервые выявлена четкая зависимость между величиной БАК и чувствительностью культуры, выделяемой больным, к изониазиду. У 96,2% больных с культурами, чувствительными к изониазиду наблюдали среднюю и высокую БАК, у 4% - среднюю и отсутствие нулевых показателей. При устойчивости к данному препарату распределение значений БАК иное: средние и высокие у 2,0% больных, низкие - у 54,0%, нулевые — у 445 (в сумме низкие и нулевые составляли 98,0%). Прослежена зависимость между частотой высоких и средних значений БАК и частотой благоприятного течения туберкулеза. Так, при сохраненной чувствительности к изониазиду при средних и высоких значениях БАК у 100,0-96,5% больных (процент зависит от группы) отмечаются значительные улучшения и улучшения. У больных с низкими и нулевыми значениями БАК в 22% случаев имело место прогрессирование процесса. Однако, у 52,6% больных с изониазидоустойчивыми штаммами отмечается "улучшение" и у 26,0% - "значительное улучшение", хотя величины БАК у них низкие. Данное обстоятельство навело нас на мысль, что затрудненная диффузия в среде препаратов с большой молекулярной массой приводит к занижению значений БАК в случае, когда культура чувствительна к такому препарату. Вследствие этого применение метода вертикальной диффузии (и в целом плотных сред) не корректно в случае устойчивости аутоштамма к изониазиду.

Тем не менее, метод был высоко информативен при использовании с целью изучения фармакокинетики изониазида при различных путях введения препарата - внутримышечном и эндолимфатическом. В случае применения эндолимфатического введения высокие значения БАК регистрировали в 2 раза чаще, чем при внутримышечном, более чем в половине случаев получали высокую концентрацию в крови без увеличения дозы изониазида, причем с четким эффектом пролонгации — до 9 часов против 4 при обычном способе введения.

С целью разработки адекватного метода исследования БАК у больных с устойчивостью к изониазиду использовали полужидкую питательную среду, применявшуюся для определения ЛУ. В ходе сравнительного исследования БАК с применением плотных (яичной и агаризованной), полужидкой и жидких сред доказано, что в случае устойчивости клинического штамма МБТ к изониазиду использовать плотные среды не корректно, так при этом показатели туберкулостатической пробы занижаются. Вероятно, это обусловлено особенностями диффузии ПТП в среду при нанесении разведений сыворотки и из среды - при росте МБТ. Оптимальными для данного исследования являются жидкие и полужидкие среды. Подтверждена зависимость между величиной БАК и чувствительностью аутоштамма к изониазиду: при чувствительности изолята к препарату отмечаются высокие значения, при устойчивости - значения зависят от того, какие среды используются - плотная или жидкая (полужидкая). Полужидкая среда по результатам не отличается от жидкой, но позволяет получать данные о БАК в недельный срок. Достоинством метода является и то, что по величине БАК можно судить о чувствительности аутоштамма в изониазиду: у всех больных с БАК, равной 9, отмечается чувствительность к изониазиду, при 7 или 8 - высокая чувствительность к 1 -2 препаратам при пероральном их приеме, или чувствительность к ПТП, вводимым парэнтерально. Значения БАК, равные 5, 6 или менее, сочетаются с МЛУ. Следовательно, по величине БАК можно в определенной степени судить о чувствительности или устойчивости культуры МБТ больного к назначаемым препаратам еще до получения результатов лабораторного определения ЛУ.

При разработке ускоренного метода определения БАК впервые выявлена обратная корреляция между значениями БАК и длительностью бакте-риовыделения (степень - средняя, г=-0,65, р=0,01). Таким образом, определение БАК с помощью полужидкой среды может служить достоверным и надежным критерием эффективности назначенной терапии, причем результаты определения БАК метод позволяет получить в недельный срок.

При обследовании в клинике терапии туберкулеза легких 101 пациента впервые получены данные о корреляции между значениями БАК и динамикой туберкулезного процесса. При высоких значениях БАК у 93,8% больных с сохраненной чувствительностью к изониазиду и у 80,0% с устойчивостью к нему наблюдали "значительное улучшение" и "улучшение". В целом, снижение показателей БАК от высоких к низким и к нулевым характеризуется ухудшением клинико-лабораторных показателей эффективности лечения. В частности, снижение показателей БАК до нулевых сопровождается уменьшением частоты благоприятного течения процесса до 18,2%. В группе больных с нулевыми значениями БАК, кроме того, наблюдали наиболее высокий процент тяжелых форм процесса, повторного туберкулеза, длительности выделения МБТ, частоты бактериовыделения через 6 месяцев лечения, высокую жизнеспособность МБТ. Следует подчеркнуть, что нулевые значения БАК четко соотносятся с наиболее неблагоприятным течением процесса и, следовательно, требуют незамедлительной и обязательной коррекции химиотерапии.

Таким образом, определение БАК больных с использованием аутош-тамма МБТ и полужидкой среды, является быстрым и надежным лабораторным методом контроля адекватности химиотерапии.

Использование одновременно двух методов - ускоренного определения ЛУ и БАК позволяет в короткие сроки, во-первых, выявить множественную лекарственную устойчивость, и, во-вторых, оценить адекватность химиотерапии и в случае необходимости откорректировать ее.

Преимущества методов — простота, дешевизна, короткий срок получения результатов - очевидны в условиях постоянного роста ЛУ, и, в особенности, множественной лекарственной устойчивости, так как они позволяют клиницистам в более короткие сроки с помощью индивидуализированной химиотерапии прервать распространение эпидемиологически более опасных МБТ.

Изменение свойств Mycobacterium tuberculosis, проявляющееся в широком распространении штаммов с МЛУ, циркуляции на территории РФ штаммов генотипа Beijing, доля которых составляет от 34 до 66% (Нарвская О.В., 2003; Иванов и др., 2004; Маракшин и др., 2004; Медведева и др., 2005 Drobniewski F. et al., 2005; Kovalev et al., 2005) требует решить вопрос о соотношении ЛУ, вирулентности, жизнеспособности и генотипа возбудителя.

При исследовании in vitro на модели инфицирования неактивированных дифференцированных клеток линии ТНР-1 микобактериями различных генотипов наибольшая вирулентность выявлена у МБТ генотипа Beijing варианта ВО. Количественно она проявляется относительно высокой скоростью роста и высокой цитотоксической активностью, стимуляцией индукции противовоспалительного цитокина TGF-р и супрессией провоспалительного TNF-a. Штаммы сборной группы иных генотипов (не Beijing), при схожей выживаемости обладали статистически достоверно меньшей способностью активировать некроз макрофагов. МБТ семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, т.е. имели меньшую скорость роста в макрофагах и в меньшей степени вызывали их некроз обратную картину в отношении цитокинов. Полученные данные коррелируют с рядом клинических характеристик пациентов: - возрастным составом, длительностью заболевания и бактериовыделения. Наиболее неблагоприятная картина наблюдается у больных, выделяющих МБТ генотипа Beijing.

МБТ любого генотипа обладают вирулентностью, так как относятся к безусловным патогенным микроорганизмам. Все исследованные штаммы были выделены из патологического материала больных ТОД и, следовательно, были вирулентны. Высокотрансмиссивные штаммы, относящиеся к большим по объему кластерам, в большей степени цитотоксичны, модулируют ответ макрофагов в сторону продукции цитокинов, уменьшающих воспалительную защитную реакцию, что может приводить к диссеминации инфекции, характерной для ТОД, вызванного МБТ генотипа Beijing, и к возможности передачи жизнеспособного возбудителя другому хозяину. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости у МБТ генотипа Beijing ВО, сочетающаяся с высокой вирулентностью, свидетельствует о том, что мутации в геноме возбудителя, которые обеспечивают устойчивость к ПТП, не сказываются на патогенных свойствах возбудителя туберкулеза.

Для более точного, количественного сопоставления значимости в туберкулезном процессе генетических и фенотипических особенностей организма-хозяина и организма-паразита необходимы дальнейшие исследования. Использованная в настоящей работе модель in vitro изучения вирулентности (цитотоксичности) с помощью клеточной линии ТНР-1, может позволить провести эти исследования. Кроме того, данная модель перспективна для поиска препаратов влияющих на вирулентность, ингибирующих или снижающих способность МВТ вызывать некроз макрофагов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Маничева, Ольга Алексеевна, Санкт-Петербург

1. Акимова НА., Морозова Т.П., Домотенко JI.B. Влияние рН среды на результаты определения чувствительности M.tuberculosis к этамбутолу // "Туберкулез сегодня": Матер.УН Рос. съезда фтизиатров. М., 2003. — С.81.

2. Алексеева Г.И., Кравченко А.Ф. Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в республике Саха (Якутия) // Пробл. туб. и болезней легких. 2007. - № 7. - С. 30-33

3. Алексеевская К.П. Лечение больных туберкулезом легких под контролем бактериостатической активности крови. Автореф. дисс. канд.мед.наук. М., 1979.

4. Альховик О.И., Гащенко Н.Н., Лисиченко Г.М. и др. Диагностическая ценность ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. // «Туберкулез старая проблема в новом тысячелетии»: Матер. Международ, конф. - М., 2002. - С.27.

5. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., и др. Изучение ех vivo роста в макрофагах штаммов Mycobacterium tuberculosis разных геноти-пических кластеров // Пробл. туб. и болезней легких. 2006. - № 12. - С. 4348.

6. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., и др. Влияние генотипа M.tuberculosis на выживаемость мышей при экспериментальном туберкулезе // Пробл. туб. и болезней легких. 2007. - № 7 - С. 45-50.

7. Аникин В.А. Проблемы корректности бактериологического исследования на лекарственную резистентность микобактерий туберкулеза.// Матер. IV (XIV) съезда науч. мед. ассоциации фтизиатров. М. - Йошкар-Ола. -1999.-С.207.

8. Бастиан И., Портале Ф. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью: прошлое, настоящее и будущее. // Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью. М.: Медицина и жизнь, 2003. С. 17-33.

9. Борисов С.Е. Диагностика туберкулеза: возможности и пределы // «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы»: Науч. тр. и матер, конф., посвящен, памяти М.М.Авербаха. М., 2000. - С. 92-97.

10. Быкадорова K.P., Чубарян В.Т., Будина Н.И., Рыжков С.И. Автоматизированная система ускоренной культуральной диагностики туберкулеза // "Туберкулез сегодня". Матер. VII Рос. съезда фтизиатров. - М., - 2003. -С.82.

11. Бялик И.Б., Журило A.A., Вялых Ж.Э., и др. Исследование бактерио-статической активности крови при полихимиотерапии в различных режимах у больных с деструктивным туберкулезом легких // Укр. химиотерапевт, журн.- 2000.- № 3,- С. 26 29.

12. Васильева И.А., Черноусова JI.H., Заседателев A.C., и др. Клиническое значение микрочиповой технологии определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Пробл. туб. 2002. - № 6. - С. 21-24.

13. Васильева С.Н., Виноградова Т.И., Кацер ЛИ., и др. Оценка вирулентности микобактерий туберкулеза по объему поражений в легких в эксперименте на мышах // «Туберкулез сегодня». Матер. VII Рос. съезда фтизиатров.-М., 2003.-С. 82.

14. Вилер П.Р., Ретледж К. Метаболизм Mycobacterium tuberculosis. // «Туберкулез. Патогенез, защита, контроль» : пер. с англ. / Под ред. Барри Б.Блума. — М.: Медицина, 2002. С.379-415.

15. Вишневский Б.И. Влияние внутривенной гормоно-химиотерапии на жизнеспособность микобактерий туберкулеза // Пробл.туб. 1971. - № 8. — С. 21-25.

16. Вишневский Б.И., Ткачук В.Н., Милорадович В. Концентрация основных противотуберкулезных препаратов в крови и почечной ткани больных туберкулезом почек // Урол. и нефрол. 1975. - № 4. - С. 12-16.

17. Вишневский Б.И., Истомин Е.А., Мякотина Е.Н. Исследование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к левофлоксацину // Антибиотики и химиотерапия. 2002.- Т. 47, № 6.- С. 28-31.

18. Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза на Северо-Западе России //Пробл. туб. и болезней легких. 2003. - № 5.- С. 42-45.

19. Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., Платонова М.В. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза при различных локализациях заболевания.// Матер. VII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и па-разитол. М., 1997. - Т.2. - С. 301-302.

20. Вишневский Б.И., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневская Е.Б. Клиническая микробиология // «Руководство по легочному и внелегочному туберкулезу» / Под ред. Ю.Н.Левашева, Ю.М.Репина. СПб.: ЭЛБИ-СПб. -2006.-С. 95-114.

21. Гамазков Р.В. Эндолимфатическое введение изониазида в комплексном лечении туберкулезного эпидидимита // Автореф. дис. . канд. мед. наук. СПб. 2000.

22. Голышевская В.И., Корнеев А.А., Черноусова Л.Н., и др. Применение новых микробиологических технологий в диагностике туберкулеза // Пробл. туб. 1996. - № 6. - С. 22- 25.

23. Голышевская В.И., Севастьянова Э.В., Воронина Г.А. Определение лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis методами пропорций и абсолютных концентраций // Пробл. туб. 2001а. - № 3. — С. 51-53.

24. Джекобе У .Р., Блум Б.Р. Молекулярно-генетические подходы к идентификации факторов вирулентности Mycobacterium tuberculosis // «Туберкулез. Патогенез, защита, контроль» : Пер. с англ. / Под ред. Барри Б.Блума. -М.: Медицина, 2002. С. 271-290.

25. Домарадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации // ЖМЭИ. 1997. - № 4. - С. 16-20.

26. Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Булатова Р.Ф., и др. Тест-набор для ускоренного определения лекарственной чувствительности М. Tuberculosis //«Туберкулез сегодня»: Матер. VII Росс. Съезда фтизиатров. М., 2003.- С. 83.

27. Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.Н. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг. // Пробл.туб. 2000. - № 5. - С. 19-22.

28. Дощак Н.И., Ломаченков В.Д. Устойчивость микобактерий и ее влияние на эффективность лечения впервые выявленных больных туберкулезом легких // Мат. VII съезда Всерос. общества эпидем., микробиол. и паразитол. М., 1997. - Т. 2. - С. 305-306.

29. Журавлев В.Ю., Васильева И.Н., Нарвская О.В. Генодиагностика дис-семинированного туберкулеза // «Генодиагностика инфекционных болезней -2007»/ Под ред. В.И.Покровского. М. - 2007. - Т.З. - С. 17-20.

30. Иванов И.Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Коробова О.В., Шемякин И.Г. Сполиготипы клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных у больных туберкулезом Центрального региона России // Пробл. туб. и болезней легких. 2004. - № 4. - С. 23-27.

31. Ильина Т.Я., Жангиров А.А., Сидоренко О.А. Резистентность микобактерий туберкулеза у впервые выявленных больных туберкулезом и при рецидивах заболевания // Пробл. туб. и болезней легких. 2003. - № 5. - С. 19-21.

32. Иртуганова О.А., Смирнова Л.С., Слогоцкая Л.В., и др. Автоматизированные методы культурального определения Mycobacterium tuberculosis на жидких средах // Пробл. туб. 2001. - № 3. - С. 53-55.

33. Кибрик Б.С., Челнокова О.Г. Некоторые особенности лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза у больных с остропрогрессирующими деструктивными формами туберкулеза легких // Пробл. туб. и болезней легких. 2003. - № 8. - С. 3-5.

34. Кондакова М.Н. Клинико-генетические особенности патогенеза туберкулеза органов дыхания у подростков // Автореф. . .дис. докт.мед.наук. -СПб, 2005.

35. Корнеев А.А. Дифференциальная диагностика и определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Матер. VII съезда Все-рос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 1997. - Т. 2. - С.ЗО.

36. Литвинов В.И. Лабораторная диагностика туберкулеза // Науч. тр.(к 75-летию ведущего противотуб. учреждения г.Москвы./ Под ред. В.И.Литвинова.-М., 2001.-С. 216-219.

37. Маракшин А.П., Мезько Е.М., Белякова Н.К., и др. Генотипические характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis из республики Тува // Пробл.туб и болезней легких. 2004. -№ 3. - С. 37-40.

38. Медведева Т.В., Огарков О.В., Некипелов О.М., и др. MIRU-VNTR-типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis из Восточной Сибири семейство Beijing, вариант Kilimanjaro // Мол.ген. микробиол. вирусол. - 2004. - № 4. — С. 33-38.

39. Медицинская микробиология // Гл. ред. В.И.Покровский, О.К.Поздеев. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200 с.

40. Мишин В.Ю., Чуканов В.И., Васильева И.А. Эффективность лечения туберкулеза легких, вызванного микобактериями с множественной лекарственной устойчивостью // Пробл. туб. 2002. - № 12. - С. 18-22.

41. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе // Автореф. .дис. докт.мед.наук. -СПб., 2003.

42. Обгольц А.А. Механизмы персистирования бактерий // ЖМЭИ. -1992.-№4.-С. 70-72.53. "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" // Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 г. № 109.

43. Самойлова А.Г., Марьяндышев А.О. Лекарственная устойчивость ми-кобактерий туберкулеза актуальная проблема фтизиатрии (обзор литературы) // Пробл. туб. и болезней легких. - 2005. - № 7. - С. 3-9.

44. Сапожникова Н.В. Особенности течения туберкулеза легких в зависимости от биологических свойств возбудителя // Автореф. дис. .канд.мед.наук. СПб., 2003.

45. Севастьянова Э.В., Голышевская В.И., Сафонова С.Г., Масленникова Ю.В. Определение лекарственной устойчивости M.tuberculosis традиционными и современными методами // Матер. IV съезда науч.-мед. ассоциации фтизиатров. М.-Йошкар-Ола, 1999. С. 218.

46. Севастьянова Э.В., Мартынова Л.П., Масленникова Ю.В. Изучение степени резистентности штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью // Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол. -М., 2002. Т.З.- С. 210 -211.

47. Сидоренко С.В. Есть ли будущее у антибактериальной терапии? // Антибиот. химиотер. 1999. - вып.44. - № 1. - С. 3-5.

48. Скотникова О.И., Михайлович В.М., Носова Г.Ю., и др. Новые технологии определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis // Пробл. туб. и болезней легких.- 2004. № 6. - С. 40-47.

49. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А. и др. Выявление микобактерий туберкулеза различными методами // Пробл.туб. 2001а.- № 5.-С. 56-58.

50. Скрягина Е.М., Залуцкая О.М., Рот А. и др. Тестирование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с использованием различных методов. // Пробл.туб. 20016.- № 5.- С. 43-45.

51. Соколова Г.Б. Индивидуализированная химиотерапия туберкулеза легких// Автореф. дисс. . докт. мед. наук. М., 2000.

52. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам // Новости науки и техн. Сер. Мед. Вып. Туберкулез/ ВИНИТИ. -2002. №5.-С. 1-6.

53. Филатова М.С., Валиев Р.Ш. Бактериостатическая активность крови у больных туберкулезом и ее клиническое значение //"Туберкулез сегодня" : Матер. VII Рос. съезда фтизиатров. М., 2003. - С. 93.

54. Хейфец Л. Традиционные методы исследования лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis // «Туберкулез с множественнойлекарственной устойчивостью»: М.: «Медицина и жизнь», 2003. - С. 163175.

55. Хоменко А.Г., Голышевская В.И. Распространенность и микробиологическая характеристика штаммов с множественной лекарственной устойчивостью // Реф. сбор. "Туберкулез". 1999. - №1. - С. 1-5.

56. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.А. и др. Биологические свойства клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis // ЖМЭИ. — 2002. № 1.-С. 7-11.

57. Щеголева Р.А. Модификация жидкой питательной среды Сотона для выращивания микобактерий туберкулеза // Лаб. дело. 1989. № 5. - С. 78-79.

58. Ягафарова Р.К., Рекель Ю.И., Вишневский Б.И. Влияние террилитина на бактериостатическую активность тканей при химиотерапии туберкулеза почек и женских половых органов в эксперименте // Антибиотики и мед. биотехнология. 1986. - № 4. - С. 294-297.

59. Affolabi D., Odoun М., Martin A. et al. Evaluation of direct detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance by a nitrate reductase assay applied to sputum samples in Cotonou, Benin // J.Clin.Microbiol. 2007. - v. 45. -P. 2123-2125.

60. Akhtar P., Srivastava S, Srivastava A. et al. Rv3303c of Mycobacterium tuberculosis protects tubercle bacilli against oxidative stress in vivo and contributes to virulence in mice // Microbes Infect. 2006. - v. 8(14-15). - P. 2855-2862.

61. Al-Akhali A., Ohkado A., Fujiki A. et al. Nationwide survey on the prevalence of anti-tuberculosis drug resistance in the Republic of Yemen, 2004 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - v.l 1(12).- P. 1328-33.

62. Albert H., Trollip A.P, Seaman T. et al. Evaluation of a rapid screening test for rifampicin resistance in re-treatment tuberculosis patients in the Eastern Cape //S. Afr. Med. J. 2007. - v.91. - № 9. - P. 858-863.

63. Ando M., Yoshimatsu T., Ko C. et al. Deletion of Mycobacterium tuberculosis Sigma Factor E Results in Delayed Time to Death with Bacterial Persistence in the Lungs of Aerosol-Infected Mice // Infec. Immunity. 2003. - Vol. 71.- № 12.- P. 7170-7172.

64. Angeby K.A., Klints L., Hoffner S.A. Rapid and inexpensive drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis with nitrate reductase assay // J. Clin. Microbiol. 2002. - v. 40. - P. 553-555.

65. Barreto A.M., Araujo J.B., Medeiros R.F, Caldas P.C. Direct sensitivity test of the MB/BacT system //Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2002. - v. 97. - № 2. -P. 263-264.

66. Bastian I., Rigouts L., Palomino J.C., Portaels F. Kanamycin Susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis Using Mycobacterim Growth Indicator Tube and a Colometric Method.// Antimicrob. Agents Chemotherap. 2001. -v.45. -№ 6. - P. 1934-1936.

67. Bemer P., Bodmer T., Munzinger J. et al. Multicenter evaluation of the MB/BACT system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J. Clin. Microbiol. 2004. - v. 42. - № 3. - P. 1030-1034.

68. Bergmann J.S., Woods G.L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs // J. Clinic.Microbiol. 1998. - v. 36. - № 10. - P. 29402943.

69. Bergval I.L., Vijzelaar R.N., Dalla Costa E.R., et al. Development of a multiplex assay for the rapid characterisation Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2007. - v. 46. - № 2. - P. 689-699.

70. Borgdorff M.W., van Deutekom H., De Haas P.E. Mycobacterium tuberculosis, Beijing genotype strains not associated with radiological presentation of pulmonary tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). 2004 - v. 84. - № 5. - P. 337340.

71. Brunello F., Fontana R. Reliability of the MB/BacT System for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis Complex Isolates to Antituberculous Drugs // J. Clinic. Microbiology. 2000. - v. 38. - № 2. - P. 872-873.

72. Cardoso R.F., Cardoso M.A., Leite C.Q. et al. Characterization of ndh gene of isoniazid resistant and susceptible Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2007. - v. 102. - № 1. - P. 59-61.

73. Casart Y., Turcios L., Florez I. IS6110 in oriC affects the morphology and growth of Mycobacterium tuberculosis and attenuates virulence in mice // Tuberculosis (Edinb). 2008. - v. 88. - № 6. - P. 545-552.

74. Castandet J., Prost J.F., Peyron P. et al. Tyrosine phosphatase MptpA of Mycobacterium tuberculosis inhibits phagocytosis and increases actin polymerization in macrophages // Res. Microbiol. 2005. - v. 156. - № 10. - p . 1005-1013.

75. Caviedes L., Delgado J., Gilman R.H. Tetrazolium microplate Assay as a Rapid and Inexpensive Colorimetric Method for Determination of Antibiotic Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2002. - v. 40. -№5.-P. 1873-1874.

76. Caviedes L., Lee T.S., Gilman R.H. et al. Efficient Detection and Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis in Sputum by Microscopic observation of Broth Culture // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 3. - P. 1203-1208.

77. Chauca A., Palomino J.C., Guerra H. Evaluation of rifampicin and isoni-azid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a mycobacteriophage D29-based assay // Med. Microbiol. 2007. - V.56 (Pt 3). - P. 360-364.

78. Cheon S.-H., Kampmann B., Hise A.G. et al. Bactericidal Activity in Whole Blood as a Potential Surrogate Marker of Immunity after Vaccination against Tuberculosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002. — v. 9. — № 4. - P. 901907.

79. Coban A.Y., Birinci A., Ekinci B., Durupinar B. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by the broth microdilution method with 7H9 broth. //Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2004. v. 99. - № 1. - P. 111-113.

80. Coban A.Y., Bilgin K., Uzun M. et al. Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to isiniazid and rifampin on blood agar // J. Clin. Microbiol. 2005. -v.43. -№ 4. - P. 1930-1931.

81. Coban A.Y., Cihan C.C., Bilgin K. et al. Blood agar for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against first-line drugs // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006 a. - v. 10. - № 4. - P.450-4503.

82. Coban A.Y., Cekic Cihan C., Bilgin K. et al. Rapid susceptibility test for Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin with resazurin method in screw-cap tubes //J. Chemother. 2006 6. - v. 18. -№ 2. - P. 140-143.

83. Costeira J, Pina J. Multi-drug resistant tuberculosis and the red queen -Diagnosis speed is crucial // Rev Port Pneumol. 2007. - v. 13. - № 6. - P. 869877.

84. Cronjo L., Edmondson N., Eisenach K.D., Bornman L. Iron and iron chelating agents modulate Mycobacterium tuberculosis growth and monocyte-macrophage viability and effector functions //FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2005. v. 45. - № 2. - P. 103-112.

85. Diaz-Infantes M.S., Ruiz-Serrano M.J., Martinez-Sanchez L. et al. Evaluation of the MB/BacT mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol.- 2000. v. 38. - № 5. - P. 1988-1989.

86. Dos Vultos T., Mestre O., Rauzier J. et al. Evolution and diversity of clonal bacteria: the paradigm of Mycobacterium tuberculosis // PLoS ONE. -2008.- v. 3. -№ 3. P. 1538.

87. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V. et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia // JAMA. 2005. v. 293. - № 22. - P. 2726-2731.

88. Dye C. Tuberculosis 2000-2010: control, but not elimination // Int. J. Tu-berc. Lung Dis. 2000. - v. 4. - P. 146-152.

89. Ejigu G.S., Woldeamanuel Y., Shah N.S. et al. Microscopic-observation drugsusceptibilityassayprovidesrapidandreliableidentification of MDR-TB // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008. - v. 12. - № 3. - P. 332-337.

90. Farnia P., Masjedi M.R., Mohammadi F. et al. Colorimetric Detection of Multidrug-Resistant Tuberculosis by Use of Malachite Green Indicator Dye // J. Clinic. Microbiol. 2008. - v. 46. - № 2. - P. 796-799.

91. Ferrer NX., Gomez A.B., Soto C.Y. et al. Intracellular replication of attenuated Mycobacterium tuberculosis phoP mutant in the absence of host cell cytotoxicity // Microbes and infection. 2009. - v. 11. - № l. - p. 115-122.

92. Foongladda S., Roengsanthia D., Arjrattanakool W. et al. Rapid and simple MTT method for rifampicin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2002. - v.6. - № 12. - P. 11181122.

93. Franzblau S.G., Witzig R.S., McLaughlin J.C. et al. Rapid, Low-technology MIC Determination with Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates by Using the Microplate Alamar Blue Assay // J. Clinic. Microbiol. 1998. - v.36.- № 6. P. 362-366.

94. Freixo I.M., Caldas P.C.S., Martins F. et al. Evaluation of Etest Strips for Rapid Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol.- 2002. v.40. - № 6. - P. 2282-2284.

95. Gagneux S., DeRiemer K., Van T. et al. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 2006. - v. 103.-№ 8.-P. 2869-2873.

96. Gali N., Dominguez J., Blanco S. et al. Utility of an in-house mycobacte-riophage-based assay for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. - № 6. - P. 2647-2649.

97. Goldman R.C., Plumley K.V., Laughon B.E. The evolution of exstensively drug resistans tuberculosis (XDR-TB): history, status, and issues for global control // Infect. Disord. Drug Targets 2007. - v. 7.- № 2. - P. 73-91.

98. Gonzalo Asensio J., Mostowy S., Harders-Westerveen J. PhoP: A Missing Piece in the Intricate Puzzle of Mycobacterium tuberculosis Virulence // PLoS. — 2008. — v. 3. №10. - P. 3496.

99. Gordon A.Y., D'Arcy Hart P., Young M.R. Ammonia inhibits phagosome-lysosome fusion in macrophages // Nature. 1980. - v. 286. - P. 79-81.

100. Hanna B.A., Walters S.B., Bonk S.J., Tick L.J. Recovery of mycobacteria from blood in mycobacteria growth indicator tube and Lowenstein-Jensen slant after lysis-centrifugation // J. Clin.Microbiol. 1995. - v. 33. - P. 3315-3316.

101. Hazbon M.H., del Socorro Orozco M., Labrada L.A. et al. Evaluation of Etest for Susceptibility Testing of Multidrug-Resistant Isolates of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 12. - P. 4599-4603.

102. Hazbon M. H.,' Guarfn N., Ferro B. E. et al. Photographic and Luminomet-ric Detection of Luciferase Reporter Phages for Drug Susceptibility Testing of

103. Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates I I J. Clinic.l Microbiol. — 2003. v. 41.- № 10.-P. 4865-4869.

104. He H., Hovey R., Kane J. et al. MprAB Is a Stress-Responsive Two-Component System That Directly Regulates Expression of Sigma Factors SigB and SigE in Mycobacterium tuberculosis //J. ofBacteriol. . 2006. - V. 188. - № 6. -P. 2134-2143.

105. Heifets L., Sanchez T. New Agar Medium for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38.-№4.-P. 1498-1501.

106. Heifets L.B., Cangelosi G.A. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: a neglected problem at the turn of century // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v. 3. - № 7. - P. 564-581.

107. Hu Y., Movahedzadeh F., Stoker N.G., Coates A.R. Deletion of the Mycobacterium tuberculosis alpha-crystallin-like hspX gene causes increased bacterial growth in vivo // Infect. Immun. 2006. v. 74. -№ 2. - P. 861-868.

108. Huang T.-S., Lee S.S.-J., Tu H.-Z. et al. Use of MGIT 960 for rapid quantitative measurement of the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis complex to ciprofloxacin and ethianamide // J. Antimicrib.Chemotherapy. 2004. - v. 53. -P .600-603.

109. Ingham C.J., Ayad A.B., Nolsen K., Mulder B. Rapid drug susceptibility testing of mycobacteria by culture on highly porous ceramic support // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008. - v. 12. - № 6. - P. 645-650.

110. Jacobs W.R. , Barletta R.G, Udani R. et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages. // Science. 1993. - v. 260(5109). - P.819-822.

111. Janulionis E., Sofer C., Song H.Y., Wallis R.S. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - v. 48. - № 8. -P. 3133-3135.

112. Jayachandran R., Scherr N., Pieters J. Analyzing the interaction of pathogens with the host immune system //Immunol. Lett. 2009. - v. 122. - № 2. - P. 112-114.J

113. Joh J.-S, Lee C.H., Lee J.E. et al. The Interval Between Initiation of Antituberculosis Treatment in Patients with Culture-positive Pulmonary Tuberculosis and Receipt of Drug-susceptibility Test Results // J. Korean Med. Sei. 2007. -v.22.-P. 26-29.

114. Joloba M.L., Bajaksouzian S., Jacobs M.R. Evaluation of Etest for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbial. 2000. - v. 38.-№ 10.-P. 3834-3836.

115. Jrdway D.J., Sonnerberg M.G., Donahue S.F. et al. Drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis exhibit a range of virulence for mice // Infect. Immunity. 1995. - v.63. - P. 741-743.

116. Kamerbeek J., Shouls L., Kolok A. et al. Simultaneous detection and strain differetiatin of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology //J. Clin. Microbiol. 1997. - v.35. - P. 907-914.

117. Keane J., Remold H.G., Kornfeld H. Virulent Mycobacterium tuberculosis Strains Evade apoptosis of Infected Alveolar Macrophages // J. Immun. 2000. -v.164. — P. 2016-2020.

118. Kirk S.M., Schell R.F., Moore A.V. et al. Flow Cytometric Testing of Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Ethambutol, Isoniazid, and Rifampin in 24 Hours // J. Clinic. Microbiol. 1998. - v. 36. - № 6. - P. 1568-1573.

119. Kovalev S.Y., Kamaev EY., Kravchenko M.A. et al. Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by

120. MIRU-VNTR genotyping // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. - v. 9. - № 7. - P. 746-752.

121. Kurtz S., McKinnon K.P., Runge M.S. et al. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response // Infect. Immun. 2006. - v. 74. - № 12. - P. 6855-6864.

122. Lam T.H., Yuen K.Y., Ho P.L., et al. Differential fadE28 expression associated with phenotypic virulence of Mycobacterium tuberculosis // Microb. Pathog. 2008.- v.45.-№ l.-P. 112-117.

123. Lamichhane G., Raghunand T.R., Morrison N.E. et al. Deletion of a Mycobacterium tuberculosis proteasomal ATPase homologue gene produces a slow-growing strain that persists in host tissues // J. Infect. Dis. 2006. v. 194. - № 9. -P. 1233-1240.

124. Leite C. Q. F., Beretta A. L. R. Z., Anno I. S., Teiles M. A. S. Standartiza-tion of Broth Microdilution Method for Mycobacterium tuberculosis // Mem. Ins. Oswaldo Cruz. 2000. - v. 95. - № l.-P. 127-129.

125. Lemus D., Martin A., Montoro E., et al. Rapid alternative methods for detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis // J. Antimicrob. Chemotherap. -2004. v. 54. - P. 130-133.

126. Lemus D., Montoro E., Echemendia M. et al. Nitrate reductase assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis; simple and inexpensive method for low-resource laboratories // J. Med. Microbiol. 2006. - v. 55. -P.861-863.

127. Levina K., Saluotsa M. Serum bactericidal activity test in patients with tuberculosis performed with BACTEC TB system // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. -v. 3.-Suppl.l.-P. 113.

128. Lew W., Pai M., Oxlade O. et al. Initial drug resistance and tuberculosis treatment outcomes: systematic review and meta-analysis // Ann. Intern. Med. -2008.- v. 149.-№2. — P.123-134.

129. Li Q., Whalen C.C., Albert J.M. Differences in Rate and Variability of Intracellular Growth of a Panel of Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates within a Human Monocyte Model // Infec. .Immun. 2002 - v. 70. - № 11. - P. 6489-6493.

130. Lopez B., Aguilar D., Orozco H. et al. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp. Immunol. -2003. v. 133. -№ 1. - P. 30-37.

131. Ma X.W., Hu Z.Y., Wang J. et al. Comparison between bacteriophage-based assay and BACTEC-960 system in detection of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2005. - V.44. - № 3. -P. 202-205. №t. no: Medline).

132. Macondo E.A., Ba F., Gaye-Diallo A. et al. Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosi by the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT AST SIRE) // Clin. Microbiol. Infect. 2000. - v .6. - P. 361-365.

133. Manca C., Tsenova L., Barry C.E. et al. Mycobacterium tuberculosis CDC 1551 Induces a More Vigorous Host Response In Vivo and In Vitro, But Is Not More Virulent Than Other Clinical Isolates //J. Immunol. 1999. - v. 162. -P. 6740-6746.

134. Manganelli R., Dubnau E., Tyagi S. et al. Differential expression of 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis // Mol. Microbiol. 1999. -v.31. -№ 2. - P. 715-724.

135. Martin A., Camacho M., Portaeis F., Palomini J.C. Resazurin Microtiter Assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis to Second-Line Drugs: Rapid,

136. Simple, And Inexpensive Method // Antimicrob. Agenta chemotherapy. 2003. -v.47. — № 11.-P. 3616-3619.

137. Martin A., Morcillo N., Lemus D. et al. Multicenter study of MTT and re-sazurin assays for testing susceptibility to first-line anti-tuberculosis drugs //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005 a. - v. 9. - № 8. - P. 901-906.

138. Martin A., Palomino J.C., Portaeis F. Rapid detection of ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis by two low-cost colorimetric methods: resa-zurin and nitrate reductase assays //J Clin Microbiol. 2005 6. - v. 43. - № 4. - P. 1612-1616.

139. Martin A., Takiff H., Vandamme P. et al. A new rapid and simple method to detect pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis using nicotinamide // J. Antimicrob. Chemotherap. 2006. - v.58. - P. 327-331.

140. Mathema B., Kurepina N.E., Bifania P.J., Kreiswirth B.N. Molecular Epidemiology of Tuberculosis: Current Insights //Clinic. Microbiol. Reviews. 2006. -v. 19.-№4.-P. 658-685.

141. McNerney R., Kiepiela P., Bishop K.S. et al. Rapid screening of Mycobacterium tuberculosis for susceptibility to rifampicin and streptomicin // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v.4. - P. 69-75.

142. McNerney R., Mallard K., Urassa H.M. et al. Colorimetric phage-based assay for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2007. - v. 45. - № 4. - P. 1330-1332.

143. Mejia G.I., Castrillon L., Tujillo H., Robledo J.A. Microcolony detection in 7H11 thin layer culture is an alternative for rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999.- v.3. - P. 138-142.

144. Mengatto L., Chiani Y., Imaz M.S. Evaluation of rapid alternative methods for drug susceptibility testing in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2006. - v. 101(5). - P. 535-542.

145. Mirovic V., Lepsanovic Z. Evaluation of the MB/BacT system for recovery of mycobacteria from clinical specimens in comparison to Lowenstein-Jensen medium.//Clin. Microbiol. Infect. -2002.- V.8.-№ 11.-P.709-714.

146. Mitchinson D.A., Wallace J.G., Bhatia A.L. A comparison of the virulence in guinea pig of South India and British tubercle bacilli // Tubercle. 1960. - v.41. -P. 1-22.

147. Moore D.A.J., Evans C.A.W., Gilman R.H. et al. Microscopic Observation Drug-Susceptibility Assay for the diagnosis of TB // N. Engl. J. Med. 2006. - v. 355.- № 15.-P. 1539-1550.

148. Mueller P., Pieters J. Modulation of macrophage antimicrobial mechanisms bypathogenicmycobacteria // Immunobiology. 2006. - v. 211. - № 6-8. -P. 549-556.

149. Musa HR, Ambroggi M, Souto A, Angeby KA. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a nitrate reductase assay applied directly on microscopy-positive sputum samples // J. Clin. Microbiol. -2005. v.43. - No 7. -P. 3159-3161.

150. Nateche F., Martin A., Baraka S., Palomino J.C., Khaled S., Portaeis F. Application of the resazurin microtitre assay for detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Algiers // J. Med. Micobiol. 2006. - v.55. — P. 857-560.

151. Nie Fhogartaigh C.J., Vardas-Prada S., Huancare V. et al. Physician-initiated courtesy MODS testing for TB and MDR-TB diagnosis and patient management //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008. - v. 12. - № 5. - P. 555-560.

152. Nullius M.V., Harth G., Horwitz M.A. Glutamine sythatase GlnAl is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis in human THP-1 macrophages and guinea pigs //Infec. Immun.- 2003. v.71. - № 7. - P. 3927-3936.

153. Ordway D.J., Sonnenberg M.G., Donahue S.A. et al. Drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis exhibit a range of virulence for mice // Infect. Immun. 1995. - v. 63. - № 2. - P. 741-743.

154. Oztur K.S., Ilvan A., Kartaloglu Z. et al. The value of mycobacterial growth indicator tube (MGIT) system for isolation of Mycobacterium tuberculosis from sputum // Int.J.Tuberc. Lung Diseas. 1999. - v. 3. - № 9. - Suppl. 1. - P. 181.

155. Palaci M., Ueki S.Y., Sato D.N. et al. Evaluation of mycobacteria growth indicator tube for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis isolates from respiratory specimens // J. Clin. Microbiol. 1996. - v. 34. -P. 762-764.

156. Palomino J.C. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field // Eur. Respir. J. 2005. - v. 26. -P. 339-350.

157. Palomino J. C., Traore H., Fissette K., Portaeis F. Evaluation of Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v. 3. - № 4. - P. 344-348.

158. Park D.J., Drobniewski F.A., Meyer A., Wilson S.M. Use of a phage-based assay for phenotypic detection of mycobacteria directly from sputum // J. Clin. Microbiol. 2003. - v.41. - № 2. - P. 680-688.

159. Park J.S., Tamayo M.H., Gonzalez-Juarrero M. et al. Virulent clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis grow rapidly and induce cellular necrosis but minimal apoptosis in murine macrophages // J. Leukoc. Biol. 2006. — v. 79. — № l.-P. 80-86.

160. Park W.G., Bishai W.R., Chaisson R.E., Dorman S.E. Performance of the Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay in Drug Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2002. - v.40. - № 12. -P. 4750-4752.

161. Park Y.K., Shin S., Ryu S. et al. Comparison of drug resistance genotypes between Beijing and non-Beijing family strains of Mycobacterium tuberculosis in Korea // J. Microbiol. Methods. 2005. - v. 65. - № 2. - P. 162-172.

162. Paul S., Laochumroonvorapong P., Kaplan G. Comparable growth of virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis in human macrophages in vitro // J. Infect. Dis. 1996. - v. 174. - № l.-P. 105-112.

163. Perez E., Samper S., Bordas Y. et al. An essential role for phoP in Mycobacterium tuberculosis virulence // Molecul. Microbiol. 2008. - v. 41(1). — P. 179-187.

164. Pfyffer G.E., Welscher H.M., Kissling P. et al. Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery of acid-fast bacilli // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - № 2. - P. 364368.

165. Piersimoni C., Olivieri A., Benacchio L., Scarparo C. Current Perspectives on Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex: the Automated Nonradiometric Systems // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v.44. - No 1. -P.20-28.

166. Pillay M, Sturm A.W. Evolution of the extensively drug-resistant F15/LAM4/KZN strain of Mycobacterium tuberculosis in KwaZulu-Natal, South Africa // Clin Infect Dis. 2007. - v.45. - P. 1409-1414.

167. Pina-Vaz C., Costa-de-Oliveira S., Rodrigues A.G. Safe susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry with the fluorescent nucleic acid strain SYTO 16 //J. Med.Micribiol. 2005. - v. 54. - P. 77-81.

168. Poogary A., Nataraj G., Kanade S. et al.Rapid antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: its utility in resource poor setting // Indian J. Med. Microbiol. 2006. - v. 24. - P. 268-272.

169. Rajavelu P., Das S. D. A Correlation between Phagocytosis and Apoptosis in THP-1 Cells Infected with Prevalent Strains of Mycobacterium tuberculosis // Microbiol. Immunol. 2007. - Vol. 51 . - № 2. - P.201-210.

170. Rama R.A., Satchidanandam V. An approach for studying the mediators of pathogenesis in Mycobacterium tuberculosis //J.Biosci. 1996. - v.21. - № 3. -P. 413-421.

171. Raut U., Narang P., Mendiratta D.K. et al. Evaluation of rapid MTT tube method for detection of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to ri-fampicin and isoniazid // Indian. J. Med. Microbiol. 2008. - v. 26. - P. 222-227.

172. Riendeau C. J., Kornfeld H. THP-1 Cell Apoptosis in Response to Mycobacterial Infection // Infect. Immu. 2003. - Vol. 71. - № 1. - P. 254-259.

173. Rivoire N., Ravololonandriana P., Rasolonavalona T. et al. Evaluation of the resazurin assay for the detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Madagascar // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v. 11. - № 6.- P. 683688.

174. Robledo J.A., Mejia G.I., Morcillo N. et al. Evaluation of a rapid culture method for tuberculosis diagnosis: a Latin American multicenter study // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006.-v. 10.-№ 6.-P.613-619.

175. Robledo J., Mejia G.I., Paniagua L. et al. Rapid detection of rifampicin and isoniasid resistance in Mycobacterium tuberculosis by the direct thin-layer method //Int. J. Tuberc. Lung Dis.-2008.-v.12.-№ 12.- P.1482-1484.

176. Rohner P., Ninet B., Metrai C. et al. Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens //J. Clin. Microbiol. 1997. - v. 35. — № 12. -P. 3127-3131.

177. Ruis P., Zerolo F.G., Casal M.J. Comparison of Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Using the ESP Culture System II That Using the BACTEC Method // J. Clinic. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 12. - P. 4663-4664.

178. Runyon E.H. Identification of mycobacterial pathogens utilizing colony characteristics // Am J.Clin.Pathol. 1970. - v. 54. - P. 578-586.

179. Rusch-Gerdes S., Domehl C., Nardi G., et al. Multicenter Evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for Testing Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to First-Line Drugs // J. Clinic. Microbiol. 1999. - V. 37. - № l.-P. 45-48.

180. Scharberg T., Reichert B., Schulin T. et al. Rapid drug susceptubility testing of Mycobacterium tuberculosis using conventional solid media // Eur. Respir. J.- 1995.-v. 8.-P. 1688-1693.

181. Schmiedel A. Der Vertikaldifffiisiontest als Methode zur Resistenzbestimmung von Tuberkulbakterien und zur JNH-spiegeltestung // Zeitschr.Tuberk. -1959. -B. 112.-№ l.-S. 48-56.

182. Sekiguchi J., Miyoshi-Akiyama T., Augustynowicz-Kopel E. et al. Detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. -2007.- v. 45.-№ l.-P. 179-192.

183. Shiferaw G., Woldeamanuel Y., Gebeyehu M. et al. Evaluation of Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay for Detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 2007. - v. 455. - № 4. - P. 1093-1097.

184. Siddiqi S.H., Libonati J.P., Middlbrook G. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J.Clin.Microbiol. 1981. -v. 13. - P. 908-912.

185. Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence // Clinic. Microbiol. Rewiers. 2003. - v. 16. - № 3. - P. 463-496.

186. Sohn H., Lee K.S., Kim S.Y. et al. Induction of cell death in human macrophages by a highly virulent Korean Isolate of Mycobacterium tuberculosis and the virulent strain H37Rv // Scand. J. Immunol. 2009. - v. 69. - № 1. - P. 43-50.

187. Solis L.A., Shin S.S., Han L.L. et al. Validation of a rapid method for detection of M. tuberculosis resistance to isoniazid and rifampin in Lima, Peru // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. - v. 9 - P. 760-764.

188. Srisuwanvilai L.O., Monkongdee P., Podewils L.J. et al. Performance of the BACTEC MGIT 960 compared with solid media for detection of Mycobacterium in Bangkok, Thailand // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - v. 61.-№4.-P. 402-407.

189. Srivastava V., Rouanet C., Srivastava R. et al. Macrophage-specific Mycobacterium tuberculosis genes: identification by green fluorescent protein andkanamycin resistance selection // Microbiology 2007. - v. 153. - Pt 3. — P. 659666.

190. Su W.J., Feng J.Y., Huang C.C., Perng R.P. Increasing drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates in a medical center in northern Taiwan // J. Formos Med. Assoc. 2008. - v. 107. - № 3. - P. 259-264.

191. Sun Y.J., Lee A.S., Wong S.Y. et al. Genotype and phenotype relationships and transmission analysis of drug-resistant tuberculosis in Singapore // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - v. 11. - № 4. - P. 436-442.

192. Tan T., Lee W.L., Alexander D.C. et al. The ESAT-6/CFP-10 secretion system of Mycobacterium marinum modulates phagosome maturation // Cell Microbiol. 2006. - v. 8. -№ 9. - P. 1417-1429.

193. Telles M.A.S., Bori A., Amorim A.B.R. et al. Rapid detection of mul-tidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis using the mycobacteria growth indicator tube (MGIT) system // Brazilian J. Med. Biol. Res. 2002. - V. 35. - P. 11271131.

194. Theus S.A., Cave M.D., Eisenach K. D. Activated THP-1 Cells: an Attractive Model for the Assessment of Intracellular Growth Rates of Mycobacterium tuberculosis Isolates I I Infect Immun. 2004. v. 72. - № 2. - P. 1169-1173.

195. Theus S.A., Cave M.D., Eisenach K.D. Intracellular Macrophage Growth Rates and Cytokine Profiles of Mycobacterium tuberculosis Strains with Different Transmission Dynamics // J. Infec. Dis. 2005. - v. 191. - P. 453-460.

196. Theus S.A., Eisenach K., Fomukong N. et al. Beijing family Mycobacterium tuberculosis strains differ in their intracellular growth in THP-1 macrophages // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007. - v. 11. - № 10. - P. 1087-1093.

197. Timm J., Kurepina N., Kreiswirth B.N. et al. A multidrag-resistant, acrl-deficient clinical isolate of Mycobacterium tuberculosis is unimpaired for replication in macrophages // J. Infect. Dis. 2006. - v. 193. - № 12. - P. 1703-1710.

198. Traore H., Ogwang S., Mallard K., et al. Low-cost rapid detection of ri-fampicin resistant tuberculosis using bacteriophagein Kampala, Uganda // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2007. - v. 9. - P. 6-11.

199. Umubyeyi A.N., Martin A., Zissis G. et al. Evaluation of the resazurin mirotitre assay for rapid detection of ofloxacin resistance in M.tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006. - v. 10. - № 7. - P. 808-811.

200. Vandal OH, Pierini LM, Schnappinger D A membrane protein preserves intrabacterial pH in intraphagosoma lMycobacterium tuberculosis // Nat. Med.2008.- v.14. № 8. — P.849-8

201. Varma M., Kumar S., Kumar A., Bose M. Comparison of Etest and Agar proportion Method of Testing Drug Susceptibility of M.tuberculosis.// Ind. J. Tub. -2002. v. 490. - P. 217-220.

202. Velmurugan K., Chen B., Miller J. et al. Mycobacterium tuberculosis nuoG is a Virulence Gene That Inhibits Apoptosis of Infected Host Cells // PLoS Pathogens. 2007. - v. 3. - № 7. - P. 0972 - 0980.

203. Vergne I., Chua J., Lee H.-H., Lucas M. et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis // PNAS. 2005. -v.102. - № 11. - P. 4033-4038.

204. Vestal A.L., Kubica G.P. Differential colonial characteristics of mycobacteria on Middlebrook and Cohn 7H10 agare-base medium // Am.Rev. Repir. Dis. -1965.-v.94.-P.247-252.

205. Wallis R.J., Nash D.R., Steele L.C., Steingrube V. Susceptibility Testing of Slowly Growing Mycobacteria by a Microdilution MIC Method with 7H9 Broth //J. Clinic. Microbiol. 1986. - v. 24. -№ 6. - P. 976-981.

206. Wallis R.S., Palaci M., Vinhas S. et al. A whole blood bactericidal assay for tuberculosis //J. Infec. Dis. 2001. - v. 183. - № 8. - P. 1300-1303 .

207. Walters S.B., Dubnau E., Kolesnikova I. et al. The Mycobacterium tuberculosis PhoPR two-component system regulates genes essential for virulence and complex lipid biosynthesis // Mol. Microbiol. 2006. v. 60. - № 2. - P. 312-330.

208. Wanger A., Mills K. Testing of Mycobacterium tuberculosis Susceptibility to Ethambutol, Isoniazid, Rifampin, and Streptomycin by Using Etest //J. Clinic. Microbiol. 1996. - v. 34. - № 7. - P. 1672-1676.

209. Wayne L.G. Synchronized replication of Mycobacterium tuberculosis // In-fect.Immun. 1977. - v. 17. - P. 528-530.

210. Werngren J., Klintz L., Hoffner S. E. Evaluation of a Novel Kit for Use with the BacT/ALERT 3D System for Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2006. - v. 44. - P. 2130-2132.

211. Williams-Bouyer N., Yorke R., Lee H.I., Woods G.L. Comparison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system II for growth and detection of mycobacteria //J. Clin. Microbiol. 2000. - v. 38. - № 11. - P. 4167-4170.

212. Wilson S.M., al-Suwaidi Z., McNerney R., et al. Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Nat. Med. 1997. - v. 3. - P. 465-468.

213. Wolinsky E., Smith M.M.,Steenken W. Isoiniazid susceptibility, catalase activity, and guinea pig virulence of recently isolated cultures of tubercle bacilli // Am. Rev. Tuberc. 1956. - v. 73. - P. 768-772.

214. Yajko D.M., Madej J.J., Lancaster M.V. et al. Colorimetric Method for Determing MICs of Antimicrobial Agents for Mycobacterium tuberculosis // J. Clinic. Microbiol. 1995. - v. 33. - № 9. - P. 2324-2327.

215. Yew W.W., Tong S.C., Lui K.S. et al. Comparison of MB/BacT system and agar proportion method in drug susceptibilitytesting of Mycobacterium tuberculosis / /Diagn Microbiol Infect Dis. 2001 -. v. 39. - № 4. - P. 229-232.

216. Yzquierdo S.L., Lemus D., Echemendia M. et al. Evaluation of phage assay for rapid phenotypic detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis //Ann. Clinic. Microbiol. Antimicrob. 2006. - v. 5. - P. 11-16.

217. Zhang M., Gong J, Yang Z. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. -1999.- v.l79.-№ 5.-P. 1213-1217.

218. Zhang M; Gong J; Lin Y; Barnes P F Growth of virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis strains in human macrophages // Infec. Immun.1998. v. 66. - № 2. - P. 794-799.

219. Zwolska Z., Augustynowicz-Kopec E., Klatt M. New automated, non-radiometric system for the culture of mycobacteria MB/BacT // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v. 3. - № 9. - Suppl. 1. - P. 112.

Информация о работе

Маничева, Ольга Алексеевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы