Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР для определения однонуклеотидных замен в геноме Mycobacterium tuberculosis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР для определения однонуклеотидных замен в геноме Mycobacterium tuberculosis"

российская академия наук

uu^D54292

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи

ИГНАТОВА АННА НИКОЛАЕВНА

разработка метода аллель-специфичной истощающей пцр для определения однонуклеотидных замен bvehome MYCOBACTERIUM ' TUBERCULOSIS.

03 00 03 - Молекулярная биология автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003054292

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация-

кандидат биологических наук С А Дубилей доктор биологических наук И Г. Шемякин

доктор биологических наук, профессор С М Деев доктор биологических наук Л. Н Черноусова

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта

Защита состоится 2007 г. в 10 часов на заседании

Специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу. 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая 16/10

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан 2007 г

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

Актуальность проблемы.

Туберкулез является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний. Около трети мирового населения инфицировано туберкулезом. Несмотря на наметившуюся стабилизацию показателей заболеваемости и смертности в России, ситуация по-прежнему остается весьма серьезной Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность туберкулеза в России в 2004 году составила не менее 160 больных на 100 000 населения

Этиологическим агентом туберкулеза является Mycobacterium tuberculosis. К особенностям этого микроорганизма можно отнести сложность строения клеточной стенки, медленный рост, возможность существования в латентной фазе Для М tuberculosis характерна природная устойчивость ко многим антибиотикам и только несколько групп антимикробных препаратов обладают противотуберкулезной активностью Со времени открытия первых антибиотиков, активных в отношении М tuberculosis, прошло всего несколько десятилетий, однако к настоящему моменту лекарственноустойчивые формы болезни зарегистрированы во всех странах мира, более того, появились штаммы, устойчивые ко всем основным противотуберкулезным препаратам Наиболее опасной формой является туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ, резистентностью по меньшей мере к двум основным противотуберкулезным антибиотикам - рифампицину и изониазиду) Россия входит в число стран, где отмечаются весьма высокие показатели распространения этой формы болезни

В этой связи особое значение приобретает разработка быстрых и высокоэффективных молекулярно-генетических методов определения лекарственной чувствительности клинических изолятов М. tuberculosis. Основную роль в возникновении лекарственно устойчивых штаммов играют точечные мутации и небольшие инсерции/делеции в геноме микроорганизма. Таким образом, для детекции устойчивости М tuberculosis необходим эффективный и надежный метод определения однонуклеотидных замен.

Детекция однонуклеотидных замен имеет важное значение для генотипирования. Определение первичной структуры ряда бактериальных геномов позволило выявить однонуклеотидные полиморфные замены (SNP, single nucleotide polymorphisms), применяемые в качестве маркеров при филогенетических и эпидемиологических исследованиях различных патогенов.

В последнее десятилетие разработано большое количество методов детекции точечных мутаций Каждый из них имеет свои положительные стороны и ограничения Метод для генотипирования клинических изолятов М tuberculosis должен быть надежным,

не требующим дорогостоящего оборудования и расходных материалов, позволять идентифицировать мутацию. Кроме того, метод должен предоставлять возможность анализировать культуры, являющиеся смесью нескольких изолятов М. tuberculosis. Существующие к настоящему времени методы не полностью удовлетворяют требованиям, необходимым для таких исследований.

Таким образом, разработка эффективного метода детекции однонуклеотидных замен является одной из актуальных проблем современной молекулярной диагностики, филогенетшси и эпидемиологии.

Цель работы.

Целью данной работы являлась разработка эффективного метода детекции однонуклеотидных замен, позволяющего определять мутации, приводящие к антибиотикорезистентности, анализировать однонуклеотидный полиморфизм и исследовать смешанные культуры М, tuberculosis.

Научная новизна и практическая ценность.

Разработан новый метод аллель-специфичной истощающей ПЦР (АСИ ПЦР), позволяющий достичь высокой аллельной дискриминации за счет дополнительной амплификации консервативного участка исследуемого генома. Показана высокая специфичность и чувствительность метода для определения различных точечных мутаций.

Метод АСИ ПЦР был применен для детекции мутаций, приводящих к устойчивости М. tuberculosis к рифампицину, изониазиду, этамбутолу и фгорхинолонам При исследовании 116 клинических изолятов М. tuberculosis устойчивость к рифампицину и изониазиду была корректно определена методом АСИ ПЦР в 95% и 100% случаев, соответственно. Таким образом, разработанный метод может быть применен в клинической лаборатории для быстрого определения резистентности к этим двум антибиотикам

Разработанный метод был адаптирован для анализа филогенетически важных однонуклеотидных полиморфных замен. Впервые была определена принадлежность российских изолятов М. tuberculosis к основным генетическим и филогенетическим группам

Существующие методики генотипирования М. tuberculosis не позволяют выявлять различия между чистой культурой и смесью нескольких штаммов Разработанный метод идентификации однонуклеотидных замен предоставляет уникальную возможность исследования смешанных культур М. tuberculosis.

Анализ результатов детекции однонуклеотидных полиморфных замен, мутаций, связанных с резистентностью, и данных IS6110 ПДРФ-типирования для 87 клинических

изолятов позволил выявить генетические характеристики штамма, явившегося причиной 31% случаев заболевания туберкулезом в тюремном госпитале пос. Озерки Тульской области

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 96 листах машинописного текста и состоит из обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 187 ссылок. Диссертация содержит 17 рисунков и 9 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР.

Из существующего разнообразия методов детекции однонуклеотидных замен, одним из наиболее простых в исполнении и не требующих специального дорогостоящего оборудования является аллель-специфичная ПЦР (АС ПЦР) Для детекции мутации этим методом проводят две ПЦР, в одной аллель-специфичный праймер полностью комплементарен матрице, в другой - содержит неспаренный 3' концевой нуклеотид (3' концевой мисматч) Поскольку Тач ДНК-полимераза не обладает 3'- 5' экзонуклеазной активностью, в процессе ПЦР происходит эффективная элонгация только тех праймеров, которые полностью комплементарны матрице Однако в ряде случаев достройка праймеров, содержащих неспаренный 3' концевой нуклеотид, все же происходит, хотя и с меньшей эффективностью, что в итоге приводит к накоплению нецелевого продукта Для получения однозначных и воспроизводимых результатов методом АС ПЦР необходим тщательный подбор праймеров и оптимизация условий амплификации Эффективность аллельной дискриминации зависит от ряда факторов природы неспаренного 3' концевого нуклеотида, Г/Ц состава матрицы, температур плавления праймеров, возможного формирования вторичных структур, концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), состава реакционного буфера и т. д Для одновременного анализа нескольких точечных мутаций, локализованных в разных участках генома, требуется еще более трудоемкий подбор условий ПЦР Сложность оптимизации АС ПЦР существенно ограничивает применение этого теоретически наиболее прямого и простого метода

Нами было показано, что одновременная амплификация аллель-специфичного продукта и не связанного с анализируемой последовательностью участка генома приводит к повышению аллельной дискриминации в АС ПЦР Схема метода представлена на рис 1 Как и в классической АС ПЦР, для детекции мутации проводят две ПЦР, но каждая из реакций содержит две пары праймеров аллель-специфичные и дополнительные - для амплификации выбранного участка генома (далее - «вспомогательный ампликон») Дополнительные праймеры образуют с ДНК-матрицей совершенные дуплексы, что приводит к эффективному накоплению только вспомогательного ампликона в случае, когда аллель-специфичный праймер содержит неспаренный 3' концевой нуклеотид, и накоплению вспомогательного и аллель-специфичного ампликонов в случае, когда аллель-специфичный праймер полностью комплементарен матрице Введение вспомогательного ампликона в АС ПЦР приводит к конкуренции между двумя ампликонами за основные компоненты реакции Разработанный

метод был назван аляель специфичная истощающая ПЦР (АСИ П1ДР).

исномогатедьнын ' аллель-сиеипфмчный

ампднкин . , амп.чикон

в •j=í————н—rft Í и

/

Рисунок 1 Схема метода аллель-специфичной истощающей ПЦР. А — алллель-специфичный праймер содержал пес паренный 3' концевой нукпеотид, в процессе ПЦР накапливается только вспомогательный амгсликон, В - алллс ль -специфичный прайме р комплементарен матрице, накапливаются оба ампликона. Стрелками обозначены праймеры, крестом-детектируемая мутация.

Эффективность метода оценивалась на примере анализа точечных мутации в геноме М tuberculosis В начальных экспериментах для характеристики специфичное™ и чувствительности метода АСИ ПЦР анализировали мутации в гене гроВ

На рис 2. представлены результату АСИ ПЦР и классической АС ПЦР. Все реакции проводились при одинаковых условиях. Результаты двух, реакций классической АС ПЦР практически неразличимы (Рис.2 А), в то время как в АСИ ПЦР продукт нежелательной элонгации праймера с несяаренным 3' концевым нуклеотвдом отсутствует, ч

х> i

-.....¡seno

mtp40 ■*~rpoB

I

л v »у? д.: ',¡yt я.Г яуг Рисунок 2 Влияние вспомогательного ампликона на аллельную дискриминацию.

М\"гацию в 516 кодоне гена rpoti GAC-GTC детектировали, используя геномну ю ДНК штамма H37Rv в качестве матрицы. А - результаты классической АС ПЦР (реакция содержит только аллель-специфичные праймеры). АСИ ПЦР проводили используя дополнительную пару праймеров для амплификации фрагмента \S6110 (В) или гена mtp40 (С), д.т. - аллель-специфичный праймер соответствует кодону дики:о типа GAC. мут -аллель-специфичны и праймер соответствует кодону с мутацией GTC

Выбор вспомогательного ампликона определяется несколькими параметрами. Для аффективной конкуренции за дНТФ такие фрагменты должны характеризоваться GC составом близким к таковому для аллель-специфично го продукта. Длинз вспомогательного ампликона должна превышать длину аллель-специфичного. В противном случае, эффективная амплификация вспомогательного фрагмента приводит к подавлению накопления аллель-специфичного фрагмента даже в тех случаях, когда аллель-

специфичный п рай мер полностью комплементарен матрице В качество вспомогательные ампяинонов были выбраны фрагмента гена mtp40 (622 п. о.) и мобильного элемента IS6110 (1(№5 п. о.). Праимеры были подобраны так, чтобы аллель-специфичиый и вспомогательный ПЦР-продукты были легко различимы электрофорезом в агзрозном геле

Было показано, что эффективность адлельной дискриминации в АСИ Ш U' зависит от концентрации дНТФ, При концентрации дНТФ (200 мкМ), используемой в стандартных протоколах амплификации, на поздних циклах ПЦР возможно накопление нецелевого продукта Нами было определено, что при концентрациях дНТФ 20-50 мкМ, АСИ ГИДР эффективна и специфична, а продукт нежелательной элонгации отсутствует

В классической АС ПЦР концентрация ДНК-матрицы является одним из существенных факторов, определяющих специфичность. Чем выше концентрация ДНК-матрицы. тем больше вероятность накопления продукта в результате достройки прайме ров, содержащих 3' концевой нес паренный нуклеотид. Для исследования чувствительности и специфичности метода АСИ ПЦР, амплификацию проводили, используя серию последовательных разведений геномной ДНК штамма H37K.V в качестве матрицы. ( Рис.3 ) Было показано, что АСИ ЛЦР эффективна и сохраняет специфичность в широком диапазоне концентраций ДНК (от 10 пкг до 100 нг).

-mlp40 -гроВ

д.т мут д.т мут д.т мут д.т мут мут Рисунок 3 Эффективность АСИ ПЦР в зависимости от концентрации ДНК -матрицы.

В качестве матрицы ДЛЯ АСИ ПЦР использовали 1(Юнг (1), Юнг (2), 1нг (3), 0.1нг (4), and 1 Опкг (5) геномной ДПК штамма H37Rv. Д.т - ПЦР проводили с аллель-специфичными праимерами, соответетв) ющими 516 кодону гена гроВ дикого типа GAC. мут - 516 кодону с мутацией GTC

Высокая специфичность АСИ ПЦР вне зависимости от количества исходной ДНК-матрицы является важным преимуществом метода. При низких концентрациях дНТФ потребление большей части дНТФ приводит к тому, что кривая накопления ПЦР-продуктов выходит на плато, где количество и соотношение ампликонов не меняется Таким образом результаты АСИ ПЦР могут анализироваться на стадии плато. Это свойство АСИ ПЦР является особенно важным для использования метода в клинической лаборатории, где количество ДНК для анализа может существенно отличаться в разных образцах.

АС ПЦР

АСИ ПЦР

20 25 30 35 40 ЦИКЛЫ ПЦР

20 25 30 35

циклы ПЦР

Рисунок 4 Детекция аллель-специфичного продукта методом ПЦР в реальном времени. В качестве матрицы для классической АС ПЦР и АСИ ПЦР использовали геномную ДНК М tuberculosis, содержащую аденозин в первом положении 526 кодона гена гроВ ПЦР проводили с 4 аллель-специфичными праймерами, содержащими на 3' конце гуанозин (г-А), аденозин (а-А), тимидин (т-А) и цитидин (ц-А) В качестве вспомогательного ампликона в АСИ ПЦР использовали фрагмент гена mtp40 ПЦР-продукт детектировали с помощью зонда Taqman, комплементарного фрагменту гена гроВ Фл сигнал* - нормализованный флуоресцентный сигнал, у е

Эффективность достройки праймеров Taq-полимеразой различна для разных типов мисматчей праймер-матрица В зависимости от природы 3'концевого неспаренного нуклеотида, эффективность элонгации составляет от 1% до 0 0001% от эффективности элонгации совершенного дуплекса. Для изучения влияния этого фактора был использован набор из четырех праймеров, отличающихся 3 'концевым нуклеотидом В качестве матрицы для ПЦР использовались 4 геномных ДНК М tuberculosis, содержащие все четыре нуклеотида в 1 положении 526 кодона гена гроВ (САС, ААС, TAC, GAC) За скоростью накопления продукта следили с помощью ПЦР в реальном времени, для детекции аллель-специфичного ампликона использовали флуоресцентный зонд Taqman (Рис 4) Высокая дискриминирующая способность АСИ ПЦР была показана для всех вариантов, за исключением двух пар праймер-матрица, содержащих на 3' конце дуплекса С-А и T-G

Как видно из рис. 4 для матрицы, содержащей аденозин в анализируемой позиции, в классической АС ПЦР накопление нецелевых продуктов на поздних циклах ПЦР происходит для всех пар праймер-матрица (С-А, G-A, А-А) При использовании метода АСИ ПЦР, только праймер, содержащий неспаренный цитидин на 3' конце (пара С-А), эффективно достраивается полимеразой, в то время как продукты элонгации дуплексов, содержащих G-A и А-А на 3' конце отсутствуют даже на поздних циклах ПЦР.

В целом, амплификация дополнительного продукта в ЛСИ 1IIГР приводит к подавлению нежелательной элонгации для 10 из 12 возможных не комплементарных сочетаний нуклеотидов на з "конце дуплекса прайм ер-матрица.

L> (i щО t-G y-Cl a-ti l-G e (j

Рисунок 5 Эффективность аллелъвой дискриминации классической АС ПЦР н АСИ ПЦР при использовании праимеров, содержащих дополнительный не спаренный нуклеотид в положении -2. В качестве матрицы для классической АС ПЦР и АСИ ПЦР использовали геномную ДНК М tuberculosis, содержащую гуанозин в анализируемом положении 526 кодона гена гроВ ПЦР проводили с 4 аллель-специфичными прайм срам и. содержащими на 3' конце гуанозин (e-G), аденозин (a-G). тимидин (t-G) и цитидин (c-G).

Для детекции трудноразличимых методом АС ПЦР замен могут оыть использованы праймеры, содержащие кроме 3' концевого неспаренного нуклеотида дополнительные мисматчи. Для изучения влияния дополнительных мисматчей на эффективность АСИ ПЦР нами были выбраны два набора праймеров, содержащих дополнительный мисматч в положении -1 и -2. В качестве ДНК-матрицы использовали четыре геномных ДНК, содержащих гуанозин, адсноз«н: тимидин и цитидин в анализируемом положении. Было показано, что введение мисматча в положении -1 приводит к существенному снижению выхода аллель-специфичного продукта, количество которого практически не детектируется при Йкрашивании бромистым этидием на агарозном гель-электрофорезе. Оптимальный баланс между выходом ПЦР-продукга и аллельиой дискриминацией в АСИ ПНР достигался при использовании праимеров. содержащих дополнительный мисматч в положении -2. (Рис.5) В классической АС ПЦР при использовании праймеров, содержащих неспаренный нуклеотид в положении -2, происходит накопление нецелевых продуктов для некоторых комбинаций 3' концевых пар нуклеотидон дуплекса прайме ра-матрнца (Рис,5) АСИ ПЦР в тех же условиях является высокоспецифичной для любых пар праймер-матрица и продукты нежелательной элонгации отсутствуют даже на поздних циклах ПЦР.

В некоторых исследованиях возникает необходимость анализа смешаных образцов, в которых представлены два или более аллель пых варианта. Большинство современных гйиетичееккх методов детекции точечных мутаций основаны на пост-ПЦР анализе образца. При таком подходе после амплификации с «внешних» праймеров проводится детекция алдельного варианта различными методами (гибридизация, ПД РФ-анализ, прямое определение нуклеотидной последовательности и т.д.) Поскольку в результате ПЦР с

«внешних» праймеров соотношение аллелей в смеси не изменяется, возможность детекции низких количеств одного из аллелей определяется чувствительностью метода, выбранного для определенна мутации. Например, гибридизационный анализ с.мссей ДНК. отличающихся однонуклеоггидной заменой, не гюадолхст достоверно детектировать оба аллеля в тех случаях, когда их количества отличаются более чем в 10 раз. В аллель-специфичной ГПДР количество ПЦР-Продукта« соответствующего детектируемому ■ аллель ному варианту, увеличивается в геометрической прогрессии, что существенно расширяет динамический диапазон метода Таким образом, именно метод А СИ ПЦР является наиболее подходящим

для анализа смешанных образцов ДИК.

■■■ Ц1 К nvuc.rn т.т.ч

М 100 $S 30 10 ь о

-*IVtp40 ■лГроВ

В

*mtp40

ПрЛк'МОр1

i-'.sim *гроВ

Рисунок 6 Чувствительность метода АСИ ПЦР для анализа образцов ДНК, содержащих несколько аллелей. ДНК штамма H37Rv и ДНК. содержащая мутацию в 516 кодонс гроВ (GAC-GTC), были смешаны в различных соотношениях (0-100%) и использованы в качестве матрицы для АСИ ПЦР. А - 1ПДР проводили с набором праймеров, соответствующих 516 кодону гена гроВ дикого типа GAC (wt516a), В - кодону с мутацией GTC (mt51ft).

Была определена чувствительность разработанного метода АСИ ПЦР для детекции образцов ДИК. содержащих несколько аллелей. Как видно из рис.6 разработанный метод позволяет детектировать присутствие до 5% ДНК, содержащей нутацию, в образце, что доказывает его перспективность для анализа смешанных бактериальных культур.

АСИ ПЦР для определения устойчивости к антибиотикам.

Дня выбора правильного режима лечения туберкулеза основное внимание должно уделяться определению устойчивости возбудителя к антибиотикам. К настоящему времени стандартными являются микробиологические методы, однако продолжительность такого определения устойчивости составляет несколько недель. Применение молекулярных методов уменьшает время, необходимое для определения резистентности, до одного дня. Таким образом, разработка быстрых и эффективных молекулярных методов детекции устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам является одним из важнейших направлений современной молекулярной диагностики.

% 1дНКо

М к ь ю ед ss roo

Рисунок 1 Пример результатов определения мутаикй, приводящих к устойчивости к иэонназиду н рифампинниу методом АСИ ПЦР, 1 - в качестве матрицы использовали ДНК штамма НЗ?Р!л' (дикого типа). 2 - ДНК клинического изояята М шЬегси1о$15. содержащего мутации Сер531Лей в гроИ и Сер315Тре в каЮ. А5 - аллель-специфичный продукт Детектируемые н каждой реакции замены обозначены над соответствующими дорожками, анализируемые мутации отмечены заглавными буквами.

Разработанный метод АСИ ПЦР был адаптирован для детекции мутаций, приводящих к устойчивости к антибиотикам - рифампицину, изониазиду, этамбутолу и фторхинолонам. Устойчивостъ к этим препаратам в основном определяется точечными мутациями в генах' гроВ, ка!й, етЬН и &угА. соответственно. Для детекции устойчивости к рифампицину и изониазиду были выбраны мутации, наиболее распространенные среди российских изолятов М (а 516, 526, 531 кодонах гроИ и 315 кодоне ка!С). Согласно литературным

данным устойчивость к этамбутолу определяется мутациями в 306 и 406 кодоне гена етЬВ, резистентность к фторишолонам - в 90, 91, 94 кодоне гена нугА. В качестве вспомогательных ампликонов были выбраны участки гена гп1р40 или \S6JJO. Ген пир40 был описан как виде специфичный генетический маркер М. (иЬегси1с>$1я 156/ Ю - бактериальный мобильный элемент, характерный для микобактерий, входящих в состав туберкулезного комплекса. Таким образом, используемый набор праймеров позволяет одновременно детектировать мутации, приводящие к устойчивости, и определять принадлежность образца к виду М. ыЬегси1о§18 или группе ^туберкулезного комплекса Пример результатов определения мутаций, приводящих к устойчивости, представлены на Рис."? и Рис.&

cmhö :«>(> ... cmhB lOfi

■Ve C.iB (JÍ J|(. Я1.Ч ij:¡ ¡Iii ik № .: » .W lec ifc' M

. í üL- < t n, ' 'Щ Kj1 '' 'i' >

gif.AW gyrA9J yyiAVf) p 1ЛЧ4 Рисунок 8 Пример результатов определения мутаций, приводящих к устойчивости к этамбутолу и фтархинолонам методом ACH ПЦР. А - к качестве матрицы использовали ДНК штамма H37Rv (дикого типа), 2 — ДНК клинического изолята Л Y tuberculosis, содержащего мутации МетЗОбИле в етЬВ. Реакции проводит с 3 парами праймеров для аллель-специфичной детекции мутаций в етЬВ и gyrA, и для вспомогательного ампликона (фрагмента IS6/.ÍÍ?) Детектируемые в каждой реакции замены обозначены над соответствующими дорожками.

Для проверки эффективности и специфичности методов в качестве матрицы для АСИ ПЦР использовали ДНК клинических изолятов М tuberculosis. Идентифицированные мутации представлены в Табл.1. Данные АСИ ПЦР были подтверждены определением первичной структуры фрагментов генов rpoB, ka 1С, етЬВ и gyrA.

AC H ПЦР для филогенетические исследований цднцнуклеотидного полиморфизма.

Детекция одноиуклеотидныч замен в геноме М. tuberculosis является наиболее подходящим методом для филогенетических исследований Основываясь на полиморфизме в в 463 кодоне гена katG и 95 кодоне гена gyrA, S. S re valsan с соавторами, были выделены 3 "основные генетические группы" (ОГГ) Метод АСИ ПЦР был адаптирован для определения таких замен. ОГГ I характеризуется комбинацией аллелей katG 4йЗЛей и gvr,495Tpe, ОГГ II -katG 463Арг и щгА 9JTpc, ОГГ' HI - katG 463Арг и gyrA 95Сер Схема метода и пример результатов АСИ ПЦР представлены на рис 9.

Таблица 1 Мутации в генах гроВ, katG, етЪВ и gyrA, детектируемые методом АСИ ПЦР.

Ген кодон Мутация Замена Количество изолятов с мутацией Общее число анализированных изолятов

гроВ 516 GAC-GTC Асп-Вал 35 126

гроВ 526 CAC-GAC Гис-Асп 6 126

гроВ 526 CAC-TAC Гис-Тяр 2 126

гроВ 526 CAC-CGC Гис-Арг 1 126

фоВ 526 CAC-CTC Гис-Лей 1 126

гроВ 531 TCG-TTG Сер-Лей 38 126

katG 315 AGC-ACC Сер-Тре 82 126

embB 306 ATG-GTG Мет-Вал 12 107

embB 306 ATG-CTG Мет-Лей 0 107

embB 306 ATG-ATA Мет-Иле 34 107

embB 306 ATG-ATT Мет-Иле 4 107

embB 306 ATG-ATC Мет-Иле 0 107

embB 406 GGC-AGC Гли-Сер 0 107

embB 406 GGC-TGC Гли-Цис 0 107

embB 406 GGC-GAC Гли-Асп 4 107

embB 406 GGC-GCC Гли-Ала 0 107

gyrA 90 GCG-GTG Ала-Вал 0 107

gyrA 91 TCG-CCG Сер-Про 0 107

gyrA 94 GAC-TAC Асп-Тир 0 107

gyrA 94 GAC-CAC Асп-Гис 0 107

' gyrA 94 GAC-GGC Асп-Гли 0 107

gyrA 94 GAC-GCC Асп-Ала 0 107

Анализ полной нуклеотидной последовательности геномов нескольких штаммов М tuberculosis позволил Filhol с соавторами выделить 6 филогенетически важных однонуклеотидных замен, согласно которым изоляты делятся на 7 филогенетических групп (ФГ) Нами был предложен метод определения ФГ с помощью двух ПЦР, в каждой из которых содержится 6 пар праймеров Анализируемые однонуклеотидные полиморфные замены, и результаты определения принадлежности изолятов к одной из 7 филогенетических групп представлены на рис 10

Смесь Смесь

прайме]ч)В ¡i iipaiiviepoii b

ÍS6110 /sei i о

дугА 95Сер дугА 95Tps

faiíG-'ЕЗЗАрг katG 463Лей

a 11 а о а Ь

ÍS611Q-*

gyrA ^ katG '

А а С M

Рисунок 9 Детекция мутаций, определяющих принадлежность к основным генетическим группам. Дли определения ОГГ проводят 2 ГПДР {а и Li) Каждая реакция содержит 3 пары прайм еров, для аллель-специфичной амплификации фрагментов katG и gyrA и вспомогательного ампликона (фрагмента JS6/10). I - праймеры, используемые в реакциях а и Ь. и детектируемые комбинации аллелей. II- результаты ГПДР, А - в качестве матрицы для ПИР использовали геномную ДНК штамма H37Rv (OIT III), В и С - паттерны, характерные для ОГГ I] и ОГГ I, соответственно.

I

I

Рисунок 10 Детекция мутаций, определяющие принадлежность к филогенетическим группам. Для определения ФГ проводят 2 ГПДР (а и Ь), в каждой из которых содержится 6 пар праймеров. I комбинации аллелей для определения принадлежности к одной из 7 филогенетических групп, цифрами указаны положение полиморфных замен в геноме штамма H37Rv II - детектируемые в реакциях а и b замены и результаты ПЦР. В качестве матрицы использовали ДНК клинических изолятов М. tuberculosis. А, В, и С - паттерны, характерные для ФГЗ. ФГ5 и ФГ6, соответственно.

Применение метода АСИ ПНР для геиотиштования клинические Щолятов М. tuberculosis.

Разработанные методы были применены для исследования клинических шо.иггов, выделенных ог больных туберкулезом, пребывающих в тюремном госпитале поселка Озерки Тульской области (2000-2001 гг.) Были получены гснотшшческие характеристики 91 иаолята методом ISrt//Ü 11ДРФ -типирования, определена принадлежность к ОГГ и

вдргз snsr

24 G0625 ..

311U73 ,Т Ti-

11 li

3j5232Э С i '-./--': G

;ЙЗ;р7 G S2is?т

А mm, G

taeíiG iaKîisT

шльж с Д

3-: i tm т тчте с

ФГ, идентифицированы мутации, приводящие к устойчивости к антибиотикам Согласно данным АСИ ПЦР, 4 изолята представляли собой смеси двух штаммов и были исключены ш кластерного анализа

Определение мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости в клинических изолятах М. tuberculosis.

Результаты АСИ ПЦР для определения мутаций, приводящих к устойчивости к изониазиду и рифампицину, сравнивались,с данными, полученными методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена, рекомендованного в РФ Кроме того, было проведено определение первичной структуры соответствующих участков генов гроВ и katG Согласно данным АСИ ПЦР и секвенирования, все 67 изониазид-устойчивых изолята содержали мутацию СерЗ 15Тре в katG. Ни в одном из чувствительных к изониазиду изолятов мутации Сер315Тре в katG обнаружено не было Среди 66 рифампицин-устойчивых изолятов методом АСИ ПЦР были обнаружены мутации Асп 516 Вал - в 27 (41%) изолятах, Сер 531 Лей - 28 (42%), Гис 526 Асп и Гис 526 Тир - в 4 (6%) и 1 (1 5%) изолятах В рифампицин-чувствительных изолятах мутаций обнаружено не было Один изолят был определен как чувствительный методом АСИ ПЦР, однако являлся устойчивым согласно данными определения первичной структуры участка гена гроВ Этот изолят содержал замену Лей 511 Про, которая не входила в список анализируемых АСИ ПЦР мутаций Таким образом, совпадение данных метода АСИ ПЦР с результатами определения первичной структуры составило 99% и 100% для рифампицина и изониазида соответственно Метод АСИ ПЦР позволил корректно определить устойчивость к изониазиду в 100% случаев и к рифампицину - в 93% случаев Совпадение результатов АСИ ПЦР с данными определения первичной структуры свидетельствует о том, что из 100% случаев, которые принципиально могут быть определены молекулярными методами, в 99% были детектированы мутации методом АСИ ПЦР с использованным набором праймеров

В гене етЬВ методом АСИ ПЦР были детектированы мутации Мет 306 Иле - в 31 изоляте (35.6%), Мет 306 Вал - в 8 (9 2%) и Гли 406 Асп в 2 изолятах (2 3 %) В гене gyrA ни в одном из 87 изолятов мутаций обнаружено не было

Молекулярная эпидемиология.

Изоляты были разделены на основные генетические и филогенетические группы (ОГГ и ФГ) Среди 87 изолятов встречались все три известные комбинации аллелей katG463 и gyrA95, однако из 7 комбинаций, определяющих ФГ, были обнаружены только характерные для ФГ2, ФГЗ, ФГ5 и ФГ6 Разделение изолятов на основные генетические группы

соответствовало филогенетическим группам все изоляты, относящиеся к ОГГ I и ОГГ III совпадали с ФГ2 и ФГ6, соответственно, a OIT II представлена изолятами, относящимися к ФГЗ и ФГ5

Таблица 2 Разделение клинических молят ов на основные генетические и филогенетические группы.

Основная

Филогенетическая Количество

генетическая

группа (ФГ) изолятов (N=87)

группа (ОГГ)

Ï 2 38 (43 6%)

3 5 (5 7%)

II

5 39 (44 8%)

III 6 5 (5 7%)

Методом IS6110 ПДРФ-типирования было выявлено 45 различных IS6110 ПДРФ-патгернов Данные IS6110 ПДРФ-типирования в целом согласовывались с данными определения ОГ и ФГ Все изоляты, обладающие идентичным IS6110 ПДРФ-патгерном входили в состав одной и той же ФГ и ОГГ.

Уровень лекарственной устойчивости отличался в разных группах изолятов Как видно из рис 11, все случаи туберкулеза с МЛУ были вызваны изолятами, принадлежащими к ОГГ I и II (ФГ2 и 5)

Сравнение данных определения ОГГ и ФГ с результатами IS6110 ПДРФ-типирования позволило определить, что все изоляты, составлявшие ОГГ I (ФГ2) обладали IS6110 -паттерном, характерным для семейства BeijingAV Штаммы этого семейства часто вызывают туберкулез с МЛУ и широко распространены в России и по всему миру 43 7% (38 из 87) исследованных изолятов принадлежали к Beijing/W семейству, 76 3% (29 из 38) из них вызывали туберкулез с МЛУ Согласно кластерному анализу по IS6110 ПДРФ паттерну, сходство изолятов внутри этой группы составляло 60% Большинство рифампицин-устойчивых изолятов этой группы (24/31, 77 4%) содержали мутацию 531 (Сер-Лей)

35

зо

25

g 20 ■ g

R

g 15

и

s

0 10 §

1 5 0

h=

—iff

Jfai

В lrV

■ Rif EJStr O Kan

■ МЛУ Ei чувств

ФГ2

ФГЗ

ФГ5

ФГ6

Рисунок 1 i Устойчивость к антибиотикам среди кслцннчеек'и\ иН'.пяI¡ж. относящихся к разным филогенетическим группам М. tuberculosis. Столбцами обозначены число клинических изолнтов, устойчивых к стрептомицину (Str), канамицнну (Кап), изониазиду (Inz). рифампицину (Rif). гаоляты с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и чувствительные ко всем вышеперечисленным антибиотикам (чувств). ФГ2, ФГЗ, ФГ5. ФГ6 -филогенетические группы.

Таблица 3 Мутации я гроВ, katG, гене стЬН и gyrA среди клинических изодятов, относящихся к разным филогенетическим группам М. tuberculosis

Иде (инфицированные мутации

Число изолятов, относящихся к основной генетической (ОГГ) и филогенетической группе (ФГ) ОГП ОГГ И ОГГ Ш

ФГ 2 ФГ 3 ФГ 5 ФГ 6

гроВ L5 1 1Р 1 0 0 0

гроВ DS16V 0 0 27 0

гроВ Н526У 1 0 0 0

гроВ H526D 2 0 2 0

rpnfí S531L 24 0 4 0

kaiG S315Т 32 0 35 0

embB М3061 atg-ata 2 0 27 0

e/nbB М3061 atg-att 3 0 0 0

етЬВ M3U6V й 0 2 0

emhfí (}4Ш) j D 1 0

Общее число изолятов 38 5 39 5

Доминирование изолятов семейства Beijing/W в России и во всей мире отмечено многими исследователями, однако роль других семейств штаммов М. tuberculosis в

эпидемиологии туберкулеза изучена недостаточно Нами было показано, что 44 8% (39/87) изолятов, полученных от больных туберкулезом тюремного госпиталя поселка Озерки, обладали характеристиками ФГ5 Степень сходства IS6110 ПДРФ паттернов внутри этой группы составила 50%, причем 66 7% (26/39) изолятов входили в состав одного из кластеров (т е обладали идентичным паттерном ПДРФ) Процент случаев туберкулеза с МЛУ в этой группе был весьма высоким (33/39), 84 6% Анализ мутаций в гене гроВ позволил определить, что большинство рифампицин-устойчивых изолятов этой группы содержали замену в 516 кодоне (Асп-Вал) (Табл 3)

Из 39 изолятов, относящихся к ФГ5, можно выделить группу из 27 образцов, степень сходства IS6110 ПДРФ паттернов в которой превышает 85% IS6110 ПДРФ паттерн изолятов этой группы характерен для LAM-семейства В выделяемой нами группе число несоответствий между полосами в разных IS6110 паттернах не превышало 3, что позволило объединить изоляты этой группы в один суперкластер Правомерность такого объединения подтверждается другими характеристиками все изоляты этого суперкластера имеют одинаковый профиль устойчивости к стрептомицину, изониазиду, рифампицину и канамицину, характеризуются идентичными комбинациями точечных мутаций, определяющих принадлежность к ФГ5 и ОГП1, все содержат одинаковые мутации в 315 кодоне katG (Сер-Тре), в 516 кодоне гроВ (Асп-Вал) и в 306 кодоне етЬВ (АТГ-АТА (МетИле)) Перечисленные генетические характеристики позволяют сделать вывод, что изоляты этой группы представляют собой клональные варианты одного штамма

Таким образом, в тюремном госпитале пос. Озерки преобладали изоляты семейств Beying/W и LAM. Большое количество кластеризованных изолятов позволяет предположить активную трансмиссию штаммов этих семейств в тюрьме

Использование метода АСИПЦР для идентификации клинических изолятов, содержащих несколько штаммов М. tuberculosis.

Одним из очевидных объяснений возникновения смешанных образцов является лабораторная контаминация на одной из стадий получения первичной культуры Однако в последнее время появляются все новые работы, в которых показана возможность заражения пациентов несколькими штаммами М tuberculosis Вопрос о том, в какой степени распространена инфекция несколькими штаммами, по-прежнему остается открытым Сложность анализа смешанных культур объясняется отсутствием адекватных методов исследования Стандартные методы генотипирования М tuberculosis (сполиготипирование и IS6110 ПДРФ-типирование) основаны на гибридизации, следовательно идентификация образца как смешанного возможна лишь в случае, когда количество двух штаммов в смеси

сравнимо. Однако даже в этом Случае, получаемый IS 6110- или споли го паттерн может ошибочно расцениваться как уникальный, а не как смесь двух паттернов. При использовании метода АСИ ПЦР для определения ФГ или ОГГ присутствие двух аллельныч вариантов для одного полиморфного нуклеотида позволяет однозначно определить образец как смешанный. Кроме того, как обсуждалось выше, аллель-специфичная ПЦР обладает большим динамическим диапазоном, чем гибридизационные методы. Таким образом, предложенный нами метод для определения ФГ и ОГГ предоставляет уникальную возможность исследования образцов, представляющих собой смеси штаммов M tuberculosis Согласно данным АСИ ПЦР 4 из 91 исследованных образцов, выделенных в тюремном госпитале пое. Озерки, представляли собой смешанные культуры изолятов, относящихся к ОГГ i и ОГГ H (ФГ2 и ФГ5) (Рнс. 12).

ШЙО -

WA . шо

Рисунок 12 Детекция смеси то л и то в методом АСИ ПЦР. ПЦР проводили используя набор праймеров для определения принадлежности к ОГГ и геномную ДНК трех клинических изолятов в качестве матрицы (А, В н С), а - ПЦР содержит праймеры, соответствующие комбинации аллелей gyrA 95Сер и karG 463Ар г, b - ПЦР содержит праймеры, соответствующие комбинации аллелей g)>rs)95Трс и kaiG 463Лей. А и В - паттерн, характерный для ОГГ 1 и ОГГ II. С - наличие фрагментов, соответствующих обоим аллельным вариантам kotG 463 свидетельствует о том, что образец является смесью изолятов ОГГ I и ОГГ II.

Анализ гетер ope зиетентных культур микобактернй необходим также для детекции устойчивости Согласно последним исследованиям, в легком больного туберкулезом могут существовать несколько разных популяций микобактернй одного штамма, которые разделены физически и эволюционируют параллельно. При лечении в каждой из таких популяций устойчивость развивается автономно, и образец мокроты такого больного может содержать смесь чувствительных и резистентных бактерий, с разными мутациями, вызывающими устойчивость Изучений г етер ope зистснтных образцов, как и анализ смесей нескольких штаммов М. tuberculosis, ограничено отсутствием подходящих методов.

Нами было показано, что для разных мутаций в rpofí и kaiG разработанный метод АСИ ПЦР позволяет детектировать от 2 до 5% мутантной ДИК в образце. {Рис.6) При анализе мутаций, приводящих к устойчивости, среди 91 клинического изолята два были определены как гетерорезистентные.

А В С

- ¡56110 гров

Л.| MJ t JI. I му I Д, I М> )

Рисунок 13 Детекция гетерорезистенткого образца методом АСИ ПЦР, Анализировали мутации, приводящие к устойчивости к рифам пицину. Е качестве матрицы использовали ДНК клинических и золотой М. tuberculosis. А - изолят не содержит мутации (дикого типа), В - изолят содержит мутацию GAC-GTC, С - гетерорезистентный образец. Д.т. - ПЦР проводили с аллель-специфичными праймерами. соответствующими 516 кодону гена гроВ дикого типа GAC. мут - 536 кодону с мутацией GTC.

Таким образом, метод АСИ ПЦР может быть применен для детекции смесей штаммов М. tuberculosis. Чувствительность метода позволяет использовать его как для изучения возникновения устойчивости, так и для исследования гетерорезистентных культур.

ВЫВОДЫ

1. Разработай метод аллель-специфичной истощающей ПЦР, позволяющий повысить ал л ель ну ю дискриминацию за счет дополнительной амплификации консервативного участка генома.

2. На основе метода разработаны тест-системы для определения точечных мутаций в генах гроВ, katG, embB и gyrA, приводящих к устойчивости Ai tuberculosis к антибиотикам.

3. Показана возможность применения аллель-специфичной истощающей ПЦР для анализа гетерорезистентных культур М. tuberculosis. Метод позволяет детектировать 5 и менее % примеси устойчивых к рифампицину и и зон и аз иду бактерий.

4. При исследовании 116 клинических изолятов М. tuberculosis с помощью разработанных тест-систем для идентификации мутаций в генах гроВ и katG, устойчивость к рифампицину и изониазиду была корректно определена в 95% и 100% случаев, соответственно.

5. Разработан экс пресс-метод идентификации основных филогенетических групп бактерий туберкулезного комплекса. Была показана возможность выявления смешанных культур, состоящих из нескольких изолятов М. tuberculosis.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах: Статьи

Дубилей С А, Игнатова А Н, Шемякин И Г (2005) Молекулярно-генетические методы идентификации лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis Молекулярная генетика, микробиология и вирусочогия, 1, 3-7.

Dubiley S, Mayorova A, Ignatova A, Kinllov Е, Stepanshina V, Kolesnikov A, Shemyakin I. (2005) New PCR-based assay for detection of common mutations associated with rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis Clin Chem, 51(2), 447-50.

Ignatova A., Dubiley S, Stepanshina V, Shemyakin I (2006) Predominance of multi-drug-resistant LAM and Beijing family strains among Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from prison inmates in Tula Region, Russia J Med Microbiol 55, 1413-1418 Опубликованные тезисы конференций'

Dubiley S., Mayorova A, Ignatova A, Kinllov E, Stepanshina V, Kolesnikov A, Shemyakin I. New PCR-based assay for detection of common mutations associated with nfampicin-and isomazid-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis integrating host and pathogen biology, Keystone Symposia, Whistler, Canada, 2-7 April, 2005. Abstracts book, p 88

Игнатова A. H «Метод истощающей аллель-специфичной ПЦР для детекции устойчивости Mycobacterium tuberculosis к антибиотикам» XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2006

Dubiley S , Ignatova А, Stepanshina V., Shemyakin I. "Characteristics of M tuberculosis isolates recovered in Central Russia". 2006 NLAD research conference, Croatia, 2006

Shemyakin I., Ignatova A, Dubiley S, Stepanshina V.N "Predominance of multidrug-resistant LAM and Beijing family strains among Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from pnson inmates in Tula Region, Russia" 12th ICID Abstracts, Lisbon, Portugal, 15-18 June, 2006, S35-36

Подписано в печать 15 декабря 2006

Формат 60x90/16

Объём 1,25 п.л.

Тираж 70 экз.

Заказ № 11010736

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес: 117292, г. Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 8, кор. 2.

Тел. 740-76-47,125-22-73.

http://www.univerprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Игнатова, Анна Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К АНТИБИОТИКАМ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 История распространения туберкулеза.

1.2 Подходы к лечению туберкулеза.

1.3 Противотуберкулезные антибиотики.

1.4 Развитие устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам.

1.5 Механизмы устойчивости к отдельным противотуберкулезным препаратам.

Рифампицин.

Изониазид.

Стрептомицин.

Пиразинамид.

Этамбутол.

Фторхинолоны.

Канамицин, амикацин, виомицин, капреомицин.

1.6 Методы диагностики лекарственной устойчивости.

Микробиологические методы.

Молекулярно-биологические методы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР для определения однонуклеотидных замен в геноме Mycobacterium tuberculosis"

Туберкулез - одно их наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека. Эта болезнь является одним из старейших врагов человечества. Примерно треть населения Земли инфицирована туберкулезом, и каждый год эта болезнь уносит 2 миллиона жизней. Несмотря на существование эффективной терапии, заболеваемость туберкулезом во всем мире продолжает расти, причем особенностью современной эпидемии является распространение лекарственно-устойчивых форм болезни.

Для проведения успешного лечения особое внимание должно уделяться определению спектра и уровней чувствительности микобактериальных культур. Поскольку М. tuberculosis медленно растущая бактерия, стандартные микробиологические тесты для определения устойчивости могут занимать от нескольких недель до двух месяцев. В этой связи особое значение приобретает разработка быстрых и высокоэффективных методов определения лекарственной чувствительности клинических изолятов М. tuberculosis. Молекулярно-генетические методы определения устойчивости обладают важным преимуществом, так как позволяют сократить время необходимое для получения результатов до нескольких дней или даже часов.

Таким образом, разработка эффективного метода детекции однонуклеотидных замен в геноме М. tuberculosis является одной из актуальных проблем современной молекулярной диагностики, филогенетики и эпидемиологии.

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К АНТИБИОТИКАМ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Игнатова, Анна Николаевна

выводы

1. Разработан метод аллель-специфичной истощающей ПЦР, позволяющий повысить аллельную дискриминацию за счет дополнительной амплификации консервативного участка генома.

2. На основе метода разработаны тест-системы для определения точечных мутаций в генах rpoB, katG, embB и gyrA, приводящих к устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам.

3. Показана возможность применения аллель-специфичной истощающей ПЦР для анализа гетерорезистентных культур М. tuberculosis. Метод позволяет детектировать 5 и менее % примеси устойчивых к рифампицину и изониазиду бактерий.

4. При исследовании 116 клинических изолятов М. tuberculosis с помощью разработанных тест-систем для идентификации мутаций в генах гроВ и katG, устойчивость к рифампицину и изониазиду была корректно определена в 95% и 100% случаев, соответственно.

5. Разработан экспресс-метод идентификации основных филогенетических групп бактерий туберкулезного комплекса. Была показана возможность выявления смешаных культур, состоящих из нескольких изолятов М. tuberculosis.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор глубоко признателен своим научным руководителям, Светлане Алексеевне Дубилей и Игорю Георгиевичу Шемякину, под чьим непосредственным руководством выполнялась настоящая работа, а также заведующему лабораторией член-корреспонденту РАН Александру Габибовичу Габибову. Автор также благодарен всем сотрудникам Лаборатории биокатализа, принимавшим живейшее участие в судьбе данной работы. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова за полученные знания, а также за высокую требовательность и постоянное внимание.

Заключение

Таким образом, нами был разработан метод аллель-специфичной истощающей ПЦР, позволяющий повысить аллельную дискриминацию за счет одновременной амплификации аллель-специфичного продукта и не связанного с анализируемой последовательностью участка генома. Разработанный метод был применен для детекции мутаций, приводящих к устойчивости М. tuberculosis к рифампицину, изониазиду, этамбутолу и фторхинолонам. Амплификация вспомогательного продукта (фрагмента гена mtp40 или мобильного элемента IS6110) в АСИ ПЦР позволяет одновременно определять видовую принадлежность исследуемого образца, а также является контролем качества ДНК-матрицы, используемой для ПЦР. Кроме быстрой детекции устойчивости к антибиотикам, описанные методы предоставляют эпидемиологически важную информацию о том, какие именно мутации приводят к резистентности, и могут быть применены как важное дополнение к стандартным микробиологическим тестам. Динамический диапазон метода АСИ ПЦР позволяет идентифицировать смешанные образцы, в которых представлены два или более аллельных варианта. Таким образом, метод АСИ ПЦР может иметь важное практическое применение для выявления лабораторных контаминаций, изучения случаев множественной инфекции и анализа гетерорезистентных культур М. tuberculosis.

ГЛАВА III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Материалы.

В работе было использовано следующее оборудование: центрифуги Eppendorf 5415D (Eppendorf, Германия), Sigma 301К и Sigma 2К15 (Sigma, Германия); УФ-трансиллюминатор 2011 Macrovue (LKB, Швеция); система для документирования и анализа результатов электрофореза (UVP, США); спектрофотометр DU-70 (Beckman, США); рН-метр CyberScan 1100 (Eutech Instruments/Oakton Instruments); термостат суховоздушный ТС 1/20 СПУ (Россия); термостат Thermolyne 17600 (Barnstead, США); приборы для горизонтального электрофореза Wide Mini-Sub Cell GT, Sub Cell 192 (BioRad, США); прибор для вертикального электрофореза BioRad Sequi-Gen Sequencing Cell (BioRad, США); прибор для переноса Vacuum Blotter model 785 (BioRad, США); прибор для фиксации ДНК на нитроцеллюлозном фильтре с помощью ультрафиолетового света UVC 500 UV Crosslinker, Hoefer; источник питания 2197 Power supply (LKB, США); ПЦР-амплификатор РТС-200 Peltier Thermal Cycler, (MJ Research, США), гибридизационный инкубатор Hybridization oven/shaker (Amersham Pharmacia, Великобритания); автоматические пипетки (Gilson, Франция); весы Sartorius laboratory (Sartorius, Германия); настольный инкубаторный шейкер Innova 4000 (New Brunswick Scientific, США); прибор для перемешивания растворов с подогревом MR 3001 (Heidolph, Германия); ламинарный шкаф Flow laboratories BSB 4А (Gelaire, Italy), система для ПЦР в реальном времени ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США).

В работе использовали следующие расходные материалы; пластиковые наконечники и пластиковые пробирки для ПЦР на 0.2 и 0.5 мл (Treff Lab, Швейцария); пластиковые микроцентрифужные пробирки на 1.5 и 2.0 мл - эппендорфы (Eppendorf, Германия); одноразовые центрифужные пробирки на 15 мл и 50 мл Corning (США); одноразовые чашки Петри Завода Медицинских Полимеров (Россия); рентгеновская пленка AGFA (Бельгия), пленка для детекции хемилюминесценции Hyperfilm (Amersham Biosciences, Великобритания); нейлоновая мембрана Hybond N+ (Amersham, США); нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм и 0.45 мкм (Millipore, США); набор реактивов для определения последовательности ДНК CycleReader (Fermentas, Литва); набор реактивов для мечения и детекции нуклеиновых кислот ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System (Amersham Biosciences, Великобритания); ДНК-маркеры длин 1 т.п.о. (1 kb DNA Ladder) и 100+1500 п.о. (100 bp DNA Ladder) (SibEnzyme, Россия).

В работе использовали следующие реактивы: трис-гидроксиметиламинометан (трис), тетраборат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), этиловый спирт, изопропиловый спирт, уксусная кислота, однократно перегнанный фенол, хлороформ, бромистый этидий, акриламид, №,№-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевину (sequence grade); агар, триптон, дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания); Repel-silane, Bind-silane (LKB, Швеция); агароза LE Molecular Biology Grade (Promega, США); бромфеноловый синий (Bio-Rad, США); ксиленцианол (Bio-Rad, США); дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Roche Diagnostics, Германия); остальные реактивы отечественного производства марки "осч" (особо чистые); плазмиды: pGEM5Z; штаммы Е. coli: DH5a - supE44, delta lacU169 (phi 80 lacZ delta M15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl (Gibco, Великобритания), эндонуклеаза рестрикции PvuII и буфер G для рестрикции (Fermentas, Литва). Растворы.

TBE IPX: 0.89 M трис, 0.89 M борная кислота, 20 мМ ЭДТА, pH 8.0 ТАЕ 50Х: 2 M трис, 0.05 M ЭДТА

Буфер для нанесения образцов ДНК на агарозный гель - 0.1 % бромфеноловый синий, 0.1 % ксиленцианол, 30 % глицерин.

Буфер для Тад-полимеразы - 2 мМ MgS04,25 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.85.

Буфер SSC (20х) - 3 M NaCl, 0.3 M цитрат натрия

Депуринизирующий раствор - 0.25 M HCl

Денатурирующий раствор - 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH

Нейтрализующий раствор - 0.5 M Трис-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.1

Отмывочные растворы для гибридизации: 1) - 0.5х SSC, 0.4 % SDS; 2) -2х SSC

Микробиологические среды. LB: 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl LB-агар: LB, 18 г/л агара

2xYT: 16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl

SOB: 20 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0.5 г/л NaCl, 250 мМ KCl,

10 мМ MgCl2

SOC: SOB, 50 мМ глюкоза

Препараты, меченные радиоактивными изотопами; [а-33Р]АТР, (>5000 Ки/ммоль) - ГНЦ РФ ФЭИ, Обнинск, Россия.

Образцы ДНК.

Образцы геномной ДНК клинических изолятов М. tuberculosis штамма H37Rv были выделены в лаборатории молекулярно-биологических исследований ГНЦ ПМ (Оболенск, Россия).

Методы

Аллель-специфичная ПЦР

АСИ ПЦР и АС ПЦР проводили используя в качестве матрицы примерно 10 нг геномной ДНК, объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Реакционная смесь включала 40 мкМ каждого из дНТФ, 2 единицы Taq-полимеразы (Fermentas, Литва), 2 мМ MgS04, 25 мМ KCl, and 2% DMSO, в 10 мМ Трис-HCl, pH 8.85. ПЦР проводили в амплификаторе DNA Engine РТС-200 (MJ Research, Inc., USA).

Детекция мутаций в генах гроВ и katG.

Каждая реакция содержала пару праймеров для аллель-специфичного ампликона (фрагмента гена гроВ или katG) и пару праймеров для вспомогательного ампликона (фрагмента mtp40 или IS6110). Использовали следующие количества праймеров: 5 пМоль аллель-специфичных праймеров, по 10 пМоль праймеров для вспомогательного ампликона (mtpFor и mtpRev или ISFor и ISRev). Режим амплификации - начальная денатурация 96°С 7 мин, затем 30-50 циклов 95°С 40 сек, 62°С 20 сек, 72°С 1 мин. Результаты ПЦР анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле. Последовательности праймеров представлены в Табл. 8.

Для определения превичной структуры участков генов гроВ использовали следущие праймеры: rSfor (GTCGGCGAGCTGATCCAAAAC), rSrev (GGTACGGCGTTTCGATGAACC), katG • kSfor (CTCCGCTGGAGCAGATGGGC), kSrev (TCTTCCAGGGTGCGAATGACCT).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Игнатова, Анна Николаевна, Москва

1. Neriich, A.G., Haas, C.J., Zink, A., Szeimies, U. and Hagedorn, H.G. (1997) Molecular evidence for tuberculosis in an ancient Egyptian mummy. Lancet, 350,1404.

2. Salo, W.L., Aufderheide, A.C., Buikstra, J. and Holcomb, T.A. (1994) Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA in a pre-Columbian Peruvian mummy. Proc Natl Acad Sei US A, 91,2091-4.

3. Zink, A., Haas, C.J., Reischl, U., Szeimies, U. and Neriich, A.G. (2001) Molecular analysis of skeletal tuberculosis in an ancient Egyptian population. J Med Microbiol, 50,35566.

4. Smith, I. (2003) Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. Clin Microbiol Rev, 16,463-96.

5. Raviglione, M.C., Snider, D.E., Jr. and Kochi, A. (1995) Global epidemiology of tuberculosis. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA, 273,220-6.

6. Yerokhin, V.V., Punga, V.V. and Rybka, L.N. (2001) Tuberculosis in Russia and the problem of multiple drug resistance. Ann N YAcad Sei, 953,133-7.

7. Liu, J., Barry, C.E., 3rd, Besra, G.S. and Nikaido, H. (1996) Mycolic acid structure determines the fluidity of the mycobacterial cell wall. J Biol Chem, 271,29545-51.

8. Brennan, P.J. and Nikaido, H. (1995) The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem, 64,29-63.

9. Engelhardt, H., Heinz, C. and Niederweis, M. (2002) A tetrameric porin limits the cell wall permeability of Mycobacterium smegmatis. J Biol Chem, 277,37567-72.

10. Stephan, J., Mailaender, C., Etienne, G., Daffe, M. and Niederweis, M. (2004) Multidrug resistance of a porin deletion mutant of Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 48,4163-70.

11. Elliott, A.M., Berning, S.E., Iseman, M.D. and Peloquin, C.A. (1995) Failure of drug penetration and acquisition of drug resistance in chronic tuberculous empyema. Tuber Lung Dis, 76,463-7.

12. Gillespie, S.H. (2002) Evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: clinical and molecular perspective. Antimicrob Agents Chemother, 46,267-74.

13. Ramaswamy, S. and Musser, J.M. (1998) Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuber Lung Dis, 79,3-29.

14. Heep, M., Rieger, U., Beck, D. and Lehn, N. (2000) Mutations in the beginning of the rpoB gene can induce resistance to rifamycins in both Helicobacter pylori and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 44,1075-7.

15. Hirano, K., Abe, C. and Takahashi, M. (1999) Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated mostly in Asian countries and their rapid detection by line probe assay. J Clin Microbiol, 37,2663-6.

16. Yuen, L.K., Leslie, D. and Coloe, P.J. (1999) Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia. J Clin Microbiol, 37, 3844-50.

17. Valim, A.R., Rossetti, M.L., Ribeiro, M.O. and Zaha, A. (2000) Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil. J Clin Microbiol, 38, 3119-22.

18. Matsiota-Bernard, P., Vrioni, G. and Marinis, E. (1998) Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Greece. J Clin Microbiol, 36,20-3.

19. Mani, C., Selvakumar, N., Narayanan, S. and Narayanan, P.R. (2001) Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India. J Clin Microbiol, 39,2987-90.

20. Pozzi, G., Meloni, M., Iona, E., Orru, G., Thoresen, O.F., Ricci, M.L., Oggioni, M.R., Fattorini, L. and Orefici, G. (1999) rpoB mutations in multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy. J Clin Microbiol, 37,1197-9.

21. Cavusoglu, C., Hilmioglu, S., Guneri, S. and Bilgic, A. (2002) Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing and line probe assay. J Clin Microbiol, 40,4435-8.

22. Yue, J., Shi, W., Xie, J., Li, Y., Zeng, E. and Wang, H. (2003) Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from China. J Clin Microbiol, 41,2209-12.

23. Hwang, H.Y., Chang, C.Y., Chang, L.L., Chang, S.F., Chang, Y.H. and Chen, Y.J. (2003) Characterization of nfampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Taiwan. J Med Microbiol, 52, 239-45.

24. Takayama, K., Wang, L. and David, H.L. (1972) Effect of isoniazid on the in vivo mycolic acid synthesis, cell growth, and viability of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2,29-35.

25. Zhang, Y., Heym, B., Allen, B„ Young, D. and Cole, S. (1992) The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature, 358,591-3.

26. Heym, B., Zhang, Y., Poulet, S., Young, D. and Cole, S.T. (1993) Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the isoniazid susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol, 175,4255-9.

27. Zhang, Y., Garbe, T. and Young, D. (1993) Transformation with katG restores isoniazid-sensitivity in Mycobacterium tuberculosis isolates resistant to a range of drug concentrations. Mol Microbiol, 8,521-4.

28. Yu, S., Girotto, S., Lee, C. and Magliozzo, R.S. (2003) Reduced affinity for Isoniazid in the S315T mutant of Mycobacterium tuberculosis KatG is a key factor in antibiotic resistance. J Biol Chem, 278,14769-75.

29. Kapetanaki, S.M., Chouchane, S., Yu, S., Zhao, X., Magliozzo, R.S. and Schelvis, J.P. (2005) Mycobacterium tuberculosis KatG(S315T) catalase-peroxidase retains all active site properties for proper catalytic function. Biochemistry, 44,243-52.

30. Banerjee, A., Dubnau, E., Quemard, A., Balasubramanian, V., Um, K.S., Wilson, T., Collins, D., de Lisle, G. and Jacobs, W.R., Jr. (1994) inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis. Science, 263,227-30.

31. Rouse, D.A., Li, Z., Bai, G.H. and Morris, S.L. (1995) Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 39,2472-7.

32. Dessen, A., Quemard, A., Blanchard, J.S., Jacobs, W.R., Jr. and Sacchettini, J.C. (1995) Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacterium tuberculosis. Science, 267,1638-41.

33. Quemard, A., Sacchettini, J.C., Dessen, A., Vilcheze, C., Bittman, R., Jacobs, W.R., Jr. and Blanchard, J.S. (1995) Enzymatic characterization of the target for isoniazid in Mycobacterium tuberculosis. Biochemistry, 34, 8235-41.

34. Rozwarski, D.A., Grant, G.A., Barton, D.H., Jacobs, W.R., Jr. and Sacchettini, J.C. (1998) Modification of the NADH of the isoniazid target (InhA) from Mycobacterium tuberculosis. Science, 279, 98-102.

35. Rawat, R., Whitty, A. and Tonge, P.J. (2003) The isoniazid-NAD adduct is a slow, tight-binding inhibitor of InhA, the Mycobacterium tuberculosis enoyl reductase: adduct affinity and drug resistance. Proc Natl Acad Sei U SA, 100,13881-6.

36. Telenti, A., Honore, N., Bernasconi, C., March, J., Ortega, A., Heym, B., Takiff, H.E. and Cole, S.T. (1997) Genotypic assessment of isoniazid and rifampin resistance in

37. Mycobacterium tuberculosis: a blind study at reference laboratory level. J Clin Microbiol, 35, 719-23.

38. Slayden, R.A., Lee, R.E. and Barry, C.E., 3rd (2000) Isoniazid affects multiple components of the type II fatty acid synthase system of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol, 38,514-25.

39. Mdluli, K., Slayden, R.A., Zhu, Y., Ramaswamy, S., Pan, X., Mead, D., Crane, D.D., Musser, J.M. and Barry, C.E., 3rd (1998) Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl ACP synthase by isoniazid. Science, 280,1607-10.

40. Lee, A.S., Lim, I.H., Tang, L.L., Telenti, A. and Wong, S.Y. (1999) Contribution of kasA analysis to detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in Singapore. Antimicrob Agents Chemother, 43,2087-9.

41. Kelley, C.L., Rouse, D.A. and Morris, S.L. (1997) Analysis of ahpC gene mutations in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 41,2057-8.

42. Miesel, L., Weisbrod, T.R., Marcinkeviciene, J.A., Bittman, R. and Jacobs, W.R., Jr. (1998) NADH dehydrogenase defects confer isoniazid resistance and conditional lethality in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol, 180,2459-67.

43. Lee, A.S., Teo, A.S. and Wong, S.Y. (2001) Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother, 45,2157-9.

44. Bercovier, H., Kafri, 0. and Sela, S. (1986) Mycobacteria possess a surprisingly small number of ribosomal RNA genes in relation to the size of their genome. Biochem Biophys Res Commun, 136,1136-41.

45. Tracevska, T., Jansone, I., Nodieva, A., Marga, O., Skenders, G. and Baumanis, V. (2004) Characterisation of rpsL, rrs and embB mutations associated with streptomycin and ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis. Res Microbiol, 155,830-4.

46. Ramaswamy, S.V., Dou, S.J., Rendon, A., Yang, Z., Cave, M.D. and Graviss, E.A. (2004) Genotypic analysis of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Monterrey, Mexico. J Med Microbiol, 53,107-13.

47. Meier, A., Sander, P., Schaper, K.J., Scholz, M. and Bottger, E.C. (1996) Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotypic resistance levels in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 40,2452-4.

48. Scorpio, A. and Zhang, Y. (1996) Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus. Nat Med, 2,662-7.

49. Guo, M., Sun, Z. and Zhang, Y. (2000) Mycobacterium smegmatis has two pyrazinamidase enzymes, PncA and pzaA .J Bacteriol, 182,3881-4.

50. Zhang, Y., Scorpio, A., Nikaido, H. and Sun, Z. (1999) Role of acid pH and deficient efflux of pyrazinoic acid in unique susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J Bacteriol, 181,2044-9.

51. Sun, Z. and Zhang, Y. (1999) Reduced pyrazinamidase activity and the natural resistance of Mycobacterium kansasii to the antituberculosis drug pyrazinamide. Antimicrob Agents Chemother, 43,537-42.

52. Sreevatsan, S., Pan, X., Zhang, Y., Kreiswirth, B.N. and Musser, J.M. (1997) Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of Mycobacterium tuberculosis complex organisms. Antimicrob Agents Chemother, 41,636-40.

53. Rodrigues Vde, F., Teiles, M.A., Ribeiro, M.O., Cafrune, P.I., Rossetti, M.L. and Zaha, A. (2005) Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, 49,444-6.

54. Morlock, G.P., Crawford, J.T., Butler, W.R., Brim, S.E., Sikes, D., Mazurek, G.H., Woodley, C.L. and Cooksey, R.C. (2000) Phenotypic characterization of pncA mutants of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 44,2291-5.

55. Scorpio, A., Lindholm-Levy, P., Heifets, L., Gilman, R., Siddiqi, S., Cynamon, M. and Zhang, Y. (1997) Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 41, 540-3.

56. Takayama, K., Armstrong, E.L., Kunugi, K.A. and Kilburn, J.O. (1979) Inhibition by ethambutol of mycolic acid transfer into the cell wall of Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 16,240-2.

57. Mikusova, K., Slayden, R.A., Besra, G.S. and Brennan, P.J. (1995) Biogenesis of the mycobacterial cell wall and the site of action of ethambutol. Antimicrob Agents Chemother, 39,2484-9.

58. Takayama, K. and Kilburn, J.O. (1989) Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 33,1493-9.

59. Telenti, A., Philipp, W.J., Sreevatsan, S., Bernasconi, C., Stockbauer, K.E., Wieles, B., Musser, J.M. and Jacobs, W.R., Jr. (1997) The emb operon, a gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol. Nat Med, 3,567-70.

60. Lety, M.A., Nair, S., Berche, P. and Escuyer, V. (1997) A single point mutation in the embB gene is responsible for resistance to ethambutol in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 41,2629-33.

61. Alcaide, F., Pfyffer, G.E. and Telenti, A. (1997) Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 41,2270-3.

62. Lee, A.S., Othman, S.N., Ho, Y.M. and Wong, S.Y. (2004) Novel mutations within the embB gene in ethambutol-susceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 48,4447-9.

63. Lee, H.Y., Myoung, H.J., Bang, H.E., Bai, G.H., Kim, S.J., Kim, J.D. and Cho, S.N. (2002) Mutations in the embB locus among Korean clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to ethambutol. Yonsei Med J, 43, 59-64.

64. Plinke, C., Rusch-Gerdes, S. and Niemann, S. (2006) Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother, 50,1900-2.

65. Kocagoz, T., Hackbarth, C.J., Unsal, I., Rosenberg, E.Y., Nikaido, H. and Chambers, H.F. (1996) Gyrase mutations in laboratory-selected, fluoroquinolone-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Antimicrob Agents Chemother, 40,1768-74.

66. Poole, K. (2000) Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-positive bacteria and the mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 44,2595-9.

67. Li, X.Z., Zhang, L. and Nikaido, H. (2004) Efflux pump-mediated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 48,2415-23.

68. Pasca, M.R., Guglierame, P., Arcesi, F., Bellinzoni, M., De Rossi, E. and Riccardi, G. (2004) Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c, an ABC fluoroquinolone efflux pump in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 48,3175-8.

69. Alangaden, G.J., Kreiswirth, B.N., Aouad, A., Khetarpal, M., Igno, F.R., Moghazeh, S.L., Manavathu, E.K. and Lerner, S.A. (1998) Mechanism of resistance to amikacin and kanamycin in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 42,1295-7.

70. Kruuner, A., Jureen, P., Levina, K., Ghebremichael, S. and Hoffner, S. (2003) Discordant resistance to kanamycin and amikacin in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 47,2971-3.

71. Taniguchi, H., Chang, B., Abe, C., Nikaido, Y., Mizuguchi, Y. and Yoshida, S.I. (1997) Molecular analysis of kanamycin and viomycin resistance in Mycobacterium smegmatis by use of the conjugation system. J Bacteriol, 179,4795-801.

72. Suzuki, Y., Katsukawa, C., Tamaru, A., Abe, C., Makino, M., Mizuguchi, Y. and Taniguchi, H. (1998) Detection of kanamycin-resistant Mycobacterium tuberculosis by identifying mutations in the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol, 36,1220-5.

73. Maus, C.E., Plikaytis, B.B. and Shinnick, T.M. (2005) Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 49, 571-7.

74. Johansen, S.K., Maus, C.E., Plikaytis, B.B. and Douthwaite, S. (2006) Capreomycin binds across the ribosomal subunit interface using tlyA-encoded 2'-0-methylations in 16S and 23S rRNAs. Mol Cell, 23,173-82.

75. Bergmann, J.S. and Woods, G.L. (1998) Evaluation of the ESP culture system II for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis isolates to four primary antituberculous drugs. J Clin Microbiol, 36,2940-3.

76. Roggenkamp, A., Hornef, M.W., Masch, A., Aigner, В., Autenrieth, I.B. and Heesemann, J. (1999) Comparison of MB/BacT and BACTEC 460 ТВ systems for recovery of mycobacteria in a routine diagnostic laboratory. J Clin Microbiol, 31,3711-2.

77. Bemer, P., Bodmer, Т., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V. and Drugeon, H. (2004) Multicenter evaluation of the MB/BACT system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 42,1030-4.

78. Heym, В., Alzari, P.M., Honore, N. and Cole, S.T. (1995) Missense mutations in the catalase-peroxidase gene, katG, are associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol, 15,235-45.

79. Nash, K.A., Gaytan, A. and Inderlied, C.B. (1997) Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by use of a rapid, simple, and specific RNA/RNA mismatch assay .J Infect Dis, 176,533-6.

80. Watterson, S.A., Wilson, S.M., Yates, M.D. and Drobniewski, F.A. (1998) Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 36,1969-73.

81. Troesch, A., Nguyen, H., Miyada, C.G., Desvarenne, S., Gingeras, T.R., Kaplan, P.M., Cros, P. and Mabilat, C. (1999) Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol, 37,49-55.

82. Torres, M.J., Criado, A., Palomares, J.C. and Aznar, J. (2000) Use of real-time PCR and fluorimetry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 38,3194-9.

83. El-Hajj, H.H., Marras, S.A., Tyagi, S., Kramer, F.R. and Alland, D. (2001) Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons. J Clin Microbiol, 39,4131-7.

84. Abate, G., Hoffner, S.E., Thomsen, V.O. and Miorner, H. (2001) Characterization of isoniazid-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis on the basis of phenotypic properties and mutations in katG. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 20,329-33.

85. Spindola de Miranda, S., Kritski, A., Filliol, I., Mabilat, C., Panteix, G. and Drouet, E. (2001) Mutations in the rpoB gene of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Brazil and France. Mem Inst Oswaldo Cruz, 96,247-50.

86. Cockerill, F.R., 3rd (1999) Genetic methods for assessing antimicrobial resistance. Antimicrob Agents Chemother, 43,199-212.

87. Gibbs, R.A., Nguyen, P.N. and Caskey, C.T. (1989) Detection of single DNA base differences by competitive oligonucleotide priming. Nucleic Acids Res, 17, 2437-48.

88. Giffard, P.M., McMahon, J.A., Gustafson, H.M., Barnard, R.T. and Voisey, J. (2001) Comparison of competitively primed and conventional allele-specific nucleic acid amplification. Anal Biochem, 292,207-15.

89. Kainz, P. (2000) The PCR plateau phase towards an understanding of its limitations. Biochim Biophys Acta, 1494,23-7.

90. Huang, M.M., Arnheim, N. and Goodman, M.F. (1992) Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for smgle nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res, 20,4567-73.

91. Waterfall, C.M., Eisenthal, R. and Cobb, B.D. (2002) Kinetic characterisation of primer mismatches in allele-specific PCR: a quantitative assessment. Biochem Biophys Res Commun, 299,715-22.

92. Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, L.E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C. and Markham, A.F. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res, 17,2503-16.

93. Mokrousov, I., Otten, T., Vyshnevskiy, B. and Narvskaya, O. (2003) Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears. Antimicrob Agents Chemother, 47,2231-5.

94. Del Portillo, P., Thomas, M.C., Martinez, E., Maranon, C., Valladares, B., Patarroyo, M.E. and Carlos Lopez, M. (1996) Multiprimer PCR system for differential identification of mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 34, 324-8.

95. Thierry, D., Brisson-Noel, A., Vincent-Levy-Frebault, V., Nguyen, S., Guesdon, J.L. and Gicquel, B. (1990) Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol, 28,2668-73.

96. Parsons, L.M., Somoskovi, A., Urbanczik, R. and Salfinger, M. (2004) Laboratory diagnostic aspects of drug resistant tuberculosis. Front Biosci, 9,2086-105.

97. Wada, T., Maeda, S., Tamaru, A., Imai, S., Hase, A. and Kobayashi, K. (2004) Dualprobe assay for rapid detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR. J Clin Microbiol, 42,5277-85.

98. Glynn, J.R., Whiteley, J., Bifani, P.J., Kremer, K. and van Soolingen, D. (2002) Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review. Emerg Infect Dis, 8, 843-9.

99. Gamier, T., Eiglmeier, K., Camus, J.C., Medina, N., Mansoor, H., Pryor, M., Duthoy, S., Grondin, S., Lacroix, C., Monsempe, C. et al. (2003) The complete genome sequence of Mycobacterium bovis. Proc Natl Acad Sei USA, 100,7877-82.

100. Kovalev, S.Y., Kamaev, E.Y., Kravchenko, M.A., Kurepina, N.E. and Skorniakov, S.N. (2005) Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping. IntJTuberc Lung Dis, 9, 746-52.

101. Shemiakin, I.G., Stepanshina, V.N., Ivanov, I., Lipin, M., Korobova, O.V. and Anisimova, V.A. (2003) Characteristics of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis using molecular biological methods. Mol Gen Mikrobiol Virusol, 32-40.

102. Yeh, R.W., Ponce de Leon, A., Agasino, C.B., Hahn, J.A., Daley, C.L., Hopewell, P.C. and Small, P.M. (1998) Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes. J Infect Dis, ill, 1107-11.

103. Niemann, S., Rusch-Gerdes, S., Richter, E., Thielen, H., Heykes-Uden, H. and Diel, R. (2000) Stability of IS6110 restriction fragment length polymorphism patterns of

104. Chaves, F., Dronda, F., Alonso-Sanz, M. and Noriega, A.R. (1999) Evidence of exogenous reinfection and mixed infection with more than one strain of Mycobacterium tuberculosis among Spanish HIV-infected inmates. Aids, 13,615-20.

105. Kruuner, A., Pehme, L., Ghebremichael, S., Koivula, T., Hoffner, S.E. and Mikelsaar, M. (2002) Use of molecular techniques to distinguish between treatment failure and exogenous reinfection with Mycobacterium tuberculosis. Clin Infect Dis, 35,146-55.

106. Soim, H., Pan, X., Amin, A., Graviss, E.A., Siddiqui, A. and Musser, J.M. (2000) Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping. J Clin Microbiol, 38,669-76.