Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

на правах рукописи

Богун Александр Геннадьевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ КОМПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

М461Я» ■ 2 Ш

0боленск2010 г.

004615390

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Черноусова Лариса Николаевна Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Защита состоится 10 декабря 2010 г. в 12 00 на заседании Диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ПМБ. Автореферат разослан «$» ноября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Туберкулёз является главным фактором инвалидизации и смертности, имеющим бактериальную природу [Кононец А.С. и др., 2010; Золотарёва Л.В. и др., 2010]. Эпидемия ВИЧ инфекции привела к значительному увеличению заболеваемости туберкулёзом [Корнилова З.Х. и др., 2010], а распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, создало дополнительные сложности при лечении туберкулёза [Крапина H.J1. и др., 2010; Drobniewski F. et al., 2005].

Существует множество работ, иллюстрирующих особенности циркуляции штаммов возбудителя туберкулёза в различных регионах мира [Кислич-кина А.А., 2009; Lazzarini L. et al., 2008]. Показано, что популяция микобак-терий является клональной [Земскова З.С. и др., 2010; Sreevatsan S. et al., 1997]. Для анализа микобактерий используется несколько методов генотипи-рования, но получаемые результаты часто противоречат друг другу [Supply Р. et а!., 2006; Gagneux S. et al., 2007; Kremer К. et al., 2005].

Наиболее полная информация о структуре популяции возбудителя туберкулёза, получена, вероятно, в результате анализа 89 генов [Comas Т. et al., 2009]. Необходимость изучения большого количества генов для филогенетического анализа штаммов М. tuberculosis методом мультилокусного секвени-рования связана с низким полиморфизмом генома. Это обстоятельство значительно усложняет анализ штаммов и ограничивает применение мультилокусного секвенирования для генотипирования М. tuberculosis.

Другим подходом является анализ полиморфных нуклеотидов, обнаруженных в разных участках хромосомы штаммов М. tuberculosis с полностью идентифицированными геномами [Filliol I.et al.,2006;GutackerM. et al., 2006]. В результате сравнения последовательностей нуклеотидов в геномах штаммов М. tuberculosis - H37Rv, 1551, 210 и штамме М. bovis AF2122/97 и последующего анализа бактериальных культур, выделенных от пациентов, разработана классификация, позволяющая определить принадлежность штамма к одной из семи групп SCG. Определение точечных мутаций в данном случае проводится с применением аллель-специфичной ПЦР. Этот метод сравнительно прост в использовании, но имеет низкую разрешающую способность и не позволяет эффективно дифференцировать клинические изоляты микобактерий.

Традиционные методы генетического анализа М. tuberculosis также по ряду причин не являются совершенными. При использовании метода RFLP-IS6110 данные, полученные в разных лабораториях, трудно сравнивать между собой. Сполиготипирование основано на анализе только одного участка хромосомы, который к тому же подвержен конвергентной эволюции, а для метода MIRU-VNTR окончательно не определён набор анализируемых локу-сов.

Для практического здравоохранения важной задачей является быстрое выявление штаммов М tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, а также обнаружение источников и путей распространения таких штаммов. Наибольшим потенциалом для этих целей обладают молекулярно-генетические методы, основанные на ПЦР, так как они позволяют быстро проводить анализ с использованием небольшого количества бактериальной культуры.

Эффективный мониторинг штаммов М. tuberculosis и оперативный обмен информацией между разными лабораториями невозможен без наличия единой системы идентификации. Так как в настоящее время все используемые методы генотипирования штаммов М. tuberculosis имеют недостатки, то возникает необходимость разработки комплексного подхода, основанного на использовании оптимальной комбинации методов.

Актуальность. Актуальность работы определяется тем, что в настоящее время отсутствует единый алгоритм генетической идентификации штаммов М. tuberculosis. Такой алгоритм должен базироваться на методах, требующих для анализа небольшое количество тестируемого материала, обладающих высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, и, кроме того, должен позволять легко сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.

Цель данной работы - комплексное исследование клинических изоля-тов М. tuberculosis молекулярно-биологическими методами, широко использующимися в настоящее время для генетической идентификации возбудителя туберкулёза, и выявление закономерностей между данными, полученными при использовании этих методов.

Задачи исследования.

1. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом сполиготипиро-вания.

2. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом RFLP-IS6//0.

3. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом MIRU-VNTR.

4. Определение принадлежности клинических изолятов М. tuberculosis к филогенетическим линиям на основании анализа точечных мутаций.

5. Изучение лекарственной устойчивости и мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам.

6. Анализ информативности разных методов генотипирования М. tuberculosis и выявление взаимосвязей между данными, полученными в результате их использования.

Научная новизна работы. Впервые проведён анализ клинических изолятов М. tuberculosis с помощью метода MIRU-VNTR, основанного на анализе 35 локусов. Впервые проведён анализ большой выборки клиниче-

ских изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ с использованием четырёх методов генотипирования - RFLP-IS67/0, SNP, сполиготипирования и MIRU-VNTR. Впервые показано полное соответствие между геногруппами, выявленными на основании данных, полученных с помощью методов MIRU-VNTR и SNP-типирования.

Практическая значимость работы. Полученные данные о генотипи-ческих особенностях клинических изолятов М tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, необходимы для разработки эффективной системы мониторинга возбудителя туберкулёза. Разработан алгоритм генотипирования штаммов М. tuberculosis, основанный на анализе точечных мутаций и результатов MIRU-VNTR, позволяющий выявлять источник и отслеживать пути распространения конкретных штаммов среди пациентов лечебных учреждений, в том числе штаммов, обладающих лекарственной устойчивостью. Кроме того, использование данного подхода делает возможным установление принадлежности штамма к индивидуальным филогенетическим группам, что позволяет отслеживать интродукцию штаммов из других регионов. Особенностью данного подхода является возможность быстрого сравнения и обработки данных, полученных в разных лабораториях.

Положения, выносимые на защиту.

1) Разработан вариант метода MIRU-VNTR, основанный на анализе 35 локусов в геноме туберкулезного микроба.

2) Разработан алгоритм генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis, включающий анализ 35 локусов MIRU-VNTR и SNP-типирование, позволяющий проводить эффективную межштаммовую дифференциацию и определять принадлежность клинических изолятов к отдельным филогенетическим линиям.

3) Использование разработанного алгоритма позволяет выявлять филогенетические связи между штаммами, обладающими лекарственной устойчивостью.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе три печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и 9 приложений.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В работе проанализированы все клинические изоляты М. tuberculosis (п 330), выделенные от больных с диагнозом туберкулёз лёгких, обратившихся в медицинские учреждения г. Тулы в период с июня 2001 по июнь 2002 г. Для культивирования изолятов М. tuberculosis использовали питательную среду Левенштейна-Йенсена. Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis осуществляли методом СТАВ.

На основании анализа литературы для проведения исследования нами выбраны 35 MIRU-VNTR локусов. При их выборе учитывали следующие критерии: 1) наличие локуса в каком-либо широко используемом наборе локусов для MIRU-VNTR типирования; 2) наличие литературных данных о том, что в каком-либо исследовании для данного локуса был обнаружен высокий уровень полиморфизма; 3) длина тандемного повтора должна превышать 40 п.о., что необходимо для анализа ампликона с помощью электрофореза в ага-розном1 геле. ПЦР проводили на амплификаторе Dyad фирмы Bio-Rad. Размер ПЦР-продукта определяли с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле при окрашивании бромистым этидием. Для оценки полиморфизма использовали коэффициент Hunter-Gaston (h) [Hunter P., 1988]. Построение филогенетической схемы для клинических изолятов М. tuberculosis по данным MIRU-VNTR осуществляли с помощью программы Population 1.2.30.

Принадлежность клинических изолятов к геногруппам, идентифицированным на основании SNP-типирования, осуществляли в соответствии с классификацией, предложенной Filliol [Filliol I. et al., 2006]. Для SNP-анализа использовали мультиплексную аллель-специфичную ПЦР [Игнатова А.Н., 2007]. Сполиготипирование проводили по стандартной методике [Kamerbeek J. et al., 1997]. Анализ RFLP-IS67/0 выполняли в соответствии с van Embden [van Embden J. et al., 1993].

При определении лекарственной устойчивости изолятов М. tuberculosis к стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину использовали метод абсолютных концентраций, в соответствии с приказами Минздрава [Приказ № 558, от 8 июня 1978 г.; Приказ № 109, от 21 марта 2003 г.]. Для определения молекулярных механизмов устойчивости к лекарственным препаратам секвенировали гены lóSrRNA, embB, katG, рпсА, гроВ, и rpsL. Последовательности фрагментов генов определяли на анализаторе Ме-gaBACE 750 ("Amersham Bioscience", США) согласно инструкциям производителя.

Результаты исследований и их обсуждение

Подбор условий проведения анализа MIRU-VNTR

В работе использовали референсный штамм М. tuberculosis H37Rv и 54 клинических изолята М. tuberculosis, принадлежащих к наиболее распространенным в РФ геногруппам. Анализ данных RFLP-IS6770 и сполиготипи-рования позволил сделать заключение о том, что охарактеризованные клинические изоляты не являются смесью нескольких культур М. tuberculosis

Рисунок 1 - ПЦР-анализ ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv по 29 MIRU-VNTR локусам и делеции TbDl:a) Реакционная смесь без дополнительных компонентов (маркер ДНК "50 bp DNA Ladder), б) ПЦР в присутствии 5 % ДМСО (маркер ДНК "O'RangeRuler 50 bp DNA Ladder), в) ПЦР в присутствии 1,5 М бетаина (маркер ДНК "O'RangeRuler 50 bp DNA Ladder"). 1 - маркер ДНК, 2 - ETR А, 3 - ETR В, 4 - ETR С, 5 - MIRU 2, 6 - MIRU 4, 7 - маркер ДНК, 8 - MIRU 10, 9 - MIRU 16, 10 - MIRU 20, 11 - MIRU 23, 12 - MIRU 24, 13 - маркер ДНК, 14 - MIRU 26, 15 - MIRU 27, 16 - MIRU 31, 17 -MIRU 39, 18 - MIRU 40, 19 - маркер ДНК, 20 - TbDl, 21 - QUB-1 la, 22 -QUB-1 lb, 23 - QUB-26, 24 - VNTR 0424, 25 - маркер ДНК, 26 - VNTR 1895, 27 - VNTR 1955, 28 - VNTR 1982, 29 - VNTR 2347, 30 - VNTR 2401, 31 -маркер ДНК, 32 - VNTR 3171, 33 - VNTR 3232, 34 - VNTR 3336, 35 - VNTR 3690, 36 - VNTR 4156, 37 - маркер ДНК.

В результате были подобраны условия проведения ПЦР, позволяющие амплифицировать участки ДНК, содержащие тандемные повторы без использования дорогостоящих наборов и полимеразы с горячим стартом. Показано, что наиболее благоприятные условия для ПЦР возникают при добавлении в реакционную смесь ДМСО в концентрации 5% или бетаина в концентрации 1,5М (рис. 1).

Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом MIRU-VNTR

MIRU-VNTR-анализ клинических изолятов М. tuberculosis (п 330) проводили по 35 локусам. Условия реакции, подобранные для анализа 29 MIRU-VNTR локусов (рис. 1), также позволяют проводить анализ дополнительных шести локусов. Введение в реакционную смесь ДМСО позволило получить данные для всех 330 изолятов по 35 MIRU-VNTR локусам, выбранным для анализа, без использования процедуры горячего старта. Кроме того, использование ДМСО позволило проводить реакцию амплификации при единой для всех локусов концентрации MgCb равной 1,5 мМ MgC^.

При анализе результатов MIRU-VNTR выявлено, что большая часть изученных клинических изолятов М. tuberculosis (п 291; 89 %) являются чистыми культурами; 28 изолятов (8 %) являются смесью нескольких штаммов, поскольку содержат большое количество двойных аллелей; а 11 изолятов (3 %) имеют два аллеля только для одного из локусов. В дальнейшем при сопоставлении информативности разных методов генотипирования мы использовали данные, полученные только для тех изолятов, которые не имеют двойных аллелей (п 291). Количество повторов варьировало от 0 для локусов ETR-F и VNTR 0569 до 28 для локуса VNTR 1895. Всего, при анализе 35 локусов обнаружено 185 профилей MIRU-VNTR: 158 изолятов имеют уникальные MIRU-VNTR профили, а 133 изолята входят в состав 27 кластеров. Индекс разнообразия генотипов MIRU-VNTR (h) равен 0,96.

Пятнадцать кластеров состояли из двух изолятов, шесть кластеров - из трёх изолятов, два кластера - из четырёх изолятов, один - из пяти изолятов, один - из семи изолятов, один - из десяти изолятов и один - из 55 изолятов. Определены индексы полиморфизма (h) для каждого локуса MIRU-VNTR, которые имеют значения от 0 до 0,8 для разных локусов (табл. 1). Таким образом, среди изученных нами локусов оказались локусы как с высоким, так и с низким полиморфизмом.

Таблица 1 - Индексы полиморфизма локусов MIRU-VNTR

Локус h Локус h Локус h Локус h Локус h

MIRU 02 0,49 MIRU 26 0,53 QUB26 0,73 VNTR 0595 0,01 VNTR 3171 0,06

MIRU 04 0,11 MIRU 27 0,03 ETRA 0,63 VNTR 1443 0,52 VNTR 3232 0,80

MIR U 10 0,64 MIRU 31 0,66 ETRB 0,05 VNTR 1895 0,31 VNTR 3336 0,71

M1RU 16 0,29 MIRU 39 0,48 ETRC 0,69 VNTR 1955 0,60 VNTR 3690 0,58

MIRU 20 0,06 MIRU 40 0,69 ETR-F 0,56 VNTR 1982 0,72 VNTR 3820 0,70

MIRU 23 0,19 QUB-lla 0,71 VNTR 0424 0,59 VNTR 2347 0,07 VNTR 4120 0,68

MIRU 24 0 QUB-llb 0,66 VNTR 0569 0,12 VNTR 2401 0,60 VNTR 4156 0,28

Анализ сполигопаттернов клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

Изучение сполигопаттернов проведено только для тех клинических изолятов М. tuberculosis, которые, согласно данным MIRU-VNTR, являются гомогенными культурами (п 291). При их анализе обнаружено 52 сполиготи-па, 33 из которых идентичны опубликованным в международной базе данных spol4. Для изолятов, сполиготипы которых не представлены в базе данных spol4, принадлежность к сполигосемействам определена на основании рекомендаций, изложенных в работе Sebban M. [Sebban M. et al., 2002]. Показано, что исследованные изоляты M. tuberculosis принадлежат к девяти сполигосемействам: Beijing (п 98), Beijing-LIKE (ni), Haarlem (n27), LAM (n 106), LAM3 and S/convergent (n 1), S (n 2), T (n 51), U (n 3), и X (n 1) (рис. 3). Рассчитанный индекс полиморфизма сполиготипов (h) равен 0,85.

Наиболее объёмный кластер состоит из 82 изолятов, имеющих споли-готип (000000000003771), относящийся к сполигосемейству Beijing (табл. 2). Вторым по величине оказался кластер, состоящий из 73 изолятов, принадлежащих к сполигосемейству LAM9. Согласно литературным данным, споли-готипирование обладает низкой разрешающей способностью для штаммов, входящих в сполигосемейство Beijing. Однако для штаммов, принадлежащих к сполигосемейству LAM, разрешающая способность данного метода оказывается более высокой. Таким образом, наличие большой группы клинических изолятов, имеющих сполиготип 777477607760771, оказывается характерным для клинической выборки, используемой в исследовании. Это подтверждается и тем, что в международную базу данных spoI4 включены 3758 штамма, имеющих сполиготип 000000000003771, и только 39 штаммов, имеющих сполиготип 777477607760771.

Таблица 2 - Сполиготипы клинических изолятов М. tuberculosis

Сполиготнп CnojiiiroceMeftCTBO Количество изолятов в исследованной коллекции Количество штаммов в базе данных Spol4

ООООООООООООООО U 1 0

000000000000771 Beijing-LIKE 1 38

000000000003171 Beijing 7 6

000000000003371 Beijing 3 26

000000000003731 Beijing 6 48

000000000003771 Beijing 82 3758

000000004020771 Haarlem2 1 283

000000007760771 LAM3-and-S/convergent 1 118

003777607760771 LAM9 1 3

377737777760771 T3 2 2

407777607760771 LAM9 I 3

674777377420771 Haarlem4 1 2

676377737760771 S 2 7

747777770060771 T 1 0

760377777410771 Haarlem 2 0

770000000760771 LAM I 1 0

770000737760751 X 1 0

770000777760771 T1 RUS2 3 46

774000000760771 T1 3 11

774777177420771 Haarlem 3 0

774777717760571 T 1 0

774777777420771 IIaarlem4 7 88

775740003760771 T1 7 14

777002000000371 LAM 1 0

777457607760771 LAM 1 0

777477607760171 LAM1 1 0

777477607760771 LAM9 73 39

777600000060771 LAM 4 0

777677777420771 Haarlem 1 0

777701003760771 LAM 5 0

777737777420771 Haarlem4 1 74

777737777760731 T2-T3 1 114

777737777760771 T3 1 155

777740007760771 T1 1 24

777757777760771 T1 1 16

777760007760771 T5 RUS1 3 92

777761003760771 T1 I 0

777761007760771 T1 2 11

777763007760771 LAM 1 0

777775077760771 T 1 0

777777207760771 LAM9 1 6

777777377560771 T 1 0

777777377760771 T4 5 87

777777600000000 U г 14

777777607760731 LAM4 1 83

777777607760771 LAM9 15 1227

777777737760571 T 2 0

777777774020771 Haarlem 6 721

777777777060771 T 4 0

777777777420771 Haarlem4 4 24

777777777720771 Ilaarlem3 1 1504

777777777760771 T1 12 2497

Всего 291

Анализ результатов SNP-типирования клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

На основании анализа точечных мутаций определена принадлежность 291 клинического изолята М. tuberculosis к индивидуальным филогенетическим группам. Показано, что в данной выборке присутствуют изоляты, принадлежащие ко второй (п 98; 33,7%), третьей (п41; 14,1 %), пятой (п 127; 43,6%) и шестой (п 25; 8,6 %) группам SCG.

Анализ клинических изолятов М tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ методом, RFLP-IS6//0

Методом RFLP-IS6//Í* проанализирован 291 клинический изолят М. tuberculosis. При анализе результатов с помощью программы GelComparll 3.5 обнаружено 182 профиля RFLP-IS6/S0. Количество копий инсерционного элемента IS6//0 в изученных изолятах варьирует от 4 до 21 (рис. 2). Индекс разнообразия профилей RFLP (h) равен 0,99. Сто тридцать пять изолятов М tuberculosis имеют уникальные профили RFLP-lS<5//0. Пятьдесят шесть изолятов сформировали 28 кластеров, состоящих из

Число рестрикционных полос в исследованных изолятах М. tuberculosis 55

31

20

_10.

о о о о ¿¿¿¿О

41

20 1Я 19

18 •• ■,„ 15 1В

8-8-9

0 0

5 10 15

Число полос в профиле RFLP IS6110

20

Рисунок 2 - Распределение изолятов М. tuberculosis по группам в зависимости от количества гибридизационных полос в профиле RFLP-1S6JJ0

двух изолятов, 30 изолятов входят в 10 кластеров, состоящих из трёх изолятов, 20 изолятов сформировали пять кластеров, каждый из которых состоял из четырёх изолятов, а 16 изолятов сформировали два кластера, каждый из которых состоял из восьми изолятов. Также обнаружен один кластер, coll

стоящий из семи изолятов и один кластер, состоящий из 17 изолятов М. tuberculosis.

Сопоставление информативности типирования клинических изолятов М. tuberculosis методами MIRU-VNTR и SNP

После получения результатов молекулярного типирования клинических изолятов М. tuberculosis четырьмя методами проведён анализ взаимосвязи между ними. По данным для 35 локусов MIRU-VNTR в программе Populations 1.2.30 с помощью метода «связывания ближайших соседей» (Neighbor Joint), построена дендрограмма генетического родства клинических изолятов М. tuberculosis. На ней изоляты сформировали пять групп -MIRU-VNTR-1, M2RU-VNTR-2, MIRU-VNTR-3a, MIRU-VNTR-3b, и MIRU-VNTR-4 (рис. 6). Все клинические изоляты, входящие в каждую группу MIRU-VNTR, являются членами только одной группы SCG.

Сопоставление информативности типирования клинических изолятов М. tuberculosis методами SNP и сполиготипирования

Генотипирование штаммов М. tuberculosis методом, основанным на анализе шести точечных мутаций, обладает низкой разрешающей способностью и не позволяет проводить тонкую генетическую дифференциацию штаммов. Поэтому при сопоставлении информативности этих двух методов использовали данные о принадлежности изолятов М. tuberculosis к сполиго-семействам, а не данные, характеризующие структуру сполигопаттернов. Это позволило нам сопоставить насколько хорошо соотносится информация о принадлежности клинического изолята к большим филогенетическим группам, полученная при использовании данных методов.

Выяснилось, что 100% (п 98) изолятов, принадлежащих к SCG-2, относятся к сполигосемейству Beijing (рис. 3). Остальные SCG состоят из изолятов, принадлежащих к нескольким сполигосемействам. Среди изолятов, входящих в SCG-3, 2,4% (n 1) принадлежат к сполигосемейству Beijing-like, 65,9% (n 27) - к сполигосемейству Haarlem, а 31,7% (п 13) - к сполигосемейству Т. Изоляты, входящие в SCG-5, принадлежат к пяти сполигосемействам. Из них к сполигосемейству LAM относится 83,4% изолятов (п 107), к сполигосемействам LAM3-S-conv, S, Т, и U относятся 0,8% (n 1), 1,6% (п 2), 11,8% (п 15) и 1,6% (п2) изолятов, соответственно. Среди изолятов, входящих в SCG-6, 92,0% принадлежит к сполигосемейству Т (п 23), а к сполигосемействам U и X принадлежит по одному изоляту (4%).

Из трёх изолятов, относящихся к сполигосемейству U, два (67%) принадлежит к SCG-5, а один (33%) - к SCG-6. Из 51 изолята, принадлежащих к сполигосемейству Т, к SCG-3 принадлежит 25% (п 13), к SCG-5 - 31% (п 16),

а к SCG-6 - 43% (п 22). Таким образом, среди изолятов, принадлежащих к сполигосемейству Beijing (n98), Beijing-like (n 1), Haarlem (n27), LAM (п 107), LAM3-S-conv (n 1), S (п 2) и X (n 1), 100% изолятов входит в состав только одной SCG. Однако было обнаружено, что изоляты, принадлежащие к споли-госемействам U и Т, могут относиться к разным SCG группам.

□ X

■ и нт

as

ИВ LAM3-S-

conv E2LAM

В Haarlem

Ш Beijinglike В Beijing

Рисунок 3 - Распределение штаммов М. tuberculosis, принадлежащих к разным сполигосемействам среди обнаруженных SCG.

Индекс аллельного разнообразия при анализе 35 локусов MIRU-VNTR равен 0,97 для группы SCG2, 0,96 - для группы snp3, 0,8 - для группы SCG 5 и 0,96 - для группы SCG6. Согласно литературным данным, метод MIRU-VNTR, как правило, обладает меньшей разрешающей способностью в отношении штаммов сполигосемейства Beijing (группа SCG2). Однако, согласно нашим данным, минимальная разрешающая способность зарегистрирована для группы SCG5, состоящей преимущественно из изолятов сполигосемейства LAM.

Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis к лекарственным препаратам у филогенетически связанных изолятов

При анализе группы MIRU-VNTR-За показано, что в неё входят 55 изолятов, имеющих одинаковые профили MIRU-VNTR. При изучении клинических изолятов М. tuberculosis, филогенетически связанных с данной группой, выявлена клональная группа, состоящая из 92 изолятов, обладающих повышенной устойчивостью к лекарственным препаратам (рис. 6, табл. 3).

Таблица 3 - Лекарственная устойчивость изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR-3a

Лекарственный препарат Концентрация мг/л Количество ЛУ изолятов М. tuberculosis

Клональная Изоляты вне

группа клональной группы

5 4 (4,3%) 9 (25,7%)

Стрептомицин 10 16 (17,4%) 10 (28,6%)

50 68 (73,9%) 5 (14,3%)

1 26 (28,3%) 13 (37,1%)

Изониазид 5 22 (23,9%) 0(%)

25 38(41,3%) 0 (%)

2 42 (45,7%) 4(11,4%)

Этамбутол 5 2 (2,2%) 0 (%)

25 0 (0%) 0(%)

Рифампицин 20 4 (4,3%) 5 (14,3%)

50 81 (88%) 8 (22,9%)

Канамицин 30 34 (37%) 7 (20%)

50 46 (50%) 0 (0%)

Данные о том, что эти клинические изоляты являются филогенетически связанной группой, были подтверждены в результате анализа мутаций, детерминирующих устойчивость к лекарственным препаратам (табл. 4). Мутация 513 А—>С гена !6$гЯМА, детерминирующая устойчивость к стрептомицину, обнаружена у 80 изолятов, входящих в клональную группу. Для изолятов, не входящих в клональную группу, характерна мутация в 43 кодоне гена гр$Ь. Изоляты, входящие в группу MIRU-VNTR-Зa (ЙСО 5), но не относящиеся к клональной группе, не содержат мутации 516 ОТС в гене гроВ. Да-ная мутация обнаружена только у двух изолятов, принадлежащих к группе МЩи-У>Ш1-2. Мутация 531 ТШ обнаружена у трёх изолятов, припадле-

жащих к группе MIRU-VNTR-За, но не относящихся к кластеру, хотя в группе MIRU-VNTR-1 (Beijing) она встречается наиболее часто. Сходня ситуация наблюдается с мутацией 526 GAC, приводящей к замене His—»Asp, которая обнаруживается только у изолятов, входящих в клональную группу, тогда как для изолятов семейства Beijing характерна мутация TAC в этом же кодо-не, но приводящая к замене His—»Туг. По данным литературы [Hatfull G., 2000] мутации в 526 и 531 кодонах гена гроВ приводят к устойчивости к ри-фампицину примерно у 80% штаммов М. tuberculosis во всём мире. Однако среди изученных нами клинических изолятов наиболее распространённой оказалась мутация в 516 кодоне. Несмотря на то, что данная мутация приводит к формированию лекарственной устойчивости к рифампицину, она не вызывает устойчивости к другим рифамицинам, в частности к рифабутину.

Таблица 4 - Мутации, детерминирующие устойчивость к лекарственным препаратам клинических изолятов М. tuberculosis, принадлежащих к разным группам MIRU-VNTR

Лекарственный препарат Ген Мутация Группа MIRU-VNTR

1 2 3a 3b 4

43 AGG 33 3 2

rpsL 88 AGG 2

88 ATG

513 A-C 1 1 80

Стрептомицин 514 G-T

/ 6SrRNA 516 C-T 8 1

513 A-C+515 C-T 1

513 A-C+904 A-C 1

513 C-T+516 C-A 1

510CAT+516TAC 1

511 CCG 2

516 TAC 6 2

516 GTC 2 73

522 CAG 2

Рифампицин 525ACG526TCC527CAG 1

гроВ 526 TAC 5

526 GAC 7

531 TGG 1

531 TTG 28 3 1

533 CCG 1

516TAC+531 TTG 2

531 TTG+533 CCG 1

Молекулярно-генетические характеристики клинических изоля-тов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

В последнее время появляется всё больше данных о том, что филогенетические линии М. tuberculosis различаются как по вирулентности [Caws М. et al., 2008; de Jong В. et al., 2008; Thwaites G. et al., 2008], так и по устойчивости к лекарственным препаратам [Сох Н. et al., 2005; Chakravorty S. et al., 2008]. Несмотря на это, единой системы классификации микобактериальных штаммов, учитывающей все свойства возбудителя туберкулёза, пока не существует. Вероятно, наиболее современная информация о филогении мико-бактерий получена при изучении 89 генов (рис. 4). Мы дополнили данную дендрограмму, определив на основании принадлежности штаммов к споли-госемействам принадлежность их к филогенетическим линиям, идентифицированным на основании анализа точечных мутаций [Filliol I. et al., 2006; Vultos Т. et al., 2008; Comas I. et al, 2009].

Как видно из рисунка 4, для сполигосемейств Cameroon, Uganda, AFRi-1 и AFRi-2, в настоящее время не существует классификации в соответствии с принадлежностью к SCG. Тем не менее, все остальные основные филогенетические линии, определенные на основании принадлежности к SCG, выявляются также и при изучении 89 генов М. tuberculosis. Однако филогенетические группы SCG3, SCG4, SCG5, SCG6 являются подгруппами Европейско-Американской линии (Lineage 4), в то время как подгруппа SCG-За является самостоятельной филогенетической линией (Lineage 4).

В нашем исследовании не обнаружены изоляты, принадлежащие к SCG-1, SCG-4 и SCG-7. Штаммы SCG-1 являются членами сполигосемейства EAI, распространенного в Восточной Африке и Индии, и встречаются в Российской Федерации редко [Comas I. et al., 2009; Reed M. et al., 2009]. Возможно, по этой причине они отсутствуют в нашей коллекции. Штаммы, принадлежащие к SCG-7, относятся к М. bovis. Всего один изученный изолят принадлежит к сполигосемейсву X, однако, его сполиготип отсутствует в международной базе данных SpoI4, и принадлежность его к сполигосемейст-ву X определена на основании эвристических алгоритмов [Sebban М. ct al., 2002]. Таким образом, вероятно, что среди изученных нами изолятов действительно отсутствуют изоляты, принадлежащие к SCG1, SCG4 и SCG7.

В 2007 году возникло предположение, что филогенетические группы SCG-3c—>SCG4 и SCG5—»SCG6 искусственно разбиты на независимые филогенетические линии в связи с тем, что для поиска маркерных мутаций использовались геномы филогенетически близких штаммов H37Rv и CDC 1551, принадлежащих к SCG-4 и SCG-6 [Gagneux S., Smal P., 2007]. Однако современные данные позволяют сделать вывод, что эти филогенетические линии

являются эволюционно независимыми, хотя и достаточно близкими [Vultos Т. et al., 2008]. Данные, полученные нами, также подтверждают гипотезу о независимости этих филогенетических линий, так как были обнаружены 152 изолята, принадлежащие к SCG5 и SCG6, но ни одного изолята, принадлежащего к SCG4. Отсутствие штаммов М. tuberculosis, принадлежащих к SCG-4, позволяет заключить, что группы SCG-4, SCG-5 и SCG-6 являются независимыми филогенетическими линиями.

УРГуГ,2

Рисунок 4 - Дендрограмма генетического родства штаммов М. tuberculosis построенная на основании результатов секвенирования 89 генов (Comas 2009 с изменениями)

Это подтверждается также данными, полученными при секвенирова-нии генов системы 3R клинических штаммов М. tuberculosis [Vultos Т. et al., 2008], так как на дендрограмме, построенной с учётом результатов анализа генов этой системы, изоляты из этих SCG сформировали самостоятельные группы.

В то же время при анализе сполиготипов клинических изолятов М. tuberculosis не обнаружено однозначных закономерностей для всех споли-госемейств. Изоляты, относящиеся к сполигосемейству Т, принадлежали к трём разным кластерным группам - SCG-3, SCG-5 и SCG-6. Также на дендрограмме, построенной на основании данных, полученных при использовании метода MIRU-VNTR, изоляты, принадлежащие к SCG-3, оказались сгруппированными в две ветви - группу MIRU-VNTR-2 и группу MIRU-VNTR-4. Обе группы состояли из изолятов, относящихся к сполигосемейст-вам Т и Haarlem. Однако мы не обнаружили совпадения сполиготипов у изолятов, входящих в эти две группы MIRU-VNTR, несмотря на то, что такое совпадение обнаружено у изолятов, входящих в группы MIRU-VNTR-2 (SCG-3) и MIRU-VNTR-3b (SCG-6). По данным секвенирования 89 генов М. tuberculosis [Comas I. et al., 2009] и секвенирования генов системы 3R [Vultos Т. et al., 2008], штаммы, имеющие сполиготипы, принадлежащие к семейству Т, также находятся на разных эволюционных ветвях. Кроме того, только при анализе изолятов, принадлежащих к сполигосемейству Beijing, нами были обнаружены закономерности, согласно которым, изоляты, имеющие один сполиготип, формировали самостоятельные ветви на дендрограмме, построенной на основании анализа 35 локусов MIRU-VNTR. При анализе клинических изолятов, относящихся к другим сполигосемействам, такие однозначные закономерности обнаружены не были. Даже при анализе кластера, состоящего из 55 изолятов, имеющих одинаковый профиль MIRU-VNTR по данным анализа 35 локусов, обнаружено четыре различных сполиготипа -777477607760771, 775740003760771, 777777607760771 и 7774000000760771, относящихся к разным сполигосемействам (LAM 9, TI, LAM9 и Т1, соответственно). Такие закономерности свидетельствуют о том, что в области прямых повторов происходит конвергентная эволюция, связанная либо со встраиванием инсерционного элемента IS61J0, либо с делециями, приводящими к утрате уникальных участков в этой области. Вероятно, у штаммов, принадлежащих к семейству Beijing, такие перестройки случаются редко и являются необратимыми, что обусловлено редукцией области прямых повторов. Эти данные позволяют заключить, что анализ точечных мутаций является наиболее надёжным методом для установления принадлежности штаммов М. tuberculosis к индивидуальным филогенетическим линиям.

Сопоставление данных, полученных при анализе клинических изоля-тов М. tuberculosis методами MIRU-VNTR и RFLP-IS6770, позволяет сделать заключение, что при дифференциации близкородственных штаммов метод RFLP-IS6//0 имеет преимущество, так как в результате его использования близкородственные изоляты формируют кластеры меньшего размера. Однако тот факт, что в нескольких случаях обнаружено совпадение профилей RFLP-IS6110 у изолятов, относящихся к разным SCG и сполигосемействам, указывает на невозможность его использования в качестве основного метода гено-типирования штаммов М. tuberculosis.

Рисунок 5 - Алгоритм генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis

Мы предлагаем алгоритм генотипирования (рис. 5), включающий в качестве основных методов анализ штаммов методом MIRU-VNTR и анализ точечных мутаций, позволяющий выявить принадлежность изолята к конкретной SCG. Оба этих метода основаны на использовании полимеразной цепной реакции и анализе ампликонов в агарозном геле, что требует наличия минимальной приборной базы. При необходимости дифференцирования близкородственных штаммов в качестве дополнительного метода генотипирования может быть использован метод RFLP-IS5770.

Рисунок 6 - Группы клинических изолятов М. tuberculosis, обнаруженные на дендрограмме, построенной на основанной данных MIRU-VNTR

Выводы.

1. Подобраны условия проведения анализа, позволяющие тестировать 35 локусов MIRU-VNTR, в том числе локусов, обладающих наибольшим полиморфизмом.

2. Показано, что клинические изоляты М. tuberculosis, выделенные от пациентов г. Тулы, распределились между SNP группами следующим образом: SCG-2 - 33,7%, SCG-3 -14,1%, SCG-5 - 43,6% и SCG-6 - 8,6%.

3. Подтверждена самостоятельность филогенетических линий SCG-4, SCG-5 и SCG-6 М. tuberculosis.

4. Установлено, что все основные ветви дендрограммы, построенной для клинических изолятов М. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.) на основании результатов анализа 35 локусов MIRU-VNTR, соответствуют геногруп-пам, определённым на основании анализа точечных мутаций.

5. Выявлено, что клинические изоляты М. tuberculosis (г. Тула, 20012002 г.), принадлежащие к сполнгосемействам Beijing, Haarlem и LAM, относятся к кластерным группам SCG-2, SCG-3 и SCG-5, соответственно, в то время как изоляты, принадлежащие к сполнгосемейству Т, относятся к трём различным кластерным группам - SCG-3, SCG-5 и SCG-

6.

6. Показано, что совместное использование методов MIRU-VNTR и SNP позволяет проводить генетическую дифференциацию изолятов М. tuberculosis и определять их принадлежность к отдельным филогенетическим линиям.

7. Установлено, что метод MIRU-VNTR обладает преимуществом перед методом RFLP-IS6//0 при выявлении изолятов М. tuberculosis, принадлежащих к одной клоналыюй линии, в то время как метод RFLP-IS6//0 обладает большей разрешающей способностью при анализе близкородственных изолятов М. tuberculosis.

8. Показано, что для клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к кластерным группам SCG-2 и SCG-5, характерны различные мутации, приводящие к формированию лекарственной устойчивости.

Публикации по теме диссертации.

1. Богун А.Г., Майская Н. В., Онасенко А.Г., Степаншина В. Н., Шемякин И.Г. Характеристика мутаций гена рпсА в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis, выделенных в Российской Федерации. Сборник тезисов. " Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита "Группы восьми" и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств", Материалы VII межгосударственной научно-практической конференции. Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г., с. 88

2. Shemyakin I., Stepanshina V., Blagodatskikh S.A., Nizova A.V., Bogun A.G. Characteristics of M. tuberculosis isolates recovered in Central Russia. Abstract Book. 28111 Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, July 1-4,2007, Athens, Greece. P. 138.

3. Низова A.B., Степаншина B.H., Майская H.B., Богун А.Г., Майорова A.A., Шемякин И.Г. Анализ устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда Л Эпидемиология и инфекционные болезни.-2007.-4.-С. 7-11.

4. Shemyakin I., Nizova А., Maiskaya N., Bogun A., Maiorova A., Stepanshina V. Drug resistance profile of M. tuberculosis strains isolated in central Russia. Abstract Book. 38lh World Conference on lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases (The Union). Cape Town, South Africa 8-12 November 2007, SI73.

5. Низова A.B., Степаншина В Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразинамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Сборник тезисов конференции "Молекулярная диагностика - 2007" (28-30 ноября 2007 год). С. 43-44.

6. Богун А.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Применение метода MIRU-VNTR для анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis. Сборник тезисов конференции "Молекулярная диагностика - 2007" (28-30 ноября 2007 год). С. 63-64.

7. Богун А.Г., Майская Н.В., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Оптимизация метода MIRU-VNTR для анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Биотехнология - 2008. -4. - 80-86.

8. Низова A.B., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразинамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis J'/Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. - 4. - С. 23-36.

9. Богун А.Г., Шемякин И.Г., Степаншина В.Н. Комплексное исследование клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis люлекулярно-генетическими методами. Материалы конференции Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека "Биологическая безопасность в современном мире" (21-22 апреля 2009, ФГУН ГНЦПМБ, Оболенск). С. 47-49.

Подписано в печать:

03.11.2010

Заказ № 4449 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богун, Александр Геннадьевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Методы генотипирования микроорганизмов

1.2 Генотипирование микобактерий туберкулёзного комплекса

1.2.1 Сполиготипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.2 ПДРФ-18б)//0 генотипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.3 MIRU-VNTR генотипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.4 SNP генотипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.5 Анализ геномных делеций как метод генотипирования штаммов М. tuberculosis

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные культуры

2.2 Питательные среды.

2.3 Определение видовой принадлежности клинических бактериальных культур.

2.4 Выделение хромосомной ДНК

2.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом MIRU-VNTR.

2.5.1 Полимеразная цепная реакция

2.5.2 Определение числа повторов в MIRU-VNTR локусах

2.5.3 Оценка аллельного разнообразия MIRU-VNTR локусов

2.5.4 Оценка разнообразия генотипов

2.5.5 Филогенетический анализ клинических изолятов М. tuberculosis

2.6 Анализ точечных мутаций в геномах клинических изолятов М. tuberculosis

2.7 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом ПДРФ-1867/0.

2.8 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом сполиготипирования

2.8.1 Полимеразная цепная реакция

2.8.2 Гибридизация

2.8.3 Детекция

2.9 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis

2.9.1 Определение лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis in vitro

2.9.2 Изучение мутаций в генерпсА

2.9.3 Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость к лекарственным препаратам

Глава 3. Результаты

3.1 Подбор оптимальных условий для амплификации локусов MIRU-VNTR.

3.1.1 Оценка влияния концентрации MgCb на ПЦР

3.1.2 Изучение влияния дополнительных компонентов на ПЦР

3.1.3 Подбор температурных и временных параметров реакции

3.2 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом MIRU-VNTR

3.3 Анализ сполигопаттернов клинических изолятов

М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

3.4 Анализ результатов SNP-типирования клинических изолятов

М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

3.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом ПДРФ

3.6 Сравнение данных, полученных при генотипировании клинических изолятов М. tuberculosis разными методами

3.6.1 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosisi методами MIRU-VNTR и SNP

3.6.2 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами MIRU-VNTR и сполиготипирования

3.6.3 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами MIRU-VNTR и ПДРФ-IStf /10.

3.6.3.1 Эффективность дифференциации клинических изолятов М. tuberculosis, кластеризованных методом MIRU-VNTR, при анализе их методом ПДРФ-IS

3.6.3.2 Эффективность дифференциации клинических изолятов М. tuberculosis, кластеризованных методом ПДРФ-IS(57 7 0, при анализе их мeтoдoм'MIRU-VNTR

3.6.4 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами

SNP и ПДРФ-18<5770.

3.6.5 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами

SNP и сполиготипирования

3.7 Исследование особенностей использования различных наборов локусов MIRU-VNTR и способов построения дендрограмм генетического родства для филогенетического анализа изолятов М. tuberculosis

3.8 Лекарственная устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis

3.8.1 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR

3.8.2 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов

M. tuberculosis группы MIRU-VNTR

3.8.3 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М tuberculosis группы MIRU-VNTR-3a

3.8.4 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR-3b

3.8.5 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR

3.8.6 Сравнение лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам

Глава 4. Обсуждение

4.1 Молекулярно-генетические характеристики клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

4.2 Особенности использования различных вариантов метода MIRU-VNTR, для анализа клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе Российской Федерации

4.3 Анализ принадлежности клинических изолятов М. tuberculosis к геногруппам, выявленным при сполиготипировании, MIRU-VNTR и SNP-типировании

4.4 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

4.5 Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость к лекарственным препаратам

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis"

В настоящее время туберкулёз является главным фактором инвалиди-зации и смертности во всём мире, имеющим бактериальную природу [9, 11, 13]. Эпидемия ВИЧ-инфекции во многих странах привела к значительному увеличению заболеваемости туберкулёзом [14], а увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к антибактериальным препаратам, создало дополнительные трудности при лечении данного заболевания [11, 15,52].

Существует множество работ, показывающих особенности циркуляции штаммов возбудителя туберкулёза в различных регионах мира [12, 37, 69, 75, 91]. Между населением отдельных регионов и субпопуляциями М. tuberculosis существуют длительные ассоциации, которые начали существенно изменяться в двадцатом веке в связи с усилением миграции и активизацией туристических и деловых поездок [47]. Невозможно изучать такие изменения, не имея четких критериев, позволяющих разграничивать разные группы М. tuberculosis. Многими исследователями показано, что популяци-онная структура микобактерий носит клональный характер [8, 126, 132, 141]. В настоящее время* для анализа микобактерий используется несколько методов генотипирования, но результаты, получаемые при этом, часто противоречат друг другу [50, 63, 85, 89, 129, 133].

Наиболее перспективной для филогенетического анализа многих микроорганизмов является классификация, основанная на использовании муль-тилокусного секвенирования для анализа точечных мутаций [77]. Так, например, успешно проводится межвидовая дифференциация нетуберкулёзных микобактерий на основании последовательности гена lóSrRNA [17]. Однако для эффективной дифференциации штаммов М. tuberculosis необходимо анализировать большое количество генов, ввиду того, что для микобактерий туберкулёзного комплекса характерен низкий уровень полиморфизма генома. В современных исследованиях при проведении филогенетического анализа штаммов секвенированию подвергается до 89 генов М. tuberculosis [44]. Необходимость определения последовательностей такого количества генов значительно усложняет процедуру анализа, что ограничивает применение муль-тилокусного секвенирования для генотипирования штаммов М. tuberculosis.

Классификация микобактерий, использующая метод SNP, основана на анализе полиморфизма нуклеотидов, обнаруженных в разных участках генома [57, 68]. Данная классификация была разработана в результате полногеномного секвенирования штаммов М. tuberculosis H37Rv, 1551, 210 и штамма Mycobacterium bovis AF2122/97. Определение точечных мутаций в исследуемых штаммах в данном случае проводится с применением аллель-специфичной ПНР [72]. Этот метод сравнительно прост в использовании, но имеет низкую разрешающую способность и не позволяет проводить эффективную дифференциацию клинических штаммов. Кроме того, по мнению ряда авторов [63], филогенетическая схема, построенная на основании SNP-типирования, не полностью отражает. особенности эволюции возбудителя туберкулёза. Это происходит из-за того, что выбор детектируемых точечных мутаций был проведён лишь на основании сравнения ДНК штаммов, для которых известна последовательность всего генома, а такой подход заведомо предполагает, что максимальное число обнаруживаемых различий будет равно числу различий между эталонными штаммами (штаммами с секвени-рованными геномами). При проведении данного анализа невозможно выявить генетические модификации, появившиеся в эволюционно более молодых штаммах. Кроме того, штаммы М. tuberculosis CDC1551 и H37Rv, использованные для обнаружения полиморфных нуклеотидов, являются филогенетически близкими, так как относятся к Европейско-Американскому семейству. Это может приводить к искусственному разделению данного семейства на две эволюционные ветви, что противоречит данным, полученным на основании анализа геномных делеций. Также невозможно выявить ранее неизвестные подгруппы М. tuberculosis только на основании SNP-анализа с помощью аллель-специфичной ПЦР, так как в данном методе используется небольшое число горячих точек, которые являются полиморфными у изученных штаммов, но могут не отражать полиморфизма, присущего другим штаммам. Методы генетического анализа, традиционно используемые для идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса, такие как ПДРФ-IS6110, сполиготипирование и MIRU-VNTR [23, 113], также, по ряду причин, не являются совершенными.

Для практического здравоохранения важной задачей является быстрое обнаружение штаммов М. tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, а также выявление источников и путей распространения таких штаммов [106, 109]. Наибольшим потенциалом для этих исследований обладают молекулярно-генетические методы, основанные на полимеразной цепной реакции, поскольку они позволяют быстро проводить анализ с использованием небольшого количества анализируемой бактериальной культуры [4, 6, 21].

Эффективный мониторинг штаммов М. tuberculosis и оперативный обмен информацией между разными лабораториями невозможен без единой системы идентификации. Так как в настоящее время ни один из существующих методов генотипирования штаммов М. tuberculosis не удовлетворяет всем требованиям, то возникает необходимость разработки комплексного подхода, основанного на использовании оптимальной комбинации методов.

Актуальность. Актуальность работы определяется тем, что в настоящее время отсутствует алгоритм генетической идентификации штаммов М. tuberculosis, удовлетворяющий всем необходимым требованиям. Такой алгоритм должен базироваться на методах, использующих для анализа небольшое количество тестируемого материала, обладающих высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, и, кроме того, позволять легко сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.

Цель данной работы - комплексное исследование клинических изо-лятов М. tuberculosis молекулярно-биологическими методами, широко использующимися в настоящее время для генетической идентификации возбудителя туберкулёза, и выявление закономерностей между данными, полученными при использовании этих методов.

Задачи исследования:

1. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом сполиготи-пирования.

2. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом ПДРФ-Ш110.

3. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом MIRU-VNTR.

4. Определение принадлежности клинических изолятов М. tuberculosis к филогенетическим линиям на основании анализа точечных мутаций.

5.Изучение лекарственной устойчивости и мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам.

6. Анализ информативности разных методов генотипирования М. tuberculosis и выявление взаимосвязей между данными, полученными в результате их использования.

Научная новизна результатов. Впервые проведён анализ клинических изолятов М. tuberculosis с помощью метода MIRU-VNTR, основанного на анализе 35 локусов. Впервые проведён анализ большой выборки клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ с использованием четырёх методов генотипирования - ПДРФ-18б/70, SNP, сполиготипирования и MIRU-VNTR. Впервые показано полное соответствие между геногруппами, выявленными на основании данных, полученных с помощью методов MIRU-VNTR и SNP-типирования.

Практическая значимость работы. Полученные данные о генотипи-ческих особенностях клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, необходимы для разработки эффективной системы мониторинга возбудителя туберкулёза. Разработан алгоритм генотипиро-вания клинических изолятов М. tuberculosis, основанный на анализе точечных мутаций и результатов MIRU-VNTR, позволяющий выявлять источник и отслеживать пути распространения штаммов, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью, среди пациентов лечебных учреждений. Кроме того, использование данного подхода делает возможным установление принадлежности изолята к большим филогенетическим группам, что позволяет отслеживать распространение штаммов из других регионов. Особенностью данного подхода является возможность быстрого сравнения и обработки данных, полученных в разных лабораториях.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработан вариант метода MIRU-VNTR, основанный на анализе 35 ло-кусов в геноме туберкулезного микроба.

2. Разработан алгоритм генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis, включающий анализ 35 локусов MIRU-VNTR и SNP-типирование, позволяющий проводить эффективную межштаммовую дифференциацию и определять принадлежность штаммов к филогенетической линии.

3. Использование разработанного алгоритма позволяет выявлять филогенетические связи между штаммами, обладающими лекарственной устойчивостью.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе три печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и 9 приложений.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Богун, Александр Геннадьевич

Выводы

1. Подобраны условия проведения анализа, позволяющие тестировать 35 ло-кусов MIRU-VNTR, в том числе локусов, обладающих наибольшим полиморфизмом.

2. Показано, что клинические изоляты М. tuberculosis, выделенные от пациентов г. Тулы, распределились между SNP группами следующим образом: SCG-2 - 33,7%, SCG-3 - 14,1%, SCG-5 - 43,6% и SCG-6 - 8,6%.

3. Подтверждена самостоятельность филогенетических линий SCG-4, SCG-5 и SCG-6 М. tuberculosis.

4. Установлено, что все основные ветви дендрограммы, построенной для клинических изолятов М. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.) на основании результатов анализа 35 локусов MIRU-VNTR, однозначно отождествлены с ге-ногруппами, определёнными на основании анализа точечных мутаций.

5. Выявлено, что клинические изоляты М. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.), принадлежащие к сполигосемействам Beijing, Haarlem и LAM, относятся к кластерным группам SCG-2, SCG-3 и SCG-5 соответственно, в то время, как изоляты, принадлежащие к сполигосемейству Т, относятся к трём различным кластерным группам - SCG-3, SCG-5 и SCG-6.

6. Показано, что совместное использование методов MIRU-VNTR и SNP позволяет проводить межштаммовую дифференциацию М. tuberculosis и определять принадлежность изолятов к отдельным филогенетическим линиям.

7. Установлено, что метод MIRU-VNTR обладает преимуществом перед методом ПДРФ-18£>770 при выявлении изолятов М. tuberculosis, принадлежащих к одной клональной линии, в то время как метод ПДРФ-lSóJJO обладает большей разрешающей способностью при анализе близкородственных изолятов М. tuberculosis.

8. Показано, что для клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к кластерным группам SCG-2 и SCG-5, характерны различные мутации, приводящие к формированию лекарственной устойчивости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богун, Александр Геннадьевич, Оболенск

1. Приказ № 558, от 8 июня 1978 г. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулёзе. Министерство Здравоохранения СССР.

2. Приказ № 109, МЗ РФ, от 21 марта 2003 г. "О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации".

3. Баранов А. А., Марьяндышев О. А. Применение методов молекулярной биологии для исследования микобактерий туберкулёза //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008. - № 4. - С.3-7.

4. Богун А. Г., Анисимова В. А., Степашина В. Н., Шемякин И. Г. Структура делеций, выявленных в геномах клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2007. -№12. - С.42-47.

5. Земскова 3. С., Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Ларионова Е. Е., Черноусова JI. Н. Экспериментальный туберкулёз, вызванный штаммами М. tuberculosis, генотипических кластеров W, AI и HD //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - № 3. - С.41-46.

6. Золотарёва JI. В., Шаханина И. Д., Золотых С. В. Эпидемиология и профилактика туберкулёза в пенитенциарных учреждениях Орловской области //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010. - № 1. — С.20-24.

7. Исакова Ж. Т. Распространённость и молекулярно-генетическая характеристика штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Кыргызской Республике //Эпидемиология и инфекционные болезни. -2008. №6. - С. 18-19.

8. Кисличкина А. А., Степаншина В. Н., Шемякин И. Г. Микобактериозы //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2009. -№5. - С.3-9.

9. Кононец А. С., Хорошилова Н. Е., Голубева Л. И. Туберкулёз лёгких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя к основным и резервным препаратам //Эпидемиология и инфекционные болезни. -2010. — №1. — С.24-29.

10. Корнилова 3. X., Луконина И. В., Алексеева Л. П. Туберкулёз в сочетании с ВИЧ-инфекцией //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - №3. -С.3-9.

11. Крапина Н. Л., Коссий Ю. Е., Фёдорова В. И., Абдулаев Р. Ю., Комиссарова О. Г. Эфферентная терапия в лечении больных туберкулёзомлёгких с лекарственной устойчивостью микобактерий //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - №3. - С.28-33.

12. Майорова А. А., Степаншина В. Н., Шемякин И. Г. Микобактерии -общая характеристика и таксономия //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. -№ 11.- 2008. С.3-7.

13. Маркелов Ю. М., Нарвская О. В. Циркуляция штаммов возбудителя туберкулёза с множественной лекарственной устойчивостью на территории Республики Карелия //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. -№2. - С.54-56.

14. Салина Т. Ю., Морозова Т. И. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени в диагностике тубёркулёза лёгких //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008. - № 6. - С. 12-18.

15. Стамболцян Е. П., Сафарян М. Д., Улумян А. К. Эпидемиология, клиническая структура и исходы туберкулёзного менингита в Армении //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - №2. - С. 20-23.

16. Степаншина В. Н., Липин М. Ю., Дубилей С. А., Игнатова А. Н. Доминирующие генотипы штаммов Mycobacterium tuberculosis от заключённых в посёлке озерки //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2007. -№3. - С.27-33.

17. Черноусова J1. Н., Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Земскова 3. С., Ларионова Е. Е. Биологические свойства штаммов М. tuberculosis, кластера W //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008. - № 10.1. C.45-50.

18. Achtman M. Evolution, Population Structure, and Phylogeography of Genetically Monomorphic Bacterial Pathogens //Annual Review of Microbiology. 2008. - Vol. 62. - p.53-70.

19. Alland, D., Whittam T. S., Murray M. В., Cave M. D., Hazbon M. H., Dix К., Kokoris M., Duesterhoeft A., Eisen J. A., Fraser С. M., Fleischmann R.

20. D. Modeling bacterial evolution with comparative-genome-based markersystems: application to Mycobacterium tuberculosis evolution and pathogenesis //Journal of Bacteriology. 2003. - Vol. 185. - p.3392-3399.

21. Allix C., Supply P., Fauville-Dufaux M. Utility of Fast Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tandem Repeat Genotyping in Clinical Mycobacteriological Analysis //Clinical Infectious Diseases. -2004. Vol. 39. - p.783-789.

22. Andersson D. I., Levin B. R. The biological cost of antibiotic resistance //Current Opinion in Microbiology. 1999. - Vol. 2. - p.489-493.

23. Baker L., Brown T., Maiden M. C., Drobniewski F. Silent nucleotide polymorphisms and a phylogeny for Mycobacterium tuberculosis //Emerging Infectious Disease. -2004. Vol. 10. - p. 1568-1577.

24. Caws M., Thwaites G., Dunstan S., Hawn T. R., Lan N. T. N., Thuong N. T. T., Stepniewska K., Huyen M. N. T., Bang N. D., Loc T. H., Gagneux S., van Soolingen D., Kremer K., van der Sande M., Small P., Anh P. T. H.,

25. Cohen T., Colijn C., Murray M. Modeling the effects of strain diversity and mechanisms of strain competition on the potential performance of new tuberculosis vaccines //PNAS. 2008. - Vol. 105. - p.16302-16307.

26. Comas I., Gagneux S. The Past and Future of Tuberculosis Research //PLoS Pathogens. 2009. - Vol.5. - Issue 10. - el000600.

27. Comas I., Homolka S., Neiman S., Gagneux S. Genotyping of Genetically Monomorphic Bacteria: DNA Sequencing in Mycobacterium tuberculosis Highlights the Limitations of Current Methodologies //PLoS ONE. 2009. -Vol.4.-Issue 11. -e7815.

28. Cox H. S., Kubica T., Doshetov D., Kebede Y., Rüsch-Gerdess S., Niemann S. The Beijing genotype and drug resistant tuberculosis in the Aral Sea region of Central Asia //BMC Respiratory Research. 2005. - 6. - 134.

29. Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H. Repetitive DNA sequences as probes for Mycobacterium tuberculosis //Journal of Clinical Microbiology. -1988.-Vol. 26. -p.2240-2245.

30. Ernst J. D., Lewinsohnb D. M., Beharc S., Blythed M., Schlesingere L. S., Kornfeldf H., Setteg A. Meeting Report: NIH Workshop on the Tuberculosis Immune Epitope Database //Tuberculosis (Edinb). 2008. - Vol. 88. -p.366-370.

31. Fitzgerald J. R., Musser J. M. Evolutionary genomics of pathogenic bacteria //TRENDS in Microbiology. -2001. Vol. 9. -p.547-553.

32. R., Jr., Venter J. C., and Fräser C. M. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains //Journal of Bacteriology. 2002. - Vol. 184. - p.5479-5490.

33. Frothingham R., Meeker-O'Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats//Microbiology. 1998. - Vol. 144.-p.l 189-1196.

34. Gagneux S., Long C. D., Small P. M., Van T., Schoolnik G. K., Bohannan B. J. M. The Competitive Cost of Antibiotic Resistance in Mycobacterium tuberculosis //Science. 2006. - Vol. 312. - p. 1944-1946.

35. Gagneux S., Small P. M. Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development //Lancet Infection Diseases. 2007. - Vol. 7. - p.328-337.

36. Hatfull G. F., Jacobs W. R. Molecular Genetics of Mycobacteria. ASM Press. - Washington, D.C. - 2000. - 363 p.

37. Hazbon M. H., Alland D. Hairpin Primers for Simplified Single-Nucleotide Polymorphism Analysis of Mycobacterium tuberculosis and Other Organisms //Journal of Clinical Microbiology. 2004. - Vol. 42. - p.1236-1242.

38. Hazbon M. H., Motiwala A. S., Cavatore M., Brimacombe M., Whittam T. S., Alland D. Convergent Evolutionary Analysis Identifies Significant Mutations in Drug Resistance Targets of Mycobacterium tuberculosis

39. Animicrobial Agents and Chemotherapy. 2008. - Vol. 52. - p.3369-3376.

40. Heidelberg J. F., Nelson W. C., Schoenfeld T., Bhaya D. Germ Warfare in a Microbial Mat Community: CRISPRs Provide Insights into the Co-Evolution of Host and Viral Genomes //PLoS ONE. 2009. - Vol.4. - Issue 1. - e4169.

41. Iwamoto T., Fujiyama R., Yoshida S., Wada T., Shirai C., Kawakami Y. 2009. Population Structure Dynamics of Mycobacterium tuberculosis Beijing Strains during Past Decades in Japan //Journal of Clinical Microbiology. 2009. - Vol. 47. - p.3340-3343.

42. Jassal M., Bishai W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis //Lancet Infectious Diseases. -2009. Vol. 9. - p. 19-30.

43. Le Fleche P., Fabre M., Denoeud F., Koeck J. L., Vergnaud G. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacterium tuberculosiscomplex based on tandem repeat typing //BMC Microbiology. 2002. - 2. -37.

44. Maisnier-Patin S., Andersson D. I. Adaptation to the deleterious effects of antimicrobial drug resistance mutations by compensatory evolution //Research in Microbiology. 2004. - Vol. 155. - p.360-369.

45. Michener C. D., Sokal R. R. A quantitative approach to a problem in classification//Evolution. 1957.-Vol. 11.-p. 130-162.

46. Murase Y., Mitarai S., Sugawara I., Kato S., Maeda S. Promising loci of variable numbers of tandem repeats for typing Beijing family Mycobacterium tuberculosis //Journal of Medical Microbiology. 2008. - Vol. 57. - p.873-880.

47. Nei M., Maruyama T., Wu C. I. Models of Evolution of Reproductive Isolation//Genetics. 1983.-Vol. 103. - p.557-579.

48. Nei M., Tajima F., Tateno Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data //Journal of Molecular Evolution. -1983.-Vol. 19. -p.153-170.

49. Nei M., Stephens J. C., Saitou N. Methods for Computing the Standard Errors of Branching Points in an Evolutionary Tree and Their Application to Molecular Data from Humans and Apes //Molecular Biology and Evolution. 1985.-Vol. 2. - p.66-85.

50. Nikolayevskyy V., Gopaul K., Balabanova Y., Brown T., Fedorin I., Drob-niewski F. Differentiation of Tuberculosis Strains in a Population with Mainly Beijing-family Strains //Emerging Infectious Diseases. 2006. -Vol. 12. -p.1406-1413.

51. Salamon H., Kato-Maeda M., Small P. M., Drenkow J., Gingeras T. R. Detection of Deleted Genomic DNA Using a Semiautomated Computational Analysis of GeneChip Data //Genome Research. 2000. - Vol. 10. -p.2044-2054.

52. Salmoniere Y.-O. L. G., Kim C. C., Tsolaki A. G., Pym A. S., Siegrist M. S., Small P. M. High-Throughput Method for Detecting Genomic-Deletion Polymorphisms //Journal of Clinical Microbiology. 2004. - Vol. 42. -p.2913-2918.

53. Scott A. N., Menzies D., Tannenbaum T.-N., Thibert L., Kozak R., Joseph L., Schwartzman K., Behr M. A. Sensitivities and Specificities of Spoligotyping and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number

54. Tandem Repeat Typing Methods for Studying Molecular Epidemiology of Tuberculosis //Journal of Clinical Microbiology. 2005. - Vol. 43. - p.89-94.

55. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis //Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - p.235-243.

56. Seiander R. K., Caugant D. A., Ochman H., Musser J. M., Gilmour M. N., Whittam T. S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics //Applied and Environmental Microbiology. 1986.-Vol. 51. -p.873-884.

57. Smittipat N., Palittapongarnpim P. Identification of possible loci of variable number of tandem repeats in Mycobacterium tuberculosis //Tubercle and Lung Disease. 2000. - Vol. 80. - p.69-74.

58. Stewart T. C., Eisenach K. D., McMurray D. N., Jacobs W. R. J., Tuberculosis and Tubercle Bacillus. ASM PRESS. - Washington, DC. 2005. - 5841. P

59. Supply P., Mazars E., Lesjean S., Vincent V., Gicquel B., Locht C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome //Molecular Microbiology. 2000. - Vol. 36. - p.762 -771.

60. Proposal for Standardization of Optimized Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit—Variable-Number Tandem Repeat Typing of Mycobacterium tuberculosis //Journal of Clinical Microbiology. 2006. - Vol. 44. - p. 4498—4510.

61. Thierry D., Cave M. D., Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H., Gicquel

62. B., Guesdon J. L. \S6110, an IS-like element of Mycobacterusm tuberculosis complex //Nucleic Acids Research. 1990. - Vol. 18. - p.188.

63. Vultos T. D., Mestre O., Rauzier J., Golec M., Rastogi N., Rasolofo V., Tonjum T., Sola C., Matic I., Gicque B. Evolution and Diversity of Clonal Bacteria: The Paradigm of Mycobacterium tuberculosis //PLoS ONE. -2008. 3. - el538.

64. Wada T., Maeda S., Hase A., Kobayashi K. Evaluation of variable numbers of tandem repeat as molecular epidemiological markers of Mycobacterium tuberculosis in Japan //Journal of Medical Microbiology. — 2007. Vol. 56. -p.1052-1057.

65. LAM9 777477607760771 5 811 Т1 774000000760771 58

66. LAM9 777477607760771 5 807 Т1 775740003760771 5 803 LAM9 777477607760771 5 785 LAM9 777477607760771 5-802 LAM9 777477607760771 51 '-711.I-- 779 LAI

67. LAM 777600000060771 5 779 LAM9 777477607760771 5

68. LAM9 407777607760771 5 939 LAM9 003777607760771 51125 LAM 777763007760771 5 19 777777207760771 5 -f 1063 U 777777600000000 5

69. T1 777777777760771 6 1100X770000737760751 6 870 T1 777777777760771 6

70. Г 941T1 777777777760771 6 940 T1 777777777760771 6 846 T4 777777377760771 6-922 T1 777777777760771 6

71. T 777775077760771 6 "963 T1 777777777760771 6-• 881 T3 377737777760771 6- 1057 T1 777777777760771 6

72. Haarlem4 774777777420771 3 816 Haarlem4 774777777420771 3---983 Haarlem 760377777420771 3

73. Haarlem 760377777420771 3 -■ 896 Haarlem4 674777377420771 3980 Haarlem 777677777420771 3ra

74. Няяг!ят4 777737777420771 31096 Haarlem4 777777777420771 3-850 HaarlerrvJ 777777777420771 3

75. Haar1em4 777777777420771 3 771 Haaflem4 777777777420771 3ь0.0SН