Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидных микрочипах для видовой идентификации микроорганизмов и определение их лекарственной чувствительности

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грядунов, Дмитрий Александрович

Используемые сокращения.

Введение

2. Литературный обзор.

2.1. Амплификационные технологии на олигонуклеотидных микрочипах и их применение

2.1.1. Мультиплексная ПЦР и альтернативные методы амплификации ДНК мишени.

2.1.2. Флуоресцентное мечение исследуемых образцов.

2.1.3. Гибридизация на олигонуклеотидном микрочипе. Эффективность и специфичность процесса.

2.1.4. Ферментативные реакции на микрочипах.

2.2. Молекулярная диагностика микобактерий.

2.2.1. Обнаружение микобактерий в клинических образцах.

2.2.2. Видовая идентификация микобактерий в клинических изолятах.

2.2.3. Генетические детерминанты устойчивости штаммов М. tuberculosis к антибиотикам.

2.2.4. Методы выявления мутаций, приводящих к устойчивости М. tuberculosis к химиопрепаратам.

2.3. Генетические детерминанты патогенности и молекулярная диагностика возбудителя сибирской язвы Bacillus, anthracis.

3. Методы.

3.1. Олигонуклеотиды.

3.2. Приготовление микрочипов методом нанесения раствора олигонуклеотида на микроматрицу.

3.3. Приготовление микрочипов методом сополимеризации.

3.4. Подготовка образцов ДНК для проведения ПЦР.

3.4.1. Подготовка ДНК для ПЦР из культур штаммов М tuberculosis.

3.4.2. Подготовка ДНК для ПЦР из клинического образца.

3.4.3. Выделение ДНК из вегетативных клеток В. cereus и В. thuringiensis.

3.5. ЛДР на олигонуклеотидном микрочипе.

3.5.1. Подготовка ДНК-матрицы для проведения ЛДР на микрочипе.

3.5.2. Проведение ЛДР на микрочипе.

3.6. ПЦР на олигонуклеотидном микрочипе.

3.6.1. Проведение аллель-специфичной ПЦР на чипе с целью обнаружения мутаций в гене rpoB М. tuberculosis.

3.6.2. Проведение мультиплексной ПЦР на чипе ПЦР на микрочипе с целью видовой идентификации микобактерий и обнаружения точечных мутаций в генах rpoB, katG, inhA, ahpC М. tuberculosis.

3.6.3. Проведение мультиплексной ПЦР на чипе с целью детекции генов токсинообразования В. anthracis, специфических последовательностей и нуклеотидного полиморфизма в генах 16S и 23 S рРНК.

3.6.4. Проведение мультиплексной ПЦР на микрочипе с целью детекции генов токсинообразования В. anthracis, Yersinia pestis и микроорганизмов рода Brucella, а также специфических последовательностей в генах рРНК.

3.7. Секвенирование ДНК.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Разработка метода аллель-специфичной ПЦР на олигонуклеотидных микрочипах.

4.1.1. Определение алгоритма выбора праймеров в ПЦР на микрочипе.

4.1.2. Выбор ДНК-полимеразы.

4.1.3. Влияние удаленности олигонуклеотидов от поверхности геля.

4.1.4. Определение оптимального соотношения праймеров в реакционной смеси.

4.1.5. Введение флуоресцентной метки в исследуемые образцы.

4.1.6. Влияние геля на эффективность ПЦР.

4.1.7. Регистрация результатов анализа.

4.1.8. Оптимизация температурно-временного режима реакции.

4.1.9. Влияние поверхностной сорбции на чувствительность метода.

4.2. Разработка метода обнаружения мутаций в гене гроВ методом ПЦР на олигонуклеотидном микрочипе.

4.2.1. Обнаружение мутаций в гене гроВ на микрочипах, изготовленных методом сополимеризации.

4.3. Анализ смесей ДНК дикого типа и мутантных вариантов с использованием ферментативных методов на микрочипе.

4.4. Видовая идентификация микобактерий и одновременное обнаружение устойчивых к рифампицину и изониазиду штаммов М. tuberculosis методом мультиплексной ПЦР на микрочипе.

4.5. Разработка метода обнаружения В. anthracis методом мультиплексной ПЦР на микрочипе.

4.6. Разработка метода мультиплексной ПЦР на микрочипе для обнаружения В. anthracis, Yersinia pestis, Brucella sp.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидных микрочипах для видовой идентификации микроорганизмов и определение их лекарственной чувствительности"

Ускоренная идентификация возбудителей инфекционных заболеваний, требовательных к условиям культивирования или находящихся в количествах за пределами чувствительности стандартных диагностических методов, быстрое определение чувствительности микроорганизмов к лекарственным препаратам и их вирулентных свойств требуют дальнейшего развития надежных высокочувствительных методов идентификации.

Одним из перспективных направлений является разработка методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют не только решить перечисленные задачи, но и могут быть использованы для генотипирования микроорганизмов и вирусов, идентификации геномного полиморфизма, ранней диагностики наследственных заболеваний.

Существующие методы ПЦР, как правило, способны определять наличие одного или нескольких локусов в геноме изучаемого объекта, а также их изменения. При необходимости параллельного анализа большого количества фрагментов одного генома или целого ряда геномов представляется целесообразным разработка методов ПЦР на биологических микрочипах. Пространственное разделение (разобщение) праймеров в ячейках биочипа позволяет использовать десятки и сотни различных праймеров в одной реакции и, следовательно, значительно увеличить количество мишеней, идентифицируемых одновременно.

За последние несколько лет было предложено несколько решений, позволяющих проводить полимеразную цепную реакцию непосредственно на ДНК-микрочипах. Однако, как правило, такие подходы находятся в стадии разработки, либо имеют ряд существенных ограничений. Это связано как с низкой эффективностью реакции, обусловленной сорбцией компонентов реакционной смеси на твердой фазе, так и необходимостью создания надежной процедуры регистрации продуктов реакции на чипе.

Применение микрочипов с олигонуклеотидами, иммобилизованными в гелевых элементах, позволяет преодолеть ряд проблем, возникающих при проведении ПЦР в твердой фазе. Использование полиакриламидного геля дает возможность проводить эффективную амплификацию в двухфазной системе. Создание специальной установки, состоящей из оргинального мини-амплификатора, флуоресцентного микроскопа, оснащенного CCD-камерой, позволило контролировать ход реакции в реальном времени.

С целью апробации метода был создан микрочип, позволяющий проводить видовую идентификацию микобактерий и определять устойчивость Mycobacterium tuberculosis к двум антимикобактериальным препаратам первого ряда, рифампицину и изониазиду. Сочетание мультиплексной ПЦР со специфическими праймерами с аллель-специфичной амплификацией демонстрирует возможность одновременной детекции генов, кодирующих диагностически важные белки, и минорного полиморфизма в генах, детерминирующих синтез рРНК.

2. Литобзор.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Грядунов, Дмитрий Александрович

Выводы.

1. Разработан метод аллель-специфичной ПЦР на олигонуклеотидном микрочипе для выявления точечных мутаций в гене rpoB М. tuberculosis, приводящих к устойчивости микроорганизма к рифампицину. Чувствительность метода составила 104 копий микобактериальной ДНК, время проведения анализа -1.5 часа.

2. Разработан вариант лигазной детектирующей реакции на олигонуклеотидном микрочипе для анализа смесей ДНК с низким содержанием (менее 10%) мутантной последовательности на фоне последовательности дикого типа.

3. Разработан метод мультиплексной аллель-специфичной ПЦР на микрочипе, позволяющий одновременно проводить видовую идентификацию микобактерий и определять устойчивость М. tuberculosis к двум антибиотикам первого ряда. Метод позволяет выявлять 95% рифампицин- и 80% изониазид-устойчивых штаммов М. tuberculosis.

4. Предложено комплексное применение ПЦР со специфическими и аллель-специфичными праймерами на олигонуклеотидном микрочипе для обнаружения патогенных штаммов В. anthracis и дифференциации от вакцинных штаммов и близкородственных видов В. cereus и В. thuringiensis.

5. Продемонстрирован высокий потенциал мультипраймерной системы ПЦР на олигонуклеотидном микрочипе на примере разработки способа идентификации патогенных штаммов В. anthracis, Y. pestis, Brucella sp.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу свою глубокую благодарность моему научному руководителю Андрею Дарьевичу Мирзабекову. Я искренне признателен Владимиру Михайловичу, Александру Соболеву и Сергею Лапе за помощь в работе и ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Борису Стрижкову, моему наставнику в освоении метода ПЦР на микрочипах, Алле Рубиной, Сергею Панькову, Ольге Дябиной, Валентине Владимировне Чупеевой, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину - за подготовку микрочипов для проведения экспериментов, Сергею Суржикову за синтез олигонуклеотидов, Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грядунов, Дмитрий Александрович, Москва

1. USAMRIID's Medical Management of Biological Casualties Handbook. Fourth edition. February 2001. U.S. Army medical research institute of infectious diseases. Fort Detrick. Frederick, Maryland.

2. Adams CP and Kron SJ: Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support. US PTO 1997, US 5,641,658.

3. Arenkov, P., Kukhtin, A., Gemmell, A., Chupeeva, V., Voloschuk, S., and Mirzabekov, A., 2000. Protein microchips: Use for immunoassay and enzymatic reactions. Anal. Biochem. 278, 123-131.

4. Belgrader P, Marino M, Lubin M and Barany F: A multiplex PCR -ligase detection reaction assay for human identity testing. Genome Sci Technol 1996, 1: 77—87.

5. Belgrader P., S Young, В Yuan, M Primeau, LA Christel, F Pourahmadi, and MA Northrup. A Battery-Powered Notebook Thermal Cycler for Rapid Multiplex Real-Time PCR Analysis. Analytical Chemistry, 13, 286-289, 2001.

6. Bernardi, L., G. Vitale, C. Montecucco, and A. Musacchio. 2000. Expression, crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of recombinant Bacillus anthracis lethal factor. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 56:1449-1451.

7. Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Ferrie R, Newton С and Little S: The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res 1997, 25: 3235—3241.

8. Case-Green SC, Mir KU, Pritchard CE and Southern EM: Analysing genetic information with DNA arrays. Curr Opin Chem Biol 1998, 2: 404—410.

9. Chen J, Iannone MA, Li M-S, Taylor JD, Rivers P, Nelsen AJ, Slentz-Kesler KA, Roses A and Weiner MP: A microsphere-based assay formultiplexed single nucleotide polymorphism analysis using single base chain extension. Genome Res 2000, 10: 549—557.

10. Chen X, Livak KJ and Kwok= PY: A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test. Genome Res 1998, 8: 549—556.

11. Cho RJ, Mindrinos M, Richards DR, Sapolsky RJ, Anderson M, Drenkard E, Dewdney J, Reuber TL, Stammers M. et al.: Genome-wide mapping with biallelic markers in Arabidopsis thaliana. Nat Genet 1999, 23: 203—207.

12. Collins FS, Guyer MS, Chakravarti A: Variations on a theme: cataloging human DNA sequence variation. Science 1997, 278: 1580—1581.

13. Collins FS, Patrinos A, Jordan E, Chakravarti A, Gesteland R, Walters L: New goals for the U.S. Human Genome Project 1998-2003. Science 1998, 282: 682—689.

14. Compton J. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification. Nature, 1991, 350: 91-92.

15. Cynthia L. K., David A. Rouse, and Sheldon L. Morris. Analysis of ahpC Gene Mutations in Isoniazid-Resistant Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial agents and chemotherapy, Sept. 1997, p. 2057-2058 Vol. 41, No. 9.

16. Daffonchio, D., Borin, S., Frova, G., Gallo, R., Mori, E., Fani, R., Sorlini, C. (1999). A Randomly Amplified Polymorphic DNA Marker Specific for the Bacillus cereus Group Is Diagnostic for Bacillus anthracis. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1298-1303

17. Dobner P, Riisch-Gerdes S, Bretzel G et al. Usefulness of Mycobacterium tuberculosis genomic mutations in the genes katG and inhA for the prediction of isoniazid resistance. Int J Tuberc Lung Dis 1997; 1: 365369.

18. Drobyshev A, Molodina N, Shik V, Pobedimskaya D, Yershov G, Mirzabekov A: Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of p-talassemia mutations. Gene 1997, 188: 45—52.

19. Dubiley S, Kirillov E & Mirzabekov A: Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucleic Acids Res 1999, 27: el9.

20. Edwards MC and Gibbs RA: Multiplex PCR: advantages, development and applications. PCR Methods Appl 1994, 3: S65—S75.

21. Elfath M. Elnifro, Ahmed M Ahshi, Robert J. Cooper,and Paul E. Klapper. Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology. Clin Microbiol Reviews Oct. 2000, p. 559-570 Vol 13, No. 4

22. Epshtein CB and Butow RA: Microarray technology—enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol 2000,11: 36—41.

23. E. Fahy, D.Y. Kwoh and T.R. Gingeras. Self-sustained Sequence Replication (3SR): An isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCR Methods and Applications, 1: 25-33.

24. Fan J-B, Chen X, Halushka MK, Berno A, Huang X, Ryder T, Lipshutz RJ, Lockhart DJ and Chakravarti A: Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res 2000, 10: 853—860.

25. Favis R, Day JP, Gerry NP, Phelan C, Narod S and Barany F: Universal DNA array detection of small insertions and deletions in BRCA1 and BRCA2. Nat Biotechnol 2000,18: 561—564.

26. Forman JE, Walton ID, Stern D, Rava RP and Trulson MO: Thermodynamics of duplex formation on photolithographically synthesized oligonucleotide arrays. ACS Symp Ser 1998 , 682: 206—228.

27. Gerold D, Rushmore T and Caskey CT: DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends Biochem Sci 1999, 24: 168—173.

28. Gerry NP, Witowski NE, Day J, Hammer RP, Barany G and Barany F: Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. JMol Biol 1999, 292: 251—262.

29. Gibson UE, Heid CA, Williams PM. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 1996 Oct;6(l0):995-l 001

30. Gilles PN, Wu DJ, Foster CB, Dillon PJ and Chanock SJ: Single nucleotide polymorphic discrimination by an electronic dot blot assay on semiconductor microchips. Nat Biotechnol 1999, 17: 365—370.

31. Grothues D, Cantor CR and Smith CL: PCR amplification of megabase DNA with tagged random primers (T-PCR). Nucleic Acids Res 1993, 21:1321—1322.

32. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SP and Collins FS: Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-color fluorescence analysis. Nat Genet 1996, 14: 441— 447.

33. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res 1996 0ct;6(10): 986-94

34. Martin Huber, Doris Losert, Reinhard Hiller, Christian Harwanegg, Manfred W. Mueller, and Wolfgang M. Schmidt: Detection of Single

35. Base Alterations in Genomic DNA by Solid Phase Polymerase Chain Reaction on Oligonucleotide Microarrays. Anal Biochem , 2001, p 1-7.

36. Haas W A, Schilke K, Brand J et al. Molecular analysis of katG gene mutations in strains of Mycobacterium tuberculosis complex from Africa. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1601-1603.

37. Isaksson A and Landegren U: Accessing genomic information: alternatives to PCR. Curr Opin Biotechnol 1999,10: 11—15.

38. Kuhn H, Demidov W, Frank-Kamenetskii MD. Rolling-circle amplification under topological constraints. Nucleic Acids Res 2002 Jan 15;30(2):574-80

39. Landegren U, Kaiser R, Sanders J, Hood L: A ligase-mediated gene detection technique. Science 1988, 241: 1077—1080.

40. Leone G, Schijndel H, Van Gemen B, Kramer FR and Schoen CD: Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous, real-time detection of RNA. Nucl Acids Res 1998, 26:2150—2155

41. Lipshutz RJ, Fodor SP, Gingeras TR and Lockhart DJ: High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet 1999, 21:20—24.

42. Lizardi PM, Huang X, Zhu Z, Bray-Ward P, Thomas DC and Ward DC: Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet 1998, 19: 225—232.

43. Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittman M, Wang C, Kobayashi M, Horton H, Brown EL: Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 1996, 14: 1675—1680.

44. Long GW, O'Brien T. Antibody-based systems for the detection of bacillus anthracis in environmental samples. J Appl Microbiol 1999 Aug;87(2):214

45. Marshall E: Drug firms to create public database of genetic mutations. Genomics 2000, 284: 406—407.

46. Moore DF, Curry JI. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by ligase chain reaction. J Clin Microbiol 1998 Apr;36(4): 1028-31

47. Nikiforov TT, Rendle RB, Goelet P, Rogers YH, Kotewicz ML, Anderson S, Trainor GL and Knapp MR: Genetic bit analysis: a solid phase method for typing single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res 1994, 22:4167—4175.

48. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC and Markham AF: Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 1989, 17: 2503—2516.

49. Pastinen T, Kurg A, Metspalu A, Peltonen L and Syvanen AC: Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays. Genome Res 1997, 7: 606—614.

50. Pastinen T, Raitio M, Lindroos K, Tainola P, Peltonen L, Syvanen AC: A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays. Genome Res 2000, 10: 1031—1042.

51. Pirrung MC, Connors RV, Odenbaugh AL, Montague-Smith MP, Walcott NG and Tollett JJ: The arrayed primer extension method for DNA microchip analysis. Molecular computation of satisfaction problems. J Am Chem Soc 2000, 122: 1873—1882.

52. Qi Y, Patra G, Liang X, Williams LE, Rose S, Redkar RJ, DelVecchio VG. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis. Appl Environ Microbiol 2001 Aug;67(8):3720-7.

53. Ramaswamy S., J. M. Musser. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tubercle and Lung Disease(1998) 79(1), 3-29

54. Reif TC, Johns M, Pillai SD, Carl M. Identification of capsule-forming Bacillus anthracis spores with the PCR and a novel dual-probe hybridization format. Appl Environ Microbiol 1994 May;60(5).T 622-5

55. Richter E, Niemann S, Rusch-Gerdes S, Hoffner S. Identification of Mycobacterium kansasii by using a DNA probe (AccuProbe) and molecular techniques. J. Clin Microbiol 1999 Apr;37(4):964-70

56. Rychlik, W: Selection of primers for polymerase chain reaction. Mol Biotechnol 1995, 3: 129—134.

57. Shangkuan YH, Chang YH, Yang JF, Lin HC, Shaio MF. Molecular characterization of Bacillus anthracis using multiplex PCR, ERIC-PCR and RAPD. Lett Appl Microbiol 2001 Mar;32(3): 139-45

58. Shoemaker DD, Lashkari DA, Morris D, Mittman M and Davis RW: Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nat Genet 1996, 14: 450—456.

59. Shuber AP, Grondin VJ and Klinger KW: A simplified procedure for developing multiplex PCRs. Genome Res 1995, 5: 488—493.

60. Sosnowski R, Tu E, Butler WB, O'Connell JP and Heller MJ: Rapid determination of single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field control. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94: 1119— 1123.

61. Southern E, Mir К and Shchepinov M: Molecular interactions on microarrays. Nature Genet 1999, 21: 5—9.

62. Spargo С. A., M. S. Fraiser, M. Van Cleve, D. J. Wright, С. M. Nycz, P. A. Spears and G. T. Walker. Detection of M. tuberculosis DNA using Thermophilic Strand Displacement Amplification. Molecular and Cellular Probes (1996) 10, 247-256

63. Steemers FJ, Ferguson J A and Walt DR: Screening unlabeled DNA targets with randomly ordered fiber-optic gene arrays. Nat Biotechnol 1999, 18: 91—94.

64. Stevens PW, Hall JG, Lyamichev V, Neri BP, Lu M, Wang L, Smith LM, Kelso DM. Analysis of single nucleotide polymorphisms with solid phase invasive cleavage reactions. Nucleic Acids Res 2001 Aug 15;29(16):E77

65. Strizhkov BN, Drobyshev AL, Mikhailovich VM and Mirzabekov AD: PCR amplification on microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. BioTechniques 2000, 29

66. Taylor MT, P Belgrader, BJ Furman, F Pourahmadi, GA Kovacs, and MA Northrup. Lysing Bacterial Spores by Sonication Through a Flexible Interface in a Microfluidic System. Analytical Chemistry, 73(3), 492496, 2001.

67. Tillib S., Strizhkov В., Mirzabekov A. Integration of Multiple PCR Amplifications and DNA Mutation Analyses by Using Oligonucleotide Microchip. Anal. Biochem. 2001. V. 292. P. 155—160

68. Tobe VO, Taylor SI and Nickerson DA: Single-well genotyping of diallelic sequence variations by a two-color ELISA-based oligonucleotide ligation assay. Nucleic Acids Res 1996, 24: 3728—3732.

69. Troesch, A., H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R. Gingeras, P. M. Kaplan., P. Cross, and C. Mabilat. 1999. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37:49-55.

70. Turnbull, P. С. В., R. A. Hutson, M. J. Ward, M. N. Jones, C. P. Quinn, N. J. Finnie, C. J. Duggleby, J. M. Krammer, and J. Melling Bacillus anthracis but not always anthrax. J. Appl. Microbiol, 1992, Vol 72, p21-28.

71. Jan Weiler, Heinrich Gausepohl , Nicole Hauser, Ole N. Jensen and Jorg D. Hoheisel. Hybridisation based DNA screening on peptide nucleicacid (PNA) oligomer arrays Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 14

72. Wen W-H, Bernstein L, Lescallett J, Beazer-Barclay Y, Sullivan-Halley J, White M and Press MF: Comparison of TP53 mutations identified by oligonucleotide microarray and convential manual DNA sequence analysis. Cancer Res 2000, 60: 2716—2722.

73. Westin L, Xu X, Miller C, Wang L, Edman CF and Nerenberg M: Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. Nat Biotechnol 2000, 18: 199—204.

74. Whitcombe D, Newton CR and Little S: Advances in approaches to DNA-based diagnostics. Curr Opin Biotechnol 1998, 9: 602—608.

75. Wu DY, Wallace RB. The ligation amplification reaction (LAR)-amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics. 1989 May;4(4):560-9.