Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и исследование биологических микрочипов с 10-микронными гелевыми ячейками

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Создание и исследование биологических микрочипов с 10-микронными гелевыми ячейками"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

на правах рукописи

ВАСИЛИСКОВ ВАДИМ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СОЗДАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ С Ю-МИКРОННЫМИ ГЕЛЕВЫМИ ЯЧЕЙКАМИ

Специальность: 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва, 1998

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН и на кафедре молекулярной биофизики МФТИ.

Научные руководители:

доктор химических наук профессор, академик РАН Мирзабеков А.Д. кандидат химических наук Дробышев А.Л.

Официальные оппоненты:

1. д.ф-м.н , проф. Заседателев А. С.

2. д.х.н., проф. Беленький. Б. Г.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится « 20 » Октября 1998г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета К .063.91.10... при Московском Физико-Техническом Институте по адресу: 141700, г. Долгопрудный, Московская обл., Институтский пер., 9 в аудитории 113 ГК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ

Автореферат разослан «19» Сентября 1998г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат физико-математических наук..............................В.Б. Киреев

ЭБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

На сегодняшний день биологические микроматрицы (или ликрочипы) находят широкое применение для анализа ДНК, выявления иутаций, при анализе экспрессии генов и идентификации микроорганизмов, в медицинской диагностике и многих других эбластях.

Всвязи с перспективами широкого применения биологических иикроматриц во всевозможных областях биологии и медицины, а также } связи с необходимостью повысить объем и скорость обработки чнформации, которая может быть проанализирована на иикроматрицах регистрирующими приборами с фиксированным эабочим полем, возникает задача миниатюризации и улучшения эабочих характеристик микроматриц с объемными гелевыми ячейками, соторые разрабатываются нашей группой в Центре биологических микрочипов в И МБ.

Существует несколько альтернативных способов решения чанной проблемы. Среди них фотолитографический способ синтеза ¿ирмы "Affymetrix", который позволяет производить ДНК/РНК-иикроматрицы с большим количеством ячеек размером до 5 мкм. Недостатком этого метода может быть низкая чистота иммобилизованных одноцепочечных олигонуклеотидов.

Недавно фирма "Mosaic Technologies" разработала метод получения микрочипов путем сополимеризации геля и модифицированных олигонуклеотидов на концах оптического волокна под действием пропускаемого света. Однако такая технология не позволяет проводить параллельный анализ большого количества мелких элементов.

Существуют также всевозможные методы пришивки элигонуклеотидов и белков на различные поверхности (стекло, пористое стекло...). Эти методы требуют больших затрат, а получаемые ячейки микроматрицы обладают меньшей емкостью по сравнению с методом пришивки к объемным гелевым элементам, который разрабатывается в Центре биологических микрочипов ИМБ РАН. Этот метод пришивки в геле позволяет иммобилизовать охарактеризованные олигонуклеотиды и белок при более высокой емкости иммобилизации.

В данном случае пришивка веществ осуществляется методом перенесения иглой робота капель различных веществ на

известные на данный момент механические методы нанесения не позволяют надежно получать микроматрицы с размером ячейки менее, чем 100 микрон.

По этой причине и была поставлена задача разработать новый метод, который позволил бы существенно уменьшить размеры гелевых ячеек микрочипа.

Цель работы:

Целью работы была разработка нового метода получения микроматриц, который позволил бы существенно уменьшить размеры ее ячейки, тем самым сильно повысив плотность информации.

Предполагается также исследовать с помощью полученны> микроматриц процессы гибридизации и идентификацм олигонуклеотидов.

Целью работы также является упрощение технологии получения микроматриц и введение автоматического контроля качества для стабильного получения ячеек микроматриц.

Научная новизна:

Был разработан новый метод получения микроматриц, который позволил уменьшить размеры ячейки в десять раз (от 100 до 10 микрон) Проведенные исследования показали, что данный метод позволил в стс раз улучшить временные характеристики таких микроматриц.

Разработан принцип и макет конструкции специального микроскопа, который способен контролировать качество получаемы) гелевых ячеек в процессе полимеризации раствора акриламида, чтс позволило надежно получать ячейки независимо от факторов, влияющи) на ход процесса полимеризации.

Данный метод позволяет соединить две стадии получени? микроматриц (подготовка шаблона микроматрицы с гелевыми ячейкам!, с последующей активацией и нанесением веществ роботом) в одну посредством сополимеризации акриламида с модифицированныл олигонуклеотидом либо белком.

Практическая значимость

Была продемонстрирована принципиальная возможное™ получения 10 - микронных ячеек микрочипа, что позволяет уменьшит! размеры микрочипа в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, чтс кинетические процессы с 10 мкм ячейками проходят в 100 раз быстрее что открывает перспективу для создания быстродействующи:

ликрочипов. Публикации

1о результатам диссертации опубликована одна печатная работа, :сылка на которую дана в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

1иссертация состоит из введения, четырех глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и лиска цитированной литературы. Работа изложена на 73 страницах лашинописного текста, содержит 13 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Зведение

В настоящее время биологические микрочипы применяются для 1нализа ДНК [Southern и др., Мирзабеков и др.], выявления мутаций Sosnovski и др.], при анализе экспрессии генов и идентификации чикроорганизмов, в медицинской диагностике [Drmanac и др.] и многих 1ругих областях.

Существует несколько способов производства таких микрочипов. 1реди них фотолитографический способ синтеза фирмы "Affymetrix", оторый позволяет производить ДНК/РНК-микрочипы с большим оличеством ячеек, размером до 5 мкм. Недостатком этого метода южет быть низкая чистота иммобилизованных одноцепочечных 1Лигонуклеотидов. Описаны также всевозможные методы пришивки 1Лигонуклеотидов и белков на различные поверхности (стекло, пористое текло...). Эти методы требуют больших затрат, а получаемые ячейки шкрочипа обладают меньшей емкостью по сравнению с методом ришивки к объемным гелевым элементам, который разрабатывается в 4ентре биологических микрочипов в ИМБ [G. Yershov и др.]. Этот метод озволяет иммобилизовать охарактеризованные олигонуклеотиды и ¡елок при более высокой емкости иммобилизации. Недавно фирма Mosaic Technologies" (http:Wwww.mostek.com) разработала реагент Acrydite-TM phosphoramidite", с помощью которого синтезированы шигонуклеотиды для сополимеризации с акриламидом на концах птического волокна, что позволяет рассматривать такую конструкцию ак своеобразный микрочип. Однако такая технология не позволяет роводить параллельный анализ большого количества мелких

элементов.

В настоящей работе предлагается новый способ получения олигонуклеотидных и белковых микрочипов методой фотосополимеризации с акриламидом. Этот метод позволяет в 10 ра; уменьшить линейные размеры микрочипа, сократив объем гелевоР ячейки с 100 мкм * 100 мкм * 25 мкм до 10 мкм * 10 мкм * 5 мкм, пр1< сохранении достаточно высокой емкости иммобилизации, сопоставимой с той ,что описано в работе [в. УегеЬоу и др.].

Олигонуклеотидный микрочип был изготовлен на специально сконструированном микроскопе. Уменьшенное оптическое изображение маски проектировали на тонкий слой раствора акриламида I/ олигонуклеотида с аллильной группой. Раствор подавали в герметичнук камеру между двумя покровными стеклами, снабженную устройством для синхронной замены исходного раствора, содержащего разные олигонуклеотиды. Поверхность одного из покровных стекол былг модифицирована производным акриламида, на котором происходило образование ячеек геля. Рассеянный или отраженный от образующихся ячеек микрочипа свет был использован для автоматического контроля формирования ячеек и уменьшения влияния условий полимеризации не качество готовой ячейки.

Данным методом был получен и испытан на стабильность пришивки микрочип с 10 мкм элементами, содержащими четыре различных октануклеотида и контрольную пустую ячейку. Для этогс микрочипа были последовательно определены равновесные кривые плавления с каждым из четырех иммобилизованных олигонуклеотидов Для каждого набора из четырех кривых плавления был четко определен совершенный дуплекс, что подтверждает пригодность метода.

Показано, что гибридизация олигонуклеотидов на микрочипах с 10 мкм элементами проходит в 100 раз быстрее, чем на обычны> микрочипах со 100 мкм элементами. Метод позволяет иммобилизовать

Таблица 1. Состав олигонуклеотидов, использованных в данной работе.

Иммобилизованные олигонуклеотиды Комплементарные олигонуклеотиды

обозначение последовательность обозначение последовательность

А111 5 '-А11у1 - ГС^ГввАС- 3' Р1 5'-ОТССАГОГГТ-КН-Р1ТС-3'

А112 5'-А11у1-ГСТГСОАС-3' ГО 5'-ОТССАЛС/ЯТ-МН-Р1ТС-3'

А113 5'-А11у1-&4СГССАС-3' РЗ 5'-ОТССАСГОТ-ЫН-Р1ТС-3'

А114 5'-А11у1 - СССГО в АС- 3' Р4 5'-ОТССАСССТТ->Ш-Р1ТС-3'

Структура аллильной группы(А11у1): О II СН2=СН-СН2-О-Р-О-(5'-0Мд0...3')-ОН 1 ОН

'лигонуклеотиды и растворимые белки равномерно по всему объему лемента.

Условия эксперимента

Синтез и очистка олигонуклеотидов

Все одноцепочечные олигонуклеотиды для описанных ниже кспериментов были синтезированы на стандартном ДНК/РНК интезаторе, используя стандартные протоколы химических реакций, краткая схема синтеза представлена на рис 1. Синтезированные лигонуклеотиды были очищены с помощью обычного препаративного .енатурирующего электрофореза и хроматографии высокого давления а колонке с обращенной фазой (таблица 1).

Сиквенс четырех олигонуклеотидов был выбран, исходя из редыдущих экспериментов с обычными микрочипами, которые были зготовлены методом нанесения олигонуклеотидов иглой робота. Это ¡ыло сделано для того, чтобы сравнить результаты экспериментов, олученных на обычных и на 10 мкм микрочипах. Все олигонуклеотиды, юдифицированные аллильной группой, были синтезированы на ДНК/ 'НК синтезаторе фосфорамидитным методом добавляя аллильный эосфорамидит на последней стадии синтеза. Для получения и ммобилизации олигонуклеотидов, меченных флуоресцентным расителем Р1ТС* на колонке синтезатора, было использовано миностекло. Р1ТС- метка была выбрана для того, чтобы "разнести" пектры излучения флуоресценции меченных олигонуклеотидов и

ЭМТгС!

Р-адеп1

ЮСН2СН=СНСН2ОН

ОМ ТгОСН2СН =СНСН2ОН

Ру

СН^И

I

п

ОСН2СН2СМ ЭМТгОСН2СН=СНСН2С>—р^

М(СзИ7}2

/

ДНК Синтезатор

'ис. 1. Синтез аллильных олигонуклеотидов

Рис. 2. Конструкция полимеризационной и гибридизационной камеры 10 - микронного микрочипа.

1-Стальная крышка

2-Верхнее окно

3-Резиновая прокладка

4-Верхнее стекло

5-Прокладка толщиной 5 мкм

6-Нижнее стекло

7-Фторопластовая прокладка

8-Микрочип (0.3*0.Змм)

9- Алюминиевая пластина Ю-Окно дискриминатора

11-Антипылевой фильтр

12-Входной капилляр

13-Выходной капилляр

" V V

Подвижная диафрагма

Белый свет

Объектив 10Х

□=Ьод(1(52))-К*Ьод(1(51))Дискриминатор

'ис. 3. Схема проекционного метода получения микрочипа.

встроившегося в гель фотокатализатора метиленового синего для получения лучшего соотношения сигнал/шум.

Получение микрочипа методом фотосополимеризации

Конструкция камеры микрочипа.

Камера микрочипа состоит из двух параллельно расположенных стекол, которые зажаты между верхней крышкой и нижней алюминиевой пластиной через 5 микронную полиэтиленовую прокладку, чтс обеспечивает герметичность камеры (рис. 2). Верхнее стекле обработано Bind-Silane (ТриЭтоксиСилилГексен1), LKB для пришивку гелевых ячеек, нижнее стекло (с двумя отверстиями) обработано Repeal-Silane (ДиМетилДиХлорСилан), LKB. После сборки, камеру нагревали дс 150 °С, чтобы размягчить полиэтиленовую прокладку для обеспечения герметичности конструкции. Растворы геля с разными пс последовательности (таблица 1) модифицированными аллильноР группой одноцепочечными олигонуклеотидами подают в камеру чере; входной тефлоновый антипылевой фильтр (Glen Reseach20-0010-0F G609011) и полимеризуют в местах расположения соответствующих гелевых ячеек с помощью специального полимеризационногс микроскопа. Пластина из алюминия используется во второй частк эксперимента как теплопроводящий материал при снятии кривых плавления.

Конструция полимеризационного микроскопа (рис. 4).

Метод фотосополимеризации основан на проекционно№ принципе (рис. 3). Источником света является галогеновая или ртутна? лампа. Фотокатализатор полимеризации акриламида метиленовый синий имеет два диапазона поглощения: это ультрафиолетовый диапазон (29С — 310 нм) и широкий видимый диапазон (500 — 700 нм). Как пру возбуждении фотокатализатора ультрафиолетовым светом, так и пру возбуждении видимым светом при получении микрочипа с помощьк сополимеризации с олигонуклеотидами, которые модифицировань аллильной группой, сигналы гибридизации были одинаковы. В даннол* эксперименте на одном микрочипе с одним и тем же залитым в камер} олигонуклеотидом AII4 были получены сначала ячейки при акгивацм фотокатализатора видимым светом (включали галогеновую лампу с у.ф запирающим фильтром), а затем рядом с ними были получены ячейм используя ультрафиолетовый свет от ртутной лампы с полосовыл, ультрафиолетовым фильтром (при этом в микроскопе была установлен кварцевая оптика, а в камере микрочипа было установлено кварцевое

зерхнее стекло). В обоих случаях использовались также контрольные ячейки без олигонуклеотидов. Затем микрочип гибридизовали с меченным Р1ТС комплементарным олигонуклеотидом F4 (подробнее см. ниже), и получили одинаковый по интенсивности сигнал флуоресценции эт ячеек, полученных с разным возбуждающим светом. Следовательно соэффициент иммобилизации таких олигонуклеотидов в этих двух случаях был одинаков, поэтому для упрощения в дальнейшем мы будем ■оворить о микрочипах, которые получены под видимым светом с юмощью галогеновой лампы.

Свет от блока смены ламп падает на конденсор, который формирует приблизительно параллельный пучок света. Свет проходит ^рез запирающий инфракрасный фильтр, затем через маску и диафрагму. Маска состоит из 10 X 10 прозрачных квадратов со стороной 100 мкм и расстоянием между ними равным 300 мкм, вытравленных в толстом непрозрачном слое из напыленного хрома на кварцевом стекле.

Диафрагма состоит из щелевой (Н = 300 мкм) вертикальной и оризонтальной диафрагмы и одного отверстия 300 X 300 мкм. Данные диафрагмы располагаются так, чтобы при прикладывании этой диафрагмы вплотную к маске, можно было открывать независимо любой столбец, строку или одну ячейку без перекрывания. В эксперименте,

ЭИС. 4. Схема полимеризационного микроскопа.

описанном ниже, мы использовали только диафрагму со строкой. Для того, чтобы открывать этой диафрагмой разные ячейки маски, был использован микрометрический позиционер. Конструкция из маски и диафрагмы была собрана в круглой трубе. Эта труба двигается вдоль пучка света для того, чтобы добиться совпадения трех плоскостей: плоскости тонкого слоя геля, плоскости изображения маски и плоскости объектов. Пропущенный через маску свет попадает на полупрозрачное зеркало из напыленного на стекло алюминия, чтобы можно было по отраженному свету контролировать процесс полимеризации. От зеркала свет направляют на револьвер из объективов с разным увеличением, переключая которые можно получить на слое геля в микрочипе уменьшенное изображение ячеек маски с размерами от трех до десяти микрон. 4 поддерживающие стойки предназначены для юстировки плоскости микрочипа.

Раствор геля подается в камеру микрочипа с помощью специального шприца, который позволяет получать гелевые ячейки с разными иммобилизованными олигонуклеотидами. Шприц позволяет создать необходимое давление для прохождения раствора геля через входной фильтр и камеру без ее механического разрушения. В качестве антипылевой защиты, для предотвращения сополимеризации пыли в ячейках микрочипа был использован тефлоновый фильтр.

Камера микрочипа позволяет без ее разборки проводить полимеризацию и гибридизацию, что заметно уменьшает количество попавшей на микрочип пыли. В камере микрочипа снизу сделано специальное окно для контроля за полимеризационным процессом пс рассеянию света от ячеек микрочипа дискриминатором. Дискриминатор (рис. 3) вычисляет средний сигнал со всех открытых ячеек одновременно, поэтому для контроля за каждой открытой ячейкой пс отдельности используется ПЗС камера (12bit CCD камера TEKCCD512SF, Princeton Instruments США), установленная на оптический ответвитель окуляра. В отличие от дискриминатора, камера следит за ходом полимеризации по отраженному от границы стекло — ячейка свету.

Проблемы уменьшения гелевых ячеек:

Надежные результаты в аспекте механической стабильности v образованию гелевых ячеек были получены при горизонтальном размере ячейки 10 мкм и высоте (1/2 от горизонтального размера) 5 мкм (ячейка 10 X 10 X 5 мкм). Уменьшение размера базы ячейки при сохранении ее высоты, которая определяется толщиной прокладки между стеклами ведет к неустойчивому поведению ячейки при ее формировании, а также к уменьшению механической прочности получившейся ячейки. Такие

ячейки во время их образования могут падать или пришиваться боком к гтеклу в произвольном направлении (см. рис. 5). В дополнение стоит сказать, что на четкость воспроизведения контуров ячейки влияет процесс диффузии в результате которого данные ячейки повторяют контуры проецируемого изображения неточно.

В этой работе мы получали и исследовали только микрочипы с надежно воспроизводимыми гелевыми ячейками размером 10 мкм. [Дальнейшее уменьшение размеров ячеек требует использования более

Состав стока до пспмеризации

Метиленовьй Сммй (Х04 в воде Олот на 50мсл раствора

IfcJVfcL) 0.6м<л на 50м<л раствора

Ппщер*н40% Р1т=7.0-Буфер

сн2=а+с=о 4% |

Дфишед №12

(>12<H-(>NHCH2-CH2-NH<>CH=CH БисАфилгмчд 1/1Э

0

II

СЗКШ2СН<НОСОР-О<?-О«эо-З>ОН

1

АПукЯдо 300рто1/ма1 ОН

(Et-0)2-S-(CH2)n-CH=CH2

I

О Bnd-silane

С>см5проирссасах1гимзризац^

? ^(300ог500)пт

Акгюфовамьм Метиленовьй См-ий

ТВШЗ

(Сгабипоагор радкалов)

Сопоптеризация

Растущая цель полиакрипамвдз I

СН2 I

Allyl-Ollgo О СН-СН2-ОН

II I OH{3,-aig&5')-CH4M>E-CH

I I ОН №1 I

00

1

Acrylarride СН2 Polymer | СН2

I

(OH)2-SI-(CH2)n-CH2-CH2

эис. 5. Химия сополимеризации олигонуклеотида с растущей депью полиакриламида в камере микрочипа.

тонких прокладок (толщиной менее 5 мкм) и специальных антипылевых условий для изготовления камеры микрочипа. Следует упомянуть, что теоретический предел размера ячейки ограничен длиной волны, которая используется в полимеризационном микроскопе (500 нм) для их формирования. Учитывая апертуру объектива, можно оценить разрешение, или минимальный размер ячейки, как 1 мкм.

В случае пришивки ячейки к обоим (верхнему и нижнему) стеклам камеры, механические свойства гелевых ячеек по отношению к перезаполнению и отмывке улучшаются, но форма гелевой ячейки при этом претерпевает большие искажения, чем в случае односторонней пришивки.

Стадии получения микрочипа (Рис. 5)

Для получения раствора акриламида используется стандартный протокол.

1) Раствор акриламида: (4% Acrylamide, 1/19BÎS, 40%Glycerol and 7.5Ph phosphate buffer (все от. LKB) ) дегазируют.

2) Добавляют катализатор TEMED (LKB) 0.6 мкл на 50 мкл раствора геля.

Во избежание паразитной полимеризации, стадии ( 3- 9 )

10000

Время полиме- 1000 ризации,

Отн.Ед. __________

25 Мощность 75 лампы, зоо Вт.

04 0.6 0.8 " Концентрация ТЕМЕД, мкл/50мкл стока

Рис. 6. Зависимость времени полной полимеризации 01 концентрации метиленового синего и интенсивности излучения

проводят в рассеянном свете в затемненном помещении.

3) Добавляют 6мл Methylene Blue (LKB) ( 0.04/Н20 ) к полученному раствору.

4) Добавляют олигонуклеотид, модифицированный аллильной группой, к полученному раствору до, концентрации: О.ЗмМ/л

5) Заполняют полученным раствором камеру, предварительно настроив и отюстировав микроскоп.

6) Двигая позиционер, открывают в маске необходимые ячейки (например, верхнюю строчку) и включают свет.

7) Полимеризуют гель в местах проекции изображения открытых ячеек, пока полимеризационная кривая на компьютере, полученная с помощью дискриминатора или камеры не придет к насыщению. Затем свет выключается, прекращая тем самым дальнейший процесс полимеризации.

В) Открывают соседние ячейки в маске и заполняют камеру раствором, содержащим другой олигонуклеотид.

Э) Повторяют стадии (5 — 9 ) пока микрочип не сформирован полностью.

10) Не разбирая камеры, исследуют полученный микрочип под флуоресцентным микроскопом, снимают кривые плавления...и т. д. ...

Выбор условий фотополимеризации, (рис.5, 6)

На данный момент нет законченной теории фотополимеризации, но существует множество работ посвященных экспериментальному изучению данной проблемы, например близки нашей тематике работы lyublmova Т., и др...]. Не вдаваясь в глубокое теоретическое изучение этих процессов, мы провели серию экспериментов для того, чтобы этыскать оптимальные параметры фотополимеризации. Изменяя интенсивность света и концентрации катализаторов (ТЕМЕДа и иетиленового синего) при измерении времени полной полимеризации, иы нашли, что функция полного времени полимеризации имеет слабый минимум в зависимости от концентрации катализаторов и интенсивности света (рис.6). Это позволило нам выбрать оптимальный, то скорости полимеризации, диапазон параметров получения гелевых ччеек конкретно для нашего случая. В дополнение можно сказать, что зремя полной полимеризации также зависит от толщины слоя геля, и /словий химической пришивки к стеклу, поэтому на рис.6 мы построили чанную зависимость в относительных единицах (зависимость от <онцентрации метиленового синего аналогична зависимости от <онцентрации ТЕМЕДа.).

Рассмотрим случай последовательного (одна за одной) получения гелевых ячеек микрочипа. В данном случае оптимальные

условия полимеризации для получаемой ячейки зависят не только от расположения рядом стоящих получаемых ячеек но и от расположения уже готовых ячеек на микрочипе (поскольку ячейки полимеризуются не все сразу...). Данный эффект можно объяснить изменением концентрации реагентов в полимеризуемой ячейке вследствие их расхода в ней и возникшей из-за этого сложной сетью диффузионных процессов на всем микрочипе в течение формирования ячейки. По этим причинам трудно предсказать, и еще труднее определить экспериментально, оптимальные условия для каждой формирующийся ячейки микрочипа, поскольку, в ходе формирования микрочипа, по мере появления новых ячеек сеть диффузионных процессов все время меняется. Дополнительный вклад в описанную неопределенность вносит

дискриминатора. Нестабильности условий эксперимента не влияют на качество готовой гелевой ячейки, если используется адаптивная остановка процесса полимеризации.

1аг-фаза начала полимеризации.

Учитывая данные обстоятельства, было предложено 1Спользовать обратную связь для повышения качества ячеек и уменьшения зависимости от множества описанных выше неблагоприятных факторов. В данном случае измерительным цементом служит дискриминатор или камера, которая получает сигнал в той или иной мере пропорциональный коэффициенту полимеризации ■еля в ячейке, поскольку во время полимеризации изменяется соэффициент преломления формирующегося в ней геля. Следовательно будут изменяться коэффициент отражения от границы ;текло-гель в месте освещения или коэффициент рассеяния света юсле прохождения через ячейку, как через неоднородную структуру рис.3). В данном случае ячейка считается готовой только тогда, когда фивая полимеризации приближается к горизонтальной асимптоте постоянный уровень сигнала). Кривые полимеризации показанные на

Рис. 8. Кривые полимеризации, полученные с помощью ПЗС камеры, которая позволяет одновременно контролировать все полимеризуемые ячейки по отдельности.

рис.7 и рис.8 были получены для 10 мкм гелевых ячеек с помощью дискриминатора (рис.7, одновременно полимеризуя и снимая сигнал с линии из ячеек) и с помощью камеры (рис.8, приведен сигнал только с одной ячейки полимеризуемой линии из ячеек).

Структура микрочипа.

Для того, чтобы показать основные преимущества данного метода был получен микрочип с 10 мкм гелевыми ячейками содержащий 5 линий из 10 одинаковых ячеек, причем первая линия была сделана для контроля и нормировки а остальные 4 содержали разные АП4...АН1 олигонуклеотиды (таблица 1, рис.10). Поскольку конструкция камеры микрочипа является неразборной, то поэтому, в силу способа их получения, гелевые ячейки микрочипа имеют открытой для диффузии только боковую поверхность (упираются своим верхом в стекло, в то время как обычные микрочипы обладают разборной камерой и обычно имеют сверху достаточный объем гибридизационного буфера, поскольку для гибридизации в камере используется более толстая прокладка, чем та, которая использовалась для приготовления шаблона микрочипа). Поскольку в нашем микрочипе при отмывке (гибридизации) линейки с ячейками, содержащими комплементарные олигонуклеотиды высвобождается (гибридизуется) большое количество меченного олигонуклеотида в малый объем окружающего буфера, что мешает соседним ячейкам с другим составом и искажает кривые плавления, было принято решение в данном конкретном случае увеличить этот объем, получив микрочип с линейками из десяти 10 мкм ячеек, которые разнесены на удвоенное расстояние (рис.10), равное 50 мкм.

Результаты и обсуждение Олигонуклеотидный микрочип

Сигналы гибридизации и кривые плавления, полученные на олигонуклеотидном микрочипе с размером ячеек 10 мкм.

Для получения гибридизационного изображения микрочипа (рис.9) и снятия кривых плавления был использован флуоресцентный микроскоп, оборудованный оптической ПЗС камерой с 12 разрядным АЦП, размером рабочего поля 512 * 512 точек (TEKCCD512SF Princeton

Instruments USA) и соответствующее программное обеспечение [Yershov G. и др.]. Для получения большего увеличения, чем в случае стандартных микрочипов со 100 мкм ячейками, вместо 3-х кратного объектива использовали 20 кратный.

Свет, проходя от ртутной лампы ДРШ350 через полосовой фильтр на 462 нм (сине - зеленый, соответствующий пику поглощения метки FITC) и объектив, падает на микрочип, возбуждая FITC метку на концах меченного, комплементарного к одному из иммобилизованных олигонуклеотидов. Свет флуоресценции и отраженный свет от микрочипа проходят назад в объектив, причем свет флуоресценции проходит через полосовой фильтр на 512 нм (зеленый, — пик флуоресценции FITZ), а отраженный свет задерживается режекторным фильтром, установленным параллельно. При этом мы видим яркие ячейки на черном фоне в тех местах, где образовался совершенный дуплекс (рис. 10).

Специально созданная программа на IBM-PC была использована для автоматического снятия кривых плавления. Сигнал с ПЗС камеры подавался на плату сбора данных, встроенную в компьютер. Программа автоматически изменяла с заданной скоростью температуру термостолика и строила кривые плавления, производя

Флюоресцентный Шкроскоп

Гелевые элементы микрочипа с иммобилизованными олигонуклеотмдами

1MNaQ

Синий свет

j, J, j,

__£зелеи»гё

FITC.«**

Совершенны* дуплекс

Термостол

Гибридизационная камера с микрочипом на термостоле

Рис. 9. Принцип получения кривых плавления с помощью флуоресцентного микроскопа

интегрирование сигнала по площади каждой ячейки и его нормировку [УегэЬоу 6. и др.].

С помощью измерительного комплекса, описанного выше, микрочип последовательно, чередуя с длительными отмывками при 60 °С в чистом гибридизационном буфере, гибридизовали с четырьмя

Пустой С F-2 Пустой

AII4 А1!4

AII3 » - АПЗ

AII2 АН2-Р

AII1-P »■ % ш * * ш t <t • t АШ

Пустой с F4 Пустой

AII4 АН4-Р

AII3-P f в • » • • • t • * АПЗ

AII2 й» щ щ » ш # t 1 » АП2

AII1 % II 'ф: ** у щ # ^ ^ АН1

Рис. 10. Изображения микрочипа с 10 мкм ячейками, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа. Концентрация олигонуклеотидов АИ1-АИ4 в ячейках микрочипа была 0.3 мМ. 1.0 мкМ меченого олигонукпеотида (М-Р4) растворяли в гибридизационном буфере (1М №С1,1 мМ ЕйТА, 10 мМ №НР04) рН 6.8), "Пустой" — ряд ячеек, не содержащих иммобилизованного олигонукпеотида, "Р"-совершенный дуплекс

Иммобилизованные олигонуклеотиды Комплементарные олигонуклеотиды

обозначение последовательность обозначение последовательность

А111 S'-Allyl-TiüfrGGAC-З' Fl 5'-GTCCArGflT-NH-FITC-3'

А112 5'-AIlyl-7jC2TGGAC-3' F2 5'-GTCCA4G^TT-NH-FlTC-3'

А113 5 '-Allv 1- CTGGAC- 3' F3 5'-GTCCAGrCTT-NH-FITC-3'

А114 5'-Allyl-CCCTGGAC-3' F4 S'-GTCCAGGGTT-NH-FITC-З'

Структура аллильной группы(А11у1): 0 п

CH2=CH-CHrO-P-0-(5'-oligo...3')-OH i

i ОН

флуоресцентно меченными (РГГС) олигонуклеотидами (таблица 1, где каждый меченный олигонукпеотид комлементарен одному из иммобилизованных) и получали равновесные кривые плавления. Гибридизацию проводили в 1М №С1 буфере с 1мМ ЕРТА и ЮмМ МаНР04 ,рН=6.8. Концентрация каждого флуоресцентно меченного олигонуклеотида в буфере была 1мМ/л. Каждый из четырех процессов плавления/гибридизации проводили на максимально возможной скорости изменения температуры микрочипа 2°С/мин, которую стабильно обеспечивал подключенный к компьютеру термостол [УегзЬюу О. и др.].

Ни в одном из четырех случаев не наблюдался заметный гистерезис в кривых плавления (разница между плавлением и ренатурацией, не показано), что свидетельствует о равновесности процесса и прочности иммобилизации. В данном эксперименте использовался термостол от комплекса для снятия кривых плавления микрочипов со 100 мкм ячейками, который к сожалению имеет большой уход от температуры, 10 мкм / 80° С, что вносило наибольшую погрешность при снятии кривых плавления. Статистика по 10 эквивалентным ячейкам линии, содержащей один и тот же иммобилизованный олигонуклеотид, позволяет оценить ошибку в сигнале с каждой гелевой ячейки как 20 %, причем термостол вносит наибольший вклад в эту ошибку.

Кривые, полученные на контрольных ячейках, не содержащих элигонуклеотида, имеют слабый наклон. Данный наклон обусловлен температурной зависимостью флуоресценции метиленового синего (не показано), который вполимеризовался во все гелевые ячейки микрочипа на этапе его производства. Если вычесть из кривых плавления кривую, полученную на контрольных ячейках, то мы получим более точные результаты (рис.11). Хотя олигонуклеотиды были иммобилизованы при достаточно низких концентрациях в ячейке (обьемная плотность молекул ДНК в ячейке была около ЗООмМ, обычно иммобилизуют до ЮОООмМ) и при сильном фоне вполимеризовавшегося метиленового синего (концентрация была в 10 раз больше, чем в ячейках микрочипа с 100 мкм размером ) была получена достаточная дискриминация совершенного дуплекса от несовершенных во всех четырех испытаниях ¡рис.11). Этот факт демонстрирует эффективность применения таких иикрочипов для тех же целей, что и микрочипов с 100 мкм ячейками.

На рис.10 показаны 4 флуоресцентные изображения, полученные для каждого олигонуклеотида отдельно при 10 °С, и в <аждом случае по данному изображению визуально можно определить совершенный дуплекс (Р). Данные, полученные в этом эксперименте по эавновесным кривым плавления, сравнимы с данными, которые были эанее получены на обычных микрочипах с 100 мкм ячейками. Обычно

МФ-микрочип с 10 мкм ячейками выдерживает 6 раундов гибридизации/ отмывки (равновесное нагревание от 0 до 65°С, отмывка пустым буфером, охлаждение до 0°С для всех четырех олигонуклеотидов по очереди) с неразличимой (в пределах 20 % ошибки) разницей между первой и последней кривой плавления для одного и того же олигонуклеотида в одинаковых условиях. Специальный эксперимент по

Рис. 11. Кривые плавления дуплексов, снимали после гибридизации с Р1-Р4 со всех ячеек одновременно, в — интегральный флуоресцентный сигнал ячейки .

1лительной отмывке в воде проводили в течение месяца при комнатной "емпературе с олигонуклеотидным микрочипом с 10 мкм ячейками. Данный эксперимент показал, что пришивка методом аллильной лодификации олигонуклеотидов и их последующей иммобилизации с юмощью фотосополимеризации устойчива к длительному хранению.

(инетика гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе

Для снятия кинетики гибридизации был получен специальный ликрочип, так что в поле микроскопа сразу попадали: стандартная ччейка (100 х 100 х 10 мкм), фрагментированная ячейка (100 X 100 X 10 лкм), сформированная из 7 X 7 Х(10 X 10 X 10) мкм ячеек с трех -ликронным интервалом между суб-ячейками, и одна ячейка (10 X 10 X

1.0-Э гибр. Отн. " 10x10x10 у >Г

ЕД. „ ^^

/ 100x100x10

/ М-Ш 1 ¡г

П П-Ч г Время,сек

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Рис. 12. Кинетика гибридизации олигонуклеотида Я4 на 100-микронной (кривая ЮОмкм) и 10-микронной (кривая Юмкм) ячейке. 3 — интегральный сигнал с ячейки.

10 мкм) на достаточном удалении от двух других (2мм). Олигонуклеотид AII4 (см таблицу 1) был иммобилизован методом сополимеризации в каждую из трех вышеупомянутых ячеек. Затем микрочип помещали под флуоресцентный микроскоп и уравновешивали буфером, помещая все три ячейки в поле микроскопа. Одновременно с пуском программы снятия кривой при постоянной температуре (10 °С), быстро заливали в камеру микрочипа гибридизационный буфер, содержащий комплементарный олигонуклеотид F4, (меченный FITZ) в концентрации 1мМ/л.

Кинетика гибридизации на фрагментированной 100 мкм ячейке была немного быстрее (не показано), чем на 100 мкм ячейке без фрагментации (рис.12). Следовательно, можно предположить, что кинетика определяется главным образом коэффициентом диффузии олигонуклеотида в растворе, а отношение объема ячейки к ее поверхности (в данном случае оно изменилось в 3.5 раза.) не сильно влияет на кинетику гибридизации в случае 4 % полиакриламидного геля.

Диффузия меченных декаолигонуклеотидов в 4 % полиакриламидном геле в случае аллильной пришивки комплементарных олигонуклеотидов проходит без затруднений, что аналогично их диффузии в гибридизационном буфере. Пористость 4 % акриламида подтверждает данные результаты. Усредненные размеры пор в 4% (1/19 bis) полиакриламидном геле чуть больше, чем длина молекулы декаолигонуклеотида (3 нм), поэтому декамеры легко проникают в ячейки микрочипа. По этой причине фрагментированная и обычная 100 мкм ячейки по кинетике практически неразличимы.

Данные по кинетике находятся в согласии с классическим законом диффузии X=D*Vt, где Х- расстояние диффузии, D- обобщенный коэффициент диффузии (одни и те же поправки на замедленную диффузию в случае ренатурации), t-время. Если мы уменьшим размер одной гелевой ячейки в 10 раз при том же коэффициенте диффузии, мы очевидно получим кинетику гибридизации, которая проходит в 100 раз быстрее. На рис. 12 можно увидеть, что 10 мкм ячейка имеет время полунарастания, равное приблизительно 5 с, а 100 мкм ячейка имеет время нарастания, равное примерно 500 с.

Стоит заметить, что верхняя поверхность гелевой ячейки находится в контакте с верхним стеклом, обработанным репел — силаном, и поэтому не доступна для диффузии, поскольку используется неразборная камера микрочипа, как в случае процесса полимеризации (получения), так и в случае гибридизации. В случае обычных микрочипов с 100 мкм ячейками верхняя поверхность так же повидимому закрыта для диффузии. Это подтверждают аналогичные эксперименты по снятию кинетики гибридизации (результаты не приводятся), которые дали одинаковое время полунарастания сигнала с 100 мкм ячейками

•азной высоты (10 и 25 мкм), иммобилизация на которых проводилась /ютодом нанесения иглой робота. Теперь можно заключить, что в аждом из двух примененных методов иммобилизации активно »аботает только боковая поверхность гелевой ячейки. Это наверное :ледует из того, что в обоих случаях ячейки изготавливались методом юлимеризации, при котором прилегающие к стеклу (препятствию) юверхности получались при полимеризации более плотными чем те, оторые ничем не ограничивались.

)ценка коэффициента иммобилизации модифицированных шлильной группой олигонуклеотидов

Для оценки коэффициента иммобилизации для каждого >лигонуклеотида были изготовлены три большие гелевые ячейки (с >дним и тем же объемом 200 мкл и с одной и той же концентрацией тигонуклеотида в ячейках 2 и 3 — ЗООмМ/л). Состав раствора для юлимеризации стока геля был тот же, что и в случае с 10 мкм ячейками. Эксперимент проводили по очереди для всех иммобилизованных на ликрочип с 10 мкм ячейками олигонуклеотидов AII1-AII4. Содержание неек было следующим: 1 ячейка — контрольная, без олигонуклеотида, I ячейка — с олигонуклеотидом AII1-AII4, но без аллильной группы, юрмировочная (ОН — на конце), 3 ячейка — с олигонуклеотидом, лодифицированным на колонке синтезатора на последней стадии ;интеза аллильным фосфорамидитом и снятыми аммонолизом 1ащитными группами (таблица 1). После получения таких гелевых ччеек, каждая из них по отдельности подвергалась длительному )ллюированию в буфер. Потом оптическую плотность эллюэнта юлученного от каждой ячейки измеряли на длине волны 260 нм на ;пектрофотометре. После проведенных измерений мы получили оценку 1нтегрального коэффициента иммобилизации, равного 20 % ± 10 % в случае аллильной модификации. Данные коэффициенты совпали для зсех четырех сиквенсов. В случае модификации Acrydite-TM -фосфорамидитом фирмы Mosaic Technologies этот коэффициент эценивался как равный 90 %, но для очищенных олигонуклеотидов. Мы чспытывали затруднения при попытке получить олигонуклеотид со :табильной акриламидной группой, а при попытке очистить элигонукпеотиды с аллильной модификацией после синтеза с помощью денатурирующего электрофореза не удалось разделить элигонуклеотид с модификацией и без нее.

Белковый микрочип, полученный методом сополимеризации.

Методом сополимеризации также можно получать и белковые микрочипы. Работы по белковым микрочипам были проведены до появления полимеризационного микроскопа и поэтому они были получены, используя первую стадию изготовления обычных микрочипов [УегеЬоу С. и др.], но при условии того, в зазор между покровным стеклом и маской заливался не пустой раствор акриламида, а раствор, который содержал модифицированные белки. Полимеризация акриламида проводилась при облучении сборки ультрафиолетовым светом (254 нм или 300 нм) в течении 30 минут. Размер полученных таким образом ячеек

<- 11И1 . Шш ' Л

эт Х\Л

Рис. 13. Флуоресцентное изображение 100 микронных ячеек белкового микрочипа, которые получены методом фотосополимеризации со стрептоавидином. Изображение получено после инкубации с комплексом биотин-флуоресцин (0.2 мМ/л) в буфере в течение 10 часов. Затем флуоресцентный раствор удаляли, а микрочип отмывали буфером.

/мкрочипа варьировался от 40 мкм до 1 мм. Для устранения не толимеризовавшихся белков микрочип интенсивно промывали водой в ечении 10 минут, затем промывали 1х PBS с 0.1% Tween 20 в течении 0 минут, binding buffer в течении 10 минут, и затем инкубировали в ¡ольшом избытке того же буфера в течении двух дней с постоянным юремешиванием. Затем его промыли водой, высушили и хранили в /юрозильной камере. Перед использованием, микрочип смачивали юдой и уравновешивали буфером.

Получить белковый микрочип можно также двумя способами: 1ибо доставляя на пустые гелевые ячейки раствор активированного ¡елка иглой робота, либо используя метод фотосополимеризации с 1криламидом специально модифицированных белков так же как и 1Лигонуклеотидов группами, содержащими двойные связи и способными утраиваться в цепь полимера.

Свободная диффузия белка в гель — это медленный процесс, :корость которого сильно зависит от молекулярного веса и формы ¡елковой молекулы. Например иммуноглобулин — G имеет юлекулярную массу около 150 кДа и его Y — образная форма к тому же 1меет размер около 15 нм. Белковые молекулы таких размеров требуют [ля себя в качестве носителя пористый гель. Дополнительный вободный объем пор требуется также для проведения взаимодействия ¡елков, аналогично комплементарным меченным олигонуклеотидам. 1апример, если в случае реакции антиген — антитело иммобилизовано 1Нтитело, а антиген имеет большие размеры, то взаимодействие ребует дополнительного места, чтобы имелся свободный доступ к шитой молекуле антитела, особенно к ее вариабельным участкам.

Непосредственное внедрение белка в гель в процессе олимеризации не подвержено вышеупомянутым недостаткам. Для этой [ели мы модифицировали белки акрилоильной производной, которая южет встраиваться в растущую цепь полиакриламида, и таким образом ¡елки могут встраиваться в гель в качестве кросслинкера и 'аспределяться равномерно по всему полимеризуемому объему елевой ячейки.

Микрочипы с иммобилизованными белками могут быть юпользованы для реакций связывания антиген — антитело, в реакциях заимодействия между белками и низкомолекулярными лигандами, ключая олигонуклеотиды, ДНК, РНК, и другие биологически активные юлекулы. Более того, гелевые ячейки с иммобилизованными белками югут служить как универсальный носитель для прикрепления других юлекул через белки посредством белок — белковых или белок — 1игандных взаимодействий.

Микрочип с стрептоавидином, иммобилизованным описанным ыше способом, инкубировали с 0.2 — 2.0 мкг/мл раствором коньюгата

(биотин — флуоресцин) в буфере. Флуоресцентный сигнал был получен для всех ячеек с разбросом концентрации биотина, использовавшегося е этом эксперименте, (рис.13 ). Связывание было настолько сильным, чтс даже длительная отмывка в буфере PBS, PBS 0.2 % раствора Tween или даже в PBS и 0.1 % SDS серьезно не изменяли флуоресцентный сигнал, за исключением уменьшения сигнала между ячейками. Различные ячейки микрочипа показывают очень сходные интенсивности флуоресценции, как показано сбоку рисунка 13 в сечении ячеек. К тому же интенсивность флуоресценции меняется вдоль сечения гелевой ячейки так, что ячейка микрочипа выглядит как тороид. Такое изображение ячейки в виде тороида может быть объяснено замедлением диффузии биотина, в то время как стептоавидин заведомо равномерно распределен по объему ячейки. Это также можно объяснить разной пропускной способностью верхней и боковой поверхностей ячейки из-за того, что верхняя (при ее получении) соприкасалась со стеклом а боковая — нет.

Конечная концентрация белка в гелевых ячейках после сополимеризации была в пределах 0.1-1.0 мкМ/л и возможно могла достигать в некоторых ячейках 10 мкМ/л (при условии 100 % сополимеризации). В то же время каждая гелевая ячейка микрочипа содержала меньше ,чем 40 — 160 АттоМоль стрептоавидина для 100 х 100 х 20 мкм гелевой ячейки и меньше, чем 7-30 АттоМоль для 40 х 40 х 20 мкм ячейки, для предполагаемого 100 % выхода реакции. Такие малые количества стрептоавидина достаточны для успешной регистрации флуоресцентно — меченного биотина при концентрации -1С -10 " М для константы связывания -1015 .Таким образом биотин или стрептоавидин могут быть обнаружены при концентрациях, которые гораздо ниже, чем микромолярные. Если мы поместим очень маленькие объемы (нанолитры и меньше) биотина в каждую гелевую ячейку микрочипа отдельно, то чувствительность обнаружения в данном случае будет порядка АттоМолей и меньше.

Заключение

Данный метод изготовления микрочипов с большим количеством ячеек может получить свое развитие при использовании многоканальной конвейерной технологии. Например: 64 канала размером 5 мкм на микрочипе могут быть получены фотолитографическим методом как е методе получения печатных плат, или методом заливки форм и; пластмассы. В каждом из конвейеров производится параллельно 64 X 64 микрочипов. В каждом микрочипе в каждом из его 64-х каналах получают 64 гелевые ячейки размером 5 мкм параллельно методом фотосополимеризации, проталкивая маленькими порциями друг зг

ругом разные растворы, содержащие модифицированные аллильной эуппой олигонуклеотиды. При этом порции раствора на такую сборку югут подаваться с помощью управляемых давлением гидравлических ентилей, вытравленных на технологической, нерабочей части 1икрочиповой сборки. Полимеризация выделенных гелевых элеметов южет быть произведена параллельно во многих ячейках, либо роекцией сдвигаемой маски (как в нашем случае), либо лазером с озиционером луча, либо светодиодной подложкой. Эффективное спользование олигонуклеотидов (и других субстратов) может быть остигнуто при заливке встык в канал маленьких порций вещества с омощью гидравлических вентилей, управляемых давлением. После олучения всех ячеек, из листа нарезаются готовые микрочипы, а частки технологических каналов и вентили могут быть убраны.

Целью данной исследовательской работы было родемонстрировать основные преимущества данного подхода и ринципиальные технологические моменты, которые используются для олучения таких микрочипов. Было показано ,что метод ютосополимеризации позволяет производить микрочипы с меньшим на орядок размером гелевых ячеек, при сохранении всех тех оложительных качеств, которые имеются у обычных микрочипов, роизводимых методом нанесения иглой робота. В дополнение к этому, данного метода обнаружился ряд преимуществ. В частности, он озволяет соединить две производственные стадии в одну, существенно меньшить неравномерность иммобилизации по объему ячейки, овысить информационную плотность, и, как всякая миниатюризация, озволяет существенно ускорить время тактирования такой иологической микросхемы, что важно например для проведения ПЦР мплификации на микрочипе, параллельного анализа субстратов в эармакологии, экспресс - мониторинга загрязнения окружающей среды атогенными микроорганизмами и для медицинской диагностики аболеваний. Это так же важно для изучения ДНК — связывающих игандов и белков. Нами было проведено тестовое исследование вязывания актиномицина с олигонуклеотидами на описанном выше 1Нкрочипе (данные не приведены): лиганд связывался с совершенным уплексом за несколько секунд. При внедрении в массовое роизводство данного метода возможно использование конвейерной инии.

выводы

1. Продемонстрирована возможность 10-кратного уменьшения размера стабильно воспроизводимой гелевой ячейки микрочипа, от ЮС до 10 микрон. При этом свойства 10-микронных ячеек оказались аналогичными свойствам 100-микронных ячеек, получаемых методом нанесения иглой робота.

2 Показано, что термодинамические свойства дуплексов образованных в ячейках, олигонуклеотиды в которых иммобилизованнь методом фотосополимеризации аналогичны свойствам дуплексов которые образуются в ячейках, олигонуклеотиды в которы> иммобилизованы стандартными методами. Пришитые таким образов олигонуклеотиды стабильны при длительном использовании микрочипов

3. Обнаружено, что в результате проведенной миниатюризации кинетика гибридизации на микрочипах с десяти микронными (10 X 10 X £ мкм) ячейками проходит в сто раз быстрее, чем на обычных микрочипа) со сто микронными гелевыми ячейками (100 X 100 X 25 мкм). Этс открывает широкие горизонты для всевозможных применений таки> микрочипов в областях, где критично время проведения процесса.

4. Достоинством данного метода является то, чтс иммобилизованные соединения (активированные олигонуклеотиды растворимые белки и.т.п.) оказываются распределенными равномернс по всему объему гелевой ячейки, в отличие от иммобилизации другим! методами, содержащими стадию диффузии соединения внутрь геля.

5. Предложен и реализован метод котроля за образованием каждо! гелевой ячейки, который позволяет получать ячейки одинаковы: размеров и плотности независимо от различных факторов, влияющих н; процесс полимеризации.

По материалам диссертации опубликована следующая работа:

В. А. Василисков, Э. Н. Тимофеев, С. А. Суржиков, А. Л. Дробышев, В. Е Шик, и А. Д. Мирзабеков, "Метод получения микрочипов с помощьь сополимеризации с акриламидом" ж. Молекулярная биология, N5, 1998) Т32 стр. 923-925.

Благодарности

Я выношу благодарность за существенный вклад в эту работу: к. . н. Шику В. В. за выполнение работ и предоставленные материалы, вязанные с работами по белковым микрочипам, за конструктивные эветы и помощь в выполнении работы; к. х. н Дробышеву А. Л. кучный руководитель) за помощь в написании программ по правлению полимеризационным микроскопом и за предоставленное рограммное обеспечение для получения кривых плавления; д. х. н. имофееву Э. и к. х. н. Суржикову С. за синтез модифицированных лигонуклеотидов в США и России соответственно; д. ф-м. н Барскому . Е. за предоставленный 20Х микроскоп "ЛЮМАМ", обьекгивы детали и энструктивные советы и сотруднику Центра Биологических Микрочипов упеевой В.В. за серьезный вклад и помощь в приготовлении растворов химических операциях.

■ Сокращения, используемые в данной работе:

. Р1ТС- стандартный краситель для мечения одноцепочечной ДНК, •люоресцеин изотиоцианат.

. МФ -Сокращение от : Метод Фотосополимеризации.

В.А. Василисков

СОЗДАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ С

Ю-МИКРОННЫМИ ГЕЛЕВЫМИ ЯЧЕЙКАМИ.

Типография при институте молекулярной биологии Главный редактор : Е.И. Новикова

Москва 1998 год

Усл. п.л.1,5. Тираж 64 экз. Заказ №7136-07