Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Количественный анализ анатоксинов на гидрогелевых биологических микрочипах

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Дюкова, Вероника Игорьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактериальные токсины.

1. 1. 1. Стафилококковый энтеротоксин В.

1. 1.2. Дифтерийный токсин.

1. 1.3. Столбнячный токсин.

1. 1.4. Сибиреязвенный токсин.

1.2. Растительные токсины.

1.2. 1.Рицин.

1. 2. 2. Вискумин.

1. 3. Методы обнаружения биотоксинов в окружающей среде.

1. 4. Белковые микрочипы.

1.4. 1. Двумерные белковые микрочипы для обнаружения биотоксинов.

1.4. 2. Белковые микрочипы на основе гидрогелей.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2. 1. Белковые микрочипы.

2. 2. Белковый гидрогелевый микрочип для обнаружения биотоксинов.

2. 3. Регистрация результатов иммуноанализа.

2.4. Исследование процессов, проходящих в объеме гелевой ячейки.

2.5. Различные варианты иммуноанализа анатоксина рицина, проводимые на микрочипе.

2.6. Иммуноанализ анатоксинов: вискумина, стафилококкового энтеротоксина В, столбнячного токсина, дифтерийного токсина и летального фактора сибиреязвенного токсина.

2.7. Прямой анализ анатоксина стафилококкового энтеротоксина В с масс-спектрометрической регистрацией сигнала.

2. 8. Параллельный анализ нескольких анатоксинов на микрочипах.

2. 9. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами.

2.10. Гликопротеиновый микрочип.

2.10.1. Выбор способа иммобилизации углеводов в гелевом элементе микрочипа.

2.10.2. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью (на примере анатоксина рицина).

2.11. Оптимизация условий для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа анатоксина рицина.

2.12. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Количественный анализ анатоксинов на гидрогелевых биологических микрочипах"

Разнообразные природные токсины представляют серьезную угрозу здоровью человека. В настоящее время хорошо известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным относятся бактериальные токсины (ботулинический и столбнячный токсины, токсины золотистого стафилококка), токсины растительного происхождения (рицин, вискумин, токсины сине-зеленых водорослей), микотоксины и пр. Эти токсины могут попадать в организм не только в результате инфицирования, но и с пищей, водой, а также воздушно-капельным путем. Поэтому большое значение в настоящее время имеет разработка быстрых и чувствительных методов определения токсинов для проведения клинических анализов, проверки пищевых продуктов, экологического мониторинга.

Для идентификации и анализа, как самих токсинов, так и организмов, которые их вырабатывают, в настоящее время используются различные лабораторные методы, включающие тесты на животных, микробиологические методы, анализ ДНК с использованием ПЦР, иммунологические методы: радиоиммунологический, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализы. Одним из чувствительных, быстрых и удобных методов анализа токсинов является твердофазный иммуноанализ. При разработке иммуноанализа токсинов используют антитела, специфичные к токсинам, а в качестве антигена, как правило, используют анатоксины, которые являются инактивированными токсинами.

К недостаткам традиционных иммунологических методов относится невозможность одновременно тестировать образец на наличие нескольких биологически активных соединений. Эта проблема решается в случае проведения анализа на белковых гидрогелевых микрочипах, разработанных в данной диссертации, которые позволяют обнаружить присутствие нескольких анатоксинов в анализируемом образце. Для создания белковых микрочипов и оптимизации методов иммуноанализа биотоксинов были использованы антитела и анатоксины, любезно предоставленные коллегами из Института Биоорганической Химии им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина (В. А. Несмеянов).

Технология гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов была разработана в ИМБ РАН под руководством академика А.Д. Мирзабекова и совершенствуется по настоящее время. Белковый гидрогелевый микрочип представляет собой матрицу индивидуальных гелевых ячеек на поверхности стекла, содержащих различные ковалентно иммобилизованные зонды (антитела, антигены).

Микрочип для одновременного определения нескольких анатоксинов позволит значительно увеличить эффективность анализа, ускорить и миниатюризировать проведение исследований и может найти применение в клинической и лабораторной практике.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дюкова, Вероника Игорьевна

выводы

1. Разработан метод количественного определения нескольких анатоксинов: SEB, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, вискумин, рицин, летальный фактор сибиреязвенного токсина с использованием трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов.

2. Показано, что ковалентно иммобилизованные в геле белки (антитела и анатоксины) равномерно распределены в объеме гелевого элемента и сохраняют свою биологическую активность, константы ассоциации комплекса антиген-антитело, полученные на микрочипе и в растворе совпадают.

3. Продемонстрирована возможность проведения различных типов иммуноанализа на белковом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела против токсинов (прямой, сэндвич-, конкурентный иммуноанализ) с флуоресцентной, хемилюминесцентной и масс-спектральной детекцией сигнала. Чувствительность анализа не уступает стандартным тест - системам.

4. Впервые показана возможность создания комбинированного гликопротеинового микрочипа, содержащего иммобилизованные белки и углеводы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Дюкова, Вероника Игорьевна, Москва

1. Angenendt P., Glokler J., Murphy D., Lehrach H., Cahill DJ. 2002. Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials. Anal. Biochem. 309,253-260.

2. Achraya R., Passalacqua E., Jones E at all. 1994. Structural basis of superantigen action inferred from crystal structure of toxic-shock syndrome toxin-1. Nature. 367, 94-97.

3. Ahuja N., Kumar P., Bhatnagar R. 2001. Hydrophobic residues Phe552, Phe554, Ile562, Leu566, and Ile574 are required for oligomerization of anthrax protective antigen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 542-9.

4. Balint G. 1974. Ricin: The toxic protein of castor oil seeds. Toxicology. 2(1), 77102.

5. Bartlett J.G. 1995. Applying Lessons Learned from Anthrax Case History To Other Scenarios. Emerg Inf Dis. 5, 561-563.

6. Barbieri L., Battelli M., Stirpe F. 1993. Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim. Biophys. Acta. 1154, 237-282.

7. Barsky V., Perov A., Tokalov A., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A. 2002. Fluorescence data analysis on gel-based biochips. J. Biomol. Screen. 7,247-257.

8. Burkin M. A., Sviridov V. V., Perelygina О. V. 2004. Determination of tetanus toxin by ELISA using monoclonal antibodies. Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 40, 478-484.

9. Burton D., Collier J., McKalanos J., Norrby E. ed. Vaccines. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Labpratory Press. 135.

10. Bavari S., Ulrich R. 1995. Staphilococcal enterotoxin A and toxic shock syndrome toxin compete with CD4 for human major histocompatibility complex class II biniding. Infect. Immun. 63(2), 423-429.

11. Beaumelle В., Taupiac M. P., Lord J. M., Roberts L. M. 1997. Ricin A Chain Can Transport Unfolded Dihydrofolate Reductase into the Cytosol. J. Biol. Chem. 272, 2209722102.

12. Beaumelle В., Alami L., Hopkins C. R., 1993. ATP-dependent translocation of ricin across the membrane of purified endosomes. J. Biol. Chem. 268,23661-23669.

13. Bigle A., Warner С. V., Press O. W. 1995. Translocation of Ricin A-chain into Proteoliposomes Reconstituted from Golgi and Endoplasmic Reticulum. J. Biol. Chem. 270, 23720-23725.

14. Bhatnagar R., Batra S. 2001. Anthrax toxin. Crit. Rev. Microbiol. 27,167-200.

15. Bradley K., Mogridge J., Mourez M., Collier R.J., Young J.A. 2001. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature.414,225-9.

16. Brodsky J., McCracken A. 1997. ER-associated and proteasome-mediated protein degradation: how two topology restricted events came together. Trends Cell Biol. 7, 151156

17. Carus W.S. Aug 1998. Bioterorism and biocrimes: the illicit use of biological agents in the 20th Century working paper., Washington: Center for Counterproliferation Research, National Defense University.

18. Choe S., Bennett M.J., Fujii G., Curmi P.M.G. 1992. The crystal structure of diphtheria toxin. Nature 357,216-222.

19. Cieslak Т., Eitzen E. 1999. Clinical and Epidemiologic Principles of Anthrax. Emerg Infect Dis. 5,552-5.

20. Collier RJ, In: Moss J, Vaughan M, editors. 1990. ADP-ribosylating toxins and G proteins. Washington: Am. Soc. Microbiol.p.3-19.

21. Crass В., Bergdoll M. 1986. Involvement of staphylococcal enterotoxins in non-menstrual toxin shock syndrome. J. Clin. Microbiol. 23,1138-1139.

22. Eisel U., Jarausch W., Goretzki K., Henschen A., Engels J ., Weller U., Hudel M., Habermann E. , Niemann H. 1986. Tetanus toxin: primary structure, expression in E. coli, and homology with botulinum toxins. EMBO. 5,2495-2502.

23. Engler K.H., Efstratiou A. 2000. Rapid enzyme immunoassay for determination of toxigenicity among clinical isolates of corynebacteria, J. Clin. Microbiol. 38,1385-1389.

24. Engler K.H., Efstratiou A. 2004. Rapid enzyme immunoassay for determination of toxigenicity among clinical isolates of corynebacteria, J. Clin. Microbiol. 38,1385-1389.

25. Ershov G.M., Mirzabekov A.D. Method of manufacturing a matrix for the detection of mismatches, US Patent № 5770721.

26. Ewalt K.L., Haigis R.W., Rooney R., Ackley D., Krihak M. 2001. Detection of biological toxins on an active electronic microchip. Anal. Biochem. 289,162-172.

27. Falnes P. O., Sandvig K. 2000. Penetration of protein toxins into cells. Curr. Opin. Cell. Biol. 12, 407-413.

28. Farrar W. 1994. Anthrax: virulence and vaccines. Ann. Intern. Med. 121,379. Fox J. 1998. Bioterrorism: microbiology key to dealing with threats ASM News. 64, 225-227.

29. Frankel A. E., Fu Т., Burbage C., Chandler J., Willingham M. C., Tagge E. P. 1997. IL2 fused to lectin-deficient ricin is toxic to human leukemia cells expressing the IL2 receptor. Leukemia. 11,22-30.

30. Fraser J. 1989. Hight-affinity binding of staphylococcal enterotoxins A and В to HLA-DR. Nature. 339, 221-223.

31. Glokler J., Angenendt P. 2003. Protein and microarray technology, J. Chromatogr. B. 797,229-240.

32. Goetz H., Kuschel M., Wulff Т., Sauber C., Miller C., Fisher S., Woodward C. 2004. Comparison of selected analytical techniques for protein sizing, quantitation and molecular weight determination. J. Biochem. Biophys. Methods. 60,281 293.

33. Grow A.E., Wood L.L., Claycomb J.L., Thompson P.A. 2003. New biochip technology for label-free detection of pathogens and their toxins. J. Microbiol. Methods. 53,221-233.

34. Haab В., Dunham M., Brown P. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. 2000. Genom. Biol. 2,0004.1.

35. Hadson Т. H., Neville D. M. 1987. Temporal separation of protein toxin translocation from processing events. J. Biol. Chem. 262,16484-16494.

36. Hazer В., Read R. 1997.Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36,11051-11054.

37. Helmy M., Lombard S. Pieroni G. 1999. Ricin RCA60: Evidence of Its Phospholipase Activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 252-255.

38. Hewetson J., Rivera V., Lemley P., Pitt M., Creasia D., Thompson W. 1996. A formalinized toxoid for protection of mice from inhaled ricin. Vaccine Research. 4, 179187.

39. Houseman В., Huh J., Kron S., Mrksich M. 2002. Peptide chips for the quantitative evaluation of protein kinase activity. Nature Biotechnol. 20,270-274.

40. Huang I.-Y., BergdoII M.S. 1970. The primary structure of staphylococcal enterotoxin B. 3. The cyanogen bromide peptides of reduced and aminoethylated enterotoxin B, and the complete amino acid sequence. J. Biol. Chem. 245, 3518-3525.

41. Hudson Т., Neville D. 1987. Temporal separation of protein toxin translocation from processing events. J. Biol. Chem. 262,16484-16494.

42. Hughes R. C. 1983. Glycoproteins. Chapman& Hall. London.

43. Jaggy C., Musielski H., Urech K., Schaller G. 1995. Quantitative determination of lectins in mistletoe preparations. Arzneimittelforschung. 45, 905-909.

44. Jardetzky T.S., Brown J.H., Gorga J.C., Stern L.J. 1994. Three-dimensional structure of a human class II histocompatibility molecule complexed with superantigen. Nature. 368, 711-718.

45. Kappler J., Kotzin В., Herron L et all. 1989. V р-specific stimulation of human T cells by staphylococcal toxins. Science. 244, 811-813.

46. Kenny K., Reiser R., Bastida-Corcuers F., Norcross N. 1993. Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by bovine mammary isolates of Staphyloclccus aureus. J. Clin. Microbiol. 31, 706-707.

47. Knezevic V., Leethanakul C., Bichsel V., Worth J., Prabhu V., Gutkind J., Liotta L., Munson P., Petricoin E. 2001. Proteomic profiling of the cancer microenvironment by antibody arrays Proteomics. 1,1271-1278.

48. MacBeath G., Schreiber S. 2000. Priniting proteins as microarrays for high -throughput function determination. Science. 289,1760-1763.

49. MacBeath G., Koehler A., Schreiber S. 1999. Printing small molecules as microarrays and detecting protein-ligand interactions en masse. J. Am. Chem. Soc. 121, 7967-7968.

50. Marrack P., Kappler J. 1990. The staphylococcal Enterotoxins and Relatives. Science. 248, 705-711.

51. Miyamoto Т., Kamikado H., Kobayashi H., Honjoh K., Iio M. 2003. Immunomagnetic flow cytometric detection of staphylococcal enterotoxin В in raw and dry milk. Food Prot. 66, 1222-1226.

52. Miwa K., Fukuyama M., Kunitomo Т., Igarashi H. 1994. Rapid assay for detection of toxic shock syndrome toxin 1 from human sera. J. Clin. Microbiol. 32, 539-542.

53. Mlsna D., Monzingo A., Katzin В., Ernst S., Robertus J. 1993. Structure of recombinant ricin A chain at 2.3 A. Protein Science. 2,429-435.

54. Morlon-Guyot J., Helmy M., Lombard-Fasca S., Pignol D., Pieroni G., Beaumelle B. 2003. Identification of the Ricin Lipase Site and Implication in Cytotoxicity. J. Biolog. Chem. 278,17006-17011.

55. Montfort W., Villafranca J. E., Monzingo A. F., Ernst S. R., Robertus J. D. 1987. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. J. Biol. Chem. 262, 5398-5403.

56. Moulin A., Teissere M., Bernard C., Pieroni G. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91,11328-11332.

57. Nedelkov D., Nelson R.W. 2003. Detection of Staphylococcal enterotoxin В via biomolecular interaction analysis mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 69, 52125215.

58. Olsnes S. 1987. Closing in on ricin action. Nature. 328,474-475.

59. Olsnes S., Pihl A. 1982. Toxic lectins and related proteins. In: Cohen P., van Heyningen S., eds. Molecular Action of Toxins and Viruses. Amsterdam, Netherlands: Elsevier Biomedical Press. 51-105.

60. Pannifer A., Wong Т., Schwarzenbacher R., Renatus M., Petosa C., Bienkowska J., Lacy D.B., Collier R.J., Park S., Leppla S.H., Hanna P., Liddington R.C. 2001. Crystal structure of the anthrax lethal factor. Nature. 414,229-233.

61. Paweletz C., Charboneau L., Bichsel V., Simone N., Chen Т., Gillespie J., Emmert-Buck M.,

62. Poli M.A., Rivera V.R., Hevetson J.F., Merril G.A. 1994. Detection of ricin by colorimetric and chemiluminescence ELISA. Toxicon. 32, 1371-1377.

63. Poli M.A., Rivera V.R., Neal D. 2002. Sensitive and specific colorimetric ELISAs for Staphylococcus aureus enterotoxins A and В in urine and buffer. Toxicon. 40, 17231726.

64. Prasad G., Earhart C., Murray D., Novick R., Schlievert P., Ohlendorf D. 1993. Structure of toxic shock toxin. Biochemistry. 32,13761-13766.

65. Ranelli D.M., Jones C.L., Johns M.B., Mussey G.J., Khan S.A. 1985. Molecular cloning of staphylococcal enterotoxin В gene in Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82,5850-5854.

66. Ramakrishnan S., Eagle M.R., Houston L.L. 1982. Radioimmunoassay of ricin A-and B-chains applied to samples of ricin A-chain prepared by chromatofocusing and by DEAE Bio-Gel A chromatography. Biochim Biophys Acta. 719, 341-348.

67. Ramsden C., Drayson M., Bell E. 1989. The toxicity, distribution, and excretion of ricin holotoxin in rats. Toxicology. 55,161-171.

68. Robertus J. 1988. Toxin structure. In: Frankel A. ed. Immunotoxins. Boston, Mass: Kluwer Academic Publisher. 11-24.

69. Roth M., Petricoin E., Liotta L. 2001. Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. Oncogen. 20, 1981-1989.

70. Roux E, Yersin A. 1888. Contribution a l'etude de la diphtherie. Ann Inst Pasteur. 629-661.

71. Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., A.D. Mirzabekov. 2003. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications, BioTechniques. 34,1008-1022.

72. Rutenberg E., Katzin В., Collins E., et all. 1991. The crystallographic refinement of ricin at 2.5 A resolution. Proteins. 10,240-250.

73. Sandvig K., Olsenes S., Pihl A. 1976. Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to surface receptors of human cells. J. Biol. Chem. 251 (13), 3977-3984.

74. Scheuber P., Denzlinger C., Wilker D., Beck G., Keppler D., Hammer D. 1987. Cysteinyl leukotrienes as mediators f staphylococcal enterotoxin В in a monkey. Eur. J. Clin. Invest. 117,455-459.

75. Schiavo G ., Benfenati F. , Poulain, B. , Rossetto, O. , Polverino de Laureto, P. , DasGupta, B. R. & Montecucco, C. 1992. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835.

76. Schweitzer В., Roberts S., Grimwade В., Shao W., Wang W. 2002. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359365.

77. Sharon N, Lis H. 1972. Cell-agglutination and sugar specific proteins. Science. 177,949-959.

78. Sandvig K., van Deurs B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. 2000. EMBO J. 19, 5943-595.

79. Seong S., Choi C. 2003. Current status of protein chip development in terms of fabrication and application. Proteomics. 3, 2176-2189.

80. Shur A. M. 1981. Vysokomolekularnye soedineniya, Vysshaya shkola, Moscow (in Russian).

81. Sreekumar A., Nyati M., Varambally S., Barrette Т., Ghosh D., Lawrence Т., Chinnaiyan A. Profiling of Cancer Cells Using Protein Microarrays: Discovery of Novel Radiation-regulated Proteins. 2001. Cancer. Res. 61, 7585-7593.

82. Sorokin N. V., Chechetkin V. R., Livshits M. A., Vasiliskov V. A., Turygin A. V., Mirzabekov A. D. 2003. inetics of hybridization on the oligonukleotide microchips with gel pads. J. Biomol. Struct. Dynam. 21, 279-288.

83. Srinivasan V., Pamula V., Fair R. 2004. An integrated digital micro fluidic lab-on-chip for clinical diagnostics on human physiological fluids. Lab Chip. 4, 310-315.

84. Stiles В., Bavari S., Krakauer Т., Ulrich R. 1993. Toxicity of staphylococcal enterotoxins potentiated by lipopolysacharide: Major histocompatibility complex class II molecule dependency and cytokine release. Infect. Immun. 61, 5333-5338.

85. Stillmark. Ueber Ricen. Arbeiten des Pharmacologischen Institutes zu Dorpat, iii,1889. Cited in: Flexner J. The historical changes produced by ricin and abrin intoxications. 1897. J. Exp. Med. 2,197-216.

86. Swaminathan S., Furey W.F. Jr., Pletcher J., Sax M. 1992. Crystal structure of staphylococcal enterotoxin B, a superantigen. Nature 359,801-806.

87. Takei S., Arora Y., Walker S. 1993. Intravenous immunoglobulin contains specific antibodies inhibitory to activation of T cells by staphylococcal toxin superantigens. J. Clin. Investm. 91, 602-607.

88. Thompson W., Scovill J., Pace J. 1995. Drugs that show protective effects from ricin toxicity in in-vitro proteins synthesis assays. Natural Toxins. 3, 369-377.

89. Toegl A., Kirchner R., Gauer C., Wixforth A. 2003. Enhancing results of microarray hybridizations throught microagitation. J. Biomol. Techniques. 14,197-204.

90. Toma C., Sisavath L., Iwanaga M. 1997. Reversed passive latex agglutination assay for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae. J. Clin Microbiol. 35, 3147-3149.

91. Tsend J., Komisar J., Trout R., et all. 1995. Humoral immunity to aerosolized staphylococcal enterotoxin В (SEB), a superantigen, in monkeys vaccinated with SEB toxoid contaning microspheres. Infect. Immun. 63 (8), 2880-2885.

92. Turnbull P., Kramer J. Bacillus. 1991. In: Balows A., Hausler W.J.Jr., Herrmann K.L., et all. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. Washington, DC, American Society for Microbiology, p. 296-303.

93. USAMRIID's medical management of biological casualties handbook, 2001, Fort Detrick, Frederic, Maryland (http://www.usamriid.army.mil/education/bluebook/litml')

94. Ulrich R., Bavari S., Olson M. 1995. Bacterial superantigens in human diseases: Structure, function and diversity. Trends Microbiol. 3,463-468.

95. Ulrich R., Bavari S., Olson M. 1995. Staphyloclccal enterotoxins A and В share a common structural motif for biniding class II major histocompatibility complex molecules. Nat. Struct. Biol. 2, 554-560.

96. Van Deurs В., Tonnessen Т. I., Petersen O. W., Sandvig K., Olsen S. 1986. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. J. Cell. Biol. 102,37-47.

97. Wales R., Richardson P. Т., Roberts L. M. et all. 1991. Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin В chain. J. Biol. Chem. 266,19172-19179.

98. Wannemaker R. 1994 September. Assistant Division Chief, Toxicology Division, USA Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Fort Detrick, Frederick, Md. Personal communication.

99. Wesche J., Rapak A., Olsen S. 1999. Dependence of Ricin Toxicity on Translocation of the Toxin A-chain from the Endoplasmic Reticulum to the Cytosol. J. Biol. Biochem. 274, 34443-34449.

100. Wick MJ, Iglewski ВН. In: Moss J, Vaughan M, editors. 1990. ADP-ribosylating toxins and g 123 proteins. Washington: Am Soc Microbiol, p.l 1-43.

101. Youle R., Huang A. 1976. Protein bodies from endosperm of castor beans, subfractionation, protein components, lectins, and changes during germination. Plant Physiol. 58, 703.

102. Youle R., Neville D. 1982. Kinetics of protein synthesis inactivation by ricin anti-thy. 1. 1. monoclonal antibody hybrids: Role of the ricin В subunits demonstrated by reconstitution. J. Biol. Chem. 267, 1598-1601.

103. Zhu H., Snyder M. 2003. Protein chip technology. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 5563.

104. Zhu H, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M. 2001. Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips. Science. 293,2101-2105.

105. Zubtsov D. A., Ivanov S. M., Rubina A. Y., Dementieva E. I., Chechetkin V. R., Zasedatelev A. S. (2006) Effect of mixing on reaction diffusion kinetics for protein hydrogel - based microchips. J. Biotechnol. 122(1), 16-27.

106. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. 1991. М.: Высшая школа.

107. Бовин Н. В. 1996. Гликоконъюгаты на основе полиакриламида- инструменты для изучения лектинов, антител, гликозил-трансфераз в гликобиологии, цитохимии и гистохимии. Биоорг. Химия. 22 (9)6 643-663.

108. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гелях при формировании микрочипа. Патент N 2175972, 20 ноября 2001 (Б.И. 2001, N25).

109. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В. Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N2216547.

110. Рубина А.Ю., Паньков С.В., Иванов С.М., Дементьева Е.И., Мирзабеков А.Д. 2001. Белковые микрочипы, Докл. Акад. Наук. 381, 701-704.

111. Ющук Н. Д., Кулагина М. Т. 1997. Дифтерия: клиническое течение, диагностика и лечение. Русский медицинский журнал. 5, (4).