Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мультиплексный анализ аллерген-специфических иммуноглобулинов человека на биологическом микрочипе

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Мультиплексный анализ аллерген-специфических иммуноглобулинов человека на биологическом микрочипе"

па правах рукописи

Фейзханова Гузель Усмановна

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ

МИКРОЧИПЕ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 № ¿(¡и

Москва 2014

005544999

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) и частично на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ).

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старшии научный сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заведующий Лабораторией молекулярных биотехнологий Института биологии гена Российской академии наук

доктор биологических наук, заведующий Лабораторией передачи внутриклеточных сигналов в норме и патологии ИМБ РАН

Ведущая организация:

А.Ю. Рубина

С.В. Тиллиб

Д.В. Купраш

Всероссийский Молекулярной Лечения

научный центр Диагностики и

¿ю

часов на заседании

Защита диссертации состоится очт.яоег _ в 4-1 Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу ГСП-1, 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан >

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

Щ 2014 г.

А.М. Крицып

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IgE — иммуноглобулин Е PBS - фосфатно-солевой буфер

PBST - фосфатно-солевой буфер, с 0,1 % содержанием Tween 20 ROC-анализ - анализ с применением характеристических кривых (ROC-кривых) slgE - аллерген-специфический иммуноглобулин Е ИФА - иммуноферментный анализ ME - международные единицы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В настоящее время аллергические заболевания являются крайне важной медицинской и социальной проблемой во всем мире. Около 30% представителей европейской популяции страдают от различных проявлений аллергии. Распространение аллергии и рост заболеваемости связаны с состоянием окружающей среды и возрастающим количеством продуктов технологической деятельности людей, попадающих в организм человека вместе с пищей, питьевой водой и воздухом. За последние три десятилетия заболеваемость аллергией удваивается каждые 10 лет. Исходя из вышесказанного, существует острая необходимость в полной и точной диагностике аллергических и связанных с ними заболеваний, а также в эффективном контроле состояния пациентов. Это может быть реализовано при использовании современных лабораторных методов, тест-систем нового поколения и инновационных технологий, включающих методы выделения и получения аллергенов, а также применение методов мультиплексного анализа на основе биологических микрочипов. Гидрогелевые биочипы, разрабатываемые в ИМБ РАН, могут обеспечивать проведение эффективного анализа различных биологических объектов. В настоящее время гидрогелевые биочипы находят применение в различных областях фундаментальных и прикладных наук, включающих молекулярную биологию, биохимию, медицину и др.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы является разработка метода одновременного определения содержания аллерген-специфических иммуноглобулинов класса Е и общего иммуноглобулина Е в ходе одного анализа образца сыворотки крови человека на биологическом микрочипе.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод одновременного количественного анализа и общего 1цЕ в образце сыворотки крови человека на биологическом микрочипе.

2. Определить аналитические и диагностические характеристики разработанного метода.

3. Провести сравнение результатов, получаемых при одновременном определении э1цЕ и общего 1§Е в сыворотке крови человека на биочипе с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из и общего 1§Е с помощью коммерческих иммуноаналитических тест-систем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В представленной работе впервые показана возможность одновременного определения 75-ти а1цЕ, в том числе количественного определения 22-х я^Е, и количественного определения общего 1уЕ в сыворотке крови человека на гидрогелевом биочипе. Впервые был создан биочип, содержащий в своей структуре, как экстракты аллергенов, так и индивидуальные аллергенные белки (рекомбинантные или нативные). Показано, что использование такой комбинации иммобилизованных аллергенов позволяет повысить чувствительность и специфичность метода и избежать ложно отрицательных результатов.

Проведена оценка аналитических и диагностических характеристик метода количественного определения 22-х На основе данного метода создан прототип тест-системы для одновременного определения 22-х и общего ^Е человека в сыворотке крови на биочипе.

Разработанный метод анализа апробирован на более чем 200-х образцах сывороток крови атопических пациентов и здоровых доноров. Был проведен корреляционный анализ результатов одновременного определения 22-х я^Е и общего в сыворотке крови человека на биочипе с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из в^Е и общего ^Е с помощью коммерческих иммуноаналитических гест-систем, и показана высокая корреляция данных. ЯОС-анализ результатов одновременного определения 22-х на биочипе показал высокую

диагностическую эффективность разработанного метода.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы докладывались на XIX Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2012» (2012, Москва), !7-й Международной Путинской школе-конференции (2013, Пущино), Конференции Молодежного форума G20 (2013, Санкт-Петербург), Всемирном конгрессе аллергии и астмы (2013, Милан, Италия).

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 3 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК, одна заявка на получение патента и 4 тезисов докладов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на,^Л:траницах машинописного текста, содержит^ рисунков и X таблиц. Библиография включает/^ наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выбор аллергенов

Для создания метода мультиплексного анализа аллерген-специфических иммуноглобулинов IgE был выбран принцип формирования так называемой «российской панели аллергенов», то есть спектр включенных в нее аллергенов максимально приближен к географическому региону. Подобным принципом руководствуются многие фирмы-производители скрининговых in vitro исследований на аллергию, например, Quidel (США) или Medland Systems (Нидерланды).

Известно, что экстракты аллергенов из разных источников имеют общие белковые компоненты, вследствие чего происходит перекрестное реагирование па разные аллергены. Развитие технологии получения различных рекомбинантных аллергенов позволило исследовать общие компоненты и использовать их для анализа slgE в сыворотке крови.

Индивидуальные белки аллергенов выделяют в несколько групп. Антитела к гомологам PR-10-белка (Pathogenesis Related proteins), таким как Betvl, Dau cl, Mal dl, Cor al, являются маркерами аллергических реакций на пыльцу деревьев, фрукты и овощи. Многие

из атопических пациентов с гиперчувствителыюстью к PR-10 белкам страдают от орального аллергического синдрома.

Белки семейства профилинов (например, Phi р 12 и Bet v2) обычно являются минорными аллергенными белками у растений и редко ассоциируются с клиническими симптомами. Тем не менее, у небольшого процента людей они вызывают острые аллергические реакции.

Некоторые slgE к индивидуальным белкам можно рассматривать как эффективные маркерБ! на целые группы аллергенов. Так, например, гиперчувствительность к белку Cypcl приводит к аллергическим реакциям на любую рыбу, а наличие slgE к белкам Phi pi, Phi р5 и Phi р7 свидетельствует об аллергии на любую пыльцу трав.

Базовые белковые аллергены коровьего молока - альфа-лактальбумин (a-LABLA), бета-лактоглобулин (ß-LG) и казенны - присутствуют также в других молочных продуктах. При этом консервативная структура ß-LG позволяет предположить, что при наличии сенсибилизации на данный белок у пациента возможно возникновение аллергических реакций на молоко других животных. Коровий a-LABLA является видоспецифичным белком, присутствующим не только в молоке, но и во многих тканях - как следствие при выявлении аллергии к a-LABLA возможна перекрестная аллергическая реакция на говяжье мясо.

Но не во всех случаях возможно выделить базовый маркер (индивидуальный белок) из одного природного источника и использовать его для выявления аллергии на целые группы аллергенов из других аналогичных источников. Так, например, наличие антител к белкам Fei dl, Ara h2 и Tri al9 свидетельствует о том, что у данного пациента есть аллергия исключительно на эпителий кошки, арахис и пшеничную муку.

Таким образом, проведение тестов на отдельные аллергенные компоненты может быть использовано для получения большей информации о причине сенсибилизации на молекулярном уровне.

Включение рекомбинантных белков в структуру биочипа позволяет выявить возможные перекрестные реактивности к различным аллергенам. Кроме того, одновременный анализ с использованием экстрактов аллергенов и соответствующих им рекомбинантных белков позволяет осуществить компонент-разрешающую диагностику,

т.е. выявить конкретный аллергенный белок из набора белков, входящих в состав данного экстракта и использовать этот белок для проведения иммунотерапии.

В рамках данного исследования было выбрано 75 аллергенов: полнобелковых экстрактов аллергенов и их компонентов (Табл. I).

Таблица 1. Список иммобилизованных аллергенов на биочипе.

Группа Аллерген Источник

Пыльца деревьев и кустарников t2 Ольха серая

t.l Береза белая

Bet vi Рекомбинантный аллерген березы белой

Bet v2 Рекомбинантный аллерген бсрсзЕ>1 белой

t4 Лешипа обыкновенная (орешник)

Cora) Рскомбинаптный аллерген лесного ореха

Cor all Рекомбинантный аллерген лесного ореха

t7 Дуб белый

t9 Маслина европейская (олива)

tl4 Тополь

Пыльца сорных трав и цветов wl Амброзия полынполистная высокая

w5 Полынь горькая

\v6 Полынь обыкновенная

w8 Одуванчик лекарственный

w9 Подорожник ланпстолистпый

wl5 Лебеда

Пыльца луговых трав и цветов К2 Свинорой пальчатый (бермудская трава)

ai Ежа сборная

K4 Овсяннина луговая

BS Райграс пастбищный (плевел)

S6 Тимофеевка луговая

Phlpl Рскомбинаптный аллерген тимофеевки луговой

Phl pS Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой

Phl p7 Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой

Phlpl2 Рекомбинантный аллерген тимофеевки луговой

Bl2 Рожь посевная

Эпидермальные белки и белки животного проихождения cl Кошка (эпителий)

Fei dl Рекомбинантный аллерген кошки (эпителии)

c5 Собака (эпителий)

c70 Гусь(оперение)

c86 Утка (оперение)

Аллергены клещей домашней пыли dl Dermatophagoides pieronvssinus

d2 Dermatophagoides farinae

Der pl Цистеиновая протеаза Dcrmatophagoides pleronvssinns

Der fl Цистеиновая протеаза Dermatophagoidcs farinae

Плесневые и дрожжевые белки ml PeniciUium nnlalnm

m2 Cladosparium herhamm

m3 Aspergillus fumigatus

m4 Mticor racemnstts

m5 Candida albicans

mfi Allernaria tenuis

Группа Аллерген Источник

11 Яичный белок

К Коровье молоко

Bus <14 а-лактальбумин коровьего молока

Bos d5 (5-лакгоглобулин коровьего молока

Bos d8 Коровье молоко

13 Треска атлантическая

Cypcl Парвальбумип карпа

f4 Пшеничная мука

Tria 19 Омега-5 глиадин пшеничной муки

П Овсяная мука

№ Кукурузная мука

19 Рис

fll Гречневая мука

113 Арахис

Пищевые Ara h2 Конглютин арахиса

аллергены 114 Соевые бобы

117 Фундук

Г24 Северная креветка

Pan Ы Тропомиочин северной креветки

П5 Томат

f29 Банан

131 Морковь

Dau cl РК-Ю-подобный белок моркови

133 Апельсин

139 Капуста

f49 Яблоко

Mai dl РЯ-Ю-иодобныи белок яблока

Г53 Персик

175 Яичный желток

183 Мясо курицы

Инсектные il Яд пчелы медоносной

¡3 Яд осы германской

аллергены ¡6 Рыжий таракан (пруссак)

CCD Перекрестные углеводные детерминанты

2. Одновременное определение набора slgE на бночине

Современные in vitro методы диагностики аллергии основаны на определении уровня slgE в крови пациеита. Основным преимуществом метода является отсутствие контакта пациента с аллергенами, т.е. полная безопасность для пациента. Лабораторное исследование можно проводить у пациентов любого возраста даже в период обострения заболевания.

Для решения задачи проведения мультиплексного анализа идеальным инструментом являются биологические микрочипы (биочипы) - массивы элементов, содержащих иммобилизованные аллергены. Перенос макроварианта иммунохимического анализа б^Е в формат биочипа позволяет проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анапитов.

В данной работе для определения ГцЕ человека бьгл выбран метод «сэндвич»-иммуноанализа с флуоресцентной регистрацией сигнала на гидрогелсвых биочипах. Биочипы изготавливали по технологии сополимеризационной иммобилизации, разработанной в ИМБ РАН. Данная технология позволяет создавать массивы гелевых элементов, содержащие различные по своей природе молекулярные зонды: белки, олигосахариды, ДНК, РНК и др. После завершения процесса полимеризации каждый иммобилизованный зонд ковалентно закреплен в структуре геля и равномерно распределен в гелевой ячейке биочипа. Технология изготовления гидрогелевых биочипов позволяет проводить иммобилизацию белков без потери исходной активности и биологических свойств, а гидрофильное окружение белковых молекул, иммобилизованных в объеме гелевых ячеек, обеспечивает длительный срок хранения биочипов.

2.1. Подбор условий иммобилизации аллергенов

Для иммобилизации в ячейках биочипа были использованы как полнобелковые экстракты аллергенов из различных источников, так и их белковые компоненты. Экстракты аллергенов представляют собой фракции растворимых белков, выделенные из природного сырья. Такие препараты могут содержать различные вещества, препятствующие иммобилизации аллергена в гелевом элементе в ходе фотоиндуцируемой сополимеризации. Поэтому, в случае неполного прохождения полимеризации гелевых элементов мы очищали препараты экстрактов аллергенов от низкомолекулярных примесей.

Был выбран состав полимеризационной смеси (состав геля, концентрации гелеобразуюших мономеров), обеспечивающий как достаточную эффективность иммобилизации молекулярных зондов, так и диффузионную подвижность анализируемых белков в объеме ячейки, и позволяющий проводить различные типы иммунологических реакций на биочипе. Были подобраны расстояние между ячейками и размер пина робота для оптимального взаиморасположения ячеек в матрице. При производстве биочипа после

завершения полимеризации и отмывки от непрореагировавших гелеобразующих компонентов проводилась обработка блокирующим раствором, уменьшающим неспецифические взаимодействия, в результате чего биочип был полностью готов к проведению анализа.

2.2. Разработка метода одновременного анализа на биочине

Для проведения одновременного анализа з^Е и общего ^Е в сыворотке крови человека был создан биочип с иммобилизованными 75-ю аллергенами (экстрактами и их компонентами, см. п.1). В структуру биочипа были также включены ячейки, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины Е человека для контроля работы проявляющих антител, ячейки с иммобилизованными антителами против иммуноглобулина класса Е человека (апП-^Е) для анализа содержания общего ^Е в анализируемом образце и ячейки, не содержащие иммобилизованных соединений, для контроля неспецифических взаимодействий и фонового сигнала. Также биочип содержал угловые маркерные элементы, необходимые для корректной работы программного обеспечения (рис.1).

т2 щ? М f4 Г25 <25 © © ®

Ш Ш Ф ®912 912 т3 го3 т ,2э © ©

а«»1 е1 е1 т4 т4 Т7 f7 <31 Г31 осо осо

ними Щ £ м<п ш« т5 т$ f8 f8 »«»«о Щ || д2 д2 е5 е5 тб тб О (33 (33 1дЕ 1дЕ дЗ дЗ еТОе70 П f1 (11 (11 <39 ТКГК?

........... д4 д4 е86 е86 п 12 (13 (13 <49 <49

ф |Г д5 д5 Щ Ца.*»*««»«*«««« I» Щ дб дб ф (14 <53 <53

«4 фрмв1В),11,10«|.10.г,1^»даа»1В<17 (17 <75 (75 ^ о»«е«И <ф fЗ (3 (24 (24 <83 (83 @ ф Щ т1 т1 «Имя ».ф ф @

Рисунок I. Схематическое изображение биочипа для определения 75-ги б^Е.

Для проведения одновременного мультиплексного анализа slgE и общего IgE в сыворотке крови человека на биочипах был разработан протокол «сэндвич»-иммуноанализа с флуоресцентной регистрацией сигнала.

В качестве проявляющих антител использовался конъюгат антивидовых антител против человеческих IgE с флуоресцентным красителем циашнговым пятым (anti-IgE-Cy5).

При проведении анализа 65 мкл образца сыворотки крови инкубировали на биочипе 18 ч при 37°С. После инкубации проводили отмывку (20 мин, PBST). Затем на биочип наносили 50 мкл раствора проявляющих антител (anti-IgE-Cy5) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Далее после процедуры отмывки (30 мин, PBST) регистрировали флуоресцентные сигналы.

Флуоресцентные измерения проводили с использованием портативного флуоресцентного анализатора биочипов (ИМБ РАН, Москва) с возбуждением при помощи лазера с использованием фильтров 650/670 нм (возбуждение/регистрация). Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала от каждой ячейки биочипа и определение уровней всех slgE производили при помощи специального программного обеспечения ImageAssay (ИМБ РАН, Москва).

3. Количественное определение slgE и общего IgE

Для определения неизвестной концентрации аналита в образце методом иммуноанализа необходимо построение калибровочной кривой - графика зависимости величины флуоресцентного сигнала от концентрации соответствующего аналита в калибровочной пробе. Одной из трудностей для большинства разработчиков методов количественного определения аллерген-специфических slgE является отсутствие выделенных и количественно охарактеризованных препаратов, содержащих индивидуальные slgE, что делает невозможным создание калибровочных проб для каждого аллергена. Существует несколько вариантов решения этой проблемы.

3.1. Использование для расчета концентрации slgE «статистических» калибровочных кривых

На разрабатываемых биочипах было проанализировано 197 сывороток атопических больных и здоровых доноров. После анализа на биочипах концентрации всех выявленных slgE определялись с помощью тест-системы ALLERG-O-LIQ («Dr.Fooke Laboratorien»,

Германия). Для каждого значения флуоресцентных сигналов, определенные на

биочипах, ставили в соответствие значениям концентраций, полученным с помощью АЫ_ЕКС-0-1_1С). Массив данных обрабатывали с помощью метода наименьших квадратов и строили кривые аппроксимации (рис.2А). Эти кривые использовались в качестве индивидуальных калибровочных кривых для определения концентрации в^Е к каждому из аллергенов по флуоресценции от соответствующих ячеек на биочипе.

о Б ЮО

К)

0,1

п = 32 Я = 0,90

1 10

МЕ/мл

100

0,1

I 10

АШИв-О-иО, МЕ/мл

100

Рисунок 2. Индивидуальная калибровочная кривая для определения концентрации б^Е к аллергену 13 (А) и точечная диаграмма корреляции (Б).

Далее с помощью полученных «статистических» калибровочных кривых определяли значения концентраций б^Е в образцах сывороток крови пациентов. Эти же образцы анализировали с помощью AL.LERG-0-l.IQ (рис.2Б). Для сравнения концентраций, полученных двумя методами, рассчитывали коэффициент корреляции по следующей формуле:

-

(1)

где XI - значения концентраций, полученных при анализе сывороток на биочипах, У( - значения концентраций, полученных при анализе сывороток на тест-системе АЬЬЕКС-О-ЫО,

х - среднее значение концентраций, полученных на биочипах, у - среднее значение концентраций, полученных с помощью АЬЕЕЯС-О-Ыр.

Считается, что чем гху ближе по модулю к 1, тем связь между анализируемыми переменными ближе к линейной. Интервал значений коэффициента корреляции можно интерпретировать следующим образом: 0-0,2 - очень слабая корреляция, 0,2-0,5 - слабая корреляция, 0,5-0,7 - средняя корреляция, 0,7-0,9 - высокая корреляция, 0,9-1 — очень высокая корреляция.

При сравнении концентраций, полученных двумя методами, коэффициент корреляции составил 0,84-0,97, что говорит о высокой корреляции данных.

Аналогичным образом поступали с построением калибровочной кривой для определения общего IgE (рис.ЗА). В одних и тех же образцах концентрацию общего IgE определяли с помощью биочипов и с помощью Total IgE-HRP EIA («Dr.Fooke Laboratorien», Германия). По этим данным проводился корреляционный анализ (рис.ЗБ). Коэффициент корреляции составил 0,97.

А зо

25

ti ^20 ё es

I 15

SJ

и D

£ Ю

I

5

Б нкю

100

Щ

3

10

11 = 46 R = 0.97

10 100 [IgE], МЕ/мл

1000

10 100 ИФА. МЕ/мл

1000

Рисунок 3. Калибровочная кривая для определения концентрации общего ^Е (А) и точечная диаграмма корреляции (Б).

3.2. Расчет концентраций э^Е при помощи калибровочной кривой для общего 1§Е

Другим способом расчета концентраций я^Е является использование одной калибровочной кривой для всех э^Е. Такой подход реализуют большинство производителей тест-систем для количественного определения в^Е («Эг. Рооке

Laboratorien», Германия; «Алкор Био», Россия). Для построения калибровочной кривой используют калибровочные пробы, содержащие различные концентрации общего IgE.

Общепринятым диапазоном исследования slgE является 0,35-100 ME/мл. При этом весь диапазон делится на классы: 0) < 0,35 ME/мл - выявляемые slgE отсутствуют, 1) 0,35-0,7 ME/мл - низкий уровень slgE, 2)0,7- 3,5 ME/мл - средний уровень slgE, 3)3,5-17,5 ME/мл - умеренно высокий уровень slgE, 4) 17,5-50 ME/мл - высокий уровень slgE, 5) 50-100 ME/мл - очень высокий уровень slgE, 6) > 100 - предельно высокий уровень slgE.

Норма содержания общего IgE зависит от возраста человека и составляет: до 1,5 МЕ/мл для новорожденных, до 15 ME/мл для детей до 1-го года, до 60 МЕ/мл - 1-5 лет, до 90 МЕ/мл - 6-9 лет, до 200 МЕ/мл - 10-15 лет, до 100 МЕ/мл для взрослых. Однако в некоторых случаях может обнаруживаться 15-20 кратное превышение концентрации общего IgE. Поэтому, диапазон определения общего IgE отличается от диапазона определения slgE и составляет 5-1000 МЕ/мл.

В данной работе были использованы калибровочные пробы, соответствующие стандарту ВОЗ (WHO IgE 75/502), предоставленные компанией «Dr. Fooke Laboratorien» (Германия): 0,35; 0,7; 3,5; 5; 17,5; 20; 50; 100; 200; 1000 МЕ/мл. Для построения общей калибровочной кривой для определения содержания всех slgE и общего IgE используются интенсивности флуоресценции от ячеек с иммобилизованными anti-IgE, полученные после анализа данных калибровочных проб на биочипах. Пример калибровочной кривой представлен на рисунке 4.

о

0,1

10

[1ёЕ], МЕ/мл

1000

Рисунок 4. Калибровочная кривая для определения з^Е и общего ^Е.

Для того чтобы использовать одну калибровочную кривую для расчета концентраций всех э^Е, необходимо было подобрать концентрации каждого иммобилизованного аллергена таким образом, чтобы флуоресцентный сигнал от гелевого элемента с соответствующим иммобилизованным аллергеном, полученный после анализа образца с известной концентрацией б^Е, совпадал с сигналом от ячеек с иммобилизованными апп-после анализа калибровочной пробы с такой же концентрацией ^Е (рис.5).

25

86,2 МЕ'мл о

20

50 МЕ мл 0

•46.70 МЕНЯ

">9.4и МЕ МЛ/ о

§

(|,:;9 ме мл _

о I 19 МЕ мл

0

0,1

10

100

[81вЕ]. МЕ/мл

Рисунок 5. Подбор концентрации иммобилизованного аллергена (11.

По значению флуоресцентного сигнала от ячеек с иммобилизованным аллергеном и калибровочной кривой рассчитывали концентрацию соответствующего slgE в образце. Одновременно с помощью той же калибровочной кривой для общего IgE и значений флуоресцентных сигналов от ячеек с иммобилизованными антителами против IgE рассчитывали концентрацию общего IgE в сыворотке крови пациента.

При сравнении концентраций, полученных на биочипах с помощью общей калибровки, и концентраций, полученных на тест-системе ALLERG-O-LIQ, коэффициент корреляции был в диапазоне 0,87-0,95. Таким образом, было показано, что расчет концентраций может быть произведен двумя способами (см. п. 3.1 и 3.2) с одинаковой точностью.

Для дальнейшей разработки метода и прототипа диагностической тест-системы на его основе для одновременного определения концентраций slgE и общего IgE на биочипе был выбран способ расчета концентраций slgE и общего IgE по калибровочной кривой, построенной по стандартам ВОЗ 75/502, как наиболее распространенный в диагностической практике.

Однако разработать количественный метод анализа удалось только для 22-х slgE из вышеперечисленных 75-ти аллергенов, поскольку независимо от способа расчета концентрации slgE для перехода к количественному анализу необходимо иметь большое число верифицированных независимым методом позитивных сывороток. Для 22-х аллергенов нам удалось набрать достаточное количество позитивных сывороток, содержащих slgE в концентрациях, перекрывающих диапазон определения.

При этом разработанный нами биочип, содержащий 75 иммобилизованных аллергенов, позволяет на качественном уровне производить дифференциальную диагностику и определять источник аллергического заболевания.

На рисунке 6А приведен пример флуоресцентного изображения биочипа после анализа сыворотки крови пациента №1. В in vitro исследованиях, выполненных с помощью ИФА, у данного пациента были обнаружены slgE к пыльце злаковых, сорных трав и к пыльце деревьев. Данные, полученные с помощью биочипа, позволили выявить как позитивную реакцию на пыльцу деревьев, злаковых и сорных трав, так и дополнительно обнаружить наличие slgE к эпителию собаки (е5). Скарификационная проба на эпителий и шерсть

собаки также дала положительный результат (реакция ++). Таким образом, в данном случае тестирование на биочипе позволило провести более полное обследование пациента.

На рисунке 6Б представлено флуоресцентное изображение биочипа после анализа сыворотки крови здорового донора. Анализ на биочипе показал отсутствие что

соответствует диагнозу «здоров».

АЛ

л " 6 ,,

и

и

и н н

П:

,L___;

¡¡•а» ¡LY-"! п

Рисунок 6. Примеры флуоресцентных изображений биочипов, содержащих 75 иммобилизованных аллергенов, после анализа образцов сывороток крови. Пунктирными рамками выделены группы иммобилизованных белков: 1) аллергены пыльцы деревьев и кустарников, 2) аллергены пыльцы сорных трав и цветов, 3) аллергены пыльцы трав и злаков, 4) эпидермальные аллергены, 5) бытовые аллергены, 6) аллергены плесневых и дрожжевых грибов, 7) пищевые аллергены, 8) инсектные аллергены, 9) антитела против IgE человека, 10) IgE человека, 11) гель, не содержащий белков. (А) - пациент №1, в сыворотке выявлено повышенные уровни slgE к аллергенам t3, Bet vl, w5, w6, w8, g3, g4, g5, g6, Phi p5, gl2, e5. (Б) - пациент №2, в сыворотке не выявлено повышенного уровня slgE ни к одному из 75-ти аллергенов.

4. Количественное определение 22-х slgE на биочине

Для количественного определения slgE был сконструирован биочип с 22-мя иммобилизованными аллергенами с подобранными концентрациями (см. п. 3.2) (рис,7). Кроме непосредственно аллергенных соединений, в структуру биочипа были включены ячейки, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины Е человека для контроля работы проявляющих антител. Также в структуру биочипа были включены ячейки, не содержащие иммобилизованных соединений, для контроля неспецифических взаимодействий и фонового сигнала. Для повышения воспроизводимости анализа каждый аллерген и антитело были иммобилизованы в четырех одинаковых гелевых ячейках.

мтщфт»пш»©©©©м ттФттттш@е@т

'» ф $ # Н Н <1 Л ТГ г? ГГ ГГ

дб дб дб дб 12 12 12 ГС

д12 д12 а« 012 « f4 14 f4

е1 е1 е1 в1 пз «3 ПЗ 03

^ (С) ^ ^ Я7 <17 «7 т

М е5 е5 е5 (5 # »( # «6 М

Рисунок 7. Схематическое изображение биочипа для количественного определения 22-х

5. Оценка аналитических характеристик метода

Были определены аналитические характеристики разрабатываемого метода, такие как чувствительность метода и воспроизводимость результатов анализа.

Чувствительность метода определяли экспериментально путем разведения сыворотки с концентрацией б^Е ~ I МЕ/мл; концентрации я^Е в сыворотке здорового донора принимали за нулевые концентрации. Чувствительность метода определяли, как концентрацию, соответствующую флуоресцентному сигналу, не менее чем на два стандартных отклонения превышающему усредненный по Ю-ти измерениям флуоресцентный сигнал при анализе сыворотки здорового донора (рис.8). Чувствительность метода определения б^Е для каждого из 22-х аллергенов не превышала 0,25 МЕ/мл.

« 0,4

0.2

0

0 0.2 0,4 0.6 0,8 пве}, ме/мл

Рисунок 8. Расчет чувствительности метода.

Воспроизводимость результатов оценивали по значению коэффициента вариации, который отражает соотношение между разбросом и среднеарифметическим значением и считается по формуле:

СУ = гг^х100% (2)

Р ^ ^

где СУ- коэффициент вариации, %;

о(Р) — среднее квадратичное отклонение для флуоресцентного сигнала, рассчитывается по формуле:

значение флуоресцентного сигнала от ячеек с иммобилизованным аллергеном для каждого измерения образца сыворотки крови;

Р— среднее арифметическое значение флуоресцентных сигналов от ячеек с иммобилизованным аллергеном для серии измерений образца сыворотки крови;

N - число измерений.

Для оценки воспроизводимости анализа проводили десятикратное измерение образца сыворотки крови на биочипах. Коэффициент вариации флуоресцентного сигнала не превышал 15%.

(3)

6. Сравнение разрабатываемого метода с коммерческой референсной тест-системой

Разрабатываемый метод был апробирован на 221 образце сывороток крови пациентов, среди которых 129 образцов сывороток крови атопических больных и 92 - здоровых доноров. Эти же сыворотки были проанализированы на тест-системе для количественного определения slgE ALLERG-O-LIQ. Концентрации общего IgE были получены с помощью ИФА тест-системы Total IgE-HRP EIA. Общее число измерений, проведенных на референсной тест-системе, составило 938 анализов.

А

Ч, t

В

0.1

т>= 108

г =0.93

95% CI 0,89 до 0,95 Р <0.0001

п»74 г »0.91

95% С10,87 до 0.93 Р< 0.0001

1 10 ALLERC.-0-LIQ, МВ/мл

V

1

10

ALLERG-O-LIQ, МЕ/ил

°fi° öS о .

о ° «

n = 69 т- 0.85

95% CI 0.81 до 0,91 Г <0.0001

n-221 г — 0,87

95% CI 0.84 ло 0.90 Р < 0.0001

10

100

ALLBRG-0-UQ, [U/ml

Total IgE-HRP EIA. ME/ид

Рисунок 9. Результаты корреляционного анализа данных, полученных после анализа сывороток с помощью двух методов: биочипов и АЬЬЕКО-О-ЫО - для аллергенов разных групп: А -для 12 (круги), 13 (квадраты) и 14 (триугольники), Б -для сП (круги) и с!2 (квадраты), В -для Л (круги), Г2 (квадраты), Р4 (треугольники), ЛЗ (ромбы) и Л 7 (крестики), Г-для общего ^Е.

5

к

Ш |

п = 50 г = 0,87

95% С10.81 до 0,92 Р < 0,0001

0,1 1 10 100 AU.BRG-0-L1Q, МЕ/мл

Рисунок J0. Результаты корреляционного анализа данных, полученных после анализа сывороток с помощью двух методов: биочипов и ALLERG-O-LIQ для рекомбипантных аллергенов: Bet vi (круги), Bet v2 (квадраты), Fel di (треугольники), Der pl (ромбы), Der fl (кресты), Ara h2 (звездочки).

Был проведен корреляционный анализ концентраций slgE, полученных на двух тест-системах (рис.9). Коэффициент корреляции составлял 0,93 для группы t2, t3 и t4 пыльцевых аллергенов (рис.9А), 0,91 для группы di и d2 клещевых аллергенов (рис.9Б), 0,85 для группы fl, f2, f4, fl3 и fl7 пищевых аллергенов (рис.9В), 0,87 для общего IgE (рис.9Г) и 0,87 для группы рекомбинантных аллергенов (рис.10).

Корреляционный анализ показывает соответствие концентраций, полученных двумя методами. Оценить диагностическую эффективность тест-системы позволяет ROC-анализ.

При ROC-анализе строится таблица сопряженности, в которой рассчитывается количество истинно положительных (ИП), ложно положительных (ЛП), а также истинно отрицательных (НО) и ложно отрицательных случаи (ЛО).

Таблица 2. Принцип расчета сопряженности полученных результатов на биочипах и

Стандартные тест-системы

Выше нормы Ниже нормы

Биочип Выше нормы ИП ЛП

Ниже нормы ЛО ИО

Принципом ЯОС-анализа является сопоставление чувствительности (Чв) и специфичности модели (Си) по уровню ложно положительных диагнозов. Для расчета чувствительности и специфичности, оперируют не абсолютными показателями, а относительными - долями, выраженными в процентах.

Чувствительность модели - это доля истинно положительных случаев: ИП

Чв=——--100% (4)

ИП + ЛО

Специфичность модели - доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:

Сп =——--100% (5)

ио+лп

Чувствительность и специфичность бинарной модели определения заболевания стремится к 100% (площадь под ЯОС-кривой стремится к 1), если количество детектируемых моделью ложно отрицательных или ложно положительных диагнозов заболевания стремится к нулю.

Согласно установленным критериям1, метод считается «превосходным», если площадь под ЯОС-кривой 0,9-1,0; «очень хорошим» при 0,8-0,9; «хорошим» при 0,7-0,8; «удовлетворительным» при 0,6-0,7; и «неудовлетворительным» при 0,5-0,6. Случайное предсказание соответствует 0,5.

На рисунке 1! представлены полученные ЯОС-кривые для разных групп аллергенов. Площади под кривыми составляли от 0,93 до 0,97, что соответствует «превосходному» качеству модели.

Как видно из рисунков 9-11, результаты одновременного определения в^Е и общего ^Е в сыворотке крови человека на биочипе показывает высокую корреляцию с результатами, полученными при помощи коммерческих иммуноаналитических тест-систем с индивидуальным определением каждого в^Е и общего ^Е.

1 bascgroup.ni/library/analysis/rcgrcssion/1ogistic/

п- 176 иоа,- (17 нет. - 59 АиО 0,968

Р< 0,0001 —,—]---

20 40 60 80 100%-С пецифичность

100

60

40

20

п -115 пох = 77 нег.:::: 38 ДОС - 0.949

Р <0,0001 __

20 40 60 80 100%-Спедифичносп,

100

В юо -

п = 248 р03 ::: 92 пси = 152 АиС = 0.929 Р< 0,0001

-----I-----:-

20 40 60 80 НЩ'! (¡-Специфичность

Р 100 -

100

80

40

п « 938 поз. - 549 нет. - 389 АиС = 0,943 Р< 0.0001

20 40 60 80 100%-СиецифичносЕь

100

Рисунок 11. ЯОС-кривые для 21 аллергена (А) для группы 12, 13 и 14 аллергенов (Б), для группы с11 и (12 аллергенов (В), для группы П, О, ПЗ и 117 аллергенов (Г).

выводы

1. Разработан метод одновременного мультиплексного определения 75-ти slgE в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе. Показано, что данный биочип позволяет выявлять наличие и источник аллергического заболевания.

2. Разработан метод количественного определения 22-х slgE и общего IgE человека в сыворотке крови на биологическом микрочипе.

3. На основе разработанного метода создан прототип тест-системы для одновременного определения 22-х slgE и общего IgE человека в сыворотке крови на биологическом микрочипе. Определены аналитические и диагностические характеристики прототипа тест-системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) Rubina A.Yu., Filippova М.А., Feizkhanova G.U.. Shepeliakovskaya A.O., Sidina E.I., Boziev Kh.M., Laman A.G., Brovko F.A., Vertiev Yu.V., Zasedatelev A.S., Grishin E.V. Simultaneous Detection of Seven Staphylococcal Enterotoxins: Development of Hydrogel Biochips for Analytical and Practical Application. Analytical Chemistry, 2010, 82, 8881-8889.

2) Филиппова M.A., Фейзханова Г.У.. Зубцова Ж.И., Стомахин А.А., Рубина А.Ю., Гришин Е.В. Биочип для многопараметрического экспресс-анализа биотоксинов. Доклады Академии Наук, 2011, 436(4), 553-558.

3) Рубина А.Ю., Фейзханова Г.У.. Филиппова М.А., Талибов В.О., Фооке-Ахтеррат М., Заседателев А.С. Мультиплексный анализ аллерген-специфических и общих иммуноглобулинов Е и G в формате биочипа. Доклады Академии Наук, 2012,447(4), 1-5.

4) Fooke-Achterrath М„ Rubina A.Yu., Savvateeva E.N., Stomakhin A.A., Filippova M.A., Feizkhanova G.U.. Dementieva, E.I., Zasedatelev, A.S., 2013. Biological microchip for the estimation of immunoglobulin E and G levels in human blood, method of assay thereof, and reagent kit comprising same. International Application No.: PCT/RU2011/000513. PCT publication: WO 2013/009210, Pub. date: 17.01.2013.

Тезисы

1) Талибов В.О., Фейзханова Г.У.. Гидрогелевый биочип в аллергодиагностике: особенности мультиплексного анализа slgE и sIgG4 в формате микрочина. Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012», Москва, 2012.

2) Талибов В.О., Фейзханова Г.У.. Филиппова М.А., Рубина А.Ю., Аллерго-биочип: применение гидрогелевых биочипов в аллергодиагностике. Биология - Наука XXI века: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2013.

3) Feizkhanova G.U.. Filippova М.А., Talibov V.O., Fooke-Achterrath M., RubinaA.Yu. Biochip for simultaneous quantitative assay of a panel of allergen-specific immunoglobulins «Allergochip». The G20 Youth Forum Conference, Saint-Petersburg, 2013.

4) Feizkhanova G.U., Filippova M.A., Talibov V.O., Dementieva E.I., Fooke-Achterrath M., Zasedatelev A.S., Rubina A.Yu. AllergoChip: development of a multiplex assay for the determination of specific and total IgE and IgG4 for 65 different targets, EAACI-WAO Congress, Milan, Italy, 2013.

Подписано в печать 30.01.2014 Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 2470 Отдел полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова 119192 Москва, Ломоносовский проспект, 27

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фейзханова, Гузель Усмановна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

на правах рукописи

П47П145^972

ФЕЙЗХАНОВА Гузель Усмановна

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ

МИКРОЧИПЕ

специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Кандидат химических наук А.Ю. Рубина

Москва 2014

Оглавление

Список сокращений.......................................................................................................................4

1 Введение................................................................................................................................5

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................6

2.1 Аллергические реакции...............................................................................................................6

2.1.1 Аллергические реакции I типа............................................................................................7

2.1.2 Аллергические реакции II типа........................................................................................14

2.1.3 Аллергические реакции III типа......................................................................................15

2.1.4 Аллергические реакции IV типа.......................................................................................16

2.2 Методы аллергодиагностики................................................................................................18

2.2.1 In vivo методы............................................................................................................................18

2.2.2 In vitro методы...........................................................................................................................20

2.2.3 Анализ аллерген-специфических иммуноглобулинов на микрочипах.......23

2.3 Биологические микрочипы....................................................................................................26

2.3.1 Белковые микрочипы............................................................................................................27

2.3.2 Методы иммобилизации белков на микрочипах....................................................31

2.3.3 Гидрогелевые Микрочипы.................................................................................................34

3 Материалы и методы..........................................................................................................37

3.1 Приборы и реактивы..................................................................................................................37

3.2 Очистка экстрактов аллергенов...........................................................................................38

3.3 Осаждение белков ТХУ..............................................................................................................39

3.4 Белковый электрофорез...........................................................................................................39

3.5 Изготовление биочипов...........................................................................................................39

3.6 Получение конъюгата антител с флуоресцентными красителями..................40

3.7 Иммуноанализ на биологических микрочипах............................................................40

3.8 Флуоресцентные измерения..................................................................................................41

3.9 Иммуноферментный анализ сывороток крови............................................................42

3.9.1 Определение содержания общего IgE в сыворотке с помощью ИФА...........42

3.9.2 Определение содержания slgE в сыворотке с помощью ИФА..........................42

4 Результаты и их обсуждение.............................................................................................44

4.1 Выбор аллергенов........................................................................................................................44

4.2 Одновременное определение набора slgE на биочипе.............................................49

4.2.1 Подбор условий иммобилизации аллергенов..........................................................50

4.3 Разработка метода одновременного анализа slgE на биочипе............................52

4.4 Количественное определение slgE и общего IgE.........................................................53

4.4.1 Использование для расчета концентраций * б^Е «статистических»

калибровочных кривых.................................................................................................................................53

4.4.2 Расчет концентраций б^Е при помощи калибровочной кривой для общего ^Е 57

4.5 Анализ частоты встречаемости аллергических заболеваний..............................62

4.6 Анализ индивидуальных аллергенных белков на биочипе..................................63

4.7 Количественное определение 22-х б^Е на биочипе.................................................66

4.8 Оценка аналитических характеристик метода............................................................67

4.9 Сравнение разрабатываемого метода с коммерческой референсной тест-системой 68

5 ВЫВОДЫ.............................................................................................................................73

6 Благодарности.....................................................................................................................74

7 Список литературы.............................................................................................................75

Список СОКРАЩЕНИЙ

Bind Silane - (З-метоксисилил)пропилметакрилат ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ IgE - иммуноглобулин Е

IT AM - иммунорецепторный тирозин-активируемый мотив MAST - множественный аллергосорбентный тест МНС - главный комплекс гистосовместимости PBS - фосфатно-солевой буфер

PBST - фосфатно-солевой буфер с 0,1% содержанием Tween-20

PVA - поливиниловый спирт

PVP - поливинилперилидон

RAST - радиоаллергосорбентный тест

ROC-анализ - анализ с применением характеристических кривых (ROC-кривых)

slgE - аллерген-специфический иммуноглобулин Е

TEMED - тетраметилэтилендиамин

АПК - антиген-презентирующие клетки

АПК - антиген-презентирующие клетки

АСИТ - аллерген-специфическая иммунотерапия

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецилсульфат натрия

ИМБ РАН - Институт Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

ИФА - иммуноферментный анализ

KB - коэффициент вариации

ME - международные единицы

ПААГ - полиакриламидный гель

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭР - эндоплазматический ретикулум

1 Введение

В настоящее время аллергические заболевания являются крайне важной медицинской и социальной проблемой во всем мире. Около 30% представителей европейской популяции страдают от различных проявлений аллергии. Распространение аллергии и рост заболеваемости связаны с состоянием окружающей среды и возрастающим количеством продуктов технологической деятельности людей, попадающих в организм человека вместе с пищей, питьевой водой и воздухом. За последние три десятилетия заболеваемость аллергией удваивается каждые 10 лет. Существует острая необходимость в полной и точной диагностике аллергических и связанных с ними заболеваний, а также в эффективном контроле состояния пациентов. Это может быть реализовано при использовании современных лабораторных методов, тест-систем нового поколения и инновационных технологий, включающих методы выделения и получения аллергенов, а также применение методов мультиплексного анализа на основе биологических микрочипов. Гидрогелевые биочипы, разрабатываемые в ИМБ РАН, могут обеспечивать проведение эффективного анализа различных биологических объектов. В настоящее время гидрогелевые биочипы находят применение в различных областях фундаментальных и прикладных наук, включающих молекулярную биологию, биохимию, медицину и др.

Целью диссертационной работы являлась разработка метода одновременного определения содержания аллерген-специфических иммуноглобулинов класса Е и общего иммуноглобулина Е в ходе одного анализа образца сыворотки крови человека на биологическом микрочипе.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Аллергические реакции

Основная функция иммунной системы - распознавать и элиминировать инфекционные агенты (патогены), а также свести к минимуму вызываемые ими повреждения. Иммунная система, в том виде, в котором она существует сейчас, возникла под влиянием эволюционного давления со стороны патогенных микроорганизмов. По ряду причин защитная система может иметь врожденный или приобретенные дефекты, которые можно подразделить на несколько категорий: аутоиммунитет, иммунодефицит, гиперчувствительность. В случае гиперчувствительности иммунная система отвечает на безвредные для организма вещества. Зачастую, реакции на такие вещества могут вызвать гораздо более серьезные повреждения, чем любые патогены [1].

Обычно, реакцию гиперчувствительности иммунной системы на повторный контакт с антигеном называют аллергией. В первую очередь, аллергию можно классифицировать по времени, которое требуется для проявления эффектов гиперчувствительности после контакта с аллергеном [2]. Реакция немедленного типа проявляется в течение нескольких минут [3], реакция замедленного типа -вплоть до нескольких суток [4].

Традиционная классификация реакций гиперчувствительности была предложена Джеллом и Кумбсом в 1963 году [5]. В ее основе лежат различия в иммунологических механизмах клинических проявлений гиперчувствительности. Реакции гиперчувствительности можно разделить на четыре типа: реакции, опосредованные аллерген-специфическими иммуноглобулинами класса Е (I тип), реакции, основанные на взаимодействии антиген-антитело (II тип, или цитотоксическая гиперчувствительность), реакции с участием иммунных комплексов (III тип, или комплемент-опосредованная), и клеточная гиперчувствительность (IV тип). С точки зрения клинических проявлений IV тип аллергии отличается от трех других - именно клеточная гиперчувствительность является причиной задержанной реакции [6].

2.1.1 Аллергические реакции I типа

Наиболее изучаемыми реакциями гиперчувствительности являются реакции I типа из-за их распространенности, скорости реакции и потенциальной опасности. В настоящее время термин «аллергия» используют для определения реакции гиперчувствительности I типа. В свою очередь термин «аллерген» подразумевает некое вещество, способное стимулировать выделение плазматическими клетками специфичных к нему иммуноглобулинов класса Е и взаимодействовать с ними [7].

В норме иммуноглобулины Е (1§Е) являются способом защиты организма от паразитических инфекций (гельминтозов) [8]. Наличие паразитов вызывает повышение уровня как общего 1§Е, циркулирующего в крови, так и специфических иммуноглобулинов к антигенам паразитической природы. Механизм защиты заключается в индукции локальных воспалительных реакций в местах . присутствия чужеродных организмов с последующим привлечением иммунных клеток для их уничтожения. В ряде случаев возможна предрасположенность к развитию немедленной гиперчувствительности при воздействии наиболее распространенных антигенов окружающей среды, порой наследственная [9-11].

Любой патоген, попадая в организм, вызывает нормальную реакцию гуморальной иммунной системы и приводит к появлению и наработке специфичных к нему иммуноглобулинов - преимущественно, в и М классов [7]. Однако, при наличии предрасположенности к аллергии дефекты в системе регуляции продукции антител способствуют повышению уровня специфических к патогену ^Е, даже если антиген не имеет паразитарной природы [12]. Такие дефекты являются причиной аллергических реакций I типа [13,14].

В 1919 году было установлено наличие в сыворотке крови фактора, способного реагировать с аллергенами. Изучение реакций, наблюдаемых в организме после переливания крови, показали, что в случае наличия у донора гиперчувствительности к какому-либо веществу она передается реципиенту [15].

Иммуноглобулины 1§Е были независимо открыты двумя исследовательскими группами в Швеции и Америке в 1970-х годах. В ранних работах было показано,

что некие реагины (атопические антитела) ответственны за высвобождение гистамина под действием аллергенного вещества [16,17]. Впервые роль аллерген-специфических антител была приписана иммуноглобулинам класса D (IgD) [18,19], однако позже данная гипотеза была опровергнута. Дальнейшие эксперименты на лабораторных животных, проводившиеся группой Ишизака в США, показали, что существует компонент сыворотки, удаление которого снижает активность реагинов [20]. В то же время, было впервые выдвинуто предположение о нахождении аллерген-специфических антител ранее неизвестного класса, которые были определены, как класс Е иммуноглобулинов. Однако, молекулы IgE еще не были выделены и охарактеризованы.

Независимо от Ишизака и др. шведская исследовательская группа выделила и охарактеризовала неизвестный класс антител, проявляющий уникальную специфичность к ряду антигенов [21]. Позже оказалось, что антисыворотка, использованная группой Ишизака для удаления реагинов, реагирует с выделенными в Швеции иммуноглобулинами. В 1968 году Всемирная Организация Здравоохранения объявила об открытии нового класса антител [22].

Наработка IgE в количестве, необходимом для исследовательской работы, была затруднена его низкими концентрациями: 0,085-0,35 мкг/мл для здоровых людей [23]. Ситуация значительно облегчилась после нахождения IgE-миеломы [24], позволившей получать IgE in vitro [25]. Иммуноглобулины класса Е - гамма-глобулины, состоящие из четырех цепей (две легкие, две тяжелые), обладающие молекулярной массой приблизительно 190 кДа и состоящие на 12% из углеводов [26].

Иммуноглобулины IgE проявляют структурно-функциональные и физико-химические свойства, аналогичные другим иммуноглобулинам, однако отличаются уникальными особенностями - при низкой концентрации в сыворотке крови они с высокой авидностью связываются с базофилами и тучными клетками. Подобно иммуноглобулинам других классов, легкие и тяжелые цепи IgE начинаются вариабельным доменом; попарно, один вариабельный домен легкой и тяжелой цепи формируют антиген-связывающий сайт. Главное отличие

заключается в структуре Fc-фрагмента: иммуноглобулин Е тяжелее IgG (150 кДа), что объясняется наличием одного дополнительного концевого домена тяжелой цепи Се4 (СН4), играющего центральную роль в механизме аллергической реакции. На уровне четвертичной структуры IgE является мономером. Известные структуры Fc-фрагмента IgE установлены методом рентгено-структурного анализа [27].

Низкий уровень IgE, циркулирующего в сыворотке крови, объясняется как низким содержанием IgE-секретирующих плазматических клеток, так и малым периодом полураспада молекулы в организме, порядка нескольких суток [28,29].

Инкубация IgE или антител против IgE, меченых радиоактивной меткой, выявило два основных клеточных партнера - меченые пробы с высокой аффинностью взаимодействуют с базофилами и с тучными клетками [30]. Базофилы - циркулирующие в крови большинства позвоночных гранулоциты. Данные клетки имеют цитоплазматические гранулы, содержащие большое количество медиаторов воспаления. Тучные клетки (мастоциты) - рассеянные по соединительной ткани клетки иммунной системы, так же являются гранулоцитами. Они в большом количестве присутствуют в поверхностных слоях эпидермальной ткани, например в желудочно-кишечном тракте или респираторной системе [1].

В работе Ochiai и др. [31] впервые было показано наличие мембранных рецепторов на определенных клетках иммунной системы, внеклеточные домены которых способны образовывать комплекс с IgE. Базофилы, равно как и тучные клетки, экспрессируют два типа рецепторов - FceRI и FcsRII [32,33]. Оба рецептора обладают высокой изотипической селективностью, вступая в реакцию исключительно с IgE, однако значительно отличаются по термодинамическим параметрам комплексообразования и играют различную физиологическую роль.

FcsRI, или высокоаффинный IgE-рецептор, был найден в мембранах базофил, мастоцитов, клеток Лангергарнса и эозинофилах. Одна клетка базофилов человека имеет от 40000 до 90000 копий данного рецептора на своей мембране. Рецептор состоит из четырех полипептидных цепей, двух связанных цистиновыми

остатками у-цепей, одной а и одной (3-цепи [34]. Две у-цепи формируют ковалентный димер, играющий регуляторную роль - их С-концы расположены в цитозоле и несут так называемый иммунорецепторный тирозин-активируемый мотив (1ТАМ) [35], являющийся мишенью для фосфорилирования сигнальными тирозин-киназами и запускающими сигнальный каскад, приводящий к дегрануляции гранулоцита. Иммуноглобулин Е-связывающую функцию играет а-цепь, на 1Ч-конце которой, экспонированной во внеклеточное пространство, присутствуют два достаточно гомологичных ^Е-связывающих домена а1 и а2, относящихся к структурному типу иммуноглобулинов [36]. Самой протяженной является (3-цепь, четыре раза проходящая через мембрану и играющая роль каркасного полипептида, связывая лиганд-связывающую а-цепь и регуляторные (3-цепи в единую структуру.

Поверхность контакта с Бс-фрагментом иммуноглобулина Е осуществляется а1- и а2- попарно с двумя константными доменами Се4 тяжелой цепи 1§Е, при этом Бс-фрагмент антитела меняет свою конформацию. Эксперименты, проводимые с растворимым фрагментом высокоаффинного ^Е-рецептора вБсеМ показали, что образуемый комплекс имеет бинарную структуру и обладает достаточно низкой константой диссоциации - порядка 10"10 М [37]. Циркулирующий уровень свободных 1§Е в сыворотке составляет порядка 10"7 М, и высокая аффинность позволяет, не смотря , на низкую концентрацию иммуноглобулина Е, обеспечить его высокую степень связывания с соответствующими клетками иммунитета.

Роль РсеЮ в механизме гиперчувствительности I типа подтверждается в экспериментах с лабораторными животными. Мыши, нокаутные по соответствующим генам и не способные экспрессировать высокоаффинный ^Е-рецептор, имеют нормальный уровень мастоцитов и базофил и не проявляют каких-либо симптомов анафилаксии при иммунизации аллергенами и их