Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффективность дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эффективность дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени"

На правах рукописи

Лободанов Сергей Александрович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОМ ДИАГНОСТИКИ ОРВИ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ 2013

ООБОбОЬЮ

Москва-2013

005060615

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Файзулоев Евгений Бахтиёрович

Официальные оппоненты:

Ленёва Ирина Анатольевна, доктор биологических наук, ФГБУ «НИИВС им. И.И.Мечникова» РАМН, заведующая лабораторией экспериментальной вирусологии,

Кицак Василий Яковлевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, заведующий кафедрой вирусологии.

Ведущая организация:

ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова»

Защита диссертации состоится 20 июня 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан «/(£» мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

РАМН.

кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) и грипп по числу случаев превосходят все другие инфекционные болезни вместе взятые. ОРВИ занимают первое место в структуре заболеваемости взрослых и детей болезнями органов дыхания и являются основной причиной обращений за медицинской помощью. Широкому распространению ОРВИ по всему миру способствуют аэрогенный путь передачи инфекции и большое количество самих респираторных возбудителей [Учайкин В.Ф., 2001]. Для вирусов, относящихся к возбудителям ОРВИ, характерны следующие общие черты - воздушно-капельный путь передачи, тропность вирусов к эпителию верхних и нижних дыхательных путей, сходные клинические проявления инфекционного процесса.

Исторически, гриппу уделяется наибольшее внимание, поскольку вирус гриппа вызывает эпидемии и пандемии, поражая людей всех возрастов, а заболевание часто протекает с осложнениями [Glezen W.P., 2000; Маринич И.Г., 1999]. Именно осложнения ответственны за летальность при гриппе, при этом их частота при гриппе может достигать 15-20% [Rothberg М.В., 2008; Treaner J.J., 2010].

Вместе с тем, остальным респираторным вирусам, к которым относятся аденовирусы (АДВ), риновирусы (РВ), респираторно-синцитиальный вирус (PCB), вирусы парагриппа 1-4 типа (ВПГ1-4), коронавирусы (KB) и некоторые другие, уделяется меньшее внимание. В то же время АДВ, PCB и ВПГ1-4 могут вызывать тяжелые поражения респираторного тракта (синдром крупа, бронхиолит, пневмония и др.) [Simoes Е.А., 2003]. Традиционно имеется представление, что такие респираторные патогены, как РВ и KB, ассоциированы исключительно с заболеваниями верхних дыхательных путей легкой и средней тяжести [Brittain-Long R., 2010]. В последнее время появились исследования, которые опровергают такое представление [Gaunt E.R., 2010; Busse W.W., 2010]. В 2003 г. мир столкнулся с угрозой пандемии атипичной пневмонии (тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, англ. SARS)). Вирус, выделенный от больных ТОРС, был идентифицирован как KB [Drosten С., 2003]. Имеются также

исследования, свидетельствующие о том, что риновирусы могут вызывать поражения и нижних дыхательных путей, "запуская" развитие таких тяжелых заболеваний, как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких [Gern J.E., 2010].

Традиционные методы идентификации респираторных вирусов имеют недостатки, прежде всего связанные с недостаточной чувствительностью (иммунофлуоресцентные методы), большой длительностью, трудоемкостью, неуниверсальностью процедуры (культуральный метод).

В настоящее время в лабораторной диагностике респираторных инфекций активно начинают использовать молекулярные методы, в том числе полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ее различные модификации. Самым перспективным методом диагностики ОРВИ является ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [Templeton К.Е., 2004; Mahony J., 2007].

Цели и задачи исследования

Целями настоящего исследования являлись: оценка эффективности дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, а также исследование видовой структуры риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе и оценка их роли в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.

Для реализации поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• разработать лабораторный образец набора реагентов для одновременного выявления 12 групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ;

• провести ПЦР-анализ панели клинических образцов, охарактеризованных в культуре клеток MDCK на наличие вирусов гриппа А и вирусов гриппа В;

• методом мультиплексной ПЦР-РВ проанализировать панели клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ неустановленной этиологии;

• провести внешний контроль качества ПЦР-диагностики ОРВИ, приняв участие в международной программе контроля качества молекулярной диагностики;

• оценить диагностическую ценность метода мультиплексной ПЦР-РВ по показателям диагностической чувствительности, специфичности и воспроизводимости;

• на основе метода ПЦР-РВ отработать условия дифференциального выявления разных видов риновирусов и коронавирусов;

• изучить видовое разнообразие риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе;

• оценить роль риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.

Научная новизна

Разработана и апробирована оригинальная тест-система для одновременного выявления в клинических образцах от больных с диагнозом ОРВИ 12 основных групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ: вирусов гриппа А и В (ВГА и ВГВ), вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, бокавирусов (БВ), респираторно-синцитиального вируса, риновирусов, энтеровирусов и коронавирусов.

Используя разработанную в ходе выполнения работ ПЦР-тест-систему, впервые в России дана всесторонняя и объективная оценка диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики ОРВИ.

Изучено видовое разнообразие риновирусов и коронавирусов, циркулировавших на территории Москвы и Московской области в период с 2007 по 2012 гг. Показана одновременная циркуляция всех видов риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С), а также четырех видов коронавирусов - 229Е, ОС43, ЫЬ63 и ШШ1.

Предложен комплексный подход к изучению видовой структуры таких широко распространенных респираторных вирусов, как риновирусы и коронавирусы в этиологии ОРВИ. Дана дифференциальная клиническая оценка этих патогенов.

Практическая значимость

1. Разработаны методические подходы, которые легли в основу набора реагентов «ОРВИ-Монитор». Приказом Росздравнадзора данный набор разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации. Эта ПЦР-тест-система может быть использована службами эпидемиологического надзора при мониторинге ситуации по гриппу и ОРВИ, а также в клинической практике для постановки этиологического диагноза пациентам с ОРВИ.

2. Получен патент РФ №2460803 от 10.09.2012 «Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления».

Положения, выносимые на защиту

1. Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени является эффективным методом дифференциальной диагностики ОРВИ. Доля расшифрованных случаев ОРВИ превышает 70% при условии соблюдения критериев отбора, хранения и транспортировки образцов, а также при использовании качественных наборов для выделения вирусной РНК.

2. Разработан экспериментальный набор реагентов (ЭНР) для одновременного выявления в клинических образцах двенадцати основных возбудителей ОРВИ методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

3. Метод мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени при выявлении вирусов гриппа А (ВГА) и вирусов гриппа В (ВГВ) значительно превосходит по диагностической чувствительности метод изоляции вирусов гриппа в культуре клеток МОСК.

4. На территории Московского региона в настоящее время циркулируют все виды риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С) и коронавирусы КВ-ИЬбЗ, КВ-229Е, КВ-ОС43 и КВ-НКШ.

5. Вопреки общепринятому представлению риновирусы и коронавирусы являются возбудителями не только простудных заболеваний. У детей эти

патогены с высокой частотой вызывают и более тяжелые заболевания, требующие госпитализации.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008), II научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2009), XIX международном ежегодном конгрессе «19th Annual Congress of the European Respiratory Society» (г. Вена, Австрия, 2009), XIV международном ежегодном конгрессе «14th Congress of the Asian Pasific Society of Repirology (APSR) and 3rd Joint Congress of the APSR/American College of Chest Physicians» (г. Сеул, Южная Корея, 2009), III ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2011), II межрегиональной научно-практической конференции молодых ученных «Человек: здоровье и экология» (г. Иркутск, 2011), X съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва, 2012).

Апробация диссертации состоялась 28.03.2013 г. на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК и 7 тезисов в сборниках российских и международных конгрессов и конференций. Получен патент РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 18 рисунками. Работа и состоит из введения,

обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты и обсуждение исследования), выводов, списка литературы, содержащего 290 источников, из которых 51 отечественный и 239 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

За период 2007-2012 гг. было проанализировано 815 клинических образцов, представленных назальными мазками или смывами, полученных от пациентов всех возрастных категорий с симптомами ОРВИ из лечебно-профилактических учреждений Москвы и Московской области. Образцы были получены как от госпитализированных пациентов, так и от лечившихся амбулаторно.

Для выделения нуклеиновых кислот (НК) вирусов из образцов использовали коммерческие наборы реактивов фирм «Qiagen», Германия («QIAmp Viral RNA mini kit») и «Zymo Research», США («ZR Viral RNA Kit™»).

При постановке реакций обратной транскрипции и ПЦР-РВ использовали «Реакционную смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ» (ЗАО «Синтол», Россия). Праймеры и зонды для ПЦР-РВ, меченные различными флуоресцентными метками (FAM, R6G, ROX и Су5), были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия).

В качестве референтных были выбраны следующие наборы для ПЦР-диагностики ОРВИ: зарубежный набор реагентов, предназначенный для выявления 12 респираторных вирусов - ВГА, ВГВ, ВПГ 1-4, PCB, РВ, метапневмовируса (МПВ), KB NL63, 229Е и ОС43. Данный набор разработан и используется для рутинной диагностики в отделе микробиологии медицинского центра Лейденского университета (Нидерланды) (далее - нидерландская тест система); наборы реагентов «АмплиСенс® Influenza virus A/B-FL» (для выявления ВГА и ВГВ) и «АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL» (для выявления PCB, РВ, KB, ВПГ1-4, МПВ, БВ и АДВ) производства ООО «ИнтерЛабСервис», Россия.

Анализ вирусных геномов, подбор нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов проводили с помощью компьютерных программ FastPCR professional v. 6.1.32.beta3 («PrimerDigital Ltd.», Финляндия), Omiga v. 2.0 («Oxford

Molecular Ltd.», США) и Vector NTI Advance v. 9.0 («InforMax Inc.», США), а также Интернет-программы BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (NCBI, США).

При постановке реакции обратной транскрипции (ОТ) 6 пмоль праймера для ОТ смешивали с 8 мкл НК и прогревали в течение 5 минут при 65°С. Далее в 25 мкл реакционной смеси, содержащей, помимо праймера и РНК, 10 мкл «Реакционной смеси 2,5х для проведения ПЦР-РВ» (ЗАО «Синтол», Россия), 25 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони (MMLV) в течение 30 минут при 42°С получали кДНК. Фермент инактивировали нагреванием при 95°С в течение 5 минут. Далее образцы анализировали в ПЦР-РВ.

В работе использовали модификацию ПЦР, названную нами "двухэтапная ОТ-ПЦР в одной пробирке". Данная модификация предусматривала поэтапное получение кДНК и проведение ПЦР-РВ в одной пробирке. При постановке мультиплексной ПЦР-РВ амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, которая содержала 10 мкл 2,5х реакционной смеси для ПЦР-РВ (ЗАО «Синтол», Россия), смесь 3-х или 4-х наборов праймеров (по 6 пмоль каждого праймера), 3 или 4 зонда (по 5 пмоль каждого зонда), 2,5 ед. Hot Start Taq-ДНК-полимеразы и 25 мкл кДНК. Реакцию проводили в термоциклере АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), либо ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Программа ПЦР: 95°С - 90 сек - 1 цикл; 95°С - 20 сек, 57°С - 40 сек - 45 циклов. Достоверное превышение величины флуоресцентоного сигнала над интенсивностью фоновой флуоресценции, выраженное в значении порогового цикла (ПЦ), являлось критерием положительного результата. Величину порогового цикла определяли с помощью программного обеспечения к приборам АНК-32 и ДТ-96 согласно руководству, прилагаемому к соответствующему прибору.

Для анализа характера варьирования данных, полученных в ходе экспериментов, использовали стандартное отклонение (SD). Данные представлены в виде M±SD, где М - среднее арифметическое. Сравнение достоверности разницы между средними показателями в независимых выборках

проводили с помощью меритерия Стьюдента. Различия статистически значимые при уровне значимости р<0,05.

принимали за

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация условий выявления 12 групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ

Подбор последовательностей праймеров и зондов к консервативным участкам геномов респираторных вирусов и вируса, представляющего внутренний положительный контроль (ВПК, вакцинный штамм вируса краснухи ЯА 27/3), осуществляли в соответствии с общепринятыми критериями.

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов приведены в патенте РФ № Яи 2460803 [Файзулоев Е.Б. с соавт., 2012].

Специфичность праймеров и зондов подтверждена ростом сигналов флуоресцентных красителей в моноспецифической ПЦР-РВ на РНК или ДНК соответствующих лабораторных штаммов вирусов, а также была подтверждена электрофоретическим анализом ампликонов.

С целью определения оптимальных комбинаций праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР-РВ была проведена серия экспериментов. При формировании реакционных смесей для мультиплексной ПЦР были опробованы различные комбинации праймеров и зондов. При этом, одним из основных критериев при выборе оптимальной комбинации праймеров и зондов была эффективность ПЦР, определяемая значениями пороговых циклов. Этот этап являлся важным, поскольку в мультиплексной ПЦР возможно неспецифическое взаимодействие праймеров в реакционной смеси (образование вторичных структур в виде шпилек, а также образование термодинамически стабильных гомо- и гетеродимеров) и, как следствие, снижение чувствительности анализа. Весь набор нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов на 13 специфичностей (12 респираторных вирусов и вирус для ВПК) проверялся с помощью программы Раз1РСЯ на взаимодействие друг с другом.

На основе подобранных праймеров и зондов было сформировано 4 реакционных смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ: 1 смесь - для выявления АДВ, БВ, ВПК; 2 смесь - ВГВ, РСВ, РВ; 3 смесь - ВПГ 1-4 и 4 смесь - ВГА, ЭВ, КВ (таблица 1).

Таблица №1. Распределение вирусспецифических праймеров и зондов по реакционным смесям в мультиплексной ПЦР-РВ.

Флуоресцентный краситель Длина волны (макс, поглощения, нм/ макс, флуоресценции, нм) Реакционная смесь

№1 №2 №3 №4

РАМ 490/520 АДВ - ВПГ4 ВГА

Ябв (НЕХ, ЮЕ)* 520/550 - ВГВ ВПГЗ ЭВ

КОХ 580/610 БВ РСВ ВПГ2 КВ

Су5 645/670 ВПК РВ ВПГ1 -

*В разных приборах канал, детектирующий интенсивность флуоресценции (и соответствующий флуорофор) при данных волновых характеристиках, может называться по-разному.

Следующим этапом была работа по подбору оптимальных условий проведения реакций мультиплексной ОТ и ПЦР. В отдельных экспериментах была оптимизирована концентрация праймеров для ОТ и ПЦР-РВ. Так, изначально в состав реакционных смесей для мультиплексной ОТ входило от одного до четырех праймеров для ОТ. То есть, для каждой реакционной смеси существовала своя смесь для ОТ.

Важным этапом работ по усовершенствованию ЭНР стал переход от четырех мультиплексных смесей праймеров для ОТ, к смеси, которая содержала все 13 праймеров для ОТ. Это значительно упростило процедуру постановки ОТ и уменьшило риск ошибки оператора. При этом была снижена концентрация праймеров для ОТ с 6 пмоль на реакционную смесь (объём 25 мкл) до 2 пмоль каждого праймера. Следует отметить, что такое изменение концентрации не отразилось на выявлении контрольных образцов и значениях ПЦ, тогда как дальнейшее снижение концентрации праймеров для ОТ приводило к снижению

угла наклона кривой роста интенсивности флуоресценции и увеличению значений ПЦ в ПЦР-РВ. Концентрации праймеров для ПЦР-РВ были снижены в 2 раза, с 12,5 пмоль на реакционную смесь (объём 50 мкл) до 6 пмоль, дальнейшее снижение концентрации вело к ухудшению эффективности ПЦР-РВ.

В результате были определены оптимальные концентрации праймеров и зондов для каждой реакционной смеси, а также температурно-временной режим амплификации ПЦР-РВ (см. Материалы и методы).

Важным этапом работы являлась разработка пулов положительных контрольных образцов (ПКО). Пулы ПКО анализируются при каждой постановке ПЦР-РВ. В случае отсутствия роста интенсивности флуоресценции по какому-либо из каналов в пулах ПКО результаты не подлежат учету. В таких случаях необходимо полностью повторить анализ. Пулы ПКО изначально создавались как смесь из разведенных в определенной степени образцов лабораторных штаммов респираторных вирусов и смешанных таким образом, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 26-32 цикле.

С целью получения пулов ПКО были выделены НК из следующих образцов лабораторных штаммов респираторных вирусов: АДВ 3 типа, ЭВ (полиовирус 1 типа, штамм Сэбина), KB ОС-43, KB 229Е, ВПК (вирус краснухи, штамм RA-27/3), ВГА (Panama/2007/99, H3N2; Puerto-Rico/8/34, H1N1; Сингапур/1/57, H2N2), ВГВ (Ленинград/179/86), PCB (штамм Long), РВ 16 типа, ВПГ1, ВПГ2, ВПГЗ, ВПГ4. Полученные препараты НК легли в основу контрольных образцов ЭНР. Далее НК, выделенные из контрольных образцов, были проанализированы методом ПЦР-РВ как в моноспецифическом, так и в мультиплексном формате с использованием ЭНР в приборе ДТ-96.

Был проведен сравнительный статистический анализ моноспецифического и мультиплексного формата проведения ПЦР-РВ. При сравнении результатов анализа контрольных образцов с фактором разведения 10"1 достоверной разницы между средними в значениями ПЦ для моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ при выбранном уровне значимости (р<0,05) отмечено не было. То есть,

эффективность двух рассматриваемых форматов проведения ПЦР-РВ сопоставима.

Эти данные позволили перейти к приготовлению пулов ПКО ЭНР. Из НК контрольных образцов были приготовлены следующие пулы ПКО: ПК01 (АДВ, БВ, ВПК); ПК02 (ВГВ, PCB, РВ); ПКОЗ (ВПГ1, ВПГ2, ВПГЗ, ВПГ4) и ПК04 (ВГА, ЭВ, КВ) (таблица 2).

Таблица №2. Апробация ЭНР на пулах положительных контрольных образцов (ПК01, ПК02, ПКОЗ и ПК04).

ПКО Вирус (значение ПЦ+SD)

Исходная НК Разведение 1:10

ПК01 АДВ (30,0+0,1) АДВ (33,2+0,1)

БВ (32,1+0,1) БВ (Зб,1±0,4)

ВПК (29,0+0,1) ВПК(31,6±0)

ПК02 ВГВ (32,2+0,2) ВГВ (33,8±0,3)

PCB (32,3+0,1) PCB (35,8+0,4)

РВ (31,1±0,1) РВ (32,6+0)

ПКОЗ ВПГ1 (29,4+0,2) ВПГ1 (33,6+0,1)

ВПГ2 (27,9+0,3) ВПГ2 (31,8+0,1)

ВПГЗ (29,0+0,1) ВПГЗ (32,6+0,1)

ВПГ4 (28,5±0,2) ВПГ4 (32,9±0,1)

ПК04 ВГА (31,2±0,2) ВГА (35,2+0,4)

ЭВ (25,4+0,1) ЭВ (28,7+0,1)

КВ (28,4+0,1) КВ (31,5+0,1)

Использование в качестве контролей РНК и ДНК, выделенных из культуральных или клинических вируссодержащих образцов, имеет ряд недостатков. Так, например, нельзя использовать культуральные и клинические образцы для контроля аналитической чувствительности выявления отдельных респираторных вирусов, поскольку в этих образцах невозможно установить концентрацию вирусной НК. Для оценки и контроля аналитической чувствительности не подходят также культуральные вируссодержащие образцы с известным титром, поскольку неизвестно соотношение в них инфекционных вирионов, дефектных (неинфекционных) вирионов и репликативных форм вирусных НК.

С целью получения образцов вирусных НК с известной концентрацией были получены фрагменты вирусных НК в составе плазмиды рСЕМ®Т-Еа5у («Ргошеяа», США) или РНК-транскриптов, содержащие сайты посадки для праймеров и зондов набора реагентов. Плазмиды, несущие фрагменты геномов РНК-содержащих вирусов, использовали для получения транскриптов. С этой целью сначала была определена нуклеотидная последовательность области вставки, подтверждена принадлежность ее соответствующему вирусу, определена ориентация вставки относительно промотров Т7 и £Р6 и выбран промотор. В реакции транскрипции были получены фрагменты геномов вирусов ВГА, ВГВ, ЭВ, РСВ, РВ, КВ, ВПГ1, ВПГ2, ВПГЗ, ВПГ4 и ВПК. Каждый транскрипт разбавляли в 100000 раз водой, свободной от РНКаз и содержащей ро1уА (конечная концентрация 0,05 мкг/мкл), и анализировали в 2 реакциях: ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-РВ (таблица 3). Как видно из таблицы 3, в реакции ОТ-ПЦР-РВ вирусная РНК определялась на 16 и более циклов раньше, чем остаточная ДНК в ПЦР-РВ, что соответствует разнице в концентрации РНК и ДНК не менее чем в 104 раз. Это свидетельствует о высокой эффективности удаления плазмидной ДНК из препаратов транскриптов, а также о высоком качестве самих транскриптов. На основе полученных данных были выработаны рекомендации по изготовлению контрольных образцов на основе плазмид или РНК-транскриптов, содержащих сайты посадки для праймеров и зондов ЭНР.

По итогам работ на ЭНР был подготовлен проект нормативно-технической документации, регламентирующий процессы изготовления и применения набора реагентов, включающий технические условия (ТУ) и инструкцию по применению набора.

Таблица ЖеЗ. Описание транскриптов, содержащих фрагменты геномов респираторных вирусов.

N Транскрипт (разведение) ОТ-ПЦР (ПЦ±80) ПЦР (ПЦ±80) Размер ампликона (н.) Размер транскрипта (н.)

1 ЭВ (Ю-5) 17,0+0 35,3+0,4 202 292

2 КВ ОС-43 (10 5) 16,6+0,1 37,1±0 96 186

3 ВПК (10"6) 20,3±0,1 36,7+0 120 460

4 ВГВ (10 5) 16,0+0 39,4 244 349

5 РСВ (10"5) 16,7+0,1 37,4+0,4 121 211

6 РВ (10 5) 20,4+0,4 39,4+0,4 203 308

7 ВПГ4(10"6) 17,8+0,7 37,9±1,2 107 197

8 ВПГЗ (10-5) 16,8+0,4 42,0 142 232

9 ВПГ2 (10 5) 20,3±0,3 отр. 241 346

10 ВПГ1 (105) 14,7 42,0+0 163 268

11 ВГА (10~5) 23,7 отр. 240 350

Определение диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для расшифровки случаев ОРВИ

Для оценки диагностической ценности метода ПЦР-РВ для выявления широкого спектра вирусов - возбудителей ОРВИ требовались репрезентативные выборки клинических образцов, в том числе охарактеризованных референтными методами на наличие респираторных вирусов.

На начальном этапе апробации ЭНР был проведен сравнительный анализ панели клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ зарубежным набором реагентов на основе мультиплексной ПЦР-РВ (нидерландская тест-система) и разрабатываемым набором. Всего двумя наборами было проанализировано 226 клинических образцов. Результаты выявления вирусов, проанализированных обеими системами (ВГВ, ВГА, РСВ, ВПГ1, ВПГ-2, ВПГ-3, ВПГ-4, РВ, КВ), совпали на 97%.

Следующим этапом работы стал сравнительный анализ выявления вирусов гриппа в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и методом изоляции вирусов в культуре

клеток MDCK. В работе исследовали 267 образцов носоглоточных смывов от больных с симптомами гриппа, полученных в течение двух эпидемических сезонов (151 образец в сезоне 2008-09 гг. и 116 - в сезоне 2009-10 гг.). Изоляцию ВГА и ВГВ в культуре клеток MDCK, а также индикацию и идентификацию ВГА и ВГВ проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ [WHO: Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza]. Далее эти же образцы исследовались ЭНР. Результаты анализа двумя методами и их сравнение представлены в таблице 4.

Таблица №4. Сравнение результатов анализа клинических образцов (п=267) методом изоляции вирусов гриппа А и В в культуре клеток МйСК и мультиплексной ПЦР-РВ.

Выявление случаев

ВГА ВГВ ВГА+ВГВ

Кол-во положительных образцов в КК* 35 49 84

Кол-во положительных образцов в ПЦР-РВ 48 56 104

Кол-во положительных образцов в КК, но отрицательных в ПЦР-РВ 2 2 4

Кол-во положительных образцов в ПЦР-РВ, но отрицательных в КК 13 9 22

Доля положительных образцов в ПЦР-РВ от числа положительных в КК (диагностическая чувствительность) 95,2% (80/84)*(100)%

*КК - метод изоляции вирусов в культуре клеток MDCK

В общей сложности при помощи мультиплексной ПЦР-РВ вирусы гриппа были достоверно выявлены в 39,0 % случаев (п=104), а в культуральном методе -в 31,4% (п=84). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что мультиплексная ПЦР-РВ значительно превосходит по диагностической чувствительности метод выявления вирусов гриппа в культуре клеток.

Завершающим этапом работ по сравнению ЭНР с референтными методами был анализ панели клинических образцов (п=89) от больных с симптомами ОРВИ с использованием в качестве референтных наборов АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL и АмплиСенс® Influenza virus A/B-FL (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).

Результаты анализа панели клинических образцов ЭНР и коммерческими наборами совпали на 94,3%.

Кроме тех образцов, которые анализировались референтными методами, с использованием ЭНР были исследованы 233 клинических образца от больных ОРВИ с неустановленной этиологией, то есть, не тестированных ранее на наличие респираторных вирусов каким-либо методом.

Далее результаты анализа ЭНР клинических образцов на наличие НК респираторных вирусов были объединены, что позволило представить результаты исследования 815 клинических образцов в обобщенном виде. Следует отметить, что из этой панели с применением референтных методов и наборов было исследовано 582 образца. Анализ 815 образцов набором ЭНР позволил выявить НК респираторных вирусов в 423 образцах, что составляет 51,9% (рисунок 1).

региона. Mix - образцы со смешанной (микст) вирусной инфекцией.

Следует особо отметить, что при исследовании отдельных панелей клинических образцов, при получении которых должным образом соблюдались

правила и критерии отбора, хранения и транспортировки образцов, доля положительных образцов достигала 72%.

Известно, что заболевания, сопровождающиеся клинической картиной ОРВИ, могут вызываться широким спектром бактериальных патогенов (S. pneumoniae, Н. Influenza, М. catarrhalis и др.). Таким образом, для обозначения острых инфекций респираторного тракта более корректно представляется использовать термин острые респираторные заболевания (ОРЗ). С другой стороны, термином ОРВИ широко пользуются практикующие врачи, хотя это идет вразрез с Международным классификатором болезней 10 пересмотра, в котором подобная нозология отсутствует.

Следующим этапом работ стала независимая оценка диагностической ценности набора реагентов. Для этого были приобретены и проанализированы следующие панели зашифрованных образцов QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics, Великобритания), представленные наборами образцов респираторных вирусов: Adenovirus (ADVDNA10); Influenza virus А & В (INFRNA10); Human Metapneumovirus & Respiratory Syncytial virus (MPV.RSV10); Parainfluenza virus (PINFRNA10); Rhinovirus & Coronavirus (RV.CVRNA10); Enterovirus and Parechovirus (EV.RNA10).

Всего в этих 6 панелях были представлены 11 групп вирусов, анализируемых разработанньм набором реагентов. Панели представлены хорошо охарактеризованными образцами, содержащими респираторные вирусы различных видов и типов, и включающие образцы, как со средним, так и низким содержанием вирусных НК. Количество образцов - от 8 до 12 образцов в каждой панели. Из образцов панелей были выделены НК и исследованы ЭНР. Результаты анализа были оформлены в соответствии с требованиями QCMD и отправлены в штаб-квартиру этой организации для оценки. По завершении каждой из программ QCMD передала результаты внешней оценки качества. В целом результаты оказались на уровне среднемировых. Таким образом, итоги участия в программах QCMD следует признать удовлетворительными.

Завершающим этапом стало определение диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для расшифровки случаев ОРВИ. Пользуясь общепринятыми методами определения показателей диагностической ценности наборов для диагностики инфекционных заболеваний, были рассчитаны следующие параметры:

- диагностическая чувствительность - 96,7% (таблица 5);

- диагностическая специфичность - 99,2%;

- воспроизводимость - 96,7%.

Таблица №5. Расчет диагностической чувствительности ЭНР.

Количество Количество положительных

Вирус положительных образцов в референтном методе/ЭНР образцов совпавших с референтным методом/кол-во положительных образцов в референтном методе Диагностическая чувствительность

вгв 112/116 108/112 96,4%

ВГА 76/78 74/76 97,4%

PB 25/28 22/25 88,0%

РСВ 5/5 5/5 100%

KB 13/13 13/13 100%

АДВ 6/6 6/6 100%

БВ 11/11 11/11 100%

ВПГ1 3/3 3/3 100%

ВПГ2 8/8 8/8 100%

ВПГЗ 4/4 4/4 100%

ВПГ4 3/3 3/3 100%

В целом по 11 вирусам 266/275 96,7%

Данные показатели свидетельствуют о высокой диагностической ценности разработанного набора реагентов и метода ПЦР-РВ, лежащего в его основе.

Исследование видовой структуры риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе

Известно, что РВ и KB являются основными возбудителями простудных заболеваний [Turner R.B., 2010]. Анализ новых научных данных свидетельствует о все возрастающей роли этих патогенов в развитии не только респираторных заболеваний легкой и средней тяжести, сопровождающихся поражением верхних

дыхательных путей, но и более тяжелых заболеваний, вплоть до развития пневмонии [O'Callaghan-Gordo С., 2011]. Благодаря успехам в развитии молекулярно-генетических методов стала возможна дифференциальная диагностика видов РВ и KB, циркулирующих в популяции. Данные, полученные в результате этих исследований, свидетельствуют о том, что виды РВ и KB различаются по патогенности и, возможно, вирулентности [Lee W.M., 2012].

В связи с этим, целью данного раздела работ стало исследование видового разнообразия РВ и KB, циркулирующих в Московском регионе, а также изучение связи видов РВ и KB с тяжестью заболеваний, вызванных данными вирусами. Для достижения этой цели надо было решить следующие задачи:

1. Подобрать последовательности праймеров и зондов для определения трёх видов РВ.

2. Отработать условия дифференциального выявления разных видов РВ и KB методом ПЦР-РВ.

3. Провести ПЦР-РВ-анализ образцов, охарактеризованных ранее с помощью лабораторного набора реагентов на наличие РНК РВ, с целью определения вида РВ.

4. Определить методом ПЦР-РВ видовую структуру KB в образцах, содержащих РНК КВ.

5. Оценить роль разных видов РВ и KB в этиологии ОРВИ различной степени тяжести и провести анализ полученных данных.

Для дифференциального выявления в реакции ОТ-ПЦР-РВ четырех видов KB (229Е, ОС43, NL63 и HKU1), были использованы видоспецифические праймеры и зонды, синтезированные в соответствии с последовательностями, опубликованными в статье Gaunt E.R. с соавторами [Gaunt E.R., 2010]. Для дифференциального выявления трех видов РВ: РВ-А, РВ-В и РВ-С были подобраны последовательности видоспецифических праймеров и зондов. Далее на панелях лабораторных штаммов РВ-А (серотипы 2, 14, 15, 20, 59) и РВ-В (серотипы 14, 17, 70, 72, 86) была проверена аналитическая специфичность выявления РВ разных видов, а также были определены оптимальные

концентрации компонентов реакционных смесей и подобрана схема температурно-временного режима амплификации. Также была оценена аналитическая специфичность выявления КВ.

Далее из 815 клинических образцов, охарактеризованных на наличие вирусов, возбудителей ОРВИ были отобраны те, которые содержали РНК PB и/или КВ. В реакции ПЦР-РВ была определена видовая структура PB и КВ (таблица 6 и таблица 7).

Таблица К«6. Видовое распределение РВ, циркулировавших на территории Московского региона в период 2007-2012 гг.

Видовое распределение РВ РВ-А РВ-В РВ-С неустаиовлен Общее количество

Кол-во случаев 34 4 19 б 63

Таблица №7. Видовое распределение КВ, циркулировавших на территории Московского региона в период 2007-2012 гг.

Видовое распределение КВ 229Е NL63 HKU1 ОС43 Общее количество

Кол-во случаев 3 9 7 10 29

Для подтверждения результатов определения вида РВ методом ПЦР-РВ было проведено выборочное секвенирование 5'-нетранслируемого региона риновирусного генома. Были отобраны 8 образцов. По результатам ПЦР-анализа один РВ был отнесен к виду РВ-А, один - к РВ-В и один к РВ-С (коровые образцы). Остальные пять образцов содержали предположительно РВ-С. Данные секвенирования подтвердили в целом данные полученные при ПЦР-анализе. То есть, вид, определенный в результате секвенирования для коровых образцов совпал с видом, определенным в результате ПЦР-анализа. А из пяти спорных образцов, в результате ПЦР предположительно отнесенных к РВ-С, два оказались РВ-А. Для остальных трёх образцов наличие РВ-С подтвердилось. На основе расшифрованных участков геномных последовательностей исследуемых вирусов и референтных штаммов (с известным видом и серотипом или генотипом) с

использованием программ Vector NTI Advance и FigTree было построено филогенетическое дерево (рисунок 2).

Рисунок №2. Филогенетический анализ геномов РВ, отсеквенированных в данной работе. Кругами отмечены образцы РВ, проанализированные секвенированием. 1*) -РВ strain NAT045 (вид С); 2*) - РВ strain PHL-TTa331S-2008 (вид С); 3*) - РВ strain PHL-TTa424-2008 (вид С). Буквенно-цифровые обозначения - названия вида и типа референсных штаммов.

Таким образом, в результате были выявлены все известные на сегодняшний день виды РВ (РВ-А, РВ-В и РВ-С) и KB (229Е, ОС43, NL63 и HKU1). Исключение составляет лишь коронавирус ТОРС, анализ на наличие которого не проводился, поскольку его циркуляция по данным литературы практически прекратилась.

На следующем этапе работ полученные данные были соотнесены с клинической картиной у пациентов и проведена обработка результатов с целью проверки гипотезы о различии в патогенности разных видов РВ и КВ. Для этого были отобраны только те образцы, в которых выявлялся только один вирус, то есть образцы с моноинфекцией (РВ и KB, соответственно). В случае смешанной инфекции роль этих вирусов в этиологии заболевания являлась неопределенной.

Всего было отобрано 52 образца, содержащих РНК РВ и 25, содержащих РНК КВ. В качестве показателя повышенной патогенности вируса служил факт госпитализации больного. Распределение видов РВ и КВ в образцах из групп амбулаторных и стационарных больных показано в таблице 8 и таблице 9.

Таблица М8. Распределение видов РВ, выявленных у амбулаторных и стационарных больных. _ ___

РВА (в т.ч. дети*) РВВ (в т.ч. дети) РВС (в т.ч. дети) Вид не определен (в т.ч. дети) Всего (в т.ч. дети)

Стационарные больные 6(3) 1(0) 7(7) 2(1) 16(11)

Амбулаторные больные 22(16) 3(2) 7(2) 4(3) 36 (23)

Всего 28 (19) 4(2) 14 (9) 6(4) 52 (34)

* - дети в возрасте от 4 месяцев до 3 лет.

Таблица №9. Распределение видов КВ, выявленных у амбулаторных и стационарных больных. _

229Е N1.63 НКШ ОС43 Всего

Стационарные 0 7 0 6 13

больные*

Амбулаторные з 0 6 з 12

больные**

Всего 3 7 6 9 25

* все стационарные пациенты - дети (1-5 лет) ** все амбулаторные пациенты - взрослые (старше 16 лет)

Показано, что большая доля госпитализированных пациентов с РВ-инфекцией была выявлена в группе больных с РВ-С-инфекцией. Следует отметить, что все госпитализированные больные, у которых был идентифицирован РВ-С, являлись детьми от 0,5 до 3 лет.

Большинство тяжелых случаев течения КВ инфекции, повлекших госпитализацию больного, связаны с инфицированием КВ N1.63 и ОС-43, тогда как у пациентов, лечившихся амбулаторно, в основном были выявлены КВ НКШ и 229Е. Кроме того, все случаи обнаружения коронавирусов N1,63 и ОС43 среди стационарных пациентов приходились на детей 1-5 лет.

Полученные данные могут служить подтверждением гипотезам о различии в патогенности различных видов РВ и KB, выдвинутым рядом научных групп [Lee W.M., 2012; Mackay I.M., 2012; Fielding B.C., 2011].

ВЫВОДЫ

1. Разработана и апробирована ПЦР-тест-система для дифференциального выявления нуклеиновых кислот 12 респираторных вирусов (вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, бокавирусов, респираторно-синцитиального вируса, риновирусов, энтеровирусов и коронавирусов) в клиническом материале методом мультиплексной обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

2. ПЦР-анализ на широкий спектр респираторных вирусов при соблюдении правил и критериев отбора, хранения и транспортировки клинических образцов позволяет определить этиологию ОРВИ более в чем 70% случаев.

3. Показана высокая диагностическая ценность разработанной ПЦР-тест-системы: диагностическая чувствительность составила 96,7%, диагностическая специфичность - 99,2% и воспроизводимость - 98,1 %.

4. Метод мультиплексной ПЦР-РВ по диагностической чувствительности выявления вирусов гриппа А и В значительно превосходит метод изоляции данных вирусов в культуре клеток MDCK.

5. Установлено, что на территории Московского региона в настоящее время циркулируют все виды риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С) и коронавирусы NL63, 229Е, ОС43 и HKU1.

6. Отдельные виды риновирусов и коронавирусов вызывают у детей тяжелые респираторные заболевания.

7. У 78% детей с риновирусной С инфекцией наблюдались случаи тяжелого течения заболевания, потребовавшее госпитализацию, а среди детей, у которых выявили коронавирусы ОС43 и NL63, госпитализированы были все 100%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никонова A.A., Файзулоев Е.Б., Оксанич A.C., Лободанов С.А., Фошина Е.П., Успенская Е.С., Каира А.Н., Зверев В.В. Одновременное выявление десяти групп респираторных вирусов в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени // Материалы IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - 2008. - С.81.

2. Никонова A.A., Успенская Е.С., Лободанов С.А., Оксанич A.C., Горбаленя А.Е., Eric C.J. Claas, Фошина Е.П., Каира А.Н., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Применение метода мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - N1. - С. 67-70.

3. Никонова A.A., Лободанов С.А., Трушакова C.B., Шевченко Е.С., Файзулоев Е.Б. Совершенствование методов выявления респираторных вирусов в клинических образцах // Материалы II научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ». - Москва, 28-29 мая 2009. - С.24.

4. Nikonova A., Lobodanov S., Oksanich A., Claas E.C.J., Zverev V., Faizuloev E. Use of a multiplex real-time PCR for differential diagnosis of respiratory viral infections // 19th Annual Congress of the ERS, Austria, Vienna, September 12-16 2009, v.34, s.53, p.590s.

5. Nikonova A., Lobodanov S., Trushakova S., Shevchenko E., Faizuloev E. Multiplex Realtime PCR for Impovement Diagnosis of the Respiratory Tract Infections // 14th Congress of the APSR and 3rd Joint Congress of the APSR/ACCP, Korea, Seoul, November 14-18 2009, v,14,p.A235.

6. Никонова A.A., Успенская E.C., Лободанов C.A., Оксанич A.C., Горбаленя А.Е., Клаас Э., Фошина Е.П., Каира А.Н., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Применение мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (сб. научных статей - выпуск 9). -2009.-С. 381-385.

7. Лободанов С.А., Файзулоев Е.Б., Трушакова C.B., Никонова A.A., Забияка Ю.И., Иванова В.Т., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. Оценка эффективности дифференциальной диагностики гриппа методом мультиплексной ПЦР // Материалы

III ежегодного всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 28-30марта2011.-С. 214.

8. Лободанов С. А., Никонова A.A., Полухина Г.М., Забияка Ю.И., Фильченкова Ф.Э., Каира А.Н., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Роль риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ// Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2011, №3(79). Часть 1. - С. 165-167.

9. Лободанов С.А., Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Забияка Ю.И., Каира А.Н., Зверев В.В. Этиология ОРВИ: новые аспекты // Санитарный врач. - 2011. - №10. - С. 4952.

10. Файзулоев Е.Б., Лободанов С.А., Никонова A.A., Каира А.Н., Полухина Г.М., Трушакова C.B., Шевченко Е.С., Калинкина М.А., Зверев В.В. Дифференциальная диагностика ОРВИ методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2012. - №1(62). - С. 12-18.

11. Лободанов С.А., Никонова A.A., Файзулоев Е.Б., Трушакова C.B., Забияка Ю.И., Калинкина М.А., Иванова В.Т., Шевченко Е.С., Зверев В.В., Бурцева Е.И. Оценка эффективности дифференциальной диагностики гриппа методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени // Вопросы вирусологии. - 2012. - Т. 57. -№1,- С. 42-45.

12. Патент РФ № 2460803: Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления // Авторы: Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Оксанич A.C., Лободанов С.А., Малахо С.Г., Зверев В.В. Опубликован: 10.09.2012.

13. Лободанов С.А., Никонова A.A., Забияка Ю.И., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Роль риновирусов и коронавирусов а этиологии ОРВИ различной степени тяжести // Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации». - Москва, 12-13 апреля 2012. - С. 191-192.

Подписано в печать 14.05.2013 г. Усл.п.л. - 1.5 Заказ № 13093 Тираж: 100 экз. Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лободанов, Сергей Александрович, Москва

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФГБУ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМ И.И. МЕЧНИКОВА РАМН

На правах рукописи

04201357967

ЛОБОДАНОВ Сергей Александрович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОРВИ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

(03.02.02 - вирусология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Г

Научный руководитель:

кандидат биологических наук ФАЙЗУЛОЕВ Евгений Ьахтиёрович

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИИЕ.....................................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................11

1.1 Классификация и общая характеристика респираторных вирусов.....................11

1.1.1 РНК-содержащие вирусы - возбудители ОРВИ..............................................11

1.1.2 ДНК-содержащие вирусы.................................................................................25

1.1.3 Другие вирусы, ассоциированные с респираторными симптомами...............29

1.2 Роль вирусов в этиологии респираторных заболеваний человека......................30

1.2.1 Тяжелые респираторные заболевания вирусной этиологи.............................31

1.2.2 "Простудные" заболевания...............................................................................32

1.2.3 Респираторные вирусы как пусковой механизм бронхиальной астмы..........34

1.3 Методы молекулярной диагностики респираторных вирусных инфекций........37

1.3.1 Полимеразная цепная реакция и ее модификации..........................................37

1.3.2 Методы изотермической амплификации нуклеиновых кислот......................46

1.3.3 Технологии, основанные на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот...........................................................................................................................48

1.3.4 Системы внешнего и внутреннего контроля качества молекулярной диагностики..................................................................................................................50

1.3.5 Показатели диагностической ценности наборов реагентов............................52

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................55

2.1 Материалы.............................................................................................................55

2.1.1 Лабораторные штаммы вирусов.......................................................................55

2.1.2 Панели клинических образцов.........................................................................56

2.1.3 Клеточные линии..............................................................................................57

2.1.4 Химические реактивы.......................................................................................57

2.1.5 Наборы реагентов для выявления респираторных вирусов методом ПЦР-РВ.........................................................................................................................57

2.2 Методы...................................................................................................................58

2.2.1 Изоляция и идентификация вирусов гриппа в клетках культуры тканей МОСК...........................................................................................................................58

2.2.2 Анализ нуклеотидных последовательностей in silico......................................59

2.2.3 Получение мазков из полости носа для исследования методом ПЦР............59

2.2.4 Выделение вирусных нуклеиновых кислот.....................................................60

2.2.5 Реакция обратной транскрипции......................................................................60

2.2.6 ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией в модификации TaqMan.....................60

2.2.7 Гель-электрофорез ДНК....................................................................................62

2.2.8 Клонирование ПЦР-продуктов в плазмиде и секвенирование фрагментов геномов вирусов...........................................................................................................62

2.2.9 Получение фрагментов геномов РНК-содержащих вирусов в реакции транскрипции...............................................................................................................62

2.2.10 Статистическая обработка результатов исследований....................................63

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................64

3.1 Оптимизация условий выявления 12 групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)...................................64

3.1.1 Подбор праймеров и зондов для дифференциального выявления респираторных вирусов методом ПЦР-РВ.................................................................64

3.1.2 Оптимизация условий и формата постановки мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР-РВ.............................................................................70

3.1.3 Приготовление пулов контрольных образцов и контрольных образцов чувствительности для набора реагентов.....................................................................75

3.1.4 Апробация набора реагентов для прибора Rotor-Gene™ 6000.......................81

3.2 Определение диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для расшифровки случаев ОРВИ.........................................................................................83

3.2.1 ПЦР-анализ панелей клинических образцов, в том числе охарактеризованных в культуре клеток MDCK на наличие вирусов гриппа А и гриппа В.......................................................................................................................84

3.2.2 Участие в международной программе контроля качества молекулярной диагностики..................................................................................................................93

3.2.3 Определение показателей диагностической ценности мультиплексной ПЦР-РВ: диагностической чувствительности, специфичности, воспроизводимости.......98

3.3 Исследование видовой структуры риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе....................................................................101

3.3.1 Отработка условий дифференциального выявления разных видов риновирусов и коронавирусов..................................................................................103

3.3.2 Изучение видового разнообразия риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе..................................................................107

3.3.3 Оценка роли риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.......................................................................................111

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................114

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................117

БЛАГОДАРНОСТИ.......................................................................................................118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................122

ВВЕДЕНИИЕ

Актуальность темы

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) и грипп по числу случаев превосходят все другие инфекционные болезни вместе взятые. ОРВИ занимают первое место в структуре заболеваемости взрослых и детей болезнями органов дыхания и являются основной причиной обращений за медицинской помощью к участковому терапевту или врачу общей практики. Широкому распространению ОРВИ по всему миру способствуют аэрогенный путь передачи инфекции и большое количество самих респираторных возбудителей (более 200 видов и типов) [45]. При этом разнообразие серологических типов вирусов одного семейства и рода определяет возможность развития заболевания даже в тех случаях, когда ранее человек уже был инфицирован близкородственными вирусами [37, 46, 227].

Для вирусов, относящихся к возбудителям ОРВИ, характерны следующие общие черты - воздушно-капельный путь передачи, тропность вирусов к эпителию верхних и нижних дыхательных путей, сходные клинические проявления инфекционного процесса.

В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев гриппа и других ОРВИ (в том числе в Москве - 2,5-3 млн.) [16, 22]. Удельный вес гриппа в общей структуре ОРВИ варьирует и по данным разных авторов составляет 5-25% [215, 17, 4]. Исторически, гриппу уделяется наибольшее внимание, поскольку вирус гриппа вызывает эпидемии и пандемии, поражая людей всех возрастов, а заболевание часто протекает с осложнениями [120, 25]. Частота осложнений при гриппе может достигать 15-20%. В подавляющем числе случаев осложнения вызываются патогенными или условно-патогенными бактериями, ингода могут наблюдаться грибковые осложнения. Именно осложнения ответственны за летальность при гриппе [232, 259]. Особенно опасно заражение этим вирусом лиц из групп риска: детей дошкольного возраста, пожилых людей (старше 65 лет), лиц с иммунодефецитными состояниями, больных хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой и дыхательной систем, беременных женщин и т.д. [128, 157]. Для профилактики гриппа, в отличие от остальных ОРВИ, ежегодно проводится масштабная

прививочная кампания, в которой используются вакцины, разрабатываемые, на основе прогноза о структуре циркулирующих штаммов [11].

Вместе с тем, остальным респираторным вирусам, к которым относятся аденовирусы (АДВ), риновирусы (РВ), респираторно-синцитиальный вирус (PCB), вирусы парагриппа 1-4 типа (ВПГ 1-4), коронавирусы (КВ) и некоторые другие, уделяется меньшее внимание. Отчасти, это связанно с отсутствием средств для специфической профилактики и препаратов для этиотропной терапии таких инфекций. В то же время АДВ, PCB и ВПГ 1-4 вызывают тяжелые поражения респираторного тракта (синдром крупа, бронхиолит, пневмония и др.) [248, 72, 135]. Также традиционно имеется представление, что такие респираторные патогены, как РВ и КВ, ассоциированы исключительно с заболеваниями верхних дыхательных путей легкой и средней тяжести [73]. В последнее время появились исследования, которые опровергают такое представление [115, 76]. В 2003 г. мир столкнулся с угрозой пандемии атипичной пневмонии (тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, англ. SARS)). Вирус, выделенный от больных ТОРС, был идентифицирован как коронавирус [102, 231]. Имеются также исследования, свидетельствующие о том, что риновирусы могут вызывать поражения и нижних дыхательных путей, "запуская" развитие таких тяжелых заболеваний, как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) [117].

Методами клинической диагностики врач не может с точностью определить возбудителя респираторного заболевания, поэтому лечение, как правило, является эмпирическим. С точностью идентифицировать возбудителя респираторного заболевания можно только при помощи лабораторных методов диагностики [32].

Традиционные методы идентификации респираторных вирусов имеют недостатки, прежде всего связанные с недостаточной чувствительностью (иммунофлуоресцентные методы), большой длительностью, трудоемкостью, неуниверсальностью процедуры (культуральный метод). Выявление антител к вирусам в сыворотке пациентов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) является ретроспективным методом (выявляет не самого возбудителя, а регистрирует ответ организма на инфекцию). Выявление методом ИФА вирусных антигенов в клинических образцах ограничено недостаточной чувствительностью метода. Использование иммунохимических и серологических методов затрудняет

также высокое антигенное разнообразие некоторых групп респираторных вирусов -аденовирусов, риновирусов, энтеровирусов и др. Традиционные методы, в силу перечисленных ограничений, не позволяют одновременно и с высокой чувствительностью выявлять в клинических образцах основные группы респираторных вирусов.

В настоящее время в лабораторной диагностике респираторных инфекций широко используются молекулярные подходы, в том числе полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее различные модификации. Важнейшее значение в диагностике таких инфекций, имеет ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [87, 254, 255, 60, 188, 171, 203, 160, 209, 84, 223]. В последние годы для диагностики ОРВИ все чаще используется такая наукоёмкая технология, как технология ДНК-микрочипов (DNA microarray) [177, 194, 144]. Преимуществами молекулярных методов являются высокая специфичность, чувствительность, универсальность процедуры, малое время проведения анализа, автоматизация процессов, возможность выявления сразу нескольких патогенов [32]. В перспективе, с развитием методов специфического лечения респираторных вирусных заболеваний, тест-системы, разработанные на основе молекулярных методах диагностики, найдут применение в клинической практике для постановки диагноза и назначения адекватного лечения.

Респираторные вирусы, как и все вирусы, быстро эволюционируют, чему способствуют многократно усилившиеся в последние годы миграционные процессы в мире. В этих условиях человечество всё чаще встречается с появлением новых респираторных вирусов или хорошо известных, но отличающихся повышенной патогенностью штаммов (коронавирус ТОРС, вирус птичьего гриппа A/H5N1), что требует от органов эпидемиологического надзора состояния постоянной готовности. Одним из наиболее перспективных инструментов эпидимеологического надзора за широким спектром респираторных вирусных инфекций становится в настоящее время метод мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Цель и задачи исследования

Целями настоящего исследования являлись: оценка эффективности дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, а также исследование видовой структуры риновирусов и коронавирусов,

циркулирующих в Московском регионе и оценка их роли в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.

Для реализации поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать лабораторный образец набора реагентов для одновременного выявления 12 групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ,

2) провести ПЦР-анализ панели клинических образцов, охарактеризованных в культуре клеток МОСК на наличие вирусов гриппа А и вирусов гриппа В,

3) методом мультиплексной ПЦР-РВ проанализировать панели клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ неустановленной этиологии,

4) провести внешний контроль качества ПЦР-диагностики ОРВИ, приняв участие в международной программе контроля качества молекулярной диагностики,

5) оценить диагностическую ценность метода мультиплексной ПЦР-РВ по показателям диагностической чувствительности, специфичности и воспроизводимости,

6) на основе метода ПЦР-РВ отработать условия дифференциального выявления разных видов риновирусов и коронавирусов,

7) изучить видовое разнообразие риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе,

8) оценить роль риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.

Научная новизна

Разработана и апробирована оригинальная тест-система для одновременного выявления в клинических образцах от больных ОРВИ 12 основных групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ: вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, бокавирусов, респираторно-синцитиального вируса, риновирусов, энтеровирусов и коронавирусов.

Используя разработанную в ходе выполнения работ ПЦР-тест-систему впервые в России дана всесторонняя и объективная оценка диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики ОРВИ.

Определена видовая структура риновирусов и коронавирусов выделенных на территории Москвы и Московской области в период 2007-2012 гг. Показана одновременная циркуляция всех видов риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С), а также четырех видов коронавирусов - 229Е, ОС43, N1,63 и НКШ.

Предложен комплексный подход к изучению видовой структуры таких широко распространенных респираторных вирусов как риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ. Дана дифференциальная клиническая оценка этих патогенов.

Практическая значимость

1 Разработаны методические подходы, которые легли в основу набора реагентов «ОРВИ-Монитор», который приказом Росздравнадзора разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации. Данная тест-система может быть использована службами эпидемиологического надзора при мониторинге ситуации по гриппу и ОРВИ, а также в клинической практике для постановки этиологического диагноза пациентам с ОРВИ.

2 Получен патент РФ №2460803 от 10.09.2012 «Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени является эффективным методом дифференциальной диагностики ОРВИ. Доля расшифрованных случаев ОРВИ превышает 70% при условии соблюдения критериев отбора, хранения и транспортировки образцов, а также при использовании качественных наборов для выделения вирусной РНК.

2. Разработан экспериментальный набора реагентов (ЭНР) для одновременного выявления в клинических образцах двенадцати основных возбудителей ОРВИ методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

3. Метод мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени при выявлении вирусов гриппа А (ВГА) и вирусов гриппа В (ВГВ) значительно

превосходит по диагностической чувствительности метод изоляции вирусов гриппа в культуре клеток 1УЮСК

4. На территории Московского региона в настоящее время циркулируют все виды риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С) и коронавирусы КВ-МЬ63, КВ-229Е, КВ-ОС43 и КВ-НКШ.

5. Вопреки общепринятому представлению риновирусы и коронавирусы являются возбудителями не только простудных заболеваний. У детей эти патогены с высокой частотой вызывают и более тяжелые заболевания, требующие �