Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека

Сергеева, Елена Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека"

005538080

На правах рукописи

Сергеева Елена Игоревна

Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека

03.01.03 - молекулярная биология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 НОЯ 2013

Кольцово-2013

005538080

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные руководители: Агафонов Александр Петрович, доктор биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заместитель генерального директора по научной работе

Терновой Владимир Александрович, кандидат биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий лабораторией

молекулярной эпидемиологии ООН

Тикунова Нина Викторовна, доктор биологических наук, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии

Левагина Галина Михайловна, кандидат биологических наук, ИМБТ ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующая отделом разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов

Ведущая организация: институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «06» декабря 2013 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» по адресу: 630559, р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, тел. (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «31» октября 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, Г.П. Трошкова

д-р биол. наук, проф.

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время известно более 200 вирусов, вызывающих ОРВИ у человека. Основные возбудители ОРВИ человека относятся к шести семействам: Orthomyxoviridae (вирусы гриппа), Paramyxoviridae (вирусы парагриппа человека 1-4, метапневмовирус человека, респираторно-синцитиальный вирус человека), Picornaviridae (энтеровирусы, риновирусы), Coronaviridae (коронавирусы человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS, MERS), Adenoviridae (аденовирусы человека), Parvaviridae (бокавирус человека).

В структуре общей инфекционной заболеваемости человека острые респираторные инфекции занимают первое место, являясь главной причиной временной нетрудоспособности, приводя к огромным экономическим потерям. По официальным данным, в 2010 году на территории Российской Федерации было зарегистрировано 28 238 271 случай острых инфекций верхних дыхательных путей, заболеваний гриппом - 27 363 случая [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2010]. В 2011 году -30 729 617 случаев, заболеваний гриппом - 308 829 случаев [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2011]. В 2012 году - 28 423 135 случаев, заболеваний гриппом - 24 638 случаев [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2012].

Хотя острые респираторные вирусные инфекции человека и составляют группу заболеваний с похожими клиническими проявлениями, вызывающие их вирусные агенты значительно отличаются по патогенности и летальности для человека. В последнее время в фармакологии стремительно развиваются направления по разработке средств специфической противовирусной терапии. Так, для лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа, применяют ингибиторы нейраминидазы (занамивир, ланинамивир, озельтамивир); для респираторно-синцитиального вируса - моноклональные антитела и малые интерферирующие РНК. Для лечения аденовирусных инфекций — цидофовир и рибавирин. Для лечения тяжелых случаев ОРВИ, вызванных метапневмовирусом человека -

рибавирин и иммуноглобулины. Для терапии риновирусной и энтеровирусной инфекций применяют препарат «Егмгсште», нивелирующий процесс репликации вируса, а также «Р1есопап1» - ингибитор капсндных белков. Ведется активная разработка средств специфической терапии коронавирусных инфекций. Таким образом, дифференциальная диагностика возбудителей ОРВИ человека позволяет скорректировать схему лечения и более эффективно использовать ресурсы системы здравоохранения.

Большинство вирусологических, серологических и иммунологических методов детекции агентов ОРВИ человека требуют значительных затрат времени, являются трудоёмкими и, как правило, выявляют один возбудитель ОРВИ. Поэтому во всем мире «золотым стандартом» дифференциальной диагностики агентов ОРВИ человека являются методы на основе амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют детектировать одновременно несколько возбудителей ОРВИ человека в клинических образцах. На территории Российской Федерации в настоящее время существует единственный набор реагентов для идентификации генетического материала возбудителей ОРВИ человека - «АмплиСенс ОРВИ-скрин-РЬ» (ЦНИИЭ, Москва). Набор позволяет методом ПЦР в реальном времени выявлять в клиническом образце генетические маркёры 17 вирусов: респираторно-синцитиального вируса человека, метапневмовируса человека, вирусов парагриппа человека 1, 2, 3 и 4, коронавирусов человека 229Е, >1Ь63, ОС43, НКШ, риновирусов А-С, аденовирусов человека В, С, Е и бокавируса человека.

Таким образом, создание набора реагентов для идентификации агентов ОРВИ человека методом мультиплексной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для детекции 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека является чрезвычайно актуальной задачей, так как позволяет не только скорректировать лечение, но и изучить структуру заболеваемости ОРВИ. Эта задача заслуживает особого внимания, поскольку широких мониторинговых исследований в этом направлении на территории Российской Федерации и, в частности, в Новосибирской области до сих пор не выполнялось.

Цели исследования. Разработать мультиплексную ПЦР-РВ и набор реагентов на её основе для выявления генетических маркёров (РНК и ДНК) наиболее распространённых возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека l^t; риновирусов А-С; метапневмовируса человека; бокавируса человека; аденовирусов человека В, С, Е; коронавирусов человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS; респираторно-синцитиального вируса человека; вируса гриппа В; вируса гриппа А, в т.ч. субтипов вируса гриппа А - H1N1 (сезонный вариант), HlNl(2009)pdm (пандемический вариант), НЗ, Н5 и Н7. Апробировать разработанный набор реагентов на клинических образцах от пациентов с диагнозом ОРВИ.

Задачи исследования.

1. Для разработки мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющей детектировать генетические маркёры наиболее распространённых возбудителей ОРВИ человека: подобрать олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентные зонды; разработать внутренние, положительные и отрицательный контрольные образцы; оптимизировать состав реакционных смесей и температурно-временные параметры ПЦР.

2. На основе разработанного метода создать и охарактеризовать лабораторный вариант набора реагентов для детекции генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека. Провести его сравнение с существующими аналогами.

3. Собрать коллекцию клинических образцов от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ. Получить суммарные РНК/ДНК и кДНК в реакции обратной транскрипции и провести апробацию разработанного набора реагентов в исследовании полученных ДНК и кДНК на наличие генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека.

4. Изучить видовое разнообразие вирусов, обнаруженных в клинических образцах от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ.

5. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов, обнаруженных вирусов и изучить их генетическое разнообразие.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработан метод одновременной детекции 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека на основе мультиплексной ПЦР-РВ. Показана эффективность его использования для исследования клинического материала.

Впервые в Западно-Сибирском регионе определена встречаемость геномов возбудителей ОРВИ человека негриппозной этиологии: вирусов парагриппа человека 1-4, риновирусов А-С, метапневмовируса человека, бокавируса человека, аденовирусов человека В, С, Е, коронавирусов человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS, респираторно-синцитиального вируса человека, а также смешанных инфекций в клинических образцах.

Определены нуклеотидные последовательности фрагментов геномов коронавирусов человека ОС43, NL63 и 229Е, респираторно-синцитиального вируса человека, вирусов парагриппа человека 1 и 3, бокавируса человека, циркулирующих в Западно-Сибирском регионе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана мультиплексная ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1-4; риновирусов А— С; метапневмовируса человека; бокавируса человека; аденовирусов человека В, С, Е; коронавирусов человека 229Е, HK.U1, NL63, ОС43, SARS; респираторно-синцитиального вируса человека; вируса гриппа В; вируса гриппа А, в т.ч. субтипов вируса гриппа А - H1N1 (сезонный вариант), HlNl(2009)pdm (пандемический вариант), НЗ, Н5 и Н7. Мультиплексная ПЦР-РВ в условиях проделанных экспериментов демонстрировала следующие характеристики: аналитическая чувствительность — 20-39 ГЭ/реакция, 1х10-1х104 в.ч./мл; диагностическая чувствительность - 100%; аналитическая специфичность - 95,7100%; диагностическая специфичность - 100%.

2. В 61 (37%) образце обнаружены генетические маркёры одного вида вируса. В 28 (17%) образцах выявлены генетические маркёры 2 и более видов вирусов.

3. Основными этиологическими агентами ОРВИ в исследованной выборке образцов являются риновирусы (42 образца (25,6%)) и коронавирусы (29 образцов (17,6%)).

4. Максимальное видовое разнообразие возбудителей ОРВИ человека наблюдается в возрастной группе детей до 7 лет с пиком в группе 2-4 года.

Вклад автора. Создание коллекции образцов РНК, ДНК, кДНК, выделенных из клинических образцов от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ, собранных в 2011-2012 гг. Расчет и тестирование праймеров и флуоресцентных зондов для детекции возбудителей ОРВИ человека. Конструирование 21 рекомбинантной плазмиды, создание коллекции трансформированных клеток Е. coli. Получение штаммов пандемического вируса гриппа А/НINI(2009) (совместно с Агафоновым А.П., Деминой O.K., Шиковым А.Н.). Выявление генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека в клинических образцах, определение нуклеотидных последовательностей их геномов, филогенетический анализ (совместно с Терновым В.А.).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы и приложений. Библиография включает 420 работ (4 отечественных, 406 зарубежных, 10 электронных ресурсов). Работа иллюстрирована 28 рисунками, включает 19 таблиц.

Апробация результатов диссертации и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Получен патент РФ № 2473702.

Полученные результаты исследований были доложены на российских и международных конференциях: V Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 25-27 марта 2013 г.); «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 г.); VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

«Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 24—26 ноября 2010 г.); II Международная конференция «Астана Биотех 2011» (г. Астана, Казахстан, 2011); научно-практическая конференция «Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Новосибирск, 13 сентября 2012 г.).

Материалы и методы исследования

Клинический материал. В работе использованы образцы мазков с носоглотки от 164 пациентов с диагнозом ОРВИ, поступившие в ГНЦ ВБ «Вектор» из ФБУЗ «ЦГиЭ в Новосибирской области», согласно приказу Роспотребнадзора № 88 от 17.03.2008, а также 94 образца мазков с носоглотки от здоровых доноров. Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор». Вирусные штаммы. В исследовании были использованы штаммы вирусов гриппа: A/Aichi/2/1968(H3N2), A/Novosibirsk/1/2009(Н IN 1), A/Ekaterinburg/01/2009 (HlNl)v, A/Tomsk/01/2009(HIN 1 )v, A/Novosibirsk/02/2009(HlNl)v, A/Irkutsk/01/ 2009(HlNl)v, A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N 1), A/garganey/Crimea/2027/2006 (H7N8), B/Chita/01/2010, B/Chita/02/2010, B/Chita/03/2010, B/Chita/04/2010, B/Chita/05/2010; штамм респираторно-синцитиального вируса человека Long, штамм аденовируса человека Gomen, штамм коронавируса SARS Frankfurt 1. Штамм A/Aichi/2/1968(H3N2) получен из Института вирусологии им. Ивановского РАМН (Москва). Штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N 1) получен из НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). Штаммы сезонного и пандемического вариантов вируса гриппа H1N1, штамм вируса гриппа A/garganey/Crimea/2027/2006(H7N8) выделены в ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская обл.). Штаммы вируса гриппа В получены из ФБУЗ «ЦГиЭ в Читинской области». Штаммы Long, Gomen, Frankfurt 1 получены из АТСС.

Физический титр препаратов определяли методом электронной микроскопии. Олигонуклеотиды синтезированы в ИХБФМ СО РАН (Новосибирск), ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская обл.), ЗАО «Синтол» (Москва).

Выделение нуклеиновых кислот из клинического материала проводили с использованием наборов «РИБО-сорб» и «РИБО-преп» (ЦНИИЭ, Москва), реакцию обратной транскрипции — с использованием набора «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Москва).

Полимеразная цепная реакция проводилась с помощью HotStart Taq-ДНК-полимеразы («Медиген», Россия), условия реакции подбирали эмпирически. В качестве референтной ПЦР тест-системы использовали: «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» (ЦНИИЭ, Москва).

Исследование диагностических чувствительности и специфичности метода проводили согласно ГОСТ Р 53022.2-2008 и ГОСТ Р 53022.3-2008. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Анализ последовательностей. Для сравнения определённых нуклеотидных последовательностей использовали последовательности прототипных изолятов из GenBank. Филогенетический анализ проводили с помощью программ MEGA5, TREE-PUZZLE, BLAST. Для оценки достоверности группирования применяли тест на стандартную ошибку длин ветвей и бутстреп-тест. Выравнивание последовательностей, филогенетический анализ проводили методами минимальной эволюции и «объединения ближайших соседей», построение филогенетических деревьев выполняли в программах MEGA5 и Lasergene 7.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Дизайн праймеров и флуоресцентных зондов. Для детекции выбранных вирусных агентов была проведена работа по моделированию праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов. Были построены массивы выравненных последовательностей, определены наиболее консервативные участки геномов, после чего с использованием пакетов программного обеспечения Vector NTI 8 и MEGA5 была проведена работа по конструированию специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов.

Разработка и апробация контрольных образцов для ПЦР-РВ. Для контроля проведения мультиплексной ПЦР-РВ были разработаны: отрицательный

контрольный образец (ОКО), положительные контрольные образцы (ПКО) - на каждый детектируемый вирус, контроль выделения ДНК (ВКО-1) и совместный контроль выделения РНК и прохождения реакции обратной транскрипции (ВКО-2).

ОКО - 1 хТЕ-буфер. Содержит все компоненты реакционной смеси кроме целевой вирусной ДНК/кДНК.

ПКО - препараты рекомбинантной ДНК, содержащей нуклеотидные последовательности для гибридизации праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов.

ВКО-1 - эндогенный внутренний контроль выделения ДНК - праймеры и флуоресцентный ДНК-зонд, гомологичные последовательности конститутивного гена человека — гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ОАРОН).

ВКО-2 - экзогенный внутренний контроль выделения РНК и обратной транскрипции - праймеры и флуоресцентный ДНК-зонд, гомологичные последовательности РНК-генома бактериофага М82.

Для исключения конкурентной амплификации ВКО проводили оценку эффективности амплификации целевых ДНК в присутствии и отсутствии праймеров и флуоресцентных зондов к ВКО. Установлено, что амплификация ВКО не конкурирует с целевыми реакциями.

Оптимизация ПНР в реальном времени. С использованием полученных плазмидных конструкций (ПКО) были подобраны условия оптимального проведения ПЦР-РВ. Эмпирически были выбраны рН реакционных смесей, концентрации М£С12, фермента, праймеров и флуоресцентных зондов, температуры отжига праймеров и время инкубации для каждой стадии цикла.

Титрование рН проводили в диапазоне 8,0-9,0. Оптимальные значения рН для всех шести используемых смесей для проведения ПЦР лежат в диапазоне 8,4-8,6.

Для выбора оптимальной концентрации MgCl2 готовили реакционные смеси с последовательными разведениями в диапазоне 1,5-5,5 мМ. Оптимальная концентрация лежит в диапазоне 2,5-3,5 мМ (рис. 1).

5 10 15 20 25 30 35

цикл реакции

Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации М§С12 в реакционной смеси. 1-1,5 мМ; 2 - 2,5 мМ; 3 - 3,5 мМ; 4 -4,5 мМ; 5 - 5,5 мМ; 6-ОКО

Концентрации прямого, обратного праймеров и флуоресцентных ДНК-зондов были подобраны эмпирически, для чего были приготовлены последовательные разведения олигонуклеотидов в диапазоне 0,1-0,6 мкМ в реакции.

Экспериментально было показано, что интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации праймеров в растворе и обратно пропорциональна концентрации ДНК-зондов. В разработанной мультиплексной ПЦР-РВ оптимальные концентрации прямого и обратного праймеров составили -0,5-0,6 мкМ/реакция, флуоресцентного ДНК-зонда - 0,1 мкМ/реакция.

При выборе оптимальных параметров циклирования ПЦР температуру гибридизации праймеров варьировали в диапазоне 46-56 °С (рис. 2). Экспериментально было показано, что оптимальная температура отжига праймеров для детекции выбранных вирусных агентов лежит в диапазоне 50— 52 °С.

5 10 15 20 25 30 35 40

цикл реакции

Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции от температуры отжига праймеров (на примере смеси для детекции вируса гриппа А). 1 - 56,0 °С, 2 -55,5 °С, 3 - 54,2 °С, 4 - 52,4 °С, 5 - 49,9 °С, 6-48,1 °С, 7 - 46,8 °С, 8 - 46,0 °С

На последнем этапе оптимизации ПЦР-РВ были выбраны оптимальные временные промежутки этапов денатурации, отжига, элонгации. Оптимальный протокол мультиплексной ПЦР-РВ: активация полимеразы - 95 С°(5 мин), 35 циклов - 95 С°(15 с), 51 С°(20 с) с детекцией по каналам FAM (470/510 нм), ROX (585/610 нм), Су5 (625/660 нм), R6G (530/555 нм).

Оценка чувствительности и специфичности ПЦР-РВ. При определении основных диагностических характеристик разрабатываемой ПЦР-РВ оценивали аналитические и диагностические чувствительность и специфичность.

Аналитической чувствительностью считается минимальное количество ДНК, которое может быть определено методом ПЦР. Для оценки аналитической чувствительности готовили последовательные 10-кратные разведения рекомбинантных плазмид (ПКО). Значения аналитической чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ варьируются в диапазоне 20-39 ГЭ/реакция.

Оценку аналитической чувствительности для вирусов гриппа А и В, вируса гриппа А субтипов Hl(2009)pdm, Hl, НЗ, Н5 и Н7, аденовируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека, коронавируса SARS осуществляли с использованием препаратов с известной концентрацией вирусных частиц (в.ч.) (рис.3). Предел чувствительности метода составил 1 х 103— 1х104 в.ч./мл.

Рис. 3. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации вирусных частиц в образце. А - вирус гриппа В, С - коронавирус, ассоциированный с тяжёлым острым респираторным синдромом (SARS). 1 - 1 х 107 в.ч./мл, 2 - 1х10б в.ч./мл, 3 - 1x10 в.ч./мл, 4- 1 х 104 в.ч./мл, 5- 1*103 в.ч./мл, 6 - 1хЮ2 в.ч./мл, 7 - ОКО

Клиническая (диагностическая) чувствительность - это отношение числа образцов, точно классифицированных по результатам исследования как положительные, к числу всех исследованных образцов. Диагностическая чувствительность была оценена для 5 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека. 94 клинических образца от условно здоровых доноров были контаминированы препаратами штаммов вирусов гриппа А (субтипы Hl(2009)pdm, Hl, НЗ, Н5 и Н7) и В, аденовируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека и коронавируса SARS с известным физическим титром. Диагностическая чувствительность составила 100%.

Аналитическая специфичность была оценена эмпирически для каждой из 6 смесей для ПЦР. Первичная оценка аналитической специфичности метода была проведена на образцах патогенов из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор», а также с использованием образцов кДНК и ДНК из коллекции отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ГНЦ ВБ «Вектор», видовая и родовая принадлежность которых была определена ранее. В проведённом эксперименте было исследовано 94 образца вирусных и бактериальных ДНК/кДНК. Не наблюдалось увеличения уровня флуоресценции при проведении ПЦР-РВ с ДНК и кДНК вируса простого герпеса человека 1 и 2, цитомегаловируса, вируса Эпштейна - Барр, энтеровирусов Echo 6, Echo 9, Echo 30, Echo 11, Echo 14, Echo 18, энтеровируса 71, Coxsackie B5, Coxsackie A4, Coxsackie A2, Coxsackie В1, Coxsackie B3, бактериями рода Streptococcus и видов Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumonia, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila. Однако было установлено, что возможно выявление близкородственных пикорнавирусов и аденовирусов. Таким образом, аналитическая специфичность метода составила 95,7-100%.

Диагностическая специфичность определялась как процент здоровых людей, имеющих истинно отрицательный результат анализа. Диагностическая специфичность была оценена в эксперименте при исследовании 94 клинических образцов от условно здоровых доноров и составила 100% для каждой из смесей.

Сравнение разработанного метода с аналогом. 164 клинических образца от пациентов с диагнозом ОРВИ исследованы с применением ПЦР тест-системы «АмплиСенс ОРВИ-скрин» (ЦНИИЭ, Москва) и разработанной мультиплексной ПЦР-РВ. Экспериментально было показано, что с использованием разработанного лабораторного варианта мультиплексной ПЦР-РВ маркёры вирусов были обнаружены в большем числе клинических образцов. Таким образом, для идентификации абсолютного большинства вирусов, вызывающих ОРВИ человека, чувствительность разработанного набора реагентов эквивалентна чувствительности коммерческого набора. Чувствительность разработанного

набора реагентов превосходит чувствительность коммерческого набора при выявлении маркёров риновирусов и пяти видов коронавирусов.

Изучение видовой структуры возбудителей ОРВИ в исследуемой выборке образцов. В рамках проводимого исследования было проанализировано 164 образца, собранных от пациентов в возрасте от 5 месяцев до 76 лет с диагнозом ОРВИ. Отрицательные в тесте на маркёры вирусов гриппа А и В в ФБУЗ «ЦГиЭ в Новосибирской области» образцы были исследованы на маркёры прочих возбудителей ОРВИ человека и повторно на вирусы гриппа в ГНЦ ВБ «Вектор».

В 89 (54%) из 164 исследованных образцов был обнаружен хотя бы один из вирусных агентов (рис. 4). В большинстве клинических образцов - 61 (37%) - был обнаружен один вид вируса. В 28 (17%) образцах был выявлен генетический материал 2 и более вирусов.

■ Коронавирус 229Е

□ Коронавирус НК111

□ Коронавирус N163

□ Коронавирус ОС43

□ Вирус парагриппа 1

□ Вирус парагриппа 2

□ Вирус парагриппа 3 И Аденовирусы

а Бокавирус

□ Метапневмовирус

□ Риновирусы ЕЛ РСВ

□ Смешанная инфекция П Не обнаружено

Рис. 4. Структура заболеваемости ОРВИ в исследованной выборке. PCB -респираторно-синцитиальный вирус человека

После этого была оценена встречаемость каждого из исследуемых вирусных агентов в анализируемых клинических образцах, в том числе в составе смешанных инфекций (рис. 5). В абсолютном большинстве образцов были обнаружены риновирусы - 42 (25,6%). В 29 (17,6%) исследованных образцах обнаружены коронавирусы человека. В структуре коронавирусной инфекции

преобладали коронавирусы I серогруппы - Ь1Ь63 и 229Е (23/14,0%). Коронавирусы II серогруппы - НКи 1 и ОС43 - встречались значительно реже (6/3,6%). Вирусы парагриппа человека были обнаружены в 24 (14,6%) клинических образцах. При этом в структуре заболеваемости преобладали вирус парагриппа человека 3 (13/7,9%) и вирус парагриппа человека 1 (11/6,1%)- Вирус парагриппа человека 2 обнаружен только в 1 (0,6%) образце. Вирус парагриппа человека 4 не был обнаружен ни в одном исследованном образце. Респираторно-синцитиальный вирус человека обнаружен в 11 (6,7%) образцах. Наименее часто обнаруживались бокавирус человека — в 8 (4,9%) образцах, аденовирусы человека - в 1 (0,6%) образце и метапневмовирус человека - в 3 (1,8%) образцах.

.о

1 I

го ш

о о.

=г

■е-

Рис. 5. Встречаемость исследуемых возбудителей ОРВИ в анализируемых клинических образцах. PCB - респираторно-синцитиальный вирус человека

В рамках проводимого исследования было изучено видовое разнообразие возбудителей ОРВИ в различных возрастных группах пациентов (рис. 6). Согласно возрасту и социальному статусу было выделено 7 групп:

1. дети до 2 лет, не посещающие дошкольные учреждения (25 образцов);

2. дети младшего дошкольного возраста от 2 до 4 лет (29 образцов);

3. дети старшего дошкольного возраста от 5 до 7 лет (21 образец);

5,6"/ >

7 V

■ 5,5% 3-0%- п 6,1% 4,9% 6,7% t

1 0,6% 0,6% 0,6% 1,5% Г~|

4. дети школьного возраста от 8 до 16 лет (29 образцов);

6. 7.

взрослые от 17 до 30 лет (26 образцов); взрослые от 31 до 51 года (23 образца); взрослые старше 52 лет (11 образцов).

л н

s в X

□ Не обнаружено

□ Смешанная инфекция

нгев

П Риновирусы

□ Метапневмовир/с ■ Бокавирус

£1 Аденовирусы

□ Вирус парагриппа 3

□ Вирус парагриппа 2

□ Вирус парагриппа 1

□ Коронавирус ОС43

□ Коронавирус [\IL63 Я Коронавир/с НК111 Ш Коронавирус 229Е

до 2

5-7 8-16 17-30 31-51 ВОЗРАСТ. ЛЕТ

Рис. 6. Распределение агентов ОРВИ человека в различных возрастных группах пациентов. PCB - респираторно-синцитиальный вирус человека

Было установлено, что пик видового разнообразия возбудителей ОРВИ человека в структуре заболеваемости приходится на возрастные группы детей до 7 лет, распределяясь по возрастанию в группах в следующем порядке: 5-7 лет < до 2 лет < 2—4 года. Отмечается также пик видового разнообразия агентов ОРВИ в группе социально активных взрослых 17-30 лет.

Исследование генетического разнообразия обнаруженных возбудителей ОРВИ человека. Для всех ПЦР-положительных образцов дополнительно проводили определение нуклеотидной последовательности фрагмента генома вируса. В результате проделанной работы был проведен анализ определённых нуклеотидных последовательностей вирусных геномов, по результатам анализа были построены семь филогенетические деревьев.

Для четырёх обнаруженных вариантов коронавируса человека N1.63 были определены нуклеотидные последовательности фрагмента 5-гена длиной 200214 н.о. (рис. 7). Филогенетический анализ показал, что обнаруженные варианты кластеризуются отдельно от всех доступных в международной базе данных ОепВапк вариантов вируса ветвь, кроме единственного, обнаруженного в Канаде в 2002 г.

r (FJ656171.1) Human coronabrus NL63 isolate. 110122 (Sweden, 2007) '(AY758301.1) Human caonabrus NL63 strain: BE03£4880 (Belgium, 2003) (D0231165.1) Human corcnabais NL63 isolate: SWE 3611612005 (Sweden, 2005) (AY766009.1) Human coronabrus ML63 isolate: 212 (Netherlands. 2007) (OQ462792-1) Hunan coronabnis NL63 isolate: Amsterdam 857 (Netherlands, 2006) , (GQ856814.1) Human coronabrus NL63 strain: CU №91 (China. 2005) I (AY758299.2) Human coronals NL63 strain: BE03-33545 (Belgium. 2005) _.(EF507768 1) Human coronabrus NL63 strain: Caeii833 (France, 2007)

39l— (J

(AB695189.1) Human coronabrus NL63 strain. F-CoV-Nl.63/N»gala JPN/11-119 (Japan, 2011) (JQ771060.1) Human coronabais NU63 strain: NL63ÍDEW2010/36 (USA, 2010) • (EU025126.1) Human coronabrus NL63 isolate: INMI3 (Italy. 2007) (AY994253.1) Human coronabnjsNL63 isolate: 23081008 (France, 2003) (EU025124.1) Human coronabrus N163 isolate: INMM (France. 2007)

• Human coronabais NL63 isolate: CoV_№.63-NSC-03/2011 (Russia, 2011)

• Human coronabais NL63 isolate. CoV_Nl63 NSC-04/2012 (Russia. 2012)

• Human coronabrus NL63 isolate: CoV_NL63-NSC-02/2011 (Russia, 2011)

• Human coronabais NL63 isolate. CoV_Nl6>NS(M>1/2011 iRussia, 2011) -(AY675553.1) Human coronabais NL63 isolate CAN54302 (Canada/2002)

i— (AF352311.1) Aban infectious bronchitis bais isolate ZJ971 yA i(AY189157 1) Aban intectious bronchitis bais isolate: LX4 75I-(AY 180958 1) Aban infectious bronchitis btus isolate LH2

Рис. 7. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента 5-гена коронавируса №63 (200 н.о.). Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. • - исследованные изоляты

Для 7 вариантов респираторно-синцитиального вируса были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена длиной 511-530 н.о. (рис. 8). Построенное филогенетическое дерево демонстрировало наличие двух клад. Два обнаруженных варианта вируса ложились в первую кладу (серогруппа А), наиболее близкие изоляты ранее были выделены в Италии в 2007 г., Китае в 2012 г., Канаде в 2010 г. Большинство обнаруженных вариантов вируса ложились

в кладу соответствующую серогруппе В, наиболее близкие варианты вируса ранее обнаружены в Японии в 2006 г., США в 2002 г., Саудовской Аравии в 2009 г.

■ (КС618408.1) rtjman respiratory syncytial litis isolate 9393 (Italy, 2007) (JX482027.1) Himan respiratory syncytial \irus isolate CQ Jan-2012(11) (CNra, 2012) (•Я7767321) Human respiratory syncytial wus tsdafe H0910-069-A (Canada, 2010)

• Human respiratory syncytial wus isolate: RSV-NSM2/2011 (Russia, 2011) -<JX482038.1) Human respiratory syncytial wus isolate CQ Dec-2011(15> (Chins, 2011) —• Hunan respiratory syncytial wus isolate: RSC-NSC46/2012 (Russia, 2012)

<— (U31560.1) Human respiratory syncytial wrns strain RSB89-1734 (IK 1995) H. (HQ317243.1) Human respiratory syncytial wus strain A (USA. 2011)

'(HQ317242.1) Human respiratory syncytial lims isdate MARM N3 (USA, 2011) g5|t Human respiratory syncytial wus isajale: RSV-NSC-0SW011 (Russia, 2011) Human respiralay syncytial vims isolate: RSV-NSM7/2012 (Russia, 2012) (AB245477.1) Respiratory syncytial virus subgroup 8 strain: RSV2177 (Japan. 2006) ' (JQ736680.1) Human respiratory syncytial «us slrain NH1001 (USA, 2002)

• Human respiratory syncytial wus isolate: RSV-NSCtfl/2011 (Russia, 2011) (JF714712.1) Human respiratory syncytial urns strain Riyai№8S/2009 (Saudi Arabia, 2009) , • Human respiratory syncytial wus isolate: RSV-NSC-03'2011 (Russia, 2011)

t« Human respiratory syncytial virus isolate: RSV-NS&04/2011 (Russia, 2011) (AY145301.1) Human metapneumovirus isolate: CANOO-16

(AY145293.1) Human metapneunowus isolate: CAN93-79 Í8Í (AB693960.1) Human metapneumovirus isolate: 907-Yamagata-10

Рис. 8. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента F-гена респираторно-синцитиального вируса человека длиной 511 н.о. Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. • - исследованные изоляты

Для 15 обнаруженных вариантов риновирусов человека определены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'-нетранслируемой области генома (5-НТО) длиной 239-326 н.о. (рис. 9). Пять выявленных вариантов принадлежат виду С. Наиболее близкие к ним изоляты обнаружены в Мексике в 2008 г. и в 2011 г., а также в Великобритании в 2007 г. Два других выявленных варианта принадлежали виду А. Наиболее близкие к этой группе варианты вируса обнаружены в Бельгии в 2008 г. и Мексике в 2011 г. Ещё 7 выявленных вариантов ложились в отдельную кладу, наиболее близкий изолят ранее выявлен в Камбодже в 2010 г. Один из обнаруженных вариантов не укладывался ни в одну кладу.

p (JQ000016.1) Human rhtnovrus С isolate MX2011-7A (Mexico. 2011) A p# Human rttfnovirus isolate: RhV-NSC-09/2012 (Russia, 2012) H Human mixovirus isolate: RhV-NSC-14/2012 (Russia. 2012) 74»# Human rhinovirus isolate: RhV-NSC-13/2012 (Russia, 2012) — • Human rhinovirus isdale: RhV-NSC-06/2011 (Russia. 2011) 97 г # Human rhinovirus isolate: RhV-NSC-12/2012 (Russia. 2012) I L (JQ000021.1) Human ffwnosiais С isolate MX-2008-13A (Mexico, 2008) I-(HM581887.1) Human rtiloodrus С isolate Resp5096/07 (UK. 2007)

• Human rhinovirus isolate: RhV-NSC-08/2011 (Russia. 2011)

• Human rhinovirus isoiate: RhV-NSC-11/2012 (Russia. 2012) (HM747058.1) Human rtitnovinjs A strain NSEW96 (Belgium, 2008) (JQ000029.1) Human iWnovkus A Isolate MX-2011-22A (Mexico. 2011) I Human rhinovirus isoiate: RhV-NSC-04/2011 (Russia. 2011) I Human rhinovirus isolate:RftV-NSC-07/2Q11 (Russia. 2011) Ь Human rttinourus isolate: RhV-NSC-02/2011 (Russia, 2011)

- (KF0339e5.1) Human itiinovtais sp. isolate TK0901 R010 (Cambodia, 2010) ft—• Human rhinovirus isolate: RhV-NSC-03/2011 (Russia. 2011) i Human rhinovirus isolate: RhV-NSC-OS/2011 (Russia. 2011)

> Human rtiinoviius isolate: RhV-NSC-01/2011 (Russia, 2011)

> Human rhinovirus isolate: RhV-NSC-10/2012 (Russia, 2012) r (KF033943.1) Human rhino^rus sp. isolate KC0905 РЗОЗ (Cambodia. 2010)

TsL (AY680837.1) Human rtvnourus 263 Berlin 2004 (Germany. 2004) ft Human rhinovirus isoOte: RTiV-NSC-15/2012 (Russia, 2012)

> (FJ82947S.1) Hepatitis A vims isolate G1B4-IRES I, (AM910908 1) Hepatitis A urns isoiate 44

l¿m^

371 (AM910904.1) Hepatitis A virus Isolate 46

Рис. 9. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента 5'-нетранслируемой области генома (5-НТО) риновирусов человека длиной 239 н.о. Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. • - исследованные изоляты

Для трёх вариантов бокавируса человека были определены нуклеотидные последовательности фрагмента КР,-гспа, кодирующего белок капсида, длиной 206-240 н.о. (рис. 10). Исследованные варианты бокавируса ложились в одну кладу и демонстрировали достоверное отличие анализируемого участка генома от вариантов вируса ранее обнаруженных в г. Новосибирске в 2010 г., а также Китае в 2006 г., Японии в 2005 г. и Греции в 2008 г.

(GQ907244.1) Human bocaams isolate Stovenia_7 (Stovenia. 2008) (DQ987598.1) Human bocatfnjs isolate: CZ707 (China, 2006) (DQ987597.1) Human bocavtnjs isolate: CS245 (China, 2006) (DQ839316.1) Human bocaums Isolate: CAN1275-03 (Canada. 2003) (JQ513509.1) Human bocawus isolate: HBOV/Athens (Greece. 2008) (JX434058.1) Human bocaWus isolate: C034 (China, 2009) ▲ (JQ964114.1) Human bocatfms Isolate: Rus-Nsc10-N1117 (Russia. 2010) (JF2725t3.1) Human bocaurus isolate: TJ235-2009 (China. 2009) (EF035488.1) Human bocaunis strain: JPBS05-52 (Japan, 2005)

IA (JQ9S4118.1) Human bocaurus isofale: Rus-Nsc10-N386 (Russia. 2010) 38lA (J0964115.1) Human bocawus isolate: Ru3Nsc10+i75t (Russia, 2010)

• Human bocawus isolate: SoV-NSC-01/2011 {Russia, 2011)

-• Human bocawus isolate: BoV-NS002/2011 (Russia, 2012)

100

• Human bocawua isotate: BoV-NSC-03/2011 (Russia. 2012) _100 f(HQ456666.1) Human bocaurus strain: HBOV/IRU47/07 (lrtand. 2007)

'(EF690656.1) Human bocaUtus isotate: CU253 (Thailand, 2008) — (EF216869 1) Human panounis B19

-(NC_000883 2) Human parvovirus B19

L- (AB030673.1) Human parvwnrs B19

Рис. 10. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента УРГгена бокавируса человека длиной 206 н.о. Анализ проведён методом объединения ближайших соседей. Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей.

• - исследованные варианты, ▲ - варианты, обнаруженные в г. Новосибирске

Таким образом, проведенный филогенетический анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей геномов обнаруженных вариантов вирусов, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска в эпидемический сезон 2011— 2012 гг. показал, что наиболее близкие изоляты вирусов ранее были выявлены в Европе, Америке, Азии и Африке в 1962-2011 гг. Выявленные варианты вирусов показывали генетическое разнообразие, что свидетельствует о циркуляции на территории Сибири вариантов вирусов, заслуживающих внимания и дальнейшего исследования.

ВЫВОДЫ

1. Разработана мультиплексная ПЦР в реальном времени, позволяющая выявлять генетические маркёры (ДНК и РНК) одновременно 20 видов и 5 субтипов возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1-4, риновирусов А-С, метапневмовируса человека, бокавируса человека,

аденовирусов человека В, С, Е, коронавирусов человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS, респираторно-синцитиального вируса человека, вируса гриппа В, вируса гриппа А, а также субтипов вируса гриппа А - H1N1 (сезонный вариант), HlNl(2009)pdm (пандемический вариант), НЗ, Н5 и Н7.

2. На основе разработанной мультиплексной ПЦР в реальном времени создан лабораторный вариант набора реагентов. Определены аналитические и диагностические характеристики набора: аналитическая чувствительность - 2039 ГЭ/реакция, lxlO'-lxlO4 в.ч./мл; диагностическая чувствительность - 100%; аналитическая специфичность - 95,7-100%; диагностическая специфичность -100%. В параллельном исследование клинических образцов показано, что чувствительность разработанного набора превосходит чувствительность российского аналога.

3. Для набора реагентов, позволяющего детектировать РНК вирусов парагриппа человека 1-4, написан проект технических условий ТУ № 9398-037-056-640122013, отражающий его качественные характеристики. Разработан новый лабораторный регламент на производство набора реагентов для детекции вирусов парагриппа человека 1-4 JIP № 05664012-016-13.

4. Разработанный набор реагентов апробирован на 164 клинических образцах от пациентов г. Новосибирска с диагнозом ОРВИ негриппозной этиологии, собранных в 2011-2012 гг. В 61 (37%) образце обнаружены генетические маркёры одного вида вируса, в 28 (17%) образцах выявлены генетические маркёры двух и более видов вирусов. Установлено, что основными этиологическими агентами ОРВИ в исследованной выборке были риновирусы (42/25,6%), коронавирусы человека (29/17,6%), вирусы парагриппа человека (24/14,6%) и респираторно-синцитиальный вирус человека (11/6,7%), что соответствует структуре заболеваемости ОРВИ в других странах мира.

5. Обнаружено, что пик видового разнообразия возбудителей, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска в 2011-2012 гг., приходился на возрастные группы детей до 7 лет, с максимумом в группе 2-4 года, а также на группу социально активных взрослых 17-30 лет.

6. Определены 58 нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов семи видов вирусов, вызывавших ОРВИ среди жителей г. Новосибирска в 20112012 гг. Полученные последовательности приняты к депонированию в международную базу данных GenBank. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей, показал, что наиболее близкие изоляты ранее были выявлены в Европе, Америке, Азии и Африке в 1962-2011 гг.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сергеева Е.И.. Иванова Е.В., ШваловА.Н., Терновой В.А., Михеев В.Н, Агафонов А.П., Иванова JI.K., Сергеев А.Н. // Структура заболеваемости респираторными вирусными инфекциями в г. Новосибирске и Новосибирской области в эпидемический сезон 2011-2012 гг. // Вестник РАМН. - 2013. - № 6. -С. 21-25.

2. Сергеева Е.И.. Терновой В. А., Демина O.K., Демина A.B., Корнеев Д.В., Шиков А.Н., Берилло С.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. // Разработка и испытание мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека // Молекул, генетика микробиол. вирусол. - 2013. - № 4. - С. 32-37.

3. Шиков А.Н., Сергеева Е.И., Демина O.K., Терновой В.А., Рябинин В.В., Костина Е.В., Малкова Е.М., Синяков А.Н., Агафонов А.П. // Разработка ДНК-биочипа для выявления субтипов вируса гриппа А // Пробл. особо опасных инфекций. - 2012. - Вып. 2. - № 112. - С. 89-94.

4. Шиков А.Н., Семенцова А.О., Демина O.K., Сергеев A.A., Берилло С.А., Сергеева Е.И., Винокурова A.B., ИшенинаА.В., Терновой В.А., Агафонов А.П., Дроздов И.Г. // Генетическая изменчивость изолятов вируса гриппа A H1N1, выделенных на территории России в 2009 году // Молекул, генетика микробиол. вирусол. - 2011. - № 4. - С. 23-29.

5. Сергеева Е.И.. Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов для идентификации РНК коронавирусов видов 229Е NL63 ОС43 HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной

цепной реакции // Патент РФ № 2473702, приоритет изобретения от 16 ноября 2011 г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 января 2013 г.

Доклады и тезисы конференций

1. Сергеева Е.И.. Иванова Е.В., Швалов А.Н., Терновой В.А., Михеев В.Н., Агафонов А.П. Иванова JI.K., Сергеев А.Н. - Структура заболеваемости респираторными вирусными инфекциями в г. Новосибирске и Новосибирской области в эпидемический сезон 2011-2012 гг. // V Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням. Москва. 25-27 марта 2013 г. С. 362-363

2. Сергеева Е.И.. Иванова Е.В., Швалов А.Н., Терновой В.А., Михеев В.Н., Агафонов А.П., Иванова JI.K., Сергеев А.Н. - Изучение видового разнообразия агентов ОРВИ в г. Новосибирске и Новосибирской области в эпидемический сезон 2011-2012 гг. // «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». Санкт-Петербург. 5-7 июня 2013 г. С. 170.

3. Сергеева Е.И,. Винокурова A.B., Агафонов А.П., Терновой В.А. - Диагностика вируса гриппа, вируса парагриппа, риновируса, метапневмовируса методом ПЦР в режиме реального времени // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Молекулярная диагностика -2010». Москва. 24-26 ноября 2010 г. С. 210.

4. Сергеева Е.И.. Терновой В.А., Демина O.K., Демина A.B., Корнеев Д.В., ШиковА.Н., БериллоС.А., ИшенинаА.В., Винокурова A.B., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. - Разработка мультиплексной обратно-транскриптазной ПЦР-тест-системы для детекции вируса гриппа, респираторно-синцитиального вируса и аденовируса в режиме реального времени // 2-ая Международная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 10-11 октября 2011 г. С. 72

5. Сергеева Е.И.. Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н - Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции 21 вируса, вызывающего острые респираторные заболевания у людей // 2-ая Международная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 10-11 октября 2011 г. С. 73

6. Сергеева Е.И.. Максимов H.JI., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. — Разработка ДНК-биочипа на основе технологии хМАР для детекции коронавируса ТОРС (SARS) // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия человека: Сб. науч. тр. - Новосибирск, 2012. -С. 371-377.

7. Сергеева Е.И.. Шиков А.Н., Демина O.K., Демина A.B., Корнеев Д.В., Пьянков О.В., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. — Разработка набора для детекции вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания у людей, на основе мультиплексного варианта ОТ-ПЦР в режиме реального времени // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия человека: Сб. науч. тр. - Новосибирск, 2012. - С. 365-371.

Настоящая работа выполнена за счет финансирования по грантам: Межгосударственная целевая программа ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» на 2011-2015 годы по теме: «Разработка тест-систем для идентификации генетического материала вирусов - возбудителей инфекций в воде объектов питьевого водопользования» шифр «2011-16-МЦП/№ 29», ГК № 16.М04.12.0028; Государственный контракт по теме «Разработка олигонуклеотидных биочипов для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний II-III групп патогенности» в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы) ГК№ 44-Д от 01.06.2012.

Подписано в печать 26.10.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 182

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сергеева, Елена Игоревна, Кольцово

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

На правах рукописи

04201365553 (//К

Сергеева Елена Игоревна

Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека

03.01.03 - молекулярная биология 03.01.06 — биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д-р биол. наук Агафонов А.П.

канд. биол. наук Терновой В.А.

Кольцове - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений 4

Введение 7 ГЛАВА 1. Обзор литературы: Методы дифференциальной диагностики

вирусов, вызывающих ОРВИ у человека 15

1.1. Вирусы гриппа 15

1.2. Вирусы парагриппа человека 21

1.3. Респираторно-синцитиальный вирус человека 26

1.4. Метапневмовирус человека 31

1.5. Риновирусы 36

1.6. Коронавирусы человека 41

1.7. Аденовирусы человека 46

1.8. Бокавирус человека 51 Заключение по обзору литературы 5 5

ГЛАВА 2. Материалы и методы 57

2.1. Химические реактивы, ферменты и наборы 57

2.2. Буферные растворы и питательные среды 58

2.3. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды 58

2.4. Трансформация компетентных клеток Е. coli 60

2.5. Выделение плазмидной ДНК 61

2.6. Создание музея трансформированных штаммов Е. coli 61

2.7. Использованные в работе штаммы вирусов 62

2.8. Получение препаратов вирусов 63

2.9. Определение физического титра вируса 64

2.10. Клинический материал 64

2.11. Подготовка проб, выделение вирусной РНК/ДНК, реакция обратной транскрипции 65

2.12. Полимеразная цепная реакция 65

2.13. Исследование чувствительности ПЦР 67

2.14. Электрофоретический анализ и выделение продуктов ПЦР из геля 67

2.15. Определение нуклеотидных последовательностей 68

2.16. Анализ нуклеотидных последовательностей 69 ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 73

3.1. Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека 73

3.1.1. Дизайн праймеров и флуоресцентных зондов 73

3.1.2. Разработка и апробация контролей ПЦР в реальном времени 77

3.1.3. Оптимизация ПЦР в реальном времени 80

3.1.4. Оценка чувствительности и специфичности ПЦР в реальном времени 88

3.1.5. Сравнение разработанного метода с аналогом 97

3.2. Исследование структуры возбудителей ОРВИ, обнаруженных в клинических образцах от жителей г. Новосибирска в 2011-2012 гг. 98

3.2.1. Изучение видового разнообразия возбудителей ОРВИ 98

3.2.2. Изучение видового разнообразия возбудителей ОРВИ в разных возрастных группах 104 3.3. Исследование генетического разнообразия обнаруженных вирусов 106

Выводы 116

Список публикаций по теме диссертации 118

Список использованной литературы 121 Приложение 1. Схема постановки ПЦР-РВ для детекции 20 видов и 5

субтипов возбудителей ОРВИ человека 169 Приложение 2. Схема проведения анализа для детекции 20 видов и 5

субтипов возбудителей ОРВИ человека 170

Приложение 3. Патент РФ №2473702 171 Приложение 4. Инструкция по приминению набора реагентов «Вектор-

ПЦРрВ-Парагрипп 1 -4» 173 Приложение 5. ТУ № 9398-037-056-64-012-2013 на набор реагентов

«Вектор-ПЦРрВ-Парагрипп 1-4» 174 Приложение 6. Лабораторный регламент № 05664012-016-13 на

производство набора реагнетов «Вектор-ПЦРрв-Парагрипп 1-4» 176

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция ПЦР - полимеразная цепная рекция

ЦНИИЭ - центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

ОРЗ - острое респираторное заболевание

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК

н. - нуклеотид

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ЦПД - цитопатическое действие

ПИФ - метод прямой иммунофлуоресценции

ТЦПД50/мл - 50%-я тканевая цитопатическая доза

ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная ПЦР

ИФА - иммуноферментный анализ

NASBA - реакция транскрипционной амплификации

ОТ-ПЦР-РВ - обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция в реальном времени

CDC - Center for Disease Control and Prevention (Центр по контролю и предотвращению заболеваний)

FDA - Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США)) LAMP - изотермальная петлевая амплификация ПГ - вирус парагриппа человека ГЭ - геномный эквивалент

PCB - респираторно-синцитиальный вирус человека

RSV - human respiratory syncytial virus (респираторно-синцитиальный вирус человека)

WHO - World Helth Organization (Всемирная Организация Здравоохранения)

пг - пикограмм (10" г)

ЦПД50 - 50%-ая цитопатическая доза

США - Соеденённые Штаты Америки

DFA - direct immunofluoresence (метод прямой иммунофлуоресценции)

5'-НТО (5'-UTR) - 5'-нетранслируемая область генома

VP (virion protein) - вирионный белок

фг - фемтограмм (10~5 г)

ВКО - внутренний контрольный образец

ТОРС - тяжёлый острый респираторный синдром

SARS - severe acute respiratory Syndrom (тяжёлый острый респираторный синдром)

п.н. - пара нуклеотидов

в.ч. - вирусная частица

БОЕ - бляшкообразующая единица

ТАЕ - трис-ацетатный буферный раствор

СО РАН - Сибирское Отделение Российской Академии Наук

мкл - микролитр (10"6 л)

ДМСО - диметилсульфоксид

мкг - микрограмм (10"6 г)

ГНЦ ВБ «Вектор» - Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Су5 - cyanine 5

FAM - 5(6)-carboxyfluorescein

R6G - rhodamine 6G

ROX - 6-Carboxyl-X-Rhodamine

РАМН - Российская Академия Медицинских Наук

НИИ - Научно-исследовательский институт

АТСС - Американская типовая коллекция клеточных культур

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РФ - Российская Федерация Тт - температура плавления

PIV-1 - parainfluenza virus 1 (вирус парагриппа человека 1) PIV-2 - parainfluenza virus 2 (вирус парагриппа человека 2) PIV-3 - parainfluenza virus 3 (вирус парагриппа человека 3) PIV-4 - parainfluenza virus 4 (вирус парагриппа человека 4) RhV - rhinovirus (риновирус)

MpV - metapneumovirus (метапневмовирус человека)

BoV - bocavirus (бокавирус человека)

AdV - adenovirus (аденовирус человека)

CoV 229Е - coronavirus 229E (коронавирус человека 229Е)

CoV HKU1 - coronavirus HKU1 (коронавирус человека HKU1)

CoV NL63 - coronavirus NL63 (коронавирус человека NL63)

CoV OC43 - coronavirus OC43 (коронавирус человека OC43)

Inf A - influenza A virus (вирус гриппа A)

Inf В - influenza В virus (вирус гриппа В)

A/H1N1 - influenza A viris H1N1 (сезонный вирус гриппа субтипа H1N1) A/H1N1(2009) - pandemic influenza A viris H1N1 (пандемический вирус гриппа субтипа H1N1)

А/НЗ - influenza A viris НЗ (вирус гриппа А субтипа НЗ) А/Н5 - influenza A viris Н5 (вирус гриппа А субтипа Н5) А/Н7 - influenza A viris Н7 (вирус гриппа А субтипа Н7) н.о. - нуклеотидное основание н.п. - нуклеотидная пара п.о. - пара оснований

ОКО - отрицательный контрольный образец ПКО - положительный контрольный образец БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин НП - нуклеотидная последовательность

ВВЕДЕНИЕ

По официальным данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в 2010 году на территории Российской Федерации было зарегистрировано 28 265 634 случая острых инфекций верхних дыхательных путей. Из них заболеваний гриппом - 27 363 случая [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2010]. В 2011 году - 31 038 446 случаев, из них заболеваний гриппом - 308 829 случаев [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2011]. В 2012 году -28 447 773 случая, из них заболеваний гриппом - 24 638 случаев [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 1) за январь-декабрь 2012].

В настоящее время известно более 200 вирусов, вызывающих ОРВИ у человека. Основные этиологические агенты ОРВИ человека относятся к шести семействам: Orthomyxoviridae (вирусы гриппа), Paramyxoviridae (вирусы парагриппа человека 1-4, метапневмовирус человека, респираторно-синцитиальный вирус человека), Picornaviridae (энтеровирусы, риновирусы), Coronaviridae (коронавирусы человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS, MERS), Adenoviridae (аденовирусы человека), Parvoviridae (бокавирус человека).

Хотя острые респираторные вирусные инфекции человека и составляют группу заболеваний с похожими клиническими проявлениями, вызывающие их вирусы значительно отличаются по патогенности и летальности для человека. В последнее время в фармакологии стремительно развиваются направления по разработке средств специфической противовирусной терапии. Так, для лечения инфекций человека, вызванных

вирусами гриппа, применяются ингибиторы нейраминидазы (занамивир, ланинамивир, озельтамивир, перамивир) [Matheson N .J. et al., 2003]. Активно разрабатываются средства терапии и профилактики для респираторно-синцитиального вируса человека, а именно: моноклональные антитела (Мотавизумаб) [Olszewska W., Openshaw P., 2009], малые интерферирующие РНК [Maggon К, Bank S., 2004; Cramer Н., 2005], ингибиторы F-белка [Bonfanti J.F., Roymans D., 2009]. Для лечения аденовирусных инфекций эффективно применяют цидофовир и рибавирин [Waye M.M.Y., Sing C.W., 2010]. Для лечения тяжелых случаев ОРВИ, вызванных метапневмовирусом, применяют комбинированное лечение рибавирином и иммуноглобулинами [Bonney D. et al., 2009]. Для терапии риновирусной и энтеровирусной инфекций применяют препарат «Enviroxime», механизм действия которого связан с ингибированием процесса репликации вирусной РНК [Wikel J.H. et al., 1980]. Одним из препаратов для лечения риновирусной инфекции является также «Pleconaril» - ингибитор капсидных белков вируса [Clercq E.D., 2012]. Для разработки средств специфической терапии коронавирусных инфекций также ведется активная исследовательская работа: обнаружены ингибиторы вирусных рецепторов, ингибиторы процесса слияния вирусной и клеточной мембран, ингибиторы репликации коронавирусов (малые интерферирующие РНК, протеазы, специфические химические соединения) [Haagmans B.L., Osterhaus A.D.M.E., 2006].

Таким образом, дифференциальная диагностика указанных вирусных агентов позволяет скорректировать схему лечения, что в свою очередь позволяет более эффективно использовать ресурсы системы здравоохранения. А исходя из того, что острые респираторные заболевания у человека способно вызывать множество инфекционных агентов, их дифференциальная диагностика требует затраты значительных материальных, временных и трудовых ресурсов. В связи с этим, особенно актуальна разработка средств дифференциальной диагностики

респираторных заболеваний в формате мультиплексной ПЦР [Mahony J.B. et al., 2011].

На территории Российской Федерации в настоящее время существует единственный набор реагентов для идентификации генетического материала агентов ОРВИ человека - «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» (ЦНИИЭ, Москва), который может быть использован для научных исследований. Набор позволяет методом ПЦР-РВ выявлять в клиническом образце генетические маркёры 17 вирусов: респираторно-синцитиального вируса человека, метапневмовируса человека, вирусов парагриппа человека 1, 2, 3 и 4, коронавирусов человека 229Е, NL63, ОС43, HKU1, риновирусов, аденовирусов человека В, С и Е и бокавируса человека.

Отличительной особенностью вирусных агентов является высокая вариабельность их геномов и высокая антигенная вариабельность. Следовательно, только исследование клинического материала с использованием сочетания нескольких наборов реагентов, либо нескольких методов позволяет точно определить вирусный агент, явившийся причиной заболевания. Таким образом, создание набора реагентов для идентификации агентов ОРВИ человека методом мультиплексной ПЦР-РВ является чрезвычайно актуальной задачей, так как позволяет изучить структуру заболеваемости ОРВИ. И это заслуживает особого внимания, поскольку обширных исследований в этом направлении на территории Российской Федерации и, в частности, в Новосибирской области до сих пор не выполнялось.

Цели исследования. Разработать мультиплексную ПЦР-РВ и набор реагентов на её основе для выявления генетических маркёров (РНК и ДНК) наиболее распространённых возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1-4; риновирусов А-С; метапневмовируса человека; бокавируса человека; аденовирусов человека В, С, Е; коронавирусов человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS; респираторно-синцитиального вируса человека; вируса гриппа В; вируса гриппа А, в т.ч. субтипов вируса

гриппа А - НШ1 (сезонный вариант), НШ1(2009)рёш (пандемический вариант), НЗ, Н5 и Н7. Апробировать разработанный набор реагентов на клинических образцах от пациентов с диагнозом ОРВИ.

Задачи исследования:

Научная новизна и практическая значимость работы.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработана мультиплексная ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека: вирусов парагриппа человека 1-4; риновирусов А-С; метапневмовируса человека; бокавируса человека; аденовирусов человека В, С, Е; коронавирусов человека 229Е, HKU1, NL63, ОС43, SARS; респираторно-синцитиального вируса человека; вируса гриппа В; вируса гриппа А, в т.ч. субтипов вируса гриппа А - H1N1 (сезонный вариант), HlNl(2009)pdm (пандемический вариант), НЗ, Н5 и Н7. Мультиплексная ПЦР-РВ в условиях проделанных экспериментов демонстрировала следующие характеристики: аналитическая чувствительность - 20-39 ГЭ/реакция, 1x103-1x104 в.ч./мл; диагностическая чувствительность - 100%; аналитическая специфичность - 95,7-100%; диагностическая специфичность - 100%.

Вклад автора.

1. Создание коллекции образцов РНК, ДНК и кДНК, выделенных из клинических образцов, собранных от пациентов г. Новосибирска и Новосибирской области с диагнозом ОРВИ в период с октября 2011 г. по апрель 2012 г.

2. Расчет и тестирование олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для генодиагностики и генотипирования возбудителей ОРВИ человека.

3. Конструирование 21 рекомбинантной плазмиды, несущих вирусспецифические вставки, и создание коллекции трансформированных клеток Е. coli.

4. Получение штаммов пандемического вируса гриппа A/HlNl(2009)pdm - совместно с Агафоновым А.П., Деминой O.K., Шиковым А.Н.

5. Выявление генетических маркёров возбудителей ОРВИ человека и определение нуклеотидных последовательностей их геномов - совместно с Терновым В.А.

6. Филогенетический анализ определённых нуклеотидных последовательностей геномов вирусов - совместно с Терновым В.А.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы и приложений. Библиография включает 420 работ (4 отечественных, 406 зарубежных, 10 электронных ресурсов). Работа иллюстрирована 28 рисунками, включает 19 таблиц.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опу�

Информация о работе

Сергеева, Елена Игоревна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы