Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени

Никонова, Александра Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени"

0034Ьи<£ !«=>

На правах рукописи

НИКОНОВА Александра Александровна

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСОВ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ.

03.00.06 - вирусология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003460216

Работа выполнена в ГУ НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, академик РАМН, ЗВЕРЕВ Виталий Васильевич

кандидат биологических наук ФАЙЗУЛОЕВ Евгений Бахтиёрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ИВАНОВА Валерия Тимофеевна

доктор медицинских наук МАРКУШИН Станислав Георгиевич

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится 19 февраля 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « ьо» 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета —

кандидат биологических наук С-^с^^р ) Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) по распространенности и контагиозности занимают ведущее место среди инфекционных болезней человека. В России на грипп и гриппоподобные острые респираторные заболевания приходится более 90% инфекционной заболеваемости (Слепушкин А. Н., 2001). Основной вклад в структуру ОРВИ вносят вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, риновирусы и некоторые энтеровирусы. С точностью идентифицировать респираторные вирусные инфекции можно только при помощи лабораторных методов диагностики. Затруднения при дифференциальной лабораторной диагностике этих инфекций вынуждают вести статистический учет по сумме всех случаев, включая их в комплекс ОРВИ. Выделение вируса в культуре клеток и реакция нейтрализации типоспецифическими сыворотками, считающиеся «золотым стандартом» диагностики, в то же время обладает рядом недостатков, включающими высокую трудоемкость и продолжительность теста. Широкое распространение имеют иммунохимические экспресс-методы выявления вирусных агентов в клинических образцах. Основными их преимуществами являются доступность и простота постановки. Однако, в ряде случаев, они бывают недостаточно информативны и неприменимы в отношении риновирусов и других респираторных вирусов, характеризующихся высоким антигенным разнообразием. В настоящее время для выявления и идентификации респираторных вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов (leven М., 2007; Kesson А. М„ 2007).

Несмотря на имеющиеся разнообразие методов диагностики вирусных инфекций, остается актуальной проблема быстрой и высокочувствительной диагностики. Внедрение метода ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий

в клинической лабораторной диагностике. Применение ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет вирусных нуклеиновых кислот.

Современные приборы для ПЦР-РВ позволяют в одной пробирке проводить и детектировать в режиме реального времени до 6-ти независимых реакций, с использованием зондов, меченных различными флуоресцентными красителями (мультиплексная ПЦР-РВ). Несмотря на очевидные преимущества этого подхода на российском рынке практически отсутствуют тест-системы на основе мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики респираторных вирусных инфекций. Таким образом, разработка мультиплексной ПЦР тест-системы для одновременного выявления в клинических образцах основных возбудителей ОРВИ является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы с детекцией в режиме реального времени, позволяющей одновременно выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - вирусы гриппа А и В (ВГА и ВГВ), вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов (ВПГ 1, 2, 3, 4), аденовирусы (АДВ), респираторно-синцитиальный вирус (PCB), риновирусы (РВ) и энтеровирусы (ЭВ).

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• в культуре клеток получить образцы лабораторных штаммов респираторных вирусов для использования их на следующих этапах работы в качестве биологических стандартов;

• к консервативным геномным последовательностям респираторных вирусов подобрать праймеры и зонды (TaqMan) и показать их специфичность в ПЦР;

• оптимизировать условия проведения мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР, провести сравнительную оценку эффективности и

чувствительности моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ для выявления различных респираторных вирусов;

• проанализировать клинические образцы от больных с симптомами ОРВИ с помощью разрабатываемой ПЦР-тест-системы и её зарубежного аналога и провести сравнительный анализ результатов, полученных двумя тест-системами;

• отработать методы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов в биологических образцах.

Научная новизна.

Впервые в России разработана тест-система, позволяющая методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека, в частности, ВГА, ВГВ, ВПГ 1, 2, 3,4 типов, АДВ, РСВ, РВ и ЭВ в присутствии внутреннего положительного контроля. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемые в тест-системе, были разработаны в процессе выполнения настоящей работы, то есть являются оригинальными.

Практическая значимость.

1. Мультиплексная тест-система с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для одновременного выявления основных респираторных вирусов в клинических образцах может применяться в эпидемиологических службах для быстрой расшифровки вспышек ОРВИ и для мониторинга эпидемиологической обстановки. В перспективе, с развитием методов специфического лечения респираторных вирусных заболеваний, подобные тест-системы найдут применение в клинической практике для постановки диагноза и назначения адекватного лечения.

2. Разработанные методические приемы количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов могут быть использованы в научных исследованиях, в частности, для контроля уровня вирусной

репродукции, наряду с традиционными методами титрования вирусов, при испытании противовирусных препаратов in vitro и in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В ходе выполнения работ были подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов TaqMan для выявления в биологических образцах ВГА, ВГВ, ВПГ 1, 2, 3, 4 типов, АДВ, РСВ, РВ и ЭВ и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов.

2. Разработана мультиплексная ПЦР-тест-система для одновременного выявления 10 групп респираторных вирусов в клинических образцах.

3. Анализ клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ показал, что разработанная тест-система не уступает по специфичности зарубежному аналогу.

4. Разработан алгоритм для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов, который был успешно применен в ряде научных исследований.

Апробация работы состоялась 27 ноября 2008 года на заседании Ученого совета ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. Результаты исследований представлены и обсуждены на VIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Суздаль, 2005 г.; г. Рязань, 2007 г.), на Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (г. Москва, 2005 г.), на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007 г.), на IV Международной Конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), на III научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики

и лечения инфекционных болезней» (г. Москва, 2008 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 статей в научных журналах и сборниках научных трудов, а также тезисы 7 докладов на научных конференциях.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 257 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, включая 16 таблиц, 17 рисунков и одно приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В качестве биологических стандартов респираторных вирусов были использованы лабораторные штаммы различных респираторных вирусов. Лабораторные штаммы вирусов гриппа: А/Соломоновы Острова/3/О6 (H1N1); А/Калифорния/7/04 (H3N2); A/Texac/1/77 (H3N2); А/Брисбан/59/07 (H1N1); АУБрисбан/10/07 (H3N2); А/Москва/80/08 (H1N1); А/Владивосток/6/08 (H3N2); В/Владимир/25/08; В/Флор ида/7/04; В/Малайзия/2506/04 любезно предоставлены Ивановой В.Т. (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва). Лабораторные штаммы вирусов: РВ 16 типа, ВПГ 2 и 3 типов, PCB (штамм Long), АДВ 5, 7 и 8 типов, ВГА Panama/2007/99 (H3N2) получены от Сомининой A.A. (ГУ НИИ гриппа РАМН, г. Санкт-Петербург). Штаммы АДВ 2 и 5 серотипов были любезно предоставлены Дорониным К.К. (ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, г. Москва). Лабораторные штаммы вирусов гриппа: А/Ленинград/549/80 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1), А/Миссисипи/1/85 (H3N2), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Ленинград/134/57

(H2N2), А/Краснодар/101/59 (H2N2), А/Чили/1/83 (H1N1), А/Рязань/6103/86 (H3N2), В/Ленинград/179/86 получены от Нагиевой Ф.Г. (ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва). Лабораторные штаммы ЭВ: ECHO 3, 6, 7 и 30 типов, Коксаки В (не типирован), полиовирусы 1, 2 и 3 типов (вакцинные штаммы Сэбина) получены от Ивановой O.E. (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва). Образцы инактивированных вирусов (ВПГ 1 и 4 типов, метапневмовирус, коронавирусы NL63, 229Е и ОС43, вирус артериита лошадей - Equine Arteritis Virus), а также смеси праймеров и зондов для выявления 12 респираторных вирусов (голландская тест-система) были любезно предоставлены Эриком Клаасом (Медицинский центр Лейденского университета - г. Лейден, Нидерланды).

Анализ нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров и зондов проводили с помощью компьютерных программ Omiga 2.0 («Oxford Molecular Ltd.», США) и Vector NTI Advance 9.0 («InforMax Inc.», США), а также Интернет-программы BLAST (NCBI, Национальный центр биотехнологической информации, США).

Двести девять клинических образцов (мазки из полости носа) от больных всех возрастов с симптомами ОРВИ были собраны в период с февраля по май 2008 года в различных лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) на территории Московской области (Истринский, Ногинский, Подольский, Серпуховской, Пушкинский районы) и получены из ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области" Роспотребнадзора, г. Мытищи.

Семнадцать клинических образцов (мазки из полости носа) от детей с симптомами ОРВИ в возрасте от 2 до 16 лет были собраны в период с октября 2007 по февраль 2008 года и предоставлены отоларингологом детской поликлиники №39 г. Москвы Фошиной Е.П.

Суммарную нуклеиновую кислоту (НК) выделяли при помощи коммерческого набора «QIAmp Viral RNA Mini Kit» («Qiagen», Германия) или фирмы «Изоген» (Россия), руководствуясь инструкцией фирмы-производителя.

В основе коммерческих наборов лежит модификация метода выделения НК, предложенная Boom R. с соавторами (Boom R.,1990).

Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием ревертазы вируса лейкоза Молони в течение 30 минут при 42 С в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). При постановке ПЦР-РВ использовалась «Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ» («Синтол», Россия). Качественный и количественный анализ образцов вирусной РНК и ДНК методом ПЦР-РВ проводили на приборе АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор праймеров и оптимизация условий выявления ДНК аденовирусов человека в биологических образцах методом ПЦР.

Аденовирусы (АДВ) человека представляют собой весьма гетерогенную группу вирусов, насчитывающую более 50 серотипов. Существование большого количества генетических вариантов АДВ чрезвычайно затрудняет проведение лабораторной диагностики. В связи с этим на данном этапе работы была поставлена цель - разработать тест-систему, позволяющую методом ПЦР при помощи одной пары праймеров выявлять в клинических образцах максимально возможное число генетических вариантов АДВ человека. Использование при составлении праймеров для ПЦР большого количества известных нуклеотидных последовательностей гена гексона АДВ - самого консервативного гена вируса - позволяет решить поставленную задачу. Был проведен компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей гена гексона, который позволил определить последовательности прямого А1 и двух обратных праймеров A3 и A4. В серии экспериментов была определена

оптимальная комбинация праймеров А1-А4, которая с высокой чувствительностью выявляла ДНК АДВ пяти серотипов (рис. 1).

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

168 п.о.

Рис.1. Выявление ДНК АДВ разных серотипов с помощью праймеров А1-А4. Дорожки: 1 - маркер веса ДНК - pBR322 Hinfl-Dral; 2-3, 4-5, 6-7 и 8-9 - 100и 10 копий ДНК АДВ 3, 7, 2 и 5 серотипов, соответственно; 10-1 мкгДНК, выделенной из незараженных клеток HeLa; 11 - Н20.

Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий для дифференциального выявления риновирусов и энтеровирусов в биологических образцах методом ПЦР.

Иммунохимические методы диагностики риновирусной инфекции не нашли широкого применения вследствие очень высокого антигенного разнообразия риновирусов (РВ) - на сегодняшний день известен 101 серотип РВ. Наиболее надежным методом идентификации РВ человека считается выделение вируса в культуре клеток с последующей постановкой теста на кислотоустойчивость (acid lability test). Метод выделения РВ в культуре клеток, являющийся «золотым стандартом», в то же время обладает рядом недостатков, включающим высокую трудоемкость, более низкую по сравнению с молекулярными методами чувствительность.

В настоящее время, наряду с культуральными методами, для выявления и идентификации РВ широко используется ПЦР. Наличие в 5'-концевой нетранслируемой области (5'НТР) риновирусной геномной РНК

консервативных участков делает возможным выявление с помощью одной пары праймеров большинства серотипов РВ (81етт§ег С. е1 а!, 2001).

На основе анализа частичных геномных последовательностей 101 серотипа РВ человека, к консервативным участкам 5'НТР было подобрано 6 праймеров для ОТ-ПЦР - по три прямых и обратных (рис. 2).

Схема генома рнновнрусов (+цепь)

5'НТР

VF4-VP1 | 2А| 2В 2С |ЗА ЗЕ| 3.Q 3D

З'НТР

—ееМА)

5'НТР

NTR1 ИИ NTR3

РБ-з

М» 117X5 Ш

Рис. 2. Подбор праймеров для выявления РВ методом ПЦР.

5'НТР, З'НТР - 5', 3'-концевая нетранслируемая область генома,

соответственно; 1УТШ- - праймеры для ПЦР; РВ-з - зонд для ПЦР-РВ.

Заражением и культивированием во вращающемся барабане диплоидных эмбриональных легочных клеток человека IMG 977 был получен вирусный материал РВ16. Из вирусного материала (лизат клеток, зараженных РВ 16) выделяли РНК и анализировали ее методом ОТ-ПЦР, используя 6 подобранных праймеров (9 вариантов пар праймеров). Продуктами всех 9 реакций, проводимых с вирусной РНК, были ампликоны ожидаемой электрофоретической подвижности (рис. 3).

Далее, была определена чувствительность выявления РНК риновирусов при помощи разных пар праймеров. С этой целью реакцию проводили с 10-кратными разведениями вирусной РНК, выделенной из лизата клеток, зараженных РВ16 (103 ТЦД5о/мл). Наибольшую чувствительность обеспечивали следующие комбинации пар праймеров - NTR1-NTR5, NTR2-NTR5, NTR3-

N7115, которые выявляли вирусную РНК до разведения 10~5, что соответствует 0,01 ТЦДзо/мл.

1 2 3 4 3 6 7 8 9 10 И 12 13 14

Рис 3. Выявление РНКРВ16 с помощью праймеров NTR1-NTR6. Дорожки: 1, 14 - маркер веса ДНК - pBR322 Hinfl-Dral; 2 - 10 - продукты реакции ОТ- ПЦР с 9 вариантами пар праймеров, в том числе: 2 - NTR4-NTR1 (465 п.о.); 3 - NTR4-NTR2 (401 и.о.); 4 - NTR4-NTR3 (274 и.о.); 5 -NTR5-NTR1 (493 п.о.); 6 - NTR5-NTR2 (430 п.о.); 7 - NTR5-NTR3 (306 п.о.); 8 -NTR6-NTR1 (596 п.о.); 9-NTR6-NTR2 (533 п.о.); 10-NTR6-NTR3 (409 п.о.); 11 -13 - незараженная культура клеток IMG 977, в том числе: 11 - NTR6-NTR1;12 - NTR6-NTR2; 13 -NTR6-NTR3.

Следует отметить, что задача специфичного определения РНК риновирусов с помощью ОТ-ПЦР усложняется тем, что 5'НТР является высококонсервативной областью для многих представителей семейства Picornaviridae (Steininger С., 2001). Таким образом, наличие в изучаемой пробе некоторых энтеровирусов может приводить к ложноположительным результатам. Для решения этой проблемы мы применяли ПЦР-РВ с использованием флуоресцентномеченных гибридизационных зондов TaqMan. Гибридизационный зонд был подобран к области, соответствующей участку связывания праймера NTR-5 (РВ-з), а для амплификации ПЦР-продукта использовали праймеры NTR-3 и NTR-6 (рис. 2). С целью оценки специфичности определения РНК рино- и энтеровирусов несколько штаммов

энтеровирусов и риновирус 16 типа были проанализированы методом ПЦР с выявлением результатов как электрофорезом, так и в режиме реального времени с использованием праймеров и зондов для выявления энтеровирусов (Оксанич A.C., 2007) и риновирусов (рис.4, табл. 1).

1234S67 8 9 10

412 п.о. „

Рис. 4. Результаты выявления РНК энтеровирусов и риновирусов праймерами и зондом, предназначенными для выявления: А - энтеровирусов; Б -риновирусов.

Дорожки: 1 - ECHO 3; 2 - ECHO 6; 3 - ECHO 7; 4 - ECHO 30; 5 - Коксаки В; 6 -полиовирус I типа; 7 - полиовирус 2 типа; 8 - полиовирус 3 типа; 9 -риновирус 16 типа; 10 - маркер веса ДНК.

Анализ результатов ПЦР показал, что праймеры и зонд для энтеровирусов не выявляют риновирус 16 типа, выявляя при этом все проанализированные лабораторные штаммы энтеровирусов, тогда как праймеры и зонд для риновирусов выявляют, как риновирус 16 типа, так и все проанализированные штаммы энтеровирусов. Анализ значений пороговых циклов (ПЦ) (табл. 1) показывает снижение эффективности ПЦР при выявлении праймерами для риновирусов лабораторных штаммов энтеровирусов - разница в значениях пороговых циклов варьирует от 4,5 до 9 циклов. Исключение составляет ECHO 3, при анализе которого разными

праймерами не было отмечено существенной разницы в значениях пороговых циклов.

Таблица 1

Результаты выявления риновирусов и энтеровирусов методом

ПЦР-РВ.

Вирусы Значения пороговых циклов

Праймеры и зонд для выявления энтеровирусов Праймеры и зонд для выявления риновирусов

ECHO 3 33,90 34,12

ECHO 6 33,37 37,84

ECHO 7 30,25 39,46

ECHO 30 29,96 34,84

Коксаки В 31,14 36,66

Полиовирус 1 типа 32,92 37,74

Полиовирус 2 типа 32,35 38,61

Полиовирус 3 типа 34,43 38,86

Риновирус 16 типа - 30,87

Компьютерный анализ специфичности подобранных праймеров и зондов с использованием большого количества геномных последовательностей показал, что праймеры и зонд для энтеровирусов должны выявлять в образцах только энтеровирусы, тогда как праймеры и зонд для риновирусов обладают меньшей специфичностью, что подтверждается приведенными выше результатами ПЦР.

Анализ полученных результатов показал, что одновременное исследование образца праймерами и зондами для выявления риновирусов и энтеровирусов и интерпретация результатов с учетом полученных значений пороговых циклов позволяет дифференцировать РНК рино- и энтеровирусов.

Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в

агарозпом геле.

В настоящей части работы была поставлена цель - разработать тест-систему, позволяющую методом мультиплексной ПЦР, с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле, при помощи специально подобранных пар праймеров выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - ВГА, ВПГ2, ВПГЗ, PCB, РВ, АДВ. Для этого в отношении каждого из респираторных вирусов был проведен анализ нуклеотидных последовательностей геномов, который позволил выявить консервативные области, к которым были подобраны праймеры. Для облегчения интерпретации результатов при электрофоретическом анализе, праймеры подбирались так, чтобы размеры вирусспецифических ПЦР-продуктов заметно различались по массе (рис. 5).

Следует отметить, что результаты, полученные при помощи мультиплексной тест-системы с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле, зачастую с трудом поддаются интерпретации при анализе некоторых типов образцов. Праймеры могут неспецифически взаимодействовать с клеточной или бактериальной ДНК, которые в большом количестве содержатся в мазках из полости носа (этот тип клинических образцов чаще всего используется для выявления респираторных вирусов), что приводит к появлению дополнительных полос на электрофореграмме и затрудняет интерпретацию результатов ПЦР. По этой причине работа по созданию мультиплексной ПЦР-тест-системы с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле не получила дальнейшего развития. Следующим этапом нашей работы стало создание тест-системы с детекцией в режиме реального времени.

М 1 2 3 4 5 6

Рис. 5. Выявление РНК (ДНК) возбудителей респираторных инфекций методом мультиплексной ОТ-ПЦР (ПЦР). Дорожки: М - маркер веса ДНК; Вирусспецифические ПЦР-продукты, соответственно: 1 - PCB, штамм Long (503 п.о.); 2 - ВПГ2 (430 п.о.); 3 - ВПГЗ (362 n.o.); 4-РВ 16 типа (306 п.о.); 5 - ВГА, H3N2, штамм Рапата/2007/99 (231п.о.); 6 - АДВ 3 типа (159 п.о.).

Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления 10 групп респираторных вирусов в биологических образцах.

Оснащение лаборатории приборами для ПЦР-РВ (АНК-32) позволило усовершенствовать разработанные тест-системы для выявления респираторных вирусов. Применение флуоресцентномеченных гибридизационных зондов обеспечивает высокую специфичность тестов, а технические возможности прибора АНК-32 позволяют в одной пробирке проводить и детектировать до четырех независимых реакций одновременно.

В настоящей работе была поставлена цель - разработать тест-систему, которая позволяет методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) одновременно выявлять в клинических образцах 10 основных возбудителей ОРВИ. Таким образом, список вирусов, выявляемых мультиплексной ПЦР с детекцией в агарозном геле на настоящем

этапе работ расширился с 6 до 10 респираторных вирусов и дополнился ВГВ, ВПГ 1, ВПГ4, ЭВ.

Последовательности праймеров, которые были использованы на предыдущих этапах работы, были скорректированы с учетом требований, предъявляемых к праймерам для мультиплексной ПЦР-РВ (Templeton К.Е., 2004). Также были подобраны последовательности гибридизационных зондов, нацеленных на область между праймерами. Всего к консервативным областям вирусных геномов были подобраны последовательности 10 пар праймеров и 10 зондов. Праймеры и зонды были направлены к следующим участкам вирусных геномов: ВГА и ВГВ - к М-гену; PCB - к гену нуклеопротеина N; ЭВ и РВ - к 5'-НТР; АДВ - к гену гексона; ВПГ 1-3 - к гену гемагглютинин-нейраминидазы HN; ВПГ4 - к гену фосфопротеина. Также были подобраны праймеры и зонд для выявления ВПК, представленного нереспираторным РНК-содержащим вирусом (вакцинный штамм вируса краснухи RA 27/3). Специфичность разработанных праймеров и зондов была показана в ПЦР-РВ (моноспецифический формат) на лабораторных штаммах вирусов, перечисленных в разделе «Материалы и методы».

С целью определения оптимальных комбинаций праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР-РВ была проведена серия экспериментов. При формировании реакционных смесей для мультиплексной ПЦР были опробованы различные комбинации праймеров и зондов. При этом одним из основных критериев при выборе оптимальной комбинации праймеров и зондов была эффективность ПЦР, определяемая значениями пороговых циклов. На основе полученных данных было сформировано 3 реакционных смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ: смесь 1 - для выявления АДВ, ЭВ, ВПК; смесь 2 - ВГА, ВГВ, РВ, PCB; смесь 3 - ВПГ 1-4 (табл. 2).

Далее, была проведена работа по подбору оптимальных условий проведения реакций мультиплексной ОТ и ПЦР. В результате были установлены оптимальные концентрации праймеров и зондов для каждой реакционной смеси, а также время и температура отжига праймеров в ПЦР-РВ.

Во всех экспериментах применялась двухэтапная ОТ-ПЦР. В состав реакционной смеси для мультиплексной ОТ входило от двух (реакционная смесь №1) до четырех (реакционная смесь №2 и №3) праймеров для ОТ.

Таблица 2

Распределение вирусспецифических праймеров и зондов по реакционным смесям в мультиплексной ПЦР-РВ.

Краситель Реакционная смесь

1 2 3

РАМ АДВ вгв ВПГ1

ИОХ - РСВ ВПГ2

Ябв ЭВ ВГА впгз

Су5 ВПК РВ ВПГ4

При разработке ПЦР-тест-системы был предусмотрен ряд контролей для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Для этого были сформированы пулы положительных контрольных образцов (ПКО), которые, наряду с ВПК, анализировались при постановке каждой реакции и контролировали все этапы анализа - выделение нуклеиновых кислот, ОТ и ПЦР. В состав пулов ПКО входили лабораторные штаммы респираторных вирусов, разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 31-33 цикле. ПКО разводят для того, чтобы контролировать возможность выявления всех образцов, содержащих вирусные НК, включая образцы с низкой концентрацией НК. Для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализировался отрицательный контроль, в качестве которого использовали дистиллированную воду.

Сравнительный анализ эффективности и чувствительности мультиплексной и моиоспецифнческой ПЦР-РВ.

В литературе встречаются данные о более низкой эффективности мультиплексной ПЦР по сравнению с моноспецифической, и, как следствие, снижении чувствительности анализа (Уегпе! в., 2004). Для сравнения эффективности ПЦР в моноспецифическом и мультиплексном форматах постановки была проведена серия экспериментов. С этой целью делали последовательные 10-кратные разведения вирусного материала таким образом, чтобы последнее разведение приближалось к пределу чувствительности моноспецифической ПЦР-РВ. Далее анализировали их методом ПЦР-РВ и сравнивали значения пороговых циклов (ПЦ) в различных вариантах постановки (мультиплексная и моноспецифическая ПЦР). При анализе значений ПЦ для моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ, которые представлены в таблице 3, не было отмечено достоверной разницы в значениях ПЦ (колебания значений ПЦ составили ±1 цикл). Таким образом, было показано, что мультиплексная ПЦР не уступает по чувствительности моноспецифической, несмотря на то, что реакционная смесь для мультиплексной ПЦР является более сложной из-за наличия в ней 3-4 пар праймеров, которые при взаимодействии друг с другом могут снижать эффективность и чувствительность ПЦР. Анализ данных, приведенных в таблице 3, позволил определить аналитическую чувствительность моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ. Пределом чувствительности ПЦР-РВ считалось последнее разведение препарата вируса, при анализе которого методом ПЦР-РВ наблюдалось нарастание сигнала флуоресценции. Предел чувствительности обнаружения АДВ составил 1 ТЦД50/мл, ЭВ - 14 ТЦД50/мл, В ГА - 3 ТЦДзо/мл, ВГВ - 10 ТЦЦ50/мл, РСВ - 2 ТЦД50/мл( РВ - 0,01 ТЦЦ50/мл, ВПГ1 - 10 ТЦД50/мл, ВПГ2 - 1 ТЦД50/мл, ВПГЗ - 0,1 ТЦД50/мл, ВПГ4 - 0,1 ТЦД50/мл.

Таблица 3

Сравнительный анализ эффективности моноспецифической и _мультиплексной ПЦР-РВ._

Последовательные разведения вирусного материала Формат постановки реакции (пороговый цикл±з,)

Моноспецифическая ПЦР-РВ Мультиплексная ПЦР-РВ

АДВ 5 типа - 104 ТЦД50/мл

10 33,86±0,47 34,23±0,09

Ю-4 36,8±0,81 37,75±0,17

ЭВ (полиовирус 3 типа, вакцинный штамм Сэбина) - 1,4*Ю8ТЦЦ50/ мл

кг4 28,90±0,10 29,23±0,04

Ю"6 32,65±0,18 32,63±0,34

10" 36,32±1,46 35,58^0,30

BfA, Panama/2007/99 (H3N2) - 3*106 ТЦЦ5„/мл

ю-4 29,00±0,24 27,92±0,33

КГ4 32,12±0,30 30,89±0,43

Ю"6 36,36±0,44 34,68±0,27

ВГВ (В/Ленинград 179/86) - 108ТДД;о/мл

Ю"5 29,33±0,03 29,33±0,63

10"6 33,12±0,59 33,30±0,18

10-' 37,02±0,18 35,88±0,62

PCB, Long - 2*106ТЦЦ5о/мл

Ю-4 32,32±0,59 31,07±0,63

Ю-5 34,43±0,64 33,10±0,18

10"6 38,54±0,57 37,47±0,27

PB 16 типа - 10J ТЦД50/мл

io-J 27,58±0,21 28,02±0,14

Ю-4 31,40±0,22 31,32±0,13

10" 35,25±0,83 34,59±0,09

ВПГ 1 - 10 ТЦ Д50/мл

исх 1 35,44±0,04 | 34,23±0,25

ВПГ 2 - 106 ТЦДя/мл

ю-4 29,17±0,07 28,65±0,45

ю-5 32,01±0,35 31,45±0,55

10"" 36,33±0,91 36,14±0,80

ВПГЗ-104ТЦД50/мл

10-J 27,07±0,07 27,50±0,29

ю-4 30,27±0,18 31,17±0,51

Ю-5 33,92±1,48 34,59±0,76

ВПГ 4 - 102 ТЦЦ50/мл

10 33,78±0,23 32,31±0,03

10-j 37,12±0,39 36,70±0,49

Внутренний п ол ожител ь н ы й контроль 33-34

Испытание тест-системы на клинических образцах, полученных от больных с симптомами ОРВИ.

Следующим этапом работы стало испытание мультиплексной ПЦР-тест-системы с детекцией в режиме реального времени на клинических образцах от больных с симптомами ОРВИ. Клинические образцы представляли собой мазки из полости носа, помещенные в пробирки с физиологическим раствором. Всего было проанализировано 226 клинических образцов от больных всех возрастных категорий. Образцы были собраны на территории г. Москвы (детская поликлиника №39) и в различных ЛПУ Московской области (Истринский, Ногинский, Подольский, Серпуховской, Пушкинский районы) в период с октября 2007 года по март 2008 года.

Все образцы были проанализированы методом мультиплексной ПЦР-РВ на наличие НК десяти респираторных вирусов. Параллельно образцы анализировались аналогичной ПЦР-тест-системой для выявления 12 респираторных вирусов - ВГА, ВГВ, ВПГ 1-4, PCB, РВ, метапневмовируса и коронавирусов NL63, 229Е и ОС43 в присутствии ВПК, представленного вирусом артериита лошадей. Эта тест-система используется в Медицинском центре Лейденского университета для рутинной диагностики ОРВИ (далее -голландская тест-система). Существенные отличия между двумя тест-системами заключаются не только в разных панелях исследуемых респираторных вирусов (табл. 4), но и в том, что праймеры и зонды для вирусов, выявляемых обеими тест-системами (ВГВ, ВГА, PCB, ВПГ 1-4, РВ), нацелены на разные участки вирусных геномов. Результаты выявления различных респираторных вирусов при помощи двух тест-систем представлены в таблице 4.

ПЦР-анализ позволил выявить различные респираторные вирусы в 51,3% и 50% случаев российской и голландской системами, соответственно (табл. 4). Частота выявления респираторных вирусов в образцах, полученных из различных ЛПУ, существенно различалась - этот показатель варьировал от 10

до 84%. Низкий процент выявления вирусов в ряде ЛПУ возможно связан с нарушением правил и критериев сбора, хранения и транспортировки клинических образцов.

Результаты выявления вирусов, анализированных обеими системами (ВГВ, ВГА, PCB, ВПГ 1-4, РВ), совпали на 94%. Всего было выявлено 7 несовпадений в результатах между двумя тест-системами. Шесть несовпадений были связаны с неодинаковой чувствительностью тест-систем, предположительно обусловленной высоким генетическим разнообразием, характерным для РНК-содержащих вирусов. Один образец, выявленный российской тест-системой как ЭВ, голландской был определен как риновирус.

Таблица 4

Результаты выявления респираторных вирусов в 226 клинических _ образцах двумя ПЦР-тест-системами._

Вирус Тест-система

Россия Нидерланды

количество % от числа положительных образцов количество % от числа положительных образцов

ВГВ 68 58,62 67 56,3

ВГА 21 18,1 20 16,8

РВ 12 10,3 11 9,24

ВПГ2 6 5,17 6 5,31

HCOV229E - - 6 5,31

PCB 3 2,59 5 4,42

АДВ 4 3,45 - -

ЭВ 2 1,72 - -

ВПГ4 2 1,72 2 1,77

ВПГЗ 1 0,86 1 0,88

ВПГ1 1 0,86 1 0,88

Смешанная 4 3,45 6 5,31

инфекция

Общее 116 51,3 113 50

количество

положительных

образцов

Путем обобщения результатов, полученных при помощи двух ПЦР-тест-систем, была определена этиологическая структура ОРВИ для группы пациентов (рис. 6).

Рис. 6. Этиологическая структура ОРВИ установленная у группы пациентов в ряде лечебно-профилактических учреждений г. Москвы и МО в период с октября 2007 г. по март 2008 г. (% от числа положительных образцов).* Случаи смешанных инфекций (ВГВ + коронавирус 229Е, ВГВ + PCB, АДВ + ВПГ2, ЭВ + ВПГ4 и 2 случая ВГВ + В ГА).

Таким образом, была разработана мультиплексная ПЦР-тест-система, позволяющая одновременно в 3 пробирках выявлять в клинических образцах десять основных возбудителей ОРВИ: ВГА, ВГВ, ВПГ 1-4, АДВ, PCB, РВ, ЭВ. Показано, что разработанная тест-система может успешно применяться для дифференциальной лабораторной диагностики ОРВИ. Мультиплексный формат постановки ПЦР в режиме реального времени значительно сокращает время и стоимость анализа, что делает тест-систему удобным и эффективным инструментом эпидемиологических исследований.

Количественное определение нуклеиновых кислот респираторных

вирусов.

Одно из преимуществ ПЦР-РВ заключается в том, что она позволяет осуществлять не только качественный, но и количественный анализ вирусных нуклеиновых кислот (НК) в образцах. Каждую из десяти пар праймеров и зондов, которые были разработаны для мультиплексной ПЦР, можно применять и в моноспецифической ПЦР для выявления и количественного учета НК отдельных респираторных вирусов в образцах.

В настоящей работе был разработан алгоритм и условия для количественного учета НК аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, вирусов гриппа А и В в биологических образцах. Важным этапом проведения количественного анализа НК является построение калибровочных прямых, отражающих зависимость числа копий ДНК в реакционной смеси от значения порогового цикла. Для построения калибровочной прямой были использованы ПЦР-продукты с известной концентрацией. Отработанные нами методические приемы показали свою высокую эффективность в ряде научных исследований (Акимов B.C., 2007; Мельников, 2008; Оксанич, 2008).

ВЫВОДЫ

1. Подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов TaqMan для выявления десяти групп респираторных вирусов в биологических образцах (вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиальный вируса, риновирусов и энтеровирусов) и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов.

2. На основе подобранных праймеров и зондов разработана мультиплексная ПЦР-тест-система с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для одновременного выявления в клинических образцах десяти основных возбудителей ОРВИ.

3. На основе анализа 226 клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ было показано, что разработанная мультиплексная ПЦР-тест-система не уступает по специфичности аналогичной тест-системе, которая применяется для диагностики ОРВИ в Медицинской центре Лейденского Университета (Нидерланды).

4. При анализе клинических образцов была установлена этиологическая структура ОРВИ у группы пациентов в ряде лечебно-профилактических учреждений г. Москвы и Московской области в период с октября 2007 по май 2008 года. Различные респираторные вирусы были выявлены в 122 образцах, что составляет 54% от всех исследованных образцов.

5. Разработан алгоритм для количественного определения нуклеиновых кислот респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов, вирусов гриппа А и В в биологических образцах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Оксанич A.C., Борисенко A.C., Зверев В.В. Разработка молекулярных методов диагностики риновирусной инфекции у человека. Медицинская иммунология, 2004, Т.6, N3-5, с. 257.

2. Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Зверев В.В. Риновирусные заболевания: патогенез, диагностика и лечение. ЖМЭИ, 2005, N 5, с.115-121.

3. Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Оксанич A.C., Борисенко A.C., Зверев В.В. Молекулярная диагностика риновирусной инфекции. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (выпуск 7), 2005, с. 9498.

4. Никонова A.A., Оксанич A.C. Использование метода ПЦР для выявления респираторных вирусов в биологических образцах. Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», 2005, с. 373.

5. Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Оксанич A.C., Борисенко A.C., Зверев В.В. Разработка ПЦР тест-системы для выявления аденовирусной инфекции у человека. Вопросы вирусологии, 2005, N6, с. 44-47.

6. Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Зверев В.В. Перспектива использования мультиплексной ПЦР в диагностике вирусных респираторных инфекций человека. Журнал АДАИР. Материалы Международного Конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», 2005, № 6 (прил. 1), с. 219.

7. Никонова A.A., Файзулоев Е.Б., Оксанич A.C., Кривцов Г.Г., Борисенко A.C., Соминина A.A., Зверев В.В. Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР.

Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (выпуск 8),

2006, с. 737-41.

8. Чучалин А.Г., Оспельникова Т.П., Осипова Г.Л., Лизогуб Н.В., Гервазиева В.Б., Кривицкая В.З., Григорян С.С.. Мазурина С.А., Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Панкратова В.Н., Гончарова С.А. Роль респираторных инфекций в обострениях бронхиальной астмы. Пульмонология, 2007, №5, с.14,-18.

9. Акимов B.C., Хаитов М.Р., Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Соминина A.A., Зверев В.В. Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA. Вопросы вирусологии, 2007, №2, с. 8-12.

Ю.Никонова A.A., Оксанич A.C., Файзулоев Е.Б., Зверев В.В. Определение нуклеиновых кислот респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени. Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», 2007, с. 253255.

11.Оксанич A.C., Файзулоев Е.Б., Иванова O.E., Никонова A.A., Зверев В.В. Разработка метода мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для одновременной детекции аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А. Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.

2007, С.69.

12.Оксанич A.C., Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Каширин В.И., Лотте В.Д., Иванова O.E., Зверев В.В. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени для быстрого выявления энтеровирусов, аденовирусов и вируса гепатита А в клинических образцах. ЖМЭИ, 2007, N5, с.65-70.

13.Никонова A.A., Файзулоев Е.Б., Оксанич A.C., Лободанов С.А.. Фошина Е.П., Успенская Е.С., Каира А.Н., Зверев В.В. Одновременное выявление десяти групп респираторных вирусов в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Материалы четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями»,

2008, С.81.

14.Никонова A.A., Успенская Е.С., Фошина Е.П., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Этиологическая диагностика ОРВИ методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Материалы III научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 2008, с.92.

15.Никонова A.A., Успенская Е.С., Лободанов С.А., Оксанич A.C., Горбаленя А.Е., Eric C.J. Claas, Фошина Е.П., Каира А.Н., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Применение метода мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций. ЖМЭИ, 2009, N1, с. 67-70.

Заказ №212/12/08 Подписано в печать 26.12.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 чСЧ/^ www.cfr.nt; е-пюИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никонова, Александра Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-биологическая и эпидемиологическая характеристика респираторных вирусов.

1.1.1.РНК-содержащие вирусы.

1.1.1.1. Семейство ОШютухоушёае.

1.1.1.2. Семейство Рагатухоутс1ае.

1.1.1.3. Семейство Ргсогпаушёае.

1.1.1.4. Семейство Согопаутёае.

1.1.2. ДНК-содержащие вирусы.

1.1.2.1. Семейство Аёепоушёае.

1.1.2.2. Семейство НегреБУтёае.

1.1.2.3. Бокавирус человека.

1.2. Методы этиологической диагностики респираторных заболеваний.

1.2.1. Выделение вируса в культуре чувствительных клеток.

1.2.2. Иммунологические методы выявления респираторных вирусов.

1.2.2.1. Реакции с использованием химических меток.

1.2.2.2. Реакции, основанные на феномене агглютинации эритроцитов.

1.2.2.3. Методы серологической диагностики.

1.2.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот.

1.2.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1.2.3.2. Мультиплексная ПЦР.

1.2.3.3. ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

1.2.3.4. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

1.2.3.5. Другие методы амплификации нуклеиновых кислот.

1.2.3.6. Тип образца и методы пробоподготовки.

1.2.3.7. Выявление ингибиторов амплификации и контроль контаминации.

1.2.3.8. Клиническое применение методов амплификации нуклеиновых кислот.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Лабораторные штаммы вирусов.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Клинические образцы.

2.1.4. Реактивы.

2.2. Методы.

2.2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.2.2. Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР.

2.2.3. Выделение вирусных нуклеиновых кислот.

2.2.4. Реакция обратной транскрипции.

2.2.5. Полимеразная цепная реакция (моноспецифический формат).

2.2.6. Полимеразная цепная реакция (мультиплексный формат).

2.2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.2.8. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ТаяМап).

2.2.9. Получение калибратора для количественного учета вирусной РНК в биологических образцах.

2.2.10.Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Подбор праймеров и оптимизация условий выявления ДНК аденовирусов человека в биологических образцах методом ПЦР.

3.2. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий для дифференциального выявления риновирусов и энтеровирусов в биологических образцах методом ПЦР.

3.3. Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

3.4. Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления 10 групп респираторных вирусов в биологических образцах.

3.4.1. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий мультиплексной ПЦР-РВ.

3.4.2. Сравнительный анализ эффективности и чувствительности мультиплексной и моноспецифической ПЦР-РВ.

3.4.3. Испытание тест-системы на клинических образцах, полученных от больных с симптомами ОРВИ.

3.5. Количественное определение нуклеиновых кислот респираторных вирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени"

Актуальность проблемы.

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) по распространенности и контагиозности занимают ведущее место среди инфекционных болезней человека. В России на грипп и гриппоподобные острые респираторные заболевания приходится более 90% инфекционной заболеваемости [20]. Основной вклад в структуру ОРВИ вносят вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, риновирусы и некоторые энтеровирусы [85, 87]. Вирус гриппа опасен осложнениями, которые часто возникают после заражения, и является причиной высокой смертности у пациентов с ослабленным иммунитетом [105, 128]. Первичная респираторно-синцитиальная вирусная инфекция, возникающая обычно у детей первого года жизни, нередко становится причиной смерти новорожденных [4, 213]. Серьезные респираторные заболевания у человека часто вызывают также вирусы парагриппа 1, 2 и 3 типов, аденовирусы, коронавирусы и другие [45, 63, 110]. На сегодняшний день нет сомнений в том, что некоторые респираторные вирусы (респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и аденовирусы) играют важную роль в развитии аллергических заболеваний дыхательных путей, в том числе бронхиальной астмы [51, 112]. Помимо вирусов, многие виды бактерий, хламидий и микоплазм способны поражать дыхательные пути, вызывая сходные с ОРВИ симптомы [69, 120, 243].

С точностью идентифицировать респираторные инфекции можно только при помощи лабораторных методов диагностики. Затруднения при дифференциальной лабораторной диагностике этих инфекций вынуждают вести статистический учет по сумме всех случаев, включая их в комплекс ОРВИ. В ранние сроки болезни для диагностики используют различные методы: выделение вируса заражением культур клеток, иммунофлуоресцентное выявление антигенов вируса в цитоплазме эпителиальных клеток носовой полости, определение нарастания титра антител в парных сыворотках [96, 128]. В настоящее время для выявления и идентификации респираторных вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов [59, 118, 128, 246].

Несмотря на имеющиеся разнообразие методов диагностики вирусных инфекций, остается актуальной проблема быстрой и высокочувствительной диагностики. Выделение вируса в культуре клеток и реакция нейтрализации типоспецифическими сыворотками, считающиеся «золотым стандартом» диагностики, в то же время обладает рядом недостатков, включающими высокую трудоемкость и продолжительность теста. Вирусы размножаются не на всех культурах клеток, поэтому обычно, клинические образцы инокулируют сразу в несколько типов клеток, для того чтобы обеспечить условия для выделения вирусов, с разной тканевой специфичностью, что значительно увеличивает трудоемкость исследования [147, 236]. Кроме того, ряд респираторных вирусов (например, риновирусы, вирус парагриппа 4 типа, метапневмовирус) с трудом выделяются в культуре клеток. Широкое распространение имеют иммунохимические экспресс-методы выявления вирусных агентов в клинических образцах. Основными их преимуществами являются доступность и простота постановки. Однако, в ряде случаев, они бывают недостаточно информативны и неприменимы в отношении таких респираторных вирусов, как риновирусы и аденовирусы из-за их высокого антигенного разнообразия. Приведенные выше данные обусловливают необходимость совершенствования существующих тест-систем для выявления респираторных вирусов.

Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как различные модификации метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе ПЦР с гибридизационной идентификацией продуктов амплификации, мультиплексная ПЦР, I а также ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Достоинствами метода ПЦР являются высокая специфичность, чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, возможность выявления сразу нескольких патогенов в одной пробирке, при условии наличия в реакционной смеси нескольких пар соответствующих праймеров (мультиплексная ПЦР).

Внедрение метода ПЦР-РВ в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в клинической лабораторной диагностике. Применение ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет вирусных нуклеиновых кислот. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Некоторые современные приборы для ПЦР-РВ позволяют в одной пробирке проводить и детектировать в режиме реального времени до 6-ти независимых реакций, с использованием зондов, меченных различными флуоресцентными красителями (мультиплексная ПЦР-РВ). Несмотря на очевидные преимущества этого подхода на российском рынке отсутствуют тест-системы на основе мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики респираторных вирусных инфекций. Таким образом, разработка мультиплексной ПЦР тест-системы для одновременного выявления в клинических образцах основных возбудителей ОРВИ является весьма актуальной задачей.

Внедрение быстрых тестов на основе мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики инфекций дыхательных путей может улучшить качество оказания медицинской помощи и снизить частоту неоправданного назначения антибактериальных препаратов, а также обеспечит эпидемиологические службы удобным и универсальным инструментом для быстрой и высокоспецифичной расшифровки вспышек ОРВИ. :

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования являлась разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы с детекцией в режиме реального времени, позволяющей одновременно выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• в культуре клеток получить образцы лабораторных штаммов вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов, риновирусов, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов и энтеровирусов для использования их на следующих этапах работы в качестве биологических стандартов;

• к консервативным геномным последовательностям десяти групп респираторных вирусов подобрать праймеры и зонды (ТаяМап) и показать их специфичность в моноспецифической ПЦР в реальном времени;

• оптимизировать условия проведения мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР и провести сравнительную оценку эффективности и чувствительности моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ для выявления различных респираторных вирусов;

• проанализировать клинические образцы от больных с симтомами ОРВИ с помощью разрабатываемой ПЦР-тест-системы и зарубежного аналога, который применяется в Медицинском центре Лейденского университета (Нидерланды), и провести сравнительный анализ результатов, полученных двумя тест-системами;

Научная новизна. '

Впервые в России разработана тест-система, позволяющая методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека, в частности, вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы в присутствии внутреннего положительного контроля. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемые в тест-системе, были разработаны в процессе выполнения данной работы, то есть являются оригинальными.

Практическая значимость.

2. Разработанные методические приемы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов могут быть использованы в научных исследованиях, в частности, для контроля уровня вирусной репродукции, наряду с традиционными методами титрования вирусов, при испытании противовирусных препаратов in vitro и in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В ходе выполнения работ, были подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов TaqMan для выявления в биологических образцах вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиальный вируса, риновирусов и энтеровирусов и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Никонова, Александра Александровна

выводы

1. Подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов ТаяМап для выявления десяти групп респираторных вирусов в биологических образцах (вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиальный вируса, риновирусов и энтеровирусов) и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы: академику РАМН, профессору, доктору биологических наук Звереву Виталию Васильевичу и кандидату биологических наук Файзулоеву Евгению Бахтиёровичу за построение логики работы и помощь в интерпретации результатов.

Кроме того, автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области" Роспотребнадзора, г. Мытищи Успенской Елене Станиславовне, а также сотруднику ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова - Фошиной Елене Петровне за помощь в сборе клинических образцов.

Автор выражает особую благодарность сотрудникам Медицинского центра Лейденского университета (Нидерланды) Горбалене Александру Евгеньевичу, Эрику Клаасу, Вилли Спаану за оказанную помощь в выполнении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Метод ПЦР эффективно дополняет спектр традиционных методов, используемых в диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, а также микроорганизмов, характеризующихся высоким антигенным многообразием, что затрудняет их выявление иммунохимическими методами. Важными достоинствами ПЦР является высокая чувствительность и специфичность, то есть она отвечает требованиям, предъявляемым к современным диагностическим тест-системам.

Научно-технический прогресс в области молекулярных технологий привел к появлению приборов для проведения ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ), применение которых в последнее время становится все более широким. Использование приборов для ПЦР-РВ исключает постамплификационные манипуляции с ПЦР-продуктом, позволяя инструментально детектировать накопление ПЦР-продукта в реакционной смеси. При помощи программного обеспечения к приборам для ПЦР-РВ можно проводить количественный учет ДНК в реакционной смеси. Современные приборы для ПЦР-РВ позволяют проводить мультиплексную ПЦР и детектировать в одной пробирке от 2 до б независимых реакций. Широкому внедрению методов мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики инфекционных заболеваний в отечественных лабораториях препятствует ряд факторов. К их числу относится высокая стоимость приборов и реагентов для ПЦР-РВ. Вместе с тем, появление на рынке отечественных производителей относительно недорогих и надежных приборов АНК-32 (НИИ аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург) и ДТ-96 (ДНК-технология, г. Москва) делают использование передовых технологий в области молекулярной диагностики более доступным для российских лабораторий. Другим фактором является практически полное отсутствие на отечественном рынке диагностических тест-систем для диагностики вирусных инфекций, в частности, респираторных вирусных инфекций, на основе мультиплексной ПЦР-РВ.

Основным результатом настоящей работы является разработка мультиплексной тест-системы на основе ПЦР-РВ, предназначеной для выявления в клинических образцах десяти групп респираторных вирусов, а именно - вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, риновирусов и энтеровирусов. Определенный набор вирусов в тест-системе не является случайным - он был составлен на основе литературных и эпидемиологических данных об этиологии ОРВИ и представлен теми группами вирусов, которые вносят основной вклад в структуру ОРВИ.

При исследовании клинических образцов разработанной тест-системой и аналогичным зарубежным аналогом было показано, что разработанная нами ПЦР-тест-система не уступает зарубежному аналогу в специфичности. Результаты выявления вирусов, анализированных обеими системами (ВГВ, ВГА, РСВ, ВПГ 1-4, РВ), совпали на 94%. Всего было выявлено 7 несовпадений в результатах между двумя тест-системами. Расхождения в результатах, полученных двумя тест-системами, представлены ложноотрицательными образцами, что может быть связано с высоким генетическим разнообразием, характерным для РНК-содержащих вирусов. Полученные данные позволяют в дальнейшем скорректировать последовательности праймеров и зондов введением «вырожденных» нуклеотидов, для того чтобы увеличить вероятность выявления максимального количества генетических вариантов вирусов.

В ходе работ особое внимание было уделено отработке условий выявления аденовирусов и риновирусов человека в биологических образцах. Аденовирусы и риновирусы человека представляют собой весьма гетерогенные группы вирусов, насчитывающих более 50 и 100 типов возбудителей, соответственно. Существование большого количества генетических вариантов аденовирусов и риновирусов чрезвычайно затрудняет проведение лабораторной диагностики. Следует отметить, что задача определения РНК риновирусов с помощью ОТ-ПЦР усложняется еще и тем, что 5'НТР является высококонсервативной областью для многих представителей семейства Рюогпаутс1ае. В результате специальных исследований были подобраны оптимальные условия для высокочувствительного выявления аденовирусов человека в клинических образцах и дифференциального выявления рино- и энтеровирусов методом ПЦР-РВ.

Следует отметить что, каждая из десяти пар праймеров и зондов, используемых в мультиплексной ПЦР-РВ, может применяться отдельно, в моноспецифической реакции, как для выявления, так и для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов в биологических образцах. В ходе работ были отработаны методические приемы количественного определения нуклеиновых кислот некоторых вирусов (АДВ, ВГА, РСВ), которые были использованы в ряде научных исследований.

Мультиплексная ПЦР-тест-система с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для одновременного выявления основных респираторных вирусов в клинических образцах может применятся в эпидемиологических службах для быстрой расшифровки вспышек ОРВИ и для мониторинга эпидемиологической обстановки. В перспективе, с развитием методов специфического лечения респираторных вирусных заболеваний, подобные тест-системы найдут применение в клинической практике для постановки диагноза и назначения адекватного лечения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никонова, Александра Александровна, Москва

1. Акимов B.C., Хаитов М.Р., Файзулоев Е.Б. и др. Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA//Bопросы вирусологии.2007.-№2.-С. 8-12.

2. Белов А.Б., Огарков П.И. Зоонозный (птичий) грипп. Прогнозы пандемии и реальность// Журн. Микробиол. 2008. - №1. - С. 90-95.

3. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. - 336 е., ил.

4. Дрейзин P.C. Респираторно-синцитиальные вирусные инфекции. Л.: Медицина, 1968.-256 с.

5. Дрейзин P.C., Жданов В.М. Аденовирусные инфекции. М: Гос. из-во мед. литры, 1962. - 304 с.

6. Иванова В.Т., Матюшина P.O., Слепушкин А.Н. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 2005-2006 гг. в России//Вопросы вирусологии.2008.-№4.-С. 13-18.

7. Иммунология: Практикум/Е. У. Пастер, В.В. Овод и др.- К.: Выща шк., 1989304 е., ил.

8. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинической практике. Методические рекомендации. Бонецкий A.A., Таирова М.М., Кутукеев Т.С., Филипченко А.И. 2000. - Бишкек.

9. Кривицкая В. 3., Соминина А. А., Сорокин Е. В. и др. Разработка иммуноферментных тест-систем для подтипоспецифической детекции антител к вирусам гриппа A (H1N1) и A (H3N2)//Bonpocbi вирусологии. 2002. - №3-С.40-43.

10. П.Киселева О.И., Жилинский И.Н. Вопросы общей вирусологии. СПб.: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2007. - 374 с.

11. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд., перераб. и доп. -М.: Высш. шк., 1990.-352 е., ил.

12. Мельников С.Я., Зверев В.В., Коровкин С.А. и др. Разработка и доклиническое исследование виросомальной расщепленной гриппозной вакцины нового поколения «Грифор®»//Журн. микробиол. 2008. - №2 (принята к печати).

13. Методические рекомендации № 0100/4434-06-34 «Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом».

14. Монаенков А. О., Сологуб В. К., Соминина А. А. и др. Получение и характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлюоресцентных реакциях//Вопросы вирусологии. — 2000. №5. — С. 3033.

15. Перадзе Т.В., Халонен П. Иммунологическая диагностика вирусных инфекции. -М.: Медицина, 1985. 302 е., ил.

16. Слепушкин А. Н. Современные особенности эпидемиологии« и профилактики гриппа//Журн. микробиол. 2001. -№ 1. - С. 95-99.

17. Соминина A.A., Киселев О.И., Грудинин и др.//Грипп и гриппоподобные инфекции (включая особо опасные формы гриппозной инфекции). Фундаментальные и прикладные аспекты изучения: Бюллетень проблемной комиссии. СПб, 2008. - С. 14-22.

18. Файзулоев Е.Б., Никонова A.A., Зверев В'.В. Риновирусные заболевания: патогенез, диагностика и лечение//Журн. микробиол. 2005. - № 5. - С. 115-121.

19. Чучалин А.Г., Оспельникова Т.П., Осипова Г.Л. и др. Роль респираторных инфекций в обострениях бронхиальной астмы//Пульмонология. 2007. - №5. -С.14.-18.

20. Adcock P. М., Stout G. G., Hauck М. A. et al. Effect of rapid viral diagnosis on the management of children hospitalized with lower respiratory tract infection// Pediatr. Infect. Dis. J. 1997. -№16. - P.842-846.

21. Allander Т., Andreasson K., Gupta S. et al. Identification of a third polyomavirus// J Virol.-2007.-№81.-P. 4130-4136.

22. Allander Т., Jartti Т., Gupta S. et al. Human bocavirus and acute wheezing in children//Clin Infect Dis. 2007. - №44. - P.904-910.

23. Allander Т., Tammi M.T., Eriksson M. et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005 -№102. P.12891-12896.

24. Allard A., Albinsson В., Wadell G. Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis//J Clin Microbiol. 2001. -№39. -P.498-505.

25. AImaza'n F., Ga'lan C., Enjuanes L. The nucleoprotein is required for efficient coronavirus genome replication// J. Virol. 2004. - №78. - 12683-12688.

26. Ambinder R.F., Burns W., Forman M. et al. Hemorrhagic cystitis associated with adenovirus infection in bone marrow transplantation//Arch. Intern. Med. 1986. -V. 146.-P. 1400-1401.

27. Arden K.E., McErlean P., Nissen M.D. Frequent detection of human rhinoviruses, paramyxoviruses, coronaviruses, and bocavirus during acute respiratory tract infections//J Med Virol. 2006. - № 78. - P.1232-1240.

28. Arnold J.C., Singh K.K., Spector S.A. Human bocavirus: prevalence and clinical spectrum at a children's hospital//Clin Infect Dis. 2006. - №43. - P.283-288.

29. Atsuko H., AsanumaH, Rinki M. et al. Use of an inactivated varicella vaccine in recipients of hematopoietic-cell transplants//New Engl. J: Med. 2002 - №347. - P. 26-34.

30. Avellon A., Perez P., Aguilar J.C. et al. Rapid and sensitive diagnosis of human adenovirus infections by a generic polymerase chain reaction//.! Virol Methods. -2001.-№92.-P. 113-20.

31. Barenfanger J., Drake C., Mueller. T. R-Mix cells are faster, at least as sensitive and marginally more costly than conventional cell lines for the detection of respiratory viruses//J Clin Virol: 2001. - №22. - P. 101-110.

32. Bastien N., Brandt K., Dust K. et al. Human Bocavirus infection, Canada //Emerg Infect Dis. 2006. - №12. - P.848-850.

33. Bellau-PujolS., Vabret A-., Legrand L. et al. Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12' respiratory RNA viruses//J Virol Methods. 2005. -№126.-P.53-63.

34. Billaud G., Peny S., Legay V. et al. Detection* of rhinovirus and enterovirus in upper respiratory tract samples using a multiplex nested PCR//J Virol Methods. 2003. -№108. - P.223-228.

35. Boivin G., Cote S., Dery P. et al. Multiplex Real-Time PCR Assay for Detection'of Influenza and Human Respiratory Syncytial Viruses// J. Clin. Microbiol: 2004. -V. 42. - №. l.-P. 45-51.

36. Boivin G., De Serres G., Cote S. et al. Human metapneumovirus infections in hospitalized children//Emerg. Infect. Dis. 2003. - № 9. - P.634-640:

37. Boivin G., De Serres G., ITamelin M.E. et al. An outbreak of severe respiratory tract infection1 due to human metapneumonvirus in a long-term care facility//Clin Infect Dis. 2007. - №44. - P: 1152-115 8.

38. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids// J Clin Microbiol. 1990. - №28. - P.495-503.

39. Breese H. C. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus//N. Engl J Med. -2001.-V. 344.-№. 25.-P. 1917-1928.

40. Brian D. A., Baric R. S. Coronavirus genome structure and replication//Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2005. - №287. - P. 1-30.

41. Brian D. A., Hogue B. G., Kienzle T. E. The Coronavirus hemagglutinin esterase glycoprotein// The Coronaviridae. Plenum Press/ Siddell S. G. New York, 1995 - P. 165-179.

42. Brittain-Long R., Nord S., Olofsson S. et al. Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections// Journal of Clinical Virology. 2008. - №41. - P.53-56.

43. Brown E. H. Enterovirus Associated with Acute Respiratory Infections//British' Medical Journal. 1972. - №2. - P. 169-171.

44. Cane P.A. Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus//Rev. Med. Virol. -2001. -№11. P. 103-116.

45. Carlsen K.H., Sterk P:J. Infection: friend or foe to the development of asthma?//Eur., Respir. J. 2001. - № 18. - P.744-747.

46. Challberg M.D., Desiderio S.V., Kelly T.J. Adenovirus DNA replication in vitro: Characterization of a protein covalently linked to nascent DNA strands//Proc. Natl.' Acad.Sci. USA.-1980.-№77.-P. 5105-5109.

47. Chano F., Rousseau C., Laferriere C. et al. Epidemiological survey of human metapneumovirus infection in a large pediatric tertiary care center//J." Clin: Microbiol. 2005. - №43. - P.5520-5525.

48. Chim S. S., Lo D. Molecular Epidemiology of the Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome: A Review of Data from The Chinese University of Hong Kong// Clin. Biochem Rev. 2004. - V. 25. - №2. - P. 143-147.

49. Choi E.H., Lee HJ., Kim S.J. et al. The association of newly identified respiratory viruses with lower respiratory tract infections in Korean children, 2000-2005//Clin Infect Dis. 2006. - №43. - P.585-592.

50. Chonmaitree T., Mann L. Respiratory infections//Human Enterovirus Infections/ Rotbart H.A. Washington, 1995. - Ch.5. - P. 255-270.

51. Chui L., Drebot M., Andonov A. et al. Comparison of 9 different PCR primers for the rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus using 2 RNA extraction methods//Diagn Microbiol Infect Dis. 2005. - №53. - P.47-55.

52. Coiras M.T., Aguilar J.C., Garcia M.L. et al. Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-PCR assays//J Med Virol. 2004. - №72. - P.484-495.

53. Corne J., Chanarin N. Respiratory viruses and asthma. Importance of infection underestimated//Br. Med. J. 1994. - V.308. - P. 57.

54. Covalciuc K.A., Webb K.H., Carlson C.A. Comparison of four clinical specimen types for detection of influenza A and B viruses by optical immunoassay (FLU OIA test) and cell culture methods //J Clin Microbiol. 1999. -№37. - P. 3971-3974.

55. Craig P. B. Systematic review of the biology and medical management of respiratory syncytial virus infection/ZRespiratory care. 2003. - V.48. - № 3. - P.209-233.

56. Cruz J.R., Caceres P., Cano F. et al. Adenovirus types 40 and 41 and rotaviruses associated with diarrhea in children from Guatemala/A!. Clin. Microbiol. 1990. -V. 28.-P. 1780-1784.

57. Dagher H., Donninger H., Hutchinson P. et al. Rhinovirus detection: comparison of real-time and conventional PCR// J Virol Methods. 2004. - №117. - P.l 13-121.

58. Daley P., Castriciano S., Chernesky M. Comparison of flocked and rayon swabs for collection of respiratory epithelial cells from uninfected volunteers and symptomatic patients//J Clin Microbiol. 2006. - №44. - P. 2265-2267.

59. Dare R., Sanghavi S., Bullotta A. et al. Diagnosis of human metapneumovirus infection in immunosuppressed lung transplant recipients and children evaluated for pertussis// J Clin Microbiol. 2007. - №45. - P.548-552.

60. Deiman B., van Aarle Pierre, Sillekens P. Characteristics and Applications of Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)//Molecular Biotechnology. 2002. -V. 20. -P.163-179.

61. Drummond P., Clark J., Wheeler J. Community acquired pneumonia—a prospective UK study//Arch Dis Child. 2000. - №83. - P.408-412.

62. Effler P. V., Ieong M. C., Tom T. et al. Enhancing public health surveillance for influenza virus by incorporating newly available rapid diagnostic tests//Emerg. Infect. Dis. 2002. - №8. - P.23-28.

63. Enjuanes L., Cavanagh D., Holmes K. et al. Coronaviridae// Virus taxonomy. Classification and nomenclature of viruses/ van Regenmortel, Fauquet C. M., Bishop D. H. et al. San Diego, 2000.- P. 835-849.

64. Esper F., Martinello R.A., Boucher D. et al. A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged <5 years//J Infect Dis. 2004. - №189. - P.1388-1396.

65. Esposito S., Bosis S., Niesters H.G. et al. Impact of human coronavirus infections in otherwise healthy children who attended an emergency department //J Med Virol. -2006. -№78. -P.1609-1615.

66. Everitt E., Sundquist B., Pettersson U. et al. Structural protein of adenoviruses. Isolation and topography of low molecular weight antigen from the virion of adenovirus type 2//Virology. 1973. -№52. - P. 130-147.

67. Falsey A. R., Criddle M. C., Walsh E. E. Detection of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus by reverse transcription polymerase chain reaction in adults with and without respiratory illness//! Clin. Virol. 2006. - №35. - P.46-50.

68. Falsey A. R., Formica M. A., Walsh E. E. Diagnosis of respiratory syncytial virus infection: comparison of reverse transcription-PCR to viral culture and serology in adults with respiratory illness//J. Clin. Microbiol. 2002. - № 40. - P. 817-820.

69. Falsey A.R., Walsh E.E. Viral pneumonia in older adults//Clin Infect Dis. 2006. -№42.-P.518-524.

70. Fenner F.J., White D.O. Laboratory diagnosis of viral disease// Medical Virology 4th edition. San Diego, 1976.-P. 191-218.

71. Fong C.K., Lee M.K., Griffith B.P. Evaluation of R-Mix FreshCells in shell vials for detection of respiratory viruses//J Clin Microbiol. 2000. - №38. - P. 4660-4662.

72. Forman M.S., Valsamakis A. Specimen collection, transport and processing: Virology// Manual of Clinical Microbiology. 9th edition/Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H. et al. Washington, 2003. - P. 1284-1296.

73. Foulongne V., Rodiere M., Segondy M. Human Bocavirus in children//Emerg Infect Dis. 2006. - №12. - P.862-863.

74. Fredman J.N., Engler J.A. Adenovirus precursor to terminal protein interacts with nuclear matrix in vivo and in vitro//J Virol. 1993. - №67. - P. 3384-3395.

75. Freymuth F., Vabret A., Legrand L. et al. Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis//Pediatr. Infect. Dis. J. -2003. №22. - P.92-94.

76. Freymuth F., Quibriac M., Petitjean J. et al. Viruses responsible for respiratory infections in pediatrics. Evaluation of 3,480 nasal aspirates performed in children over a 6-year period//Ann Pediatr (Paris). 1987. - №34. - P.493-501.

77. Friefeld B. R., Lichy J., Field J. et al. The in vitro replication of adenovirus DNA in the molecular biology of adenoviruses//Current Topics in Microbiology and Immunology/ Doerfler W. Berlin, 1984. -pp 221-255.

78. Fronhoffs S., Totzke G., Stier S. et al. A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction// Mol Cell Probes. 2002. - №16. - P.99-110.

79. Fry A.M., Lu X., Chittaganpitch M. Human bocavirus: a novel parvovirus epidemiological^ associated with pneumonia requiring hospitalization in Thailand// J Infect Dis. 2007. - №195. - P. 1038-1045.

80. Garbino J., Gerbase M.W., Wunderli W. et al. Lower respiratory viral illnesses: improved diagnosis by molecular methods and clinical impact//Am J Respir Crit Care Med. 2004. - №170. - P. 1197-1203.

81. George S. K, Patel N.M., Hartwig R.A. et al. Rapid and sensitive detection of respiratory virus infections for directed antiviral treatment using R-Mix cultures//J Clin Virol. -2002. -№24. P. 107-115.

82. Gern J.E., Busse W.W. Association of Rhinovirus Infections with Asthma// Clinical Microbiology Review. 1999. - №1. - P.9-18.

83. Gillim-Ross L., Subbarao K. Emerging Respiratory Viruses: Challenges and Vaccine Strategies// Clinical Microbiology Review. 2006. - №10. - P.614-636.

84. Gillim-Ross L., Taylor J., Scholl D.R. Discovery of novel human and animal cells infected by the severe acute respiratory syndrome Coronavirus by replication-specific multiplex reverse transcription-PCR//J Clin Microbiol. 2004. - №42. -P.3196-3206.

85. Ginocchio C. C. Detection of respiratory viruses using non-molecular based methods//Journal of Clinical Virology. 2007. - V.40. - № 1. - P. 11-14.

86. Gooskens J., Templeton K.E., Claas E.C. et al. Quantitative detection of herpes simplex virus DNA in the lower respiratory tract//J Med Virol. 2007. - V.79. - №5. -P.597-604.

87. Gruteke P., Glas A.S., Dierdorp M. et al. Practical implementation of a multiplex PCR for acute respiratory tract infections in children//.! Clin Microbiol. 2004. - №42. -P.5596-5603.

88. Gu Z., Beizer S.W., Gibson C.S. et al. Multiplexed, real-time PCR for quantitative detection of human adenovirus//!. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. - №10. - P. 4636-4641.

89. Guittet V., Brouard J., Vabret A. et al. Rhinovirus and acute respiratory infections in hospitalized children. Retrospective study 1998-2000//Arch Pediatr. 2003. - №10. -P.417-423.

90. Gunson R.N., Collins T.C., Carman W.F. Real-time RT-PCR detection of 12 respiratory viral infections in four triplex reactions// J Clin Virol. 2005. - №33. -P.341-344.

91. Gwaltney J.M., Jourdan W.S. Rhinoviruses and Respiratory Disease//Bacteriological Reviews. 1964. - V.28. - №4. - P.409-422.

92. Hacking D., Hull J. Respiratory syncytial virus viral biology and the host response// Journal of Infection. 2002. -№ 45. - P. 18-24.

93. Hampson A. W., Mackenzie J. S. The influenza viruses//MJA. 2006. - V.185. -№10. -P.39-43.

94. Harcourt B. H., Jukneliene D., Kanjanahaluethai L. et al. Identification of severe acute respiratory syndrome coronavirus replicase products and characterization of papain-like protease activity//J. Virol. 2004. -№78 - P.13600-13612.

95. Heikkinen T., Marttila J., Salmi A.A. Nasal swab versus nasopharyngeal aspirate for isolation of respiratory viruses//J Clin Microbiol. 2002. - №40. - P. 4337-4339.

96. Hemming-V.G. Respiratory syncytial virus: a brief history//Contemporary diagnosis and management of respiratory syncytial virus/ Weisman L.E., Groothuis J.R. -Newtown PA., 2000. Ch. 1. - P. 7-23.

97. Hemming V.G., Prince G.A., Groothuis J.R. et al. Hyperimmune Globulins in Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infections//Clinical Microbiology Review. 1995. - №1. - P. 22-33.

98. Henrickson K. J. Parainfluenza Viruses//Clinical Microbiology Review. 2003. -№4.-P. 242-264.

99. Hierholzer J. C. Adenoviruses in the Immunocompromised Host//Clinical Microbiology Review. 1992. - V.5. - №3. - P.262-274.

100. Holt P.G., Sly P. D. Interactions between RSV Infection, Asthma, and Atopy: Unraveling the Complexities//!. Exp. Med. 2002. - V.196. - №10. - P.1271-1275.

101. Hong T.C., Mai Q.L., Cuong D.V. et al. Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus//J Clin Microbiol. 2004. - №42. - P. 1956-1961.

102. Hörne R. W., Bonner S., Waterson A.P. et al. The icosahedral form of an adenovirus// J. Mol. Biol.-1959.-№ 1.-P.84-86.

103. Horwitz M.S., Maizel J.V., Scharff M.D. Molecular weight of adenovirus type 2 hexon polypeptide//! Virol. 1970. -№ 6. - P.569-571.

104. Hourfar M.K., Roth W.K., Seifried E. et al. Comparison of two real-time quantitative assays for detection of severe acute respiratory syndrome Coronavirus. J Clin Microbiol. 2004. - №42. - P.2094-2100.

105. Huckriede A., Bungener L., Stegmann T. et al. The virosome concept for influenza vaccines//Vaccine. 2005. - №23. - P.26-38.

106. Ieven M. Currently used nucleic acid amplification tests for the detection of viruses and atypicals in acute respiratory infections// Journal of Clinical Virology. 2007. -№40. — P.259-276.

107. Ieven M., Loens K. Nucleic acid sequence-based amplifictaion (NASBA) and transcription-mediated amplification (TMA)//Encyclopedia of diagnostic genomics and proteomics/ Fuchs J., Podda M. Marcel, 2006. - P. 933-937.

108. Ieven M., Ursi D., Van Bever H. et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae by two polymerase chain reactions and role of M. pneumoniae in acute respiratory tract infections in pediatric patients//J Infect Dis. 1996. - №173. - P.1445-14452.

109. Jacques J., Bouscambert-Duchamp M., Moret H. et al. Association of respiratory picornaviruses with acute bronchiolitis in French infants//J Clin Virol. 2006. - №35. -P.463-466.

110. Jartti T., Lehtinen P., Vuorinen T. et al. Respiratory Picornaviruses and Respiratory Syncytial Virus as Causative Agents of Acute Expiratory Wheezing in Children// Emerging Infectious Diseases. 2004. - V.10. - №6. - P. 1095-1101.

111. Johnston S. L., Pattemore P. K., Sanderson G. et al. Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children//Br. Med. J. 1995. -№310.-P. 1225-1229.

112. Kahn J. S. Epidemiology of Human Metapneumovirus//Clinical Microbiology Review. 2006. - №7. - P.546-557.

113. Karsai A. Müller S., Platz S. et al. Evaluation of a Homemade SYBR® Green I Reaction Mixture for Real-Time PCR Quantification of Gene Expression// BioTechniques. 2002. - №32. - P.790-796.

114. Kehl S. C., Henrickson K. J., Hua W. Evaluation of the Hexaplex assay for detection of respiratory viruses in children// J. Clin. Microbiol. 2001. - № 39. -P.1696-1701.

115. Kesebir D., Vazquez M., Weibel C. et al. Human bocavirus infection in young children in the United States: molecular epidemiological profile and clinical characteristics of a newly emerging respiratory virus//J Infect Dis. 2006. - №194. -P.1276-1282.

116. Kesson A. M. Respiratory virus infections//Paedriatric respiratory reviews. 2007. -№8. - P.240-248.

117. Kidd A.H., Chroboczek J., Cusack S. et al. Adenovirus type 40 virions contain two distinct fibers//Virology. 1993. -№192. -P.73-84.

118. Kinchington P.R., Romanowski E.G., Gordon J. Prospects for adenovirus antivirals// Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2005. - №55. - P. 424-429.

119. Koetz A., Nilsson P., Linden M. et al. Detection of human coronavirus NL63, human metapneumovirus and respiratory syncytial virus in children with respiratory tract infections in south-west Sweden//Clin Microbiol Infect. 2006. - №12. - P.1089-1096.

120. Korppi M., Piippo-Savolainen E., Korhonen K. et al. Respiratory Morbidity 20 Years After RSV Infection in Infancy/ZPediatric Pulmonology. 2004. - №38. - P. 155-160.

121. Kupfer B., Vehreschild J., Comely O. et al. Severe pneumonia and human bocavirus in adult//Emerg Infect Dis. -2006. -№12. P.1614-1616.

122. Kusel M.M., de Klerk N.H., Holt PGet al. Role of respiratory viruses in acute upper and lower respiratory tract illness in the first year of life: a birth cohort study// Pediatr Infect Dis. 2006. - №25. - P.680-686.

123. Kuypers J., Wright N., Ferrenberg J. et al. Comparison of real-time PCR assays with fluorescent-antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children//J Clin Microbiol. 2006. - №44. - P.2382-2388.

124. Lai M.M., Holmes K.V. Coronaviridae: The viruses and their replication// Fundamental virology /Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 21. - P. 641-688.

125. Lamb R.A., Kolakofsky D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication// Fundamental virology /Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 23. -P.689-724.

126. Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication// Fundamental virology /Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 24. -P.725-769.

127. Landry M.L., Cohen S., Ferguson D. Impact of sample type on rapid detection of influenza virus A by cytospin-enhanced immunofluorescence and membrane enzyme-linked immunosorbent assay//J Clin Microbiol. 2000. - №38. - P.429-430.

128. Landry M.L., Ferguson D. SimulFluor respiratory screen for rapid detection of multiple respiratory viruses in clinical specimens by immunofluorescence staining//J Clin Microbiol. 2000. - №38. - P.708-711.

129. Ledford R. M., Patel N. R., Demenczuk T. M. et al. VP1 Sequencing of All Human Rhinovirus Serotypes: Insights into Genus Phylogeny and Susceptibility to Antiviral Capsid-Binding Compounds//Journal of Virology. 2004. - №4. - P. 3663-3674.

130. Lee B.E., Robinson J.L., Khurana V. et al. Enhanced identification of viral and atypical bacterial pathogens in lower respiratory tract samples with nucleic acid amplification tests// J Med Virol. 2006. - №78. - P.702-710.

131. Lee W.M., Grindle K., Pappas T. et al. High-throughput, sensitive, and accurate multiplex PCR-microsphere flow cytometry system of large-scale compehensive detection of respiratory viruses //J Clin Microbiol. 2007. - №45. - P.2626-2634.

132. Lee W.M., Kiesner C., Pappas T. et al. Diverse Group of Previously Unrecognized Human Rhinoviruses Are Common Causes of Respiratory Illnesses in Infants//PLoS ONE. -2007. -V.2. -№10. P. 1-11.

133. Leland D.S., Ginocchio C.C. Role of cell culture for virus detection in the age of technology//Clin Microbiol Rev. 2007. - №20. - P.49-78.

134. Li H., McCormac M.A., Estes R.W. et al. Simultaneous detection and high throughput identification of a panel of RNA viruses causing respiratory tract infections// J Clin Microbiol. 2007. - №45. - P. 2105-2109.

135. Lin F., Guan W., Cheng F. et al. Using Human Bocavirus VP2 Virus-Like Particles for Detection of Antibodies against HboV//J Virol Methods. 2008. -V.149. - №1. -P.110-117.

136. Lin F., Zeng A., Yang N. et al. Quantification of human bocavirus in lower respiratory tract infections in China// Infect Agent Cancer. 2007. - №2. - P. 1-3.

137. Ljungman P. Respiratory virus infections in bone marrow transplant recipients: the European perspective//Am J Med. 1997. - №102. - P.44-47.

138. Lodes M. J., Suciu D., Wilmoth J. L. at al. Identification of Upper Respiratory Tract Pathogens Using Electrochemical Detection on an Oligonucleotide Microarray //PLoS ONE. 2007. -№ 9. - P. 1-11.

139. Longtin J., Bastien M., Gilca R., Leblanc E. Human Bocavirus Infections in Hospitalized Children and Adults//Emerging Infectious Diseases. 2008. - V. 14. - № 2. -P.217-221.

140. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology//Nucleic Acids Res. 2002. - №30. - P.1292-1305.

141. Mackie P. L. The classification of viruses infecting the respiratory tract//Paediatric reviews. 2003. - № 4. - P.84-90.

142. Mahony J., Chong S., Merante F. et al. Development of a respiratory virus panel (RVP) test for the detection of twenty human respiratory viruses by using multiplex PCR and a fluid microbead-based assay//J Clin Microbiol. 2007. - №45. - P.2965-2670.

143. Manoha C., Espinosa S., Aho S.L. Epidemiological and clinical features of hMPV, RSV and RVs infections in young children// J Clin Virol. 2007. - №38. - P.221-226.

144. Mantripragada K.K., Buckley P.G., de Stahl T.D. et al. Genomic microarrays in the spotlight//Trends Genet. 2004. - V.20. - №2. - P.87-94.

145. McAdam A.J., Hasenbein M.E., Feldman H.A. et al. Human metapneumovirus in children tested at a tertiary-care hospital//J Infect Dis. 2004. - №190. - P.20-26.

146. McErlean P., Shackelton L. A., Andrews E. et al. Distinguishing Molecular Features and Characteristics of a Putative New Rhinovirus Human Rhinovirus C (HRV C)// PLoS ONE. 2008. - V.3. - №4. - P. 1-12.

147. Mcintosh K. Coronaviruses: a comparative review//Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1974. -№63. -P.85-129.

148. Mcintosh K. Human bocavirus: developing evidence for pathogenicity//! Infect Dis. 2006. - №194. - P.l 197-1199.

149. Miller E.K., Lu X., Erdman D.D. et al. Rhinovirus-associated hospitalizations in young children// J Infect Dis. 2007. - №195. - P.773-781.

150. Mirtza M.A., Weber J. Structure of adenovirus chromatin//Biochem. Biophys. Acta. -1982.-№696.-P.76-86.

151. Monto A.S., Fendrick A. M., Sanies M. W. Respiratory Illness Caused by Picornavirus Infection: A Review of Clinical Outcomes//Clinical Terapeljtic. 2001. -V.23. -№10. -P.1615-1627.

152. Monto A.S. Occurrence of respiratory virus: time, place and person//Pediatr Infect Dis J. 2004. - №23. - P.58-64.

153. Myint S., Johnston S., Sanderson G. et al. Evaluation of nested polymerase chain methods for the detection of human coronaviruses 229E and OC43//Mol Cell Probes. -1994. №8. -P.357-364.

154. Nagamine K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers//Mol Cell Probes. 2002. -№16. - 223-229.

155. Nicholson K.G, Kent J, Hammersley V. et al. Acute viral infections of upper respiratory tract in elderly people living in the community: comparative, prospective, population based study of disease burden//BMJ. 1997. -№315. -1060-1064.

156. Nicholson K.G., Kent J., Ireland D.C. Respiratory viruses and exacerbations of asthma in adults//Br. Med. J. 1993. -№307. - P. 982-986.

157. Nix W. Allan M. Steven O. Sensitive, Seminested PCR Amplification of VP1 Sequences for Direct Identification of All Enterovirus Serotypes from Original Clinical • Specimens//! Clin. Microbiol. 2006. - V.44. - №8. - P.2698-2704.

158. Oberste M. S., Maher K., Schnurr D. et al. Enterovirus 68 is associated with respiratory illness and shares biological features with both the enteroviruses and the rhinoviruses//Journal of General Virology. 2004. - №85. - P.2577-2584.

159. Olivo P.D. Transgenic cell lines for detection of animal viruses//Clin Microbiol Rev. 1996. -№ 9. - P.321-334.

160. Ordas J., Boga J.A., Alvarez-Arguelles M. et al. Role of metapneumovirus in viral respiratory infections in young children//J Clin Microbiol. 2006. - №44. - P.2739-2742.

161. Pasternak A. O., Spaan W. J., Snijder E. J. Nidovirus transcription: how to make sense.?// Journal of General Virology. 2006. - №87. - P. 1403-1421.

162. Patel N., Kauffmann L., Baniewicz G. et al. Confirmation of low-titer, herpes simplex virus-positive specimen results by the enzyme-linked virus-inducible system (ELVIS) using PCR and repeat testing//J Clin- Microbiol. 1999. - №37. - P. 39863989.

163. Percivalle E., Sarasini A., Torsellini M. et al. A comparison of methods for detecting adenovirus type 8 keratoconjunctivitis during a nosocomial outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit//J. Clin. Virol. 2003. - V. 28. - № 3. - P. 257-264.

164. Pillay D. Developments in the treatment of acute viral infections: what's the problem? //Curr Opin Infect Dis. 2002. - №15. - P. 591-592.

165. Poon L., Wong O.K., Chan K.H. et al. Rapid diagnosis of a coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS)//Clin Chem. 2003. - №49. - P.953-955.

166. Prentice E. J., McAuliffe X., Lu K. et al. Identification and characterization of severe acute respiratory syndrome coronavirus replicase proteins//J. Virol. 2004. - №78. -P.9977-9986.

167. Pyre K., Berkhout B., van der Hoek Lia. The Novel Human Coronaviruses NL63 and HKUl//Journal of Virology. 2007. - №4. - P. 3051-3057.

168. Qiu J., Cheng F., Johnson F.B. et al. The transcription profile of the Bocavirus bovine parvovirus is unlike previously characterized parvoviruses//J Virol 2007. -№81. P. 12080-12085.

169. Racaniello V.R. Picornaviridae: The viruses and their replication//Fundamental virology /Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 18. - P.529-566.

170. Raty R., Kleemola M., Melen K. et al. Efficacy of PCR and other diagnostic methods for the detection of respiratory adenoviral infections//J Med Virol. 1999. - №59. -P.66-72.

171. Rekosh D.M., Russell W.C., Bellet A.J. et al. Identification of a protein linked to the ends of adenovirus DNA//Cell. 1977. - №11. - P.283-295.

172. Richardson J., Akkina R. NS2 protein of influenza virus is found in purified virus and phosphorylated in infected cells//Arch. Virol. 1991. - №116. - P.69-80.

173. Rowe W.P., Huebner R.J., Gilmore L.K. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture//Proc. Soc Exp Biol Med. 1953. - V.84. - №3. - P.570-573.

174. Robin B., Sandra N. Sigvard O., et al. Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections//Journal of Clinical Virology. 2008. - №41. - P.53-56.

175. Rocholl C., Gerber K., Daly J. et al. Adenoviral infections in children: the impact of rapid diagnosis/ZPediatrics. 2004. - V. 113. - № 1. - P. 51-56.

176. Roizman B., Knipe D. Herpes Simplex Viruses and Their Replication//Fundamental virology /Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 33. - P. 1123-1185.

177. Rota P. A., Oberste M. S., Monroe W. A. et al. Characterization of a novel Coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome//Science. 2003. -№300. - P.1394-1399.

178. Rux J. J., Burnett R. M. Adenovirus Structure//ITuman Gene Therapy. 2004. -№15.-P.l 167-1176.

179. Sandrock C., Kelly T. Clinical review: Update of avian influenza A infections in humans//Critical Care. 2007. - №11. - P. 1-9.

180. Sawicki S.G., Sawicki D. L., Siddell S.G. A Contemporary View of Coronavirus Transcription//Journal of Virology. 2007. - №1. - P.20-29.

181. Schaack J., Ho W.Y., Freimuth P. et al. Adenovirus terminal protein mediates both nuclear matrix associations and efficient transcription of adenovirus DNA//Genes Dev. -1990.-№4.-P.l 197-1208.

182. Schelle B., Karl N., Ludewig B. et al. Selective replication of Coronavirus genomes that express nucleocapsid protein//J. Virol. 2005. - №79. - P.6620-6630.

183. Scheltinga S.A., Templeton K.E., Beersma M.F. et al. Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR//J Clin Virol. 2005. - №33. - P. 306-311

184. Schildgen O., Müller A., Simon A. Human Bocavirus and Gastroenteritis// Emerging Infectious Diseases. 2007. -V. 13. -№10. - P. 1620-1621.

185. Schmidt A.C., Johnson T. R., Openshaw P. et al. Respiratory syncytial virus and other pneumoviruses: a review of the international symposium RSV 2003//Virus Research. - 2004. -№106. - P. 1-13.

186. Semple M.G., Cowell A., Dove W. et al. Dual infection of infants by human metapneumovirus and human respiratory syncytial virus is strongly associated with severe bronchiolitis//J Infect Dis. 2005. -№191. -P.382-386.

187. Sencer S.F., Haake R.J., Weisdorf DJ. Hemorrhagic cystitis after bone marrow transplantation. Risk factors and complications//Transplantation. 1993. - V. 56. -P. 875-879.

188. Shenk T.S. Adenoviridae: The viruses and their replication. //Fundamental virology/Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 31. - P. 1053-1088.

189. Shibo Jiang, Yuxian He, Shuwen Liu. SARS Vaccine Development//Emerging Infectious Diseases. 2005. - V. 11. - №7. - P. 1016-1020.

190. Shields A.F., Hackman R.C., Fife K.H. et al. Adenovirus infections in patients undergoing bone-marrow transplantation//N. Engl. J. Med. 1985. - V. 312. - P. 529-533.

191. Siddell S., Ziebuhr J., Snijder E. J. Coronaviruses, toroviruses, and arteriviruses// Topley & Wilson's microbiology and microbial infections: virology/ Mahy B. W. ter Meulen V. London, 2005. - P. 823-856.

192. Sims L., Domenech J., Benigno C. Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia//Vet Ree. 2005. - №157. - P.159-164.

193. Singleton R. J., Redding G. J., Lewis T. C. et al. Childhood Among Alaska Native Children Sequelae of Severe Respiratory Syncytial Virus Infection im Infancy and Early// Pediatrics. 2003. - №112. - P.285-290.

194. Smith G., Naipospos T., Nguyen T. et al. Evolution and adaptation- of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam//Virology. -2006. -№ 350. -P.258-268.

195. Snijder E. J., van der Meer Y., Zevenhoven-Dobbe J. et al. Ultrastructure and origin of membrane vesicles associated with the severe acute respiratory syndrome Coronavirus replication complex//J. Virol. 2006. - №80. - P.5927-5940.

196. South, M. A., Dolen J., Beach D. K. et al. Fatal adenovirus hepatic necrosis in severe combined immune deficiency/ZPediatr. Infect. Dis. 1982. - Vol. 1. - P. 416-419.

197. Stockman L. J., Bellamy R., Garner P. SARS: Systematic Review of Treatment Effects//PLoS Medicine. -2006. V.3. - №9. - P. 1525-1531.

198. Storch G. A. Rapid diagnostic tests for influenza// Curr. Opin. Pediatr. 2003. -№15. -P.77-84.

199. Swierkosz E. M., Flanders R., Melvin L. Evaluation of the Abbott TESTPACK RSV enzyme immunoassay for detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal swab specimens// J. Clin. Microbiol. 1989. - №27. - P.l 151-1154.

200. Teichtahl H., Buckmaster N., Pertnikovs E.The Incidence of Respiratory Tract Infection in Adults Requiring Hospitalization for Asthma//CHEST. 1997. - №112. -P.591-596.

201. Templeton K. E. Why diagnose respiratory viral infection?//Journal of Clinical Virology. 2007. - V.40. - №1. - P.2-4.

202. Templeton K.E., Forde C.B., van Loon A.M. A multi-centre pilot proficiency programme to assess the quality of molecular detection of respiratory viruses// Journal of Clinical Virology. 2006. - №35. - P.51-58.

203. Templeton K.E., Scheltinga S.A., van den Eeden W.C. Improved diagnosis of the etiology of community acquired pneumonia with real-time polymerase chain reaction//Clin Infect Dis. 2005. - №41. - P.345-351.

204. Tomita N., Mori Y., Kanda H. et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products//Nature Protocols. 2008. - V.3. - №.5. - P.877-882.

205. Tsolia M.N., Psarras S., Bossios A. et al. Etiology of community-acquired pneumonia in hospitalized school-age children: evidence for high prevalence of viral infections// Clin Infect Dis. 2004. - №39. - P.681-686.

206. Tyrrel D.A., Almedia J.D., Berry D.M. et al. Coronavirus// Nature. 1968. - №220 -650-656.

207. Vabret A., Mourez T., Dina J. et al. Human coronavirus NL63, France//Emerg Infect Dis. 2005. -№11. - P.1225-1229.

208. Vanionpaa R., Hyypia T. Biology of Parainfluenza Viruses//Clinical Microbiology Review. 1994. - №4. - P.265-275.

209. Vernet G. Molecular diagnostics in virology//J Clin Virol. 2004. - №31. - P. 239247.

210. Vicente D., Cilia G., Monies M. et al. Human bocavirus, a respiratory and enteric virus//Emerg Infect Dis. 2007. - №13. - P.636-637.

211. Vijgen L., Keyaerts E., Moes E. et al. Development of one-step, real-time, quantitative reverse transcriptase PCR assays for absolute quantitation of human coronaviruses OC43 and 229E//J Clin Microbiol. 2005. - №43. - P.5452-5456.

212. Wadell G. Adenoviruses//Curr Top Microbiol Immunol. 1984. - №110. - P. 191220.

213. Waites K.B., Talkington D.F. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen//Clin Microbiol Rev. 2004. - №17. - P.697-728.

214. Walsh E., McConnochie K. M., Long C. E. et al. Severity of Respiratory Syncytial Virus Infection Is Related to Virus Strain //The Journal of Infectious Diseases. 1997. - №175. - P.814-820.

215. Watzinger F., Suda M., Preuner S. et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients//J Clin Microbiol. 2004. - №42. - №5189-5198.

216. Weinberg, A., Zamora M. R., Li S. The value of polymerase chain reaction for the diagnosis of viral respiratory tract infections in lung transplant recipients// J. Clin. Virol. 2002. -№ 25. - P. 171 -175.

217. Weiss S.R, Navas-Martin S. Coronavirus Pathogenesis and the Emerging Pathogen Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus//Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2005. - №12. - P. 635-664.

218. WHO guidelines for the collection of human specimens for laboratory diagnosis of avian influenza infection. 12 January 2005. http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/guidelines/humanspecimens/en/

219. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Cameron N. et al. Real-Time Multiplex PCR//Methods. 2001. -№25. - P.430-442.

220. Woo P. C., Chiu S. S., Seto W. H. et al. Cost-effectiveness of rapid diagnosis of viral respiratory tract infections in pediatric patients// J. Clin. Microbiol. 1997. - №35. -P.1579-1581.

221. Woo P. C., Lau S. K., Chu C. M. Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia//J. Virol. -2005. №79. - P.884-895.

222. World Health Organization. Weekly Epidemiological Record. 2008. - № 83. - P. 1-192.

223. World Health Organization. WHO recommendations on the use of rapid testing for influenza diagnosis. Online July 2005. (http://www.who.int / entity / csr / disease / avianinfluenza / guidelines /RapidTestInfluenzaweb.pdf).

224. Yasuda J., Nakada S., Kato A. et al. Molecular assembly of influenza virus: Association of the NS2 protein with virion matrix/A^irology. 1993. - №196. - P. 249-255.

225. Yu-Chia Hsieh, Tsung-Zu Wu, Ding-Ping Liu et al. Influenza Pandemics: Past, Present and Future//J Formos Med Assoc. 2006. - V. 105. - №1. - P. 1-6.

226. Zheng M. Z., Richard J. L., Binder J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins// Mycopathologia. 2006. - №161. - P.261-273.

227. Ziebuhr J., Snijder E. J., Gorbalenya A. E. Virus-encoded proteinases and proteolytic processing in the Nidovirales//J. Gen. Virol. 2000. - №81. - P.853-879.

Информация о работе

Никонова, Александра Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы