Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах

Михайлович, Владимир Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах"

На правах рукописи

00347Э087

МИХАЙЛОВИЧ Владимир Михайлович

Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.07 - микробиология

~ 8 0НТ 2009

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва 2009

003479087

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук

Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор, академик

Николай Федорович Мясоедов

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Николай Казимирович Янковский

доктор биологических наук, профессор Олег Леонидович Поляновский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Биологический факультет

Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 2009 г. в на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «_ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук /И> ^ Д^-МгКрицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование методов, основанных на идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК), позволило перевести лабораторную диагностику возбудителей инфекционных заболеваний, определение их токсигенных свойств и чувствительности к лекарственным препаратам на принципиально иной, более совершенный методологический уровень. Разработанные почти три десятилетия назад и активно совершенствуемые амплификационные подходы - NAT-методы {от англ. Nucleic Acid Amplification Technology) - создали мощную конкуренцию традиционным «эталонным» диагностическим системам. Выгодно отличаясь от последних в чувствительности и специфичности, NAT-методы сократили время проведения анализа, оставили в прошлом стадию культивирования зачастую небезопасных инфекционных агентов, предоставили возможность их количественного определения. Все возрастающее количество разрабатываемых оригинальных методических подходов основано на определении именно генетических детерминант, и, с точки зрения научной значимости и важности получаемых результатов, сколь-нибудь равноценных альтернатив NAT-методам при существующем методологическом уровне не наблюдается.

Обладая очевидными преимуществами, молекулярно-биологические методы, тем не менее, не смогли полностью вытеснить более трудо- и временноемкие традиционные подходы, главным образом, из-за повышенных технических требований, предъявляемых к их выполнению, и неспособности NAT-систем выявлять необходимое количество генетических мишеней одновременно без потери в аналитической чувствительности. Кроме того, внедрение новых методов требует радикальной модификации десятилетиями устоявшейся и весьма консервативной схемы лабораторной диагностики.

Очевидно, что разработка методических подходов, лишенных упомянутых недостатков, приблизит широкомасштабное внедрение молекулярно-биологических методов в систему лабораторной диагностики, приведет к ее качественному улучшению, позволит обнаружить новые зависимости между проявлением фенотипических признаков и их генетическими детерминантами.

К одним из наиболее многообещающих инструментов прецизионного многопараметрического анализа геномов (минорного полиморфизма) можно отнести олигонуклеотидные микрочипы. Первоначально разработанные для минисекве-нирования de novo (Lysov et al., 1996), микрочипы были успешно применены для целевого секвенирования (resequencing) (Hacia et al, 1999); обнаружения SNP (Hacia, 1999; Gunderson et al., 1998; Lindroos et al., 2001); сравнения последовательностей (идентификация клонов, несущих SNP) (Southern et al, 1996); анализа стабильности и образования вторичной структуры (Sohail et al., 1999, 2001; Mir and Southern, 1999); изучения кинетики гибридизации (Fotin et al., 1998) и др.

информативности и прикладной значимости результаты можно получить, только используя прямое секвенирование - метода, который в обозримом будущем, очевидно, не займет статуса рутинной процедуры в районных диспансерах и лабораториях провинциальных больниц. Гибридизационный же анализ, выполняемый на микрочипах, как показал наш опыт, основанный на применении метода более чем в 20-ти учреждениях противотуберкулезной службы, является более доступным для использования в практической лабораторной диагностике.

Еще одно преимущество микрочипов, связанное с иммобилизацией специфичных праймеров в отдельные ячейки, т.е. с пространственным их разделением, а следовательно, и отсутствием межпраймерных взаимодействий, потенциально способно решить проблемы, возникающие при разработке мультиплексной ПЦР. Стоит отметить, что именно из лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН вышли пионерские работы как по гибридизационному анализу на олигонуклеотидных микрочипах (Mirzabekov, 1994), так и по разработке ПЦР на биочипе (Strizhkov et al., 2000), а в последующем и количественный анализ на ее основе - real-time On-Chip PCR (Khodakov et al., 2008).

Таким образом, актуальность выбранной проблемы представляется достаточно очевидной - потенциальные возможности олигонуклеотидных микрочипов далеко не раскрыты, что серьезно ограничивает области и масштабы их применения.

Подходы, используемые при разработке методов, выполняемых на микрочипах, возникающие проблемы и пути их решения, а также описание полученных результатов представлены в настоящей работе.

Цель работы и задачи исследования

Целью работы является разработка ферментативных и гибридизационных методов идентификации вирусных и бактериальных агентов, определения генетических детерминант резистентности и токсинообразования на биологических микрочипах.

Задачи исследования:

1. Разработать эффективный способ идентификации функционально и таксономи-чески значимых участков бактериальных и вирусных НК методом гибридизации на биологическом микрочипе, включающий рациональные способы подготовки пробы, введения в нее флуоресцентной метки, конструирования набора дискриминирующих олигонуклеотидов и интерпретации результатов анализа;

2. Разработать ферментативные методы анализа на микрочипах, позволяющие идентифицировать специфические последовательности бактериальных и вирусных НК и минорный геномный полиморфизм (включая точечные нуклеотидные замены);

3. Разработать специализированные методы на биологических микрочипах для:

• выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и

изониазиду;

• идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких

видов рода Bacillus',

• идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с

натуральной оспой клиническую картину;

• идентификации и количественного определения возбудителей ВИЧ-инфекции,

гепатитов В и С в образцах донорской крови;

• обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз;

• определения субтипов вирусов гриппа А.

Научная новизна. В работе впервые предложен оригинальный подход, основанный на гибридизации флуоресцентно меченных продуктов амплификации функционально и таксономически значимых участков бактериальной и вирусной Ж на биологических микрочипах.

Разработанная оригинальная комплексная схема подготовки проб, включающая комбинирование симметричной и асимметричной стадий мультиплексной ПЦР с одновременным введением флуоресцентной метки, значительно упростила традиционный предгибридизационный этап, позволила анализировать непосредственно материал клинического образца и отличалась высокой воспроизводимостью результатов в заданном динамическом диапазоне.

В работе впервые приведен алгоритм выбора дискриминирующих иммобилизованных олигонуклеотидов, позволяющих в многопараметрическом режиме анализировать минорный функционально значимый нуклеотидный полиморфизм амплифицированных фрагментов НК на биологическом микрочипе. Использование разработанного подхода позволило проводить четкую дифференциацию между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами, сформированными молекулами целевой (искомой) последовательности и иммобилизованными олигонуклеотидными зондами. Дифференциация достигалась за счет разницы в термодинамической стабильности сравниваемых комплексов и, как следствие, в получаемых высоких значениях отношений сигналов флуоресценции (от 3 до 200х), регистрируемых в соответствующих ячейках биочипа.

В работе впервые представлен метод ПЦР на биологическом микрочипе, в котором часть специфичных праймеров иммобилизована в гелевых ячейках. В процессе амплификации праймеры ферментативно достраиваются, формируя фрагменты, комплементарные целевой последовательности, которые впоследствии выступают как в роли дополнительной мишени для амплификации, так и участвуют в организации гибридизационного комплекса, регистрируемого в гелевой ячейке при успешном прохождении ПЦР.

Разработанный подход, основанный на регистрации образования совершенных гибридизационных комплексов в режиме реального времени посредством детекции флуоресцентного сигнала неспецифического красителя БУВЯ I, имеющего высокое сродство к двуцепочечным участкам НК, позволил количественно оценить накопление сигналов в ячейках биочипа на каждом цикле ПЦР. Проведенный расчет корреляционной зависимости между количеством анализируемой мишени и накоплением флуоресцентного сигнала предоставил возможность выполнить не только качественный, но и количественный анализ - ПЦР на чипе в режиме реального времени.

В работе впервые представлены оригинальные методы идентификации МЛиЪегсгйохгь с одновременным определением чувствительности возбудителя к наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам первого ряда - рифампи-

цину и изониазиду. Разработаны методы: идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus; идентификации ортопоксвирусов и агентов, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину; одновременной идентификации и количественного определения вирусов гемотрансмиссивных инфекций (ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С) в донорской крови; определения устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеаз; генотипирования вирусов гриппа А.

Практическая ценность работы заключается в разработке ряда новых методических комплексных подходов для создания специализированных олигонуклеотидных биочипов, позволяющих проводить многопараметрический анализ возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в том числе, непосредственно используя материал клинического образца.

Представленные в работе подходы позволили рационально объединить преимущества чувствительных и эффективных энзиматических реакций и гибридизационного анализа с платформой биологического микрочипа, вскрывая его ранее не используемые уникальные потенциальные возможности.

Развитая концепция создания специализированных микрочипов, направленная на решение конкретных частных задач, в отличие от громоздких дорогостоящих зарубежных аналогов, нацеленных, например, на изучение экспрессии генов, позволила сконструировать, клинически испытать и внедрить в практику недорогие прецизионные молекулярные инструменты идентификации. Специализированные чипы, содержащие сравнительно небольшое количество гидрогелевых ячеек, вкупе с получаемыми высокими значениями отношений сигнал/шум позволили использовать относительно несложные оптические устройства для регистрации флуоресцентных сигналов. В то же время, высокие дискриминационные характеристики разработанных методов (отношение сигналов между совершенными и несовершенными гибридизационными комплексами) не требуют сложных алгоритмов обсчета полученных результатов.

Созданные на основе разработанных подходов 4 диагностические тест-системы прошли государственную сертификацию и применяются более чем в 20 научных и медицинских учреждениях страны.

Дополнительным подтверждением практической и научной значимости работы может являться высокая оценка Правительством РФ - аспиранты, участвовавшие в настоящих исследованиях - Д.А. Грядунов и С.А. Лапа, были удостоены Государственной премии для молодых ученых.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном совещании рабочей группы «Detection & Identification Technology Workshop», (Orlando, Florida, 1999); на Международном совещании ВОЗ по идентификации возбудителя натуральной оспы, (Geneva, Switzerland, 2001); на 5-й Международной конференции по молекулярной биологии (Москва, 2001); на 2-м Международном совещании экспертов МНТЦ «Oligonucleotide technology in epidemiology and microbiology», (Bergendal, Sweden, 2001); на Совещании Американского общества микробиологов «ASM Biodefense Research Meeting», (Baltimore, Maryland, 2003); на 15-й Международной конференции по ВИЧ-инфекции (Bangkok, Thailand, 2004), на Международном конгрессе "Современные проблемы генетики", Минск, 2005); на Международной конференции «Commercial and Pre-commercial Cell Detection

Technologies for Defense against Bioterror», (Brno, Czech Republic, 2006); на Международной конференции ««Research on tuberculosis. State of art in Russia and way toward the foundations of a Russian research cluster», (Москва, 2007); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», (Москва, 2007), других конференциях, совещаниях и семинарах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ в международных и отечественных журналах; 5 патентов в РФ и 1 патент в США.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав и заключения. Диссертация изложена на 197 страницах, содержит 47 рисунков, 17 таблиц и 5 приложений.

Благодарности. Автор считает приятным долгом поблагодарить всех соавторов и коллабораторов; и особенно сотрудников и аспирантов Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН за полезные обсуждения и помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка эффективного способа идентификации функционально и таксономически значимых участков бактериальной и вирусной HK методом гибридизации на биологическом микрочипе

Гибридизационный анализ с олигонуклеотидными зондами для идентификации точечного нуклеотидного полиморфизма (SNP), впервые предложенный Wallace (1979, 1981), нашел практическое применение только после разработки миниатюрной платформы, позволяющей иммобилизовать сотни и тысячи олигонуклеотидов, получившей название олигонуклеотидного микрочипа (Мирзабеков А.Д., 1994).

Существующие методы одновременного многопараметрического анализа, созданные на платформе микрочипов и являющиеся, вероятно, наиболее перспективным инструментом для изучения экспрессии генов, имеют существенные ограничения при использовании в клинической лабораторной диагностике. Трудоемкие способы подготовки пробы, высокая стоимость проведения анализа и сложное оборудование являются основными лимитирующими факторами при выполнении рутинных экспериментов.

Вклад в решение этой проблемы вносит описанная в данном разделе, разработанная и реализованная концепция комплексного подхода для идентификации функционально (или таксономически) значимого минорного полиморфизма методом гибридизации амплифицированных участков НК, в котором перечисленные выше недостатки отсутствуют или в значительной степени минимизированы. Разработанный подход включает в себя следующие этапы:

1. Выбор мишени для гибридизационного анализа;

2. Получение целевой одноцепочечной ДНК из клинического материала с одновременным введением флуоресцентной метки;

3. Конструирование набора дискриминирующих олигонуклеотидных зондов для иммобилизации на подложку;

4. Проведение гибридизации и отмывка;

5. Регистрацию и интерпретацию результатов;

6. Определение чувствительности, специфичности и динамического диапазона метода.

1.1. Выбор мишени для гибридизационного анализа

Очевидно, что применение гибридизационного анализа амплифицированных продуктов наиболее рационально в случае, когда функционально значимые мишени, подлежащие идентификации, представлены множественным полиморфизмом, локализованным в относительно коротком участке(ах) НК. Удачным примером может служить выбранный в нашей работе (Mikhailovich et al., 2001) в качестве молекулы-мишени ген гроВ, кодирующий Р-субъединицу РНК-полимеразы у M.tuberculosis. В коротком (81 п.о.) участке данного гена, обозначаемого в литературе как RRDR (Rifampicin Resistance Determining Region), известны более 40 мутаций, приводящих в 96% случаев к устойчивости возбудителя туберкулеза к одному из наиболее эффективных антимикобактериальных препаратов - рифампицину. Еще одним примером рационально выбранного участка может служить ген сгтВ, кодирующий вирусный аналог TNF-связывающего белка у ортопоксвирусов и играющего определяющую роль в патогенезе заболевания. Короткий фрагмент этого гена (менее 200 п.о.) содержит пять высококонсервативных участков, идентификация минорного полиморфизма в которых позволила провести внутривидовую дискриминацию ортопоксвирусов (Lapa et al., 2002).

В более сложных случаях, когда изучаемый полиморфизм локализован в относительно удаленных друг от друга участках одного гена или в нескольких генах, потребовалось использование мультиплексной ПЦР. В частности, такой прием был реализован в разработке микрочипов для идентификации М. tuberculosis с одновременным определением чувствительности микроорганизма к рифампицину и изониазиду (анализировались гены гроВ, katG, inhA, ahpC и IS6110, (Gryadunov et al., 2005)) и для типирования вирусов гриппа типа A (Fesenko et al., 2007) и др.

При выборе гибридизационного анализа в качестве основного метода идентификации должны учитываться некоторые специфические критерии. Например, время, требуемое для определения резистентности возбудителя ТБ к противотуберкулезным препаратам методом гибридизации (24 часа), может рассматриваться как вполне приемлемое, учитывая, что туберкулез относится к медленно прогрессирующим заболеваниям, длящимся годами. Идентификация же возбудителей особо опасных инфекций, как например, высококонтагиозных вирусных геморрагических лихорадок требует проведения идентификации в кратчайшие сроки, т.е. подразумевает применение амплификационных подходов.

Из вышеизложенного можно заключить, что применение гибридизации выглядит наиболее перспективным именно для проведения многопараметрического анализа, при котором не временная, а информационная составляющая является наиболее важной.

Примеры, на наш взгляд, удачно выбранных мишеней для идентификации конкретных инфекционных агентов методом гибридизационного анализа и их детальное описание приводятся в соответствующих разделах диссертационной работы.

1.2. Разработка оптимального способа подготовки пробы для гибридизации

В гибридизационном анализе требуются относительно высокие концентрации анализируемой флуоресцентно меченной молекулы-мишени в одноцепочечной форме.

Для получения оц-ДНК, пригодной для гибридизации, применяют ряд способов, наиболее известные из которых: биотинилирование одной цепи с последующим отделением ее стрептавидином, включение' в праймер промотора фага Т7, с последующим получением in vitro РНК-транскриптов, гидролиз предварительно 5'-фосфорилированной цепи, например, энзимом strandase, ассиметричная ПЦР и др.

В результате анализа существующих методов был развита процедура получения меченой оц-ДНК путем двустадийной ПЦР (nested вариант), вторая стадия которой проводится по асимметричному типу. Экспериментально определенное соотношение «прямых» и «обратных» праймеров (1:10 - 1:100) позволило воспроизводимо получать необходимое для гибридизации количество целевого оц-продукта непосредственно из материала клинического образца. На рис. 1 представлены результаты первой (симметричной) и второй (асимметричной) стадий ПЦР. В качестве анализируемой мишени использовался фрагмент гроВ гена различных мутантных штаммов М.tuberculosis длиной 192 и 126 п.н. для первой и второй стадий, соответственно.

||р ** ш т

Рис. 1. Результаты 1-й и 11-й стадий амплификации фрагмента гроВ гена М. tuberculosis, несущих мутации, соответствующие аминокислотным заменам: 516Туг (2), 533Рго (3), 511 Pro и 526Gln (4), 526Asp (5), 51 lPro и 526Asn (6), 516Gly и 526Asn (7), 511 Pro и 516Gly (8), 511 Arg и 51 ÓTyr (9).

Лунки 1 и 10 - 100b -DNA Ladder и отрицательный контроль, соответственно.

Введение флуоресцентной метки посредством меченого по 5'-концу и находящегося в 10-100 -кратном избытке праймера обеспечило адресное маркирование заданной цепи. Во время гибридизации наличие в растворе недостроенных меченых праймеров приводило к увеличению флуоресцентного фона, который после постгибридизационной отмывки практически исчезал.

Подобный же подход подготовки оц-меченого продукта был успешно нами применен и в мультиплексных реакциях с той лишь разницей, что соотношение концентраций праймеров приходилось подбирать эмпирически для получения относительно одинаковых количеств нескольких продуктов ПЦР.

Таким образом, было показано, что метод двустадийной ПЦР, выполняемый при выбранных условиях, может применяться для подготовки мишени к процедуре гибридизации. Метод чрезвычайно прост, обладает чувствительностью стандартной ПЦР и высокой специфичностью, благодаря использованию nested- формата. Любые флуоро-форы, не ингибирующие ПЦР и не изменяющие свойств олигонуклеотидов, могут быть введены в требуемую цепь молекулы-мишени схожим образом (в автоматическом или мануальном режиме). В частности, в наших работах мы использовали широко применяемые для гибридизационного анализа как коммерческие красители FITC (495/520, поглощение/испускание) и Texas Red (595/615), так и синтезированные в лаборатории под руководством д-ра A.B. Чудинова индоцианиновые флуорохромы, ImD-300 (аналог СуЗ, 550/570), ImD-500 (аналог Су5, 650/670).

1.3. Конструирование набора дискриминирующих олигонуклеотидов

Основной сложностью в разработке гибридизационного олигонуклеотидного чипа является правильное конструирование зондов, которые будут работать при одинаковой температуре, не теряя при этом в специфичности. По существу, имеются лишь два основных работающих подхода, применяемых для подобного конструирования. Один из них подразумевает использование олигонуклеотидов одинаковой длины при проведении гибридизации в буфере, минимизирующем влияние GC-состава на температуру плавления (Тт). Например, буферы, содержащие соли четвертичных аминов (тетраметиламмонийхлорид - ТМАС1, тетраэтиламмонийхлорид (ТЕАС1), позволяют проводить гибридизацию, не зависимую от GC- состава на нитроцеллюлозных или нейлоновых мембранах (Wood et al., 1985; Connors et al., 1997; Mir and Southern, 1999). Слабость данного подхода заключается в нарушении термодинамических свойств системы в целом, что затрудняет предсказание поведения олигонуклеотидов из-за не вполне изученных эффектов иных факторов, ассоциированных с таким нарушением.

В большинстве случаев используют второй подход - создавать олигонуклеотиды с заданной температурой плавления в традиционных Na-содержэщих буферах, подобных 6xSSC. В этом случае для предсказания поведения каждого зонда в наборе используют метод расчета Тт с учетом «ближайшего нуклеотидного окружения» (Breslauer et al., 1986). К недостаткам данного подхода можно отнести неправомерность экстраполяции Тт, рассчитанной для растворов, на таковую для иммобилизованных олигонуклеотидов.

Основная задача, которой посвящен данный раздел, сводилась к разработке приемов подбора наборов олигонуклеотидов с возможностью предсказания их поведения в реакции гибридизации. Поскольку гибридизация является обратимым процессом, ключевую роль в успешной дискриминации образовавшихся дц-комплексов играет их термодинамическая стабильность, или энергия связывания.

При разработке набора дискриминирующих олигонуклеотидов, учитывали, что энергия связывания, в свою очередь, зависит от ряда факторов:

- длины, GC-состава и нуклеотидной последовательности зондов - параметров, оказывающих влияние на значение Тт и определяющих их вторичную структуру;

- расположения GC и AT пар в олигонуклеотиде, т.к. середина зонда вносит больший вклад в стабилизацию гибридизационного комплекса. Зонды, содержащие в середине G и С связывают мишень сильнее, чем таковые с равномерным их распределением по всей длине (при одинаковых длине и составе);

- количества и типов «запрашивающих нуклеотидов», т.е. способных образовывать совершенный или несовершенный дуплекс с комплементарным основанием в молекуле-мишени;

- позиции «запрашивающего нуклеотида». Находясь в средине, он более дестабилизирует комплекс, чем таковой, расположенный на фланге зонда;

- факторов, связанных с иммобилизацией: стерические эффекты затрудняют взаимодействие между мишенью и иммобилизованным зондом. Иммобилизованный конец зонда играет меньшую роль в гибридизации, чем свободный. Дистанция от поверхности подложки должна быть соответствующей и пространственно не препятствовать гибридизации. Полимер, используемый для иммобилизации, также не должен создавать стерических препятствий;

- влияния полимера и /или/ подложки на Тт.

В мультиплексной реакции гибридизации учитывали конкуренцию, неспецифическую гибридизацию и концентрационные отношения мишеней.

Термодинамическая стабильность гибридизационных дуплексов будет также зависеть от вторичной структуры комплементарной целевой последовательности.

Влияние всех этих факторов способно в значительной степени изменить рассчитанную Тт. По этой причине, в данном разделе описаны методические приемы, позволяющие предсказать поведение набора дискриминирующих олигонуклеотидов при гибридизационном анализе.

1.3.1. Сравнительный анализ отношений сигналов при использовании дискриминирующих пар олигонуклеотидов полностью комплементарных мишени и имеющих одно / два некомплементариых основания

В подавляющем большинстве представленных в работе специализированных микрочипов был использован принцип дифференциации, основанный на сравнении сигналов, регистрируемых в ячейках, содержащих гибридизационные комплексы полностью совершенные, с таковыми, имеющими одно некомплементарное основание.

Тем не менее, ниже приводится ряд экспериментов, показывающих, что в ряде случаев большей дискриминации (отношения сигналов) можно достичь, применяя пары зондов, некомплементарные мишени по одной и двум позициям.

В дальнейшем, олигонуклеотидный зонд, образующий полностью совершенный комплекс с молекулой-мишенью (обозначим как «р», от англ. perfect), а имеющий одно или два некомплементарных основания «ш» и «тт» (от mismatch), соответственно.

Для мишени гроВ МЛиЬегси1ов13 были сконструированы зонды, полностью ей комплементарные и таковые, имеющие один или два мисматча. Локализация зондов относительно мишени показана на рис. 2А. Для сравнения использовали полученные в результате четырех экспериментов усредненные величины нормализованных по фону флуоресцентных сигналов.

Рис. 2. (А) Фрагмент гена гроВ M.tuberculosis и расположение зондов, полностью ему комплементарных и содержащих мисматчи в различных положениях (выделены цветом). (В) Результаты гибридизации, схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе и значения отношений флуоресцентных сигналов (для код она Asp516). А

М. tuberculosis H37Rv ACCESSION No. L27989

2461 2451 2441 2431 2421 2411 2401 2391 2381

tcacgtgacagaccgccgggccccagcgccl|acagtcggcgcttgtgggtcaaccccgacagcgggttgttctggt¡§catgaattggct

Oligo No.

AspSl6

#532 CCAGCGCÜjfCAGTCGG #542 TTGTTCTG¡}§§¡CATGAAT

#533 CCCAGCGCCAACAGTCGG #543 TTGTTCTGGTACATGAAT

#534 ccagcgccgacaptcgg #544 ttgttctggtccaigaat

#535 ccagcgccgacaptcgg #545 ttgttctggtccalfgaat

#536 ccagcgcciacaitcgg #54 6 ttgttctggtjlcalgaat

#537 ccagcgcc¡|acaf|tcgg #547 ttgttctggtccaigaat

#538 ccagügccgacaitcgg #548 ttgtjjctggtcca||gaat

#539 ccagj|gcccfacaf¡tcgg #549 ttgttctggtccaigaat

#540 gccccagcgcclacag

#541 gccccagcgccl¡acag

M M

532 533 534 535 536 537 538 539

540 541 542 543 544 545 546 547

548 549

M M

Схемы Мишень и олигонуклеотиды Отношение сигналов

TTGTTCTgIJÍCATGAAT -ASP516 (Target) ttgttctggtccatgaat- 542 ttgttctggt¡fcatgaat- 543 ttgttctggtccaigaat -544 ttgttctggtccaigaat -545 ttgttctggticajgaat -54 6 ttgttctggt¡§ca||gaat -547 ttgttctggtccaigaat -54 8 ttgt|ctggtccaigaat -54 9 543 / 542 = 0.23 ± 0.02 544 / 542 = 0.31 ± 0.04 545 / 542 - 0.18 ± 0.02

-----X—X— 546 / 544 =0.10 ± 0.02 547 / 545 =0.10 ± 0.02

—x-----x— —x-----x— 548 / 544 = 0.24 ± 0.03 549 / 545 - 0.10 ± 0.02

Из полученных отношений сигналов (см. рис. 2В) следует, что дискриминирующие пары зондов, содержащие один и два мисматча (пары 549/545 и 548/544 или 547/545 и 546/544), позволяют определить SNP, не хуже, чем пара, содержащая перфектный дуплекс и один мисматч (543/542). Отношение значений в паре 543/542 (m/p) превышало более чем в два раза таковое, полученное для сравниваемой пары

549/545 (mm/m). В то же время, при замене одного нуклеотида (C>G) в зонде # 548, дискриминация значительно снижается. Таким образом, показано, что тактика применения пар типа m/mm вместо р/т для идентификации SNP допустима и может дать больший «выигрыш» в случае удачного выбора искусственно введенного мисматча. К сожалению, «правильность» такого выбора предсказать a priori затруднительно (см. пары 549/545 и 548/544), и принятие окончательного решения требует эмпирического подтверждения. Еще одним очевидным недостатком выбора пар типа m/mm для дискриминации, является значительное снижение уровня флуоресцентных сигналов. Как следствие, для их регистрации потребуются более сложные оптические системы.

Рис. 3. (А) Последовательности иммобилизованных ДНК-зондов для дифференциации 16S рРНК В. anthracis, (В) результаты гибридизации (при анализе 1 мкг РНК) и схема расположения зондов на микрочипе. А

Bacillus anthracis 16S ribosomal RNA gene (AF176321) (Complementary chain)

Pos. 1321 cataagtgac agccgaagcc gcctttcaat ttcgaaccat gcggttcaaa atgttatccg

Oligo #12 Oligo #13 Oligo #44 Oligo #34 Oligo #35 Oligo #36

gaaccat gcggttcaaa atg gaaccat gcgfittcaaa atg gaaccat gcggttcaaa atg gaaccat gca^ttcaaa atg gaaccat gtagttcaaa atg gaaccat gjjggttcaaa atg

Схема расположения олигонуклеотидов Отношения значений сигналов*

I 2 3 4 5 m/p mm/m

S1 34 36 12 (#36/12)-0.12 (#34/36) - 0.75

S2 34 44 12 (#44/12) - 0.42 (#34/44) - IÜ

S3 35 13 12 (#13/12)- 0.28 (#35/13)-0.18

S4 35 44 12 (#44/12) - 0.36 (#35/44)-0.15

* Для сравнения использовали значения усредненных величин сигналов, полученных в 4-х независимых экспериментах. Относительная погрешность измерения составляла < 15%. Лучшие соотношения в парах m/p и mm/m выделены серым цветом.

Поскольку термодинамические характеристики образования ДНК/ДНК и РНК/ДНК гибридизационных комплексов различны, был проведен схожий эксперимент, направленный на определение способа конструирования дискриминирующих ДНК-зондов, в случае, когда анализируемая мишень представлена фрагментом РНК. На рис. ЗА представлено расположение «запрашивающих» зондов относительно

последовательности 16S рРНК Bacillus anthracis. В данном эксперименте дополнительные мисматчи вводили в серединную часть зонда, рядом с «запрашивающим» основанием.

Из полученных в 4-х экспериментах отношений видно, что только в одном случае из четырех отношение сигналов пары m/p выше соответствующих значений, полученных для пар mm/m (см. рис. 3 В). Таким образом, в целом, для РНК-мишени, как и в случае с ДНК-мишенью, подтверждается тенденция лучшей дискриминации парами m/mm, в сравнении с парами m/p.

С другой стороны, полученное для пары зондов 34/36 (mm/m) отношение сигналов (0,75), не может считаться удовлетворительным для целей дискриминации. По всей видимости, можно сделать предварительный, основанный на ограниченном количестве экспериментов вывод, что именно поведение пары p/m, является более предсказуемым и менее зависимым от первичной структуры анализируемой молекулы-мишени как для ДНК-ДНК, так и РНК-ДНК гибридизационных дуплексов.

1.3.2. Определение положения «запрашивающего нуклеотида» в составе иммобилизованного зонда, обеспечивающего лучшую дискриминацию SNP

Способность метода гибридизации надежно идентифицировать точечный нуклеотидный полиморфизм (SNP) зависит также от положения «запрашивающего нуклеотида» внутри последовательности иммобилизованного зонда.

На рис. 4А представлена схема конструирования иммобилизованных олиго-нуклеотидов, содержащих от 17 до 22 и.о., в которых «запрашивающее» основание расположено как в серединной части зонда (поз. #11), так и сдвинуто к его флангу (в поз. # 8).

Из полученных данных можно сделать вывод, что устойчивая дестабилизация гибридизационного комплекса наступает при размещении «запрашивающего» основания в центральной его части. При этом, в рассматриваемом случае максимальный дестабилизирующий эффект отмечали при его расположении в восьмом от конца положении, а не в очевидном одиннадцатом, строго соответствующем середине (см. рис. 4В).

К настоящему времени нами были получены дополнительные данные о том, что в некоторых случаях сдвиг «запрашивающего» основания с «геометрической» середины до 6-8 положения от фланга 20-членного олигонуклеотида действительно улучшают дискриминационные характеристики пары зондов (данные не представлены).

Кроме того, показано, что для достижения эффективной гибридизации необходимо соблюдать ряд условий, как-то: минимальное расстояние, физически отделяющее зонд от активных, например, альдегидных групп геля должна соответствовать спейсеру Сб. Использование более длинных спейсеров не оказывало значимого влияния на уровень абсолютных сигналов и специфичность гибридизации.

В всех проведенных экспериментах оптимальная длина иммобилизованных олигонуклеотидных зондов находилась в интервале 15-23 п.н. в зависимости от предпочтительной температуры проведения гибридизации, типа мишени, ее GC-состава и используемых буферов.

Рис. 4. (А) Последовательности дискриминирующих олигонуклеотидов, содержащих «запрашивающее» основание в различных положениях (позиция указана в квадратных скобках). (В) Схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе и отношения полученных нормализованных сигналов при гибридизации фрагмента гроВ гена М. tuberculosis (126 п.н.).

А) М. tuberculosis H37Rv ACCESSION No. L27989 ASP516

2371 2381 2391 2401 2411 2421 2431

gctactcggttaagtac^ffigtcttgttgggcgacagccccaactgggtgttcgcggctgacagccgc

gttaagtaccjggtcttgttgg

ctcggttaagtacc|ggtcttg

gttaagtaccíggtcttgttgg

ctcggttaagtaccIggtcttg

Oligo asp516 [11] Oligo asp516 [8] Oligo as p516>val [ 11 ] Oligo asp516>VAL [ 8 ]

Влияние расположение "запрашивающего нуклеотида" на гибридизационный сигнал

1 2 Отношение сигналов*

S1 ASP5161111 ASP516>VAL[11] ASP516>VAL[11] /ASP516[11] 0.21 ±0.02

S2 ASP516[8| ASP516>VAL[8] ASP516>VAL[8] /ASP516 [8] 0.0810.01

* Для сравнения использовали значения усредненных величин нормализованных флуоресцентных сигналов, полученных в 4-х независимых экспериментах.

1.4. Разработка условий гибридизации амплифицированных участков НК на биологических микрочипах

В предыдущем разделе упоминалось, что теоретически предсказать поведение набора иммобилизованных олигонуклеотидов в гибридизации, работающих совместно, возможно, но объективная оценка специфичности разработанного набора выполняется эмпирически в соответствующих для данного набора условиях проведения гибридизации и постгибридизационной отмывки. Подходы, использованные нами в разработке этих условий, описаны в настоящем разделе.

1.4.1. Оптимизация температурного и временного режима гибридизации

проводилась для выбора необходимого и достаточного времени, позволяющего достоверно различать образование совершенных (РО) и несовершенных (МО) дуплексов, и проводить анализ при температурах, широко применяемых в практических лабораториях. Очевидно, что высокие температуры гибридизации увеличивают вероятность испарения гибридизационного буфера при относительно

продолжительном времени гибридизации (18 часов), что накладывает повышенные конструкционные требования к герметизации камер при их изготовлении и эксплуатации.

Рис. 5. Влияние различных буферов на температуру плавления гибридизационных дуплексов. Дуплекс образован иммобилизованным зондом Leu511 (WT) 5' -AATTGGCTCAGC TGGCTG (pos. 2380-2363, Acc.No. L27989) и Temperature, °С оц- фрагментом гена гроВ (дикого типа) в

буферах: 1М NaCl+30% формамида (кривая 1); 1,5 М GuSCN (кривая 2); 1М NaCl +20% формамида (3); 1M NaCl + 10% формамида (4); 1M NaCl (кривая 5).

Температуры, сравнимые с «комнатной», имеют безусловное преимущество, но их поддержание в допустимом диапазоне требует климатического оборудования. По этим причинам было предложено привести температуру проведения гибридизации к 37 °С и выполнять ее в стандартных термостатах, применяемых для культивирования.

Модификация гибридизационного буфера путем добавления хаотропного агента (GuSCN), позволила снизить Тт, например, для разработанного набора олигонуклео-тидных зондов при выявлении мутаций в геноме M.tuberculosis с 62-65 °С до заданной (см. рис.5). Использование буферов, содержащих формамид, также снижало Тт, но не стало популярным из-за способности формамида (20-30 %, об./об.) разрушать связи, удерживающие гелевые ячейки на поверхности стеклянной подложки.

При гибридизации мишени в буфере, содержащем 1,5 М GuSCN, в течение 18 часов при Т=37 °С гибридизационные комплексы находились в состоянии, близком к равновесному, а при повышении температуры, олигонуклеотид, содержащий PD, кооперативно плавился, что свидетельствовало о его специфичности (см. рис. 6).

Таким образом, применение хаотропного агента позволило получать термодинамически стабильные комплексы для всего набора зондов, сохранив при этом специфичность взаимодействия при желаемой (заданной) температуре.

Рис. 6. Кривые плавления совершенного (РЭ) и несовершенного (МО) дуплексов, полученные при гибридизации одноцепочечного меченого фрагмента гроВ гена дикого типа с комплементарным иммобилизованным олигонуклеотидом и содержащим одно некомплементарное основание

— pd —md

Temperature, С

TARGET DNA: 3'

PERFECT PROBE: 5'

MISMATCH PROBE: 5'

- TTA ACC GAG TCG ACC GAC

- AAT TGG CTC IGC TGG CTG

- AAT TGG CTC |GC TGG CT

1.4.1.1. Определение оптимального времени гибридизации

Применение пористых трехмерных ячеек в микрочипах в сравнении с иммобилизацией олигонуклеотидных зондов на плоской подложке имеет ряд очевидных преимуществ, но требует большего времени для выполнения анализа. Если на 2D-микрочипах это время составляет 30 мин (Chizikov et al., 2001), то для гелевых чипов оно достигает 4-6 часов и более. Проигрыш во времени компенсируется высоким (в ряде случаев, на порядок) отношением дифференцируемых сигналов PD/MD, высокой воспроизводимостью результатов, и, как следствие, способностью дифференциации смесей НК дикого и мутантного типов (см. раздел 1.4.З.).

Несмотря на тот факт, что полностью равновесное состояние на 3-D микрочипах достигается в течение достаточно продолжительного времени (1-2 суток, данные не показаны), экспоненциальное нарастание сигналов происходит в первые 10-18 часов (в зависимости от условий проведения реакции, длины олигонуклеотидов и пр.). Поскольку в дальнейшем существенного возрастания сигналов не происходит, равно как и не наблюдается увеличения соотношения PD/MD, в последующих экспериментах мы проводили гибридизацию в течение ночи (около 14 часов).

В сравнении с 3-D микрочипами, отличительной и в то же время лимитирующей особенностью 2-D микрочипов является относительно быстрое время насыщения, обусловленное большей доступностью иммобилизованных зондов и их более низкой абсолютной концентрацией за счет расположения на поверхности; при этом, как уже отмечалось, уровень дискриминации (PD/MD) остается низким и сравним с таковым, получаемым при 40-минутной гибридизации в объемных ячейках геля.

1.4.1.2. Влияние условий постгибридизационной отмывки на дискриминацию совершенных и несовершенных гибридизационных комплексов

Поскольку дискриминирующая способность метода зависит не только от условий гибридизации, но и от соответствующих условий отмывки, оптимальные условия последней процедуры были изучены и определены. Эффективная отмывка достигалась 3-кратной обработкой (в течение 1-3 с) реакционной поверхности микрочипа чипа буфером 6,67xSSPE, pH 7,4, содержащим 10% Tween 20, при 37 °С.

Практическое применение ТБ-микрочипов внесло свои субъективные неожиданные корректировки: большой объем анализируемых образцов, не всегда четкое следование инструкции изготовителя и получаемые высокие значения отношения сигналов спровоцировали пользователей лабораторной службы отмывать чипы дистиллированной водой.

Преследуя цель вернуть ситуацию в «научное русло» и сделать процесс контролируемым и предсказуемым, был выполнен ряд экспериментов, направленных на унификацию условий отмывки.

В частности, было изучено влияние условий отмывки на получаемые отношения сигналов MD/PD. Для этого, после проведения гибридизации партии чипов (п=8) подвергались следующим вариантам отмывки: (а) в течение 2-х минут дистиллированной водой; дважды в течение 5 с споласкивалась буфером (6.67xSSPE, pH 7.4, 10% Tween 20) при комнатной температуре (б) и при 37 °С (в), и в течение 30 с в том же буфере при комнатной температуре (г). Результаты полученных отношений представлены на рис. 7.

Iii

1 I TR jj

fen ^Jrilili i j jiirflftifliffiirfl .1ffi-ffl

1 2. 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2В 27 Oligo Pair No. (Mismatch & Perfect)

| ■ Water 2 min RT a WB 2x Ss RT q WB 2x 5s 37oC О WB 2x 30s RT |

Рис. 7. Отношения гибридизационных сигналов для дифференцирующих пар олигонуклеотидов в зависимости от условий постгибридизационной отмывки. Гибридизовали меченый фрагмент ДНК M.tuberculosis дикого типа в течение 14 часов. Условия отмывки указаны в легенде диаграммы и в тексте. Дифференцирующие пары с указанным номером сформированы из олигонуклеотидов, соответствующих мутантной ДНК, и релевантных зондов, соответствующих ДНК дикого типа (список приведен в диссертации).

Полученные значения отношений (с учетом соответствующих им среднеквадратичных отклонений) позволяют сделать заключение, что экспозиция чипа в дистиллированной воде (t=120 с) допустима, а значения (MD/PD) сравнимы с таковыми, получаемыми при рекомендованных разработчиком условиями отмывки (двукратное 5-секундное споласкивание в буфере при комнатной температуре по варианту (б)).

Для формирования окончательного заключения о возможности применения нестандартных условий отмывки было определено оптимальное время экспонирования чипа в дистиллированной воде. Для этого партии биочипов после гибридизации (п=10) отмывали при 20 °С в течение 5, 20, 120 и 300 с (см. диссертацию). При этом особое внимание было уделено не определению отношений MD/PD, а воспроизводимости отмывки, т.е. установлению ошибки в регистрации остаточных постгибридиза-ционных флуоресцентных сигналов. В полученных результатах прослеживались очевидные закономерности: среднеквадратичные отклонения при коротком времени отмывки (5 с) были недопустимо велики (достигали 80%); и при 5-минутном экспонировании их значения также увеличивались. Минимальные же отклонения (в пределах 10%) наблюдали при отмывке, выполненной в течение 30 с. По этой причине, именно данное значение времени может быть рекомендовано для постгибридизационной отмывки микрочипов, содержащих конкретный набор дискриминирующих зондов.

1.4.2. Влияние исходной концентрации молекулы-мишени в образце на результаты гибридизационного анализа

Очевидно, что интенсивность флуоресцентных сигналов в некотором определенном диапазоне должна быть прямо пропорциональна количеству прогибридизовавшейся молекулы-мишени. Возникает правомерный вопрос: будет ли зависеть специфичность результатов (дискриминирующие свойства) от концентрации

молекулы-мишени (в частности, для туберкулеза - количества микобактерий, присутствующих в клиническом образце)? Если да, то каков динамический диапазон разработанного метода гибридизации?

Рис. 8. Влияние исходной концентрации молекулы-мишени (фрагмент гена гроВ М.tuberculosis) на интенсивность гибридизационных сигналов (А) и на отношения MD/PD для каждой пары дискриминирующих олигонуклеотидов (В).

■ 10*2 В 10я3 □ 1 DM В 10*5 ■ 10«6

■ 10*2

и 10*3 Q 10*4 В 10*5 ■ 10*6

4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Mismatch Oligo No

o.ooi

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 25 27

Oligo Pair No (Mismatch & Perfect)

На рис. 8 представлены результаты гибридизации, полученные из образцов, содержащих различное первоначальное количество клеток М.tuberculosis (от 102 до 106). Из чистой культуры микобактерий Н37Лу, выращенной на жидкой питательной среде, делали ряд последовательных десятикратных разведений в стерильном физиологическом растворе. Аликвоты каждого разведения засевали на плотные питательные среды; выросшие колонии подсчитывали и определяли исходную концентрацию клеток. Для проведения первой стадии ПЦР брали соответствующие количества материала из полученных разведений. Затем выполняли вторую

(асимметричную) стадию ПЦР, продукт которой гибридизовали на микрочипы. Для каждого разведения выполнили по 10 независимых экспериментов. Полученные средние значения нормализованных сигналов для каждого разведения представлены на рис. 8А. Относительная погрешность не превышала 15%. Отношения (MD/PD) для каждой пары олигонуклеотидов представлены на рис. 8В.

Полученные результаты могут быть объяснены следующим образом. По своей природе, ПЦР, удваивающая мишень в геометрической прогрессии, за 40-50 циклов (проводимых в две стадии) позволяет нивелировать разницу в исходных концентрациях, отличающихся на несколько порядков (в данном случае - бактериальных клеток). В ходе эксперимента отмечено увеличение нормализованных сигналов при гибридизации образца, исходно содержащего 106 клеток. Значимой разницы при гибридизации иных образцов, содержащих мишень в различных концентрациях, включая с=102 клеток, не наблюдали. Более важным полученным результатом, безусловно, представляется практическое отсутствие влияния исходных концентраций на дискриминирующую способность олигонуклеотидного набора. Учитывая, что в клиническом материале больных туберкулезом количество бактериальных клеток возбудителя находится в диапазоне, близком к изученному, можно констатировать, что метод гибридизации пригоден для анализа данной молекулярной мишени.

1.4.3. Применение гибридизационного анализа для дифференциации смесей HK

Высокие отношения (PD/MD) и воспроизводимые результаты разработанного метода позволяют применить его не только для качественного, но и для полуколичественного анализа. Установив на статистически достаточном количестве экспериментов интервалы значений (пороги) для отношений PD/MD, возможно дифференцировать гетерогенные смеси НК. Пример такой дифференциации показан на рис. 9.

Рис. 9. Дифференциация смесей, содержащих ДНК дикого типа и ДНК, имеющих мутацию, соответствующую ASP516> VAL (слева) и SER531> LEU (справа).

Значения сигналов, в ячейках, содержащих зонд, комплементарный ДНК дикого типа, снижается при увеличении в смеси количества ДНК, несущей мутацию.

Пары олигонуклеотидов, способные специфично идентифицировать точечные замены, могут быть использованы и для дифференциации смесей РНК (рис. 10). РНК микроорганизмов рода Bacillus выделяли, фрагменгировали, вводили метку и гибридизовали, согласно Kelly J., 2002. Для приготовления смеси 9:1 использовали

Mixture VfT* Asp516>va!

Mixture WT+Ser531>Leu

уже выделенную из микроорганизмов рРНК. Полученные отношения значений сигналов в ячейках, соответствующих дифференцирующим парам зондов, демонстрируют возможность обнаружения до 10% чужеродной РНК в смеси. В то же время, значения этих величин свидетельствуют о том, что эксперимент выполнен на пределе разрешающей способности метода гибридизации, и вероятность обнаружения меньших количеств инородной РНК в смеси низка.

Рис. 10. Последовательности олигонуклеотидов для дифференциации В. anthracis и B.thuringiensis и схема их расположения на микрочипе (А). Результаты гибридизации препаратов 16S рРНК микроорганизмов и их смесей (В). Отношения нормализованных сигналов для дифференцирующих пар олигонуклеотидов (1:41) и (23:22) приведены в таблице.

Bacillus anthracis 16S ribosomal RNA gene (AF176321), complementary chain.

Pos. #1441 tcacccgtcc gccgctaact tcataagagc aagctcttaa tccattcgct cgacttgcat Oligo #1 agctcttaa tccattcgct с

Oligo #41 agctct|aa tccattcgct с

Pos. #511 cccgaaggag aagccctatc tctagggttg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct Oligo #23 tctagggttg tcagaggatg

Oligo #22 tctagggttjf tcagaggatg

Схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе

1 2 3 4 5

S1 26 27 12 44

S2 54 25 15 16

S3 12 17 4 4-1

S4 10 11 1 Я

S5 9 8

S6 ■

Target В.anthracis Sterne B.thurinqiensis 4Q281 Mixture BT/BA (9/1)

Ratio 1/41 2.93 ± 0.23 0.25 ± 0.03 0.36 ± 0.04

Ratio 23/22 6.36 ± 0.20 0.25 ± 0.03 0.44 ± 0.05

Резюмируя раздел, можно заключить, что оптимизация условий проведения гибридизации и отмывки является неотъемлемой и важной частью, позволяющей проводить специфичный анализ, регистрирующий минорный полиморфизм, включая БЫР. Вкупе с правильно сконструированным набором пар дифференцирующих олигонуклеотидов оптимизация позволяет применить метод гибридизации в качестве надежного инструмента молекулярного узнавания.

2. Разработка ферментативных методов анализа на микрочипах

Метод гибридизации на микрочипах с методологической точки зрения обладает рядом неоспоримых преимуществ, главным из которых является возможность проводить многопараметрический анализ. Не случайно экспрессия генов стала наиболее активно (и эффективно) изучаться именно с появлением такого инструмента молекулярного узнавания. Применение же микрочипов в практической лабораторной диагностике остается ограниченным из-за относительно большого времени, требуемого для проведения анализа, наиболее продолжительной стадией которого является собственно гибридизация.

С открытием высокочувствительных амплификационных подходов, позволяющих получать результаты в кратчайшие сроки, возникла очевидная идея переноса их выполнения на твердую подложку, тем самым, выгодно комбинируя преимущества, присущие этим методам, с уникальными свойствами микрочипа - способностью анализировать одновременно практически неограниченное количество мишеней.

В задачи данной работы входила разработка четырех типов амплификационных методов, проводимых на микрочипах: лигазной детектирующей реакции (LDR), мультиплексной PCR, и двух ее модификаций: аллель-специфичной (AS-PCR) и realtime On-Chip PCR.

2.1. Лигазная детектирующая реакция (LDR)

Разработан метод термоциклической реакции лигирования (LDR, Ligase Detection Reaction) на микрочипе для идентификации мутаций на примере гена гроВ М. tuberculosis.

Одноцепочечную ДНК вариабельного участка гроВ гена получали путем ассиметричной ПЦР. Остаточную полимеразную активность устраняли обработкой протеиназой К (1 мкг/мл), которую, в свою очередь, инактивировали термически (95°С, 15 мин). Полученный продукт гибридизовали на микрочип с двумя 5'-иммобилизованными олигонуклеотидами, содержавшими в 3'-положении либо А, либо Т, что соответствует второму нуклеотиду кодона 526 (САС), кодирующего His (дикий тип), или СТС, кодирующего Leu (мутация). Реакционная смесь содержала также 5'- фосфорилированный олигонуклеотид меченный по З'-концу, подобранный таким образом, чтобы он гибридизовался с ДНК-мишенью встык к иммобилизованному в геле олигонуклеотиду. Если в месте их соединения происходило комплементарное спаривание оснований с ДНК-мишенью, то лигаза присоединяла флуоресцентно меченный олигонуклеотид к ковалентно иммобилизованному в геле. Этапы гибридизации и лигирования повторяли несколько раз, результатом чего явилось накопление сигнала в соответствующей гелевой ячейке биочипа. Детали проведения описаны в работе Mikhailovich et al., 2001.

На рис. 11 показаны результаты LDR, в которой в качестве мишеней использовали оц-ДНК продукты дикого и мутантного (His 526) штаммов M.tuberculosis и их смеси.

При анализе ДНК, представленной последовательностью одного типа (дикой или мутантной) накопление флуоресцентного сигнала происходит только в одной из ячеек. При наличии ДНК двух типов одновременно, накопление сигнала происходит в обеих ячейках, причем интенсивность зависит от их соотношения в смеси.

Рис. 11. Результаты идентификации ТНЗ в ДНК М. tuberculosis, полученные методом LDR на микрочипе. В качестве мишени использовали ДНК дикого (а) и мутантного (е) типов по 3 пмоль на реакцию. Смеси включали 3 пмоль ДНК дикого типа с добавлением 1% (Ь), 2% (с) и 10% (d) мутантной ДНК.

Отличительной особенностью метода является его высокая специфичность. Известно, что лигаза соединяет олигонуклео-тиды только в том случае, если в месте их лигирования образуются совершенные комплементарные дуплексы (Barany, F. et al., 1991). Так как в реакции не образуются последовательности de novo, и ошибки LDR составляют десятые доли процента и менее, данный метод представляет большой интерес при идентификации мутаций с низкой частотой, на фоне дикого типа (Khanna et al., 1999, Gerry et al., 1999), что в полной мере подтвердилось выполненными на микрочипе экспериментами.

О 9

§§

2.2. PCR на микрочипе (on-Chip PCR)

В задачи настоящей работы входила разработка PCR на микрочипе, гелевые ячейки которого несут не иммобилизованные олигонуклеотиды, как в случае с гибридизацией, а праймеры. Физическое разделение специфичных праймеров посредством ковалентной иммобилизации их в различных ячейках а priori позволит увеличить «степень мультиплексности» реакции за счет снижения числа межпраймерных взаимодействий. В этом случае каждая ячейка микрочипа выступает в роли отдельной микропробирки, в которой проходит собственная реакция. Схема PCR, проходящей внутри и в растворе над гелевой ячейкой представлена на рис. 12.

Рис. 12. Схема PCR на микрочипе. Праймеры иммобилизованы за 5'-конец. Растущие цепи обозначены пунктирной линией.

Реакционная смесь содержала пару специфичных праймеров, один из которых (обратный) имел 5-- флуоресцентную метку. В гелевых ячейках были иммобилизованы прямые праймеры. На первой стадии целевая ДНК амплифицировалась в растворе над ячейкой (Рис. 12-1). После нескольких циклов амплификации, накопленный амплификацией целевой продукт начинал отжигаться на иммобилизованные в геле праймеры, которые достраивались (2), образуя ковалентно связанную с гелем de novo синтезированную цепь ДНК. В дальнейшем, эта цепь использовалась как в качестве матрицы для амплификации (3), так и для образования гибридизационного комплекса (4), который регистрировали по наличию флуоресценции в соответствующей ячейке микрочипа при температуре отжига. Образование гибридизационного комплекса амплифици-рованной мишени с контрольным олигонуклеотидом, комплементарным серединному участку ампликона (5), служило контролем специфичности реакции.

Впервые эксперимент, демонстрирующий возможность проведения амплификации на микрочипе (Strizhkov et al., 2000) был выполнен на гене Ыа, кодирующем синтез ß-лактамазы. Мы использовали коммерческую плазмидную ДНК pUC18 (Sigma, USA), несущую данный ген в качестве маркера резистентности. Один из праймеров bla-Y CCG ССТ ССА ТСС AGT СТА TT (pos. # 2656-2674, Асс. No. AF074376) был иммобилизован в ячейке в количестве 1 пмоль. Его же и обратный праймер Ыа-R CTG TAG CAA TGG CAA CAA CG (pos. # 2748-2729) также помещали в раствор над биочипом в количестве 5 пмоль. Амплифицировали участок длиной 93 п.н. Концентрация мишени составляла 104 копий на эксперимент.

В качестве отрицательного контрольного праймера использовали олигонуклео-тидный фрагмент того же гена, локализованного за пределами участка амплификации (6/fl-NC СТТ ТТА СТТ ТСА CCA GCG ТТТ CT, pos. # 3193-3215). В качестве положительного контрольного праймера использовали олигонуклеотид, комплементарный серединному участку ампликона (Wa-Fl TGC CGG GAA GCT AGA GTA AGT AGT ТС, pos. # 2682-2707). Принцип его работы показан на рис. 12 (5).

Амплификацию проводили согласно схеме, приведенной выше. Кинетика процесса представлена на рис. 13.

Рис. 13. Кинетика амплификации фрагмента гена Ыа (А) и картина, полученная методом On-chip PCR (В). Специфической амплификации в ячейке, содержащей праймер Ыа-F, соответствует верхняя ломаная линия (А). Нижняя кривая описывает кинетику в ячейке, содержащей неспецифичный праймер Ыа-NC (детали см. в тексте). Расположение ячеек с праймером Ыа-F в виде буквы «R» {от англ. resistance) носит презентационный характер.

А В

—?

fee • «

"*■' Ii II

На 25-26 циклах амплификации флуоресцентный ~ —- ~ ~

сигнал в ячейках, содержащих специфичные праймеры, начинал экспоненциально увеличиваться, чего не наблюдали в ячейках с неспецифичными праймерами.

Для проведения реакции был подобран ряд условий, учитывающих специфику проведения PCR в гелях. В качестве полимеразы использовали Stoffel Fragment (Applied Biosystems), эффективность с которой оказалась выше в сравнении со стандартным энзимом. Температуру отжига праймеров снизили до 45 °С, т.е. сделали на 5-6 °С ниже расчетной, введя, таким образом, поправку на проведение реакции в геле. Время отжига, увеличили в 1,5 раза (с 40 секунд до 60) в сравнении с таковым, используемым при выполнении реакции в пробирке, что привело к возрастанию флуоресцентного сигнала в 2...2,5 раза. При концентрации мишени <10 нг, в реакционную смесь добавляли чужеродную ДНК (фаг Я, 100 нг).

Для проведения реакции использовали специально разработанный пористый гель (Arenkov et al., 2000), обеспечивающий беспрепятственную диффузию внутрь геля глобулярных белков до 100 кДа, и НК - от 150 до 400 п.о. Преимущество применения пористого геля продемонстрировано на рис. 14, где в качестве мишени использовали фрагмент гена rpoB М. tuberculosis. Видно, что абсолютная интенсивность флуоресцентных сигналов (например, в ячейке В5) увеличивается почти в 3 раза -соответственно, увеличивается и дискриминирующая способность метода.

Рис. 14. Результаты амплификации фрагмента гена гроВ, полученные на пористом (I) и стандартном полиакрил-амидном (II) геле. Специфичность метода оценивали по накоплению продукта в ячейке, содержащей «положительный контрольный праймер» bla-F1. В этом

-т со о

со В £

■ч- Ъ

Intensity

случае реакция проходит по типу «nested-amplification». Кинетика On-chip PCR с участием фланкирующего праймера bla-F и праймера bla-F1, комплементарного внутренней части ампликона показана на рис. 15.

Рис. 15. Амплификация фрагмента гена Ыа. В растворе находятся прямой {bla-F) и обратный флуоресцентно меченный (bla-R) фланкирующие ампликон праймеры. Real-time регистрация сигналов произведена в ячейках с 5'-иммобили-зованными праймерами bla-F (1) и bla-Fl (2).

Эксперименты, направленные на определение специфичности On-Chip PCR, были выполнены и в мультиплексном формате на молекулярных мишенях, ответственных за синтез бактериальных токсинов. К фрагментам генов lef и pag4, детерминирующих синтез летального фактора и протективного антигена B.anthracis, соответственно, были подобраны специфичные праймеры для выполнения мультиплексной On-Chip PCR. Синтезирован также олигонуклеотидный зонд, комплементарный внутреннему участку фрагмента гена.pag4 (см. табл. 1)

Кинетика амплификации фрагментов генов lef и pag4 В. anthracis представлена на рис. 16 (А - С). Кривые 1 и 2 отражают изменение сигналов в ячейках со специфическими праймерами к генам lef и pag4, соответственно. Видно, что в отсутствие анализируемой мишени флуоресцентный сигнал соответствующей ячейки близок по значению к фоновому. На рис. 16С, нарастание сигнала обусловлено не отжигом 5'-

ампликона на соответсвующей стадии PCR, а гибридизацией 3'- меченного олиго-нуклеотида (Texas Red), комплементарного внутреннему участку мишени.

Табл. 1. Праймеры и зонды, используемые для мультиплексной On-Chip PCR генов lef и pag4 B.anthracis.___

Олигонуклео-тиды" Позиция4 Последовательность 5' 3' TT opc 1 an> ^

lef-F 1255 CCCTTGATAATATCTTACC 51

lef-R 1153 GATATGAACCCGTACTTG 51

pag4-F 1931 CAAGTTCCCAGGGGTTACTAGG 58

pag4-R 2178 CACTTCTTGGTCATCTACCCAC 58

pag4-Y 2155 TTGTTACATGATTATCAGCGGAA 58

"F - прямой, R - обратный праймеры, соответственно; Р - зонд.

4 Относительно последовательностей /e/(GenBank Асс. No т302\0),pag4 (Асс. No m22589). 'Температура отжига (Тап= Т„,— 5 °С), рассчитанная с использованием Williamstone Software, (nearest-neighbor method).

Рис. 16. Кинетика мультиплексной On-Chip PCR фрагментов генов lef и pag4 B.anthracis. Детали см. в тексте. А В

С D

В этом случае наличие сигнала в соответствующей ячейке однозначно свидетельствует об успешной достройке иммобилизованных специфичных праймеров над и внутри гелевых ячеек.

После гибридизации зонда, было проведено плавление дуплексов (с 55 до 78 °С) со скоростью 0,5 °С /мин (рис. 16Э). Кооперативность плавления гибридизационного комплекса в ячейке 1 свидетельствовала об образовании совершенного гибридного продукта.

2.2.1. Аллель-специфичная PCR (AS-PCR)

Дальнейшее развитие метода включало разработку AS-PCR, в которой 3'-нуклеотид иммобилизованного праймера определял, будет ли синтезироваться специфический продукт. А priori, преимущества проведения AS-PCR на микрочипе очевидны, все из-за того же удачно предложенного формата раздельной иммобилизации праймеров в гелевых элементах. Стандартно выполняемая AS-PCR с незакрепленными на подложку праймерами ассоциирована с ограниченным количеством одновременно детектируемых мишеней, поскольку каждая из них требует своей флуоресцентной метки, спектры испускания которых должны отличаться. Пространственное разделение праймеров иммобилизацией позволяет использовать один флуорофор для регистрации теоретически неограниченного количества мишеней.

Схема разработанной на чипе реакции AS-PCR и кинетика реакции на примере дифференциации генов Шига и шигаподобного токсинов представлены на рис. 17.

Рис. 17. Схема On-Chip AS-PCR (I) и кинетика реакции (II) идентификации генов sht (1) и sit (2).

star-

s'-.........т-....

3'..........А—

—--------

.........А-

УМ»

-3'

-в

I II

Иммобилизованный праймер достраивается эффективно, если его 3'- нуклеотид комплементарен анализируемой мишени (1-С), что регистрируется по накоплению в ячейке флуоресцентно меченного продукта (II-1). При наличии мутации эффективность амплификации заметно снижается (П-2). Аллель-специфичные праймеры ¡1Я-Р(Т) и содержащие соответствующий З'-концевой нуклеотид

были иммобилизованы (см. табл. 2). В реакционной смеси находились прямой и обратный (флуоресцентно меченный) праймеры и соответственно.

Табл. 2. Праймеры для дифференциации генов Шига и шигаподобного токсинов методом AS-PCR на микрочипе._

Праймеры Позиция* Последовательность 5' 3'

sht-F(T) 1619/1648 T TTCTTTGTTATCTTTTCAGTTAATGTGGTt

sit-F(G) 1619/1668 G TTCTTTGTTATCTTTTCAGTTAATGTGGTg

sht-Y 1619 TTCTTTGTTATCTTTTCAGTTAATGTGGT

sht- R 1757 TACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGG

♦Позиции указаны согласно GenBank Асс. No AJ132761

Разработанный метод был также успешно применен для идентификации мутаций в гене rpoB М. tuberculosis (см. диссертацию). Было показано, что разработанный метод On-Chip AS-PCR способен параллельно дифференцировать несколько SNP и не требует применения флуорофоров, различающихся по

2.2.2. ПЦР в режиме реального времени на микрочипе (Real-time On-Chip PCR)

Следующим этапом исследования была разработка метода количественного анализа - real-time PCR на микрочипе. В качестве мишеней были выбраны гены gag (HIV-1), 5'-UTR (нетранслируемый регион) HCV и геи X(HBV). Выбор определялся, в первую очередь, необходимостью разработки системы идентификации вирусов в донорской крови и возможностью продемонстрировать преимущества чипов при выполнении мультиплексной количественной RT-PCR на гетерогенных (ДНК- и РНК-содержащих) мишенях.

Реакцию проводили в две стадии, первая из которых выполнялась как RT-PCR в пробирке и имела целью а) синтезировать кДНК с РНК- матрицы и б) провести предварительную стадию амплификации, чтобы достичь необходимой аналитической чувствительности (101 вирионов на реакцию) и специфичности (выполнив реакцию в формате nested). Реакцию вели по стандартной схеме в 25 мкл смеси с некоторыми модификациями. Наибольшую эффективность при одновременном выполнении мультиплексной реакции обратной транскрипции и амплификации обеспечило применение StrataScript® Reverse Transcriptase и SureStart® Taq polymerase (Stratagene, USA) в присутствии RNasin® (20 Ед.). После 25 циклов RT-PCR, 1 мкл полученного продукта переносили в PCR-камеру микрочипа, в которой реакция проходила, согласно схеме на рис.15, с той лишь разницей, что детекция флуоресцентного сигнала происходила в реальном времени за счет связывания находящегося в растворе красителя lxSYBR® Green I. Микрочип содержал ячейки с иммобилизованными в них «внутренними» праймерами (с=0,2 мкМ) для проведения nested-PCR (см. диссертацию).

Более длинный продукт, полученный на 1-й стадии, амплифицировался первоначально в растворе над ячейками микрочипа, и, достигнув определенной концентрации, начинал гибридизоваться с иммобилизованными праймерами. В результате реакции специфичные праймеры на микрочипе энзиматически достраивались, образуя гибридные комплексы с комплементарными целевыми продуктами (рис. 12-4). Краситель SYBR® Green I, имеющий высокое сродство к малой бороздке дц-ДНК, связывался с образовавшимися комплексами на каждом цикле амплификации (при температуре отжига), отражая таким образом количество образовавшихся комплексов. Поскольку праймеры, специфичные для каждого вирусного агента, локализованы в различных ячейках, кинетику реакции наблюдали одновременно для каждой мишени, используя единственный краситель.

Определение первоначальной концентрации мишени в образце. Динамический диапазон определения.

Для количественного определения концентрации мишени был выполнен ряд экспериментов, результатом которых явилось построение калибровочных кривых для образцов, содержащих известное количество анализируемых НК.

Серопозитивные количественно охарактеризованные референс-образцы плазмы крови [3,85хЮ6 ёЕЧ/шЬ Н1У-1; 1,73*107 §Ея/тЬ (2,89><10б Ш/тЬ) НВУ; 1,04x107 §Ец/тЬ (5,22х106 Ш/тЬ) НСУ] и приготовленные из них с помощью серонегативной сыворотки последовательные 10-кратные разведения использовали для построения калибровочных кривых (для диапазона 106 - 10° gEq на реакцию). При построении кривых проводили от 4-х до 8-ми повторных экспериментов для разведений выше 102 gEq, более низкие концентрации получали двукратными разведениями; для расчетов использовали средние значения, полученные в 25 экспериментах. Зависимость порогового цикла (Ст) от концентрации мишени приведена на рис. 18.

А В

■О20

R^O.99 R^.99

16 20 M 40

Second Stage Cycle Number

10'' 10° 10' 10* 10' 10* 105 10* 10' 10' Input Template Copy Number

Рис. 18. Количественное определение вирусных частиц методом real-time On-chip PCR. (А) График накопления сигнала и значения Ст, полученные при анализе 10-кратных разведений HBV DNA (loglO) в диапазоне от 10б до 10° gEq/mL (слева направо). (В) Калибровочные кривые для определения первоначальной концентрации вирусных частиц HIV-1, HBV, HCV в образце (обозначены квадратами, треугольниками и кружками, соответственно).

Концентрацию молекулы-мишени в исследуемых образцах определяли с помощью построенных калибровочных кривых, проецируя экспериментально полученное значение порогового цикла (Ст), на соответствующую каждому инфекционному агенту кривую. В обозначенном выше диапазоне концентраций наблюдали линейную зависимость значений концентраций от порогового цикла.

Аналитическая чувствительность метода, выраженная 95%-м лимитом детекции (минимальное количество вирусных частиц, которое может быть обнаружено с 95%-ной вероятностью) составила 14 gEq HIV-1, 10 gEq (1,7 IU) HBV, и 15 gEq (7,5 IU) HCV на реакцию. Данная характеристика введена, поскольку в н.в. она является общепринятой при разработке и применении real-time PCR. Этот лимит рассчитывали методом пробит-анализа (http://www.statsdirect.co.uk).

Поскольку реакция амплификации выполнялась в две стадии, очевидно, что количество циклов, проведенных в первой ПЦР, будет влиять на результаты определения концентрации, получаемые на второй («количественной») стадии. Приведенные выше результаты являлись воспроизводимыми, если на первой стадии ПЦР выполняли 23-28 циклов амплификации. Уменьшение количества циклов сдвигало

динамический диапазон определения в сторону больших концентраций. Увеличение упомянутого количества циклов приводило к сужению динамического диапазона, не повышая аналитической чувствительности метода.

Способность разработанного метода количественно определять все анализируемые мишени одновременно была продемонстрирована в следующем эксперименте (см. рис. ' 19А). В серонегативную плазму внесли предварительно выделенные образцы НК в следующих концентрациях: 9х103 gEq/mL HCV, 102 gEq/mL HBV и 101 gEq/mL HIV-1. Полученный таким образом образец подвергся последовательной процедуре RT-PCR и real-time on-Chip PCR. Кривые накопления флуоресцентных сигналов соответствовали теоретически ожидаемым, причем признаков интерференции не наблюдали. На врезке рисунка показаны ячейки микрочипа, снятые на 25-м цикле при Т=72°С (стадия достройки праймеров).

А В

о 10 20 30 40 70 80 90 100

Second Stage Cycle Number Temperature (*C)

Рис. 19. Кинетика второй стадии real-time On-chip PCR и кривые плавления специфических гибридизационных комплексов.

A. Результаты мультиплексной амплификации модельного образца, содержавшего 9x103 gEq/mL HCV, 102 gEq/mL HBV и 10' gEq/mL HIV-1 (слева направо, соответственно). На врезанном снимке - флуоресцентная картина, полученная на 25 цикле реакции. Регистрирующие элементы (в центре) содержат праймеры, специфичные к мишеням HIV-1, HBV и HCV (сверху вниз, соответственно). Пологая кривая отражает накопление сигнала в контрольных ячейках, расположенных по периметру.

B. Плавление дуплексов, сформированных иммобилизованными достроенными праймерами и целевыми оц-продуктами ПЦР. На врезке отражены пики Тт.

Специфичность образования гибридизационных комплексов, образованных экстендированными праймерами и амплифицированной меченной мишенью, проверялась плавлением (рис. 19В). Кооперативность плавления и полученные эмпирически значения Тт, соответствующие теоретическим, свидетельствовали о специфичности образовавшихся гибридных комплексов.

В результате выполненной оптимизации были подобраны условия для эффективного проведения real-time On-chip PCR, по чувствительности не уступающей таковой, проводимой «в пробирке».

Резюмируя раздел, необходимо отметить, что ферментативные реакции, проходящие на микрочипе, имеют высокий научно-прикладной и методологический потенциал. При этом пространственное разделение праймеров в ячейках микрочипа потенциально способно решить проблему, ассоциированную с межпраймерным взаимодействием при разработке мультиплексной ПЦР. Необходимо отметить, что использование для иммобилизации предварительно высокоочищенных олигонуклео-тидов (в данном случае — праймеров), позволило ученым ИМБ РАН выполнить на чипе такие реакции, как аллель-специфичная ПЦР или LDR, что не представлялось возможным даже повторить на двумерных микрочипах, использующих технологию синтеза in situ, подразумевающую технологическую негомогенность зонда, а следовательно, и отсутствие специфичности.

3. Разработка специализированных микрочипов

3.1. Метод идентификации микобактерий туберкулезного комплекса с одновременным определением их лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду на олигонуклеотидных микрочипах

Распространение штаммов M.tuberculosis (МТБ), обладающих множественной лекарственной устойчивостью (MDR), т.е. резистентных одновременно к рифампицину (RIF) и изониазиду (INH) — двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам, является одной из основных причин повышения заболеваемости туберкулезом в мире, низкой эффективности лечения и частых неблагоприятных исходов заболевания. Устойчивость возбудителя у впервые выявленных больных в России составляет, по различным источникам, от 10 до 15 %

— к препаратам первой очереди (RIF+INH), и около 2% — к препаратам второго ряда (фторхинолонам). В мире все чаще регистрируют штаммы, обладающие устойчивостью как к препаратам первого и второго рядов, так и к одному из аминогликозидных антибиотиков. У таких штаммов появилось собственное название

— XDR-штаммы (от англ. Extensively Drug-Resistant).

Устойчивость к RIF в 96% случаев обусловлена минорным полиморфизмом в последовательности фрагмента гена гроВ длиной 81 п.о. Устойчивость к INH определяют мутации, расположенные в нескольких генах (katG, inhA, oxyR, ahpC и др.)

Более ста лет «золотым стандартом» лабораторной диагностики туберкулеза являлось классическое сочетание микроскопического и культурального методов исследования. Однако традиционные методы обнаружения возбудителя и определения их лекарственной чувствительности позволяют получить ответ лишь через 610 недель и характеризуются недостаточной чувствительностью. С появлением автоматизированных бактериологических систем это время удалось сократить до 5-6 недель. Тем не менее, и такие сроки определения лекарственной чувствительности МБТ не являются оптимальными, поскольку не позволяют своевременно начать терапию, учитывающую индивидуальные особенности конкретного возбудителя.

По этой причине, разработка экспресс-метода идентификации мутаций, ответственных за устойчивость М. tuberculosis к RIF и INH, представлялась весьма актуальной. Наличие таких методов позволит своевременно корректировать антимикобактериальную терапию и предотвратить дальнейшее распространение полирезистентных штаммов.

В настоящем разделе описан метод идентификации МТБ в клинических образцах с одновременным определением их лекарственной устойчивости к RIF и INH на олигонуклеотидных микрочипах. Разработанный биочип является логическим продолжением ранее созданного биочипа, способного обнаруживать устойчивые к RIF штаммы возбудителя туберкулеза (Mikhailovich et al., 2001).

Поскольку на основе разработанного метода была создана диагностическая тест-система «TB-Biochip (MDR)», успешно прошедшая процедуру государственной сертификации и применяемая уже более чем в 20 противотуберкулезных учреждениях, в дальнейшем будем использовать именно название системы.

Микрочип содержит 80 дискриминирующих иммобилизованных олигонуклеотидов (см. рис. 20 и диссертацию), три маркерные ячейки для позиционирования изображения и 7 резервных ячеек.

Рис. 20. Схема размещения зондов на микрочипе (А) и гибридизационные картины, полученные при анализе образцов ДНК дикого типа (Б) и ДНК, содержащей мутации, приводящие к аминокислотным заменам Ser531>Leu в гене гроВ и Ser 315>Thr в гене katG (В).

• « о ©

й с Ш / Ф 1 •

Ф ф * ш # о |# • § • Ш о!

• • в ' : • •«••ее»

• * « • Ш 9 Ф

• в

Гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотиды, объединены в 23 группы (разграничены на рис. 20А линиями) таким образом, что сравнение интенсивностей флуоресцентных сигналов ячеек внутри каждой группы позволяет сделать заключение о наличии /отсутствии мутации (минорного полиморфизма), приводящей к замене одного аминокислотного остатка.

Черным цветом на рис. 20А обозначены гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотиды, способные формировать совершенные гибридизационные комплексы с ДНК, не имеющей мутаций, в позициях, соответствующих указанным аминокислотным остаткам (или нуклеотидам в промоторной области генов). Серым цветом маркированы ячейки с олигонуклеотидами, формирующими несовершенные 30

12 3 4 5 6 7 8 б

©<§) @<§) #©©©© 0® ® ©©

Wk*)

/ял /^pffc ©©© @©@ (d©®

ф© и

в©©©©©©©

©@@©l©@l@®

ж шш Ш2

©ООООООО©« •

гибридизационные комплексы с ДНК дикого типа, и совершенные — с ДНК, содержащей соответствующую мутацию (тип мутации указан в ячейке).

Ячейки Е8 и К8 содержат олигонуклеотид, комплементарный фрагменту последовательности инсерционного элемента IS6110, который, как правило, присутствует в ДНК микобактерий туберкулезного комплекса.

Определение чувствительности штаммов M.tuberculosis к RIF и INH выполняли двумя способами: с помощью системы «TB-Biochip (MDR)» и стандартным методом. Были проанализированы 72 образца легочного секрета (мокрота, бронхоальвеолярные лаважи, аспираты из бронхов), полученные от 83 больных с различными формами туберкулеза легких и 351 клинический изолят МБТ, выделенных от больных туберкулезом в Москве и Московском регионе.

В качестве стандартного метода определения чувствительности применяли метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена или на жидкой среде Middlebrook 7Н9 с помощью автоматизированной системы Bactec™ MGIT™960. Ддя анализа на плотных средах использовали следующие ингибирующие концентрации: 40 и 80 мкг/мл RIF и 1 и 10 мкг/мл INH.

Подготовку проб для проведения гибридизации на микрочипе осуществляли методом двустадийной мультиплексной ПЦР (Gryadunov et al., 2005). Списки праймеров и зондов приведены в диссертации.

Гибридизацию на микрочипе проводили при 37°С в течение 14-18 часов, используя 12 мкл реакционной смеси, полученной после второй стадии ПЦР, в буфере, конечная концентрация ингредиентов в котором составляла: гуанидина тиоцианата- 1М, HEPES - 50 мМ, рН 7,5, ЭДТА- 5 мМ. По окончании гибридизации микрочип трижды промывали водой при 20°С. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации выполнялась на анализаторе (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) с использованием программного обеспечения ImageWare®.

Примеры гибридизационных картин, полученные для штамма дикого типа (чувствительного к RIF и INH) и штамма, несущего мутации (резистентного к обоим препаратам), представлены на рис. 20 (Б и В, соответственно).

Результаты определения чувствительности разработанного метода в сравнении с традиционным (основанным на культивировании) при анализе клинических образцов и выделенных штаммов М. tuberculosis представлены в табл. 4.

Отметим, что выделенные штаммы были взяты из лабораторной коллекции и никак этиологически не связаны с изученными клиническими образцами. По этой причине совпадение цифр, например, общего количества INH-устойчивых штаммов в табл. 4А и 4В, случайно, и результаты в них никоим образом не следует сопоставлять. Кроме того, из коллекции взяты преимущественно устойчивые к RIF и INH штаммы (как представляющие наибольший интерес), и любые выводы о соотношении устойчивых штаммов к резистентным для популяции неправомерны.

В целом, отмечалась достаточно высокая степень корреляции результатов. По этой причине рассмотрим только противоречивые случаи. Видно, что не все устойчивые к INH штаммы определяются с помощью гибридизационного анализа на микрочипе как при изучении клинических образцов, так и из выделенных культур. Это объясняется отсутствием на микрочипе зондов к ряду редко встречающихся

генетических детерминант. Кроме того, для части штаммов генетическая природа резистентности пока не установлена.

Таблица 4. Результаты определения устойчивости М. tuberculosis к рифампицину (RIF), изониазиду (INH) и к обоим препаратам (MDR) в клинических образцах (А) и в выделенных культурах (В) методом гибридизации и стандартным тестом определения чувствительности к антибиотикам.

Результаты Результаты микробиологического анализа

гибридизации на чипе Кол-во чувств. Кол-во RIF Кол-во INHr Кол-во MDR Всего

Чувствительные * МГ 1Ш' №НЖ 24 0 6 3 27 12 27 6 27 12

Всего В 24 6 30 12 72

Результаты Результаты микробиологического анализа

гибридизации на чипе Кол-во чувств. Кол-во RIF' Кол-во INIf Кол-во MDR Всего

Чувствительные* ЯШ' ШНГ МОК 83 15 2 28 8 215 85 23 28 215

Всего 83 15 30 223 351

* - чувствительные к RIF и INH;' - устойчивые штаммы.

Тем не менее, значения полученных характеристик, сведенных в табл. 5. могут рассматриваться как достаточно высокие, поскольку подавляющее большинство MDR- штаммов методом гибридизации выявляются.

Табл. 5. Диагностические характеристики тест-системы «ТВ-ВюсЫр (М1Ж)» при определении резистентности к рифампицину изониазиду (ПЧН) и к обоим препаратам (MDR-штaммы)■_

Характеристики теста Значения характеристик (%), рассчитанные для

клинических образцов выделенных штаммов

RIF INH MDR RIF INH MDR

Чувствительность 100 90 100 100 93 96

Специфичность 100 100 100 100 100 100

Точность* 100 100 100 100 100 100

ПЗПР** 100 89 100 100 98 91

ПЗОР** 100 94 100 100 98 97

* от англ. «accuracy». ** прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов, соответственно.

Независимые испытания более ранней версии микрочипа, способного выявлять только RIF-устойчивые штаммы, были проведены в 2004 г в лаборатории микобакте-риозов д-ра Т. Shinnick'a в Centers for Disease Control and Prevention (CDC, Atlanta). Результаты испытаний были опубликованы (Shinnick, 2005), показав сравнимые, но несколько меньшие значения характеристик, представленных в настоящей работе. Различия объясняются тем, что за прошедшие пять лет чип был модифицирован (в 32

сторону повышения чувствительности и специфичности анализа). Тем не менее, авторы разработки чрезвычайно признательны коллективу весьма известной в мировом научном сообществе лаборатории, выполнившему независимые испытания.

Теоретически, в настоящей версии тест-система позволяет выявлять около 95% рифампицин- и свыше 80% изониазид-устойчивых штаммов М. tuberculosis. На практике, число определяемых штаммов, устойчивых к изониазиду, выше за счет значительного доминирования определенных типов мутаций (напр., Ser315).

Подтверждением тому могут быть результаты исследования, выполненные на указанной выше выборке. Среди изученных 253 образцов ДНК, выделенных из штаммов, устойчивых к RIF и INH или только к INH, мутации в гене katG обнаружены в 89% случаев, причем наиболее частая замена (77%) зарегистрирована в кодоне, детерминирующем 315-й аминокислотный остаток (Ser315>Thr). Мутации также выявлены в генах inhA и ahpC в 55% и 6% случаев, соответственно. Резистентные к обоим препаратам штаммы (MDR), содержали мутации в гене гроВ в 73% случаев.

Способность метода специфично идентифицировать микобактерии туберкулезного комплекса была оценена тестированием образцов ДНК, выделенных из М. avium, М. intracellular, М. kansasii. Ложноположительных результатов при идентификации IS6110 зарегистрировано не было.

Таким образом, в результате выполненных исследований разработан ускоренный метод идентификации МБТ с одновременным определением их лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду. К существенным преимуществам разработанной процедуры следует отнести возможность выполнения анализа непосредственно из материала клинического образца за короткое время (1 сутки). Применение подобных методов в клинической практике и своевременное назначение адекватной терапии позволят сократить время пребывания пациентов в стационаре, а также пресекать трансмиссивные пути распространения полирезистентных штаммов возбудителя туберкулеза, благодаря их быстрому обнаружению.

3.2. Идентификация возбудителя сибирской язвы и дифференциация его от близких видов рода Bacillus

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis входит в таксономическую группу В. cereus, которая также включает виды thuringiensis, mycoides, cereus, weihenstephanensis и cytotoxicus. Задача своевременного обнаружения В. anthracis и ее дифференциации от непатогенных близких видов бацилл остается весьма актуальной. Основными доводами, подчеркивающими актуальность проблемы являются: а) наличие природных резервуаров возбудителя, ассоциированных с потенциальными вспышками заболеваний скота и персонала, задействованного в работе с ним; б) повышенный и отчасти искусственно спровоцированный нездоровый интерес к возбудителю со стороны террористов, связанный с относительной доступностью инфекционного агента и простотой изготовления из него токсичной и/или инфекционной субстанции, и наличием успешного прецедента применения бактериальных спор в качестве средства биологического терроризма (США, 2001).

Существует два основных молекулярно-биологических подхода для идентификации возбудителя. Первый предполагает обнаружение специфических последовательностей в классически используемых для таксономических целей генах, ответст-

венных за синтез рРНК и гираз (топоизомераз). Во втором случае идентифицируют гены токсинообразования и формирования капсулы (pag, lef, суа и cap).

В данном разделе представлены два способа идентификации В. anthracis на биологических микрочипах, различающиеся как детектируемыми мишенями, так и использованными методическим подходами.

3.2.1. Дифференциация В. anthracis от близких видов методом гибридизации 16S рРНК на биологическом микрочипе

Анализ последовательностей рибосомальных генов в настоящее время является признанным методом идентификации микроорганизмов. Однако в организмах, принадлежащих группе В. cereus, последовательности как 16S-, так и 23 S рРНК чрезвычайно схожи (>99,5%) (Ash et al., 1991, Harrell, et al, 1995).

Выполнив множественное выравнивание доступных к 1998 г. последовательностей, был разработан набор дифференцирующих зондов, позволяющих идентифицировать SNP в 16S рРНК, для идентификации каждого представителя группы (рис. 21).

Рис. 21. Фрагменты последовательности 16S рРНК В. anthracis и комплементарные им зонды, используемые для дифференциации близкородственных бацилл. Нуклеотиды, выделенные цветом, соответствуют SNP в рРНК бацилл, не принадлежащих к виду В. anthracis.

Bacillus anthracis 16S ribosomal RNA gene (AF176321) (Complementary chain)

Pos.# 481 cgacaaccat gcaccacctg tcactctgct cccgaaggag aagccctatc tctagggttg Oligo #26 tctgct cccgaaggag aagc

Oligo 127 tctgcg cccgaaggfjg aagc

Pos. #511 cccgaaggag aagccctatc tctagggttg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct

Oligo #23 tctagggttg tcagaggatg

Oligo #22 tctagggttjj tcagaggatg

Pos.#1321 cataagtgac agccgaagcc gcctttcaat ttcgaaccat gcggttcaaa atgttatccg

Oligo #12 gaaccat gcggttcaaa atg

Oligo #44 gaaccat gcggttcaaa atg

Oligo #17 gaaccat gcggtgcaaaatg

Oligo #9 caat ttcgaaccat gcggtt

Oligo #8 caat ttcgcaccat gcggtt

Oligo #10 gcctttcaat ttcgaaccat

Oligo #11 gcctttgaat ttcgeaccat

Oligo #54 cgaagcc gcctttcaat ttc

Oligo #25 cgaagcc gcctttgaat ttc

Pos. #1441 tcacccgtcc gccgctaact tcataagagc aagctcttaa tccattcgct cgacttgcat

Oligo #1 agctcttaa tccattcgct с

Oligo #41 agctctpaa tccattcgct с

Oligo #4 ccgctaact tcataagagc a

Oligo #4-1 ccgctaact tcttgagagc a

Oligo #15 taact tcataagagc aagct

Oligo #16 taact tcttgagagc aagct

Тотальную РНК (около 1 мкг) фрагментировали радикал-генерирующим комплексом (1,1 o-phenanthroline-Cu(II)), вносящим разрывы в оц-РНК и работающим как сиквенс-неспецифическая «химическая нуклеаза», и метили лизамин-родамин ß-этилендиамином (Molecular Probes, USA), как описано в работе Kelly J., 2002.

Гибридизацию провоВ. csreus 9620 B.cereus Т дили в течение ночи при

____комнатной температуре;

двукратную (по 10 с) отмывку выполняли в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 0,9 M NaCl и 1% Tween 20.

. anthracis Ames Bthuringiersis4Q

В. mycoides 10206

Рис. 22. Результаты гибридизации 168 рРНК бацилл группы В.сегеиз и схема расположения зондов. Описание зондов см. на рис.22

Результаты гибридизации представлены на рис. 22.Из представленных на рисунке диаграмм можно сделать заключение, что при правильно подобранных парах дифференцирующих зондов возможна дифференциация возбудителя сибирской язвы от близкородственных видов бацилл.

В. mycoides 6462

1 2 3 4 5

S1 26 12 44

S2 54 Ж л

S3 ш 1 Ш

S4 10 | ч m

S5 9

S6 s 8

Например, В. тусо1с1е5 без труда дифференцируются парами зондов, расположенных в колонках 1 и 2. Специфичная дискриминирующая пара для В. амИгаж локализована на чипе в ячейках вб-4 и 86-5. Различные комбинации отношений

сигналов олигонуклеотидов, расположенных в колонках 4 и 5, позволяют идентифицировать виды B.thuringiensis и B.cereus.

Специфичность выбранных зондов и воспроизводимость получаемых разработанным методом результатов подтверждается и тем фактом, что, применяя данный чип, можно анализировать смеси рРНК (подробности см. в главе 1.4.З.).

3.2.2. Идентификация Bacillus anthracis методом мультиплексной ПЦР на олигонуклеотидных биочипах

Несмотря на высокие дискриминирующие способности описанного в предыдущем разделе метода, данный подход не лишен общих недостатков, ассоциированных с гибридизационным анализом, главными из которых являются наличие трудоемкого и продолжительного этапа подготовки препарата РНК и длительность проведения эксперимента. По этой причине был разработан иной подход, основанный на ПЦР, а в качестве мишеней, наряду с рибосомальными (16 и 23S рРНК) генами, были выбраны генетические детерминанты патогенности.

В работе использовали выделенную по стандартной процедуре ДНК охарактеризованных в ГНЦ прикладной микробиологии штаммов рода Bacillus.

Около 50 нг выделенной тотальной (хромосомной и плазмидной) ДНК вносили в амплификационную камеру в составе ПЦР-смеси (конечный объем 25 мкл). Детали проведения реакции приведены в работе Грядунов и др., 2001. После амплификации проводили отмывку биочипа в 0,1 М NaCl при 80°С в течение 5 мин. Регистрацию результатов выполняли на флуоресцентном микроскопе, оборудованном CCD-камерой, с помощью программы WinView (Roper Scientific, USA).

Для идентификации видов, входящих в группу В. cereus, был выбран регион 23S рРНК, специфичный для представителей данной группы, соответствующий нуклеотидным позициям 2226 - 2231 (Асс. No AF267876). Для дифференциации В. anthracis были разработаны специфичные праймеры к фрагментам генов pag и lef, ответственных за синтез протективного антигена и летального фактора, соответственно; и к фрагменту гена сарВ, принимающего участие в синтезе капсулы. В дополнение к этим регионам в последовательности 16S рРНК была определена область, в которой присутствуют две точечные видоспецифичные нуклеотидные замены (поз. 933 и 1005, Асс. No AF155950), позволяющие дифференцировать В. anthracis от В. cereus и В. thuringiensis. Для большинства штаммов В. cereus характерно наличие точечной делеции (С) в позиции 933, которой не обладают виды В.anthracis и B.thuringiensis. Точечная нуклеотидная замена С>А в поз. 1005 является видоспецифичной для В. thurinigiensis и некоторых штаммов В. cereus.

В результате настоящей работы был сконструирован биочип, позволяющий дифференцировать В. anthracis от других представителей рода Bacillus методом мультиплексной ПЦР. Структура биочипа представлена на рис. 23А. Праймеры, специфичные к генам pag, lef и сарВ, а также праймер, специфичный для 23S рРНК представителей группы В. cereus, расположены в двух верхних рядах биочипа. Ниже локализованы праймеры, позволяющие дифференцировать виды anthracis, thuringiensis и cereus (а также варианты последнего) по полиморфизму в последовательности гена 16S рРНК. В нижнем ряду ячеек биочипа иммобилизованы праймеры, неспецифичные к роду Bacillus и выполняющие роль отрицательного контроля реакции.

• щ

• »

" £> w В. anthracis Ames

• •

— # -> «

В. anthracis В. cereus В. thuringiensis

770 VR 122 Sotto ТО 4001

Рис. 23. Схема расположения праймеров на биочипе (А) и результаты мультиплексной ПЦР при анализе ДНК В. anthracis CTI-1 (В); В. anthracis Ames (С); В. anthracis 770vr (D); В. cereus str. 122 (E); В. thuringiensis sp. Sotte ТО 4001 (F). Стрелками отмечены ячейки со специфическими гибридизационными сигналами.

Методом ПЦР на биочипе были изучены образцы тотальной ДНК, выделенной из штаммов В. anthracis CTI-1, содержащего плазмиду рХ01 (рис. 23В), В. anthracis Ames с плазмидой рХ02 (рис. 23С) и В. anthracis 770vr, содержащего обе указанные плазмиды (рис. 23D). На рис. 23Е и F представлены результаты, полученные методом мультиплексной ПЦР с тотальной ДНК, выделенной из штаммов В. cereus 122 и В. thuringiensis sp. Sotto ТО 4001.

Интенсивность флуоресцентного сигнала в ячейках с неспецифичными праймерами во всех случаях была близка к интенсивности сигналов в контрольных ячейках нижнего ряда. Сигналы в ячейках со специфичными праймерами превышали контрольные в 3-4 раза.

Результаты идентификации НК бацилл, полученные методом мультиплексной ПЦР на биочипе, показали, что последняя способна специфично выявлять вирулентные штаммы В. anthracis за счет необходимого и достаточного количества мишеней,

Capí

PagJ » •

16Sbl_I •

: ¿: V .

16Sb2_I •

MT2_I f

В.anthracis

CTI-1

E F

tilR ШЁ

ИИИИИ •

— # *

• — •

! ■ é

выбранных на основе их функциональной и таксономической значимости. Совместное применение специфичных и аллель-специфичных праймеров демонстрирует возможность одновременной идентификации как детерминант диагностически важных белков, так и SNP в генах рРНК.

3.3. Идентификация ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину

Вирусы рода Orthopoxvirus подразделяют на 9 видов, 4 из которых могут вызывать заболевания человека различной степени тяжести (Маренникова, 1998). Наиболее опасным представителем данной таксономической группы является вирус натуральной, или черной оспы (variola major), распространение которого было остановлено в 1977 году благодаря программе всемирной ликвидации оспы. Иные представители рода, например, вирус оспы коров, или вирус оспы обезьян (Mukinda et al., 1997) могут также вызывать оспоподобные заболевания у человека, характеризующиеся несоизмеримо более низким процентом летальности.

Актуальность проблемы идентификации возбудителя и дифференциации его от агентов, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину, обусловлена следующими обстоятельствами:

• поскольку обязательная вакцинация отменена, доминирующая часть населения к н.в. не обладает специфическим иммунитетом, и риск возникновения эпидемии при наличии даже спорадических случаев заболевания натуральной оспой весьма велик;

• существуют естественные резервуары близкородственных ортопоксвирусов, и возможность образования новых резервуаров натуральной оспы не отрицается;

• продолжительный инкубационный период (в среднем, 12 дней), высокая контагиозность (передается воздушно-капельным путем), схожие с распространенными болезнями (например, с герпетической инфекцией) клинические кожные поражения на ранних этапах развития заболевания и наличие живых штаммов возбудителя в двух официально зарегистрированных коллекциях (CDC, Atlanta; Центр ВБ «Вектор»), позволяют рассматривать агента как чрезвычайно опасного в случае применения в биотеррористических целях.

Было разработано два биологических микрочипа, позволяющих в короткие сроки а) идентифицировать ортопоксвирусы внутри рода и б) идентифицировать агент и дифференцировать его от иных возбудителей (герпесвирусов и остальных видов рода ортопоксвирусов), вызывающих заболевания, схожие по клинической картине с натуральной оспой.

3.3.1. Видовая идентификация ортопоксвирусов методом гибридизации на биочипе

В качестве мишени для видовой идентификации был выбран фрагмент гена сгтВ (или vTNFR), кодирующий вирусный аналог клеточного рецептора фактора некроза опухолей (TNF).

В табл. 6. приведен список используемых в работе ДНК ортопоксвирусов. В качестве негативных контролей использовали ДНК вируса миксомы кролика, штамм

Lausanne (род Leporipoxvirus), ДНК вируса фибромы Шоупа, штамм Kasza (род Leporipoxvirus) и ДНК вируса оспы кур, штамм FP9 (род Avipoxvirus).

Культивирование ортопоксвирусов осуществлялось в сертифицированной лаборатории Ш-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор» на культуре клеток Vero, выращенных на среде Игла-ДМЕМ с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Монослой клеток инфицировали дозой 0,1-1 вирусных частиц на клетку и инкубировали при 35°С в течение 2-4 дней.

Вид Штамм Ссылка*

ортопоксвируса_

Vaccinia virus Wyeth (10)

LIVP, clone 2 (30)

LIVP, clone 4 (30)

EM-63 (22)

_Rabbitpox Utrecht_(6)

Cowpox virus GRI-90 (20,38)

Hamburg (32)

Turkmenia (21)

Puma M-73 (23)

Brighton (7)

_Elephantpox EP-1 (19)

Monkeypox Congo 8 (26)

virus Zaire 96 (29)

Variola virus Garcia-1966 (39)

_India-1967_(37)

Camelpox virus CP-1 (19)

согласно инструкции изготовителя (Molecular Probes, USA).

Последовательности специфичных олигонуклеотидных зондов выбирали внутри кодирующей части гена сгтВ таким образом, чтобы каждый вариабельный сайт данного участка гена, содержащий точечную замену, короткую делецию или вставку был комплементарен серединной части детектирующего олигонуклеотида.

Микрочип содержал 15 зондов (рис. 24), расположенных в 5-ти колонках, каждая из которых соответствовала отдельному анализируемому участку амплифициро-ванной вирусной ДНК. Внутри каждой колонки только один видоспецифичный зонд способен формировать совершенный дуплекс с препаратом изучаемой ДНК. Гибридизацию и регистрацию результатов проводили, согласно Lapa et al., 2002. На рис. 25 приведены результаты 6-ти часовой гибридизации ДНК ортопоксвирусов (при 37 °С, в буфере, содержащем 0,5 M NaCl). На рис. 24 слева показаны ожидаемые гибридизационные картины для всех анализируемых видов ортопоксвирусов, справа - результаты эксперимента.

Таблица 6. ДНК ортопоксвирусов, использованные в работе. * Ссылки на происхождение штаммов приведены в диссертации.

Фрагмент гена сгтВ длиной 245-273 пар нуклеотидов (варьирует в зависимости от вида (Асс. No U88151)) амлифицировали с помощью праймеров TNFRlf (5'-gct ТСС aga ТТА tgt gat agc aag act А-3') и TNFR3r (5'-ТСС gga tac тсс gta тсс tat tees'). Для проведения асимметричной ПЦР использовали праймер TNFR3r, меченный по 5'- концу флуоресцентным красителем Texas Red®,

Variola

7 П U <1. U U Ü О В Ü a it и и и • • » ■ •

1 4 8 1!

2 5 9 12 14

3 6 10 13 15

Vaccinia

7 . в . .. U •. Ш ; ■ D О ф .. mm •••«•

I 4 8 11

2 5 9 12 14

3 6 10 13 15

Monkeypox

7 <.. .

1 4 8 п а n Я ■ ;

2 5 9 12 14 в • я ■ в

3 6 10 13 15 | а в | О

Rabbitpox

7 Г I г о К D .п ■ п • а а e п т ■ ■ ■

1 4 8 и

2 5 9 12 14

3 6 10 13 15

Cowpox

7 ш 9 * я я > в Ш ш в ■

1 4 8 11

2 5 9 12 14

3 6 10 13 15

Видно, что последние соответствовали ожидаемым. Для проверки специфичности метода проанализировали ДНК контрольных вирусных агентов, не принадлежащих к роду Orthopoxvirus. Не менее 4-х повторных экспериментов для каждого образца было выполнено для проверки воспроизводимости.

Рис. 24. Схема расположения зондов на биочипе; ожидаемые сигналы (слева, закрашены серым) и результаты гибридизации ДНК ортопоксвирусов (справа).

Основными преимуществами разработанного метода являются относительная простота анализа и возможность одновременной детекции необходимого количества локусов в последовательности ДНК ортопоксвирусов. Подобно другим подходам, основанным на ПЦР, в методе отсутствует стадия культивирования вируса, патогенного для человека, и, в то же время, чувствительность позволяет анализировать НК непосредственно из клинических образцов.

3.3.2. Идентификация возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину

В разделе представлен ускоренный метод идентификации возбудителей, основанный на мультиплексной амплификации участков геномов ортопокс- и герпесвирусов с последующей гибридизацией на биологическом микрочипе, и является логическим продолжением работы по видовой дифференциации ортопоксвирусов, изложенной выше. Метод позволяет идентифицировать 6 видов ортопоксирусов и 3 типа герпесвирусов в течение 6 часов.

Видоспецифичные олигонуклеотидные зонды для ортопоксвирусов оставались прежними. Для вирусов простого герпеса (HSV) использовали последовательности гена pol вируса HSV-1 (No. М10792) и HSV-2 (No. М16321), для вируса ветряной оспы (VZV) - последовательности гена pol (No. АВ059830). Последовательности специфичных праймеров для проведения мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидных зондов представлены в диссертации. В работе использовали 15 образцов геномной ДНК VZV, 10 препаратов геномной ДНК HSV и расширенное количество ДНК ортопоксвирусов - 51 образец. 40

Camelpox

1 4 8 11

2 5 ш 12 14

3 6 10 13 15

и я

а 9

Мультиплексную ПЦР, гибридизационный анализ и регистрацию результатов проводили, как указано в (Мызникова и др., 2007). На рис. 25 представлена схема микрочипа и результаты анализа вирусных агентов, вызывающих заболевания, схожие по клиническим признакам с натуральной оспой на ранних стадиях заболевания.

Рис. 25. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биологическом микрочипе (А) и результаты гибридизационного анализа ДНК вирусов натуральной оспы (Б), оспы обезьян (В), (Г), Н8У-2 (Д) и УгУ (Е). Номер внутри ячейки

соответствует номеру олигонуклеотида (см. в диссертации), М - маркерная ячейка, в - ячейки отрицательного контроля.

По техническим причинам, связанным с ограничениями при работе с ортопоксвирусами, идентификацию образцов на биочипах проводили не одновременно с определением традиционными методами. Для идентификации на биочипах лаборатории-коллабораторы предварительно закодировали образцы, сделав их «слепыми». Расхождений в результатах идентификации, полученных методом гибридизации и традиционными методами, отмечено не было (п=76). Специфичность определения была проверена гибридизацией образцов, содержащих геномную ДНК человека и близкородственных агентов - образцов ДНК вируса эктромелии и цитомегаловируса.

К преимуществам разработанного метода относятся возможность одновременного выявления нескольких вирусных агентов и короткое время, необходимое для получения результатов. Существующие аналоги, основанные на ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) могут быть выполнены быстрее, но не позволяют идентифицировать вызывающих схожую клиническую картину вирусы

герпетической группы (Olson V., Panning М, 2004). Традиционные процедуры требуют стадии культивирования вирусного агента и не могут быть отнесены к методам ускоренной лабораторной диагностики. При этом, манипуляции, связанные с культивированием живых вирусов, требуют особых мер безопасности.

Принимая во внимание крайне высокую вирулентность вируса натуральной оспы, учитывая иммунную незащищенность населения к возбудителю и имевшие место прецеденты террористических актов с использованием биологических агентов, наличие ускоренного метода лабораторной диагностики, позволяющего в сжатые сроки подтвердить правильность клинического диагноза, представляется достаточно актуальным.

3.4. Идентификация и количественное определение возбудителей ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови

Своевременное выявление возбудителей инфекционных заболеваний в донорской крови является актуальной задачей в связи с широким распространением ВИЧ-инфекции и трансфузионных гепатитов В и С. В настоящее время донорская кровь проверяется на наличие антител к вирусным и бактериальным антигенам методами иммунологического анализа. Одним из наиболее серьезных недостатков последних является их ограниченное применение в течение так называемого «периода окна» (Chamberland М. et al., 2001) - промежутка времени с момента инфицирования до выработки антител в количестве, достаточном для обнаружения методами иммунодиагностики. Для вирусов иммунодефицита человека «период окна» составляет, в среднем, 21 день, а при гепатите С может достигать полугода. Решение данной проблемы частично достигается карантинизацией, суть которой заключается во введении карантина на использование заготовленной и хранящейся при низких температурах плазмы крови (6 мес.) до повторного анализа сыворотки донора. К сожалению, процедура ассоциирована с рядом проблем: в худшую сторону изменился контингент доноров, более трети из которых повторно не приходят на донорский пункт (неопубл. данные, 2008 г.), и полученная от них плазма подлежит уничтожению; далеко не все пункты сдачи и переливания крови способны обеспечить необходимые условия для проведения карантинизации, главным из которых является наличие достаточного количества низкотемпературного оборудования. Решение перечисленных проблем видится, в первую очередь, в возрождении донорства как государственного института, адекватной государственной финансовой поддержке учреждений переливания и заготовки крови, обеспечении разумно действующей нормативно-правовой базы, а также внедрением современных методов лабораторного контроля, основанных на прямой идентификации НК. Эти методы отличаются высокой чувствительностью, способны применяться в период серонегативного окна, а их комбинирование с традиционными серологическими методами позволит выбраковывать заражённую кровь на самых ранних этапах.

В настоящем разделе описан метод real-time On-Chip PCR для количественного определения НК HIV-1, HBV и HCV в образцах плазмы крови человека.

Метод включает два этапа: а) стадию мультиплексной предамплификации, совмещённую с обратной транскрипцией - RT-PCR и б) стадию мультиплексной real-time On-Chip PCR.

г*

1 г fi

g 8,5

S s,о

ï 5,5

i «,5 ï *,d

Ь 3,5

|м

ï 2,5

I 2.0

11,51 1,0

HIV-1 n-52

r'«o.îs

y« 1.05X-4.26

1,0 1JS

-r-*

J.0

-T-1

3,5 40 4Д 5,0 J,S $.0 6,5 T,0 концентрация HK (коим. твст^ист,}, 1од(ГЗквЛ|л)

Т-»

5,5

HCV n-SO R1 * 0.97 y ■ 0-ЭЕх + 0.1*

Рис. 26. Сравнительный анализ систем количественного определения возбудителей гемотранс-миссивных инфекций: HIV-1; HCV и HBV (сверху вниз, соответственно).

Принцип количественной идентификации, генетические мишени для идентификации и структура биочипа подробно описаны выше в гл. 2.2.2.

Всего было проанализировано 132 серологически охарактеризованных образца плазмы крови человека, полученные из лаборатории клинико - вирусологической диагностики гепатитов и СПИД ГНЦ РАМН. Количественные стандарты (см. главу 2.2.2.), были любезно предоставлены д-ром J.Izopet (Centre Hospitalier Universitaire Purpan, Toulouse). В качестве референс-методов использовали наборы реагентов Qiagen, Германия, ДНК-Технология, Россия. Измерения производили на приборах RotorGene 3000 (Corbett Research, Australia) и m2000 (Abbott, USA) на базе Московского городского центра профилактики и борьбы со СПИДом (ДЗ г.Москвы) и в ГНЦ РАМН.

На изученной выборке были получены следующие результаты:

Уровень вирусной нагрузки для 32 образцов, содержащих HIV-1

(выражена в gEq на 1 мл исходного образца), находился в пределах от 60 до 4,2 хЮ7 gEq/mL. Менее 1000 gEq/mL содержали пять образцов.

I w

1м

I 6.0 I Si

I 5,0

I 4,5

S 4,0 X 3,5 | 3fl

1 M i 2,0

2,0 2,S

—Г" «

—I—' <,0

т-

ifi 1,0 S,1 С,0 <,5 кбицонтриция НК (комм. т*сг-«ист.), |_ов(гЭк»/мл)

R*"0,9» у » 1.01x4.010

-г-<

6,0

т—

1,0

„ 7.5-,

I 7,0

| 5,5

f M

f? 5.5

| 5,0

I 4,9 S

Ï 4,0 g ,.5 «W

| 2,5

I 1,5

I ' I 8,0 >,5

T"i

1,0 1.5 2,0 2.5 3,0 i.8 4,0 4,5 5.0 5.5 0.0 S,5 концентрация HK {kouu. т«ет-саст.}, 1.од(гЭкв/Ш|}

0.0

"Ti 7,0

7,S

Из 58 образцов, содержащих вирус гепатита В, 11 имели концентрацию мишени менее 1000 gEq/mL, 7 - более 107 gEq/mL. Минимальная определённая концентрация ДНК HBV составила 50 gEq/mL.

Из 50 проанализированных образцов плазмы крови, содержащих вирус гепатита С, минимальная концентрация РНК HCV составила 550 gEq/mL, 9 образцов имели концентрацию менее 1000 gEq/mL, 4 образца - более 107 gEq/mL.

В четырёх из 22 образцов, содержащих как вирус гепатита С, так и ВИЧ, и в одном образце из двух, содержащих все три вируса, разница в концентрациях вирусных частиц составляла более четырёх порядков. Расхождения значений концентраций, полученные в трёх экспериментах для каждой мишени, составили не более одного порядка, что свидетельствует о воспроизводимости результатов количественного анализа.

Серонегативные образцы плазмы крови человека (п=18) были проанализированы в качестве отрицательного контроля реакции. Ложноположи-тельных результатов не зарегистрировано.

В дополнение к проведённым исследованиям, 20 образцов были зашифрованы и протестированы в формате «слепого» эксперимента. Все серопозитивные образцы были определены разработанным методом корректно, при этом, для отрицательных образцов специфической амплификации не наблюдали. Полученные высокие результаты чувствительности и специфичности, очевидно, объясняются малой выборкой использованных в эксперименте образцов. На большей выборке эти показатели могут быть определены более точно.

На рис. 26 показана корреляция значений концентраций НК HIV-1, HCV и HBV в плазме крови, определённых методом real-time On-Chip PCR и с помощью коммерческих тест-систем (см. выше). Значение R2 для корреляции по HIV-1 (R2=0,95) несколько ниже, чем для HCV и HBV (0,97 и 0,98, соответственно), что, очевидно, объясняется большей вариабельностью генома HIV-1, и, как следствие, менее специфичным взаимодействием праймеров. Допускаем, что после проведения анализа всех существующих генотипов вируса иммунодефицита человека возможна некоторая модификация праймерной системы, что, тем не менее, не внесёт принципиальных изменений в общую концепцию метода.

Таким образом, разработанный метод real-time On-Chip PCR, в котором используется только один флуоресцентный краситель, был применён для одновременной количественной идентификации вирусных НК в образцах плазмы крови. Чувствительность и специфичность системы составили 100% (на выборке из 132 образцов), пределы количественного определения (с вероятностью обнаружения 95%) составили 14,10 и 15 геном-эквивалентов для HIV-1, HBV и HCV, соответственно.

3.3.5. Разработка биологических микрочипов для выявления мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы и результаты их применения

При отсутствии средств специфической профилактики ВИЧ-инфекции, на первый план выходит противовирусная терапия. К 2004 году в нашей стране имелось 17 препаратов, разрешенных к применению для лечения инфекции, вызываемой ВИЧ-1 (Покровский, 2003). Эти вещества способны подавлять размножение вируса,

воздействуя на один из двух вирусспецифических ферментов - обратную транскриптазу (ревертазу) или протеазу.

Важнейшей проблемой, снижающей эффективность применения противо-ретровирусной терапии, является приобретение вирусом устойчивости к действию лекарственных средств, и в первую очередь, к ингибиторам вирусных протеаз. Известно, что эта устойчивость ассоциирована с возникновением мутаций в гене pol ВИЧ. Отмечается увеличение доли штаммов, несущих такие мутации, в вирусной популяции, и возникает серьезная опасность возникновения вариантов ВИЧ, обладающих множественной устойчивостью. По этой причине является очевидным, что информация о генетических вариантах ВИЧ, несущих мутации устойчивости, крайне необходима как при выборе схемы лечения каждого отдельно взятого пациента, так и для оценки устойчивости вирусной популяции в регионе в целом.

В настоящем разделе описан способ идентификации мутаций в гене pol ВИЧ-1 методом гибридизации на биологическом микрочипе и результаты его практического применения на примере крупномасштабного скрининга вариантов ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующих среди наркоманов и их половых партнеров в различных регионах России и других республик СНГ, на наличие мутации Val77>Ile. В связи с этим, представляло интерес выяснить время и место первого появления варианта ВИЧ-1, содержащего мутацию Val77>Ile, а также более подробно изучить географические направления его распространения среди наркоманов в странах бывшего СССР.

Был сконструирован биочип для выявления 34 мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы, и разработан метод, в основе которого лежит гибридизация флуоресцентно меченного амплифицированного участка гена pol провирусной ДНК ВИЧ-1 с набором специфичных олигонуклеотидов, иммобилизованных в трехмерных ячейках биологического микрочипа.

Для выбора специфичных олигонуклеотидов для иммобилизации выполнили анализ последовательности положительной цепи гена pol вирусного штамма НХВ2 (Асс. No К03455) и множественное выравнивание последовательностей гена pol изолятов с территорий стран бывшего СССР.

На рис. 27А представлена картина гибридизации амплифицированного участка гена pol ДНК одного из клинических образцов. Полученная картина позволяет заключить, что в исследуемой области гена данного штамма содержится только одна мутация (Met36>Ile), что подтверждено результатами секвенирования.

При анализе 92 образцов ДНК ВИЧ-1 подтипа А, выделенных от наркоманов и их половых партнеров, инфицированных ВИЧ-1 в 14 географических регионах России, Украины и Казахстана, все пробы, содержащие замену 77Val>Ile, демонстрировали схожие друг с другом гибридизационные картины, пример которой приведен на рис. 28Б. Данные о распространении мутации 77Val>Ile в различных регионах России и сопредельных странах были обработаны специалистами из лаборатории А.Ф. Бобкова (Суханова А., Казеннова Е., 2003), что позволило сделать ряд важных эпидемиологических заключений о возникновении ВИЧ-инфекции в РФ и соседних странах, а также спрогнозировать пути распространения инфекции.

Схема чипа и порядок проведения реакции приведены в работе НоисНпвку е/. а!., 2004.

*- ^ • • *

* •' Ш ф $ « ♦ ® # Ц

• *

• ш ш

• •

• Ф т

1» »']

« т % • • •

• щ

• •

• »*

• • в • # в

• • т

♦

• • •

♦

Рис. 27. Гибридизационные картины, полученные при анализе образца ДНК с заменой Ме136>11е (А) и с двумя заменами Ме136>11е и Уа177>11е (Б) (релевантные дискриминирующие пары ячеек обведены в рамки).

Таким образом, наряду с традиционным определением нуклеотидных последовательностей, в распоряжении специалистов появился альтернативный метод, основанный на технологии биологических микрочипов, который впервые в нашей стране был применен для идентификации лекарственной устойчивости ВИЧ-1.

3.3.6. Разработка биологического микрочипа для типирования вируса гриппа А

Вирусы гриппа вызывают заболевания различной степени тяжести у миллионов людей, ежегодно являясь причиной около 500 тысяч смертельных исходов (Nicholson et ed., 2004). Исходя из антигенных свойств двух поверхностных гликопротеинов -гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), вирусы серологически разделяют на подтипы: к настоящему моменту известно 16 подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9) (Fouchier R.,2005). Вирусы всех перечисленных подтипов могут быть обнаружены в популяциях диких водоплавающих птиц, являющихся естественным резервуаром инфекции. В отличие от птиц, для человеческой популяции характерна циркуляция штаммов, имеющих только 3 подтипа НА (Н1-НЗ) и 2 подтипа NA (N1, N2). Необходимо отметить, что в последние годы отмечается увеличение количества случаев заражения человека различными подтипами вируса гриппа А, включающими H7N7, H7N3, H9N2 и H5N1, ранее не характерными для человеческой популяции.

В 1997 г. в Гонконге впервые зафиксированы случаи заражения человека подтипом H5N1, причем из 18 заболевших погибли пятеро. В 2004 г. вирус «птичьего» гриппа (H5N1) стал причиной новых случаев заболевания в странах Азии, гибели 60 человек во Вьетнаме, Таиланде, Камбодже, Индонезии, и уничтожения 150 млн домашних птиц. По данным ВОЗ, только в первом квартале в 2009 г. было

зарегистрировано 20 подтвержденных случаев заболевания человека данным подтипом, 9 из которых закончились летальным исходом.

В 2009 г. вновь возникший вариант вируса «свиного» гриппа H1N1 за несколько месяцев унес жизни 86 человек, К концу мая были подтверждены более 11000 случаев заражения, а ареал распространения штамма покрыл территории 42 государств.

В настоящий момент представляется затруднительным объективно оценить пандемический потенциал вирусов «птичьего» и «свиного» гриппа, однако именно эта непредсказуемость требует разработки высокочувствительных надежных экспресс- методов идентификации вирусного подтипа.

В настоящем разделе представлен метод молекулярного типирования вируса гриппа А, на основе гибридизации амплифицированных фрагментов генов НА и NA на биологическом микрочипе. Разработанный подход позволяет идентифицировать 15 подтипов НА и 2 наиболее распространенных подтипа NA, выявляя как ассоциированные с человеческой популяцией вирусы (H1N1, H3N2), так и не рассматриваемые ранее как патогенные для человека вирусы гриппа А, включающие штаммы с антигенными комбинациями H5N1, H1N1, H7N1, H9N2 и др.

Охарактеризованные референс- штаммы вируса гриппа А (п=18) были получены из музея Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (Табл.9). Вирусы гриппа культивировали в 10-дневных куриных эмбрионах. Количество вирусных частиц оценивали с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Для исследования использовали штаммы с титром не менее чем 1/32. Аликвота каждого образца (200 мкл) была использована для выделения РНК с помощью коммерческого набора («НАРВАК», РФ), либо TRI® Reagent (Sigma, USA), согласно инструкциям производителей.

Подготовку образцов для гибридизации на микрочипе осуществляли в 2 стадии, применяя формат semi-nested PCR. Реакцию проводили, как описано в работе Fesenko et al., 2007. На первой стадии проводили синтез кДНК и совместную амплификацию участков НА- и NA- сегментов с использованием 2-х пар праймеров: rl73ha 5'-AGA AAC AAG GGT GTT TT-3' и f817ha 5'-GGA ATG ATH GAY GGN TG G TAT GG-3' (H(A,C,T),Y(C,T)); R556na 5'-AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT-3' и F552na 5'-TGT GTT TGC AGA GAT AAT TGG-3" (продукты 640 и 600 пар оснований для НА- и NA- сегментов, соответственно). На 2-й стадии использовали праймеры R173ha* и F 170ha 5'-ТТТ GAA TTC TAC САС AAG TGT GA-3' для НА сегмента, R556na* и F551na 5'-ATG GTG TTT GGA TGG GAA GAA C-3' - для NA сегмента с получением продуктов амплификации длиной 300 и 390 оснований, соответственно. Обратные праймеры для 2-й стадии R173ha* и R556na* на 5'-конце содержали флуоресцентную метку IMD-504.

Микрочип для типирования вируса гриппа А включает 47 гелевых элементов (Рис. 28). Гелевые элементы, содержащие олигонуклеотиды для определения каждого подтипа, объединены в группы (на рис. обведены в рамки). Ряды B-G содержат олигонуклеотиды для типирования подтипов гемагглютинина; ряды H и I - для нейрамини-дазы. Список зондов приведен в диссертации. Гелевые элементы Al, Jl, J7 содержат флуоресцентный маркер для автоматической обработки гибридизационной картины, выполняемой программным обеспечением. Ячейки F4-F6 не содержат олигонуклео-тидов и служат в качестве контроля фонового сигнала. Количество олигонуклеотидов, используемых для определения конкретного подтипа, отличается и зависит от числа обнаруженных консервативных участков в его амплифицируемой области.

Таблица 9. Референс-штаммы вируса гриппа А, использованные в исследовании.

Штамм Cepo-ТИП Код штамма Идентификационный номер в GenBank

AAVSN/33 H1N1 GB33 J02176

A/USSR/90/77 H1N1 USSR77 X00027

A/Puerto Rico/8/34 H1N1 PR34 ISDN 13422

A/Brazil/I 1/78 H1N1 Bra78 X86657

A/Pintail Duck/Primorie/695/76 : H2N3 avPrimorie76 i 5'mF290442

A/Laughing gull/New Jersey/75/85 H2N9 avNJ85 AF116201

A/duck/Ukraine/1/63 H3N8 avllkr63 V01087

AA'ictoria/3/75¿.»й ....... H3N2 ........ Aus75 V0I0S6

A/Engl and/42/72 H3N2 Eng72 AF201875

A/Udorn/307/72 H3N2 Udorn72 M54895

A/Duck/CzechosIovakiW56 H4N6 avCzech56 AF290436

A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84 H5N2 avPen84 AF100180

А/Duck/ Ho Chi Minh/14/78 H5N3 avHo78 AF290443

........................... S'»-: i-Wihh-i H7N1 Rost34 Я^Д:; M24457

A/FPV/Weybridge/34 H7N7 Wey34 L37794

A/Swine/Hong Kong/9/98 H9N2 swHK98 AY428485

* A/Chicken/Geraiaiy/49' H10N7 avGer49 li™: «№I647f,;;H

A/Pilot whale/Maine/328/84 H13N2 wMaine84 M26091

Рис. 28. Структура биочипа для типирования вируса гриппа А.

Во многих случаях для идентификации всех возможных вариантов подтипа в границах одного консервативного участка требовались не один, а несколько олигонуклеотидов близкой, но не тождественной последовательности. Олигонуклеотиды были подобраны таким образом, чтобы исключить перекрестное взаимодействие изучаемых мишеней, принадлежащих различным подтипам. Исключение составляют ЕЗ, комплементарный вариантам 7-го, 10-го и 15-го подтипов гемагглютинина, и С5, комплементарный вариантам 3-го и 4-го подтипов. При гибридизации в пределах одной группы ячеек совершенных комплексов может образоваться несколько. В остальных группах ячеек образуются несовершенные гибридизационные комплексы, которые ввиду своей термодинамической нестабильности не приводят к значимому накоплению флуоресцентного сигнала. Таким образом, выбирается максимальный сигнал внутри каждой группы. Сравнение максимальных сигналов групп позволяет сделать заключение о принадлежности исследуемого штамма к тому или иному подтипу.

Для оценки эффективности разработанного метода были проанализированы образцы РНК, выделенные из 18 референс-штаммов. Результаты анализа во всех 48

1 2 3 4 5 6 7

случаях полностью совпали с данными определения вирусного подтипа традиционными иммунологическими методами.

На рисунке 29 приведены примеры результатов гибридизации на биочипе фрагментов генома референс- штаммов, выделенных в различных регионах и в разное время. Следует подчеркнуть, что при анализе всех 18 штаммов, выделенных из материала различных хозяев (птиц, человека или животных), не было отмечено перекрестного взаимодействия, когда флуоресцентный сигнал наблюдался бы в нескольких группах НА- (либо ЫА-) кластера биологического микрочипа.

Помимо типирования предварительно культивированных на куриных эмбрионах референс-штаммов, был успешно выполнен анализ 10 образцов РНК, выделенных из суспензии внутренних органов домашних птиц, погибших в период эпизоотии в Новосибирской области в июле 2005 года.

В отличие от применяемых ныне серологических методов и стандартной ПЦР, очевидным преимуществом разработанного подхода является возможность определения подтипа вируса гриппа А при проведении лишь одной реакции, что, безусловно, сокращает общее время анализа и позволяет получить результат, минуя трудоемкую и продолжительную стадию культивирования вирусного агента.

1 2 3 4 5 6 7

•

• " *—

• • 1 • »: ]

• •

Н1

(а)

1 2 3 4 5 6 7

Н4

• • • [

• •

(с)

Рис. 29. Гибридизационные картины, полученные при анализе референс- штаммов вируса гриппа А: А/и88Ш90/77/НШ1 (а), А/Лиск/Сгес1юз1оуа1«а/56/Н41Ч6 (Ь), А/8\™еЛ-кящ Ко^/9/98/Н9Ы2 (с)

Разработанный метод позволяет в короткие сроки идентифицировать подтип вируса гриппа А из полевого материала, включая таковой, полученный от птиц с клиническими симптомами острой инфекции. Применение данного подхода может способствовать лучшему пониманию механизмов возникновения и течения эпидемий, осуществлять мониторинг за циркуляцией возбудителя инфекции, своевременно проводить противоэпидемические мероприятия и создавать требуемые вакцины.

Заключение

В настоящей работе мы реализовали часть потенциальных возможностей олигонуклеотидных микрочипов. Был разработан метод гибридизации амплифици-рованных фрагментов НК. Впервые продемонстрированы преимущества практического применения биочипов на примере разработанных четырех тест-систем, разрешенных к использованию в учреждениях здравоохранения. Разработан ряд новых подходов, эффективно сочетающих в себе специфичность и высокую процессивность энзиматических реакций с многопараметрическим микроформатом анализа на олигонуклеотидном микрочипе.

Было показано, что теоретически обоснованное и методически верно выполненное конструирование олигонуклеотидных зондов вкупе с тщательно подобранными условиями гибридизационного анализа позволяют с высоким уровнем надежности дифференцировать гибридизационные комплексы, имеющие минимальные отличия, вплоть до точечных нуклеотидных замен. Данный подход был рационально применен для идентификации тех молекулярных мишеней, выявление которых иными средствами не выглядит целесообразным, например, ассоциировано с недостаточной чувствительностью, большими трудо- или временными затратами и др.

Последовательная разработка методов, начиная с гибридизационного анализа и заканчивая (к настоящему моменту) количественной амплификацией с регистрацией результатов в режиме реального времени, дает все основания полагать, что биологические микрочипы в самом ближайшем будущем могут стать признанным конкурентоспособным инструментом для проведения многопараметрического анализа в различных областях современной биологии и биомедицины.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный способ идентификации функционально и таксономически значимых участков бактериальных и вирусных нуклеиновых кислот методом гибридизации на биологическом микрочипе, включающий рациональные способы подготовки пробы, введения в нее флуоресцентной метки, конструирования набора дискриминирующих олигонуклеотидов и интерпретации результатов анализа;

2. Разработаны ферментативные методы анализа на микрочипах: PCR, AS-PCR, LDR и количественная PCR в режиме реального времени;

3. Разработан ряд специализированных методов на биологических микрочипах для:

• выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду;

• идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus-,

• идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину;

• идентификации и количественного определения возбудителей ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови;

• обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз;

• определения субтипов вирусов гриппа А.

4. На основе разработанных методов созданы 4 тест-системы, которые проведены через процедуру государственной сертификации. Тест-система для идентификации M.tuberculosis с одновременным определением устойчивости возбудителя к рифампицину и изониазиду внедрена и успешно применяется в 20-ти лечебно-профилактических учреждениях практического здравоохранения РФ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Михайлович В.М., Заикин В.Д., Мазурова И.К. Применение метода ДНК-ДНК гибридизации для изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae. Мол. генетика, микробиол., вирусолог. 1994. Т.6. С. 27-29.

2. Mikhailovich, V.M., Melnikov, V.G., Mazurova, I.K., Wachsmuth, I.K., Wenger, J.D., Wharton, M., Nakao, H. and T. Popovic. Application of PCR for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheriae epidemic, 1990 through 1994. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: 3061-63.

3. Strizhkov, B.N., Drobyshev, A.L., Mikhailovich, V.M., and A.D. Mirzabekov. PCR amplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. BioTechniques 2000; 29:844-857.

4. Mikhailovich, V., Lapa, S., Gryadunov, D., Sobolev, A., Strizhkov, В., Chernyh, N., Skotnikova, O., Irtuganova, O, Moroz, A., Litvinov, V., Vladimirskii, M., Perelman, M., Chernousova, L., Erokhin, V., Zasedatelev, A., and A. Mirzabekov. Identification of Mycobacterium tuberculosis strains resistant to rifampin by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 2531-40.

5. Gryadunov D. A., V. M. Mikhailovich, A. N. Noskov, S. A. Lapa, A. Yu. Sobolev, S. V. Pan'kov, A. Yu. Rubina, A. S. Zasedatelev, and A. D. Mirzabekov. Detection of Bacillus anthracis using multiplex PCR on the oligonucleotide biochip. Doclady Biochem. Biophys. 2001; 381(2): 265-267

6. Скотникова О. П., Заседателев А. С., Михайлович В. М., Соболев А. Ю., Исаева Е. Л., Грядунов Д. А., Лапа С. А. Методы выявления мутаций и результаты их использования. В кн. Лабораторная диагностика туберкулеза. Под ред. Литвинов В.И., Мороз A.M., Москва, Медицина и жизнь, 2001. С. 91-115.

7. Lapa S., М. Mikheev, S. Shchelkunov, V. Mikhailovich, A. Sobolev, V. Blinov, I. Babkin, A. Guskov, E. Sokunova, A. Zasedatelev, L. Sandakhchiev, and A. Mirzabekov. Species-level identification of orthopoxviruses with an oligonucleotide microchip. J. Clin. Microbiol. 2002: 40: 753-757.

8. Васильева И.А., Черноусова Л.Н., Заседателев A.C., Михайлович В.М. Клиническое значение микрочиповой технологии определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. Проблемы туберкулеза. 2002. Т.6. С.21-24.

9. Скотникова, О. И.; Соболев, А. Ю.; Михайлович, В. М.; Грядунов, Д. А.; Иртуганова, О. А.; Носова, Е. Ю.; Исаева, Е. Л.; Лапа, С. А.; Заседателев, А. С.; Литвинов В.И., Мороз, А. М.; Мирзабеков, А. Д. Молекулярно-генетические методы выявления рифампицинрезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis. Вестник Росс. акад. мед. наук. 2002. Т.2. С.36-39.

10. Михайлович, В. М., Лапа, С. А. Грядунов, Д. А. Стрижков, Б. Н. Соболев, А. Ю. Скотникова, О. И. Иртуганова, О. А. Мороз, А. М. Литвинов В.И., Шипина, Л. К. Владимирский, М. А. Черноусова, Л. Н. Ерохин, В. В. Мирзабеков, А. Д. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микрочипе для обнаружения римфамцин-резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis. Бюлл. эксперимент, медицины. 2003. Т.131(1). С. 94-98.

11. Скотникова, О. И.; Носова, Е. Ю.; Маркова, О. В.; Иртуганова, О. А.; Круду, В. Н.; Гинда, С. С.; Голшцева, О. В.; Бирюкова, М. Н.; Стрельцова, Е. Н.; Калянина, О. В.;

Литвинов В.И., Мороз, А. М.; Лапа, С. А.; Грядунов, Д. А.; Михайлович, В. М. Типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, с помощью молекулярно-биологических методов. Бюлл. эксперимент, медицины. 2003. Т.136 (3). С. 273-275.

12. Грядунов Д.А., Михайлович В.М., Лапа С.А., Рудинский Н.И., Барский В.Е., Чудинов А.В., Заседателев А.С., Мирзабеков А.Д. Идентификация штаммов Mycobacterium tuberculosis с одновременным определением их лекарственной устойчивости методом гибридизации на олигонуклеотидных микрочипах. Мол. генетика, микробиол., вирусолог. 2003. Т.4. С.24-27.

13. Михеев М. В., Лапа С. А., Щелкунов С. Н., Чикова А. К., Михайлович В. М., Соболев А. Ю., Бабкин И. В., Грядунов Д. А., Булавкина М. А., Гуськов А. А., Сокунова Е. Б., Кочнева Г. В., Блинов В. М., Сандахчиев Л. С., Заседателев А. С., Мирзабеков А. Д. Видовая идентификация ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах. Вопр. Вирусол. 2003. Т.48(1). С.4-9.

14. Rubina A.Yu., Pan'kov S.V., Dementieva E.I., Pen'kov D.N., Butygin A.V., Vasiliskov V.A., Chudinov A.V.,. Mikheikin A.L., Mikhailovich V.M, Mirzabekov A.D. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Anal. Biochem. 2004; 325: 92-106.

15. Колчинский A. M., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П., Михайлович В. М.,. Наседкина Т. В, Турыгин А. Ю.,. Рубина А. Ю, Барский В. Е.,. Заседателев А. С. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. Мол.екулярная биология. 2004. Т. 38, 5-16.

16. Скотникова, О. И.; Михайлович, В. М.; Носова, Е. Ю.; Лапа, С. А.; Грядунов, Д. А.; Донников, М. Ю.; Бадлеева, М. В.; Галкина, К. Ю.; Дорожкова, И. Р.; Литвинов В.И., Заседателев, А. С.; Мороз, А. М.; Мирзабеков, А. Д. Новые технологии определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis. Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. Т.6. С.40-42.

17. Roudinskii, N.I., Sukhanova A.L., Kazennova E.V., Weber J.N., Pokrovsky V.V., Mikhailovich V.M., Bobkov A.F. Diversity of human immunodeficiency virus type 1 subtype A and CRF03_AB protease in Eastern Europe: selection of the V77I variant and its rapid spread in injecting drug user populations. J. Virol. 2004; 78(20): 11276-87.

18. Рудинский Н.И., Михайлович B.M., Донников М.Ю., Лапа С.А., Суханова А.Л., Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Заседателев А.С., Покровский В.В., Мирзабеков А.Д. Разработка биологических микрочипов для выявления мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы и результаты их применения. Вопр. Вирусол. 2004, 6. -С.10-15.

19. Суханова А.Л., Казеннова Е.В., Рудинский Н.И., Михайлович В.М., Грядунов Д.А., Будилов А.В., Булавкина М.А., Weber J.N., Покровский В.В., Бобков А.Ф. Генетическая изменчивость области, кодирующей протеазу, у изолятов ВИЧ-1 подтипа А и рекомбинантов CRF03_AB на территории СНГ: возникновение и быстрое распространение варианта с заменой V77I. 2004, Вопр. Вирусол. -№ 6. -С.4-9

20. Gryadunov D, Mikhailovich V, Lapa S, Roudinskii N, Donnikov M, Pan'kov S, Markova O, Kuz'min A, Chernousova L, Skotnikova O, Moroz A, Zasedatelev A, Mirzabekov A. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2005; 11(7):531-9.

21.Мызникова А. И., Файзуллин Л.З., Захарова Н.В., Грядунов ДА., Володин Н.Н., Барский В.Е., Михайлович В.М. Олигонуклеотидные биочипы в диагностике нео-натальных вирусных инфекций. Вопросы практической педиатрии. 2006; 1 (3): 61-64.

22. Мызникова А.И., Лапа С.А., Грядунов Д.А., Ходаков Д.А., Заседателев А.С., Михайлович В.М. Биологический микрочип для идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину. Вопросы вирусол. 2007. Т.2. С. 41-45.

23. Fesenko, Е. Е., Kireyev, D. Е., Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V. М., Grebennikova, Т. V., L'vov, D. К., and Zasedatelev, A. S. 2007. Oligonucleotide microchip for subtyping of influenza A virus. Influenza and Other Respiratory Viruses: 1(3): 121-129.

24. Кузнецова B.E., Василисков B.A., Антонова O.B., Михайлович В.М., Заседателев

A.С., Чудинов А.В. Новые индодикарбоцианиновые красители для технологии биологических микрочипов. Биоорганическая химия, 2008 34(1): 141-144.

25. Антонова О.В., Д.А.Грядунов, С.А.Лапа, А.В.Кузьмин, Е.Е.Ларионова, Т.Г.Смирнова, Е.Ю.Носова, О.И.Скотникова, Л.Н.Черноусова, А.М.Мороз, А.С.Заседателев,

B.М.Михайлович. Выявление мутаций в геноме Mycobacterium tuberculosis, приводящих к устойчивости к фторхинолонам, методом гибридизации на биологических микрочипах. Бюлл. Эксперимент. Биологии и Медицины 2008; 145 (1): 115-120.

26. Львов Д. К., Щелканов М. Ю., Власов Н. А., Прилипов А. Г., Дерябин П. Г., Федякина И. Т., Галкина И. В., Забережный А. Д., Ляпина О. В., Шляпникова О. В., Киреев Д. Е., Фесенко Е. Е., Калмыков М. В., Виткова О. Н., Морозова Т. Н., Прошина Е. С., Гребенникова Т. В., Аканина Д. С., Самохвалов Е. И., Альховский С. В., Волков В. А., Семенов В. И., Гапонов В. В., Шмаков Н. И., Кушнир А. Т., Казарян А. С., Стариков Н.

C., Петренко М. С., Славский А. А., Литвин К. Е., Щербакова Л. О., Фролов А. В., Манин Т. Б., Уманец О. А., Бандеев В. В., Хван А. М., Дунаев В. Г., Челедина Т. П., Абгарян С. Р., Михайлович В. М., Заседателев А. С., Любченко Е. Н., Флягин В. Н., Тихонова И. Ф., Маслов Д. В., Ананьев В. Ю., Баранов Н. И., Гореликов В. Н., Яковлев С. С., Алипер Т. И., Непоклонов Е. A., Suarez D. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа А / H5N1 на Дальнем Востоке. Вопросы вирусологии. 2008; №5, стр. 4-9.

27. Mikhailovich V, Gryadunov D, Kolchinsky A, Makarov AA, Zasedatelev A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. Bioessays, 2008; 30(7):673-682.

28. Bavykin SG, Mikhailovich VM, Zakharyev VM, Lysov YP, Kelly JJ, Alferov OS, Gavin IM, Kukhtin AV, Jackman J, Stahl DA, Chandler D, Mirzabekov AD. Discrimination of Bacillus anthracis and closely related microorganisms by analysis of 16S and 23S rRNA with oligonucleotide microarray. Chem Biol Interact. 2008; 171(2):212-35.

29. Khodakov D., Zakharova N., Gryadunov D., Filatov F.P., Zasedatelev A., V. Mikhailovich. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-l, HBV, and HCV. Biotechniques, 2008; 44: 241-8.

30. Мызникова А.И., Захарова H.B., Грядунов Д.А., Чудинов А.И, Володин Н.Н., Заседателев А.С., Михайлович В.М. Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации шести возбудителей различной природы. Вопросы практической педиатрии, 2009; 4 (1): 35-38

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, д.37А Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Михайлович, Владимир Михайлович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава Ъ Биологические микрочипы: определение понятия, классификация, назначение

1.1. Классификация микрочипов по типу иммобилизованных зондов

1.2. Способы изготовления микрочипов. Методы иммобилизации зондов.

1.3. Способы регистрации флуоресцентных сигналов в элементах микрочипа

1.4. Принцип работы гпбридизационного микрочипа

1.5. Конструирование микрочипов для идентификационных целей

1.5.1. Выбор мишени для гибридизационного анализа и способа подготовки пробы

1.5.2. Конструирование набора дискриминирующих олигонуклеотидов

1.5.3. Влияние положения и типа «запрашивающего нуклеотида» в составе иммобилизованного зонда на специфичность гибридизационного анализа

1.6. Условия проведения гибридизации и постгибриди-зационной отмывки

Глава 2 Ферментативные методы анализа на микрочипах

2.1. Реакции фосфорилирования и лигирования на микрочипах

2.2. Реакция удлинения праймера на один нуклеотид -SNE (Single nucleotide extension)

2.3. Амплификационные методы на микрочипах.

Полимеразная цепная реакция и аллель-специфичная ПЦР.

Глава 3 Специальная часть.

Инфекционные-агенты, избранные для анализа, и методы их идентификации.

3.1. Возбудитель туберкулеза: характеристика и методы 54 изучения

3.2. Идентификация возбудителя сибирской язвы и его 58 дифференциация от близких видов рода Bacillus

3.3. Идентификация ортопоксвирусов и возбудителей, 60 вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину

3.4. Идентификация и количественное определение 62 возбудителей ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови

3.5. Методы выявления мутаций, ответственных за 65 устойчивость ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы

3.6. Идентификация и типирование вируса гриппа А

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Материалы

4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.

1. Клинические образцы и нуклеиновые кислоты

1.2. НК из штаммов Mycobacterium tuberculosis

1.3. НК из штаммов рода Bacillus

1.4. НК ортопоксвирусов (фрагментированные)

1.5. Препараты ДНК герпесвирусов (HSV и VZV)

1.6. РЖ вирусов иммунодефицита человека , гепатитов 74 ВиС

4.1.1.7. Клинические образцы донорской плазмы крови

4.1.1.8. НК вирусов гриппа типа А

4.1.1.9. Клинические (полевые) образцы вирусов гриппа А

4.1.2. Коммерческие препараты НК

4.1.3. Флуоресцентные красители

4.2. Методы

4.2.1. Выделение ДНК из штаммов Mycobacterium 76 tuberculosis для проведения ПЦР (получение бактериальных лизатов)

4.2.2. Подготовка препаратов ДНК М. tuberculosis из 76 клинических образцов

4.2.3. Определение чувствительности штаммов 77 М. tuberculosis к рифампицину и изониазиду

4.2.4. Выделение ДНК из вегетативных клеток бацилл

4.2.5. Выделение, фрагментирование и введение 78 флуоресцентной метки в РНК бацилл

4.2.6. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из 78 образцов донорской крови

4.2.7. Количественное определение вирусных НК

4.2.8. Выделение РНК из референс- штаммов вируса 79 гриппа А

4.2.9. Олигонуклеотидные зонды и праймеры для 79 амплификации

4.2.10. Олигонуклеотидные микрочипы (MagicChip™ и 80 Биочип™)

4.2.11. Анализ длин продуктов ПЦР

4.2.12. Секвенирование ДНК

4.2.13. Гибридизация на микрочипе

4.2.14. Мультиплексная RT-PCR (общий случай)

4.2.15. Регистрация результатов гибридизации и On-Chip 83 PCR

4.2.16. Анализ температур плавления гибридизационных 84 комплексов на микрочипе

4.2.17. Определение предела чувствительности метода real- 84 time On-chip PCR

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5 Разработка эффективного способа идептнфика- 85 ции функционально н таксономическшзначимых участков бактериальной и вирусной НК методом гибридизациилш-биологическом микрочипе

5.1. Выбор мишени для гибридизационного анализа

5.2. Разработка оптимального способа подготовки пробы 87 для гибридизации

5.3. Конструирование набора дискриминирующих 89 олигонуклеотидов

5.3.1. Сравнительный анализ отношений сигналов при 90 использовании дискриминирующих пар олигонуклеотидов полностью комплементарных мишени и имеющих одно / два некомплементарных основания

5.3.2. Определение положения «запрашивающего 94 нуклеотида» в составе иммобилизованного зонда, обеспечивающего лучшую дискриминацию SNP

5.4. Разработка условий гибридизации амплифициро- 96 ванных участков НК на биологических микрочипах

5.4.1. Оптимизация температурного и временного режима 96 гибридизации

5.4.1.1. Определение оптимального времени гибридизации

5.4.1.2. Влияние условий постгибридизационпой отмывки 101 на дискриминацию совершенных и несовершенных гибридизационных комплексов

5.4.1.3. Влияние исходной концентрации молекулы-мишени 105 в образце на результаты гибридизационного анализа

5.4.2. Применение гибридизационного анализа для дифференциации смесей НК

Глава 6 Разработка ферментативных методов анализа на биологических микрочипах

6.1. Лигазная детектирующая реакция (LDR)

6.2. ПЦР на микрочипе (on-Chip PCR)

6.3. Аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR)

6.4. ПЦР в режиме реального времени на микрочипе 122 (real-time On-Chip PCR)

6.4.1. Определение первоначальной концентрации мишени 124 в образце. Динамический диапазон определения.

Глава 7 Разработка специализированных микрочипов

7.1. Метод идентификации микобактерий туберкулез- 129 ного комплекса с одновременнымопределением их лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду на олигонуклеотидных микрочипах

7.2. Идентификация возбудителя сибирской язвы и 136 дифференциация его от близких видов рода Bacillus

7.2.1. Дифференциация Bacillus anthracis от близких видов 136 методом гибридизации 16S рРНК на биологическом микрочипе

7.2.2. Идентификация Bacillus anthracis методом мульти- 139 плексной ПЦР на олигонуклеотидных биочипах

7.3. Идентификация ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину

7.3.1. Видовая идентификация ортопоксвирусов методом 142 гибридизации на биочипе

7.3.2. Идентификация возбудителей, вызывающих схожую 145 с натуральной оспой клиническую картину

7.4. Идентификация и количественное определение 150 возбудителей ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови

7.5. Разработка биологических микрочипов для 153 выявления мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы и результаты их применения

7.6. Разработка биологического микрочипа для 160 типирования вируса гриппа А

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах"

Использование методов, основанных на идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК), позволило перевести лабораторную диагностику возбудителей инфекционных заболеваний, определение их токсигенных свойств и чувствительности к лекарственным препаратам на принципиально иной, более совершенный методологический уровень. Разработанные почти три десятилетия назад и активно совершенствуемые амплификационные подходы - NAT-методы {от англ. Nucleic Acid Amplification Technology) - создали мощную конкуренцию традиционным «эталонным» диагностическим системам. Выгодно отличаясь от последних в чувствительности и специфичности, NAT-методы сократили время проведения анализа; оставили в прошлом стадию культивирования зачастую небезопасных инфекционных агентов, предоставили возможность их количественного определения.

Все возрастающее количество разрабатываемых оригинальных методических подходов основано на определении- именно генетических детерминант, и с точки зрения научной значимости и важности получаемых результатов, сколь-нибудь равноценных альтернатив NAT-методам при существующем методологическом уровне не наблюдается.

К одним из наиболее многообещающих инструментов прецизионного многопараметрического анализа геномов (минорного полиморфизма) можно отнести олигонуклеотидные микрочипы. Первоначально разработанные для минисеквенирования de novo (Lysov et al, 1996), микрочипы были успешно применены для целевого секвенирования (resequencing) (Hacia, 1999); обнаружения SNP (Hacia, 1999; Gunderson et al, 1998; Lindroos et al., 2001); сравнения последовательностей (идентификация клонов, несущих SNP) (Southern et al, 1996); анализа стабильности и образования вторичной структуры (Sohail et al., 1999, 2001; Mir and Southern, 1999); изучения кинетики гибридизации (Fotin et al., 1998) и др.

Тем не менее, несмотря на все очевидные преимущества этого современного инструмента, прикладной потенциал микрочипов в полной мере не реализован. Например, гибридизационный микрочип для идентификации устойчивых форм возбудителя туберкулеза, описанный в данной работе, позволяет получить результат в течение одних суток, при этом идентифицируя более 50-ти минорных изменений в последовательностях пяти генов Mycobacterium tuberculosis. Аналогичные по информативности и прикладной значимости результаты возможно получить, только используя прямое секвенирование — метода, который в обозримом будущем, очевидно, не займет статуса рутинной процедуры в районных диспансерах и лабораториях провинциальных больниц. Гибридизационный же анализ, выполняемый на микрочипах, как показал наш опыт, основанный на применении метода более чем в 20-ти учреждениях противотуберкулезной службы, является более доступным для использования в практической лабораторной диагностике.

Подходы, используемые при разработке перечисленных выше методов, возникающие проблемы и пути их решения, а также описание полученных результатов представлены в настоящей работе.

Цель работы и задачи исследования

Задачи исследования:

1. Разработать эффективный способ идентификации функционально и таксономически значимых участков бактериальных и вирусных НК методом гибридизации на биологическом микрочипе, включающий рациональные способы подготовки пробы, введения в нее флуоресцентной метки, конструирования набора дискриминирующих олигонуклеотидов и интерпретации результатов анализа; 1

3. Разработать специализированные методы на биологических микрочипах для:

• выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду;

• идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus',

• идентификации и количественного определения вирусов ВИЧинфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови;

• обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз;

• определения субтипов вирусов гриппа А.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав и заключения. Диссертация изложена на 197 страницах, содержит 47 рисунков, 16 таблиц и 5 приложений.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Михайлович, Владимир Михайлович

выводы

3. Разработан ряд специализированных методов на биологических микрочипах для:

• выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду;

• идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus',

• идентификации и количественного определения вирусов ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови; •обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз;

• определения субтипов вирусов гриппа А.

Автор посвящает данный труд светлой памяти академика Андрея Дарьевича Мирзабекова, под умелым и чутким руководством которого был выполнен основной задел данного исследования.

Считаю своим приятным долгом поблагодарить сотрудников Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН, аспирантов и инженеров, внесших вклад в данную работу, и особенно Д.А. Грядунова, С.А. Лапу, А.Ю. Соболева, А.В.Чудинова, Д.А. Ходакова, Е.Е. Фесенко, С.В. Суржикова, В.Е. Барского, Б.Н. Стрижкова, Н.А. Черных, Э.Я. Крейндлина, А.Ю. Рубину, С.В. Панькова, О.В. Антонову, Р.Ю. Юрасова и Н.И. Рудпнского.

Выражаю глубокую благодарность всем коллабораторам, поделившимся своими профессиональными знаниями и обеспечивших выполнение исследования качественно подготовленным клиническим материалом, и особенно д-рам А. М. Морозу, Ф.П. Филатову , Л.Н. Черноусовоп,

А.Ф. Бобкову , Т.В. Гребенниковой, С.Н. Щелкунову и

Л.С. Сандахчневу

Особую благодарность хочу выразить старшим коллегам ИМБ РАН: д-ру А.С. Заседателеву как непосредственному своему руководителю, оказавшему мне колоссальную помощь в подготовке данной работы, д-рам В. С. Прасолову, М. А. Лившицу, Ю. В. Козлову. А. В. Зеленину, П.М. Рубцову за полезные обсуждения и дружеское расположение, которое поддерживало меня на всех этапах работы.

Заключение

В настоящей работе мы реализовали часть потенциальных возможностей олигонуклеотидных микрочипов. Был разработан метод гибридизации амплифицированных фрагментов НК. Впервые продемонстрированы преимущества практического применения биочипов на примере разработанных четырех тест-систем, разрешенных к использованию в учреждениях здравоохранения. Разработан ряд новых подходов, эффективно сочетающих в себе специфичность и высокую процессивность энзиматических реакций с многопараметрическим микроформатом анализа на олигонуклеотидном микрочипе.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Михайлович, Владимир Михайлович, Москва

1. Грядунов Д. А., Михайлович В.М., Носков А.Н. и др. (2001) Обнаружение Bacillus anthracis методом мультиплексной ПЦР на олигонуклеотидных микрочипах. Доклады Академии Наук, 381: 265-267

2. Котова Е., Крейндлин Э., Барский В. и др. (2000) Взаимное влияние олигонуклеотидов и флуоресцентной метки на эффективность гибридизации с олигонуклео гидами, иммобилизованными на биологических микрочипах. Мол. Биол. 34: 304-309

3. Кузнецова В.Е., Василисков В.А., Антонова О.В. и др. (2008) Новые индодикарбоцианиновые красители для технологии биологических микрочипов. Биоорганическая химия, 34(1): 141-144.

4. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. "Патогенные для человека ортопоксвирусы", Товарищество научных изданий КМК, Москва, 1998.

5. Мызникова А.И., Захарова Н.В., Грядунов Д.А. и др. (2009) Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации шести возбудителей различной природы. Вопросы практической педиатрии, 4 (1): 3538

6. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В. и др. (2003) ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение. Издательский дом «ГЭОТАР-МЕД». Москва. С.418-426.

7. Abravaya К, Huff J, Marshall R, et al. (2003) Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications. Clin Chem Lab Med 41: 468-474.

8. Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, et al. (1991) Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science 252: 1651-1656.

9. Adams,C.P. and Kron,S.J. (1997) United States Patent no.5,641,658

10. Albert TJ, Norton J, Ott M, et al. (2003) Light-directed 5'-->3' synthesis of complex oligonucleotide microarrays. Nucleic Acids Res 31: e35.

11. Alexandre I, Hamels S, Dufour S, et al. (2001) Colorimetric silver detection of DNA microarrays. Anal Biochem 295: 1-8.

12. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. (1990) Basic local alignment search tool. JMol Biol 215: 403-410.

13. Anthony RM, Schuitema AR, Oskam L, Klatser PR. (2005) Direct detection of

14. Staphylococcus aureus mRNA using a flow through microarray. J Microbiol Methods 60: 47-54.

15. Ash C, Farrow JA, Dorsch M, Stackebrandt E, Collins MD. (1991) Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int JSyst Bacteriol 41: 343-346.

16. Baldauf SL, Palmer JD, Doolittle WF. (1996) The root of the universal tree and the origin of eukaryotes based on elongation factor phylogeny. Proc Natl Acad Sci USA 93: 7749-7754.

17. Baner J, Isaksson A, Waldenstrom E, Jarvius J, Landegren U, Nilsson M. (2003) Parallel gene analysis with allele-specific padlock probes and tag microarrays. Nucleic Acids Res 31: el03.

18. Bavykin SG, Lysov YP, Zakhariev V, et al. (2004) Use of 16S rRNA, 23S iRNA, and gyrB gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus gioup microorganisms. J Clin Microbiol 42: 3711-3730.

19. Bavykin SG, Mikhailovich VM, Zakharyev VM, et al. (2008), Discrimination of Bacillus anthracis and closely related microorganisms by analysis of 16S and 23S rRNA with oligonucleotide microarray. Chem Biol Interact 171: 212-235.

20. Bedecarrats GY, O'Neill FH, Norwitz ER, Kaiser UB, Teixeira J. (2003) Regulation of gonadotropin gene expression by Mullerian inhibiting substance. Proc Natl Acad1. Sci USA 100: 9348-9353.

21. Bellau-Pujol S, Vabret A. Legrand L, et al. (2005) Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses. J Virol Methods 126: 53-63.

22. Bodrossy L, Stralis-Pavese N, Murrell JC, Radajewski S, Weilharter A, Sessitsch A. (2003) Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs. Environ Microbiol 5: 566-582.

23. Bonch-Osmoiovskaya EA, Miroshnichenko ML, Lebedinsky AV, et al. (2003)

24. Radioisotopic, culture-based, and oligonucleotide microchip analyses of thermophilic microbial communities in a continental high-temperature petroleum reservoir. Appl Environ Microbiol 69: 6143-6151.

25. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Janscn CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 28: 495-503.

26. Bowtell DD. (1999) Options available—from start to finish—for obtaining expression data by microarray. Nat Genet 21: 25-32.

27. Bozdech Z, Zhu J, Joachimiak MP, Cohen FE, Pulliam B, DeRisi JL. (2003) Expression profiling of the schizont and trophozoite stages of Plasmodium falciparum with a long-oligonucleotide microarray. Genome Biol 4: R9.

28. Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U SA 83: 3746-3750.

29. Breslauer KJ, Frank R, Blocker II, Marky LA. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 3746-3750.

30. Carlson CR, Caugant DA, Kolsto AB. (1994) Genotypic Diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringicnsis Strains. Appl Environ Microbiol 60: 1719-1725.

31. Castiglioni B, Rizzi E, Frosini A, et al. (2004) Development of a universal microarray based on the ligation detection reaction and 16S rrna gene polymorphism to target diversity of cyanobacteria. Appl Environ Microbiol 70: 7161-7172.

32. Cattoli G, Drago A, Maniero S, et al. (2004) Comparison of three rapid detection systems for type A influenza virus on tracheal swabs of experimentally and naturally infected birds. Avian Pathol 33: 432-437.

33. Charbonnier Y, Gettler B, Francois P, et al. (2005) A generic approach for the design of whole-genome oligoarrays, validated for genomotyping, deletion mapping and gene expression analysis on Staphylococcus aureus. BMC Genomics 6: 95.

34. Chen H, Sharp BM. (2002) Oliz, a suite of Perl scripts that assist in the design of microarrays using 50mer oligonucleotides from the 3' untranslated region. BMC Bioinformatics 3: 27.

35. Chen JJ, Wu R, Yang PC, et al. (1998) Profiling expression patterns and isolating differentially expressed genes by cDNA microarray system with colorimetry detection. Genomics 51: 313-324.

36. Chen Q, Bian Z, Chen M, et al. (2009) Real-time monitoring of the strand displacement amplification (SDA) of human cytomegalovirus by a new SDA-piezoelectric DNA sensor system. Biosens Bioelectron 24: 3412-3418.

37. Chen S, Li Y, Yu C. (2008) Oligonucleotide microarray: a new rapid method for screening the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori for single nucleotide polymorphisms associated with clarithromycin resistance. J Gastroenterol Hepatol 23: 126-131.

38. Chittur SV. (2004) DNA microarrays: tools for the 21st Century. Comb Chem High Throughput Screen 7: 531-537.

39. Chizhikov V, Rasooly A, Chumakov K, Levy DD. (2001) Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl Environ Microbiol 67: 3258-3263.

40. Chizhikov V, Wagner M, Ivshina A, Hoshino Y, Kapikian AZ, Chumakov K. (2002) Detection and genotyping of human group A rotaviruses by oligonucleotide microarray hybridization. J Clin Microbiol 40: 2398-2407.

41. Clio RJ, Campbell MJ, Winzeler EA, et al. (1998) A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Mol Cell 2: 65-73.

42. Chou HH, Hsia AP, Mooney DL, Schnable PS. (2004) Picky: oligo microarray design for large genomes. Bioinformatics 20: 2893-2902.

43. Clarke PA, te Poele R, Wooster R, Workman P. (2001) Gene expression microarray analysis in cancer biology, pharmacology, and drug development: progress and potential. Biochem Pharmacol 62: 1311-1336.

44. Collins ML, Irvine B, Tyner D, et al. (1997) A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml. Nucleic Acids Res 25: 2979-2984.

45. Connors TD, Burn TC, VanRaay T, Germino GG, Klinger ICW, Landes GM. (1997) Evaluation of DNA sequencing ambiguities using tetramethylammonium chloride hybridization conditions. Biotechniques 22: 1088-1090.

46. Delrio-Lafrenicrc SA, Browning MK, McGlennen RC. (2004) Low-density addressable array for the detection and typing of the human papillomavirus. Diagn Microbiol Infect Dis 48: 23-31.

47. Deng JY, Zhang XE, Lu HB, et al. (2004) Multiplex detection of mutations in clinical isolates of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by short oligonucleotide ligation assay on DNA chips. J Clin Microbiol 42: 4850-4852.

48. Draghici S, Khatri P, Eklund AC, Szallasi Z. (2006) Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurements. Trends Genet 22: 101-109.

49. Drancourt M, Roux V, Fournier PE, Raoult D. (2004) rpoB gene sequence-based identification of aerobic Gram-positive cocci of the genera Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia, and Granulicatella. J Clin Microbiol 42: 497504.

50. Dubiley S, Kirillov E, Lysov Y, Mirzabekov A. (1997) Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization. Nucleic Acids Res 25: 2259-2265.

51. Dubiley S, Kirillov E, Mirzabekov A. (1999) Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucleic Acids Res 27: el9.

52. Favis R, Barany F. (2000) Mutation detection in K-ras, BRCA1, BRCA2, and p53 using PCR/LDR and a universal DNA microarray. Ann N YAcad Sci 906: 39-43.

53. Finney, D.J., Probit Analysis, 1971, Cambridge University Press, ISBN 052108041X, p. 333.

54. Fodor SP, Rava RP, Huang XC, Pease AC, Holmes CP, Adams CL. (1993) Multiplexed biochemical assays with biological chips. Nature 364: 555-556.

55. Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D. (1991) Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251: 767-773.

56. Fotin AV, Drobyshev AL, Proudnikov DY, Perov AN, Mirzabekov AD. (1998) Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res 26: 1515-1521.

57. Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, et al. (2005) Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J1. Virol 79:2814-2822.

58. Freier SM, Kierzek R, Jaeger JA, et al. (1986) Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. Proc Natl Acad Sci USA 83: 9373-9377.

59. Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H, Nagai H, Ito K, Kawaguchi R. (2003) Detection and identification of Mycobacterium species isolates by DNA microarray. J Clin Microbiol 41: 2605-2615.

60. Gerry NP, Witowski NE, Day J, Hammer RP, Barany G, Barany F. (1999) Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. J Mo I Biol 292: 251-262.

61. Gonzalez SF, Krug MJ, Nielsen ME, Santos Y, Call DR. (2004) Simultaneous detection of marine fish pathogens by using multiplex PCR and a DNA microarray. J Clin Microbiol 42: 1414-1419.

62. Gordon PM, Sensen CW. (2004) Osprey: a comprehensive tool employing novel methods for the design of oligonucleotides for DNA sequencing and microarrays. Nucleic. 1 cids Res 32: e 13 3.

63. Grimm V. Ezaki S, Susa M, Knabbc C, Schmid RD, Bachmann TT. (2004) Use of DNA microarrays for rapid genotyping of ТЕМ beta-lactamases that confer resistance. J Clin Microbiol 42: 3766-3774.

64. Gross C, Kelleher M, Iyer VR, Brown PO, Winge DR. (2000) Identification of the copper regulon in Saccharomyces cerevisiae by DNA microarrays. J Biol Chem 275: 32310-32316.

65. Gunderson KL, Huang XC, Morris MS, Lipshutz RJ, Lockhart DJ, Chee MS. (1998) Mutation detection by ligation to complete n-mer DNA arrays. Genome Res 8: 11421153.

66. Hacia JG. (1999) Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays. Nat Genet 21: 42-47.

67. Harrell LJ, Andersen GL, Wilson KH. (1995) Genetic variability of Bacillus anthracis and related species. J Clin Microbiol 33: 1847-1850.

68. Hashimoto M, Barany F, Soper SA. (2006) Polymerase chain reaction/Iigase detection reaction/hybridization assays using flow-through microfluidic devices for the detection of low-abundant DNA point mutations. Biosens Bioelectron 21: 19151923.

69. Hegde P, Qi R, Abernathy K, ct al. (2000) A concise guide to cDNA microarray analysis. Bioteclmiques 29: 548-550, 552-544, 556 passim.

70. Henderson I, Duggleby CJ, Turnbull PC. (1994) Differentiation of Bacillus anthracis from other Bacillus cereus group bacteria with the PCR. In! J Svst Bacterial 44: 99105.

71. Hindiyeh M, Levy V, Azar R, et al. (2005) Evaluation of a multiplex real-time reverse transcriptase PCR assay for detection and differentiation of influenza viruses A and В during the 2001-2002 influenza season in Israel. J Clin Microbiol 43: 589595.

72. Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. (1991) Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 88: 7276-7280.

73. Ibrahim MS, Esposito JJ, Jahrling PB, Lofts RS. (1997) The potential of 5' nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in Orthopoxvirus. Mol Cell Probes 11: 143-147.

74. Ikuta S, Takagi K, Wallace RB, Itakura K. (1987) Dissociation kinetics of 19 base paired oligonucleotide-DNA duplexes containing different single mismatched base pairs. Nucleic Acids Res 15: 797-811.

75. Ji M, Hou P, Li S, He N, Lu Z. (2004) Colorimetric silver detection of methylation using DNA microarray coupled with linker-PCR. Clin Chim Acta 342: 145-153.

76. Kaderali L, Schliep A. (2002) Selecting signature oligonucleotides to identify organisms using DNA arrays. Bioinformatics 18: 1340-1349.

77. Kaigala GV, Hoang VN, Stickel A, et al. (2008) An inexpensive and portable microchip-based platform for integrated RT-PCR and capillary electrophoresis. Analyst 133: 331-338.

78. Kalcinuma K, Fukushima M, Kawaguchi R. (2003) Detection and identification of Escherichia coli, Shigella, and Salmonella by microarrays using the gyrB gene. Bioteclmol Bioeng 83: 721 -728.

79. Keim P, Kalif A, Schupp J, et al. (1997) Molecular evolution and diversity in Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers. J Bacteriol 179: 818-824.

80. Kelly JJ, Chernov BK, Tovstanovsky I, Mirzabekov AD, Bavykin SG. (2002)

81. Radical-generating coordination complexes as tools for rapid and effective fragmentation and fluorescent labeling of nucleic acids for microchip hybridization. Anal Biochem 211: 103-118.

82. Keramas G, Bang DD, Lund M, et al. (2003) Development of a sensitive DNA microarray suitable for rapid detection of Campylobacter spp. Mol Cell Probes 17: 187-196.

83. Keramas G, Bang DD, Lund M, et al. (2004) Use of culture, PCR analysis, and DNA microarrays for detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from chicken feces. J Clin Microbiol 42: 3985-3991.

84. Kessler N, Ferraris O, Palmer K, Marsh W, Steel A. (2004) Use of the DNA flow-thru chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol 42: 2173-2185.

85. Khanna M, Park P, Zirvi M, et al. (1999) Multiplex PCR/LDR for detection of K-ras mutations in primary colon tumors. Oncogene 18: 27-38.

86. Khodakov DA, Zakharova NV, Gryadunov DA, Filatov FP, Zasedatelev AS, Mikhailovich VM. (2008) An oligonucleotide microarray for multiplex ieal-time PCR identification of HIV-l, HBV, and HCV. Biotechniques 44: 241-246, 248.

87. Khrapko KR, Lysov Yu P, Khorlin AA, et al. (1991) A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA Seq 1: 375-388.

88. Klaassen CH, Prinsen CF, de Valk HA, Horrevorts AM, Jeunink MA, Thunnissen FB. (2004) DNA microarray format for detection and subtyping of human papillomavirus. J Clin Microbiol 42: 2152-2160.

89. Koppelman Mil, Sjerps MC, Reesink HW, Cuypcrs HT. (2005) Evaluation of COBAS AmpliPrep nucleic acid extraction in conjunction with COBAS AmpliScrcen HBV DNA. HCV RNA and HIV-1 RNA amplification and detection. Vox Sang 89: 193-200.

90. Kostic Т., Butaye P, Schrenzel J., (2009) Detection of Highly Dangerous Pathogens: Microarray Methods for BSL 3 and BSL 4 Agents. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, Weinheim.

91. Kurg A, Tonisson N, Georgiou I, Shumaker J, Tollett J, Metspalu A. (2000) Arrayed primer extension: solid-phase four-color DNA resequencing and mutation detection technology. Genet Test 4: 1-7.

92. Laassri M, Chizhikov V, Mikheev M, Shchelkunov S, Chumakov K. (2003) Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. J Virol Methods 112: 67-78.

93. Lapa S, Mikheev M, Shchelkunov S, et al. (2002) Species-level identification of orthopoxviruses with an oligonucleotide microchip. J Clin Microbiol 40: 753-757.

94. Lehner A, Loy A, Behr T, et al. (2005) Oligonucleotide microarray for identification of Enterococcus species. FEMS Microbiol Lett 246: 133-142.

95. Lelie PN, van Drimmelen HA, Cuypers HT, et al. (2002) Sensitivity of HCV RNA and HIV RNA blood screening assays. Transfusion 42: 527-536.

96. Lequin RM. (2005) Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (EL1SA). Clin Chem 51: 2415-2418.

97. Leung YF, Cavalieri D. (2003) Fundamentals of cDNA microarray data analysis. Trends Genet 19: 649-659.

98. Li F, Stormo GD. (2001) Selection of optimal DNA oligos for gene expression arrays. Bioinformatics 17: 1067-1076.

99. Liang P, Pardee AB. (1992) Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971.

100. Lin B, Qiu J, Gerstenmeier J, et al. (2002) A label-free optical technique for detecting small molecule interactions. Biosens Dioelectron 17: 827-834.

101. Lin B, Vora GJ, Thach D, et al. (2004) Use of oligonucleotide microarrays for rapid detection and serotyping of acute respiratory disease-associated adenoviruses. J Clin Microbiol 42: 3232-3239.

102. Lindroos K, Liljedahl U, Raitio M, Syvanen AC. (2001) Minisequencing on oligonucleotide microarrays: comparison of immobilisation chemistries. Nucleic Acids Res 29: E69-69.

103. Lipshutz RJ, Fodor SP, Gingeras TR. Lockhart DJ. (1999) High density synthetic oligonucleotide arrays. Nai Genet 21: 20-24.

104. Liu WT, Mirzabekov AD, Stahl DA. (2001) Optimization of an oligonucleotide microchip for microbial identification studies: a non-equilibrium dissociation approach. Environ Microbiol 3: 619-629.

105. Lizardi PM, Huang X, Zhu Z, Bray-Ward P, Thomas DC, Ward DC. (1998) Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification.1. Nat Genet 19: 225-232.

106. Lloyd AT, Sharp PM. (1993) Evolution of the recA gene and the molecular phylogeny of bacteria. J Mol Evol 37: 399-407.

107. LoBue P. (2009) Extensively drug-resistant tuberculosis. Curr Opin Infect Dis 22: 167-173.

108. Lodes MJ, Suciu D, Elliott M, et al. (2006) Use of semiconductor-based oligonucleotide microarrays for influenza a virus subtype identification and sequencing. J Clin Microbiol 44: 1209-1218.

109. Loparev VN, Massung RF, Esposito JJ, Meyer H. (2001) Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. J Clin Microbiol 39: 94-100.

110. Loy A, Kusel K, Lehner A, Drake HL. Wagner M. (2004) Microarray and functional gene analyses of sulfate-reducing prokaryotes in low-sulfate, acidic fens reveal cooccurrence of recognized genera and novel lineages. Appl Environ Microbiol 70: 6998-7009.

111. Loy A, Lehner A, Lee N, et al. (2002) Oligonucleotide microarray for 16S rRNA gene-based detection of all recognized lineages of sulfate-reducing prokaryotes in the environment. Appl Environ Microbiol 68: 5064-5081.

112. Loy A, Schulz C, Lucker S, et al. (2005) 16S rRNA gene-based oligonucleotide microarray for environmental monitoring of the betaproteobacterial order "Rhodocyclales". Appl Environ Microbiol 71: 1373-1386.

113. Ludwig W, Neumaier J, Klugbauer N, et al. (1993) Phylogenetic relationships of Bacteria based on comparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-snbunit genes. Antonie Van Leeuwenhoek 64: 285-305.

114. Lysov YP, Gnuchev FN, Mironov AA, Chernyi AA, Beattie KL, Mirzabekov AD. (1996) Efficiency of sequencing by hybridization on oligonucleotide matrix supplemented by measurement of the distance between DNA segments. DNA Seq 6: 65-73.

115. Mah N, Thelin A, Lu T, et al. (2004) A comparison of oligonucleotide and cDNA-based microarray systems. Physiol Genomics 16: 361-370.

116. Majtan T, Bukovska G, Timko J. (2004) DNA microarrays—techniques and applications in microbial systems. Folia Microbiol (Praha) 49: 635-664.

117. Manber, U., and Myers, E. W. (1993). Suffix arrays: a new method for on-line string searches. SI AM J. Comput. 22, 935-948.

118. Marennikova SS, Nagieva FG, Matsevich GR, Shelukhina EM, Khabakhpasheva AA, Platonova GM. (1988) Monoclonal antibodies to monkey pox virus: preparation and application. Acta Virol 32: 19-26.

119. Marras SA, Kramer FR, Tyagi S. (2002) Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res 30: el22.

120. Matsubara Y, Kobayashi M, Morita Y, Tamiiya E. (2002) Application of a microchambcr array for DNA amplification using a novel dispensing method. Arch Histol Cytol 65: 481-488.

121. Mei R, Hubbell E, Bekiranov S, et al. (2003) Probe selection for high-density oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci US A 100: 11237-11242.

122. Meltzer PS. (2001) Spotting the target: microarrays for disease gene discovery. Сип-Орт Genet Dev 11: 258-263.

123. Meyer H, Pfeffer M, Rziha HJ. (1994) Sequence alterations within and downstream of the A-type inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. J Gen Virol 75 ( Pt 8): 1975-1981.

124. Mikhailovich V, Gryadunov D, Kolchinsky A, Makarov ЛА, Zasedatelev A. (2008) DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. Bioessays 30: 673-682.

125. Mikhailovich V, Lapa S, Gryadunov D, et al. (2001) Identification of rifampin-rcsistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips. J Clin Microbiol 39: 2531-2540.

126. Mir KU, Southern EM. (1999) Determining the influence of structure on hybridization using oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 17: 788-792.

127. Mirzabekov AD. (1994) DNA sequencing by hybridization—a mcgasequencing method and a diagnostic tool? Trends Biotechnol 12: 27-32.

128. Mitterer G, Huber M, Leidinger E, et al. (2004) Microarray-based identification of bacteria in clinical samples by solid-phase PCR amplification of 23S ribosomal DNA sequences. J Clin Microbiol 42: 1048-1057.

129. Mrowka R, Schuchhardt J, Gille C. (2002) Oligodb-interactive design of oligo DNA for transcription profiling of human genes. Bioinformatics 18: 1686-1687.

130. Mukinda VB, Mwema G, Kilundu M, Heymann DL, Khan AS, Esposito JJ. (1997) Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Monkeypox Epidemiologic Working Group. Lancet 349: 1449-1450.

131. Munch M, Nielsen LP, Handberg KJ, Jorgensen PH. (2001) Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA. Arch Virol 87-97.

132. Murphy G, Parry JV. (2008) Assays for the detection of recent infections with human immunodeficiency virus type 1. Euro Surveill 13.

133. Naef F, Lim DA, Patil N, Magnasco M. (2002) DNA hybridization to mismatched templates: a chip study. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 65: 040902.

134. Nazarenko I, Lowe B, Darfler M, Ikonomi P, Schuster D, Rashtchian A. (2002) Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore. Nucleic Acids Res 30: e37.

135. Nielsen HB, Wernersson R, Knudsen S. (2003) Design of oligonucleotides for microarrays and perspectives for design of multi-transcriptome arrays. Nucleic Acids Res ЪЬ. 3491-3496.

136. Nordberg EK. (2005) YODA: selecting signature oligonucleotides. Bioinformatics 21: 1365-1370.

137. Nubel U, Schmidt PM, Reiss E, Bier F, Beyer W, Naumann D. (2004) Oligonucleotide microarray for identification of Bacillus anthracis based on intergenic transcribed spacers in ribosomal DNA. FEMS Microbiol Lett 240: 215223.

138. Nuwaysir EF, Huang W, Albert TJ, et al. (2002) Gene expression analysis using oligonucleotide arrays produced by maskless photolithography. Genome Res 12: 1749-1755.

139. Oh TJ, Kim CJ, Woo SK, et al. (2004) Development and clinical evaluation of a highly sensitive DNA microarray for detection and genotyping of human papillomaviruses. J Clin Microbiol 42: 3272-3280.

140. Olson AD, Shope TC, Flynn JT. (2001) Pretransplant varicella vaccination is cost-effective in pediatric renal transplantation. Pediatr Transplant 5: 44-50.

141. Pai M, Kalantri S, Dheda K. (2006) New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: part II. Active tuberculosis and drug resistance. Expert Rev1. Mol Diagn 6: 423-432.

142. Panicker G, Call DR, Krug MJ, Bej AK. (2004) Detection of pathogenic Vibrio spp. in shellfish by using multiplex PCR and DNA microarrays. Appl Environ Microbiol 70: 7436-7444.

143. Panning M, Asper M, Kramme S, Schmitz H, Drostcn C. (2004) Rapid detection and differentiation of human pathogenic orthopox viruses by a fluorescence resonance energy transfer real-time PCR assay. Clin Chem 50: 702-708.

144. Parikh U, Calef C, Larder В et al. (2002) Mutations in retroviral genes associated with drug resistance. IIIV Sequence Compendium 2002. Los Alamos, 2002. P. 94 — 183.

145. Pastinen T, Raitio M, Lindroos K, Tainola P, Peltonen L, Syvanen AC. (2000) A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays. Genome Res 10: 1031-1042.

146. Pemov A. Modi H, Chandler DP, Bavykin S. (2005) DNA analysis with multiplex microarray-enhanced PCR. Nucleic Acids Res 33: ell.

147. Peplies J, Lau SC, Pernthaler J, Amann R, Glockner FO. (2004) Application and validation of DNA microarrays for the 16S rRNA-based analysis of marine bacterioplankton. Environ Microbiol 6: 638-645.

148. Piao X, Sun L, Zhang T, Gan Y, Guan Y. (2008) Effects of mismatches and insertions on discrimination accuracy of nucleic acid probes. Acta Biochim Pol 55: 713-720.

149. Poon LL, Leung CS, Chan KH, et al. (2005) Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 43: 427-430.

150. Pozhitkov A, Noble PA, Domazet-Loso T, et al. (2006) Tests of rRNA hybridization to microarrays suggest that hybridization characteristics of oligonucleotide probes for species discrimination cannot be predicted. Nucleic Acids Res 34: e66.

151. Quinlivan M, Cullinane A, Nelly M, Van Maanen K, Heldens J, Arkins S. (2004) Comparison of sensitivities of virus isolation, antigen detection, and nucleic acid amplification for detection of equine influenza virus. J Clin Microbiol 42: 759-763.

152. Rahmann S. (2003) Fast large scale oligonucleotide selection using the longest common factor approach. JBioinform Comput Biol 1: 343-361.

153. Ramakrishnan R, Dorris D, Lublinsky A, et al. (2002) An assessment of Motorola

154. CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res 30: e30.

155. Ramaswamy S, Musser JM. (1998) Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuber Lung Dis 79: 3-29.

156. Reymond N, Charles H, Duret L, Calevro F, Beslon G. Fayard JM. (2004) ROSO: optimizing oligonucleotide probes for microarrays. Bioinjormatics 20: 271-273.

157. Rimour S, Hill D, Militon C, Peyret P. (2005) GoArrays: highly dynamic and efficient microarray probe design. Bioinformatics 21: 1094-1103.

158. Rogojina AT, Orr WE, Song BK, Geisert EE, Jr. (2003) Comparing the use of Affymetrix to spotted oligonucleotide microarrays using two retinal pigment epithelium cell lines. Mol Vis 9: 482-496.

159. Roth SB, Jalava J, Ruuskanen O, Ruohola A, Nikkari S. (2004) Use of an oligonucleotide array for laboratory diagnosis of bacteria responsible for acute upper respiratory infections. J Clin Microbiol 42: 4268-4274.

160. Rouillard JM, Herbert CJ, Zuker M. (2002) OligoArray: genome-scale oligonucleotide design for microarrays. Bioinformatics 18: 486-487.

161. Rouillard JM, Zuker M, Gulari E. (2003) OligoArray 2.0: design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic approach. Nucleic Acids Res 31: 3057-3062.

162. Rubina AY, Pan'kov SV, Dementieva EI, et al. (2004) Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Anal Biochem 325: 92-106.

163. Rychlik W, Rhoads RE. (1989) A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res 17: 8543-8551.

164. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.

165. Sengupta S, Onodera K, Lai A, Melcher U. (2003) Molecular detection andidentification of influenza viruses by oligonucleotide microarray hybridization. J Clin Microbiol 41: 4542-4550.

166. Sergeev N, Distler M, Courtney S, et al. (2004b) Multipathogen oligonucleotide microarray for environmental and biodcfense applications. Biosens Bioelectron 20: 684-698.

167. Sergeev N, Volokhov D, Chizhikov V, Rasooly A. (2004a) Simultaneous analysis of multiple staphylococcal enterotoxin genes by an oligonucleotide microarray assay. J Clin Microbiol 42: 2134-2143.

168. Shi C, Eshleman SH, Jones D, et al. (2004) LigAmp for sensitive detection of singlc-nucleotide differences. Nat Methods 1: 141-147.

169. Shumaker JM, Toilet JJ, Filbin KJ, Montague-Smith MP, Pirrung MC. (2001) APEX disease gene resequencing: mutations in exon 7 of the p53 tumor suppressor gene. Bioorg Med Chem 9: 2269-2278.

170. Sias C, Carletti F, Capobianchi MR, et al. (2007) Rapid differential diagnosis of Orthopoxviruses and Herpesviruses based upon multiplex real-time PCR. Infez Med 15: 47-55.

171. Sohail M, Akhtar S, Southern EM. (1999) The folding of large RNAs studied by hybridization to arrays of complementary oligonucleotides. Rna 5: 646-655.

172. Sohail M, Hochegger H, Klotzbuchcr A, Guellec RL, Hunt T, Southern EM. (2001) Antisense oligonucleotides sclcctcd by hybridisation to scanning arrays are effective reagents in vivo. Nucleic Acids Res 29: 2041-2051.

173. Southern EM. (1996) High-density gridding: techniques and applications. Curr Opin Biotechnol 7: 85-88.

174. Stone B, Burrows J, Schepetiuk S, et al. (2004) Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR. J Virol Methods 117: 103-112.

175. Stralis-Pavese N, Sessitsch A, Weilharter A, et al. (2004) Optimization of diagnostic microarray for application in analysing landfill mcthanotroph communities under different plant covers. Environ Microbiol 6: 347-363.

176. Straub TM, Daly DS, Wunshel S, Rochelle PA, DeLeon R, Chandler DP. (2002) Genotyping Cryptosporidium parvum with an hsp70 single-nucleotide polymorphism microarray. Appl Environ Microbiol 68: 1817-1826.

177. Sukhanova AL, Kazennova EV, Rudinskii N1, et al. (2004) The genetic variability of the protease-encoding region in HIV-1 A isolates and in CRF03AB recombinants as observed in the CIS territory., Vopr Virusol 49: 4-9.

178. Suzuki S, Ono N, Furusawa C, Kashiwagi A, Yomo T. (2007) Experimental optimization of probe length to increase the sequence specificity of high-density oligonucleotide microarrays. BMC Genomics 8: 373.

179. Tao H, Bausch C, Richmond C, Blattner FR, Conway T. (1999) Functional genomics: expression analysis of Escherichia coli growing on minimal and rich media. JBacteriol 181: 6425-6440.

180. Tao SC, Li Y, Liu YH, Ma XM, Cheng J. (2003) Room-tempcrature hybridization of target DNA with microarrays in concentrated solutions of guanidine thiocyanate. Biotechniques 34: 1260-1262.

181. Tillib SV, Strizhkov BN, Mirzabekov AD. (2001) Integration of multiple PCR amplifications and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip. Anal Biochem 292:155-160.

182. Tiquia SM, Wu L, Chong SC, et al. (2004) Evaluation of 50-mer oligonucleotide arrays for detecting microbial populations in environmental samples. Biotechniques 36: 664-670, 672, 674-665.

183. Tolstrup N, Nielsen PS, Kolberg JG, Frankel AM, Vissing H, Kauppinen S. (2003) OligoDesign: Optimal design of LNA (locked nucleic acid) oligonucleotide capture probes for gene expression profiling. Nucleic Acids Res 31: 3758-3762.

184. Tonisson N, Kurg A, Kaasik K, Lohmussaar E, Metspalu'A. (2000) Unravelling genetic data by arrayed primer extension. Clin Chem Lab Med38: 165-170.

185. Trevino V, Falciani F, Barrera-Saldana HA. (2007) DNA microarrays: a powerful genomic tool for biomedical and clinical research. Mo I Med 13: 527-541.

186. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, et al. (1999) Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol 37: 49-55.

187. Van Ness J, Chen L. (1991) The use of oligodeoxynucleotide probes in chaotrope-based hybridization solutions. Nucleic Acids Res 19: 5143-5151.

188. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler K.W. (1995) Serial analysis of gene expression. Science 270: 484-487.

189. Vernet G. (2004) Molecular diagnostics in virology. J Clin Virol 31: 239-247.

190. Vet JA, Van der Rijt BJ, Blom HJ. (2002) Molecular beacons: colorful analysis of nucleic acids. Expert Rev Mol Diagn 2: 77-86.

191. Vijaya Satya R, Zavaljevski N, Kumar K, Reifman J. (2008) A high-throughput pipeline for designing microarray-based pathogen diagnostic assays. BMC Bioinformatics 9: 185.

192. Volokhov D, Chizhikov V, Chumakov K, Rasooly A. (2003) Microarray-based identification of thermophilic Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, and C. upsaliensis. J Clin Microbiol 41: 4071-4080.

193. Volokhov D, Rasooly A, Chumakov K, Chizhikov V. (2002) Identification of Listeria species by microarray-based-assay. J Clin Microbiol 40: 4720-4728.

194. Wang D, Coscoy L, Zylberberg M, et al. (2002) Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci US A 99: 15687-15692:

195. Wang X, Seed B. (2003) Selection of oligonucleotide probes for protein coding sequences. Bioinformatics 19: 796-802.

196. Wang Z, Dauin LT, Vora GJ, et al. (2006) Identifying influenza viruses with resequencing microarrays. Emerg Infect Dis 12: 638-646.

197. Wang Z, Vora GJ, Stenger DA. (2004) Detection and genotyping of Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Giardia lamblia, and vCryptosporidium parvum by oligonucleotide microarray. J Clin Microbiol 42: 3262-3271.

198. Warsen AE, Krug MJ, LaFrentz S, Stanek DR, Loge FJ, Call DR. (2004) Simultaneous discrimination between 15 fish pathogens by using 16S ribosomal DNA PCR and DNA microarrays. Appl Environ Microbiol 70: 4216-4221.

199. Westin L, Xu X, Miller C, Wang L, Edman CF, Nerenberg M. (2000) Anchored multiplex amplification on a microelectronic chip array. Nat Biotechnol 18: 199-204.

200. Whitcombe D, Theaker J, Guy SP, Brown T, Little S. (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat Biotechnol 17: 804807.

201. Wilson KH, Wilson WJ, Radosevich JL, et al. (2002a) High-density microarray of small-subunit ribosomal DNA probes. Appl Environ Microbiol 68: 2535-2541.

202. Wilson M, DeRisi J, Kristensen HH, et al. (1999) Exploring drug-induced alterations in gene expression in Mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization. Proc Natl Acad Sci USA 96: 12833-12838.

203. Wilson WJ, Strout CL. DeSantis TZ, Stilwell JL, Carrano AV, Andersen GL. (2002b) Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology. Mol Cell Probes 16: 119-127.

204. Wood WI, Gitschier J, Lasky LA, Lawn RM. (1985) Base composition-independent hybridization in tetramethylammonium chloride: a method for oligonucleotide screening of highly complex gene libraries. Proc Natl Acad Sci USA 82: 1585-1588.

205. Yershov G, Barsky V, Belgovskiy A, et al. (1996) DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips. Proc Natl Acad Sci USA 93: 4913-4918.

206. Yguerabide J, Yguerabide EE. (2001) Resonance light scattering particles as ultrasensitive labels for detection of analytes in a wide range of applications. J Cell Biochem Suppl Suppl 37: 71-81.

207. Yu J, Othman MI, Farjo R, ct al. (2002) Evaluation and optimization of procedures for target labeling and hybridization of cDNA microarrays. Mol Vis 8: 130-137.

208. Yu X, Susa M, Knabbe C, Schmid RD, Bachmann TT. (2004) Development and validation of a diagnostic DNA microarray to detect quinolone-resistant Escherichia coli among clinical isolates. J Clin Microbiol 42: 4083-4091.

209. Zhao S, Bruce WB. (2003) Expression profiling using cDNA microarrays. Methods Mol Biol 236: 365-380.

210. Zhou Y, Abagyan R. (2002) Match-only integral distribution (MOID) algorithm for high-density oligonucleotide array analysis. BMC Bioinformatics 3: 3.

Информация о работе

Михайлович, Владимир Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы