Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран"

Лайман Елена Федоровна

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран

03.02.03- микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток 2013

21 НОЯ 2013

005539138

Диссертация выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Шаркова Валентина Александровна Официальные оппоненты:

Тимченко Нелли Фёдоровна — доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Кольцов Игорь Петрович - кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Хабаровск

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Санкг-Петербург

Защита диссертации состоится « 24 » декабря 2013 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета ДКМ208.007.02 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Автореферат разослан « 13 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Практически любая рана, даже нанесенная в условиях операционной, содержит определенное количество микробов, в том числе способных вызвать послеоперационную инфекцию, определяемую как клинически распознаваемое инфекционное осложнение (Абаев Ю. К., 2007). Многолетняя динамика инфекций в области хирургического вмешательства (ИОХВ) в России не изучена в связи с отсутствием объективных данных об их частоте, поэтому изучение микробного состава операционной раны, является одним из этапов решения указанной проблемы (Зуева Л. П., Яфа-ев Р. X., 2006; Миронов А. Ю. с соав., 2010).

Оценке микробного фактора в развитии раневой инфекции всегда уделялось большое внимание. Несомненно, вид и количество микроорганизмов и их патогенные свойства играют существенную роль в возникновении и развитии гнойно-воспалительных осложнений и во многом определяют характер их течения (Булынин В. И., 1998; Глаго-ев В. М., 2008).

В настоящее время доказано, что инфекционный процесс в ране может быть вызван микрофлорой различной степени патогенности. Массивная антибиотикотерапия, проводимая без учета характера возбудителя, подавляет нормальную микрофлору, облегчая условия жизнедеятельности антибиотикоустойчивых микробов (Сидоренко С. В., Яковлев С. В., 2000; ВСоз1а V. М. с! а1, 2006). Наряду с этим, у микробов-возбудителей патологического процесса происходит ускорение модификации в сторону появления и усиления патогенных свойств (Петровская В. Г., 1967; Бухарин О. В., 1999; Гинц-бург А. Л. с соав., 2003).

Поскольку, видовое разнообразие микроорганизмов увеличивается, а их патогенные свойства и устойчивость к антимикробным препаратам усиливаются, вопросы изучения микробного аспекта и его влияния на патогенез, клинику и лечение ИОХВ, усовершенствование диагностики, поиск новых эффективных противомикробных лекарственных препаратов являются актуальными, что и определило выбор цели и основных задач настоящего исследования.

Цель исследования: Определение микробного состава операционной раны, моле-кулярно-генетической характеристики основных штаммов-контаминантов, антибиотико-резистентности микрофлоры, обоснование рациональной антибактериальной терапии инфекций в области хирургического вмешательства.

Задачи исследования:

1. Определить микробиоценоз операционной раны в динамике шести лет с учетом класса ран (операций) с выявлением основной этиологической группы и состава микробных ассоциантов, дать экологическую характеристику.

2. Оценить глубокую аутомикрофлору кожи хирургических больных, микрофлору слизистых верхних дыхательных путей (ВДП) медицинского персонала и микрофлору внешней среды отделений хирургического профиля.

3. Дать молекулярно-генетическую характеристику патогенных свойств различных видов микробов, изолированных из основных биотопов, оценить ее значимость при ИОХВ в динамике исследования.

4. Оценить устойчивость к антибиотикам микрофлоры операционных ран.

5. Разработать рекомендации по микробиологической диагностике и оптимизации терапии ИОХВ.

Научная новизна. Впервые проведен микробиологический мониторинг штаммов, изолированных из после- и операционных ран в условиях многопрофильного хирургического стационара. Выявлена доминирующая микрофлора Е coli и S. epidermidis и варианты их доминирования в микробных ассоциациях. Указанные микроорганизмы отнесены к эпизодически встречающимся по показателю постоянства, имеют наибольший показатель значимости и наибольшую плотность распределения, которая увеличивается с ростом класса ран (операций).

Показано, что клинические штаммы Е coli, S. aureus, S. epidermidis несут фрагменты ДНК «островов» патогснности, гомологичные известным генам кластеров патогенности, позволяющие обсуждать наличие потенциальной опасности данных микроорганизмов и участие их в развитии раневой инфекции. У 58,7% штаммов Е coli обнаружено присутствие генов, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfa G), цитотоксический некротизирующий фактор (enf 1), гемолизины (Ыу А и Ыу В) с преобладанием высокого уровня ß-гемолитических кишечных палочек, в особенности в ранах Ш-IV класса с тенденцией к нарастанию патогенности в динамике исследования.

Выявлены различия выраженности маркеров факторов патогенности fnbp A, fnbp В, lue PVS с преобладанием генов адгезии (до 85%) у штаммов S. aureus и S. epidermidis, изолированных из различных источников.

Выявлено появление комбинаций генов патогенности: штаммов Е coli - с 2009г., S. aureus и S. epidermidis — с 2010г., повышающие патогенные свойства изолятов (hly В, enf lvi fnbp A, fnbp В, lue PVS, соответственно).

Проведено мониторирование антибиотикорезистентности основных штаммов-контаминаптов, изолированных из операционных ран. В группе штаммов Staphylococcus spp. определены генетические особенности формирования антибиотикорезистентности. Предложена возможная коррекция терапии инфекций в области хирургического вмешательства.

Практическая значимость исследований.

Разработаны схемы отбора проб клинического материала, критерии мониторинга антибиотикорезистентности, с целью идентификации клинически значимых микроорганизмов, контамиругощих операционные раны. Определена схема эффективного применения молекулярно-генетических методов с целью микробиологического мониторинга па-тогенности и метициллинрезистентности значимых штаммов микроорганизмов, выделенных из различных биотопов хирургического стационара.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов E.coli и Staphylococcus spp. предлагает и обосновывает эффективную этиотропную химиотерапию, в том числе, для последних, с определением гена тес А при множественной антибиотикорезистентности и гетерорезистентности.

Подготовлены и внедрены в практическое здравоохранение методические разработки «Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования», «Определение генетических маркеров факторов патогенности К coli методом ПЦР-РВ»; информационное письмо

«Мониторинг антибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран»; рационализаторское предложение «Метод бакпечаток для культурального исследования глубокой аутомикрофлоры у хирургических больных» (№ 2787 от 22 июня 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микробиоценоз операционных ран характеризуется богатством видов. Группу основной микрофлоры составляют К coli и S. epidermidis. Рост контаминации операционных ран происходит от первого класса к четвертому за счет нарастания удельного веса Е. coli и снижения штаммов S. epidermidis.

2. Штаммы К coli, изолированные из операционных ран, характеризуются высоким уровнем колонизации р-гемолитическими вариантами, преобладанием комбинаций генетических детерминант патогенности hly В, cnf 1. S. epidermidis, изолированный из послеоперационных ран, характеризуются наличием генетических маркеров fnbp A, fnbp В, что определяет его как потенциальный патоген.

3. Чувствительность микрофлоры к антибиотикам мало зависит от биотопа. Антибиоти-корезистентность основных штаммов — контаминантов операционной раны характеризуется ростом удельного веса штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, появлением гена тес А у изолятов S. epidermidis, S. aureus.

Апробация научных материалов диссертации прошла на разных уровнях: Европейском съезде инфекционистов (г. Витебск, 2007 г.), IX и XI Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, (г. Владивосток, 2008 г., 2010 г.), Научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста. Антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (г. Харьков, 2008 г.), VII, VIII Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Владивосток, 2010 г., 2011 г.), XVI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Франция, г. Париж, 2011 г.), научной конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Турция, г. Анталия, 2011 г.), 2-й Международной научно-практической конференции "Европейская наука и технологии" (Германия, г. Вестба-ден, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Италия, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (Италия, 2012 г.), XIV, XV Международных конгрессах МАК-MAX/ESCMID по антимикробной терапии (г. Москва, 2012 г., 2013 г.). Результаты диссертационного исследования обсуждены на заседании кафедры микробиологии и вирусологии (протокол № 6 от 15.02.2013 г.) и проблемной комиссии «Инфекционные болезни, гигиена, эпидемиология, микробиология, иммунология» (протокол № 10 от 02.07.2013г.) ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России.

Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано 19 научных публикаций, в том числе 3 статьи в печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ, одна — в международной печати, 2 методические разработки, 1 информационное письмо. Имеется рационализаторское предложение.

Личный вклад автора. Автором осуществлена систематизация и анализ полученного материала. Лично автором проведены забор проб и посев биоматериала от хирургических больных, материала госпитальной среды и верхних дыхательных путей медицинского персонала; осуществлено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам; молекулярно-генетические исследования основных штаммов бактерий. Все методы статистической обработки выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации традиционная. Ее текст изложен на 207 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 54 таблицами, 10 рисунками, 1 схемой. Она включает: введение;главу «Контингент, материалы, направления и методы исследования», собственные исследования (4 главы), заключение, общие выводы, рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку, практику, учебный процесс. Использовано 293 литературных источника, в том числе 184 отечественных и 109 иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Контингент, материалы и методы исследования. Микробный состав операционных ран был изучен в группах хирургических больных, которым проведены операции в период времени с 2005 г. по 2010 г. с положительными высевами из операционных ран. Сформировано 4 группы (248 человек), различаемые по классу хирургических ран (операций) согласно классификации Classen С. D. (1992): I класс - «чистые» - 15 человек, II класс - «условно-чистые» - 101 человек, III класс - «загрязненные» - 70 человек, IV класс - «грязные» - 62 человека. Больные перенёсшие операции I, III и IV класса - пациенты хирургического отделения, перенёсшие операции II класса - акушерского и гинекологического отделений.

Материалом для микробиологического анализа явились 1596 биологических проб отделяемого операционных ран от 861 пациентов, 67 проб отделяемого послеоперационных ран, 152 пробы глубокой аутомикрофлоры кожи (АМФК) и 1663 мазка-отпечатка раневой поверхности хирургических больных. Отобрано для исследований 118 пробы воздуха, 783 смыва с поверхностей. Сравнительные биологические свойства и ассоциированные формы изучены у 372 штаммов микроорганизмов, выделенных от хирургических больных во время операции. 46 штаммов, выделенных из послеоперационных ран, 164 штаммов глубокой АМФК, 66 штаммов из внешней среды и 44 штамма со слизистых верхних дыхательных путей медицинского персонала. Проведено 626 молекулярно-генетических исследования методом ПЦР-РВ с детекцией восьми маркеров факторов патогенное™ и одного метициллинрезистентности. Статистический анализ исследований проведен с использованием метода одномерной описательной статистики с использовае-нием программы «Statistica 6,0» (среднеарифметическая М, ее ошибка ш, критерий Стьюдента - t, уровень значимости - р), корреляционного анализа с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена - г, оценкой достоверности коэффициента корреляции. Проведено определение показателя постоянства (С), видового разнообразия (d) по Р. Уитгекеру (1980), индекса значимости микрофлоры (V) по М. П. Наткевичайте-Ивапаускене, индекса MAR (Krumperman P. Н., 1983).

Результаты исследования и их обсуждение. При бактериологическом исследовании отделяемого операционных ран изолировано и идентифицировано 372 штамма, среди которых преобладали аэробные микроорганизмы (98,4±0,6%) - 366 шт. На долю анаэробной флоры пришлось 6 штаммов (1,6±0,6%). Спектр аэробной микрофлоры был сформирован 53 видами и 18 родами, в число анаэробов вошло 5 видов бактерий, отнесенных к 3 родам.

Наиболее частыми представителями микрофлоры операционных ран явились грам-положительные кокковые формы, удельный вес которых составил 56,5±2,6% (210 штаммов) и грамотрицательные палочки - 39,2±2,5% (146 штаммов). Прочие микроорганизмы: грамотрицательные кокки, грамположительные палочки, дрожжеподобные грибы выделены с удельным весом 0,3±0,3%, 1,9±0,7%, 0,5±0,4%, соответственно. Видовой состав отдельных групп микроорганизмов операционных ран был нами изучен в динамике. В общем спектре микроорганизмов все годы лидирующее место занимали грамположительные кокки (таблица 1) в пределах 48,6±8,4% - 64,3±7,4%. Удельный вес грамотрицательных палочек был несколько ниже и составлял от 30,9±7,1% до 48,6±8,4%. В 2006 г. участие грамположительных кокков и грамотрицательных палочек было однозначным (по 48,6±8,4%). Все прочие микроорганизмы выделялись в единичных случаях. Грамполо-жительная кокковая флора была представлена двумя семействами микрококков (55,1±2,6%) и стрептококков (1,4±0,6%). Отличительным свойством первого являлось разнообразие видов, многочисленность штаммов и большое число выделенных культур. В число представителей рода Staphylococcus вошли 14 видов, из них12 видов были отнесены к коагулазоотрицательным (КОС), 2 вида, - к коагулазоположительным стафилококкам. При этом те и другие в суммарном соотношении составили - 87,3±2,8% (124 штамма) и 12,7 ±2,8% (18 штаммов), соответственно. Удельный вес микрококков среди всех выделенных микроорганизмов составлял от 4,8±2,1% до 29,1 ± 6,6% с лидирующим положением в 2007 г. Удельный вес высева микрококков повышался с 2005 г. по 2007 г. от 23,8±6,6%, до 29,1±6,6% соответственно, в 2008 г. снизился до 15,6±4,5%, в 2010 г. -до 5,9±2,9%. Таким образом, произошло статистически достоверное снижение удельного веса микрококков в общем спектре микроорганизмов операционной раны в изучаемый период в 4,7 раза (р<0,001). Семейство Streptococcaceae было представлено двумя родами (Streptococcus, Enterococcus) и тремя видами (S. milleri, Е. faecium, Е. faecalis), изолированных в единичных случаях, что составило от 1,6±1,6% до 5,7±3,9%. В группе грамотрицательных палочек выделены энтеробактерии с удельным весом от 20,8±5,9% до 48,6±8,4% и нефер-ментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ) (от 10,4±4,4% до 4,8±2,1). Среди энте-робактерий наиболее часто встречаема Е. coli - 64,5±4,3% (78 штаммов суммарно по годам). Удельный вес Е. coli в разные годы был от 37,5±10,1% до 100±0,0% с некоторой тенденцией к снижению с 2005 г. по 2010 г. Удельный вес НГОБ в общей структуре микроорганизмов оставался с течением времени практически неизменным и включал A. hvoffii 48±10,2% (12 штаммов), Р. aeruginosa - 20,8±8,2% (5 штаммов). A. junii и A. piechaudii по 12±6,6% (3 штамма). A. faecalis и P. putida по 4,0±4,0%.

Спектр микроорганизмов, выделенных из операционных ран в период с 2005 по2010г.

Таблица 1

Наименование микроорганизмов 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Суммарная доля

п М±ш% п М±ш% п М±ш% п М±т% п I М±т% п М±т% п М±т%

Грамположительные кокки: 27 64,3±7,4 17 48,6±8,4 27 56,3±7,4 33 51,6±6,2 61 58,7±4, 8 45 56,9±5,6 210 56,5±2,6

Род Staphylococcus 16 38,1 ±7,5 6 17,1±6,4 12 22,9t6,l 22 34,3±5,9 56 54±4,9 41 51,9±5,6 153 41,1±2,6

Род Micrococcus 10 23,8±6,6 9 25,7±7,4 14 29,1±6,6 10 15,6±4,5 5 4,8±2,1 4 5,1±2,5 52 13,9±1,8

Род Streptococcus 1 1,6±1,6 1 0,3±0,3

Род Enterococcus 1 2,4±2,4 2 5,7±3,9 1 2,1±2,1 4 1,1±0,54

Грам отрицательные палочки: 13 30,9±7,1 17 48,6±8,4 15 31,3±б,7 30 46,9±6,1 39 37,5±4, 7 32 40,5±5,5 146 39,2±2,5

Сем. Enterobacteriaceae 10 23,8±6,6 17 48,6±8,4 10 20,8±5,9 24 37,5±6,1 34 32,7±4, 6 26 32,9±5,3 121 32,5±2,4

НГОБ 3 7,1±3,96 5 10,4±4,4 6 9,4±3,6 5 4,8±2,1 6 7,6±2,98 25 6,7±1,3

Род Neisseria 1 2,1±2Д 1 0,3±0,3

Род Corynebacterium 1 2,4±2,4 1 2,9±2,8 2 4,2±2,9 1 1,6±1,6 1 0,9±0,9 1 1,3±1,3 7 1,9±0,7

Дрожжеподобные грибы 1 0,9±0,9 1 1,3±1,3 2 0,5±0,4

Анаэробы 1 2,4±2,4 3 6,3±3,5 2 1,9±1,3 6 1,6±0,7

Род Peptostreptococcus 1 2,4±2,4 1 0,3±0,3

Род Clostridium 3 6,3±3,5 3 0,8±0,46

Род Bacillus 2 1,9±1,3 2 0,5±0,37

ИТОГО 42 100 35 100 48 100 64 100 104 100 79 100 372 100

Анализ суммарной частоты встречаемости отдельных микробных видов в изучаемый период показал, что ведущее место среди них заняли 2 представителя: Е. coli (21,0±3,1%) и S. epidermidis (15,3±2,7%) (таблица 2). Они в совокупности составили 36,3±3,6% и включены нами в основную группу бактерий. Прочие, редко встречаемые виды, в совокупности составили 47,6±3,8%, удельный вес каждого из них составил от 1,1±0,8% до 6,7±1,9%. Редкими находками были: прочие представители стафилококков 22,8±3,1, энтеробактерий - 8,3±2,1%, НГОБ 4,6 ±1,6%. Остальная микрофлора (60 видов) была выделена в виде единичных культур, совокупность которых составила — 16,1±1,9% и отнесена нами к группе эпизодически встречаемых микроорганизмов.

Таблица 2

Суммарная доля основных и редких микроорганизмов операционной раны

Группы и виды бактерий Абс. число Удельный вес

Основная группа бактерий

Грамположительные кокки-S. epidermidis 57 15,3±2,7

Грамотрицательные палочки- Е. coli 78 21,0±3,1

Итого по группе 135 36,3±3,6

Группа редких видов

Стафилококки S. saprophytics 25 6,7±1,9

S. haemolyticus 22 5,9±1,8

S. intermedins 15 4,Oil,5

S aureus 14 3,8±1,4

S. hominis 5 1,3±0,8

S. caprae 4 1,1±0,8

Итого 85 22,8±3,1

Микрококки M. agilis 9 2,4±1,2

M.roseus 7 1,9±1,0

M. sedentarius 24 6,5±1,9

M. nishinomiyaensis 4 1,1±0,8

Итого 44 11,9±2,4

Энтеробактерии E.aerogenes 13 3,5±1,4

С. freundii 5 1,3±0,9

С. diversus 4 1,1±0,8

К. pneumonia 9 2,4±1,2

Итого 31 8,3±2,1

НГОБ P. aeruginosa 5 1,3±0,8

A. Iwoffii 12 3,3±1,3

Итого 17 4,6±1,6

Итого по группе 177 47,6±3,8

При изучении микробиоценоза операционных ран в группах больных, которым проведены операции по профилю хирургического, гинекологического и акушерского отделений, установлено, что удельный вес представителей основной микрофлоры по мере усиления загрязнения ран от первого класса к четвертому повышался от 30,4±9,8% (при операциях I класса) до 25,6±3,6% (при операциях II класса), 47,3±5,1% - III класса и 42,1±4,7% - IV класса. Причем, удельный вес S. epidermidis снижался с увеличением класса с 30,4±9,8% в I до 22,8±3,5% во II, 7,3±2,7% и 9,1±2,8% III и IV, соответственно (рисунок 1). Е. coli в I классе не определялись, во II классе составили 2,8±1,4%, в III и IV классах обнаруживались с удельным весом до 40,0±5,03% и 33,0±4,5% соответственно.

В целом, по сумме выделенных микроорганизмов, микрофлора ХО характеризуется преобладанием Е. coli 32,6±3,1% , микрофлора ГО и АО - S. epidermidis - (28,6±8,7% и 21,4±3,8% соответственно).

Из 61 микроорганизмов, обнаруженных в составе ассоциаций в изучаемый период, в 11 случаях (18,0%) обязательным микроорганизмом был S. epidermidis и в 8 - Е. coli (13,1%). В целом стафилококки составили 40,9%, а энтеробактерии - 26,2%. Микрококки и НГОБ составили по 13,1%, коринебактерии и дрожжеподобные грибы, встречавшиеся в единичных случаях, - 4,9% и 1,6%, соответственно.

й S. epidermidis И В. coli Рисунок 1. Удельный вес основных микроорганизмов, выделенных интраопера-ционно (%).

Проведенный нами микробиоценотический анализ микропейзажа операционной раны с использованием показателей: индекса встречаемости, индекса значимости (Натке-вичайте-Иванаускене М. П., 1985), показателя видового разнообразия показал, что, несмотря на нарастание богатства видов в динамике, все выделенные микроорганизмы отнесены к группе эпизодически встречающихся или случайных, (индекс постоянства -

С<25%), так как операционная рана по своей сути не является биотопом человеческого организма с наличием постоянных обитателей. Наибольшим индекс постоянства был в группе грамположительных кокков (13%), средикоторых; у рода Staphylococcus 9,5%, грамотрицательных палочек 9%, семейство Enterobacteriaceae в том числе 7,6% (таблица 3). Прочие группы и рода встречались с еще меньшей частотой.

Таблица 3.

Индекс постоянства, микроорганизмов, выделенных из операционных ран в период

с 2005 по 2010 годы.

Наименование микроорганизмов Число проб с обнаружением микроорганизмов* Индекс постоянства (С,%)

Грамположительные кокки: 210 13

Род Staphylococcus 153 9,5

Род Micrococcus 52 3

Род Streptococcus 1 0,06

Род Enterococcus 4 0,25

Грамотрицательные палочки: 146 9

Сем. Enterobacteriaceae 121 7,6

НГОБ 25 1,6

Грамотрицательные кокки Род Neisseria 1 0,06

Грамположительные палочки Род Corynebacterium 7 0,44

Дрожжеподобные грибы Род Candida 2 0,13

Анаэробные микроорганизмы 6 0,38

Род Peptostreptococcus 1 0,06

Род Clostridium 3 0,19

Род Bacilus 2 0,13

ИТОГО 372 23,3

*- общее количество исследованных проб — 1596

Индекс постоянства всех выделенных микроорганизмов суммарно составил 23,3%.

Значимость микроорганизмов оценивали с учетом класса ран в основных группах (II, III, IV). Наиболее значимыми во II классе ран (операций) были бактерии Staphylococus spp., показатель их значимости составил 24,5%. Бактерии Е. coli оказались наиболее значимы в III классе с индексом 23,5%, стафилококки и прочие энтеробактерии -в IV классе ран (операций) (16,2% и 18%, соответственно). Микроорганизмы Micrococcus spp., Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., B. mesentericus имели низкие индексы значимости.

В динамике происходило нарастание качественного показателя богатства видов до 0,0026% (2009 г.), служившее компенсаторным механизмом низкого показателя их постоянства, а далее наметилось снижение видового разнообразия, как меры компенсации роста патогенных свойств оставшихся видов (рисунок 2).

% 0,005 ■>

Рисунок 2. Видовое разнообразие микроорганизмов (<!,%), выделенных в динамике.

При бактериологическом исследовании отделяемого 67 послеоперационных ран пациентов хирургического отделения обнаружено 46 микроорганизмов в 57% проб. Микрофлора послеоперационной раны была представлена 18 видами и 9 родами против 40 видов из 20 родов операционной раны.

Анализ суммарной этиологической значимости отдельных микробных видов в послеоперационной ране показал, что основное значение имели представители кокковой микрофлоры, а именно стафилококки, в совокупности составив 67,4±6,9% (рисунок 3).

17,4

КЗ Стафилококки ЕЭ НГОБ

В Микрококки В5 Энгеробактерии

Рисунок 3. Удельный вес обнаружения различных видов бактерий в послеоперационной ране (%).

Между группами стафилококков, выделенных из операционных и послеоперационных ран, зафиксированы статистически достоверные различия (р<0,05). Среди стафилококков лидирующее место занимал S. epidermidis 26,1±6,5 против 10,5±2,0% в операционных ранах (р<0,05). Второе место после стафилококков в этиологии послеоперационной раны занимали энтеробактерии - 17,4±5,6%, что в 2,7 раза меньше, чем доля их участия в этиологии операционной раны (р<0,05). Среди энтеробактерий также преобладали E.coli (8,7±4,1%) против 32,6±3,1% в операционных ранах (р<0,05).

Спектр выделенных у сотрудников стационаров хирургического профиля микроорганизмов включал 44 штамма, отнесенные к 4 родам и 11 видам. Бактерии рода Staphylococcus выделены в 90,9±4,3 % случаях, рода Micrococcus — 4,5±3,1%, кандиды (С. albicans) и нейссерии (N. mucosa) - по 4,5±2,3%.

В микрофлоре госпитальной среды стафилококки составили 57,6% как в воздухе, так и в смывах с поверхностей. Энтеробактерии обнаружены лишь в смывах с поверхностей, составив 12,1% в общем спектре микроорганизмов. Среди стафилококков выделены S. epidermidis и S.aureus по 10,6±3,8% с интенсивностью роста 101 - 102, прочие встречались реже.

Так как факторы патогенности генетически детерминированы, определение генетических детерминант, гомологичных известным генам патогенности «классических» патогенов Е. coli (hly А, hly В, sfa G, cnf 1, est В), было использовано нами для тестирования 46 клинических штаммов Е. coli и штаммов из внешней среды, из которых 58,7% оказались патогенными. При этом в операционной ране обнаружено 45,7% штаммов Е. coli с факторами патогенности, в послеоперационной ране и во внешней среде - по 6,5%. В общем пуле исследованных штаммов Е. coli, изолированных из операционных ран в 2007 - 2010 гг., образование искомых ампликонов имело место в 52,5% случаях.

Отмечено статистически достоверное количественное нарастание факторов патогенности микроба с 33,3% до 100% (р<0,001) 2007 - 2009 гг., 66,7% (р<0,002) в 2010 г. Ассоциативность генов патогенности статистически достоверно возрастала,превысив число штаммов с одиночными генами (75% против 25%, р<0,01). При этом отмечалось по два сочетания геновариантов - 58,3%, по три - 16,7%. Чаще встречались сочетания hly В, cnf 1 (33,3%). В общем разнообразии генов патогенности преобладали hly В - 52,5%, cnf 1 - 36,4%, sfa G- 24,2%, hly A - 12,1%. Энтеротоксин (est В) не был обнаружен ни в одном штамме. Разнообразие генов патогенности в штаммах Е. coli несколько отличалось по классам ран. В III классе ран преобладали sfa G (38,9%) и hly В (33,3%); cnf 1 составил

22,2%, hly A — 5,6%. В IV классе преобладали hly В и cnf 1 (40% и 33,3%, соответственно), sfa G - 6,7%, hly А — 20%. В ранах обоих классов преобладали ß-гемолитические и некро-тизирующие Е. coli.

На присутствие генетических детерминант (фибронектинсвязывающие протеины А и В, лейкоцидин) исследовано 48 штаммов S. aureus и 51 штамм S. epidermidis, изолированных из операционных и послеоперационных ран, зева и носа медицинского персонала, госпитальной среды. Гены патогенности обнаружены в 56,3% штаммах S. aureus и 15,7% штаммах S. epidermidis изолированных из различных источников (рисунок 4). Гены патогенности штаммов Staphylococcus spp. выявлялись с 2010 г., преимущественно детерминированы от медицинского персонала - 66,7%, из после- и операционных ран (50% и 27,7%). При этом гены патогенности штаммов S. aureus выделены преимущественно из операционных ран (81,8%) и от медицинского персонала (85%), с меньшей частотой из послеоперационных ран (50%) и представлены в основном фибронектинсвязы-вающими протеинами А и В (fnb р A, fnbp В). В штаммах, изолированных из операционных ран fnbp A, fnbp В составили 94,7%, лейкоцидин (lue PVSy-5,3 %; от медицинского персонала—100% fnbp A, fnbp В. В штаммах S. epidermidis, изолированных из послеоперационных ран генетические де терминанты, обнаруженные с частотой 50%, были представлены в 90,9% fnbpA, fnbp В и в 9,1% лейкоцидином. Маркер лейкоцидина обнаруживался у обоих видов (S. aureus и S. epidermidis) с практически с одинаковой частотой 4,2% и 3,9%, соответственно.

□ Гены обнаружены Н Гены не обнаружены

Рисунок 4. Выявление генов патогенности у штаммов Staphylococcus spp (S. aureus, S. epdermidis), %.

Устойчивость к антимикробным препаратам определяли у штаммов наиболее часто встретившихся в операционных ранах: S. epidermidis, S. aureus, Е. coli. Выраженность устойчивости к антибактериальным препаратам определялась свойствами штаммов, выделявшихся от пациентов хирургического стационара в разные периоды исследования (с 2008 г. по 2010 г. для S. epidermidis), но в целом чувствительность стафилококков к таким препаратам как цефтриаксон, офлоксацин, меропенем оставалась стабильно высокой (100%).

Чувствительность эпидермальных стафилококков к таким препаратам как фурагин, фурадонин, гентамицин, тобрамицин, цефуроксим, цефотаксим, рифампицин, ванкоми-цин составила более 80%, в том числе оставалась стабильно высокой (от 83,3±9,0% до 100%) весь изучаемый период к фурагину, гентамицину, тобрамицину, ванкомицину.

Напротив, устойчивость была достаточно высокой и продолжала нарастать к следующим антибиотикам: бензилпенициллину (от 76,4±10,6% до 83,3±11,2%), цефтазиди-му, налидиксовой кислоте, тетрациклинам, линкомицину, рифампицину и макролидам, за исключением эритромицина, и составила максимально в 2010 г. от 33,3±14,2 % до 58,3±14,9% резистентных штаммов.

Весь изучаемый период встречались штаммы S. epidermidis с множественной лекарственной устойчивостью. Для ее оценки нами был использован индекс множественной антибиотикорезистентности - MAR (Krumperman P. Н., 1983). В результате анализа установлено, что множественной антибиотикорезистентностью в 2008г. обладали 11,8% штаммов, 2009 г. и 2010 г. по 16,7%. Причем в 2010 г. зафиксирован штамм устойчивый к ванкомицину.

Анализ антибиотикочувствительности штаммов S. aureus, S. epidermidis, выделенных из различных биотопов показал, что резистентность к большему числу антибактериальных препаратов, мало зависит от биотопа, что подчеркивает циркуляцию единых микроорганизмов в хирургическом стационаре. Резистентность штаммов S. aureus, изолированных из разных источников, была ниже по всем группам антибактериальных препаратов, чем у штаммов S. epidermidis. Удельный вес штаммов с MAR > 0,2 был равен 15,7% и 17,6% у & aureus и S. epidermidis, соответственно.

При молекулярно-генетическом определении антибиотикочувствительности 51 штамма S. epidermidis и 48 штаммов S. aureus, выделенных из после - и операционных ран, госпитальной среды, от медицинского персонала обнаружено наличие гена метицил-линрезистентости (тес А) в 25,5% и 20,8%, соответственно.

Ген метициллинрезистентности обнаружен у 18,2% штаммов S. aureus, 24% штаммов S. epidermidis, изолированных из операционных ран.

В послеоперационных ранах генетические детерминанты антибиотикорезистенно-сти обнаружены в 10% штаммов только S. epidermidis. Штаммы S. aureus, выделенные из микрофлоры медицинского персонала, содержали тес А в 10% случаев, S. epidermidis в 4 раза чаще (42,9%). Обнаружение данного гена в микрофлоре госпитальной среды составило 33,3% у штаммов S. epidermidis и 40% S. aureus.

Устойчивость 78 штаммов Е. coli, выделенных из операционных ран проанализирована по 8 группам антибактериальных препаратов, включая препараты первого и дополнительного ряда, согласно МУК 4.2. 1890-04, в том числе с использованием метода серийных разведений.

Среднюю суммарную резистентность штаммы Е. coli проявляли к полусинтетическим пенициллинам (с 42,3±5,6% до 50±5,7%), фуразолидону - до 30,8±5,2%), канамици-ну - до 65,4±5,4%, пефлоксацину - до 34,6±5,4%, тетрациклину - до 64,1±5,4%. Высокую чувствительность сохраняли к карбопенемам и цефалоспоринам II поколения (цефурок-сим) до 100%; к цефалоспоринам III поколения (цефтазидиму) до 80,7±4,5%, фторхино-лонам II поколения (ципрофлоксацин, офлоксацин по 82,1±4,3%, 94,9±2,5%, соответственно), амикацину - до 96,1±2,2%, но с формированием устойчивости, выразившееся в появлении умеренно устойчивых штаммов к цефазолину 11,5±3,6%, цефтазидиму — 12,9±3,8%, ципрофлоксацину - 10,3±3,4%, амикацину - 2,6±1,8%. Удельный вес штаммов Е. coli с MAR, начиная с 2005 г. нарастает до 22,2%, удерживая данный уровень в 2009 г., и несколько снижаясь в 2010 г. (17,6%).

ВЫВОДЫ

1. Микроорганизмы, изолированные из операционных ран, относятся к группе эпизодически встречающихся или случайных. Группу основной микрофлоры составляют S. epidermidis, Е. coli с преимуществом выделения S. epidermidis в акушерском и гинекологическом отделении, Е. coli, - в хирургическом. Для микробиоценоза операционной раны характерно нарастание богатства видов, что служит компенсаторным механизмом низкого показателя их постоянства. Данные микроорганизмы имеют наибольший показатель значимости, зависящий от класса ран (II класс - Staphylococcus spp, III класс — Е. coli), нарастание в динамике удельного веса в моноформах и в ассоциациях.

2. Микробиоценоз глубокой АМФК хирургических больных преимущественно представлен: Staphylococcus spp (S. epidermidis - 37,8%, S. saprophytics - 29,3%), соста-

вив в моноформах - 78,9%, в ассоциациях - 14,5%. Преобладание стафилококков, отмеченное как в микрофлоре операционных и послеоперационных ран, так и в мико-флоре внешней среды и медицинского персонала, свидетельствует о формировании единого микробиоценоза между различными биотопами.

3. Мониторинг микробиоценоза операционной раны выявил увеличение удельного веса штаммов Е. coli с детерминированием генов патогенности с высоким уровнем колонизации р - гемолитическими вариантами (52,5%). Комбинации генов отмечены с 2009 г., резко нарастая в динамике: преимущественно hly В, cnf 1 (33,3%), hly В, sfa G (22,2%), hly В, cnfl, sfa G (22,2%), что подчеркивает потенциальную патогенность данных этнеро-бактерий, участие их в развитии раневой инфекции и в усугублении патогенетических процессов.

4. Гены патогенности штаммов Staphylococcus spp. выявляются с 2010 г., преимущественно детерминированы из после- и операционных ран (50% и 27,7%), от медицинского персонала - 66,7%. При этом гены патогенности штаммов S. epidermidis выделены преимущественно из послеоперационных ран в ХО (62,5%), S. aureus - из операционных ран (33,3%) и от медицинского персонала (63,8%), причем чаще fnbp A, fnbp В. Изоляты Staphylococcus spp из биоматериала обнаруживают генетические детерминанты лейкоци-дина, являющиеся маркерами тяжелых инфекционных процессов, в равном количестве, что позволяет судить о горизонтальном переносе luc PVS. Амплификация fnbp A, fnbp В, lucPVS может использоваться для подтверждения патогенности клинических изолятов Staphylococcus spp, и служить объективным критерием при оценке их эпидемического значения.

5. Чувствительность микрофлоры к АБП зависела от вида микроорганизма, препарата, мало зависела от биотопа. Имели наибольшую чувствительность штаммы S. aureus к гентамицину, ванкомицину, ципрофлоксацину, рифампицину; штаммы S. epidermidis — к цефуроксиму, ванкомицину, меропенему, офлоксацину; штаммы Е. coli к цефаклору, цефуроксиму, цефтазидиму, амикацину, меропенему, ципрофлоксацину, офлоксацину. Отмечено нарастание в динамике удельного веса штаммов S. epidermidis, Е. coli с множественной антиботикорезистентностью.

6. Гены устойчивости к метициллину у штаммов S. epidermidis обнаруживались чаще, особенно у изолированных из биопроб, что может свидетельствовать о ведущей роли эпидермального стафилококка в передаче подвижного генетического элемента тес А золотистому стафилококку.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ

И ПРАКТИКУ

1. Учитывая факт обнаружения в операционной ране микроорганизмов вне зависимости от чистоты операции, рекомендовать проводить микробиологические исследования отделяемого операционной раны, подкожно-жировой клетчатки интраоперационно и на пятый день после операции с использованием расширенного набора дифференциально-диагностических и селективных питательных сред и культивированием их в аэробных и анаэробных условиях, с количественным определением выделенной микрофлоры, профиля антибиотикочувствительности как к препаратам выбора, так и к препаратам других классов и групп. В характеристике выделенной микрофлоры необходимо учитывать весь спектр микроорганизмов и их антибиотикочувствительность.

2. Рекомендовать определение факторов патогенности молекулярно-генетическим методом для ускорения идентификации патогенных свойств микроорганизмов, оценки степени их патогенности:

-Клинических штаммов К coli - hly A, hly В, sfa G, cnf 1; —Клинических штаммов S. aureus и S. epidermidis - fnbp A,fnbp B, lue PVS.

3. В случае выделения из операционных ран штаммов S. aureus, S. epidermidis, обладающих множественной шпибиотикорезистентносгью и гегерорезисгенгносгыо к оксациллину, использовать определение гена метициллинзистентности тес А для подтверждения MRSA и MRSE.

4. Проводить в лечебных учреждениях постоянный мониторинг патогенности и антибио-тикорезистентиности, в том числе метициллинрезистентности, циркулирующих штаммов для обоснования риска развития ИОХВ и назначения эффективной этиотропной химиотерапии.

5. Для эмпирической терапии ИОХВ рекомендовать использование следующих антибактериальных препаратов: При обнаружении в ране стафилококков (S. aureus, S. epidermidis)-. цефуроксим, ванкомицин, меропенем, офлоксацин; кишечной палочки: цефаклор, меропе-нем. Возможно использование с индивидуальным подходом нитрофуранов и гентамицина при выделении из ран кишечной палочки, эпидермального стафилококка.

6. Подготовлены и внедрены в практическое здравоохранение методические разработки «Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования», «Определение генетических маркеров факторов патогешюсти Е coli методом ПЦР-РВ»; рационализаторское предложение «Метод бакпечаток для культурального исследования глубокой ау-томикрофлоры у хирургических больных» № 2787 от 22 июня 2011г.; информационное письмо «Мониторинг антибиотикорезистентносги микрофлоры операционных ран».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шаркова, В. А. Микробиоценоз операционной раны и его зависимость от класса / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 5 (2). - С. 379-383.

2. Шаркова, В. А. Генетически обусловленная патогениость и антибиоти-корезистентность штаммов Staphylococcus spp. / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман // Дальневосточный мед. журн. — 2013. — № 3. — С. 28-31.

3. Случай обнаружения S. enteritidis в послеоперационной ране / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, Н. А. Баранова, И. Д. Шарафулнеламова, А. Т. Федо-ренко, В. А. Гуркалюк, И. Ю. Карташов // Дальневосточный мед. журн. - 2011. -№ 4. - С. 104-109.

4. Characteristic of patogenicity of strains К coli, isolated from incisional wounds / E. F. Laiman, V. A. Sharkova, M. E. Mazur, M. N. Prosiannikova // European Science and Technology : mat. II International Research Practice Conf., Wiesbaden (Germany), 9-10 мая 2012 г. - Wiesbaden, Germany. 2012. - Vol. II. - P. 463-468.

5. Шаркова, В. А. Чувствительность к антибиотикам микрофлоры операционных ран / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Материалы научно-практической конференции с международным участием. «Инфекции в практике клинициста. Антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах», Харьков, 27-28 марта 2008 г. / ред. В.П. Малой, И.С. Кратенко - Харьков, 2008. -С. 372-373.

6. Лайман, Е. Ф. Микробный пейзаж операционных ран / Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. IX Тихоокеанской науч.-практич. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Владивосток, 20 сентября 2008 г. ВГМУ / ред. В. А. Невзорова, О. В. Семешина, Т. А. Бродская. — Владивосток: Медицина ДВ, 2008.-С. 60-61.

7. Лайман, Е. Ф. Мониторинг внешней среды хирургического стационара / Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Медицинские науки. - 2008. - № 6. - С. 7. — Приложение к журн. «Современные проблемы науки и образования».

8. Лайман, Е. Ф. Устойчивость коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных интраоперационно к антибактериальным препаратам / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, Н. А. Баранова // Человек и лекарство: тез. докл. VII Дальневосточного регионального конгресса, Владивосток, 30 сентября-1 октября 2010 г. ВГМУ / ред. В.Б. Шуманов. -Приложение к журн. «Тихоокеанский мед. журн.». - 2010. - № 3. - С. 28.

9. Структура таксономических групп микрофлоры ран при различных типах хирургического вмешательства / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова [и др.] // Тез. XVI междунар. конгр. по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Москва,

15-19 сентября 2011 г. / ред. Р.И. Сепиашвили - Аллергология и иммунология. - 2011. — Т. 12. № 1.-С. 95-96.

10. Лайман, Е. Ф. Динамика антибиотикорезистентности штаммов Е. coli, выделенных интраоперационно / Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Человек и лекарство : тез. докл. VIII Дальневосточного регионального конгр., Владивосток, 15-16 сентября 20011 г.

- Приложение к журн. «Тихоокеанский мед. журн. - 2011. - № 3. - С. 55-56.

11. Характеристика видового состава и устойчивости к антимикробным препаратам микробиоценоза верхних дыхательных путей медицинского персонала / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, Н. А Баранова [и др.] // Междунар. журн. прикладных и фундаментальных исследований. -2011. -№ 10. - С. 66.

12. Молекулярно-генетическая характеристика патогенности штаммов Staphylococcus spp., изолированных из операционных ран / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, М. Е. Мазур, М. Н. Просянникова // Междунар. журн. экспериментального образования. — 2012.-№ 7.-С. 69.

13. Шаркова, В. А. Молекулярно-генетический мониторинг метициллинустой-чивых штаммов Staphylococcus spp / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, М. Е. Мазур // Мат.

XIV Междунар. конгр. MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии // КМАХ. - 2012.

— Т. 14, № 2. — С. 57. — Приложение 1

14. Молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности штаммов Е. coli, выделенных из операционных ран различных классов / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, М. Е. Мазур, М. Н. Просянникова // Междунар. журн. экспериментального образования. - 2012. - № 5. - С. 84-85.

15. Лайман, Е. Ф. Характеристка микрофлоры послеоперационных ран / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова // Мат. Второго Евро-Азиатского конгр. Общества по инфекционным болезням, Астана (Казахстан), 12-14 сентября 2012 г. / под ред. В. И. Покровского, Ю. В. Лобзина. - Астана (Казахстан), 2012. - С.48.

16. Шаркова, В. А. Динамика патогенности и антибиотикорезистентности штаммов Е. coli, выделенных из операционных ран // В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман // Мат.

XV Междунар. конгр. MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. // КМАХ. - 2013. -Т. 15, №2.-С. 48.-Приложение 1.

17. Лайман, Е. Ф. Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования: методическая разработка / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова. — Владивосток, 2012. — 14 с.

18. Лайман, Е. Ф. Определение генетических маркеров факторов патогенности Е. coli методом ПЦР: методическая разработка / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, М. Е. Мазур. - Владивосток, 2012. - 17 с.

19. Шаркова, В. А. Мониторинг шггибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран: информационное письмо / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман. - Владивосток, 2013. - 27 с.

Рационализаторское предложение

Шаркова, В. А. Метод бакпечаток для культурального исследования глубокой аутомикрофлоры у хирургических больных: рационализаторское предложение / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман. - (Удостоверение № 2787 ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава России, г. Владивосток от 22.06.2011).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМФК - аутомикрофлора кожи АО - акушерское отделение ВДП — верхние дыхательные пути

ИОХВ - инфекции в области хирургического вмешательства НГОБ - неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы ХО - хирургическое отделение ГО - гинекологическое отделение MAR-множественная антибиотикорезистентность.

Лайман Елена Федоровна

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 23.10.2013. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 120 экз.

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Лайман, Елена Федоровна, Владивосток

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

04201450639 На правах рукописи

Лайман Елена Федоровна

Микробиологическая и молекулярно-геиетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран

03.02.03. - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Шаркова В.А.

г. Владивосток - 2013 г.

Оглавление

Список сокращений 5

Введение 6

Глава 1. Обзор литературы. Раневые инфекции, их микробиологическая характеристика 12

1.1 .Раневые инфекции, раневой процесс, классификация ран 12

1.1.1. Распространенность раневых инфекций 12

1.1.2. Классификация ран 15

1.1.3. Раневой процесс, его патофизиологические аспекты 17

1.1.4. Факторы, способствующие возникновению послеоперационных инфекций 21

1.2.Микробиологическая характеристика раневых инфекций 27

1.2.1. Этиология инфекций области хирургического вмешательства 27

1.2.2. Генетические маркеры патогенности возбудителей послеоперационных раневых инфекций 35

1.2.2.1. Генетические маркеры патогенности стафилококков 3 6

1.2.2.2. Генетические маркеры патогенности Е. соИ. 39

1.3.Резистентность штаммов-участников инфекций области хирургического вмешательства к антибактериальным химиопрепаратам 41

Глава 2. Контингент, материалы, направления и методы исследования 44

2.1. Контингент, материалы исследования 45

2.2. Направления исследования 48

2.3. Методы исследования 5 О 2.3.1. Анализ клинического материала 5 О 2.3.1.1. Факторы риска развития инфекции области хирургического вмешательства 50 2.3.1.1.1. Изучение зависимости контаминации операционных ран от класса.

52

2.3.1.2. Признаки наличия инфекции в области хирургического вмешательства. 55

2.3.2. Микробиологические методы 57

2.3.2.1. Отбор проб для микробиологического исследования 57

2.3.2.2. Микробиологическое исследование материала 60

2.3.2.3. Определение устойчивости к антимикробным препаратам 63

2.3.2.4. Определение факторов патогенности 64

2.3.3. Молекулярно-генетические методы 65

2.3.3.1. Выявление генов, детерминирующих патогенные свойства Е. coli

65

2.3.3.2. Выявление генов, детерминирующих патогенные свойства микробов рода Staphylococcus 66

2.3.4. Статистические методы 67 Глава 3. Микробиологическая характеристика микрофлоры операционных ран, медицинского персонала, объектов госпитальной среды 69

3.1. Характеристика глубокой аутомикрофлоры кожи хирургических больных 69

3.2. Характеристика микрофлоры операционных ран 73

3.2.1. Особенности микробиоценоза операционных ран в зависимости от биотопа 87

3.2.2. Микробиоценоз операционных ран больных различных стационаров хирургического профиля 91

3.3. Характеристика микрофлоры послеоперационных ран 98

3.4. Микрофлора медицинского персонала отделений хирургического профиля 101

3.5. Микрофлора госпитальной среды отделений хирургического профиля

102

3.6. Характеристика ассоциаций микрофлоры 105

3.7. Изучение микробиоценотической характеристики операционных ран

107

Глава 4. Генетическая характеристика патогенности штаммов Е. coli, изолированных из операционных и послеоперационных ран, госпитальной среды 115

4.1. Определение детерминант основных факторов патогенности Е. coli и их комплекса 117

4.2. Обнаружение генов факторов патогенности Е. coli, выделенных из операционных ран различных классов 121 Глава 5. Генетическая характеристика патогенных свойств штаммов стафилококков, изолированных из биологического материала и госпитальной среды 125 5.1. Определение детерминант основных факторов патогенности стафилококков. 126 Глава 6. Мониторинг формирования антибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран 132

6.1. Чувствительность к антибиотикам штаммов Staphylococcus spp 132

6.2. Определение гена тес А у штаммов стафилококка 144

6.3. Устойчивость штаммов Е. coli к антибактериальным препаратам 147 Заключение 154 Выводы 175 Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практическое здравоохранение 177 Список литературы 179

Список сокращений

АБП - антибактериальные препараты

ДДМ - диско-диффузионный метод

ВДП - верхние дыхательные пути

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ИОХВ - инфекции в области хирургического вмешательства

КОЕ - колониеобразующие единицы

КОС - коагулазоотрицательные стафилококки

КПС - коагулазопозитивные стафилококки

MAP - множественная антиботикорезистентность

МЛУ множественная лекарственная устойчивость

МПК - минимальная подавляющая концентрация

НГОБ - неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы

ОМЧ - общее микробное число

ОП - «острова» патогенности

ПЖК подкожно-жировая клетчатка

ПОИ послеоперационная инфекция

ППО поздние послеоперационные осложнения

ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ЭБИ - эндогенная бактериальная инфекция

MAR -индекс множественной антиботикорезистентности

Введение

Актуальность темы. Практически любая рана, даже нанесенная в условиях операционной, содержит определенное количество микробов, в том числе способных вызвать послеоперационную инфекцию, определяемую как клинически распознаваемое инфекционное осложнение [2]. Многолетняя динамика инфекций в области хирургического вмешательства (ИОХВ) в России не изучена в связи с отсутствием объективных данных об их частоте, поэтому изучение микробного состава операционной раны, является одним из этапов решения указанной проблемы [67, 107].

Оценке микробного фактора в развитии раневой инфекции всегда уделялось большое внимание. Несомненно, вид и количество микроорганизмов и их патогенные свойства играют существенную роль в возникновении и развитии гнойно-воспалительных осложнений и во многом определяют характер их течения [29, 48].

В настоящее время доказано, что инфекционный процесс в ране может быть вызван микрофлорой различной степени патогенности. Массивная антибиотикотерапия, проводимая без учета характера возбудителя, подавляет нормальную микрофлору, облегчая условия жизнедеятельности антибиотикоустойчивых микробов [29, 146, 208]. Наряду с этим, у микробов-возбудителей патологического процесса происходит ускорение модификации в сторону появления и усиления патогенных свойств [126, 30, 47].

Поскольку, видовое разнообразие микроорганизмов увеличивается, а их патогенные свойства и устойчивость к антимикробным препаратам усиливаются, вопросы изучения микробного аспекта и его влияния на патогенез, клинику и лечение ИОХВ, усовершенствование диагностики, поиск новых эффективных противомикробных лекарственных препаратов являются актуальными, что и определило выбор цели и основных задач настоящего исследования.

Цель исследования: Определение микробного состава операционной раны, молекулярно-генетической характеристики основных штаммов-контаминатов, антибиотикорезистентности микрофлоры, обоснование рациональной антибактериальной терапии инфекций в области хирургического вмешательства. Задачи исследования:

1. Определить микробиоценоз операционной раны в динамике шести лет с учетом класса ран (операций) с выявлением основной этиологической группы и состава, микробных ассоциантов, дать экологическую характеристику.

2. Оценить глубокую аутомикрофлору кожи хирургических больных, микрофлору слизистых верхних дыхательных путей (ВДТТ) медицинского персонала и микрофлору внешней среды отделений хирургического профиля.

3. Дать молекулярно-генетическую характеристику патогенных свойств основных видов микробов, изолированных из различных биотопов, оценить ее значимость при ИОХВ в динамике исследования.

4. Оценить устойчивость к антибиотикам микрофлоры операционных ран.

5. Разработать рекомендации по микробиологической диагностике и оптимизации терапии ИОХВ.

Научная новизна. Впервые проведен микробиологический мониторинг штаммов, изолированных из после и операционных ран в условиях многопрофильного хирургического стационара. Выявлена доминирующая микрофлора E.coli и S. epidermidis и их варианты в микробных ассоциациях. Указанные микроорганизмы отнесены к эпизодически встречающимся по показателю постоянства. Имеют наибольший показатель значимости и наибольшую плотность распределения, которая увеличивается с ростом класса ран (операций). Показано, что клинические штаммы Е. coli, S. aureus, S. epidermidis несут фрагменты ДНК

«островов» патогенности, гомологичные известным генам кластеров патогенности, позволяющие обсуждать наличие потенциальной опасности данных микроорганизмов и участие их в развитии раневой инфекции. У 58,7% штаммов E.coli обнаружено присутствие генов, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрин типа S (sfa G) цитотоксический некротизирующий фактор (cnf 1) , гемолизины (hly А и My В) с преобладанием высокого уровня ß-гемолитических кишечных палочек в ранах III- IV класса с тенденцией к нарастанию патогенности в динамике исследования. Выявлены различия выраженности маркеров факторов патогенности fnbp A, fnbp В, lue PVS с преобладанием генов адгезии (до 85%) у штаммов S. aureus и S. epidermidis, изолированных из различных источников.

Выявлено появление комбинаций генов патогенности: штаммов E.coli -с 2009 г., S. aureus и S. epidermidis - с 2010г., повышающие патогенные свойства изолятов {hly В, cnf /и fnbp A, fnbp В, lue PVS, соответственно).

Проведено мониторирование антибиотикорезистентности основных штаммов-контаминатов, изолированных из операционных ран, у группы которых - штаммы Staphylococcus spp., определены генетические особенности формирования антибиотикорезистентности. Предложена, возможная коррекция терапии инфекций в области хирургического вмешательства.

Практическая значимость исследований. Разработаны схемы отбора проб клинического материала, критерии мониторинга антибиотикорезистентности, с целью идентификации клинически значимых микроорганизмов, контаминирующих операционные раны. Определена схема эффективного применения молекулярно-генетических методов с целью микробиологического мониторинга патогенности и

метициллинрезистентности значимых штаммов микроорганизмов, выделенных из различных биотопов хирургического стационара.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов E.coli и Staphylococcus spp. предлагает и обосновывает

эффективную этиотропную химиотерапию, в том числе, для последних, с определением гена тес А при множественной антибиотикорезистентности и гетерорезистентности.

Подготовлены и внедрены в практическое здравоохранение методические разработки «Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования», «Определение генетических маркеров факторов патогенности Е. coli методом ПЦР-РВ»; информационное письмо

«Мониторинг антибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран»; рационализаторское предложение «Метод бакпечаток для культурального исследования глубокой аутомикрофлоры у хирургических больных» (№ 2787 от 22 июня 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микробиоценоз операционных ран характеризуется богатством видов, группу основной микрофлоры составляют Е. coli и S. epidermidis. Рост контаминации операционных ран происходит от первого класса к четвертому за счет нарастания удельного веса Е. coli и снижения штаммов S. epidermidis.

2. Штаммы Е. coli, изолированные из операционных ран, характеризуются высоким уровнем колонизации ß-гемолитическими вариантами, преобладанием комбинаций генетических детерминант патогенности (Ыу В, cnf 1). S. epidermidis, изолированный из послеоперационных ран, характеризуются наличием генетических маркеров fnbp A, fnbp В, что определяет его как потенциальный патоген.

3. Чувствительность микрофлоры к антибиотикам мало зависит от биотопа. Антибиотикорезистентность основных штаммов - контаминантов операционные раны характеризуются ростом удельного веса штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, появлением гена тес А у изолятов S. epidermidis, S. aureus.

Апробация научных материалов диссертации прошла на разных уровнях: Европейском съезде инфекционистов (г. Витебск, 2007 г.), IX и XI

Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, (г. Владивосток, 2008 г., 2010 г.), Научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста. Антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (г. Харьков, 2008 г.), VII, VIII Дальневосточного регионального Конгресса «Человек и лекарство» (г. Владивосток, 2010 г., 2011 г.), XVI Международном Конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилита- ции (Франция, г. Париж, 2011 г.), научной конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Турция, г. Анталия, 2011 г.), 2nd International Conference on European Science and Technology (2й Международной научно-практической конференции "Европейская наука и технологии" (Germany, Wiesbaden, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Италия, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (Италия, 2012 г.), XIV, XV Международных конгрессах MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии (г. Москва, 2012 г., 2013 г.).

Результаты диссертационного исследования обсуждены на заседании кафедры микробиологии и вирусологии (протокол № 6, от 15.02.2013 г.) и проблемной комиссии «Инфекционные болезни, гигиена, эпидемиология, микробиология, иммунология» (протокол № 10 , от 02.07.2013г.) ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России.

Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано 19 научных публикаций, в том числе 3 статьи в печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ, одна - в международной печати, 2 методические разработки, 1 информационное письмо. Имеется рационализаторское предложение.

Личный вклад автора. Автором осуществлена систематизация и анализ полученного материала. Лично автором проведены забор проб и посев

биоматериала от хирургических больных, материала госпитальной среды и ВДП медицинского персонала; осуществлено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам; молекулярно-генетические исследования основных штаммов бактерий. Все методы статистической обработки выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации традиционная. Ее текст изложен на 207 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 54 таблицами, 10 рисунками, 1 схемой. Она включает: введение - главу «Контингент, материалы, направления и методы исследования», собственные исследования - (4 главы), заключение - общие выводы, рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практику. Использовано 293 литературных источника, в том числе 184 отечественных и 109 иностранных авторов.

Глава 1. Обзор литературы. Раневые инфекции, их микробиологическая

характеристика

1.1. Раневые инфекции, раневой процесс, классификация ран 1.1.1. Распространенность раневых инфекций

В последние годы наблюдается рост частоты инфекционных осложнений ран, что объясняется выросшим объемом оперативных вмешательств, появлением возбудителей, резистентных к антимикробным препаратам, увеличением пациентов с иммунодефицитными состояниями и сопутствующими заболеваниями, влиянием госпитальной среды, рядом других факторов [52, 69, 80, 1, 2, 3, 132, 171, 229].

В клиниках США и Европы, для определения данного вида осложнений пользуются термином инфекция в области хирургического вмешательства (ИОХВ), критерии определения которого сформулированы в руководстве ШСРАС в 1999 г. (Hospital Infection Control Practices Advisory Committee) консультативного комитета по контролю внутрибольничных инфекций, работающего под эгидой Центра по контролю и профилактике болезней (CDC) США [130]. В Российской Федерации термин «инфекция в области хирургического вмешательства» не имеет достаточного распространения, однако его критерии регламентированы СанПиН 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность», утвержденных постановлением главного санитарного врача РФ № 58 от 18. 05.2010 г. В тексте документа вместо термина «инфекции в области хирургического вмешательства» используется более широкий термин «внутрибольничная инфекция» (ВБИ) [176,141]. Ряд отечественных авторов используют термин послеоперационная инфекция (ПОИ) [152, 22, 2]. В своей работе мы чаще использовали термин ИОХВ, на наш взгляд более приемлемый, позволяющий конкретизировать ПОИ.

Инфекция в хирургии занимает одно из основных мест и определяет сущность многих заболеваний и послеоперационных осложнений [155,7]. Больные с гнойно-воспалительными заболеваниями составляют 1/3 всех хирургических больных. Эти патологические процессы включают следующие группы: 1 - гнойные заболевания; 2 - гнойно-деструктивные процессы при острых хирургических заболеваниях; 3 -