Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона"

р г п 0

' 1 и ^м На правах рукописи

ИСАЕВА

Марина Петровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЮЖНО-СИХОТЭ-АЛИНЬСКОГО ОЧАГОВОГО РЕГИОНА

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ВЛАДИВОСТОК - 1998

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Сибирского Отделения РАМН и в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного Отделения РАН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Г.НЛеонова

кандидат биологических наук В.Б.Кожемяко

Научный консультант: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В. А. Рассказов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Р.А.Слонова

член-корреспондент РАМН, профессор В.И.Злобин

Ведущая организация: Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ

Защита состоится "¿0" О. 6 1998 г. в // часов на заседании Диссертационного Совета (К.084.24.01) при Владивостокском Государственном медицинском университете по адресу: 690600, г.Владивосток, ул.Острякова,2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского университета

Автореферат разослан " ^ О " 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук,

Р.Н.Диго

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус клещевого энцефалита (вКЭ) относится к семейству Flaviviridae, включающему около 70 классифицированных членов, многие из которых имеют важное эпидемиологическое значение (Westaway, 1985). С современных позиций, вКЭ является широко распространенным политипическим видом, которому свойственна значительная географическая и внутрипопуляционная изменчивость по ряду антигенных и биологических признаков (Львов, 1989). Начатые в 90-х годах исследования в области молекулярной эпидемиологии и генетической дифференциации штаммов вКЭ (Шаманин, 1990; Злобин, 1990, 1992, 1996; Погодина, 1992) подтверждают представление о внутривидовой гетерогенности этого вируса.

Территория Приморского края является эндемичным регионом, где ежегодно клещевым энцефалитом (КЭ) заболевает от 30 до 200 и более человек. Летальность у заболевших КЭ в разные годы составляет от 20 до 35%, что определяет характерные особенности в этиологии, эпидемиологии и клинике этой инфекции на Дальнем Востоке (Леонова, 1987-1997). В этой связи, изучение молекулярной характеристики изолятов вКЭ представляет значительный научный и практический интерес для оценки эпидемической опасности, связанной с циркуляцией разных по вирулентности штаммов на территории Приморского края.

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с применением олигонуклеотидных зондов является высокоспецифичным, способным выявлять тонкие штаммовые различия в вирусном геноме (Wallace, 1979; Kerschner, 1986; Shamanin, 1990). Данный метод надежно зарекомендовал себя для идентификации и детекции штаммов вКЭ (Злобин, 1990, 1992; Дрокин, 1993). С помощью этого метода установлена выраженная генетическая вариабельность штаммов вКЭ, выделенных из иксодовых клещей на территории различных эпидемических районов от Приморского края (на востоке) до Западной Украины и Калининградской области (на западе) (Злобин, 1996). При этом практически не исследовались штаммы, изолированные от больных людей, а также от лиц с инаппарантной формой инфекции КЭ. Кроме того, проведенные с помощью этого метода единичные исследования (Леонова, 1992; Злобин, 1992) штаммов вКЭ, изолированных на территории Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона, не позволили получить полное представление о молекулярной структуре

региональной вирусной популяции.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось определение молекулярно-генетической характеристики штаммов вКЭ Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона при использовании синтетических дезоксиолигонуклеотидных зондов, а также сравнительное изучение репродукции некоторых штаммов и ответной реакции клетки-хозяина на вирусную инфекцию in vivo и in vitro.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить данные по молекулярно-генетической характеристике штаммов вКЭ с помощью синтетических дезоксиолигонуклеотидных зондов.

2. Дать оценку специфичности гибридизации используемого в работе набора зондов относительно популяции вКЭ Южно-Сихотэ-Алиньского природного очага.

3. Изучить генетическую вариабельность штаммов вКЭ региональной вирусной популяции.

4. Провести сравнительный анализ молекулярно-генетической характеристики штаммов, изолированных от больных КЭ и от клинически здоровых лиц с присасыванием клеща.

5. Изучить в сравнительном плане репродукцию штаммов вКЭ, имеющих различные молекулярно-генегические характеристики, на разных моделях культивирования in vivo и in vitro.

6. Выяснить характер механизма цитопатического действия вКЭ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гетерогенность региональной вирусной популяции на основе молекулярно-генетической характеристики штаммов вКЭ.

2. Генетические варианты и патогенотипы как отражение молекулярной структуры вирусной популяции КЭ.

3. Особенности репродуктивного цикла разных штаммов вКЭ и ответной реакции клетки-хозяина на вирусную инфекцию.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены данные о молекулярной структуре вирусной популяции Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона на основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот при использовании набора дезоксиолигонуклеотидных зондов, комплементарных геному штамма Софьин.

Показана выраженная генетическая вариабельность изученных штаммов вКЭ. Выявлено несколько уровней специфичности зондов, на основе которых получены пять генетических вариантов вКЭ. Исходя из результатов гибридизации дезоксиолигонуклеотидных зондов с РНК штаммов, выделенных от людей, установлены критерии для патогенетической дифференциации региональных штаммов вКЭ. Показано распространение выделенных нами патогенотипов вКЭ на территории Приморского края. Данные результаты служат основой для дальнейших исследований по определению нуклеотидных последовательностей, обусловливающих вирулентные свойства штаммов вКЭ. Полученные результаты по дифференциации штаммов на патогенотипы могут быть использованы для разработки новых подходов для ранней клинической диагностики разных форм проявлений инфекционного процесса К.Э.

Проведено сравнительное изучение динамики размножения региональных штаммов на разных моделях культивирования, что позволило выявить индивидуальные особенности репродукции штаммов вКЭ, имеющих разные молекулярно-генетические характеристики. Впервые установлено, что ответной острой реакцией клетки-хозяина на вирусную инфекцию КЭ является запрограммированная гибель клетки или явление апоптоза, известное при других вирусных инфекциях. Дальнейшие целенаправленные исследования по выяснению молекулярных основ патогенное™ вКЭ, а также механизма вирусиндуцированной запрограммированной гибели клеток-мишеней может стать основой для разработки новых подходов к лечению этой тяжелой нейроинфекции. Апробация полученных результатов и практической ценности. Основные положения диссертационной работы обсуждались на:

Международной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (г. Иркутск, 1996);

Юбилейном заседании, посвященном 60-летию открытия вируса клещевого энцефалита на Дальнем Востоке (Владивосток, 1997);

Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследование в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 1997). Апробация работы состоялась 30 апреля 1998 г. на совместном Ученом Совете НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации наложен на /^.страницах с 21 рисунком и 13 таблицами. Диссертационная работа состоит из введения, 8 глав (3 главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований), заключения и выводов. Библиографический указатель содержит 30 отечественных и 158 зарубежных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы. В работе использованы 41 штаммы вКЭ, которые были выделены в лаборатории КЭ НИИЭМ СО РАМН в период с 1973 по 1994 годы. Сведения о региональных штаммах вКЭ представлены в табл.1. В исследование взяты 8 штаммов вКЭ, изолированных из клещей I.persulcatus, и 33 штамма, выделенных от больных КЭ и клинически здоровых лиц с присасыванием иксодовых клещей. Штаммы вКЭ, изолированные от людей, включают: 13 из крови больных с инаппарантной формой КЭ; 8 из крови больных с лихорадочной формой КЭ; 10 из мозга умерших и 2 из крови выздоровевших людей с очаговыми формами КЭ. Изоляция штаммов из крови проведена методом, разработанным Г.Н.Леоновой (патент N1836422). Идентификация штаммов проводилась с помощью общепринятых методов иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием коммерческих диагностикумов и специфических иммунных сывороток морских свинок к региональным штаммам вКЭ. Большинство штаммов прошли от 1 до 6 пассажей через мозг белых мышей 2-х суточного возраста.

В качестве зондов в работе использовали набор дезоксиолигонуклеотидов, комплементарных участкам генов С, ргМ, M, Е, NSI, NS2b, NS4b штамма Софьин, сконструированных В.А.Шаманиным с соавт. (Shamanin, 1990). Дезоксиолигокуклеотиды (SI, S2, S3, S5, Р2, Р5, PIO, Р31, Р131, Х2), любезно предоставленные В.А.Шаманиным и В.И.Злобиным, метили у33Р (АТР| при помощи полинуклеотидкиназы Т4 (Маниатис, 1984). Для выделения суммарной РНК использовали метод горячей фенольной экстракции (Shamamn, 1990) в присутствии 0.2-0.5% додецилсульфата натрия. Нанесение образцов РНК на нейлоновые фильтры, предгибридизацию и гибридизацию, экспонирование с рентгеновской пленкой и оценку результатов проводили в соответствии с методическими рекомендациями, приведенными в каталогах фирм (Zeta-Probe,

TM

"Bio-Rad"; Hybond -N, nylon membrane, "Amersham").

Таблица 1.

Штаммы вКЭ, использованные для изучения молекулярной характеристики

геномной РНК.

Штамм год изоляции вируса кол-во пассажей титр lgTUHs 0 источник изоляции, клинический диагноз Место изоляции вируса, район

178 1991 1 6 кровь человека, ЛФ Надеждинский

653 1991 3 6 -II- п-д Владивостока

533 1991 1 10 -II- Надеждинский

208 1991 2 7 -II- б. Шамора

Астафьева 1994 4 н.и. -II- Надеждинский

Берчинский 1994 4 н.и. -II- Кневичи

Бабич 1994 3 н.и. -II- Надеждинский

Синолицин 1982 8 н.и. -II- п-д Владивостока

478 1991 2 10 кровь человека, ИФ п-д Владивостока

243 1991 1 н.и. Надеждинский

651 1991 1 6 -II- п-д Владивостока

315 1991 4 3 п.Трудовой

212 1991 2 3 п-д Владивостока

288 199) 1 3 п-д Владивостока

211 1991 1 н.и. Надеждинский

183 1991 1 3 п-д Владивостока

582 1991 2 10 п-д Владивостока

345 1991 1 3 -II- Анучинский

253 1991 2 13 -II- Надеждинский

322 1991 4 4.5 -II- Надеждинский

270 1991 2 10 -II- Надеждинский

336 1991 3 3 кровь человека, ОФ Анучинский

185 1991 1 н.и. -и- п-д Владивостока

Агафонов 1991 2 9 мозг человека Чугуевский

Негушкин 1991 1 н.и. -II- Спасский

Бабаева 1991 3 н.и. -II- Партизанский

Мордовец 1990 4 3 -II- Арсеньев

Чугурин 1985 5/6 7/н.и -II- Кавалеровский

Шейнин 1991 3 н.и. -II- Спасский

Сенцов 1987 7 12 -II- Арсеньев

Шкребач 1987 5 12 -II- Кавалеровский

Пищелкин 1986 2 8.5 -II- Кировский

Марунов 1973 12 н.и. -II- Дапьнереченский

290 1990 2 9 клещ 1.регзи1са1из Михайловский

493 1977 6/9 10 -II- Спасский

2239 1985 4/5 10/н.и -II- Красноармейский

2910 1990 2 9.5 -II- Михайловский

2701 1985 6 9.5 -II- Лазовский

155 1977 9 9 -II- Спасский

472 1977 5 7 -II- Спасский

680 1977 12 9 -II- Спасский

Примечание: ИФ- инаппарантная форма КЭ, ЛФ- лихорадочная форма КЭ, ОФ-

очаговая форма КЭ.

Определение титра инфекционного вируса проводили на монослое клеточной культуры СПЭВ по цитопатическому действию (lgTimjo), а вирусного антигена - в ИФА с применением тест-системы НПО "Вирион" (г.Томск) с количественной оценкой на мультискане "ТИТЕРТЕК" (Швеция).

Ядерную ДНК из клеток мозга мышей-сосунков и культуры клеток СПЭВ и Vero-Еб, инфицированных штаммами вКЭ, выделяли в присутствии 0.5 % додецилсульфата натрия, 100 мкг/мл протеиназы К (Маниатис, 1984). Электрофорез ДНК (2.4- 4 мкг/лунка) проводили в 1.8% агарозном геле при напряжении 45-50 V. Полученные гели окрашивали этидиум бромидом, просматривали и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Проводили визуальную оценку по наличию межнуклеосомной фрагментации ДНК (Wyllie, 1984).

Результаты и обсуждение Определение спектра специфичности дезоксиолигонуклеотидных зондов относительно региональной популяции вируса клещевого энцефалита

На основе результатов гибридизации РНК региональных штаммов вКЭ с набором зондов установлено, что наиболее консервативными зондами являлись олигонуклеотиды S1 и S5. Показано, что с данными зондами гибридизовались 95.1% и 92.7% региональных штаммов, соответственно. Достаточно высокую гибридизационную активность показали также два других зонда: Р2 (80.5%) и Р131 (78.1%). Средний уровень гибридизации с РНК региональных штаммов наблюдался для следующих зондов: Р10 (62.9%), РЗ (53.7%), Р5 и Р2 (по 34.2%), Р31 (29.3%). Наиболее вариабельным зондом оказался зонд S2, с которым гибридизовались 17.1% штаммов вКЭ.

С целью разработки критериев генетической дифференциации региональных штаммов была проведена группировка зондов в соответствии с их гибридизационными активностями. Исходя из этого, использованные зонды были разделены на 5 групп (А, В, С, D, Е) (табл.2).

Для каждой группы зондов были определены спектры специфичности в зависимости от гибридизации региональных штаммов с одним или со всеми зондами данной группы. Как видно на рис.1, наиболее широким спектром специфичности обладали зонды группы A (S1 и S5), которая была обозначена как

высококонсервативная: все региональные штаммы реагировали с одним и 89.4% с обоими зондами данной группы. Вторая группа В (Р2 и Р131) охарактеризована нами как умеренно консервативная. Третья группа С (Р10 и S3) названа нами промежуточной. Четвертая группа D (зонды Р5, Х2 и Р31) определена как вариабельная. Последняя группа Е, представленная зондом S2, обозначена как высоковариабельная, так как с ней гибридизовалось всего 17% региональных штаммов вКЭ.

Таблица 2.

Классификация зондов в зависимости от способности к гибридизации со штаммами юга Дальнего Востока

Зонд Гибридизация штаммов вКЭ группа зондов

N Р % позит.проб

S1 41 39 95.1 А

S5 41 38 92.7

Р2 41 33 80.5 В

Р131 41 32 78.1

Р10 35 22 62.9 С

S3 41 22 53.7

Р5 41 14 34.2 D

Х2 41 14 34.2

Р31 41 12 29.3

S2 41 7 17.1 Е

Рис.1. Спектр специфичности групповых зондов. Примечание: черный цвет- общий показатель частоты избирательной гибридизации штаммов с зондами группы; белый цвет- показатель сочетанной гибридизации штаммов со всеми зондами группы.

р5/х2/рЯ

-1 «ЗрЮ

«3/рЮ 2р134

Ж

I р2/р131 I sls5

■ 1/.Í

На основе полученных результатов были разработаны критерии для генетической дифференциации штаммов вКЭ. Критерием принадлежности штамма вКЭ к генетическому варианту (табл.3), являлась гибридизация РНК штамма с зондами предыдущих, но не последующих групп (группы расположены в порядке снижения уровня специфичности для штаммов вКЭ).

Таблица 3.

Характеристика генетических вариантов региональных штаммов вКЭ в зависимости от спектра взаимодействия с групповыми зондами.

Группа генетические варианты

зондов 1 2 3 4 5

А (sl, s5) + + + + +

В (р2,р131) - + + + +

С (s3, рЮ) - - + + +

D(x2,p5,p31) - - - + +

E(s2) - - - - +

Исходя из гибридизации штаммов вКЭ с групповыми зондами получено пять генетических вариантов: 1-ый составили штаммы вКЭ, которые реагировали только с зондами группы А; 2-ой - с зондами групп А и В; 3-ий - с А, В и С; 4-ый

- с А, В, С и О; 5-ый - с зондами всех групп.

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вКЭ, изолированных из клещей 1.репи!саШ

Основными переносчиками вКЭ на юге Дальнего Востока являются иксодовые клещи. Среди них ведущее эпидемиологическое значение имеет клещ У.регаи/саЛ«. Проведенный сравнительный анализ уровня специфической гибридизационной активности набора зондов с этими штаммами показал, что наиболее эффективно гибридизация происходила с зондами групп А (85 - 100%, 81

- 87.5%) и В (Р131, Р2 -по 75%). Менее эффективно "клещевые" штаммы гибридизовались с остальными зондами (от 62.5% до 37.5%). В среднем эффективность гибридизации для данной группы штаммов составила 63.3%. Следует отметить, что в сравнении с литературными данными (Злобин, 1992),

сопоставимые уровни гибридизации были отмечены только со штаммами Амуро-Сахалинской страны (60.5%) и близкие - со штаммами центрального и северозападного районов Восточно-Европейской равнины (53.3%). При этом приморские штаммы, в среднем, показали более низкий уровень гибридизации только с зондом S2 (28.6%) по сравнению со штаммами указанных территорий (50% и 44.4%, соответственно).

Молекулярно-гепетическая характеристика штаммов вКЭ, выделенных из организма человека

Исходя из того, что гетерогенная по вирулентности региональная популяция вКЭ является одной из причин возникновения различных клинических форм данной инфекции (Леонова, 1988, 1995, 1997), значительный интерес представляют исследования по изучению генофонда штаммов, выделенных от больных КЭ людей.

Результаты анализа средних значений эффективности гибридизации каждого зонда свидетельствуют о том, что штаммы, выделенные от людей с инаппарантной формой инфекции КЭ (первая группа), в основном, гибридизовались с зондами групп А, В, С (Р10) и практически не реагировали с остальными группами зондов. Эффективность гибридизации для данной группы штаммов в среднем составила 35.7%. Для штаммов вКЭ, выделенных от людей с лихорадочной формой инфекции (вторая группа), эффективность гибридизации составила 64.6%. В отличие от апатогенных штаммов данные изоляты взаимодействовали с зондами групп С (зонд S3), D и Е. Для штаммов вКЭ, выделенных от людей с очаговыми формами инфекций КЭ (третья группа), эффективность гибридизации была значительно выше (73.5%) по сравнению с двумя другими группами. При гибридизации с данным набором зондов штаммы этой группы проявляли близкую или сходную специфичность с геномом штамма Софьин.

Генетические варианты штаммов вКЭ, изолированные из организма человека. Возможный вклад генотипа в развитие инфекционного процесса рассмотрен нами через распределение генетических вариантов. Результаты, представленные на рис.2, были проанализированы в двух направлениях. Первое, вдоль оси ОХ,-распределение генетических вариантов внутри группы штаммов, вызвавших определенную форму инфекции. Так, первая группа штаммов была представлена 211

ым (61.5%), 3-им (30.8%) и 4-ым (7.7%) генетическими вариантами. Штаммы второй группы относились к 3-му (37.5%), 4-му (50%) и 5-му (12.5%) генетическим вариантам. Штаммы третьей группы были образованы 3-им (8.3%), 4-ым (66.7%) и 5-ым (25%) генетическими вариантами. Следует отметить, что во второй и третьей группах отсутствовали штаммы 2-го, а в первой группе- 5-го генетических вариантов. Ни в одной из этих групп не было обнаружено ни одного штамма, относящегося к 1-му генетическому варианту.

Рис.2. Распределение генетических вариантов в разным группам штаммов вКЭ. Примечание: по оси ОХ- генетические варианты; по оси ОУ- процент штаммов; по оси ОХ- группы штаммов (первая, вторая, третья группы- штаммы, выделенные от лиц с инаппарантной, лихорадочной и очаговыми формами инфекций КЭ, соответственно).

Внутри генетического варианта (анализ вдоль оси ОХ) штаммы, вызвавшие разные формы инфекции КЭ, распределились следующим образом: 2-ой вариант был образован только апатогенными штаммами; 3-ий - в виде соотношения штаммов 4:5:1 (явное преобладание "апатогенных" и "лихорадочных" штаммов). В 4-ом генетическом варианте наблюдалось резкое изменение соотношения в сторону штаммов, вызвавших манифестную форму инфекции (1:4:5). Пятый вариант был образован только "лихорадочными" и "очаговыми" штаммами в соотношении 0:1:2. По-видимому, бессимптомное течение йнфекции КЭ определяется преимущественно инфицированием штаммами 2-го генетического варианта, а манифестное - 3-им, 4-ым и 5-ым генетическими вариантами.

1

о

перкм

Определение спектра специфичности зондов относительно штаммов вКЭ, изолированных из разных клинических групп больных КЭ. Следует отметить, что наиболее часто сочетания положительных реакций зонда 83 с олигонуклеотидами группы О (Р31, Х2, Р5), а также олигонуклеотидов группы О между собой встречались во второй и в третьей группах штаммов (табл.4). В первой группе не было обнаружено ни одного штамма, который бы одновременно имел в геноме участки, комплементарные этим зондам. Во второй группе от 12.5% до 25% штаммов одновременно гибридизовались с этими зондами. Однако в данной группе не было обнаружено ни одного штамма, который одновременно имел бы геномные участки, гомологичные зондам Х2 и Р31. Совершенно иная картина наблюдалась в третьей группе штаммов, вызвавших очаговую форму инфекции. Здесь от 33.3% до 58.3% штаммов содержали рассматриваемые пары олигонуклеотидов.

Таблица 4.

Эффективность сочетанной гибридизации зондов групп С и О с РНК штаммов вКЭ

Группа Кол-во Пары дезоксиолигонуклеотидных зондов

штаммов штаммов S3P5 S3X2 S3P31 Р5Р31 Р5Х2 Х2Р31

первая 13 0 0 0 0 0 0

вторая 8 15.4 15.4 15.4 25 12.5 0

третья 12 58.3 33.3 41.7 33.3 33.3 33.3

Примечание: первая, вторая, третья группы- штаммы, выделенные от лиц с инаппарантной, лихорадочной и очаговыми формами инфекций КЭ, соответственно.

Патогенетические варианты вКЭ

Среди групповых зондов было обращено внимание на олигонуклеотиды группы С (S3, Р10). В этой группе зонд S3, в отличие от зонда Р10, практически не гибридизовался со штаммами первой группы, но взаимодействовал с большинством штаммов второй (87.5%) и третьей (75%) групп. В то же время уровень специфической гибридизации зонда Р10 со штаммами первой группы превышал уровень гибридизации зонда S3 в 5.4 раза. Мы предположили, что эти факты свидетельствуют о разной патогенетической значимости зондов,

образующих группу С. На этом основании зонды группы С (S3, Р10) были разгруппированы, что позволило нам получить критерии для дифференциации региональных штаммов на патогенотипы (табл.5). В результате к первому (I) патогенотипу были отнесены штаммы, которые гибридизовались хотя бы с одним олигонуклеотидом из каждой группы зондов (А, В, С, D, Е). Обязательным условием принадлежности штамма ко второму (II) патогенотипу являлась гибридизация с ведущим зондом S3 группы С и/или с зондами группы D. Третий (III) патогенотип объединил штаммы, которые гибридизовались с другим зондом группа С (Р10), а также с зондами групп А и В. Таким образом, I патогенотип соответствует 5-му генетическому варианту; II патогенотип - 4-му и 3-му; III патогенотип - 3-му, 2-му и 1-му генетическим вариантам.

Как показано в табл.5, абсолютное большинство апатогенных штаммов (84.6%) принадлежало к III патогенотипу. В этой группе отсутствовали штаммы I патогенотипа. Основную часть штаммов второй и третьей групп (по 75%) составили штаммы, принадлежащие ко II патогенотипу. Следует отметить, что в третьей группе не было обнаружено ни одного штамма, принадлежащего к III патогенотипу. В группе штаммов вКЭ, изолированных из иксодовых клещей встречались все три патогенотипа. Следует отметить, что эта группа штаммов в большей степени была представлена I и II патогенотипами, которые охарактеризованы нами как достаточно вирулентные варианты вКЭ. Возможно, что циркуляция таких патогенотипов в природной популяции обуславливает манифестные формы этой нейроинфекции у человека.

Таблица 5.

Распределение патогенотипов в разных группах штаммов вКЭ.

Патогенотип Группы Группы штаммов Всего

зондов инаппа- лихора- очаго- клеще-

рантные дочные вые вые (%)

I A,B,C,D,E 0 12.5 25 37.50 17

II A,B,C(s3),D 15.4 75 75 37.5 48.8

III А,В,С(р10) 84.6 12.5 0 25 34.2

Итоговая молекулярно-генетическая характеристика региональной популяции вКЭ Молекулярная структура всей изученной вирусной популяции отражена на рис.3 и рис.4 в виде процентных соотношений генетических вариантов и патогенотипов. Региональная популяция вКЭ приблизительно на 2/5 была представлена штаммами 4-го генетического варианта, по 1/5 штаммами 2-го, 3-го и 5-го генетических вариантов. И только 1/25 часть популяции составили штаммы 1-го генетического варианта. В то же время региональная популяция, в основном, представлена штаммами, принадлежащими ко II (48.8%) и III (34.2%) патогенотипам. Изоляты, подобные штамму Софьин, относящиеся к I патогенотипу, составили только 17.1%. Определено распределение патогенотипов на территории Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона. В средней части данного региона преобладали I и II, а в южной части- II и III патогенотипы (рис.5).

Рис.3. Распределение генетических Рис.4. Распределение патогенотипов в

вариан-тов в региональной популяции региональной популяции вКЭ юга

вКЭ. Дальнего Востока.

Примечание: 1 - 4.3%; 2 - 23.4%; 3- 19.4%; 4 Примечание: I - 17%; II - 48.8%; III -

- 36%; 5 - 17%. 34.2%.

Сравнительное изучение репродукции штаммов вКЭ и ответной реакции клетки-хозяина in vivo и in vitro

Результаты сравнительного изучения репродукции региональных штаммов вКЭ in vivo представлены на рис.6. Все три штамма демонстрировали сходную картину в синтезе вирусной РНК (рис.ба). Основное накопление вирусной РНК для всех штаммов наблюдалось на третьи сутки после заражения. Как видно на рис.66, наиболее выраженное накопление антигена наблюдалось при заражении штаммом Пищелкин. Наименьшие показатели накопления антигена были отмечены при заражении штаммом 155. Ответной реакцией на заражение данными штаммами вКЭ на этой модели была запрограммированная гибель клеток

ПРИМОРСКИЙ КРАЙ

Рис. 5. Распределение патогенотипов на территории Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона.

Рис.6, а) Динамика синтеза вирусной РНК в мозге двухсуточных мышей. Примечание: по оси Х- время после заражения (часы) ; по оси Y-радиоактивный сигнал (имп/мин); б). Динамика синтеза вирусного антигена в мозге двухсуточных мышей. Примечание: по оси Х- время после заражения (часы) ; по оси Y-показатель накопления вирусного антигена (К). 1- штамм Пищелкин; 2- штамм 651; 3- штамм 155.

500 400 300 200 100 0

500 400 300 200 100 0

500 400 300 200 100 о

24

Рис. 7. Репродукция штаммов вКЭ в клетках СПЭВ. Динамика синтеза вирусной РНК: а) штамм Пшцелкин; б) штамм 651; в) штамм 155.

Примечание: по оси Х- время после заражения (часы) ; по оси Y-радиоакгивный сигнал (имп/мин) Динамика накопления вирусного антигена: г) штамм Пишелкин; д) штамм 651; е) штамм 155. Примечание: по оси Х- время после заражения (часы); по оси Y- показатель накоплениявирусного антигенат (К).

б

Рис. 8 .Накопление вирионов в культуралькой жидкости. Динамика накопления вирусной РНК: а) штамм Пшцелкин; б) штамм 651; в) штамм 155. Примечание: по оси Х- время после заражения (часы) ; по оси Y-радиоактивный сигнал (имп/мин). Динамика накопления инфекционного вируса: г) штамм Пшцелкин; д) штамм 651; е) штамм 155. Примечание: по оси Х- время после заражения (часы); по оси Y- титр (lgTIXflso).

(апоптоз) головного мозга, которая проявлялась в виде межнуклеосомной фрагментации ядерной ДНК.

В экспериментах in vitro при заражении клеток Vero-Еб этими же штаммами вКЭ электрофоретический анализ показал отсутствие какой-либо деградации ядерной ДНК. Наряду с этим наблюдалось низкое накопление вирусного антигена в пределах К=2.7- 4.8. По-видимому, латентная вирусная инфекция клеток Vero-E6 определяется генетическими свойствами этих клеток, в которых вКЭ не способен индуцировать апоптоз.

В то же время инфицирование данными штаммами вКЭ клеток СПЭВ во всех случаях сопровождалось деградацией ядерной ДНК по типу межнуклеосомной фрагментации. Выраженной разницы между штаммами в способности вызывать деградацию ДНК не обнаружено. Сопоставление основных показателей репродукции вКЭ трёх региональных штаммов свидетельствует об индивидуальном характере размножения каждого штамма в перевиваемой линии клеток СПЭВ. При этом репродуктивные характеристики высоковирулентного штамма Пшцелкин занимают как бы промежуточное положение между непатогенным штаммом 651 и другим вирулентным штаммом 155. Так, показатели внутриклеточной репродукции штамма Пшцелкин были сходными со штаммом 651 (рис.7), а показатели накопления вируса в культуральной жидкости- со штаммом 155 (рис.8).

Таким образом, полученные знания по молекулярно-генетической структуре вирусной популяции позволили расширить представление о гетерогенности штаммов вКЭ, циркулирующих на территории Южно-Сихогэ-Алиньского очагового региона. Дальнейшее изучение молекулярных механизмов вирусиндуцированного апоптоза при КЭ, возможности их регулирования могут послужить основой для разработки принципиально новых подходов к лечению не только клещевого энцефалита, но и других флавивирусных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Дана молекулярно-генетическая характеристика популяции вКЭ Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона. Показано, что региональная вирусная популяция характеризуется значительной вариабельностью штаммов по способности гибридизоваться с набором дезоксиолигонуклеотидных зондов. Наиболее гетерогенными по молекулярной характеристике являются группы штаммов, изолированных из иксодовых клещей и из крови больных лихорадочной формой КЭ. Высокие показатели эффективности гибридизации выявлены в группе штаммов, выделенных из мозга умерших от КЭ людей. Низкие показатели гибридизации определены в группе штаммов, изолированных из крови лиц с инаппарантной формой КЭ.

2. Изучена специфичность гибридизации набора олигонуклеотидных зондов, комплементарных участкам генов штамма Софыш, относительно популяцш! вКЭ Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона. Выявлено несколько уровней гибридизационной активности, с помощью которых разработаны критерии для генетической и патогенетической дифференциации региональных штаммов вКЭ. На этом основании для качественной характеристики вирусной популяции впервые предложены пять генетических вариантов и три патогенотипа вКЭ.

3. Выявлена взаимосвязь между патогенотипом штамма вКЭ и вызванной им клинической формой инфекции. Показано, что Ш патогенотип определяет развитие инаппарантной формы инфекции, а I и II - манифестных форм инфекции.

4. Показано распространение патогенотипов вКЭ на территории Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона: в средней части преобладают I и II, а в южной - II и III патогенотипы.

5. Выявлены особенности репродуктивного цикла вКЭ, который у разных штаммов проявляется или избыточным синтезом вирусного антигена, или вирусной РНК.

6. Впервые установлено, что на изученных моделях in vivo и in vitro механизмом цитопатического действия является вирусиндуцированный апоптоз клеток-мишеней (запрограммированная гибель клеток).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.П., Исачкова Л.М., Рассказов В.А. Биологическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита юга Дальнего Востока России// Сб. межд. конфер. "Вирусные, риккетисиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами". Иркутск, 1996. С.44-45.

2. Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.П., Майстровская О.С. Молекулярная характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона// Вопр. вирусол. 1996. N.4. С.154- 158.

3. Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.П., Исачкова Л.М., Рассказов В.А. Биологическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита юга Дальнего Востока России// Журн. инфек. патол. 1996. Т.З. N.4. С.37- 31.

4. Исаева М.П., Кожемяко В.Б., Леонова Г.Н., Майстровская О.С. Изучение дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита с помощью метода молекулярной гибридизации// Сб. "Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере". Новосибирск, 1996. С.9- 10.

5. Леонова Г.Н., Исаева М.П., Борисевич В.Г., Майстровская О.С., Кожемяко В.Б., Рассказов В.А. Итоги и перспективы изучения клещевого энцефалита на

Дальнем Востоке// Матер, науч. конфер." Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере". Новосибирск, 1998. С.З.

6. Исаева М.П., Леонова Г.Н., Борисевич В.Г., Майстровская О.С., Кожемяко В.Б., Рассказов В.А. Вирусспёцифический антиген как ведущий индуктор апоптоза при клещевом энцефалите// Матер, науч. конфер." Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере". Новосибирск, 1998. С.41 42.

7. Исаева М.П. Особенности репродукции разных штаммов вируса клещевого энцефалита// Матер. 39-й науч.-практ. конфер. студентов и мол. ученых ВМГУ "Проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины на Дальнем Востоке". Владивосток, 1998. С. 11.

8. Исаева М.П., Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Борисевич В.Г., Майстровская О.С., Рассказов В.А. Апоптоз как механизм цитопатического действия вируса клещевого энцефалита// Вопр. вирусол. 1998 N.4. (принято в печать).

Соискатель:

/Исаева М.П./