Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномный полиморфизм в эпидемиологическом анализе бактериальных инфекций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Геномный полиморфизм в эпидемиологическом анализе бактериальных инфекций"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУЯ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И Л1ИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н. Ф. ГАМАЛЕИ

Г Б ОД

Па пианах /»икппчг>>

ШАГИНЯН Игорь Андроникович

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Специальности: 03.00.07— микробиология 14.00.30— эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва^- 1995

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН

Научный консультант: доктор биологических наук А. Л. Гинцбург

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. Г. Лиходед доктор медицинских наук, профессор Е. А. Ведьмина доктор медицинских наук, профессор Н. А. Семина

Ведущая организация — Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится « » 1995 г. в час.

на заседании Специализированного совета Д001.07.01 в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « » 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем медицинской микробиологии, имеющей теоретическое и практическое значение, является разработка новых методов диагностики и дифференциации возбудителей бактериальных инфекций, позволяющих устанавливать источник инфекции, изучить механизмы и пути передачи, ре-ячряуярч и арсапы распространения возбудителей. Использование оу-тинных методов диагностики и типирования возбудителей, основанных на выявлении фенотипических признаков, часто неэффективно, в связи с существованием огромного количества штаммов различных видов возбудителей, обладающих высокой степенью фенотипического и генотилического родства, но характеризующихся различной эпидемиологической значимостью. Создание современных истодов призвано обеспечить эффективность лабораторной диагностики и типирования возбудителей бактериальных инфекций и, тем самым, создать возможности осуществлять оценку широты распространения инфекции и выявлять изменения в характере развития эпидемического процесса. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии позволяют разработать подходы, с помощью которых представляется возможным оценить генетическое разнообразие, устанавливать степень родства и выявлять индивидуальные особенности организма при анализе структуры ДНК. Как известно, в последнее десятилетие исследования геномного полиморфизма позволили решить ряд фундаментальных и прик-падных проблем генетики человека, популяционной генетики, осу-дествлять анализ родословной, идентификации личности, определения чистоты линий и т.д. Указанные данные «вились предпосылкой для использования молекулярно-генетических подходов в микробиологии л эпидемиологии бактериальных инфекций. Обусловлено это необходимостью выяснения генетической структуры популяций возбудителей бактериальных инфекций, выявления генетического родства между

эпидемическими и неэпидемическими вариантами возбудителя, расшифровкой механизмов появления, формирования и распространена эпидемических штаммов, маркирования и определения ареалов распространения наиболее значимых в патологии человека штаммов. Результаты такого рода исследований важны для разработки научно-обоснованных противоэпидемических мероприятий в борьбе с бактериальным» инфекциями.

Цель работы - изучение методами геномной дактилоскопии взаимосвязей между эпидемически значимыми и неэпидемическими формам» возбудителей бактериальных инфекций и оценка их потенциала в решении ряда фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и эпидемиологии.

Основные задачи:

1. Расшифровать механизмы появления и формирования эпидемически значимых штаммов в очаге инфекции в разные эпидемические периоды.

2. Исслецовать генетические связи между штаммами различной эпидемиологической значимости.

3.Изучить возможные механизмы появления, формирования и распространения эпидемически значимых штаммов возбудителей внутри-больничных инфекций.

4. Разработать принципы и схемы генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций для решения различных проблем инфектологии.

5. Разработать экспресс-методы индикации и типирования возбудителей на . основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (на модели возбудителя туберкулеза), позволяющих идентифицировать и дифференцировать возбудителей непосредственно в клиническом материале.

Научная новизна.

- Впервые исследован геномный полиморфизм возбудителей бакто-иальрых инфекций, характеризующихся различной эпидемиологической начимостью, типами паразитизма, разными механизмами передачи и езервуарами инфекции.

- Выявлены общие и специфические закономерности генотипической труктуры представителей эпидемически значимой части популяции v

йяпиимыу ГТЗТОГОЙКУЛ КИКВиоВГаНиаиоп,

- Впервые установлено, что с помощью молекулярно-геметических одходов эпидемически значимые представители популяции возбуди-влей бактериальных инфекций разделяются на следующие группы:

1) эпидемически значимые штаммы, имеющие высокую степень гено-ипического родства независимо от места, времени и источника их ^деления. Типичными представителями данной группы являются воэ-/дители сапронозов (холеры, легионеллеза, лептоспироза);

2) эпидемически значимые штаммы, имеющие высокую степень гено-тического родства в пределах определенного региона. Предстаеи-глями этой группы являются возбудители дизентерии - штаммы .f lexneri;

3) эпидемически значимые штаммы, имеющие высокую степень гено-мического родства в пределах региона с повышенным уровнем яяЛп-¡ваеиости, а в регионах с спорадической заболеваемостью - гено-тически разнообразные, то есть поликлональные. К этой группе ■носится возбудител* туберкулеза - бактерии вида М. tuberculo-

¡з;

4) эпидемически значимые штаммы, не имеющие клонального проис->ждения, и принадлежащие к различным стенотипическим вариантам юликлональность эпидемических штаммов). К этой группе относятся »збудители внутрибольничных инфекций - штаммы К.pneumoniae и S. ireus.

- Впервые показано,.что методы генетического типирования поз->ляют решать следующие задачи:

1) осуществлять региональное картирование штаммов, а следовательно, проводить мониторинг ареалов распространения эпидемическ! значимых штаммов возбудителей (на модели возбудителя дизентерии • S. flexneri).

2) дифференцировать эпидемические формы от неэпидемически (штаммы видов V. cholerae, L.pneumophi1а, родов Leptospira, Fran ci seila),

3) осуществлять контроль микробных коллекций с целью подт верждения или исключения новых под- или видовых статусов микроор ганизмов (на модели возбудителей лептослироза - штаммах L. int er rogans).

- Впервые при мониторинге очага холерной инфекции установлено что генотипически полиморфная часть популяции холерных вибрионов не имеющих эпидемиологической значимости, не может быть источни ком формирования эпидемически значимых, патогенных, штаммов воз будителя за счет генетической передачи в природных очагах инфек ции генов факторов патогенности.

- Впервые* с помощью микробиологического, эпидемиологическог и молекулярно-генетического мониторинга установлено, что условнс патогенные микроорганизмы циркулирующие в стационарах (госпиталь ные штаммы) генотипически неоднородны; из генотипически различен щихся госпитальных вариантов условно-патогенных микроорганизме не все способны вызывать вспышку госпитальной инфекции.

- Впервые получены прямые доказательства, что в основе возни» новения госпитальных вспышек лежат 2 механизма: 1) занос эпидеш чески значимого штамма .извне и 2) формирование эпидемического bi рианта в стационаре за счет генетической передачи плазмид вир: лентности и антибиотикоустойчивости в циркулирующие в стационар« штаммы определенных генотипических вариантов.

- Впервые разработана методика генетического тилирования urrai мое M.tuberculosis на основе полимерааной цепной реакции, поэв<

¡яющая дифференцировать возбудитель непосредственно в диагности-юском материале.

- Сравнительные результаты эффективности различных методов ис-ледования геномного полиморфизма позволили установить для каждо-о из изученных видов возбудителей наиболее эффективные методы еметического типироваиия, разработать принципы и оптимальные

I внегичнопгп ти"ирсг~1!ИЛ ¿¡йаоуди I олвй бакипияпьии« ,.,..«....-;ип для решения цепого ряда задач микробиологии и эпидемиологии.

- Показано, что наиболее репрезентативными из методов исследо-ания геномного полиморфизма возбудителей бактериальных инфекций вляются использование в качестве зонда ДНК фага М13 и ПЦР-генв-ическое типирование на основе амплификации гена или специфичес-ой последовательности и анализа полиморфизма длины фрагментов естрикции (ПДФР).

Практическая значимость работы.

Разработанные принципы и схемы генетического типироваиия воэ-удителей бактериальных инфекций могут использоваться в эпидемио-огии и микробиологии для решения разнообразных актуальных задач: . дифференциации штаммов возбудителей, характеризующихся различ-ой эпидемиологической значиаость», 2. выявления источника инфек-ии, 3. мониторинга эпидемиологического благополучия на террито-иях и в стационарах, 4. регионального картирования возбудителей нфекций, 5. разработки и использования новых вариантов генети-еского типироваиия. .

Впервые полученные "фингерпринты"(дактилограммы) могут служить тандартами при исследовании геномного полиморфизма возбудителей актериальных инфекций в практических и научных целях.

По материалам диссертации разработаны методические рекоменда-ии, утвержденные МЗ СССР (1986 и 1990 г.):.а). Методические ре-

комендации по определению токсигенности штаммов холерного вибрио на и энтеропатогенной кишечной палочки иммуноферментным методо! (соавт. Степанова М.В., Осауленко О.В., Вейде A.A., Вертиев Ю.В. б) Определение генетических связей штаммов холерных вибрионо! различного происхождения методом геномной дактилоскопии (соавт, Токарская О.Н., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф., Рысков А.П., Гинцбург А.Л.).

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены: на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры" (Саратов, 1988), Всесоюзной конференции "Бактериальные плазмиды" (Нальчик, 1990), Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов (Москва, 1990), на У1I Европейской и IX Всесоюзной конференции по лвп-тоспирозам (СССР,Москва, 1991), Международной конференции "Медицина чрезвычайных ситуаций" (Болгария, София, 1991), 7 Европейском совещании по болезням легионеров (Греция, НаМо^г-НаНосЖо, 1992), 7 Республиканском конгрессе "Инфекционные и паразитарные болезни (Болгария, Велинград, 1992), совместном заседании проблемных комиссий "Медицинская микробиология" и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Москва, 1993), международном семинаре по улучшению качества вакцины БЦЖ (Москва, 1994), Российской научной конференции "Персистенция микроорганизмов" (Оренбург, 1994), а также научных конференциях отдела генетики и молекулярной биологии бактерий (1990, 1993). Фрагменты работы отмечены 1-ми премиями на конкурсах научных работ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи (1990, 1991).

Диссертация апробирована на совместной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий, медицинской микробиологии и эпидемиологии НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 21 марта 1995 г.

протокол N 3). Публикации.

о теме диссертации опубликованы 33 работы (см.список), 2 мето-ических материала (инструкции), получены 2 авторских свиде-ельства.

Структура и объем диссертации.

иссертация написана в монографическом стиле и включает введение, бзор литературы (1 глава), 10 глав результатов собственных ис-педований и их обсуждения,, общее заключение по работе и выводы, писок литературы включает 218 наименований отечественных и зару-ежных работ. Диссертация изложена на 244 страницах машинописно-

0 текста, иллюстрирована 42 рисунками и 14 таблицами. Основные результаты, представленные в диссертации, получены

ично автором. Исследования по изучению геномного полиморфизма 1зпичных видов возбудителей бактериальных инфекций проводили а эмплексе со следующими институтами и лабораториями: Ставропольс-1М научно-исследовательским противочумным институтом (отдел эпи-эмиологии - рук., к.м.н. Г.М.Грижебовский), НИИЭМ им.Н.Ф.Гама-îh (лаборатории лептоспироза - рук., д.м.н. Ю.В.Ананьина, легио-зллеза - рук., д.б.н. U.C. Тартаковский, генетики бактерий -,н.с., д.м.н. Г.И. Алошкин, стафилококковых инфекций - в.н.с., >оф. B.C. Зуева), ЦНИИ туберкулеза РАМН (рук.лаборатории микро-юлогии - проф.В.И. Голышевская), ЦНИИ эпидемиологии Госкомите-

1 санитарно-эпидемиологического надзора РФ (ст.н.с., к.м.н. Г.Е. 'бинов). '

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Для решения цели и задач настоящей работы использованы штаммы |едующих видов возбудителей бактериальных инфекций: возбудители сапронозных инфекций - штаммы V.cholerae, L.pneu-

а.

mophila, L.interrogans;

2. возбудители антропонозных инфекций - штаммы М. tuberculosis (аэрозольный антропоноз) и штаммы вида S. flexneri (антропоноз с фекально-оральным механизмом передачи),

3. возбудители эоонозной инфекции - штаммы вида F. tularensis

4. возбудители внутрибольничной инфекции - штаммы видов S.aureus и К.pneumoniae.

Исследованные штаммы этих видов возбудителей выделены в эпидемические и межэпидемические периоды, в различных географических регионах бывшего СССР и сопредельных с СССР странах, в разное время. Все исследованные■штаммы предварительно типировались с помощью стандартных методов лабораторной диагностики возбудителей бактериальных инфекций с помощью микробиологических, биохимических, иммуносерологических, биологических методов в соответствии с нормативными требованиями, разработанными для каждого из исследованных видов патогенных бактерий.

Генетическое типирование патогенных микроорганизмов осуществляли с помсдью следующих методов исследования геномного полиморфизма:

1. Исследование геномного полиморфизма возбудителей бактериальных инфекций с помощью "универсальных" зондов: а) зонда ДНК фага Ml 3, выявляющего гиперварибельные ("минисателлитные") последовательности в геномах и 6) зонда на рРНК гены ("риботипирова-ние";

2. Исследование геномного полиморфизма методом ПЦР с использованием неспецифических (произвольных> праймеров (ПП-ПЦР-дактило-скопия);

3. Исследование полиморфизма длины фрагментов рестрикции гена или специфической последовательности возбудителя (ПДФР)амплифици-руемых в ПЦР при расщеплении эндонуклеазами (Г-ПЦР-дактилоскопия);

4. Исследование плазмидного анализа для плазмидсодержащих ви-

дов ооэбудитвлвй.

Выделение ДНК, рестрикцию ДНК зндонуклеазами, электрофорез в агарозном геле, перенос фрагментов рестрициройанной ДНК с геля на нитроцеллюлоэныо фильтры, получение зонда, гибридизации и анализ полученных гибридизационных профилей осуществляли в соответствии с описанными рекомендациями в руководствах по молекулярной биологии (Маниятм<~. <95?, 'antut.

Tííni-.puaaHKñ ма эпидемически значимые штаммы и штаммы, не имега-цие эпидемиологической значимости исследованных видов возбудите-1ей, осуществляли с помощью а) молекулярно-генетических методов: зондирование на гены токсинобразования у V. cholera» с использованием в качестве зонда фрагмента гена vet, клонированного нами 13 штамма V.Cholerae eltor RV 79 (Гиицбург А.Л. и др., 1985), б) (ммуносерологических методов: использование моноклональных антител, позволяющих типировать вирулентные и авирулеитные штаммы ..pneumophila и моноспецифических антитоксических противохолерных :ывороток (Шагинян H.A., Вортиев Ю.В., 1982) для выявления ток-:инпродуцирующих штаммов V.Cholerae иммуноферментным и радиоимму-юлогическики методами (Степанова М.В. и др., 19В5, Вертиев Ю.В. i др., 1985), в) биологических: использование биологических моде-1вй, позволяющих у.аргкторизоиать вирулентные свойства штаммоа [.tuberculosis, L. interrogans, S. Floxneri, «.pneumoniae, F. tu-arensis.

Статистическую обработку материала для выявления степени гвно-

ипического родства осуществляли по формуле,

' к

(а.+Ь.) - {а.-Ь^} 1=1

SAB=~£- (Schmid J. et al., 1990),

(ai+bi)

i=1

где а^ и Ь ■ - интенсивность полосы 1 в образцах А и В (О - н<

присутствует, 1 - присутствует), а к - число полос. Если А и £

идентичны (все полосы в идентичных позициях), то 3АВ='■ в случае

полной неидентичности (все основные полосы а различных позициях]

- Бав = 0. Увеличивающееся генетическое родство характеризуется

увеличением Б от 0 к 1. АВ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПР0Н03НЫХ ИНФЕКЦИЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ.

а) Геномная.дактилоскопия штаммов холерных вибрионов.

Особую роль в эпидемиологии холеры играют вибрионы Эль-Тор, циркулирующие в водоемах. Предполагают, что эндемичность современной холеры в некоторых регионах мира определяется именно существованием стойкого резервуара холерной инфекции в водоемах с эпизодическим проникновением различными путями в человеческие коллективы и последующим распространением в них (Шляхов Э.Н., Литвин В.Ю., 1989}. Поэтому актуальным является решение вопроса об эпидемиологической значимости штаммов холерного вибриона, выделяемых из различных объектов внешней среды, и их генетической связи со штаммами, выделяемыми от человека. Нами установлено, что холерные вибрионы, выделяемые из окружающей среды, представлены 2-мя группами - 1) вибрионами, содержащими vet гены и 2) вибрионами, не имеющими в составе генома vet гены. В связи с этим представляло интерес исследовать генетические связи vct+ и vet холерных вибрионов, так как отсутствие гена холерного токсина у определенной выборки исследованных штаммов никогда не может являться гарантией отсутствия в популяции отдельных клонов виб-

рионов, обладающих генами vet. Кроме того,известно, что гены vet у вибрионов биотипа Эль Тор фланкированы повторяющимися последовательностями, имеющими свойства IS элементов. В связи с этим существует возможность перехода vet гена на конъюгативную плаэмиду ; последующим попаданием в ранее нетоксигенные штаммы и, следовательно, превращения популяции в токсигенную-апиплиы..«»;^.. loofway д;'.я решения вппппс» значимое in vet пиб-

>ионов было исследовано генетическое родство vet и vct+ штаммов, >ыделенных из разных источников, и осуществлен анализ возможности 1ерехода vet вибрионов в vct+ в природных условиях. С этой целью 1ССледованы 3 выборки штаммов, выделенных в разное время, в раз-ичных регионах и в различные эпидемические периоды. В первой вы-оркв были представлены штамма, выделенные от больных с 3-х вспы-ек, из открытых водоемов в эпидемический и межэпидемический пе-

иоды. Полученные данные, показали, что картина гибридизации ДНК +

ct штаммов, изолированных с 3-х вспышек, оказалась одинаковой.

+

нелогичными оказались и профили гибридизации vet штамиов, выдо-анных в разных местах одной административной территории в хода :пышки холеры. Bi естз с тем, картины гибридизации vet атаммов, оделенных из открытых водоемов, отличались по большинству псясс

1бридизации друг от друга и имели четкие отличия от картин гиб-щизации vct+ штамиов (рис. 1). При этом между каждой парой ток-генных штаммов, выделенных в очаге инфекции в ходе вспышки,

AS

ютавлял 0,91-1,0, что свидетельствует о идентичности или высо-

>й степени генот1.пического родства, тогда как S между любыми + АВ

vet и vet штаммами колебался от 0,25 до q,5, характеризуя том мым низкую степень генотипического родства между токеигенкыии и токсигенными вариантами возбудителя. Таким образом, представленные данные по анализу данной выбор-дали определенное основание для вывода о том, что исследован-е Yct+ штаммы имеют клональное происхождение, тогда как неток-

сигенные штаммы генотипически гетерогенны и отличны как друг от друга, как и от токсигенных штаммов.

В связи с тем, что однозначность данного вывода могла быть поставлена под сомнение в силу ограниченного числа исследованных штаммов и предположении,что при существенном увеличении выборки возможно обнаружение vet штаммов, которые по данным геномной дактилоскопии будут генотипически родственны vct+ штаммам, далее была осуществлена геномная дактилоскопия 2-х новых выборок штаммов холерных вибрионов, в которые были включены штаммы, выделенные из других эпидемиологических очагов в разное время и в различные эпидемиологические периоды. Все токсигенные штаммы, выделенные на различных территориях за период с 1970 по 1986 гг., формировали идентичные профили гибридизации аналогичные профилю гибридизации референс-штамма V.cholerae eltor RV 79. 2 штамма, которые не типировались типовыми холерными О-сыворотками (НАГ-вибрион N 2991 и N С-47, типировавшийся сывороткой R0) формировали профили гибридизации, идентичные типичным токсигенным штаммам V.cholerae Полученные результаты позволяют полагать, что определенная доля так называемых атипичных токсигенных штаммов, выявляемых по фенотипическим свойствам, в действительности принадлежит генотипически однородной популяции вибрионов V. cholerae eltor.

Таким образом, установлено, что метод геномной дактилоскопии позволяет исследовать взаимоотношения между эпидемическими и неэпидемическими штаммами холерных вибрионов. Полученные данные показывают, что в природных условиях нетоксиногенные штаммы фактически не являются реципиентами vet-генов, кодирующих синтез основного фактора патогенности холерных вибрионов. Поэтому неток-сигенные штаммы не являются даже потенциально опасными в плане возможного осложнения эпидемических ситуаций, так как исключаете»

а—p»«>'.V>»»«?> г. г

(уд к?^ — I'.t . ^ — — Si

г

J

e

э ——

i Ыз* «*

I.

_23,13 42 8,68 a in

и —

„.«.Ирм. I » " t^i

й ! _

№ I—«.' Ш mat— 2,32

& - .

©I

i® ^Mtw

® e*

rt'.

12 3 4 5 6 7 В 9 10 !I , fZ vct+ vet" vct+

dez с^тм^^т^й

668

e

3-

• U ~~■ esa>

Г 2 3 << S 6 7 в 9 10 U 12

Рис.1. Геномная дактилоскопия штаммов V.cholerae eltor, выделенных в очаге инфекции в течение 12 лет (А); других очагах инфекции (Б). Исследуемые ДНК расщеплены эндонуклеазой Hind III.

их возможная роль как резервуара для формирования эпидемическ! опасной популяции возбудителя в течение рассмотренного промежутка времени на исследованных территориях.

б) Геномный полиморфизм бактерий рода Legionella.

В настоящее время известно около 40 видов легионелл, но подавляющее большинство вспышек и спорадических случаев легионелле-за вызывается штаммами Legionella pneumophila серогруппы 1. В отличив от холерных вибрионов факторы латогенности легионелл изучены недостаточно хорошо и единственным методом, который дает возможность выявлять эпидемически значимые штаммы, является иммунологический, в .котором с помощью эмпирически подобранных панелей моноклональных антител удается определять потенциально опасные вирулентные штаммы. Однако, этот подход не позволяет установить природу выявляемых отличий штаммов с различной вирулентностью на генетическом уровне. Результаты гибридизации ДНК фага М13 с рест-рицированн-ши фрагментами ДНК 56 различных штаммов легионелл показывают значительные различия в профилях гибридизации у представителей разных видов легионелл и разных серотипов L.pneumophila (рис.2). При анализе профилей гибридизации между близкородственными штаммами L.pneumophi1а серогруппы 1 оказалось, что все вирулентные штаммы L.pneumophi1а серогруппы 1, как музейные культуры Philadelphia 1, 2, так и выделенные во время вспышки в г.Армавире имеют идентичные профили гибридизации, в то время как авирулент-ные культуры характеризуются другими картинами гибридизации. При этом все вирулентные культуры типировались моноклональными антителами панелей АМВ 2 и Понтиак, выявляющими вирулентные штаммы, а невирулентные штаммы типировались моноклональными антителами невирулентных панелей сывороток MAB 1, ОLOA и подгруппы Понтиак. Анализ 2-й выборки штаммов, в которой были исследованы штаммы L.

шеиторЬИа серогруппы -1, выделенные в течение вспышки в ФРГ, шрулентные культуры, выделенные в Новороссийске и авирулснтные пгаммы, изолированные с разных территорий Кубы показал, что ви-|улентные штаммы, давали картину гибридизации, сходную с профи-ями гибридизации вирулентных штаммов ранее исследованной выбор-

О

• о <

О о

. —23,13

mm

I ~

i съ <» *

— О - 6,68 - 4,3В

_L

- 2,32 »- 2,03

vir avir

СЕРОГРУППА 1

_L

СЕРОГРУППЫ 2-8 Др.виды 13 S 7 9 // гз fS Г? /9 гг

г ■ ь -6-2 го 12 /« те >в го

с.2. Профили гибридизации ДНК штаммов рода Legionella.

- фаг Л; 2 - Philadelphia 1; 3 - Philadelphia 2: 4 - Армавир 1;

- Армавир 2; 6 - Армавир 6; 7 - Армавир а; в Ленинград 33; 9 Ленинград Зв; 10 - 0LDA; 11 - 61-1; 12 - 61-2; 13 - Bellingham

14 - Togus-1; 15 - Bloomington-2; 18 - Portland; 17 - Dallas ; 18 - Oxford-1; 19 - L.parasiensis PF-209C-C2; 20— L.eritra -32A-C8; 21- L.longbeachae Long Beach-4.

ки. Аоирулентныо штаммы L.pneumophila серогруппы 1 пр картинам гибридизации типировались на 2 различные группы, профили которых отличались друг от друга и от профилей гибридизации вирулентных штаммов. Таким образом, полученные данные на генетическом уровне демонстрируют различия между близкородственными штаммами L.pneumophila серогруппы 1 и дают основание сделать вывод, что, как и в случае с холерными вибрионами, эпидемически значимые, вирулентные штаммы легионелл имеют клональное происхождение, а штаммы ааиру-леитной части популяции генотипически отличны от вирулентных штаммов и генотипически гетерогенны.

I

в) Геномная дактилоскопия представителей рода Leptospira.

Холерные вибрионы и легионеллы объединяет общность, а именно, сапрофитическая фаза существования - различные акватории. Выявленная клональность эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов и легионелл, изолированных в разных географических регионах, в различное время и из разных источников, вероятно, универсальна для возбудителей, основной средой обитания которых является внешняя среда. В связи с этим представляло интерес исследовать генетические связи у возбудителей лептоспироза, паразитизм которых не случаен и обусловлен достаточно высокой специфичностью к хозяину (грызуны, человек, сельскохозяйственные животные). Поэтому далее был изучен геномный полиморфизм лептоспир различной .видовой, серологической принадлежности и вирулентности. Работа проведена на 23 штаммах следующих видов; 17 - Leptospira interrogans (серовары Copenhagen!„ icterohaemorrahagiae, lai, grippotyphosa, tarassovi, monjakov, h&nke), 2 - Leptospira biflexa (patoc, bairam-ali), 1 - Leptospira (Leptonema) illini, 2 - Leptospira ina-dai и Leptospira phoney parva.

Результаты гибридизации ДНК фага М13 с рестрицированными эндо-

нуклеазой Hind III фрагментами хромосомной ДНК лептоспир показа-пи наличие гипервариабельннх последовательностей у всех штаммов непатогенных видов (рис.3). При этом отмечен выраженный геномный полиморфизм: каждый штамм имел строго индивидуальную картину гибридизации, за исключением N 10 (lyme) и EMJH-86, имевшие идентичные профили гибридизации.

Из 17-и исслелопямим» ншогани« я «я тс~~"р г к поуаариа-

бапкиыо ner.rcp-u и2»аружвим только в ДНК культур серовара grippo-typhosa. ДНК лептоспир остальных сероваров не гибридизовалась с указанным зондом. Последний факт представляет интерес с экологической точки зрения, поскольку именно лептоспирам указанного серовара свойственна способность продолжительное время переживать в почве природного очага в отличие от других лептоспир (C.B. Зайцев, 1981).

В процессе исследования геномного полиморфизма выявлена еще одна возможная область применения геномной дактилоскопии - контроль микробных коллекций, иллюстрируемая следующим примером.

В 1986 г. Schmid et al. опубликовано сообщение о выделении штамма пептоспир из кожного биоптата больного Лайм-боррелиоэом, который был отнесен апторами к новому виду - Leptospira Inadai, серовар Lyme, типовой ттамм M 10. В процессе работы с твин-аль-буминовой жидкой питательной средой EMJH производства фирмы "Dit-со" Ю.В. Ананьиной были установлены факты контаминации двух серий среды лептоспирами и выделены три штамма-контаминанта. Два иэ них (EMJH-86 и EMJH-S7) в тестах перекрестной абсорбции агглютининов оказались полностью идентичными штаму> N 10 (lyme), а по фенотипу соответствовали сапрофитам.При геномной дактилоскопии с ДНК фага М13 рестри.цнрованные эндонуклеаэой Hind III ДНК штаммов-контаминантов и N 10 (lyme) имели идентичные профили гибридизации, что свидетельствовало о их клональном происхождении. На этом

основании Международному подкомитету по таксономии лептоспир было предложено исключить из рассмотрения вопрос о присвоении видового статуса Leptospira inadai.

- 23,13

Leptospira interrogans

46 6 630

XAptoaplr« Ъ1ХХ«ха

Bal-P«- XaJK I<yne Ь«р- JPbo-ras-toc (Itf- JonbMtone-ney all 2 ■•) aoa aa il>an

_ 9,42

6,68 436

L_ 2,32

125. «56 7 8 9

Рис.3. Результаты анализа ДНК лептоспир методом геномной дактилоскопии. Исследуемая ДНК расщеплялась эндонуклеазой Hind III. Справа указано местоположение и молекулярная масса реперных фрагментов - ДНК фага лямбда Hind III.

Таким образом,'использование геномной дактилоскопии лептоспир позволило решить несколько задач: 1) дифференцировать патогенные штаммы от непатогенных, 2) обнаружить различия в структуре генома, отражающиеся на одной из основных характеристик лептоспир-способности к существованию в сапрофитической фазе, 3) осуществ-

пять контроль микробных коллекций.

XI. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЭПИДЕМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ АНТРОПОНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ В РАЗЛИЧНЫХ ГЕОГРАФИЧЕСКИХ РЕГИОНАХ БЫВШЕГО СССР.

гяаупктяти и^сгсдйт-пИ* гакоиного иолимооАиямя

сапронозов дали основание сделать вывод, что эпидемически значимые штаммы имеют клональную природу. Так как не было известно, является ли выявленная закономерность универсальной или зависит от типа паразитизма, механизмов передачи возбудителя и резервуаров инфекции, представляло интерес исследовать геномный полиморфизм у возбудителей, характеризующихся отличным от возбудителей сапронозных инфекций типом паразитизма, механизмами передачи и резервуарами инфекции. В связи с этим в качестве модельных систем были выбраны возбудители антропоноэных инфекций -1 ) дизентерии - заболевания с фекально-оральным механизмом передачи и 2) туберкулеза - инфекции, передающейся воздушно-капельным путем.

1) Геномная дактилоскопия штаммов Shigella flexneri, изолированных в разных географических регионах.

В работе были использованы штаммы Б.^ехпеМ, выделенные во время спорадических заболеваний в 4-х различных регионах страны в разное время. В выборку были включены бактерии в.ИехпеН наиболее распространенных сероааров - 1Ь, 2'а} 6% вызывающих в зависимости от географического региона бывшего СССР от 45% до 85% всех случаев заболеваний дизентерией Флекснера. Для сравнения были изучены штаммы редко встречающихся сероваров X, У и 5а, изолированные в Киеве и Душанбе.

Использование двух наиболее используемых для типировання

штаммов Б.ЛехпеМ в качестве эпидемиологических маркеров - определения устойчивости к антибиотикам и вирулентности культур, в данном исследовании не позволило выявить различия по фенотипу и осуществить их дифференциацию по.этим признакам.

Исследование геномного полиморфизма штаммов в.ЛехпеН .включавшее плазмидный анализ, "риботипированив" и геноиную дактилоскопию с помощью ДНК фага М13, позволило типировать их на 7 различных генотипически* вариантов по плаэиидныи профилям (ллазмидо-варов), 2 генотипических варианта при "риботипировании'и 3 хромосомных генотипических варианта при зондировании хромосомной ДНК с помощью ДНК фага М13 (табл.1( рис.4). Плазмидный анализ проводили

Табл.1.

Генотипические варианты исследованных штаммов S.flexneri.

Штамм Место выделения Серовар ПДФР-генотип Плаэмидо-вар Суммарный генотип, вариант

ДНК фага М13 "риботи-пирова-ние

823 Душанбе 1Ь 1 1 1 I

199 Ереван - 1Ь 1 1 1 I

821 Душанбе 2а 1 1 3 II

202 Ереван 2а 1 1 3 II

295 Душанбе У 1 1 6 III

; 194 Ереван в 1 1 5 IV

; 314 Ташкент 1Ь 3 2 2 V

! 297 Ташкент- 2а 3 2 4 VI

; 342 Ташкент 6 3 2 5 VII

! 574 1 Киев X 2 1 7 VIII

! 581 Киев 5а 2 1 3 IX

в связи с тем, что множественная устойчивость к антибиотикам и основные вирулентный свойства у бактерий З.Т1вхпегт детерминируются генами, локализованными на плазмидах. Не удалось обнару

>ис. 4. Схема профилей гибридизации геномной дактилоскопии ипам-юв S. flexneri.

i. ДНК расщеплены эндонуклеазой Pst I: 1) 194, 2) 199,3) 202, 4) 121, 5) 823, 6) 295, 7) 314, 8) 297, 9) 342, 10) 575,11) 581. а, I, с , d - фрагменты специфические для всех исследованных штаммов: f, 9, h, i, j, k - фрагменты специфические для штаммов, изоли-юванных в Ереване и Душанбе; 1, т, п, о - фрагменты специфичес-;ие для штаммов, изолированных в Ташкента^ р - фрагменты специ-'ические для штаммэг, изолированных в Киеве; г, s - общие фрагмен-ы для штаммов,выделенных в Ереване, Душанбе и Киеве. .. ДНК расщеплены эндонуклеазой Hind III: 1) 821, 2) 823, 3) 295, 4) 194, 5) 199, в) 202, 7) 314, 8) 297, 9) 342. а, Ь, О - фраг-енты специфические для всех исследованных штаммов; d, f, е -рагмевты специфические для душанбинских и ереванских штаммов; д, , i - фрагменты специфические для ташкентских штаммов.

жить каких-либо закономерностей в плазмидных профилях штаммов между культурами, выделенными на определенной территории, так как в различных географических регионах обнаруживались штаммы, принадлежащие как к одинаковым, так- и различным плаэмидоварам. Однако, была выявлена определенная связь между сероваром и плазмидо-варом у штаммов З-Лехпеп". Так, одинаковые плазмидовары обнаружены у штаммов З.^ехпеН серовара 1Ь, изолированных в Душанбе и Ереване, серовара 2а, также выделенных от больных в тех же регионах, сероваров 5а и 6, изолированных от больных в Киеве, Ереване и Ташкенте.

Таким образом использование плаэмидного анализа для типирова-ния сходных по фенотипу штаммов 8.Иехпег1, выделенных в различных географических регионах, позволило дифференцировать их на 7 различных плазмидоваров и выявить взаимосвязь между плазмидоваром и сероваром возбудителя. Однако, то обстоятельство, что в лабораторных условиях возможна как элиминация ллазмид, так и перестройки плаэмидного генома (делеции, инсерции 1в-подобных элементов), свидетельском чему являются наши данные, что плазмида с мол. массой 120-140 М<1а, определяющая основные вирулентные свойства у бактерий этого вида, обнаружена только в почти половине случаев, позволяет утверждать, что данный метод не является оптимальным для типирования. Использование методов изучения геномного полиморфизма ДНК с помощью зондов - ДНК фага М13 на выявление гипервариабельных последовательностей и генов рРНК позволило более объективно охарактеризовать генотипическую вариабельность у сходных по фенотипу штаммов в.ИехпеМ и установить, что штаммы в.ЛехпеМ, циркулирующие в каждом географическом регионе, принадлежат к одному конкретному хромосомному генотипическому варианту, несмотря на то, что они могут различаться по плазмидным спектрам или сероварам (рис. 4). При этом, штаммы Б.ЛехпеМ,

изолированные в Ереване и Душанбе принадлежали к одному геноти-пическому варианту, штаммы, выделенные от больных в Киеве - к другому, а штаммы, выделенные от больных в Ташкенте - к третьему, четко отличавшемуся по большинству полос гибридизации от двух других. Результаты "риботилирования" подтвердили генотипические отличия штаммов S.flexneri, изолирозанных от больных в Душанбе и

от »»aen™w< » T~V"*0iiT0. Однако, пои nuónru-

иировании" не удалось Дифференцировать штаммы киевского, ереванского и душанбинского регионов, так профили гибридизации у /казенных штаммов были одинаковыми.

Таким образом установлено, что циркулирующие в каждом из регионов бактерии S.flexneH характеризуются хромосомным генотипи-jgckhm родством, свойственным для данной территории. Такая хромосомная генотипическая однородность штаммов является еще одним :видетельством клональности эпидемически значимых штаммов возбу-(ителей. Однако, в отличие от позбудителой сапронозов клональ-юсть у эпидемически значимых штаммов S.flexneri носит не глобальный, а региональный характер. Использование плазмидного ана-жэа в молекулярно-эпидемиологической характеристике штаммов l.flexneri позволило, с одной стороны, проследить связь опреде-енных плаэмидных профилей (плазмидоваров) с сероваром возбуди-оля, а, с другой, в совокупности с геномной дактилоскопией -существить дифференциацию сходных по фенотипу штаммов на 9 геотипических вариантов. Указанное обстоятельство показывает реимущество данных методов перед широко используемыми рутинными етодами типирования возбудителей бактери шьиых инфекций.

2) Изучение геномного полиморфизма бактерий М.tuberculosis.

Основной проблемой в борьбе с высококонтагиозной болезнью -уберкулезом является отсутствие эффективных методов экспресс-

,,.:<а ностики возбудителя инфекции и типирования бактерий для выявления контактов и путей передачи возбудителя. Поэтому нами были разработаны две диагностические тест-системы для ранней диагностики возбудителя туберкулеза на основе ПЦР. Из ряда амплифика-ционных тест-систем, разработанных к началу нашей работы для обнаружения возбудителя, нами были отобраны методики P. Hermans et al.(1990) и Kolk A. et al. (1992), позволяющие выявлять микроорганизмы патогенных для человека видов М.tuberculosis и M.bovis. При использовании в ПЦР праймеров TUB А и TUB D и INS 1 и INS 2 в реакции амплифицируются специфические фрагменты 158 нп и 245 нп с ДНК патогенных для человека видов микобактерий. В ходе работы были подобраны оптимальные концентрации дезоксинуклеотидтрифосфа-тов, праймеров и ионов магния. Далее было установлено, что предложенная Hermans P. et al.(1990) и Kolk A.et al. (1992) температура отжига праймеров 55°С, не обеспечивала необходимого уровня специфичности тест-систем. Так пробы, которые содержали ДНК видоа S.aureus, К.pneumoniae, F.tularensis, L.pneumophila, способных вызывать легочные заболевания, давали слабоположительный результат, а ДНК видов М.pneumoniae, Y. pseudotuberculosis, E.coli v один из образцов ДНК человека, не болевшего туберкулезом, давали неспецифические реакции. В связи с этим нами далее был отработан температурный режим отжига праймеров в диапазоне температур от 5! до 65°С. Оказалось, что оптимальная температура отжига праймерОЕ в наших условиях оавна 65°С. При этой температуре исчезали вс< неспецифические реакции, а положительный результат наблюдало только в пробах, содержащих ДНК М. tuberculosis и M.bovis. Пр| этом при использовании INS-праймеров и температуре отжига праймеров 65°С положительную реакцию наблюдали только с ДНК M.tubercu losis. Выявленная особенность позволяет осуществлять дифференциа цию возбудителя туберкулеза от вакцинного штамма БЦЖ у больных вакцинированных незадолго до заболевания. В случае поствакциналь ного осложнения, вызванного вакцинным штаммом БЦЖ, при использо

вании обеих тест-систем для идентификации положительный резулы;. будет получен только в ПЦР с ШВ-праймерами, тогда как в ПЦР . IЫЭ-праймерами не будет амплификации специфического фрагмент-(245 нп). При супоринфекции вакцинированного индивида патогенные

Табл. 2. Видоспецифичность амплификационных тест-систем в условна» ¡uMiieuarvriw от^иг^ npañaapoa.

ДНК бактерий температура отжига праймеров

55°C 65°С

TUBA.TUBD INS1,INS2 TUBA.TUBD INS1,INS2

М. bovis + + + -

М.tuberculosi s + + + f

М. phloi + +/- - -

М. smagmatis +,н/сп +/- - . -

ДНК человека - н/сп - -

(не болевших 1. +/- - - -

туберкулезом) 2. - н/сп - -

F. tularensis +/- - - -

К. pneumoniae +/- н/сп - -

М. pneumoniae н/сп н/сп - -

L. pneumophi 1 а н/сп + - -

S. aureus +/- - - - •

Y. pseudotuberculosis н/сп +/- - -

E. coli н/сп ', +/- -

S. typhimurium - - - -

штаммом М. tuberculosis оба варианта ПЦР будут продуцировать специфические продукты амплификации. Такая возможность диффярог циации патогенных штаммов от вакцинного штамма М. bovis ВСГ СОЗ-

дает существенные предпосылки для решения одной из проблем туберкулеза, а именно, выяснения причин лоствакцинальных осложнений.

Далее было проведено сравнительное изучение эффективности применения данных тест-систем для быстрой и ранней идентификаций! возбудителя туберкулеза в различных типах клинического материала, взятого от больных с разными формами туберкулеза, и осуществлен сравнительный анализ частоты выявления М. tuberculosis с помощью ПЦР и традиционных бактериологических методов (микросколии, культивирования).. Исследование клинического материала от больных с разными формами туберкулеза с помощью разработанных нами тест-систем на основе ПЦР позволило выявить возбудитель у 48 (90,6Х) из 53 больных. В то же время при использовании традиционых методов бактериологической диагностики возбудитель удалось идентифицировать только у 21 (39,6Ж) из 53 больных. Выявленные различия репрезентативны (р<0,001) (табл.3). Чтобы исключить возможность гипердиагностики возбудителя туберкулеза были также исследованы клинические образцы от больных с хроническими респираторными за-1 болеваниями нетуберкулеэной этиологии и дете(. группы риска с хроническими заболеваниями крови. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что разработанные амплификационные тест-системы на основе ПЦР характеризуются высокой специфичностью; высокий процент (90,вх) выявления возбудителя туберкулеза, является истинным, а ложноположительные реакции отсутствуют или их показатель ничтожен.

Таким образом, сравнительное исследование эффективности выявления возбудителя туберкулеза разными методами дало убедительные доказательства преимущества разработанных нами тест-систем на основе ПЦР перед традицинными методами лабораторной диагностики. Эти преимущества характеризуются 3 существенными параметрами: 1) достоверно более высокими показателями выявления возбудителя в клинических образцах; 2) значительно более ранним сроком иденти-

фикации (48.часов и 3-4 недели соответственно); 3) простотой »остановки ПЦР.

Следующей задачей работы являлась апробация и разработка эффективных методов генетического типирооания возбудителей туберку леза. Были разработаны: 1) амплификационная тест-система, основан-

Табл.3.

Сравнение эффективности идентификации возбудителя туберкулеза с помощью ПЦР и бактериологических методов.

Диагноз

Кол-во больных

Метод

ПЦР

Бактериологический

Возбудитель выявлен

абс. число

абс.число

1. Группа 1.Больные с различными клиническими формами туберкулеза

Туберкулема 2 1 50

Очаговый 8 7 87,5

Инфильтративный 14 12 85,7

Диссеминирующий 11 10 90,0

Фиброэно- 18 18 100,0

кавернозный

итого 2. Группа II Хронические Легочные заболевания нету-беркулеэной этиологии

■i. Группа III. Больные дети (группа риска)

О 0 4 6 11

53 48 90,6 21

Больные с хроническими легочными заболеваниями 10 О О О

о о

28,6 54,5 61 ,1

39, 6

Хронические лаболевания чрови

14

7,1

7,1

О

х - измененные/ зернистые формы микобактерий

пая на попимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой удалось осуществить дифференциацию штаммов М. tuberculosis от вакцинного штамма М.bovis BCG как в модельных опытах, так в и диагностическом материале; 2) ПЦР-генетическое типирование на основе использования специфических праймеров IS-Gene 1 и IS-Gene 2, позволяющее амплифицировать собственный инсерционный элемент штаммов М. tuberculosis IS 6110 с мол.массой 1261 нп и далее исследовать ПДФР синтезированного ампликона при расщеплении эндонуклеазами рестрикции. Были Также использованы методы геномной дактилоскопии с применением в качестве зондов ДНК фага М13 и собственного ин-серционного элемента микобактерий IS 6110 и апробированы широко используемый метод "риботипирования" и ПЦР-генетическое типирование с использованием произвольных праймеров. Наиболее эффективными для генетического типирования штаммов М.tuberculosis оказались методы исследования геномного полиморфизма с помощью зондов ДНК фага М13 и IS 6110, а наихудшие результаты получены при использовании метода "риботипирования", при котором удавалось' осуществить только межвидовую дифференциацию возбудителей, а генетических различий между штаммами одного вида выявить не удалось.

Использование, совокупности методов генетического типирования возбудителей туберкулеза позволило получить результаты, свидетельствующие о.том, что выделенные от больных штаммы М.tuberculosis генотипически родственны в регионах с повышенным уровнем заболеваемости, а в регионах с спорадическим уровнем заболеваемости, штаммы, выделенные от больных - ге.нетически гетерогенны, то есть поликлональны (табл. 4). Следовательно для возбудителя туберкулеза выявлена закономерность, отличная от возбудителей сап-ронозов и кишечного антропоноза - дизентерии Флекснера - геноти-пическое родство эпидемических штаммов в регионах с более высоким уровнем заболеваемости и генотипическая гетерогенность штаммов в регионах с спорадической заболеваемостью. Указанное Ьбстоятельст-

Табл.4.

ПДФР-генотипы различных штаммов М. 1иЬегси1озтэ при использование различных методов генетического типирования.

i 1 нн i 1 H Район Генотип, вариант при использовании

штамма проживания зонда ПЦР

ДНК фага "правого пле- профиль ПДФР

М13 ча" 156110 ампликонов

1. 582 Узбекистан 1 1 Г 1

г. 1260 Узбекистан 1 1 1 . 1

3. 1332 Узбекистан н.д. н.д. 1 1

4. 133С Узбекистан н.д. н.д. 2 2

5. 2294 Москва 2 2 1 1

8. 3815 Моек.обл. н.д. н.д. 3 3

7. 2928 Чечня 3 3 4 4

В. 3853 Чечня н.д. н.д. 5 5

9. 2924 Грузия 4 4 6 6

10. 3760 Тюмень 5 5 7 7

1 1 . 3813 Магадан 1 6 1 1

12. 3757 Азербайджан 1 . 7 1 1

13. 6751 Гомель н.д. н.д. 7 7

14. 2524 ' Чернобыль н.д. н.д. 8 в

15. Эрдман (лаб.штамм) 6 в 9 9

16. BCG М.Ьоут э 7 9 10 10

во позволяет предположить, что в основе клональности штаммов, изолированных в регионах с высокой заболеваемостью туберкулезом лежат общие закономерности клонально-селекционного механизма и соответствующей организации генома, создающего оптимальные- условия для выживания возбудителя на данной территории вследствие проживающей на ней более восприимчивой к инфекции популяции людей.

III. ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗООНОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ - БАКТЕРИЙ РОДА FRANCISELLA РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ.

Дифференциация вирулентных и авирулентных клонов различных подвидов F.tularensis является одной из актуальных задач молекулярной эпидемиологии возбудителя туляремии. Помимо отсутствия каких-либо данных,' касающихся использования геномного полиморфизма для типирования франсизелл, задачей данного фрагмента работы было получить данные,подтверждающие или опровергающие выявленные закономерности, обнаруженные для эпидемически значимых штаммов возбудителей сапронозов и антролонозов. В работе были использованы вирулентные, и авирулентные штаммы F. tularensis неарктического, голарктического и среднеазиатского подвидов возбудителя, а также мутанты этих подвидов. С помощью метода геномной дактилоскопии с использованием ДНК фага М13 удалось выявить различия между виру-' лентными и авирулентными штаммами F. tularensis, заключавшиеся в том, что фрагменты рестрицированной хромосомной ДНК у штаммов F. tularensis разной степени вирулентности, гибридизовавшиеся с зондом, отличались по молекулярной массе. При этом все вирулентные штаммы формировали идентичный профиль гибридизации, в то время как авирулентные штаммы, потенциально вакцинные авирулентные му-тантн, вакцинный штамм 15-10 формировали 3 других, отличных друг от друга и от профиля гибридизации вирулентных штаммов, картины гибридизации. Исключение из выявленной закономерности обнаружено для штамма Schu, картина гибридизации которого оказалась идентичной профилям гибридизации при расщеплении ДНК'эндонуклеазой Eco R1 авирулентных мутантов 1650 и 22-7, полученных из вирулентного штаммы формировали идентичный профиль гибридизации, в то время как авирулентные штаммы, потенциально вакцинные авирулентные му-

'23,13

9.42

6,68

5 6 7 8 9 10 11

А. Эндонуклеаэа I.

А: Р. 1и1агепэ13: 1-;а >Й1»: 3-543;

■*-5 31И»; й-Ьспи; б-22-7 7-1650; 8-15-10; 9-53

10 - Р.поу<с1аа и 112

11 - Р.поУ1с1аа 15/6

23,13'

9,42-

3,63Н

Р.1и1агепэ1з:' 1-А СоТе; 2-503; 3-543; 4-1386; 5-1650; б-БсИи; 7-15-10; 8-22-7; 9-53; 10 - Р„поУ1С1(1а I) 112; >'. - г . ; с; *5/3

12 345 57 8 9 !0 !!

А. Эндонуклеаэа Есо Я!,

23,13 -Г

9,42

а,68 4,36

1 2 3 4 Е б 7 8 Эндонуклеаэа Есо Я1.

ъ: - :-и • агэп£1 а: 21/40С;. 2-503; 3-543. 4-А Со1е; 5-1386; 61650; 7-6/6; 8-22-7; 9 - Р. поутстйа 1Л12;. { 10-Р.1и1агег>8<з 15-Ю; 11-Р.рМ1оггпгадта 3017, 12 - Р. 4и1агепзта Зсви; 50 11 12 13 13 - Р.4и1агапз'!£: 15/Е.

?ис.5. Генетическое типированиа штаммов рода ггапс1зе!5а. А) зонд - ДНК фага М13, Б) зонд - фрагмент гена рРНК.

танты, вакцинный штамм 15-10 формировали 3 других, отличных дру.

or друга и от профиля гибридизации вирулентных штаммов, картины гибридизации. Исключение из выявленной закономерности обнаружено для штамма Schu, картина гибридизации которого оказалась идентичной профилям гибридизации при .расщеплении ДНК эндонуклеазой Eco Ri авирулентных мутантов 1650 и 22-7, полученных из вирулентного штамма A Cole, (рис.5) и индивидуальной при расщеплении ДНК эндонуклеазой Pst 1.

.Таким образом, как и в случае с другими исследованными видами бактериальных инфекций выявлена эффективность метода геномной дактилоскопии с использованием в качестве зонда фага М13, позволяющего дифференцировать эпидемически значимые штаммы от штаммов, не имеющих эпидемиологической значимости.

Использование второго метода генетического типирования - "ри-ботипироеания" показало, что данный метод является эффективным в дифференциации подвидов F.tularensis, а также других видов Francisella - F.tularensis biogr.novicida и F. philomiragia (рис.5).

IY. ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ . ИНФЕКЦИЙ.

Возбудители внутрибольничных инфекций в отличие от типичных возбудителей сапронозов, антропоноэов и зооноэов объединены не по признаку резурвуара инфекции или механизму передачи, а по признаку общности условий их - возникновения и распространения. Другим существенным отличием от типичных бактериальных инфекций, является то, что особенности "госпитальной" инфекции определяются как контингентом госпитализированных больных и популяциями паразитов, так и условиями, в которых развивается эпидемический процесс (В.Д. Беляков, Р.Х. Яфаев, 1989). В связи с этим исследован геномный полиморфизм "госпитальных" штаммов для 1) оценки эффек-

гивности методов исследования геномного полиморфизма в дифференциации и маркировке близкородственных по фенотипу (как правило, идентичных по таким эпидемиологическим маркерам как устойчивость < антибиотикам, фаготипу и серотипу) штаммов и 2) расшифровки зозможных механизмов появления, формирования и распространения эпидемических значимых (вспышечных) штаммов. С этой целью исследован ГеНОМНЫЙ ПОЛИМОРЛИяи ОТПмиимг ---руг O'i дру-

а воа6»питвг.?й n;;yi р;;оаль«мчных инфекций - грамотрицательных >актерий вида К.pneumoniae семейства Enterobacteriaceae и грампо-южительных - метициллинустойчивых штаммов S.aureus (MRSA) семей-:тва Micrococcaceae.

I) Молекулярно-генвтический мониторинг внутрибольничных штаммов С. pneumoniae а детском стационаре.

Исследованы штаммы К.pneumoniае, выделенные в течение постоянного микробиологического мониторинга на протяжении двух лет j отделении интенсивной терапии новорожденных Российского Центра то акушерству, леринатологии и гинекологии РАМН. В течение данно-"о периода в отделении были зарегистрированы две вспышки внутри-тольничной инфекции (с интервалом в 1 год), вызванными ата«иами (.pneumoniae, сходными по фенотипу и плазмидному составу. При ис-;лодованяи геномного полиморфизма госпитальных штаммов К. pneumoniae с помощью зондов ДНК фага М13 и рРНК гена выявлено 11 различных хромосомных генотипических вариантов (рис.б). Анализ штампов К.pneumoniae, выделенных во время двух вспышек, показал', что каждая из них была вызвана отдельным хромосомным генотипическим вариантом, получившим распространение во время вспышки. При этом, в штаммах, выделенных с каждой из вспышек обнаружены 2 идентичные плазмиды - конъюгативная R-плазмида с won. массой 40 Mda, кодирующая цитотоксичность по отношению к клеткам НЕр-2 (Калнин К.В.

а) '.М MBB В М М М М В MB М М М м !

б) .J < < I I J « II » J I J I И I » j

e)

,1 3 it s

> 1» II II II t< is 1С

г

Рис.6. Геномная дактилоскопия ДНК штаммов К.pneumoniae, выделенных в течение постоянного молекулярно-генетического мониторинга в различные эпидемиологические периоды: а) М - межэпидемический период, В - эпидемический период (вспышка), 6) ПДФР-генотип, в) порядковый номер штамма. В качестве зонда использована ДНК фага М13.

и др.,1993) и плазмида с мол.массой 105 Mda. В межэпидемические периоды обнаружены как штаммы хромосомных генотипических вариантов аналогичных вспышечным штаммам , но не содержащих плазмид с мол. массами -40 и 105 Mda, так и штаммы других, отличных от вс-пышечных, хромосомных генотипических вариантов, содержащие вышеуказанные плазмиды. Установлено, что штаммы, выделенные в течение первой вспышки не обнаруживались в. отделении ни до возникно-' вения вспышки, ни-, после проведения противоэпидемических мероприятий. В то же время бактерии К.pneumoniae хромосомного гено-типического варианта, вызвавшие вторую вспышку, обнаруживались в стационаре в течение нескольких месяцев до ее возникновения, но имели другие плаэмидные спектры. Таким образом, полученные данные

свидетельствуют о том, что в основе появления эпидемического штамма лежат 2 механизма: 1 ) занос эпидемического штамма извне и 2) формирование эпидемического варианта непосредственно в стационаре. Для формирования эпидемического варианта необходимы 2 условия: 1) определенный хромосомный генотип штамма и 2) наличие в штамме 2-х плазмид с мол. массами 40 и i«« Указанно* обстлп-

«епьство сяг?,-отйлье7вует о -гг..». ^то Гини факюроо патогенности у эпидемических форм К.pneumoniae, способных вызывать вспышки внут-рибольничной инфекции, локализованы как на хромосоме, так и на плазмидах.

2) Генотипическая характеристика метициллинустойчивых штаммов (MRSA) S.aureus, изолированных в стационарах различных гографи-ческих регионов бывшего СССР.

Исследованы метициллинустойчивые штаммы S. aureus, изолированные от носителей и больных с внутрибольничной инфекцией, лечившихся в 7 стационарах и расположенных в различных географических регионах бывшего СССР. В связи с тем, что MRSА штаммы, как правило, фактически идентичны по фенотипу, существует гипотеза (Laeey, 1974), чтб они имеют клональное происхождение. Существует и противоположное мнение, однако прямых доказательств,- которые можно получить только методами геномной дактилоскопии не существовало. В исследуемую выборку были включены штаммы, которые характеризовались сходными фенотипами. Использование для типирования в качестве эпидемиологических маркеров таких фенотипических признаков как устойчивость к антибиотикам и фаготипирование позволило выя-зить незначительные фенотипические отличия между штаммами, выдоенными в стационарах разных регионов. Однако при типировании штаммов, изолированном в каком-либо одном конкретном стационаре, |иф$еренцировать штаммы с помощью указанных тестов оказалось не-

возможный.

Табл.5.

ПДФР-генотипы метициллинустайчивых стафилококков.

NN Метод генетического типирования (ПДФР генотип)

штамма

Хромосомный полиморфизм Плазмид- ПДФР коагу- Суммарный

(рРН.К ген) (ДНК фага чый про- лазного гена ПДФР гено-

М13) филь тип

- г. Москва

I •Л (9-я больница]

947 IY I 4 IY I

746 11 YI 4 I 2

37 II I 3 I 3

1054 I II 6 I 4

1007 I I 4 YII 5

(30-я больница)

489 II I 3 6.

(Ин-т педиатрии)

352 III I, 1 I 7

• (ЦИТО)

22-13 I I 5 YII а

22ВМ I I 5 IY 9

г. Минск

(Ожоговый центр)

2023 II 4 t 10

64 III ■ 5 I 11

67 I 4 I 10

74 I 4 I . 10

2451 II 2 Y 12

89 I . .1 2 н.д. 13

112 II I 0 Y 14

115 I г. Омск (роддом) Y | 1 m 15

г. Тбилиси

(Хирург.стационар)

L17 I IY I 2 IY 16

PS85 ii.iSi-Sii I i 1 YII I п _____ 1 >¿11 i н.а. 1 4 - vi т т 1 1 _____________J

Использование различных методов генетического типирования (плазмидный анализ, гибридизация рестрицированных эндонуклеазами " фрагментов хромосомной ДНК с помощью универсальных зондов - ДНК фага Ml3 и генов рРНК, изучение ПДФР коагулазного гена, который амплифициропали в ГИДР, позволило типировать сходные по фенотипу штаммы S. aureus на 16 различных генотипических вариантов (табл. 5). При этом оказалось возможным типировать штаммы, идентичные по фенотипу и выделенные в одном стационаре в одно и то же время. Результаты комплексного исследования геномного полиморфизма "госпитальных" штаммов S. aureus подтверждают закономерность поли-клональности эпидемических штаммов условнопатогонных микроорганизмов, выявленной нами ранее для другого вида возбудителей внут-рибольничной инфекции - штаммов К.pneumoniае.

V. РАЗРАБОТКА ОСНОВНЫХ ПРИНЦИПОВ И СХЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТИПИРОВАНИЯ

ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ.

Исследование геномного полиморфизма с помощью различных моло-кулярно-генетических методов у возбудителей бактериальных инфекций, относящиеся к 5 семействам, 8 родам, 23 видам и характеризующихся различными типами паразитизма, позволили получить исчерпывающие характеристики их потенциала в генетическом типировании дпя решения актуальных проблем микробиологии и эпидемиологии.

за.

Прежде всего необходимо отметить, что методы, основанные на исследовании геномного полиморфизма с помощью универсальных зондов - ДНК фага М13 и генов рРНК в равной степени эффективны при проведении межродового и межвидового типирования. Поэтому, данные, полученные с помощью этих методов, могут служить дополнительными доказательствами для решения задач таксономии и систематики патогенных микроорганизмов, ярким примером чему могут быть наши исследования геномного полиморфизма штаммов вида Leptospira inadai, на основании которых Международному подкомитету по таксономии лептоспир было предложено исключить из рассмотрения вопрос о присвоении видового статуса Leptospira inadai.

Однако, наиболее важным является оценка эффективности существующих методов изучения геномного полиморфизма в дифференциации близкородственных возбудителей инфекций, характеризующихся высокой степенью фенотипического и генотипичоского родства, но обладающих различной эпидемиологической значимостью. В связи с этим в исследованные выборки включались, как правило, штаммы идентич- ' ные или сходные по фенотипу, которые невозмож-о дифференцировать с помощью стандартных методов лабораторной диагностики, используемых в медицинской микробиологии. При использовании данного принципа осуществлена оценка эффективности примененных нами методов по отношению к каждому изученному виду возбудителя и в табл.0 представлены оптимальные и альтернативные методы исследования геномного полиморфизма для решения некоторых актуальных задач эпидемиологии и микробиологии.

Кз представленных данных можно видеть, что наиболее эффективными из использованных и разработанных нами методов являются тест-системы, основанные на выявлении повторяющихся последовательностей, рассеянных по гейому. При этом, некоторые из таких «

последовательностей, .как например, повторяющиеся или "минисател-литные" последовательности, обнаружены во многих видах возбудите-

Табл.6.

Рекомендуемые методы генетического типирооания близкородственных

штаммов различных видов патогенных микроорганизмов.

Семейство род, вид, биотип 1 Возможные задачи Метод Авторы Альтерна-ные методы

v. гьл1 " ™ ~ ciassic»» eltor non 01 *.атгг:"03 ^а^ной »ни демиологичоской значимости 2. Мониторинг очага инфекции ¡ Зонд ЛИК фага М13 ,Гини6упг А.Л. и др. (1989) 'ПП- Г!Ц?-i а нетическое типирование

Legionella L.pneumophi1 la 1. То же То же Шагинян И.Д. и др.(1990) То же

Leptospi ra L.Interrogan L.btflexa -eptonema 1 . То же в 2.контроль коллекций культур микроорганизмов То же Шагинян И.А. и др. (1990) То же

intorobacte-'i aceae, ¡hlgella, i.flexnori . 1. Региональное картирование 2. Мониторинг ареалов распространения Зонд ДНК фага М13 Шагинян И.А. И др.(1993) "риботипи-рование"

rancísella, .tularensi s .novicida, .philomiraía 1.Типирование .штаммов с разной вирулентностью 2. Меж-родовое и видовое типирование 3. Маркировка вакцинного штамма Зонд ДНК фага М13 риботипи-рование" Шагинян И.А. и др.(1992) Шагинян И.А. и др. (1994] ПП-ПЦР-ге-нетическое типирование

Enterobacte- Насеае, Klebsiel 1а, К.pneumoniae 1. Идентифика- кация вспышечных штаммов 2. Выявление источника' инфекции 3. Выявление причины госпитальных вспышек Зонд ДНК фага М13 "риботипи-рование" Шагинян И.А. и др. (1993)

Mic'rococca-ceae, Staphilococ-cus, S.aureus X 1. То же 2. 'То же 3. То же То же То же Шагинян И.А. и др. (1994) ПЦР-гене-тическое типирование на основе ПДФР гена коа-гулазы (воп виее- Нап и др. 1992)

Mycobacte-riaceae, Mycobacteria M. tuberculosa M.bovis, 1. Типирование эпидемических , штаммов в, 2. Маркировка вакцинного штамма 1.Зонд на собст.повтор последовател ность IS 611 2. Зонд ДНК фага М13 Hermans et а' 7~] (1993) ь-0 Шагинян И.А. и др. (1994) .

Примечание: для плаэмидсодержащих видов бактерий необходимы исследования плазмидных спектров и ПДФР плазкид.

лей бактериальных инфекций, а это позволяет, используя зонд на гипервариабельную последовательность, эффективно типировать различные виды возбудителей. "Универсальные" зонды очень удобны, так как стандартизируют методы исследования и упрощают выполнение работы. Преимуществом таких (ест-систем • типирования является и то, что ¿то единственный метод исследования геномного полиморфизма, позволяющий дифференцировать штаммы с различной эпидемиологической значимостью. Столь выраженные и характерные профили гибриди-

зации у эпидемически значимых штаммов, которые отличны от профилей гибридизации близкородственных штаммов, не имеющих эпидемической значимости, позволяют полагать, что определенная локализация на тех или иных участках хромосомы гипервариабельных последовательностей не случайна и последние выполняют функцию существенно важную для выражения вирулентных свойств í«»«?»?.

IIO Mücrcrv^ro Примени ЭГИ Функции "Siírin.-CTücí.

Второй тип повторяющихся последовательностей относится к собственным последовательностям определенных видов возбудителей. Применив таких последовательностей, как например в качестве зонда, "правого плеча* инсерционного элемента М.tuberculosis IS 6110 или ПДФР ампликона этого же элемента, для типирования близкородственных штаммов показало, что они могут быть использованы для решения таких задач микробиологии и эпидемиологии как выявление источника инфекции, картирования ареалов распространения определенных клонов возбудителей, путей передачи и т.д.

Наиболее широко используемый метод "риботипирования" был также апробирован нами на ряде моделей. По нашему мнению он уступает методам типирования, основанных на выявлении гипервариабепькых и собственных повторяющихся последовательностей, особенно в тех случаях, «огда исследуется геномный полиморфизм штаммов, сходных По фенотипу и генотипу.

В случае использования ПЦР-генетического типирования показано, что оба из известных вариантов изучения полиморфизма возбудителей эффективны в случае, когда при ПП-ПЦР типировании подобраны эптимальные произвольные праймеры, а при Г-ПЦР-типировании выбра-■ш ген или специфическая последовательность возбудителя, имеющие вариабельные участки.

Совокупность полученных результатов и проведенная в прйцессе заботы сравнительная оценка разнообразных методов исследования -еномного полиморфизма позволила сформулировать основные - прйКЦИ-

пы, методологию и тактику генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций, которые должны использоваться для получения объективных и репрезентативных данных.

Основными условиями использования методов геномного полиморфизма для решения фундаментальных и прикладных задач инфектологии являются:

1. Невозможность решения задач с помощью рутинных микробиологических, биохимических и иммуносерологических методов исследования .

2.. Изучение генетических связей представителей популяции,которые характеризуются различной эпидемиологической значимостью.

3. Изучение геномного полиморфизма у видов возбудителей, ге-нотипические характеристики которых не исследованы.

4. Исследование геномного полиморфизма для подтверждения выводов, основанных на методах исследования фенотипов возбудителей."

5. Разработка новых методов молекулярно-генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций.

ВЫВОДЫ:

1. На основе исследования геномного полиморфизма разработаны принципы и схемы генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций, различающихся эпидемиологической значимостью, типами паразитизма и резервуарами.

< 2. Разработанные схемы генетического типирования включают комбинирование, в зависимости от вида возбудителя, трех молекулярно-.генетических методов - исследование геномного полиморфизма с использованием универсального зонда - ДНК фага М13, ПЦР-генетичес-кого типирования на основе изучения полиморфизма длины фрагментов рестрикции аиплифицированного гена или специфической последовательности возбудителя и ПЦР-генетического типирования с использо-

ванием произвольных лраймеров.

3. Установлено, что с помощью разработанных схем генетического типирования эпидемически значимые штаммы исследованных видов возбудителей разделяются на 3 основных типа:

а) эпидемически значимые штаммы, имеющие клепальную природу 1 ) глобального и 2) регионального характера. Tunnuuu.... вигппаи" ТСКИХ csyjlia ЬОЗбуДИГППАЙ Wr.r.-rzr, ££).»5удиТ«»Л« сапронозов (холеры, легионеллеза, лептоспироза). (1) и (2) антропоноза с ки-шечно-оральным механизмом передачи - дизентерии Фпекснера;

б) эпидемически значимые штаммы смешанного ( клонально-поли-клонапьного) характера, т.е. имеющие клональное происхождение в регионах с повышенным уровнем заболеваемости и генотипически гетерогенные в регионах с спорадическим уровнем заболеваемости. Типичным представителем такой группы являются возбудители аэрозольного антропоноза - туберкулеза - штаммы М.tuberculosis;

в) эпидемически значимые штаммы, характеризующиеся генотили-ческой гетерогенностью. Характерными представителями этой группы возбудителей являются возбудители внутрибольничных инфекций -грамположительные штаммы S. aureus и грамотрицательные бактерии К.pneumoniae.

4. Впервие установлено, что исследование геномного полиморфизма возбудителей бактериальных инфекций на основе - созданных схем генетического типирования, позволяет решать следующие задачи:

1) осуществлять региональное картирование штаммов, а следовательно, проводить мониторинг ареалов распространения эпидемичес-<и значимых штаммов возбудителей Сна модели возбудителя дизентерии - штаммов S.flexneri);

2) дифференцировать эпидемические формы возбудителей от неэпидемических (штаммы видов V.cholerae, L.pneumophila, родов Lepto-;pira, Francisella);

3) проводить контроль микробных коллекций с целью подтвержде-

ния или исключения новых под- или видовых статусов микроорганизмов (на модели бактерий рода Leptospira).

5. С помощью микробиологического, эпидемиологического и молв-кулярно-генетического мониторинга впервые установлено, что условно-патогенные микроорганизмы, циркулирующие в стационарах (госпитальные штаммы видов S.aureus и К.pneumoniae) генотипически неоднородны, однако не все из генотипически различающихся госпитальных. вариантов условно-патогенных микроорганизмов способны вызывать вспышку'госпитальной инфекции.

б.. Впервые получены прямые доказательства, что при возникновении госпитальных вспышек реализуются 2 механизма: 1) занос эпидемически значимого штамма извне и 2) формирование эпидемического варианта в стационаре за счет генетической передачи плазмид вирулентности и антибиотикоустойчивости .в циркулирующие в стационарах штаммы определенных генотипических вариантов.

7. При мониторинге очага холерной инфекции впервые установлено, что генотипически полиморфная часть популяции холерных виб-' рионов, не имеющих эпидемиологической значимости, не может быть источником формирования эпидемически значимых штаммов возбудителя за счет передачи генов факторов патогенности в водоемах.

8. Разработаны методы экспресс-диагностики и генетического ти-лнрования возбудителей туберкулеза - штаммов М. tuberculosis на основе ПЦР:'

5) Метод экспресс-диагностики позволяет выявлять возбудитель на 2-е сутки после взятия' диагностического материала на анализ у 90,ех больных, тогда как при использовании рутинных методов лабораторной диагностики М.tuberculosis возбудитель удается выявить только у 39,6* больных в срок 3-4 недели;

6) Разработанный метод генетического тилирования возбудителей туберкулеза на основе ПЦР позволяет дифференцировать штаммы непосредственно в диагностическом материале;

в) Последовательное использование методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулеза на основе ПЦР позволяет в течение 4-5 дней осуществить выявление и маркирование штаммов М. tuberculosis, обеспечивая тем самым возможность начала проведения этиотропного лечения и противоэпидемических мероприятий на 1,5 месяца раньше, чем при применении рутинных методов лабораторной диагкоы^ки ьозбудигелн.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Генетический контроль токсинообразования у холерных вибрио-рионов. Сообщение 1. Мобилизация гена tox V.Cholorae ллазмидой RP4:mucts62//*.микробиол.,эпидемиол.,иммунобиол.,1981,N7, стр.22-

27(соавт.Скавронская 4.Г., Гайлонская И.Н.,Вертиев Ю.В. .Алешин Г.И.,Тиганова И.Г.,Езепчук Ю.В.).

2.Роль энтеротоксина и нейраминидазы в биологической активности вибрионов Эль Тор// Ж.микробиолэпидемиол.,иммунобиол., 1982,N9, стр.90-93 (соавт. Гайлонская И.Н.,Жукова Э.В..Святой В.И).

3. Способ получения гипериммунной антитоксической противохолерной сыворотки// Авторское свидетельство N 936514 , выдано 1982 г. (соавт. Вертиев Ю.В.).

4. Холероподобные энтеротоксины бактерий: методология диагности-ки//Кн."Мол.биология, генетика и иммунология особо опасных инфек-ций"1984, Ростов-на-Дону, стр.73-78.

5. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина

V.cholerae Eltor// Мол.генетика,микробиол., вирусол.,1984,N9, стр. 12-18.(соавт. Гинцбург А.Л., Н.В.Янишевский, В.Л.Мотин, Ю.В. Вертиев, Г.6.Смирнов).

6. Определение токсигенности штаммов кишечной палочки и холерного вибриона радиоиммунологическим методом// Мол.генетика,микробиол.., вирусол., 1985,N3, стр.38-40.(соавт.Ю.В. Вертиев, М.В. Степанова,

Ю.В.Езепчук).

7. Штамм Escherichia coli KS 1672 - продуцент холерного токсина// Авторское свидетельство N 1190640,'Выдано в 1985 г.(соавт. Гинцбург А.Л..Янишевский Н.В., Мотин В.Л.,Вертиев Ю.В.,Смирнов Г.Б.).

8. Испытание различных питательных сред для продукции внутриклеточного термолабильного энтеротоксина штаммами Н74-114 и 86 Escherichia coli// Ж.микробиол..эпидемиол..иммунобиол.,1985, N6, стр. 23 - 26 (соавт.М. В. Степанова, Ю. В. Вертиев, В.П. Носкова, Ю.В.Езепчук).

9. Исследование штаммов V.cholerae eltor методом ДНК-ДНК гибридизации с зондом холерного токсина// Кн."Проблема переноса гене-

тической информации",1985, стр.11 5-118(соавт.Мотин В.Л., Гинцбург А.Л..Гончарова Н.С., Смирнов Г.Б).

10. Изучение попупяционного состава вибрионов Эль Тор различной вирулентности по токсинобразующей способности //Сб. Всесоюзн.конференции "Актуальные вопросы микробиологии, лаб. диагностики и профилактики холеры",1988, стр.76-77 (соавт. О.В. Осауленко, А.А. Вейдо, А.С.Марамович, Ю.В.Вертиев).

11. Использование молекулярного зонда ДНК фага М13 для эпидемиологического анализа штаммов холерных вибрионов//Там же,1988, стр. 51-53,(соавт.Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф.,Янишевский Н.В., Грижебовский Г.М.,Токарская О.Н.,Рысков А.П.,Смирнов Г.Б).

12. Изучение, полиморфизма штаммов холерных вибрионов разного происхождения методом геномной дактилоскопии//Генетика, 1989, т. 24, N7,стр.1320-1324 (соавт.Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М., То- карская О.Н.,Рысков А.П., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В., Смирнов

Г.Б).

13. Токсинпродуцирукицая способность популяций холерных вибрионов разного происхождения// Ж.микробиол.,эпидемиол.,иммунобиол, 1990, N1,стр.9-13 (соавт.Осауленко О.В., А.С.Марамович, А.А.Вейде, Ю.В.Вертиев).

14. Геномная дактилоскопия возбудителей бактериальных инфекций// Сб."Современные направления создания медицинских диагностикумов", М.,1990, стр.80.(соавт. Токарская О.Н., Грижебовский Г.М., Тарта-ковский И.С., Ананьина Ю.В., Романова Ю.М., Рысков А.П., Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В).

15. Genomic polymorphism of Leptospira DNA r. a effective method for their identification//Abstracts Leptospirosis Research Conference 1990, p. 63 (соавт. Ananyina Yu.V., Tokarskaya O.N., Gints-burg A.L.Pros'orovskii S.V.).

16. DNA fingerprinting as a effective method for epidemiological analysis of bacterial infection agents//IUMS Congress: Bacteriology and Mycology - Osaka, Japan - 1990. Program and Abstract, PS51-08,p.102 (соавт. Tokarskaya O.N., GrigebovskH G.M. et al.).

17.Использование ДНК фага M13 для выявления геномного полиморфизма у' возбудителей бактериальных инфекций// Кн. "Бактериальные плазмиды", Нальчик, 1990, стр.86-87 (соавт. Гинцбург А.Л., Токарская О.Н., Грижебовский Г.М., Рысков А.П. и др.).

18. Молекулярная эпидемиология холеры: некоторые подходы к решению спорных вопросов// Кн. "Бактериальные плазмиды", Нальчик, 1990,стр.55-57.(соавт. Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф., Гинцбург А.Л.).

19. DNA Fingerprinting of Leptospira Species//Abstracts of YII Europian and IX USSR Leptospirosis research conference, Moscow, 1990, p.66-67 (соавт, Ananyina Yu.V., Tokarskaya O.N., Gintsburg A.L..Prosorovskii S.V).

20. Геномная дактилоскопия возбудителей сапронозов//Ж.микробиол., эпидемиол.,иммунобиол., 1991,N6, стр.25-31.(соавт. Ананьина Ю.В., Токарская О.Н., Тартаковский И.С., Брюханов А.Ф., Рысков А.П.,

Гинцбург А.Л..Прозоровский С.В.)

21. Изучение генетического полиморфизма F.tularensis методом геномной дактилоскопии// Кн. "Актульные проблемы профилактики туляремии". Тезисы докладов Всесоюзной конференции, М.,1991, стр.195-196(соавт. Комиссарова Л.В., Захаренко В.И., Алешкин Г.И., Гинцбург А.Л. ) .

22. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций// Мол. генетика, микробиол.и вирусол., 1991, N 12, стр.3-9. (соавт.

ГиинАилг Л П \

23. СонОнмйнный нптппм unnavvnanunaunnnruuarvna пиагип^ти.,, п

микробиологии и эпидемиологии// Кн."Современные методы иммунохи-мической и молекулярнобиологической диагностики в медицине", М., 1992, стр.6-12. (соавт. Гинцбург А.Л.).

24. DNA Fingerprinting of Legionella pneumophila serogroup 1// LG-92. 7th Meeting of Europian.Working Group on Legionella Infec-' tions,1992, pp.126-128 (соавт. Tartakovskii I.S., Marakusha B.I, Gintsburg A.L., Prosorovskii S.V.).

25."ДНК амплификационен тест за детекция на Helicobacter pylori "//Сб. тезисов "YII конгресс по заразни и паразитии болести", Велинград, 1992, С.6.(соавт.Бошнаков Р., Маркова Г., Гинцбург А., Аксенов М., Кьсовски).

26. "Изучение геномного полиморфизма штаммов Shigella flexneri, изолированных в разных географических регионах"// Мол. генетика, микробиол.и вирусол., 1993, N1-2, стр. 8-13 (соавт..Романова Ю.М, Уткин В.В., Рубинов Г.Е., Бондаренко В.М., Гинцбург А.Л).

27. Исследование геномного полиморфизма метициллинустойчивых штаммов золотистого стафилококка// Генетика,19Э4, N5, с.627-634 (соавт. Нестеренко Л.Н., Терехов А.А., Гладкова К.К., Диитренко О.Д., Гинцбург А.П.)

28. Геномный полиморфизм госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae//^. "Актуальные проблемы инфекционной патологии", часть 1, Санкт-Петербург, 1993, стр.89 (соавт..Калнин К. В. , • Терехов А.А., Анкирская А.е., Глатман Л.И., Гинцбург А.Л).

29. Тест системы на основе полимеразной цепной реакции для иден-тификадции возбудителя туберкулеза//Лроблемы туберкулеза, 1994, N 4,с.29-32 (соавт. Нестеренко Л.Н., Аксенов М.Ю., Гришина Т.Д.,

Голышевская В.И., Хоменко А.Г..Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В.)

30. DNA fingerprinting of met hici11iп-resistant staphylococcus aureus (MRSA) strains//Abstracts of 7 International Congress on Microbiology, Prague, 1994.

31. Является ли саркоидоз хронической персистирующей инфекцией 7 1/Ж.Микробиол., эпидемиол., иммунобиол, 1994, Приложение к N 4, стр. 64-68 (соавт.Хоменко А.Г, Голышевская В.И. и др.)

32. ПЦР-генетическое типирование возбудителей бактериальных ин-|>екций//Генетика, 1995, т. 31, N 5, стр. 600-610 (соавт. Гинц-5ург А.Л.)

33. Идентификация возбудителя туберкулеза в клиническом материа-

ле с помощью метода полимераэной цепной реакции //Мол. генетика, микробиол•и вирусол., 1995, N 1, стр. 36-39 (соавт. Гришина Т.Д., Пузанов В.А.и др.).