Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину

Дмитриенко, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину"

На правах рукописи

ДМИТРЕНКО Ольга Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ ВИДА STAPHYLOCOCCUS AUREUS, УСТОЙЧИВЫМИ К МЕТИЦИЛЛИНУ/ОКСАЦИЛЛИНУ

03 00 07 - микробиология, 14 00 30 - эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ооз

Москва - 2008

003163628

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Почетного академика Н Ф Гамалеи РАМН

Официальные оппоненты

Член-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор Брико Николай Иванович

Доктор медицинских наук, профессор Анкирская Алла Семеновна

Доктор медицинских наук, профессор Белобородова Наталья Владимировна

Ведущая организация - ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Защита состоится 15 февраля 2008 г в 11 час на заседании Диссертационного совета Д 001.007 01 в ГУ НИИЭМ им НФ Гамалеи РАМН по адресу 123098 г Москва, ул Гамалеи, д 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Автореферат разослан «М» 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета /тДАд

доктор медицинских наук, профессор Г ^ \ I Е. В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в конце XX века в борьбе с инфекционными заболеваниями человека, внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из острейших проблем современной медицины, которая приобретает все большую экономическую и социальную значимость Рост заболеваемости ВБИ связан со значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов, увеличением частоты инвазивных лечебных процедур и методов диагностики, качественными изменениями структуры популяции пациентов (Прозоровский С.В , Генчиков JIА, 1994, Покровский В И и др 2000, Семина H А , Ковалева Е П, Акимкин В Г, Сидоренко С В., 2006)

Среди возбудителей ВБИ одно из ведущих мест во многих развитых странах мира принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является Staphylococcus aureus Эпидемиологическая обстановка осложняется в связи нарастанием частоты выделения клинических изолятов золотистого стафилококка, устойчивых к оксациллину (метициллину), сокращенно называемых ORSA или MRSA, которые наряду с устойчивостью ко всем ß-лактамным антибиотикам нередко обладают резистентностью и ко многим другим классам антимикробных препаратов (Ayhffe, G А , 1997, Воусе J M ,1997, Lowy F D , 2003) По данным зарубежных исследований MRSA вызывают разнообразные формы внутрибольничной инфекции, включая наиболее тяжелые, такие как бактериемия, пневмония, синдром токсического шока, септический артрит, остеомиелит, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения (Edmond MB et al ,1999, Dinges M M , Orwin P.M. and Schlievert P M, 2000, Engelmann J J et al, 2003)

В конце 80-х годов XX века на основании сходства фенотипических характеристик клинических изолятов MRSA, выделенных во время вспышек ВБИ в разных стационарах, сформировалось представление о способности некоторых госпитальных штаммов MRSA к эпидемическому распространению (MarplesR. R, and Cooke Е, 1985) Внедрение молекулярных методов типирования в эпидемиологические исследования явилось мощным инструментом идентификации и изучения механизмов формирования эпидемически значимых штаммов прокариот На стыке микробиологии, молекулярной биологии и эпидемиологии возникло новое направление исследований — молекулярная эпидемиология инфекционных заболеваний, основными задачами которого являются изучение географического распространения различных генотипов патогенных микроорганизмов, их роли в формировании особенностей клинических форм заболеваний, т.е углубленного изучения паразитарной системы как биологической основы эпидемического процесса инфекционных болезней (Черкасский БЛ, 2001) Использование молекулярных методов типирования позволило нескольким группам

зарубежных исследователей выявить циркуляцию MRSA, сходных по ряду молекулярно-генетических характеристик, не только в стационарах различных городов, но даже стран, расположенных на разных континентах. Такие MRSA в работах английских исследователей получили название эпидемических штаммов (Hookey J.V., Richardson J F and Cookson В D, 1998) В отличие от идентифицированных в Великобритании, выделенные в стационарах некоторых стран Латинской Америки и на европейском континенте, в США и Японии, схожие изоляты MRSA, охарактеризованные американскими исследователями с использованием других молекулярных методов типирования, были названы эпидемическими клонами Было показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах, в значительной степени обусловлен распространением эпидемических штаммов или клонов MRSA (Ayliffe, G А , 1997, Oliveira D et al, 1998)

Достигнутый на рубеже веков существенный прогресс в изучении молекулярных механизмов резистентности S aureus к антимикробным препаратам, расшифровка полных нуклеотидных последовательностей геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S aureus выявили, что этот микроорганизм принадлежит к гетерогенным и полиморфным видам, у которого не только гены антибиотикорезистентности, но и многие гены патогенности присутствуют в хромосоме в составе геномных островов различных типов островов «патогенности», стафилококковых хромосомных кассет (SCC), профагов В разных штаммах эти генетические элементы существуют в виде аллельных форм и характеризуются различной степенью мобильности (KurodaM et al., 2001, BabaT et al, 2002) Генетическое разнообразие внутри вида является следствием горизонтального переноса генов, расположенных на мобильных генетических элементах (МГЭ) Стало очевидным, что многие из широко используемых методов молекулярно-генетического типирования не способны выявить наличие МГЭ в хромосоме MRSA, и лишь косвенно отражают различия в геноме тестируемых клинических изолятов

Несмотря на введение Международной классификации болезней 10-го пересмотра, в РФ до настоящего времени не осуществляется регистрация стафилококковых инфекций Данные официальной отчетности (ф №2) не отражают этиологическую роль в развитии ВБИ условно-патогенных микроорганизмов и не позволяют определить частоту инфекций, вызванных MRSA Вместе с тем с конца 90-х годов в РФ отмечался рост числа научных публикаций, посвященных выделению MRSA в стационарах. Известно, что нарастание доли MRSA среди клинических изолятов S aureus значительно ограничивает возможности эмпирической антимикробной терапии, сокращает арсенал используемых антибактериальных препаратов, существенно ухудшает качество медицинской помощи, оказываемой населению В этих условиях назрела неотложная необходимость совершенствования методов микробиологического мониторинга S aureus, проводимого в отечественных стационарах

Цель работы: исследование геномного полиморфизма как основы молекулярно-генетического мониторинга метициллинрезистентных Staphylococcus aureus в системе эпидемиологического надзора за возбудителями внутрибольничных инфекций

Задачи исследования:

1 Создание коллекции клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в многопрофильных и специализированных стационарах нескольких регионов Российской Федерации от пациентов и медицинского персонала, а также из объектов окружающей среды, для анализа частоты распространения и определения значения метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничных инфекций

2 Выявление детерминант антибиотикорезистентности и фагочувствительности и определение возможности их использования в качестве маркеров в эпидемиологических исследованиях для дифференциации MRSA

3. Изучение структурного полиморфизма генов хромосомного «ядра» и набора генов, входящих в состав мобильного генетического пула микробной клетки, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность. Определение критериев дифференциации эпидемически значимых штаммов MRSA

4 Разработка схемы молекулярно-генетического типирования, учитывающей особенности структурной организации генома метициллинрезистентных S aureus, и исследование генетических связей между клиническими изолятами MRSA, выделенными в разных стационарах Идентификация эпидемически значимых штаммов, выявление их клональности

5 Определение наличия (отсутствия) генетической общности между циркулирующими в стационарах России и эпидемическими метициллинрезистентными штаммами S aureus, циркулирующими в других странах мира. Выявление возможных механизмов появления и генетической изменчивости эпидемических штаммов MRSA

6 Определение возможности применения разработанной схемы молекулярно-генетического типирования MRSA при проведении локальных эпидемиологических расследований

Научная новизна. Разработана схема молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекционных заболеваний метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, основанная на изучении молекулярных маркеров двух типов генов, входящих в состав хромосомного « ядра», и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных классов, которая позволяет

• дифференцировать эпидемические штаммы;

• выявлять случаи заноса в стационары РФ эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в других странах мира;

• обнаруживать появление новых эпидемических штаммов и изучать механизмы их формирования,

• прослеживать генетические связи между штаммами

Впервые у метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах нескольких регионов Российской Федерации исследован полиморфизм генов, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность, входящих как в состав хромосомного «ядра», так и являющихся структурными компонентами мобильных генетических элементов (МГЭ), принадлежащих к различным классам

Впервые показано, что в стационарах России циркулируют эпидемически значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции, получены приоритетные данные о структурных особенностях их геномов

Выявлено генетическое родство идентифицированных эпидемических штаммов с международными эпидемическими штаммами и клонами MRSA, указывающее на то, что появление MRSA в России является результатом их заноса из европейских стран Получены приоритетные данные о распространении эпидемических штаммов MRSA в стационарах нескольких регионов РФ Расширены представления об эпидемическом распространении MRSA в Евразии

Установлено, что в процессе распространения эпидемических штаммов MRSA на отдельных территориях может происходить их дальнейшая дивергенция за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки, которая может приводить к формированию новых эпидемических штаммов

Идентифицированы новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC) Показано, что формирование новых кассет происходит в результате делеций и рекомбинаций, затрагивающих как отдельные фрагменты, так и целые генетические элементы SCC

Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, содержащий композитный генетический элемент SCCтес

Установлено наличие связи между определенным генетическим «бэкграундом» и присутствием в бактериальной клетке генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах

Практическая значимость и внедрение. Разработана молекулярно-генетическая основа для создания национальной базы данных эпидемических метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus - возбудителей ВБИ

Усовершенствована система эпидемиологического надзора (ЭН) за внутрибольничными инфекциями, вызванными множественно-устойчивыми к антибиотикам патогенами научно обоснованы схема и необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга MRSA в стационарах РФ Разработаны и внедрены в практику работы территориальных управлений Роспотребназора и региональных центров гигиены и эпидемиологии методические рекомендации «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций идентификация и генотипирование», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека JIП Гульченко 23 июля 2006 г

Предложена новая экономичная методика выделения ДНК из S aureus, с использованием в качестве лизирующего агента гуанидина тиоционата вместо лизостафина, которая гарантирует стабильность полученной ДНК в течение нескольких лет и расширяет возможности для проведения генетических исследований S aureus

Впервые создан музей и банк ДНК эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих на территории РФ, а также музей клинических изолятов метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S aureus, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Полученные в проведенном исследовании результаты могут быть использованы в работе клинических микробиологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений хирургического, акушерско-гинекологического, травматологического профиля, ожоговыми центрами, а также специалистами, осуществляющими эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями

Апробация диссертационной работы Материалы диссертационной работы доложены на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002 г), Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2002 г), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г), VII Международной конференции MAKMAX/ESMID (Москва,

2005 г), 16-Европейском конгрессе «Клиническая микробиология и инфекционные болезни» (Ницца, 2006 г), VIII Международном конгрессе MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2006 г ), VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии», (Москва,

2006 г), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела бактериальных инфекций совместно с отделами генетики и молекулярной биологии бактерий и эпидемиологии в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН 14 мая 2007 г

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 232 источника (57 отечественных и 175 зарубежных) Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 24 таблицы

Основные экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом Исследования по определению нуклеотидных последовательностей генов coa и spa выполнены в соавторстве с сотрудниками лаборатории «Группа анализа генома» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (рук к б н Шилов И А) Эксперименты по разработке методики выделения ДНК из золотистого стафилококка выполнены совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики плазмид ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (рук член-корр РАМН, д б н, профессор Смирнов Г Б )

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Клинической базой для проведения исследований явились многопрофильные стационары, имеющие в своей структуре отделения интенсивной терапии и реанимации, хирургические и травматологические, а также специализированные стационары, расположенные в крупных городах с численностью населения, превышающей 500 000 чел , в которых наблюдаются интенсивные миграционные потоки населения

Бактериальные штаммы В исследование были включены.

1395 клинических изолятов S aureus, выделенных в 1998-2002 г г в стационарах Центрального, Северо-Западного, Поволжского, Южного, Уральского и Восточно-Сибирского федеральных округов России, от пациентов, медицинского персонала, а также и из объектов окружающей среды;

184 клинических изолята S aureus, устойчивых к оксациллину, выделенных от пациентов в стационарах различных городов СССР в

1976-1990 г г (Москва, Минск, Омск, Вологда, Смоленск, Душанбе, Тбилиси);

12 международных штаммов S aureus, полученных из Референс-лаборатории стафилококковых инфекций Центра народного здравоохранения г Лондона (табл 1)

Согласно рекомендациям ВОЗ ВБИ - это любое клинически выраженное заболевание микробного происхождения, поражающего больного в результате госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществляемой им деятельности независимо от того, проявляются или не проявляются симптомы этого заболевания во время нахождения данных лиц в больнице В связи с этим появление клинических признаков инфекции после 48 час пребывания пациента в стационаре оценивалось как случай ВБИ Наличие золотистого стафилококка в диагностических титрах или высев микроорганизма из органов, тканей, жидкостей и полостей макроорганизма, которые в норме должны быть стерильными, рассматривалось как подтверждение этиологической роли данного микроорганизма в развитии заболевания От каждого пациента (за редким исключением) в исследование включали только один изолят 5 aureus

Определение принадлежности к виду S aureus проводили, используя стандартные методики, описанные в руководствах (Биргер М О , 1982)

Продукцию стафилококковых энтеротоксинов А и В определяли в реакции непрямой гемагглютинации с помощью стафилококковых энтеротоксических эритроцитарных иммуноглобулиновых диагностикумов, разработанных в ГУ НИИЭМ им. Н Ф Гамалеи РАМН, любезно предоставленных ст н сотр , к б н Флуером Ф С

Определение чувствительности к антибиотикам проводили методом серийных разведений в плотной питательной среде, используя соответствующие методические рекомендации (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам. Москва, 1976 Методические указания МУК 4 2 1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам Москва, 2004 ) В ряде случаев использовали диско-диффузионный метод

Фаготипирование осуществляли, используя фаги Международного набора (BIS), выпускаемого в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН, и фаги экспериментальной коллекции, разработанной при участии автора в Институте для типирования изолятов MRS А (Зуева ВС и др, 1994), и впоследствии значительно расширенной (Дмитренко OA и др , 2003)

Таблица 1

Международные штаммы Staphylococcus aureus

Штамм Чувствительность к оксациллину Фаготип Продукция токсинов

EMRSA-1* Oxar 85 энтеротоксин А

EMRSA-2 Oxar 85 энтеротоксин А

EMRSA-3 Oxar 75/83A —

EMRSA-12 Oxar 75/83A —

PS** 6, NCTC 8509 Oxas 6/47/53/54/75/83А —

PS 29, NCTC 8331 Oxas 29 энтеротоксин С, Т88Т-1

PS 52, NCTC 8503 Oxas 52 —

PS 53, NCTC 8511 Oxas 53/75/77/84/85 энтеротоксин В

PS 71, NCTC 9315 Oxas 3 С/5 5/71 ТБ5Т-1

PS 95, NCTC 10971 Oxas 95 энтеротоксин В

PS 96, NCTC 10972 Oxas 94/96 энтеротоксин В

ATCC 25923 Oxas н/д н/д

Условные обозначения: Охаг— оксациллинрезистентный,

Оха5 — оксациллинчувствительный, - продукция токсинов не описана, * - штаммы ЕМ118А-1,-2,-3,-12 - эпидемические штаммы МЛБА, выделенные в стационарах Великобритании, **- штаммы Р8 - метициллинчувствительные штаммы, используемые для размножения бактериофагов Международного набора, относящихся к различным фаговым группам.

Принципиально важной при проведении настоящей работы была необходимость разработать простую и достаточно дешевую методику выделения ДНК из стафилококка, которую в дальнейшем можно было бы предложить для практического использования В связи с этим разработали методику, в которой в качестве единственного лизирующего агента применяется 6М раствор гуанидина тиоционата вместо дорогостоящего лизостафина Очистка выделенной ДНК проводится раствором этанола, а не фенол-хлороформной смесью, что позволяет сократить число единиц используемого оборудования Выделенная таким способом ДНК, как показали проведенные исследования, может храниться в течение нескольких лет при -20°С, не теряя при этом своей активности

Для амплификации внутренних фрагментов исследуемых генетических структур использовались, как правило, праймеры, уже описанные в научных публикациях Такой методический прием позволял проводить сравнительный анализ клинических изолятов MRSA и международных штаммов, используя данные, представленные в литературных источниках, а, впоследствии, и компьютерные базы данных

Амплификацию гена тесА осуществляли с использованием праймеров, предложенных Mehrotra M , Wang G , and Johnson W M (2000)

Для амплификации фрагмента коагулазного гена (coa), содержащего вариабельные тандемные нуклеотидные повторы (VNTRs), использовали праймеры, разработанные Hookey J V , Richardson J F and Cookson В D (1998) Амплификацию геномной ДНК, электрофорез в агарозном геле, визуализацию продуктов амплификации, условия рестрикции гена, детерминирующего синтез коагулазы, проводили как изложено в работе Дмитренко О А и др (2005)

Рестрикцию амплифицированного фрагмента осуществляли эндонуклеазами Alul и Cfol Дальнейший анализ проводили на основании определения величины размеров образовавшихся ампликонов, а также числа и величины размеров фрагментов рестрикции (метод ПЦР-ПДРФ)

Амплификацию и последующее секвенирование фрагмента гена coa, расположенного между 979 и 1355 нуклеотидами, содержащего единичные нуклеотидные замены, проводили с использованием праймеров, разработанных с помощью программы «Ohgo-4» (Дмитренко OA и др , 2005)

Определение типа SCCmec осуществляли на основании результатов амплификации с использованием 7 разных пар праймеров, отобранных из 10, предложенных Okuma К. et al (2002), как описано в работе (Дмитренко О А , Шагинян И А , Гинцбург A JI, 2005)

Для определения наличия генов sea, seb, sec была разработана мультиплексная ПЦР с использованием наборов праймеров, предложенных Mehrotra M , Wang G, and Johnson W M (2000) Идентификацию гена ist проводили дополнительно.

Амплификацию вариабельного фрагмента гена spa проводили с использованием праймеров, предложенных Shopsm В et al (1999) и Koreen L et al (2004)

Выделение из геля и последующую очистку продуктов амплификации генов coa и spa проводили с использованием набора фирмы "Amersham Formacia Biotech" в соответствии с инструкцией производителя

Секвенирование выполнили на секвенаторе фирмы "Amersham Formacia Biotech" ALFexpress И®

Анализ нуклеотидного состава полученных последовательностей гена coa провели с использованием программы BLAST на сайте NCBI (http //www nih gov nebí) Результаты секвенирования гена spa обрабатывали, используя программу Win_DNAsis, сиквенс тип определяли, используя данные web-сайта http //www ridom de/spaserver/

Для амплификации 15 различных генетических локусов золотистого стафилококка были разработаны 2 основные программы и две дополнительные программы для амплификации генетических локусов, которые в дальнейшем подвергались секвенированию

В работе использовали описательно-оценочный методический подход эпидемиологического анализа. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы StatCals и таблиц биномиального распределения (Ю Тюрин, А Макаров, 2003)

Результаты исследований и их обсуждение

Значение MRSA как возбудителей внутрибольничных инфекций в стационарах РФ

Одной из первостепенных задач настоящего исследования являлось изучение распространенности метициллинрезистентных Staphylococcus aureus в стационарах различных регионов РФ и определение их этиологической значимости в развитии различных форм внутрибольничной инфекции

Устойчивые к оксациллину изоляты S aureus были идентифицированы в 15 из 23 стационаров (табл 2). Частота выделения MRSA колебалась от 0,06 % до 80 % Наибольшая частота выделения MRSA отмечалась в стационарах Москвы и Санкт-Петербурга Вместе с тем, в ряде стационаров, расположенных в крупных городах Южного, Сибирского и Приволжского регионов России MRSA выявлены не были Доля устойчивых к оксациллину среди всех изученных изолятов S aureus составила 27,68 % Она превысила частоту выделения MRSA в стационарах стран центральной Европы и, тем более, в лечебных учреждениях Скандинавских стран (При расчете исключили изоляты S aureus, выделенные в Дорожной больнице г Санкт-Петербурга, тк среди S aureus, выделенных в этом стационаре, MRSA обнаружили только у одного носителя из контингента медицинских работников)

Результаты статистической обработки результатов выявили наличие достоверных различий в частоте выделения MRSA в многопрофильных стационарах Москвы (Р=0,000349) Частота выделения MRS А в клиниках BMA военно-полевой терапии, лор- и глазной была достоверно ниже по сравнению с клиниками хирургического профиля (Р=0,0000000) Частота выделения MRSA в

многопрофильных стационарах г Москвы, а также в ряде хирургических клиник BMA (общая хирургия, абдоминальная хирургия), оказалась достоверно ниже, чем в ожоговом центре г Оренбурга (Р <0,05)

Таблица 2

Частота выделения метнцнллннрезистентных S.aureus в стационарах различных регионов РФ

Федеральный округ Город Число стационаров Число изолятов S aureus

изученных устойчивых к оксациллину (%) вариации числа (%) Охаг изолятов

Центральный Москва 6 420 127 30,2% (25,87*-34,87**) 6-40

Поволжский Саратов, Н Новгород 2 120 0 0

0 0

СевероЗападный Санкт-Петербург 11 575 198 41,86%*** (37,37-46,45) 0,06-80

Уральский Оренбург 1 50 70 70

Сибирский Иркутск 2 160 0 0

Южный Ростов-на -Дону 1 70 0 0

Всего: 7 23 1395 358 27,68% (19,68-35,66) 0,06-80

Примечание * - нижняя граница доверительного интервала к вероятности;

* * - верхняя граница доверительного интервала к вероятности, (доверительная вероятность 0,05)

Анализ источников выделения возбудителя показал, что, МКБА явились причиной нагноений хирургических и ожоговых ран в 37,7%, заболеваний дыхательных путей - 30,1%, включая пневмонию и трахеобронхит, бактериемий - в 19,6% случаев Другими источниками возбудителя (12,6%) в ряде случаев были ликвор и экссудат брюшной полости (см рис 1)

12,60% N = 293

30,10%

□ Гнойные осложнения хирургических и ожоговых ран

89 Заболевания дыхательных путей, включая пневмонию и трахеобронхкгг

□ Бактериемия

□ Другие

Рис. 1. Структура заболеваний, вызванных МИБА. Примечание: N — число источников возбудителя.

Летальность при заболеваниях, вызванных МКБА, составила в среднем 31,5%, при этом она была значительно выше в группе лиц старше 40 лет (табл.3). В случае присоединения грамотрицательной микрофлоры или патогенных грибов летальность возрастала до 53,3%.

Таблица 3

Исходы заболеваний, вызванных МЯ8А, у пациентов стационара травматологического профили

Состав микрофлоры Возраст Число пациентов Исходы заболеваний

выздоровление летальный исход

моноинфекция МЛБА 19—40 12 83% 17%

41-60 7 43% 57%

всего: 19 13 (68,4%) 6(31,5 %)

ассоциация МИБА с другими микроорганизмами 19-40 15 60% 40%

41-60 15 33% 66%

всего: 30 14(46,6%) 16 (53,3%)

итого: 49 27 (55,1%) 22 (44,8%)

Однако, несмотря на выраженность наблюдаемой тенденции из-за малой численности пациентов в сравниваемых группах выявить достоверных

различий нам не удалось Во всех случаях летальных исходов у пациентов диагностировали развитие сепсиса

Схожесть эпидемиологической социально-экологической системы, сложившейся в многопрофильных стационарах крупных индустриальных городов, во многом определяемой как демографическим сходством контингента госпитализируемых больных, так и характером и объемом оказываемой медицинской помощи, а также однотипностью используемых антимикробных препаратов, предполагала и однотипность изменений возбудителя в этих условиях Однако обнаруженные существенные различия в частоте выделения MRSA в таких стационарах, расположенных как в одном, так и в разных регионах РФ, свидетельствовали о необходимости более углубленного изучения гетерогенности популяции возбудителя как компонента паразитарной системы, являющейся биологической основой эпидемического процесса

Прежде всего, изучили антибиотико- и фагочувствительность как метициллинрезистентных (MRSA), так и метициллинчувствительных (MSSA) изолятов 5 aureus, т е определили те фенотипические характеристики патогена, которые могут использоваться как маркеры в эпидемиологических исследованиях Изучение профиля антибиотикорезистентности показало, что более 80% изолятов MRSA, выделенных в 1998-2002 г г, проявляли устойчивость к 5-8 классам антимикробных препаратов, сохраняя чувствительность только к ванкомицину и фузидину натрия (рис 2)

Сравнение антибиотикочувствительности изолятов, выделенных в 1998— 2000 г г, и выделенных в 2001-2002 гг, свидетельствовало о достаточно быстром нарастании числа изолятов, устойчивых к большинству известных антибиотиков, включая макролиды, фторхинолоны и рифампицин (рис 3) Не обнаружили изолятов, резистентных к ванкомицину и фузидину натрия

Подавляющее большинство оксациллинчувствительных изолятов S aureus сохранили чувствительность и к другим классам антимикробных препаратов

Чувствительность изолятов MRSA и MSSA к фагам Международного набора также была различной Подавляющее большинство изолятов MRSA были чувствительными к фагам III группы (72,8%) Доминировали изоляты фаготипов 85, 29/85, 77, 77/84/85, 77/83А/85. Среди изолятов, выделенных в 2001-2002 гг, появились чувствительные к фагам Ш группы в новых, необычных для MRSA сочетаниях 42Е/77, 29/42Е, 42Е/53/77 Спектр чувствительности изолятов MSSA к фагам был значительно шире Были обнаружены изоляты, чувствительные к фагам разных групп I, II, III, V и смешанной (рис 4)

Рис.2. Чувствительность к антибиотикам клинических изолятов MRSA, выделенных в 1998-2000 г.г. Условные обозначения: S - чувствительный; S± - умеренно-чувствительный;

R — устойчивый; MR - мультирезистентный; Cm - хлорамфеникол; Gn - гентамицин; Doc - доксициклин; Em - эритромицин; Ln — линкомицин; Cipr - ципрофлоксацин; Oil - офлоксацин; Rif- рифампицин.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

(N=123)

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Cm Gm Em Lm Doc Km Cipr

ER C3S± BS HM-R

Рис.3. Чувствительность к антибиотикам клинических изолятов MRSA, выделенных в 2001-2002 г.г.

Условные обозначения: те же, что и на рис.2.

в II

QUI

■ смешанных фаго групп

□ фагам вне группы

□ нечувств, к бактериофагам

Рис.4, Чувствительность изолятов S.aureus, выделенных в 1998-2002 г.г., к бактериофагам Международного набора (концентрация 100 TP).

Типирование с помощью экспериментальной коллекции бактериофагов, специально предназначенной для дифференциации штаммов MRSA, выявило существенные различия между метициллинрезистентными клиническими изолятами S.aureus, выделенными в московских стационарах в 1998 г., и изолятами, выделенными в 1976-1990 г.г.

Таким образом, проведение данного раздела работы позволило сделать целый ряд принципиально важных заключений и определить дальнейшее направление исследований. Прежде всего, были подтверждены некоторые общие закономерности, характеризующие MRSA в качестве возбудителей ВБИ: их способность вызывать различные, в том числе и тяжелые инвазивные формы внутрибольничной стафилококковой инфекции (сепсис, менингит, перитонит) у пациентов со сниженной иммунной реактивностью и/или целостностью кожных покровов, мягких тканей или внутренних органов, возникших как результат оперативного вмешательства, травмы или термического поражения.

Вместе с тем, обнаружили, что частота выделения MRSA в сходных по структуре многопрофильных стационарах, расположенных в крупных индустриальных и административных городах различных регионов страны, так и в одном регионе, значительно варьирует. В связи с этим дальнейшие исследования представлялось целесообразным направить, прежде всего, на изучение особенностей популяции возбудителя.

Анализ популяций MRSA и MSSA показал наличие существенных различий между ними как в отношении распространенности детерминант антибиотикорезистентности, так и фагочувствительности, и их гетерогенность, но не позволил определить число циркулирующих штаммов, механизмы, пути и факторы передачи возбудителя в стационарах. Выявленные различия в

III; 72.6%

нечувств, к фагам; 19,4%

смешан, фагогрупл; 5,9%

чувствительности MRSA, выделенных в 1998-2002 г г, и MRSA, выделенных в 1976-1990 гг, к бактериофагам экспериментальной коллекции позволили выдвинуть рабочую гипотезу о появлении новых эпидемических штаммов в стационарах страны

Геномный полиморфизм клинических изолятов MRSA

Анализ данных литературы свидетельствовал о том, что, несмотря на обилие разработанных молекулярно-генетических методов типирования, ни один из них не учитывает особенностей структурной организации генома MRSA наличие хромосомного «ядра» и мобильного генетического пула, представленного геномными островами различных классов, интегрированными плазмидами, транспозонами и IS элементами В этой связи представлялось целесообразным схему типирования MRSA построить таким образом, чтобы она включала как гены хромосомного «ядра», обладающие структурным полиморфизмом, так и гены, расположенные на мобильных генетических элементах (МГЭ), присутствие которых может варьировать от штамма к штамму

Для изучения геномного полиморфизма, которое и являлось центральной задачей настоящей работы, были отобраны 80 клинических изолятов MRSA, выделенных в 1998-2002 г г в разных стационарах при различных формах ВБИ, как нетипируемые, так и чувствительные к различным сочетаниям бактериофагов (одинаковым и разным), обладающие сходными и различными профилями антибиотикорезистентности

Группу сравнения составили 8 изолятов MRSA, выделенных в 1986-1990 г г в ожоговом центре г Минска от пациентов с ожогами различной степени тяжести, как чувствительные к фагу 85, так и нетипируемые бактериофагами BIS, которые обладали различными профилями антибиотикорезистентности Кроме того, в исследование были включены и 2 изолята MRSA, выделенные от новорожденных с клиническим диагнозом омфалит, чувствительные к фагокомплексу 77/85, которые были изолированы в январе и марте 1990 г в родильном доме г Омска во время вспышки стафилококковой инфекции, охватившей 11 новорожденных

Отобранные для молекулярно-генетических исследований изоляты MRSA были тестированы на наличие гена тесА, детерминирующего устойчивость к В-лактамам, с помощью ПЦР Все изоляты образовали продукт амплификации размером 163 н п., что свидетельствовало о наличии у них гена тесА

Структурный полиморфизм генов, входящих в состав хромосомного «ядра»

По результатам компьютерного анализа известных нуклеотидных последовательностей генов S aureus, представленных в геномном банке, а также данных литературы, были выбраны два гена, кодирующие синтез факторов

патогенности S.aureus, а именно: ген, кодирующий синтез коагулазы (coa), и ген, кодирующий синтез протеина A (spa), имеющие фрагменты, содержащие различное число тандемных повторов. Наличие различий в длине нуклеотидных повторов в составе названных генов предполагало возможность существования разницы в скорости их изменения и соответствующей дифференцирующей способности маркеров.

Структурный полиморфизм области гена coa, расположенной между 1513 и 2188 нуклеотидами, исследовали методом ПЦР-ПДРФ. Прежде всего, на группе штаммов S.aureus, включавшей как метициллинчувствительные PS штаммы, так эпидемические штаммы MRSA, выделенные в Великобритании, сравнили дифференцирующую способность двух эндонуклеаз: А1и\ и Cfo 1. Использование эндонуклеазы Cfo\, оказалось более эффективным, по сравнению с Alul, и позволило выявить 9 различных профилей рестрикции гена coa у тестируемых штаммов. Однако, подавляющее большинство клинических изолятов MRSA, выделенных в стационарах РФ, по типу рестрикции относились только к двум группам: 4-ой и 5-ой (рис.5).

Изоляты каждой труппы характеризовались одинаковыми размерами ампликона и специфическими сайтами рестрикции. Отсутствие различий в размерах ампликонов свидетельствовало об отсутствии различий в числе нуклеотидных повторов, а одинаковые сайты рестрикции указывали на j структурное сходство этих повторов.

Проведенный дополнительный компьютерный анализ гена соа клинических изолятов S.aureus, представленных в геномном банке, с использованием программы "VECTOR-NTI" выявил наличие в структуре этого

Рис. 5. Электрофореграмма образцов рестрикции коагулазного гена клинических изолятов МИ^А, выделенных в стационарах РФ в 1998-2002 г.г.

гена вариабельного фрагмента в районе между 900-ым и 1400-ым нуклеотидами, который содержал единичные нуклеотидные замены В связи с этим было принято решение об изучении данного фрагмента гена coa методом секвенирования

При сравнении полученных нами результатов секвенирования указанной области гена coa клинических изолятов MRS А, а также штаммов EMRSA-1,-2,-3,-12 с данными секвенирования этого гена у штамма NCTC 8325-4, имевшихся в геномном банке, установили следующее Во-первых, выбранная нами генетическая мишень является адекватной, поскольку позволяет дифференцировать эпидемические штаммы MRSA, выделенные в Великобритании и охарактеризованные с помощью различных методов; и, во-вторых, клинические изоляты MRSA, выделенные в стационарах РФ, по-видимому, не столь однородны внутри тех двух групп, которые мы выявили по результатам ПЦР-ПДРФ 3 '-области гена (см табл 4).

Таблица 4

Дифференцирующая способность двух различных локусов гена coa

Страна № эпид штамма MRSA Группа гена со а Гомология (%) со штаммом S.aureus 8325-4 Число изученных клинических изолятов

Велико- EMRSA-1 4 86 1

британия EMRSA-2 (8) 99 1

EMRSA-3 1 90 1

EMRSA-12 5 97 1

РФ н/д 4 87-88 7

н/д 4 83-86 2

н/д 5 98-99 5

н/д 5 100 6

СССР н/д 4 87 6

н/д 5 99 1

Среди изолятов 4-ой коагулазной группы было выявлено несколько вариантов Тождественные изоляты выявили в клиниках BMA, ожоговых центрах г г Оренбург и Минск Они оказались сходными со штаммом EMRSA-! Изоляты, выделенные в больнице им СП Боткина в г Москве, имели меньшую степень гомологии, которая составляла всего 83-86% Среди изолятов 5-ой коагулазной группы были изоляты, которые проявляли 98-99%

гомологии со штаммом NCTC 8325-4, так и изоляты степень гомологии которых составляла 100%

Следующим разделом работы было изучение вариабельности гена, кодирующего синтез протеина А После выравнивания результатов секвенирования с использованием программы WIN_DNAsis были идентифицированы изоляты, содержащие 4, 6. 7 и 10 24-членных нуклеотидных повторов Дальнейший анализ проводили, используя базу данных s/га-сервера, созданную в октябре 2005 г Согласно этой базе каждому известному типу повторов присвоен определенный номер (номенклатура Ridom) или буква (номенклатура Kreiswirth В) Сочетания повторов формируют spa профиль Идентифицированные профили зарегистрированы под определенным номерами, которым присвоено название spa типов

Было установчено, что все изученные изоляты согласно spa типу можно дифференцировать на два кластера Первый кластер составили изоляты, отнесенные к 4-ой группе, согласно типу гена соа Их дифференцировали на два субклона, относящиеся к spa типам t-037 и t-030, различия между которыми характеризовались делецией 6-го повтора и заменой одного нуклеотида в структуре 5-го повтора (табл 5) Данные секвенирования гена spa позволили нам подтвердить генетическое родство большинства клинических изолятов 4-ой коагулазной группы и штамма EMRSA-1

Таблица 5

Структурный полиморфизм гена spa тестированных клинических изолятов MRSA и некоторых штаммов EMRSA

Кластер Spa тип Spa профиль EMRSA выделены в Великобритании Клинические изоляты MRSA выделены в стационарах городов РФ

1 (coa группа 4) t-037 r15r12r16 r02r25r17r24 EMRSA-1 Санкт-Петербург, Оренбург, Минск

t-030 r15r12r16r02,,?4—r24 - Москва

2 (coa группа 5) t-008 r11 r19r12r21 rl 7г34г24г34г22г25 Санкт-Петербург, Москва, Оренбург

t-П r11r19r-----------------------r22r25 - Москва

t-622 r11r19r12r21r17r34r--------r22r25 - Омск

t-190 г11г-------------17г34г24г34г22г25 EMRSA-2,-12 -

Второй кластер составили изоляты, отнесенные к 5-ой коагулазной группе Их дифференцировали на 4 субклона, различия между которыми были обусловлены делециями разных нуклеотидных повторов (см табл 5). При этом клинические изоляты, выделенные в 1998-2002 гг. в разных стационарах, имели профиль нуклеотидных повторов сходный, но не идентичный, обнаруженным у штаммов EMRSA-2 и EMRSA-12 Он также отличался от профиля повторов spa гена клинических изолятов, выделенных в 1990 г в родильном доме г Омска

Было установлено, что MRSA первоначально дифференцированные согласно их coa типу, могли в дальнейшем отличаться структурой гена spa Вместе с тем, каждый spa тип, обнаруженный у исследуемых клинических изолятов MRSA, был ассоциирован только с единственным coa типом Выявленная корреляция полученных нами данных coa и spa типирования международных эпидемических штаммов MRSA с результатами их мультилокусного секвенирования, проведенного Enright М et al. (2002), при котором также исследовались гены хромосомного «ядра», позволила нам установить принадлежность исследуемых изолятов всего лишь к нескольким эпидемическим штаммам, входящим в группу клонального комплекса СС8

Проведенные эксперименты и последующее сопоставление полученных результатов с данными, представленными на web- сайтах, позволили заключить, что на основании изучения структурного полиморфизма генов coa и spa возможно выявление клонов S aureus, к которым принадлежат эпидемические штаммы

Идентификация генов и генных комплексов в составе мобильного генетического пула микробной клетки

Среди многочисленных МГЭ, обнаруженных в геноме S aureus, наибольший интерес, по нашему мнению, представляли стафилококковые хромосомные кассеты тес (SCCтес) - геномные острова, несущие ген тесА и отсутствующие у MSSA, впервые выявленные в результате полного секвенирования геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S aureus Уже во время выполнения настоящей работы японскими исследователями были определены полные нуклеотидные последовательности и частично охарактеризованы несколько аллотипов SCC тес (I, И, Ш, IV), различающихся, как размерами, так и набором генов, составляющих кассеты (Ito Т et al, 2001, Okuma К et al, 2002) Разделение на типы основано на различиях в генах, образующих комплекс тес, участвующий в выражении гена тесА, аллотипах генов, кодирующих комплекс рекомбиназ ссгА и ссгВ, обеспечивающих кассетам мобильность, а также генов, образующих структурные генетические области, обозначенные как J1, J2 и J3

В результате проведенных нами исследований впервые было обнаружено,

что

• выделенные в стационарах России клинические изоляты содержат разные типы SССтес,

• в одной микробной клетке могут присутствовать стафилококковые хромосомные кассеты различных аллотипов,

• существуют стафилококковые кассеты, несущие несколько генных комплексов, кодирующих синтез рекомбиназ различных типов,

• имеются стафилококковые кассеты, не несущие генов комплекса тес

Было установлено, что изоляты, характеризующиеся одинаковым структурным полиморфизмом коагулазного гена, выделенные в стационарах различных регионов страны, содержат один и тот же тип SCCтес, в то время как изоляты, разных коагулазных групп, содержат разные типы тес ДНК Клинические изоляты, отнесенные к 4-ой коагулазной группе, содержали SCСтес типа III, кроме того, у некоторых из них была идентифицирована не описанная ранее дефектная копия SCCтес типа IVb, не содержащая комплекса генов тес класса В, специфичных для данного типа кассет Дополнительной особенностью этой кассеты было наличие области Jib, структура которой отличалась от ранее охарактеризованной Okuma К et al (2002), т к амплификация со специфичными праймерами приводила к образованию ампликона, размер которого на 200 н п был больше ожидаемого

Изоляты, отнесенные к 5-ой коагулазной группе, выделенные в 1998— 2002 г г , несли молекулярные маркеры, характерные для кассет двух типов I и IVb Выделенная из этих изолятов ДНК амплифицировалась с праймерами, выявляющими комплекс тес типа В, два различных комплекса генов, кодирующих синтез рекомбиназ (типов 1 и 2), область Jib, сходную по структуре с обнаруженной в дефектном элементе SCC, идентифицированном в изолятах, отнесенных к ^-ей коагулазной группе Стабильная ассоциация молекулярных маркеров, присущих двум различным типам SССтес, во всех изученных изолятах, выделенных в разное время в стационарах, расположенных в различных регионах страны, позволила заключить, что они присутствуют в составе композитного генетического элемента Позднее композитные генетические элементы SCCтес были идентифицированы и другими исследователями (Chongtrakool Р et al., 2006)

Изоляты 5-ой коагулазной группы, выделенные в 1990 г в родильном доме г Омска, содержали SCC тес типа IVb

Выявленные различия в структуре тес ДНК у клинических изолятов MRSA показали возможность их дифференциации на основании определения типа SCCтес Вместе с тем, было установлено, что изоляты, имеющие различный, но близкий профиль повторов spa гена, содержали один и тот же тип SССтес Это не позволяло сделать однозначных выводов о тождестве или различиях циркулирующих штаммов и требовало проведения дополнительных исследований

Следующую группу молекулярных маркеров составили расположенные на МГЭ гены, детерминирующие синтез энтеротоксинов А, В, С и токсина синдрома токсического шока, т е те гены, продукты которых, обладают суперантигенной активностью (иначе называются пирогенные токсины суперантигены или PTSAgs), и могут оказать влияние на состояние иммунореактивности макроорганизма

Проведенные исследования выявили вариабельность в наборе генов, детерминирующих синтез этих токсинов, у клинических изолятов, различающихся по результатам coa и spa типирования Среди изолятов, выделенных в 1998-2002 г г и отнесенных к 4-ой коагулазной группе, только единичные несли ген sea Три из них принадлежали к spa типу t-ОЗО (табл 6)

Таблица 6

Результаты идентификации генов sea, seb, sec и tst в геноме клинических

изолятов MRSA

Дата выделения Число изученных клинических Группа коагулаз-ного гена Тип SCC тес Число изолятов, в геноме которых обнаружены гены

изолятов sea seb sec tst

1998-2002 29 4 Ш 5 - 1 -

51 5 SCC-CI 51 - 14 -

Всего 80 56 - 15 -

1986-1990 8 4 ш 2 - - -

2 5 IVb 2 2 - -

Всего 10 4 2 - -

Все изоляты коагулазной группы 5 несли ген sea Ген sec дополнительно несли изоляты spa типа t-008, тогда как ген seb - изоляты spa типа t-622, выделенные в 1990 г Ни у одного из исследованных изолятов не обнаружили ген tst

При анализе содержания генов PTSAgs в геноме клинических изолятов MRSA, выделенных при бактериемии, было установлено, что 88% изолятов содержат ген sea (табл 7J Кроме того, приблизительно треть изолятов дополнительно несли ген sec

Исследование геномного полиморфизма клинических изолятов MRSA выявило, что каждый из исследованных маркеров позволяет дифференцировать клинические изоляты на группы и поэтому может быть использован для их типирования Гены хромосомного «ядра» были выявлены у всех изолятов,

тогда как гены, расположенные на мобильных генетических элементах, присутствовали в геноме лишь у части изолятов Наблюдалась стойкая ассоциация молекулярных маркеров, расположенных на «добавочных» элементах, с определенным генетическим «бэкграундом».

Таблица 7

Результаты идентификации генов sea, seb, sec и tst в геноме клинических изолятов MRSA, выделенных при бактериемии

Число изученных клинических изолятов Группа коагулаз-ного гена Тип SCC тес Число изолятов, в геноме которых обнаружены гены

sea seb sec tst

7 IV III (IVbd) 3 - - -

24 V SCC- CI (I+IVbd) 24 - 8 -

Всего 31 27 - - -

Поскольку изоляты MRSA, значительно отличающиеся по фенотипическим свойствам, выделенные в различных стационарах, распотоженных в нескольких регионах страны, удавалось дифференцировать лишь на ограниченное число групп, это, с одной стороны, могло свидетельствовать о том, что выбранные нами молекулярные маркеры обладают низкой дифференцирующей способностью, с другой - косвенно указывало на клональность исследуемых изолятов

В связи с этим мы попытались рассчитать теоретически возможное количество произвольных комбинаций исследованных маркеров, при этом исключив из первичного анализа ген spa, вариабельность которого исследовали по результатам секвенирования С учетом ряда ограничений количество возможных комбинаций маркеров составило

210*10*2= 20480,

где 210-возможное число произвольных сочетаний 10 молекулярных маркеров,

10 - число вариантов гена coa, выявленных по результатам рестрикции с использованием Cfol,

2 - число идентифицируемых комплексов тес

Включение в схему типирования секвенирования гена spa повышает это количество вариантов многократно, т к количество вариантов повторов гена spa теоретически может превышать 3 триллиона (или 3x1012)

Следовательно, количество случайных комбинаций использованных нами молекулярных маркеров практически бесконечно велико, и разработанная схема мультилокусного анализа генома обладает очень высокой дифференцирующей способностью

Клональность клинических изолятов MRSA. выявленная методами молекулярной генетики

Разработанная схема молекулярно-генетического типирования позволила идентифицировать среди клинических изолятов, выделенных в 1998-2002 г г, четыре эпидемических штамма, различающихся несколькими молекулярными маркерами, входящими как в состав хромосомного «ядра», так и мобильного генетического пула микробной клетки Два из них, REMRSA-1 и REMRSA-2, являлись доминирующими и были выявлены в нескольких стационарах, расположенных в различных географических регионах страны Было установлено, что REMRSA-1 циркулирует в стационарах, расположенных на территории нашей страны, в течение почти 20 лет, поскольку именно этот эпидемический штамм был идентифицирован среди изолятов, выделенных в конце 80-х годов в ожоговом центре г Минска Близкородственный ему штамм REMRSA-3 (spa t-030) впервые был идентифицирован среди изолятов MRS А, выделенных в 2001 г, и его распространение ограничивалось только одним из московских стационаров

Таблица 8

Молекуляро-генетическне характеристики идентифицированных эпидемических штаммов MRSA

Название штамма Тип гена coa Тип гена spa Тип SCCmec Набор генов PTSAgs*

REMRSA-1 4 t-037 III (IVbd) -

REMRSA-2 5 t-008 CI (I+IVbd ) sea (sea, sec)

REMRSA-3 4 t-030 III sea

REMRSA-4 5 t-n CI(I+IVbd) sea, sec

REMRSA-5** 5 t-622 IVb sea, seb

Примечание набор тестируемых включал гены sea, seb, sec, tst.

Эпидемический штамм REMRSA-2 (spa t-008) доминировал в стационарах Москвы, а также был идентифицирован среди изолятов MRSA, выделенных в стационарах Санкт-Петербурга и Оренбурга Первые изоляты, с генетическими характеристиками, характерными для этого штамма, представленными в таблице 8, выявили среди изолятов MRSA, выделенных в нескольких московских стационарах в 1998 г Это свидетельствовало об эпидемическом распространении REMRSA-2 к этому времени на региональном уровне Мы идентифицировали два варианта этого штамма, различавшихся содержанием генов энтеротоксинов Штамм REMRSA-4, идентифицированный среди изолятов MRSA, выделенных от пациентов (материалом для исследования служили экссудат брюшной полости и мокрота), персонала (со слизистой передних отделов носа) и из воздуха палаты отделения реанимации одной из московских больниц, по-видимому, сформировался в этом стационаре. Выявленная в структуре гена spa обширная делецич нескольких нуклеотидных повторов позволяет допустить, что предшественником этого штамма был циркулирующий в этом же стационаре штамм REMRSA-2 Штамм REMRSA-4, так же как и REMRSA-2, содержит композитный элемент SCCmec и несет ген sea Дополнительным доказательством появления REMRSA-4 в этом стационаре служит отсутствие в базе данных spa сервера данных об изолятах с таким же профилем spa повторов

Выделенные в родильном доме г Омска изоляты принадлежали к эпидемическому штамму, обозначенному нами как REMRSA-5 Молекулярно-генетические особенности строения вариабельной области гена spa, наличие кассеты тес аллотипа IVb и гена seb, помимо sea, дали основание заключить, что этот штамм не является предшественником штаммов REMRSA-2 и REMRSA-4

Использование мультилокусного анализа генома MRSA в системе эпидемиологического надзора

Эпидемический процесс стафилококковой инфекции проявляется в виде спорадической и вспышечной заболеваемости Основным резервуаром и источником инфекции в госпитальной среде являются как инфицированные, так и колонизованные пациенты Эпидемический очаг включает не только пациентов с манифестными формами инфекции, но и носителей, в том числе медицинских работников Показано, что колонизация пациента MRSA в 3060% случаев приводит к развитию инфекции (Kluytmans J, van Belcum A, Verbruch H, 1997) В этих условиях вполне оправданными являются рекомендации считать вспышкой возникновение двух и более эпидемически связанных случаев заболеваний, вызванных MRSA (Kerr S, Kerr G E., Makintosh С A, and Marples RR , 1990, O'Neil GL et al, 2001)

Система управления эпидемическим процессом инфекционной или паразитарной болезни включает две организационные подсистемы эпидемиологический надзор и эпидемиологический контроль В отличие от

эпидемиологического контроля, который представляет систему профилактических и противоэпидемических мероприятий,

эпидемиологический надзор (ЭН) является сугубо информационной системой, целью которой является получение объективной эпидемиологической информации для обеспечения рационального планирования, осуществления и корректировки мероприятий по профилактике и борьбе с инфекционными болезнями В настоящее время предложены несколько структурных моделей эпиднадзора за ВБИ (Методические указания по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями, 1987, Черкасский Б Л, 1988; 2001, Акимкин В Г, 2003), каждая из которых, как необходимое звено, предусматривает получение информации, характеризующей возбудитель ВБИ, и, прежде всего, данные об его лекарственной чувствительности Вместе с тем, только одна из предложенных концепций ЭН (Черкасский Б Л, 1988) предполагает проведение молекулярно-генетического мониторинга для оценки возможной внутривидовой гетерогенности популяции госпитальных микроорганизмов Однако ни одна из существующих моделей эпиднадзора не предусматривает молекулярно-генетический мониторинг MRSA, целью которого является выявление эпидемических штаммов патогена, обладающего множественной лекарственной устойчивостью, путей и механизмов их распространения в стационаре

Использование разработанного мультилокусного анализа генома MRSA позволило решить ряд задач, как теоретического характера (идентифицировать эпидемические штаммы MRSA и выявить их возможные механизмы появления в стационарах РФ), так имеющих практическую значимость (провести ретроспективный эпидемиологический анализ случаев заболеваний, вызванных MRSA, в стационарах различного профиля)

Филогенетические связи идентифицированных в РФ и эпидемических штаммов MRSA, выделенных в других ст ранах мира

Одной из основных задач настоящего исследования являлось определение возможных генетических связей идентифицированных эпидемических штаммов с международными штаммами и клонами и определение их места в процессе глобального распространения MRSA С этой целью полученные результаты молекулярно-генетического типирования эпидемических штаммов EMRSА-1,-2,-3,-12 и клинических изолятов MRSA, выделенных в стационарах РФ, сопоставили с данными, представленными на web-сайтах, и с опубликованными результатами исследования эпидемических штаммов MRSA, выделенных в стационарах как европейских, так и некоторых других стран мира

Согласно данным spa сервера, база данных которого к настоящему времени содержит около 2500 типов гена spa, доля изолятов MRSA, несущих ген spa типа t-008, составляет более 5%, и они занимают третье место по

частоте распространения в стационарах европейских стран Несколько меньше частота выделения изолятов со spa типом t-037. Она чуть превышает 2% Еще реже обнаруживаются изоляты, характеризующиеся spa типами t-ОЗО и t-622, те как и в РФ, циркуляция этих штаммов MRSA ограничивается только отдельными стационарами (рис.6)

■ Spa тип t-003 - 14,946

■ Spa тип t-032 - 10,2%

■ Spa тип t-008 - 5,6%

■ Spa тип t-044 - 5,3%

• Spa тип t-001 - 5,00%

Spa тип t-002 - 4,50%

■ Spa тип t-004 - 3, 30%

я Spa тип t-024 - 2,20%

■ ■ Spa > тип t-037 - 2,10%

■ Spa тип t 030 - 0,8%

■ Spa тип t-190 - 0,09%

■ Spa тип t-622 - 0, 00%

Источник http //www ridom /spaserver/nomenclature/shtml

Рис 6 Наиболее часто выявляемые типы гена spa у клинических изолятов

MRSA

Сопоставление результатов изучения структурного полиморфизма двух генов хромосомного «ядра», детерминирующих факторы патогенности, позволило нам выявить генетическое родство российских штаммов MRSA с международными эпидемическими штаммами и клонами, входящими в группу клонального комплекса СС8, сформированную согласно результатам секвенирования 7-ми генов домашнего хозяйства у тестируемых штаммов, и построить молекулярно-генетическую модель происхождения REMRSA-1,-2,-3,-4,-5, представленную на рис 7

Согласно предложенной модели идентифицированные эпидемические штаммы можно разделить на две группы Первую группу составили штаммы REMRSA-1 и REMRSA-3 Эпидемический штамм REMRSA-i (spa тип t-037), как показали проведенные исследования, имеет генетическое родство с эпидемическими штаммами EMRSA-1,-4,-7,-9,-11 (Enright М С et al, 2002), впервые идентифицированными английскими исследователями, а также с Бразильским и Венгерским эпидемическими клонами, охарактеризованными группой американских исследователей (Oliveira D et al, 1998) Эти штаммы и клоны представляют самостоятельную генетическую линию внутри СС8 Так

же, как и названные международные эпидемические штаммы и клоны, REMRSA-1 содержит SССтес аллотипа Ш, но отличается от эпидемических штаммов, выделенных в Великобритании, отсутствием гена sea Как эпидемическая, эта генетическая линия, включающая многочисленные эпидемические штаммы и клоны MRSA, впервые появилась в Австралии в конце 70-х годов, а затем распространилась в Великобританию, где и получила название EMRSA-1 (Coombs GW et al, 2004) В настоящее время эта генетическая линия MRSA доминирует в стационарах стран Юго-Восточной Азии и Саудовской Аравии, присутствует в стационарах Южной Америки (Ohveira D С, Tomasz A, and de Lencastre Н, 2002, Alakere G et al, 2005, Deurenberg R H, 2005, Ко К S et al, 2005, Hsu Li-Y et al, 2005) Вследствие широкого распространения ее считают пандемической (Chongtrakool Р et al., 2006) Штамм spa типа t-030 является ее потомком, т к содержит кассету SCСтес типа III и ген sea Для идентификации этой группы эпидемических штаммов весьма ценным оказалось сочетание coa и spa типирования, которое позволило выявить их отличие от штаммов группы ССЗО

Другую группу составили штаммы REMRSA-2,-4,-5 (см рис 7) Штамм REMRSA-2, в отличие от международных эпидемических штаммов, характеризующихся таким же типом гена spa, содержащих SCCmec либо аллотипа I, либо аллотипа IV, несет новый композитный элемент SCCтес и, по-видимому, сформировался именно в одном из стационаров России в середине 90-х годов Безусловно, сходный в большинстве стран мира социально-экологический характер условий, создаваемых в лечебно-профилактических учреждениях, и, прежде всего, широкое повсеместное использование ß-лактамных антибиотиков, определяют и общность механизмов воздействия на возбудитель и однотипность направленности их изменения Тем не менее, ряд выявленных нами молекулярно-биологических характеристик этого штамма и, в частности, особенности строения элемента SCC-CI служат в качестве доказательств его появления именно в стационарах РФ Этот элемент несет молекулярные маркеры, характерные для кассет двух типов I и IVb Генетическая область Jib композитного элемента, так же как и данная область у дефектного элемента IVb, не несущего генов комплекса тес и обнаруженного нами у некоторых изолятов spa t-037, по своим размерам превышает таковую в охарактеризованном ранее генетическом элементе SCCтес IVb на 200 н п Эта область является своеобразным маркером данного генетического элемента, который не описан другими исследователями Поскольку гены рекомбиназ у кассеты SCC типа I функционально мало активны (Ito Т et al, 2001),, то можно предположить, что в штамм, содержащий кассету типа I, дополнительно интегрировала кассета IVbd, что и привело к образованию нового генетического элемента, который стабильно наследуется микробными клетками Штамм REMRSA-4 является прямым потомком этого штамма, т.к несет тот же самый композитный генетический элемент SCCmec-Cl, ген sea и дополнительно ген sec

Полученные данные позволили сформулировать гипотезу, согласно которой основным механизмом появления эпидемических штаммов MRSA в стационарах России явился их занос из стационаров европейских стран Вероятно имелось несколько эпизодов таких заносов, приведших к появлению эпидемических штаммов spa типов t-037, t-030 и t-008 Занос двух последних штаммов, по-видимому, произошел после 90-го года, когда существенно увеличились миграционные потоки и расширились возможности для деловых и туристических поездок в Западную Европу

Дальнейшая микроэволюция эпидемических штаммов оказалась различной. Эпидемический штамм spa типа t-037 утратил находящийся в геноме профага ген sea, тогда как штамм t-008 приобрел дополнительную кассету тес, а некоторые его изоляты и ген sec Формирование штамма, содержащего композитную форму SCCmeqn его дальнейшее распространение в стационарах различных регионов РФ, свидетельствует о появлении нового эпидемического штамма в широко диверсифицированном семействе эпидемических штаммов, принадлежащих к СС8 Штамм REMRSA-2 претерпевает быстрые генетические изменения, и его микроэволюция направлена как на приобретение генов антибиотикорезистентности, так и генов патогенности

Молекулярно-генетическнй мониторинг MRSA в стационарах

В данном разделе работы продемонстрированы возможности мультилокусного анализа для расследования вспышек ВБИ, вызванных MRSA, в стационарах различных типов

За период наблюдения, равный одному году, в отделении реанимации детской больницы, рассчитанном на 20 коек, произошли две вспышки заболеваний, одна из которых имела место в мае - июне, а другая - в сентябре -октябре Динамика вспышек представлена на рис 8 Интервалы между заболеваниями колебались от 1 до 17 дней Всего заболели 18 новорожденных в возрасте от 3 до 20 дней Среди клинических форм заболеваний преобладали инфекции дыхательных путей бронхиолит и пневмония Кроме того, были зарегистрированы менингит и несколько случаев пиодермии. Выделенные изоляты MRSA были чувствительными к макролидам, линкомицину, офлохсацину, рифампицину, фузидину, ванкомицину Некоторые изоляты несли детерминанты устойчивости к хлорамфениколу, гентамицину, доксициклину Небольшая часть изолятов оказалась резистентной к ципрофлоксацину Все изоляты типировались фагом 77 Международного набора Отсутствие корреляции чувствительности к антибиотикам и бактериофагам не позволяло сделать однозначных выводов о числе циркулирующих штаммов, источников возбудителя и определить причину эпидемической ситуации, возникшей в отделении

+SCCmecI

Arhaic done MRSA + SCC IVbd REMRSA-2 REMRSA-4

coa 5 coa 5 coa 5

spa: YHGFBQMBLO spa: YHGFBQMBLO spa. YHLO

SCC тес I SCCmec~CI(I+IVbd) SCCmec-CI(I+IVbd)

sea (sec) sea, sec

MSSA (NCTC8325)

coa: 5 spa. YHGFMBQBLO CC8

+SCCmecXU*

f SCC/лес IV i

+5CCmec IV

EMRSA - 1, 11 coa 4 spa: WGKAOMQ SCC/necIII sea

REMRSA-X

OPa4 WGKAOMQ SCCmecIII -sea

REMRSA-3 coa A spa: WGKAQQ SCCmecIII sea

REMRSA-5 EMRSA-2

coa 5 coa 5

spa-. YHGFMBLO spa: YMBQBLO

ss^ seb sea

* полагают, что EMRSA-1 возник в результате рекомбинации между СС8 и ССЗО (WGKAKAOMQ), включающий фрагмент около 200 т.п.н. (D.Ashley and M.C.Enright 2003 ).

Рис.7. Предполагаемая молекулярно-генетическая модель происхождения REMRSA-l,-2,-3,-4,-5 (схема) Примечание тип гена spa представлен согласно номенклатуре В Kreiswirth

Проведенное молекулярно-генетическое типирование показало, что все изоляты характеризуются идентичным типом гена coa, выявленным по результатам ПЦР-ПДРФ, имеют одинаковое число нуклеотидных повторов в структуре гена spa (тип t-008), содержат композитный элемент SССтес и несут ген sea. Это позволило заключить, что обе вспышки были вызваны одним эпидемическим штаммом. Преобладание в структуре заболеваний инфекций дыхательных путей свидетельствовало о том, что аспирационный механизм передачи возбудителя являлся ведущим.

Примечание: по оси ординат отмечено число заболевших детей.

Рис. 8. Динамика вспышек внутрибольничной инфекции, вызванной МКБА, в отделении реанимации детской больницы.

Вероятно, источником инфекции оказался работник отделения -носитель МЯБА, поскольку 2-ая вспышка возникла после того, как все новорожденные, инфицированные во время первой вспышки, были

выписаны из стационара Появление изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину, который не используется в педиатрической практике, свидетельствует о попытке санации данного носителя с использованием указанного препарата

В крупном многопрофильном стационаре за период наблюдения (1 год) вспышки заболеваний, вызванных MRSA, наблюдали в отделениях реанимации, хирургии и травматологии,

В хирургическом отделении выявлены две вспышки инфекций, вызванных MRSA Первая из них имела место в августе - сентябре, когда в течение 20 дней произошли нагноения хирургических ран у 4 пациентов Вторая вспышка произошла январе - марте следующего года В течение 40 дней после оперативных вмешательств у одного из пациентов произошло нагноение операционной раны, у трех пациентов развилась бактериемия и у двух - пневмония Случаи заболеваний имели место в июле (бактериемия) и апреле (нагноение хирургической раны) Общее число инфицированных пациентов составило 12 человек (возраст пациентов колебался от 23 до 65 лет) Возбудитель был выделен из отделяемого хирургических ран, крови и дыхательных путей

За этот период времени в отделении травматологии также произошли вспышки заболеваний, вызванных MRSA Всего заболели 14 пациентов (средний возраст составил 43,5 года) Первая вспышка наблюдалась в июне -июле, когда в результате оперативного вмешательства в связи с перенесенной травмой у двух пациентов появились нагноения операционных ран, и у трех пациентов развился синдром системной воспалительной реакции В конце января у двух пациентов возникла пневмония, вызванная MRSA, а у одного пациента на рентгенограмме были выявлены признаки остеомиелита Изоляты MRSA были выделены из крови и дыхательных путей пациентов Единичные случаи бактериемии, вызванной MRSA, имели место в феврале и марте В первой половине апреля месяца заболевания, вызванные MRSA, возникли у 5 пациентов Признаки системной воспалительной реакции отмечались у двух пациентов Остеомиелит был диагностирован у одного пациента Еще у двух пациентов имели место пневмония и нагноение пролежня соответственно

В отделении реанимации в ноябре - декабре произошла вспышка, охватившая 5 пациентов После перенесенного оперативного вмешательства у одного пациента развилась пневмония, у двух пациентов перитонит, и у двух пациентов отмечались признаки системной воспалительной реакции Возраст пациентов колебался от 37 до 49 лет Изоляты MRSA были выделены из мокроты, крови и сальниковой сумки пациентов В течение последующих нескольких месяцев в этом отделении отмечались единичные случаи инфицирования MRSA

Выделенные изоляты MRSA, помимо (3-лактамов, обладали устойчивостью к аминогликозидам, макролидам, линкомицину, хлорамфениколу и были избирательно чувствительными к фторхинолонам,

доксициклину и рифампицину. Были идентифицированы как нечувствительные, так и чувствительные к бактериофагам Ш группы изоляты Все типируемые бактериофагами изоляты проявляли чувствительность к фагу 77, многие из них дополнительно были чувствительными к фагам 75, 84 и 85 в различных сочетаниях

Молекулярно-генетическое типирование выявило циркуляцию в стационаре только двух эпидемических штаммов spa типа t-008 и spa типа t-п Было установлено, что вспышка, возникшая в августе - сентябре в хирургическом отделении была вызвана штаммом spa типа t-008, содержащим композитный элемент S ССтес и ген sea Вспышке предшествовало выделение этого же штамма MRSA со слизистой передних отделов носа двух медицинских работников, обследованных в июне в плановом порядке Санация медицинских работников не проводилась

Возникшая в ноябре вспышка в отделении реанимации была вызвана штаммом spa типа t-008 и t-n, содержащим композитный элемент SCCmec, гены sea и sec Этот же штамм был выделен из воздуха палаты отделения и от носителя из числа медицинских работников

Во время вспышек заболеваний, вызванных MRSA, имевших место в следующем году, как в отделении хирургии, так и в отделении травматологии, выделялись оба штамма Выделенные из дыхательных путей пациентов изоляты MRSA принадлежали к spa типу t-n, выделенные из крови и ран изоляты принадлежали к spa типу t-008 Это свидетельствовало о существовании различных источников инфицирования и механизмов передачи возбудителя в стационаре Учитывая, что изоляты MRSA были выделены из раневого отделяемого и крови пациентов, можно предположить, что артифициальный механизм передачи инфекции являлся основным, и заражение происходило при обработке хирургических ран или непосредственно во время оперативного вмешательства Аспирационный механизм передачи также имел место, т к в течении вспышек MRSA выделялись либо из воздуха, либо из дыхательных путей пациентов и медицинских работников

Проведенные исследования показали отсутствие сезонности в возникновении вспышек ВБИ, вызванных MRSA, и выявили клональность возбудителя

Новой тревожной тенденцией, наблюдаемой в последние годы, является появление заболеваний, вызванных MRSA, среди пациентов и во внебольничной среде Показано, что такие внебольничные или «популяционные» MRSA генетически неоднородны Представлялось важным провести молекулярно-генетическое типирование изолятов MRSA, выделенных от пациентов в течение первых 48 часов пребывания в стационаре Обследовали 30 пациентов, поступивших в один из московских стационаров с инфекциями кожи и мягких тканей MRSA были выделены из биоптата гнойных ран у 12 пациентов Все выделенные изоляты являлись мультирезистентными, обладали устойчивостью к 5-6 классам

антимикробных препаратов, помимо оксациллина Молекулярно-генетическое типирование выявило, что они имеют следующие характеристики, ген coa - тип 5, ген spa -тип t-008, содержат композитный элемент SCCтес и ген sea Анализ сопроводительных документов показал, что большинство пациентов страдали хроническими трофическими язвами Очевидно, выявленный контингент пациентов может являться источником распространения эпидемического штамма, как в стационаре, так и во внебольничной обстановке в семье, в рабочем коллективе и т п Возможность внутрисемейной передачи золотистого стафилококка, в том числе и MRSA, описана в ряде зарубежных исследований

Разработанный мультилокусный анализ генома MRSA позволил проследить генетические связи идентифицированных в стационарах России эпидемических штаммов MRSA с международными эпидемическими штаммами и клонами, расшифровать механизмы их появления в стационарах РФ, эпидемического распространения и дальнейшей микроэволюции Он также явился эффективным инструментом для анализа вспышек внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, в стационарах различного профиля и позволил сформулировать основные положения ЭН за ВБИ, вызванными MRSA Как составная часть эпидемиологического надзора за ВБИ эпидемиологический надзор за заболеваниями, вызванными MRSA в стационаре, должен включать следующие составные элементы

• выявление, учет и регистрацию всех случаев ВБИ, вызванных MRSA, подтвержденных результатами микробиологических исследований,

• эпидемиологический анализ заболеваемости и смертности от ВБИ, вызванных MRSA,

• контроль состояния здоровья медицинского персонала (носительство эпидемически значимых штаммов, заболеваемость),

• выявление пациентов, колонизованных MRSA (по эпидемическим показаниям),

• определение спектра устойчивости изолятов MRSA к антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и чувствительности к бактериофагам,

• санитарно-бактериологические исследования объектов окружающей среды на наличие MRSA,

• проведение молекулярно-генетического мониторинга, целью которого является получение данных о структуре госпитальных изолятов, выявление среди них эпидемически значимых, а также расшифровка механизмов их циркуляции и распространения в стационаре. Молекулярно-генетический мониторинг свойств возбудителя должен

стать центральным звеном эпидемиологического надзора Полученные на его основе данные позволяют сделать научно-обоснованное заключение об источниках, путях и факторах передачи возбудителя, условиях способствующих инфицированию MRSA, правильно оценить и спрогнозировать эпидемические ситуации, посредством заблаговременных

противоэпидемических мероприятий предотвращать вспышки ВБИ, вызванные эпидемическими штаммами MRSA

Таким образом, полученные результаты показали, что в стационарах России циркулируют эпидемически значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции

Основной теоретический вывод, который можно сделать на основании представленных в работе данных, это доказательство того, что появление таких штаммов в стационарах РФ является частью глобального распространения MRSA Выявленные молекулярно-генетические особенности идентифицированных эпидемических штаммов свидетельствуют о дальнейшей дивергенции эпидемических штаммов, циркулирующих на отдельных территориях Появление среди госпитальных эпидемического штамма, несущего вариант кассеты SCCтес типа IV, способной подвергаться многочисленным генетическим перестройкам и распространяться между штаммами, принадлежащими различным генетическим «бэкграундам», позволяет предположить, что в дальнейшем может происходить формирование новых эпидемических штаммов MRSA в стационарах России Достаточно высокая частота выделения MRSA в лечебно-профилактических учреждениях РФ, которая в ряде стационаров достигла 70% и более, очевидно, будет способствовать «выносу» госпитальных штаммов в популяцию Сходство некоторых молекулярно-генетических характеристик REMRSA-1 и REMRSA-2 с таковыми у Aus-2(3) и USA300 - эпидемическими штаммам MRSA, вызывающими заболевания у пациентов вне стационаров в других странах мира, свидетельствует о потенциальной способности выявленных в стационарах РФ эпидемических штаммов MRSA циркулировать и во внебольничной среде

Включение в мультилокусный анализ секвенирования гена spa, выполнение которого доступно научно-исследовательским центрам нашей страны, позволяет проследить филогенетические связи идентифицированных эпидемических штаммов MRSA и формировать национальную базу таких штаммов Создание такой базы данных предоставит новые возможности для обмена информацией о циркулирующих эпидемических штаммах с использованием Интернет технологий, позволит фиксировать появление новых эпидемических штаммов и предупреждать их распространение Оптимизация эпидемиологического надзора за ВБИ на основе компьютерной техники становится в настоящее время важнейшим научно-организационным принципом, обеспечивающим принятие оперативных организационных решений с учетом сложившейся эпидемиологической обстановки

Исследование структурного полиморфизма гена coa методом ПЦР-ПДРФ в сочетании с SCCтес типированием и изучением профиля генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах, позволяет использовать мультилокусный анализ в клинических лабораториях и осуществлять молекулярно-генетический мониторинг в стационаре

ВЫВОДЫ

1 Эпидемический процесс стафилококковой инфекции в стационарах обусловлен фенотипически и генотипически гетерогенной популяцией возбудителя Выявлены достоверные различия в частоте встречаемости детерминант антибиотикоустойчивости и фагочувствительности у метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S aureus, которые указывают на существование различий в темпах и/или механизмах их генетической изменчивости в организме больных в условиях стационара Установлено, что только некоторые генотипические варианты возбудителя способны формировать множественную резистентность к антибиотикам

2 Разработан мультилокусный анализ генома метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA), включающий изучение молекулярных маркеров двух типов генов, в составе хромосомного «ядра», имеющих в своей структуре вариабельные нуклеотидные последовательности, и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных типов тес кассет, «островов патогенности» и профагов

3 С использованием мультилокусного анализа выявлена клональность госпитальных изолятов MRSA, идентифицированы эпидемически значимые штаммы, циркулирующие как в стационарах нескольких регионов страны, так и в отдельных стационарах

4 Установлено, что геномы эпидемических штаммов MRSA различаются, специфичностью нуклеотидных последовательностей генов хромосомного «ядра», детерминирующих синтез факторов патогенности (коагулазу и/или протеин А), содержат разные аллотипы стафилококковых хромосомных кассет (SCC) и различный набор генов, кодирующих энтеротоксины А, В и С, продукты которых обладают суперантигенной активностью

5 Доказана генетическая общность идентифицированных эпидемических штаммов с эпидемическими штаммами MRSA, один из которых циркулирует в стационарах европейских стран (coa тип IV, spa тип t-030, SCCmec тип Ш), а другой имеет межконтинентальное распространение (coa тип IV, spa тип t-037, SCC тес тип Ш)

6 Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, характеризующийся полиморфизмом структуры гена spa t-008, который, в отличие от других эпидемических штаммов этой группы, циркулирующих в стационарах Европы и США, содержит композитный генетический элемент SCCmec

7 Сформулирована гипотеза, согласно которой основным механизмом появления эпидемических штаммов MRSA в стационарах РФ является занос из европейских стран Установлено, что в процессе распространения метициллинрезистентных штаммов на отдельных территориях происходит дальнейшая дивергенция эпидемических штаммов за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки

8 Обнаружены новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC)

Выявлено одновременное присутствие в геноме MRSA генетических элементов SCC различных аллотипов

9. Доказано распространение эпидемических метициллинрезистентных/ оксациллинрезистентных штаммов S aureus в крупных многопрофильных и специализированных стационарах Центрального, Северо-Западного и Уральского регионов РФ В структуре заболеваний, вызванных MRSA, нагноения хирургических и ожоговых ран составили 37,7%, инфекции дыхательных путей, включая пневмонию и трахеобронхит -30,1%, бактериемии -19,6%, другие нозологические формы - 12,6% Случаи внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, не выявлены в отдельных многопрофильных стационарах Южного, Приволжского и Сибирского регионов РФ согласно результатам скринингового исследования

10 Установлено, что увеличение частоты выделения антибиотико-резистентных изолятов S aureus в стационарах, является следствием распространения эпидемических штаммов MRSA Частота устойчивых к оксациллину изолятов 5 aureus в стационарах составила в среднем 27,68% (0,06%-80%), мультирезистентными среди них являлись 80%-100% изолятов Среди метициллинчувствительных изолятов S aureus мультирезистентных выявлено не было

11 Выявлен контингент больных, страдающих трофическими язвами, которые могут являться резервуаром и источником госпитальных эпидемических штаммов MRSA как в условиях стационара, так и за его пределами,т е в популяции

12 Создан музей клинических изолятов MRSA, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, который может служить основой для проведения дальнейших генетических исследований S aureus Сформирован банк ДНК эпидемических штаммов MRSA.

13 Основные элементы мультилокусного анализа рекомендованы для включения в блок микробиологического мониторинга MRSA в системе эпиднадзора за внутрибольничными инфекциями и создания национальной базы данных эпидемических штаммов MRSA

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Зуева В С , Дмитренко О А, Нестеренко JIН, Беликов Н Г, Witte W., Акатов А К Метициллинорезистентные стафилококки//ЖМЭИ - 1988 -№4 — С.100 —108

2 Зуева В С , Дмитренко О А , Акатов А К Экспериментальные фаги для дифференцирования нетипируемых метициллинрезистентных Staphylococcus aureus 11 ЖМЭИ - 1988 - № 9 - С 19-24

3 Зуева В С , Дмитренко О А , Крупина Е А , Беликов Н Г, Нестеренко JI П К механизму устойчивости метициллинрезистентных Staphylococcus aureus к фагам Международного набора // ЖМЭИ - 1990 - № 10 — С IIIS

4 Зуева В С , Дмитренко О А, Зуева Е А Дифференциация

метициллинрезистентных Staphylococcus aureus по специфичности профагов//Антибиотики и химиотерапия - 1991 -№ 10.-С. 11-15

5. Akatov А К, Zueva V S , Dmitrenko О A A new Approach to Establishing the Set of Phages for Typing Methicillin-resistant Staphylococcus aureus // J Chemother -1991 -V3 -№5 -P 275-278

6 Зуева В С , Дмитренко О А , Зуева Е А , Акатов А К Новый принцип коллекции фагов для дифференцирования метициллин-резистентных Staphylococcus aureus» // Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии современное состояние, перспективы, М - 1992 -С 135-147

7 Зуева В С, Дмитренко О А, Акатов А.К, Крупина Е С Метициллинрезистентные стафилококки - возбудители внутрибольничной инфекции // Госпитальные инфекции и лекарственная устойчивость микроорганизмов Сб научн трудов Москва, 1992 - С 6163

8 Зуева В С , Дмитренко О А , Гладкова К К , Зуева Е А Новая коллекция фагов для типирования метициллин-резистентных Staphylococcus aureus // ЖМЭИ - 1994 -№ 2 -С 20-23

9 Дмитренко О А,Зуева В С Новая схема дифференцирования метициллинрезистентных золотистых стафилококков // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов-Москва, 1997 -Т2 - С 341-342

10 Зуева ВС., Дмитренко О. А., Шагинян ИА, Акатов А К Система поэтапного дифференцирования метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus II Антибиот химиотер - 1997 - Т 42 - № 9 -С 20-26

11 Dmitrenko О А, Zueva V S , Shaginyan IA New phage collection for differentiation methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains // Abst Book 9lh Intern Symposium on Staphylococci and staphylococcal Infections -Kolding, Denmark, 2000 - P 101

12 Дмитренко OA, Сидоренко CB, Терехова PB, Жуховицкий ВТ, Тарасевич H М Расширенная коллекция фагов для типирования метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка // Клинич. лаборат диагн -2001 -№11 -С 34-35

13 Дмитренко OA, Прохоров ВЯ, Шагинян И А, Сидоренко СВ, Жуховицкий В Г, Карабак В И, Терехова Р В, Васильева Е И Особенности современных метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничных инфекций Идентификация эпидемических клонов, выделенных в стационарах города Москвы // Сб Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва, 2002 — Т 4 - С 83.

14 Дмитренко О А Шагинян И А, Прохоров В Я , Волков И И, Дерябин Д Г Значение фенотипических и генотипических методов типирования в

системе эпидемиологического мониторинга метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus // Генодиагностика инфекционных заболеваний сб материалов IV Всероссийской научно-практической конференции / Под ред Покровского В И - Москва, 2002 — С. 208-210

15Дмитренко OA., Флуер ФС, Шагинян И А, Прохоров В Я Характеристика эпидемических штаммов MRSA, выделенных в стационарах г Москвы // Клин микробиол. антимикроб химиотер -2002.-т 4 — прилож 1 -С 18

16 Дмитренко О А, Сидоренко С В , Жуховицкий В Г .Терехова Р В , Карабах В И, Н Н Тарасевич, Васильева Е И, Прохоров В Я Сравнительная эффективность типирования тремя коллекциями бактериофагов штаммов метициллинрезистетных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах г Москвы //ЖМЭИ -2003.-№1 -С 3-9

17 Шагинян И А, Дмитренко О А Молекулярная эпидемиология инфекций, вызываемых метициллинустойчивыми стафилококками // ЖМЭИ - 2003 -№3 -С 99-109

18 Дмитренко О А , Прохоров В Я , Шагинян И А , Волков И И , Суборова Т Н, Карабак В И, Жуховицкий В Г, Гинцбург A Л Фенотипические и генотипические свойства метициллинрезистетных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах в 1998—2001 г г // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы Сб Материалы международного конгресса / Россия, Санкт-Петрбург, 2003 г - С 160

19 Дмитренко О А , Флуер Ф С , Прохоров В Я , Шагинян И А ,Волков И И , Суборова ТН, Дерябин ДГ, Клименко ЕВ, Стрижак ВВ., Коломиец В В , Карабак В И, Щугорова Н Г, Гинцбург A JI Особенности эпидемического распространения метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus в стационарах различных регионов Российской Федерации (результаты мультицентрового исследования) // Сб Материалы VI Российского съезда врачей - инфекционистов Санкт-Петербург, 2003 -С 110

20 Флуер Ф С , Дмитренко О А , Прохоров В Я , Вертиев Ю В , Охлопкова К А Энтеротоксигенность штаммов стафилококков, выделенных от больных сепсисом, пневмонией и ожоговой болезнью // - Там же - С 408

21 Дмитренко О А , Шагинян И А., Ванюшева О В , Шилов И А , Прохоров В Я, Лунин В Г, Гинцбург А Л Генотипирование метициллинрезистетных штаммов Staphylococcus aureus методами исследования полиморфизма коагулазного гена и типа тес ДНК // Генодиагностика инфекционных болезней сб науч тр 5-ой Всероссийской научно-практической конференции - Москва, 2004 - Т 2 -С 20-23

22 Дмитренко О А , Прохоров В Я, Железнова Н И , Гинцбург А Л Мониторинг антибиотикорезистентности метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах России в 1998-2002гг // Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных

инфекций сб. докладов Российской научно-практической конференции с международным участием - Москва, 2004 - С 40-41

23 Дмитренко О А , Шагинян И А , Ванюшева О В , Шилов И А , Прохоров В Я, Лунин В Г, Гинцбург А Л Молекулярно-генетический мониторинг метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах России и Беларуси в 1986-2002г г // Там же - С 42^43.

24 Дмитренко О А, Прохоров В Я , Шагинян И А , Волков И И , Суворова Т Н, Гинцбург А Л Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus -возбудители внутрибольничных инфекций в стационарах России Роль факторов патогенности // Узловые вопросы борьбы с инфекцией сб материалов Российской научно-практической конференции - Санкт-Петербург, 2004 - С 76-77

25.Дмитренко О А , Шагинян И А , Прохоров В Я, Гинцбург А Л Геномный полиморфизм метициллинрезистентных Staphylococcus aureus -возбудителей внутрибольничных инфекций в стационарах России // Клин микробиол антимикроб химиотерап — 2005 - Т 7 - №2 — Прил 1 -С 22

26 Дмитренко О А , Шагинян И А , Прохоров В Я , Гинцбург А Л Эпидемиология нозокомиальных инфекций, вызванных метициллинрезистетными Staphylococcus aureus, в стационарах России // Там же - С 23

27 Дмитренко О А, Шагинян И А, Гинцбург А Л Исследование полиморфизма тесЩШ. у метициллинрезистетных штаммов золотистого стафилококка, выделенных в стационарах разных регионов России // Мол генетика, микробиол и вирусол —2005 -№3 -С 11-17

28 Дмитренко О А , Шагинян И А , Прохоров В Я,Матвеев С М , Аляпкина Ю , Ванюшева О В , Гинцбург А Л , Шилов И А , Лунин в В Г Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси // ЖМЭИ - 2005 -№3 -С 27-33

29 Дмитренко О А, Шагинян И А , Прохоров В.Я , Матвеев С М , Гинцбург А Л Молекулярно-генетическое типирование метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в разных регионах Российской Федерации, на основании изучения размеров продукта амплификации и последующего рестрикционного анализа коагулазного гена ЖМЭИ - 2005 - № 4 - С 46-52

30 Флуер Ф С , В Я Прохоров, В М Бондаренко, Дмитренко О ,А , Лашенкова Н Н , Меньшикова Е Д, Вертиев Ю В Частота выделения энтеротоксигенных стафилококков среди больных сепсисом, пневмонией и ожогам // ЖМЭИ - 2005 - № 5 - С 3-6

31 Dmitrenko О А , Prohorov V Ya , Shilov IA , Lavrova N V , Ginzburg A L Identification epidemic methicillin-resistant S aureus in Russian hospitals multicentre study 1998 - 2002. Clinical Microbiol Infect - 2006. - № 12 -Suppl 4 - P 468 [Электронный ресурс]

32 Дмитренко О А, Белокрысенко С С , Лаврова Н В , Прохоров В.Я, Гинцбург A JI Идентификация госпитального эпидемического метициллинрезистентного штамма Staphylococcus aureus, у амбулаторных пациентов при поступлении в стационар // Клин микробиол антимикроб химиотер -2006 - Т8 -№2 -Прилож 1 -С 15

33 Белокрысенко С, С , Дмитренко О А, Шилов И А , Прохоров В Я , Гинцбург A JI Характеристика метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных от здоровых новорожденных в акушерском стационаре // Там же - С 11

34 Дмитренко О А, Прохоров В Я, Шагинян И А., Флуер Ф С , Суборова Т Н., Волков И И , Карабак В И, Гинцбург A JI Определение генов пирогенных токсинов суперантигенов у клинических изолятов метициллинрезистентных Staphylococcus aureus IIЖМЭИ - 2006 - № 2 -С -36-42

35 Лазикова ГФ, Мельникова А А, Фролова НВ, Дмитренко OA, Прохоров В Я , Гинцбург А Л Метициллинрезистентные стафилококки -возбудители внутрибольничных инфекций идентификация и генотипирование Методические рекомендации - М Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006 -43с

36 Дмитренко О А, Прохоров В Я, Шилов И А, Лаврова Н В , Гинцбург А.Л Современные особенности эпидемиологии стафилококковых инфекций В сб Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов М -2007 -Т 1 -С 143

37 Дмитренко О А , Прохоров В Я, Шилов И А., Лаврова Н В Гинцбург А Л Изучение распространенности и свойств метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в стационарах различных регионов Российской Федерации // Там же - Т 2 - С 28

38 Флуер ФС, Меньшиков Д.Д, Прохоров ВЯ, Бондаренко ВМ, Дмитренко О А, Н Н Лашенкова, Ю В Вертиев Индикация штаммов стафилококков, продуцирующих энтеротоксины типов А и В, выделенных от больных в стационарах разного профиля // Внутрибольничные инфекции в стационарах различного профиля, профилактика, лечение осложнений Сб Материалы пятой научно-практической конференции -Москва, 2007 - С 53- 54

Выражаю глубокую благодарность за постоянные ценные консультации и содействие при проведении исследований Академику РАМН, доктору биологических наук, профессору Александру Леонидовичу Гинцбургу

Искренне признательна всем работникам лечебно-профилактических учреждений, предоставившим клинические изоляты S aureus для проведения настоящего исследования

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 11 12 07 Тираж 100 экз Уел пл 2,53 Печать авторефератов (495) 730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Дмитриенко, Ольга Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Роль метициллинрезистентных/ оксациллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в инфекционной патологии человека.

Глава 1. Микробиологическая характеристика.

1.1. Таксономическое положение и биологические особенности.

1.2. Факторы патогенности.

1.3. Структурная организация генома.

1.3.1. Хромосомное « ядро» и мобильный генетический пул микробной клетки.

1.3.2. Феномен «гетерорезистентности» стафилококковой популяции по устойчивости к метициллину и его генетический контроль.

1.4. Лабораторные методы идентификации и типирования.

1.4.1. Детекция MRSA.

1.4.2. Внутривидовая дифференциация S. aureus.

Глава 2. Классификация и номенклатура стафилококковых заболеваний человека.

Глава 3. Особенности эпидемиологии заболеваний, вызванных

MRSA.

3.1. Общая характеристика эпидемического процесса стафилококковой инфекции.

3.2. Распространенность и клинико-эпидемиологические особенности госпитальных инфекций, вызванных MRSA.

3.3. Клональность госпитальных MRSA.

3.4. Внегоспитальная заболеваемость, вызванная MRSA.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Бактериальные штаммы.

4.2. Среды, антибиотики, реактивы.

4.3. Методы изучения фенотипических свойств клинических изолятов MRSA.

4.3.1. Анализ экспрессии белков.

4.3.2. Определение чувствительности к антибиотикам.

4.3.3. Определение чувствительности к бактериофагам.

4.4. Разработка методологии анализа генома MRSA и выбор молекулярных маркеров.

4.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами.

4.5.1. Разработка методики выделения ДНК из стафилококка, предназначенной для постановки ПЦР.

4.5.2. Амплификация геномной ДНК.

4.5.3. Электрофорез и визуализация продуктов амплификации и рестрикции.

4.6. Оптимизация условий и программ ПЦР для исследования генов и генных комплексов S.aureus.

4.6.1. Амплификация гена, кодирующего синтез коагулазы.

4.6.2. Амплификация генов и генных комплексов, входящих в состав стафилококковых хромосомных кассет тес.

4.6.3. Разработка мультиплексной ПЦР для детекции генов, детерминирующих синтез энтеротоксинов А, В и С, и детекция гена, детерминирующего синтез токсина синдрома токсического шока.

4.7. Разработка условий рестрикции гена, детерминирующего синтез коагулазы.

4.8. Определение нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав хромосомного «ядра».

4.9. Эпидемиологический метод.

4.10. Статистические методы.

Глава 5. ЗНАЧЕНИЕ MRSA КАК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В СТАЦИОНАРАХ РФ.

5.1. Идентификация изолятов S. aureus, устойчивых к оксациллину.

5.2. Фенотипические свойства клинических изолятов MRSA.

5.3. Роль MRSA в возникновении различных форм внутрибольничной инфекции.

Глава 6. ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КЛИНИЧЕСКИХ

ИЗОЛЯТОВ MRSA.

6.1. Детекция гена тесА.

6.2. Структурный полиморфизм генов, входящих в состав хромосомного «ядра».

6.2.1. Вариабельность гена, кодирующего синтез коагулазы.

6.2.2. Вариабельность гена, кодирующего синтез протеина А.

6.3 Идентификация генов и генных комплексов в составе мобильного генетического пула микробной клетки.

6.3.1. Структурный полиморфизм тес ДНК - генетической области, детерминирующей устойчивость к оксациллину.

6.3.2. Детекция генов, кодирующих синтез пирогенных токсинов суперантигенов.

Глава 7. КЛОНАЛЬНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ MRSA, ВЫЯВЛЕННАЯ МЕТОДАМИ

МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ.

7.1. Идентификация и характеристика эпидемических штаммов, выявленных среди клинических изолятов, выделенных в 1998-2002 г. г.

7.2. Анализ клинических изолятов, выделенных в

1986-1990 г. г.

ГЛАВА 8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННОГО

МУЛЬТИЛОКУСНОГО АНАЛИЗА ГЕНОМА MRSA

В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО

НАДЗОРА.

8.1. Молекулярно-генетическая модель формирования идентифицированных эпидемических штаммов MRSA и гипотеза их появления в стационарах РФ.

8.2. Молекулярно-генетический мониторинг MRSA.

8.2.1. Ретроспективный анализ вспышек внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, в стационарах различного профиля.

8.2.2. Идентификация госпитального эпидемического штамма

MRSA у больных при поступлении в стационар.

ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину"

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в конце 20-го века в борьбе с инфекционными заболеваниями человека, внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из острейших проблем современной медицины, которая приобретает все большую экономическую и социальную значимость. Рост заболеваемости ВБИ связан со значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов, увеличением частоты инвазивных лечебных процедур и методов диагностики, качественными изменениями структуры популяции пациентов. В развитых странах ВБИ развиваются у 5-10% пациентов, находящихся в стационаре. В Российской Федерации регистрируется около 30.000 тыс. случаев внутрибольничной инфекции, при этом минимальный экономический ущерб составляет более 5 млрд рублей ежегодно в ценах 1998 г., однако по расчетным данным эти цифры во много раз выше [Венцел B.JL, 1990; Прозоровский С.В., Генчиков JI.A., 1994; Покровский В.И. и др. 2000; Козлов Р.С. 2000; Онищенко Г.Г., 2004]. Согласно результатам выборочных исследований ВБИ переносят 10-15% новорожденных, 16% (5%-27,8%>) оперированных пациентов [Прозоровский С.В., Генчиков JI.A., 1994; М.Г. Аверьянов, В.Т. Соколовский, 1999; Е.В. Борисова и др., 1999; Семина Н.А., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г., Сидоренко С.В., 2006].

Среди возбудителей ВБИ инфекций одно из ведущих мест во многих странах мира принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является S. aureus. Эпидемиологическая обстановка осложняется в связи с широким распространением в стационарах, а также появлением и во внебольничной среде, клинических изолятов S.aureus, устойчивых к оксациллину (ORSA или MRSA), обладающих наряду с устойчивостью ко всем (3-лактамным антибиотикам резистентностью ко многим другим классам антимикробных препаратов [Ayliffe G.A. 1997; Воусе J.M.,1997; Lowy F.D., 2003]. По данным зарубежных исследований MRSA вызывают разнообразные формы внутрнбольничной инфекции, включая, наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром токсического шока, септический артрит, остеомиелит, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения [Edmond М.В. et al., 1999; Dinges М.М., Orwin P.M. and Schlievert P.M., 2000; Engelmann J J. et al., 2003].

В результате изучения фенотипических свойств клинических изолятов MRSA, выделенных в разных стационарах в 80-х годах прошлого века, сформировалось представление о способности некоторых госпитальных штаммов MRSA к эпидемическому распространению [Marples R.R., and Е.М. Cooke, 1985; Kerr S., Kerr G.E., Makintosh C.A, and Marples R.R., 1990]. Внедрение на рубеже веков молекулярных методов типирования в эпидемиологические исследования явилось мощным инструментом идентификации, изучения механизмов формирования и эволюции эпидемически значимых штаммов микроорганизмов. На стыке микробиологии, молекулярной биологии и эпидемиологии возникло новое направление исследований - молекулярная эпидемиология инфекционных заболеваний, основными задачами которого являются изучение географического распространения различных генотипов патогенных микроорганизмов, их роли в формировании особенностей клинических форм заболеваний, т.е. углубленного изучения закономерностей возникновения, развития и угасания эпидемического процесса инфекционных болезней [Черкасский Б.Л., 2001].

Использование молекулярных методов типирования позволило нескольким группам зарубежных исследователей выявить циркуляцию MRSA, сходных по ряду молекулярно-генетических характеристик, не только в стационарах различных городов, но даже стран, расположенных на разных континентах. Такие MRSA в работах английских исследователей получили название эпидемических штаммов [Hookey J.V., Richardson J. F. and Cookson B. D., 1998]. В отличие от идентифицированных в Великобритании, схожие изоляты MRSA, выделенные в стационарах некоторых стран Латинской

Америки и на европейском континенте, в США и Японии, охарактеризованные американскими исследователями с использованием других молекулярных методов типирования, были названы эпидемическими клонами. Было показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах, в значительной степени обусловлен распространением эпидемических штаммов или клонов MRSA [Ayliffe, G.A., 1997; OliveiraD. et. al., 1998].

В последние два десятилетия достигнут существенный прогресс в изучении молекулярных механизмов резистентности S. aureus к антимикробным препаратам и структурной организации его генома. Проведенные исследования позволили выявить у MRSA наличие дополнительного белка (РВР-2'), относящегося к группе транспептидаз и участвующего в формировании клеточной стенки. В отличие от других подобных белков, обнаруженных у метициллинчувствительных штаммов S.aureus (MSSA), РВР-2' продолжает функционировать в присутствии бета-лактамных антибиотиков и сохраняет микробной клетке жизнеспособность [Hartman B.I., Tomasz А. 1984; BeckW.D., Berger-Bachi В. and KayserF.H., 1986]. Синтез этого белка кодируется геном тесА, расположенном на мигрирующем генетическом элементе, получившем название стафилококковая хромосомная кассета (SCCтес), который отсутствует у чувствительных микроорганизмов [Berger-Bachi В., Strassle A., Gustsfson J.E. and Kayser F.H., 1992; Katayama Y., Ito Т., and Hiramatsu K., 2000].

Расшифровка полных нуклеотидных последовательностей геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S. aureus выявила, что этот микроорганизм принадлежит к гетерогенным и полиморфным видам, у которого не только гены антибиотикорезистентности, но и многие гены патогенности присутствуют в хромосоме в составе геномных островов различных типов: островов «патогенности», стафилококковых хромосомных кассет (SCC), профагов. Было обнаружено, что в разных штаммах эти генетические элементы существуют в виде аллельных форм и и характеризуются различной степенью мобильности. Генетическое разнообразие внутри вида является следствием горизонтального переноса генов, расположенных на мобильных генетических элементах (МГЭ) [KurodaM. et al., 2001; BabaT. et al., 2002]. Стало очевидным, что многие из широко используемых методов молекулярно-генетического типирования не способны выявить наличие МГЭ в хромосоме MRSA, и лишь косвенно отражают различия в геноме тестируемых клинических изолятов.

С конца 90-х годов в Российской Федерации отмечался рост числа публикаций, посвященных выделению MRSA в стационарах. В представленных сообщениях информация ограничивалась только частотой выделения, и отсутствовали какие-либо данные о свойствах идентифицированных как MRSA клинических изолятов [Габбасова JI.A., Бурмистрова A.JL,

Шафикова Н.Э., 2002; ДехничА.В. и др., 2002; Евстропов А.Д. и др., 2002]. Известно, что высокая частота MRSA среди клинических изолятов S. aureus делает неэффективным использование многих антимикробных препаратов и существенно ухудшает качество медицинской помощи, оказываемой населению. В этих условиях назрела неотложная необходимость совершенствования методов микробиологического мониторинга S. aureus, проводимого в отечественных стационарах.

Однако на момент начала нашей работы не существовало общепризнанных методов и схем молекулярно-генетического типирования MRSA, были не известны какие-либо генетические характеристики штаммов S.aureus, циркулирующих в стационарах РФ, отсутствовали представления о наличии возможных генетических связей между эпидемическими штаммами и клонами MRSA, выделенными в стационарах других стран мира и охарактеризованными с помощью разных молекулярных методов. Все это и определило направление исследований, представленных в данной работе, посвященной значимости проблемы метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) для отечественного здравоохранения, исследованию геномного полиморфизма клинических изолятов MRSA, идентификации и расшифровке механизмов появления в стационарах эпидемических штаммов. Основой для проведения этого исследования явилась схема молекулярно-генетического типирования MRSA, разработанная с учетом новых представлений о структурной организации генома золотистого стафилококка.

Цель и задачи исследования Целью работы являлось исследование геномного полиморфизма как основы молекулярно-генетического мониторинга метициллинрезистентных Staphylococcus aureus в системе эпидемиологического надзора за возбудителями внутрибольничных инфекций.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создание коллекции клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в многопрофильных и специализированных стационарах нескольких регионов Российской Федерации от пациентов и медицинского персонала, а также из объектов окружающей среды, для анализа частоты распространения и определения значения метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничной инфекции.

2. Выявление детерминант антибиотикорезистентности и фагочувствительности и определение возможности их использования в качестве маркеров в эпидемиологических исследованиях для дифференциации MRSA.

4. Разработка схемы молекулярно-генетического типирования, учитывающей особенности структурной организации генома метициллинрезистентных

S.aureus, и исследование генетических связей между клиническими изолятами MRSA, выделенными в разных стационарах. Идентификация эпидемически значимых штаммов, выявление их клональности.

5. Определение наличия (отсутствия) генетической общности между циркулирующими в стационарах России и эпидемическими метициллинрезистентными штаммами S. aureus, циркулирующими в других странах мира. Выявление возможных механизмов появления и генетической изменчивости эпидемических штаммов MRSA.

6. Определение возможности применения разработанной схемы молекулярно-генетического типирования MRSA при проведении локальных эпидемиологических расследований.

Научная новизна

Разработана схема молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекционных заболеваний - метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, основанная на изучение молекулярных маркеров двух типов: генов, входящих в состав хромосомного «ядра», и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных типов. Разработанная схема позволяет:

• дифференцировать эпидемические штаммы;

• выявлять случаи заноса в стационары РФ эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в других странах мира;

• обнаруживать появление новых эпидемических штаммов, изучать механизмы их формирования;

• прослеживать генетические связи между штаммами.

Впервые исследован полиморфизм генов, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность, входящих как в состав хромосомного «ядра», так и являющихся структурными компонентами мигрирующих генетических элементов нескольких классов, у метициллинрезистентных изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах нескольких регионов Российской Федерации.

Впервые показано, что в стационарах РФ циркулируют эпидемические значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрнбольничной гнойно-септической инфекции; получены приоритетные данные о структурных особенностях их геномов.

Выявлено генетическое родство идентифицированных эпидемических штаммов с международными эпидемическими штаммами и клонами MRSA, указывающее на то, что появление MRSA в России является результатом заноса из европейских стран. Получены приоритетные данные о распространении эпидемических штаммов MRSA в стационарах нескольких регионов РФ. Расширены представления об эпидемическом распространении MRSA на Евразийском континенте.

Установлено, что в процессе распространения международных эпидемических штаммов MRSA на отдельных территориях может происходить дальнейшая дивергенция эпидемических штаммов за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки.

Идентифицированы новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC). Показано, что формирование новых кассет происходит в результате делеций и рекомбинаций, затрагивающих как отдельные фрагменты, так и целые генетические элементы SCC.

Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, содержащий композитный генетический элемент SCCтес.

Практическая значимость и внедрение

Разработана молекулярно-генетическая основа для создания национальной базы данных эпидемических метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus — возбудителей ВБИ.

Усовершенствована система эпидемиологического надзора (ЭН) за внутрибольничной инфекцией, вызванной множественно-устойчивыми к антибиотикам патогенами: научно обоснованы схема и необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга MRSA в стационарах РФ. Разработаны и внедрены в практику работы территориальных управлений Роспотребназора и региональных центров гигиены и эпидемиологии методические рекомендации «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Л.П. Гульченко 23 июля 2006 г.

Предложена новая экономичная методика выделения ДНК из S. aureus, с использованием в качестве лизирующего агента гуанидина тиоционата вместо лизостафина, которая гарантирует стабильность полученной ДНК в течение нескольких лет и расширяет возможности для проведения генетических исследований S. aureus.

Создан музей клинических метициллинрезистентных и метициллинчувствительных изолятов S. aureus, выделенных при различных формах ВБИ, а также банк ДНК эпидемических штаммов MRSA в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на: VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002 г.); V Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2002 г.); 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г.); VII Международной конференции MAKMAX/ESMID (Москва, 2005 г.); 16-Европейском конгрессе «Клиническая микробиология и инфекционные болезни» (Ницца, 2006 г.); VIII Международном конгрессе MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2006 г.); VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии» (Москва, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).

Апробация диссертации состоялась на конференции отдела бактериальных инфекций совместно с отделами генетики и молекулярной биологии бактерий и эпидемиологии в ГУ НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН 14 мая 2007 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 232 источника (57 отечественных и 175 зарубежных). Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 24 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дмитриенко, Ольга Александровна

выводы

1. Эпидемический процесс стафилококковой инфекции в стационарах обусловлен фенотипически и генотипически гетерогенной популяцией возбудителя. Выявлены достоверные различия в частоте встречаемости детерминант антибиотикоустойчивости и фагочувствительности у метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S. aureus, которые указывают на существование различий в темпах и/или механизмах их генетической изменчивости в организме больных в условиях стационара. Установлено, что только некоторые генотипические варианты возбудителя формируют множественную резистентность к антибиотикам.

2. Разработан мультилокусный анализ генома метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA), включающий изучение молекулярных маркеров двух типов: генов, в составе хромосомного «ядра», имеющих в своей структуре вариабельные нуклеотидные последовательности, и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных типов: тес кассет, «островов патогенности» и профагов.

3. С использованием мультилокусного анализа выявлена клональность госпитальных изолятов MRSA, идентифицированы эпидемически значимые штаммы, циркулирующие как в стационарах нескольких регионов страны, так и в отдельных стационарах.

4. Установлено, что геномы эпидемических штаммов MRSA различаются: специфичностью нуклеотидных последовательностей генов хромосомного «ядра», детерминирующих синтез факторов патогенности (коагулазу и/или протеин А); содержат разные аллотипы стафилококковых хромосомных кассет (SCC) и различный набор генов, кодирующих энтеротоксины А, В и С, продукты которых обладают суперантигенной активностью.

5. Доказана генетическая общность идентифицированных эпидемических штаммов с эпидемическими штаммами MRSA, один из которых циркулирует в стационарах европейских стран {соа тип IV, spa тип t-030, SCCmec тип Ш), а другой имеет межконтинентальное распространение {соа тип IV, spa тип t-037, SCCmec тип Ш).

6. Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, характеризующийся полиморфизмом структуры гена spa t-008, который, в отличие от других эпидемических штаммов этой группы, циркулирующих в стационарах Европы и США, содержит композитный генетический элемент SCCmec.

7. Сформулирована гипотеза, согласно которой основным механизмом появления эпидемических штаммов MRSA в стационарах РФ является занос из европейских стран. Установлено, что в процессе распространения метициллинрезистентных штаммов на отдельных территориях происходит дальнейшая дивергенция эпидемических штаммов за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки.

8. Обнаружены новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC). Выявлено одновременное присутствие в геноме MRSA генетических элементов SCC различных аллотипов.

9. Доказано распространение эпидемических метициллинрезистентных/ оксациллинрезистентных штаммов S. aureus в крупных многопрофильных и специализированных стационарах Центрального, Северо-Западного и Уральского регионов РФ. В структуре заболеваний, вызванных MRSA, нагноения хирургических и ожоговых ран составили 37,7%, инфекции дыхательных путей, включая пневмонию и трахеобронхит — 30,1%, бактериемии - 19,6%, другие нозологические формы - 12,6%. Случаи внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, не выявлены в отдельных многопрофильных стационарах Южного,

Приволжского и Сибирского регионов РФ согласно результатам скринингового исследования.

Ю.Установлено, что увеличение частоты выделения антибиотикорезистентных изолятов S.aureus в стационарах, является следствием распространения эпидемических штаммов MRSA. Частота устойчивых к оксациллину изолятов S. aureus в стационарах составила в среднем 27,68% (0,06%-80%), мультирезистентными среди них являлись 80%—100% изолятов. Среди метициллинчувствительных изолятов S.aureus мультирезистентных выявлено не было.

11.Выявлен контингент больных, страдающих трофическими язвами, которые могут являться резервуаром и источником госпитальных эпидемических штаммов MRSA как в условиях стационара, так и за его пределами, т.е. в популяции.

12.Создан музей клинических изолятов MRSA, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, который может служить основой для проведения дальнейших генетических исследований S.aureus. Сформирован банк ДНК эпидемических штаммов MRSA.

13.Основные элементы мультилокусного анализа рекомендованы для включения в блок микробиологического мониторинга MRSA в системе эпиднадзора за внутрибольничными инфекциями и создания национальной базы данных эпидемических штаммов MRSA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты показали, что в стационарах России циркулируют эпидемические значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные формы внутрнбольничной гнойно-септической инфекции.

Основной теоретический вывод, который можно сделать на основании представленных в работе данных - это доказательство того, что появление таких штаммов в стационарах РФ является частью глобального процесса распространения MRSA. Основным механизмом формирования антибиотикорезистентных популяций S.aureus в стационарах является занос из стационаров европейских стран и дальнейшее распространение эпидемических штаммов MRSA. Выявленные молекулярно-генетические особенности идентифицированных эпидемических штаммов свидетельствуют о дальнейшей дивергенции эпидемических штаммов, циркулирующих на отдельных территориях. Обнаруженная высокая клональность популяции госпитальных MRSA в стационарах доказывает неэффективность существующей системы противоэпидемических мероприятий и неотложную необходимость принятия мер организационно-правового характера для борьбы с распространением эпидемически значимых штаммов. Идентификация среди госпитальных эпидемического штамма, несущего вариант кассеты SCCтес типа IV, способной подвергаться многочисленным генетическим перестройкам и распространяться между штаммами, принадлежащими различным генетическим «бэкграундам», позволяет предположить, что в дальнейшем может происходить формирование новых эпидемических штаммов в стационарах России. Достаточно высокая частота выделения MRSA в стационарах России, очевидно, будет способствовать «выносу» госпитальных штаммов в популяцию. Некоторые молекулярно-генетические характеристики идентифицированных эпидемических штаммов свидетельствуют об их способности циркулировать и во внебольничной среде.

Разработанный мультилокусный анализ генома MRSA оказался эффективным инструментом, как для расследования вспышек, так и для определения статуса идентифицированных эпидемических штаммов в процессе глобального распространения MRSA. Основанный на исследовании молекулярных маркеров двух типов он не только позволяет идентифицировать известные эпидемические штаммы, но и фиксировать появление новых штаммов, обусловленное как внутригенными перестройками генов хромосомного «ядра», так и горизонтальной передачей генов в составе мобильных генетических элементов. Обладая высокой дифференцирующей способностью, он, в отличие от PFGE, дает возможность не только дифференцировать клинические изоляты, но прослеживать их эволюционные взаимосвязи, оценивать эпидемиологическую обстановку и прогнозировать тяжесть и развитие эпидемической ситуации.

Включение в мультилокусный анализ секвенирования гена spa, выполнение которого доступно научно-исследовательским центрам нашей страны, позволяет проследить филогенетические связи идентифицированных эпидемических штаммов и формировать национальную базу таких штаммов. Создание последней предоставит новые возможности для обмена информацией о циркулирующих эпидемических штаммах с использованием Интернет технологий, позволит фиксировать появление новых эпидемических штаммов и предупреждать их распространение. На сегодняшний день spa секвенирование является единственным из молекулярно-генетических методов типирования, показавшим свою 100% межлабораторную воспроизводимость [de-Sousa A.M. et al., 2006]. Именно этот метод наилучшим образом коррелирует с результатами типирования, полученными на основе использования технологии микрочипов [KoreenL. al., 2004].

Оптимизация эпидемиологического надзора за ВБИ на основе компьютерной техники становится в настоящее время важнейшим научно-организационным принципом, обеспечивающим принятие оперативных организационных решений с учетом сложившейся эпидемиологической обстановки, необходимостью решения задач по прогнозированию, моделированию эпидемического процесса с помощью специализированного программного обеспечения [Соколовский В.Т., Семина Н.А., 1999; Ермилов Ю.Н., 2001; Акимкин В.Г., 2003].

Исследование структурного полиморфизма гена соа методом ПЦР-ПДРФ в сочетании SCCтес типированием и изучением профиля генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах, позволяет использовать мультилокусный анализ в клинических лабораториях и осуществлять молекулярно-генетический мониторинг в стационаре.

Разработанная методика выделения ДНК гарантирует стабильность ДНК в течение нескольких лет и позволяет оперативно исследовать дополнительные молекулярные маркеры, не включенные в схему мультилокусного анализа. Она также расширяет возможности для проведения всесторонних научных исследований, позволяя в течение длительного времени работать с единым образцом выделенной ДНК, и изучать множество молекулярных маркеров, используя ПЦР-анализ.

Результаты проведенных исследований положены в основу разработанных и внедренных в практику здравоохранения Методических рекомендаций, утвержденных Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, посвященных идентификации и генотипированию метициллинрезистентных Staphylococcus aureus - возбудителей внутрибольничных инфекций.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Дмитриенко, Ольга Александровна, Москва

1. Акатов А.К. Микробиологические аспекты антистафилококкового иммунитета (экспериментальное исследование): дис. докт. мед. наук — Москва, 1969.-503 с.

2. Акатов А.К., Зуева B.C. Стафилококки. — М.: Медицина, 1983. 256 с.

3. Акимкин В.Г. Концептуальная модель организации эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями в системе социально-генетического мониторинга // Эпидемиол. инфекц. бол 2003. - № 2 — С. 11— 16.

4. Акимкин В.Г. Система профилактики внутрибольничных инфекций в России. Служба госпитальных эпидемиологов: итоги и перспективы. // Эпидемиол. инфекц. бол.-2005.-№ 1.-С. 4-8.

5. Беляков В.Д., Колесов А.П., Остроумов П.Б., Немченко В.И. // Госпитальная инфекция Л., М.: Медицина, 1976.-232 с.

6. Биргер М.О. Справочник по микробиолгическим и вирусологическим методам исследования // М Медицина, 1982.

7. Ю.Внутрибольничные инфекции / Под редакцией Р.П.Венцеля. Пер. с англ. // М.:-Медицина, 1990.

8. Гоик В.Г., Козлова Н.С., Гранстрем К.О. Оценка антибиотикорезистентности стафилококков воздушной экосистемы шести стационаров г. Санкт-Петербурга // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2002.- Т. 4 - Прил. 1.- С. 16.

9. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность / Екатеринбург: УрО РАН, 2000. -239 с.

10. Дехнич А.В., Эйделыптейн И.А., Нарезкина А.Д., и др. Эпидемиология антибиотикорезистентности нозокомиальных штаммов в России: результаты многоцентрового исследования // Клинич. микробиол. антимикроб, химиотер. 2002. Т. 4. - № 4. - С.325-336.

11. Дмитренко О. А. Стабильность лекарственной устойчивости у стафилококков в различных условиях: дис. канд. мед. наук. Москва, 1979. -с.181.

12. Евстропов А.Д., Ильина В.Н., Шмырин А.А. и др. Этиология бактериемии у обожженных //Сб. Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М.: РОСИНЭКС, 2002г. -Т. 4. С.147-148.

13. Езепчук Ю.В., Пронин А.В. Иммунобиологические свойства суперантигенов // Вестн. Рос. Академ, мед. наук. 2000. - № 1. - С.38^15.

14. Ермилов Ю.Н. Особенности эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями на региональном уровне в условиях Крайнего Севера: автореф. дис. канд. мед. наук. М., 2001.

15. Ершов Г.В., Смоленов И.В., Чернавин А.В. Структура и антибиотикорезистентность возбудителей послеоперационных осложнений в гинекологических стационарах г. Волгограда. // Клин, микробиол. антимикрооб. химиотер. 2002. - Т. 4. - Прил. 1. - С. 20.

16. Зуева B.C. , Дмитренко О.А, Нестеренко Л.Н., Беликов Н.Г., Witte W., Акатов А.К. Метициллинорезистентные стафилококки // ЖМЭИ. 1988. -№4.-С. 100-108.

17. Зуева B.C., Дмитренко О.А., Акатов А.К. Экспериментальные фаги для дифференцирования нетипируемых культур метициллинрезистентных Staphylococcus aureus //ЖМЭИ. 1988. - № 9. - С. 19-24.

18. Козлов Р.С. Нозокомиальные инфекции: эпидемиология, патогенез, профилактика, контроль // Клин, микроб, антимикроб, химиотер. 2000, Т. 1, № 2. - С. 16-30.

19. Российской научно-практической конференции с международным участием. -Москва, 1999 г.-С. 149-150.

20. Методические указания по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями / Утверждены Приказом МЗ СССР от 02.09. 87 №28-6/34.-21с.

21. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. — Москва, 2004. 91 с.

22. Миронов А.Ю. Патогенные кокки // Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под редакцией А.А. Воробьева М.:: Медицинское инфомационное агенство, 2006 — 702 с.

23. Определитель бактерий Берджи в 2 т./ Под ред. Дж. Хоума, Н.Крига, П.Снита и др./ Пер. с англ. М.: Мир, 1997-Т. 2.

24. Прозоровский С.В., Генчиков Л.А. Эпидемиология внутрибольничных инфекций и проблема их профилактики // Mater. Med. Бюллетень для врачей и фармацевтов, 1994. № 3. - С. 5-28.

25. Русакова Е.В. Эпидемиология' и профилактика аспирационных антропонозов, эпидемиологический надзор и противоэпидемические мероприятия: Лекции. М. ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. - 160 с.

26. Семина Н.А., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г., Сидоренко С.В. Особенности эпидемиологии и эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями на современном этапе // Эпидем. инфекц. бол. — 2006. — Т. 4. -С. 22-26.

27. Сидоренко С.В., Резван С.П., Грудинина С.А. и др. Результаты многоцентрового исследовании чувствительности стафилококков кантибиотикам в Москве и Санкт-Петербурге // Антибиот. химиотерап. — 1998.-Т. 43.-С. 15-25.

28. Сидоренко С.В., Резван С.П., Еремина и др. Этиология и антибиотикочувствительность возбудителей тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации // Антибиот. химиотер. 2005. - Т. 50. -С. 33-41.

29. Справочник госпитального эпидемиолога // М.: Христозом, 1999. 336 с.

30. Страчунский JI.C., Белькова Ю.А., Дехнич А.В. Внебольничные MRSA -новая проблема антибиотикорезистентности. // Клин, микробиол. антимикроб, химиотерап. 2005. - Т. 7. - № 1. - С. 32-44.

31. Тюрин Ю., Макаров А. Анализ данных на компьютере. М., Инфра-М, 2003. - 544 с.

32. Усманова Г.М., Рафиев Х.К., Дабуров К.Н. Заболеваемость внутрибольничными инфекциями и ее структура среди новорожденных в Таджикистане // Эпидемиол. инфекц. бол. 2005. - № 1. - С. 11-12.

33. Черепанова Т.А., Шаликова Г.Г.Чувствительность к антибиотикам S.aureus II Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М.: РОСИНЭКС, 2002 г. Т. 4. - С. 128.

34. Черкасский Б.Л. Системный подход в эпидемиологии // М.: Медицина, 1988.

35. Черкасский Б.Л. Руководство по общей эпидемиологии // М.: Медицина, 2001.-557 с.

36. Черкасский Б.Л. Понятие « риск» в эпидемиологии. // Эпидемиол. инфекц. бол. 2006,-№4.-С. 5-11.

37. Чистович Г.Н. Эпидемиология и профилактика стафилкокковых инфекций — Л.: Медицина, 1969. 141 с.

38. Шагинян И.А. Геномный полиморфизм в эпидемиологическом анализе бактериальных инфекций: автореферат дис. док. мед. наук. Москва, 1995.

39. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // Клинич. микроб, антимикроб, химиотерап. 2000, - Т. 2. - № 3. - С. 82-95.

40. Шагинян И.А., Дмитренко О.А. Молекулярная эпидемиология инфекций, вызываемых метициллинустойчивыми стафилококками // ЖМЭИ. 2003. -№ 3. - С.99-109.

41. Шатохина С.Н. Гетерорезистентность клеток метициллино-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus: дис. канд. мед. наук. Москва, 1980. -146с.

42. Arakere Gayathri, Savitha Nadig, GoteSwetberg, Ragini Macaden Satish K.Amarnath and Dasarathy Raghunath. Genotyping of methicillin-resistant strains from two hospitals in Bangalore, South India // J. Clinical Microbiol. 2005. - V. 43.-№7.-P. 3198-3202.

43. Arbeit R.D. Laboratory procedures for epidemiologic analysis, in The staphylococci in human disease / Ed. K.B. Crossley and G.L.Archer (New York: Churchill Livingstone, p. 353-386.

44. Ausken H.M., Ganner M., Murchan St., Cookson B.D., Jonson A.P. A new UK strain of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus (EMRSA-17) resistant to multiple antibiotics // J. Antimicrobiol. Chemoth. 2002. - V. 50. - № 2 - P. 171-175.

45. Ayliffe, G.A. The progressive intercontinental spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Clin. Infect. Dis. 1997. - V. 24. -Suppl. 1. - S74-79.

46. Bacterial Nomenclature Up-to-date. DSMZ Search Catalogues, электронный ресурс. доступ: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htlm

47. ВаЬа Т., Takeuchi F., Kuroda M., et al. Genome and virulence determinants of high virulence community-acquried MRSA // Lancet 2002. - V. 359. - № 9320 -P. 1819-1827.

48. Baird-Parker A.C. Classification and identification of Staphylococci and their resistance to physical agents / In Jay O. Cohen. The Staphylococci. Wiley-Interscience. A Division John Wiley and Sons, Inc.- 1972. - PP.1—20.

49. Baird-Parker A.C. Genus Staphylococcus / In Buchanan and Gibbons (ed.), Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed.- Baltimore: The Williams and Wilkins Co., 1974. PP. 483^189.

50. Beard-Pegler M., Vickery A. Lysogenicity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // J. Med. Microbiol. 1985. - V.20. - № 2. - P. 147-155.

51. Beck W.D., Berger-Bachi B. and Kayser F.H. Additional DNA in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and molecular cloning of mec specific DNA // J.Bacteriol. 1986. - V. 165. - № 2. - P. 373-378.

52. Berger-Bachi В., Strassle A., Gustsfson J.E. and Kayser F.H. Mapping and characterization of multiple chromosomal factors involved in methicillin resistance in Staphylococcus aureus // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. -V. 36.-№7.-P. 1367-1373.

53. Berger-Bachi В., Rohrer S. Factors influencing methicillin resistance in staphylococci // Arch. Microbiol. 2002. - V. 178. - P. 165-171.

54. Bodmann K.-F., Lorenz J., Bauer T.T., Evig S., Trautmann, Vogel F. Nosocomial Pneumonia: Prevention, Diagnosis, and Treatment // J. Chemother 2003. - V. 12.-№2.-P. 33-34.

55. Boyce J.M. Epidemiology and prevention of nosocomial infection / In: The staphylococci in human disease / Ed. K.B. Crossley and G.L.Archer. New York: Churchill Livingstone, 1997. - P. 309-329.

56. Boyce J.M.,Cookson В., Christensen K., Hori S., Vuopioo-Varkila J., Kosagos S. et al., Methicillin-resistant Staphylococcus aureus II Lancet Infect. Dis. 2005. -V. 5. -№ x10. - P. 653-663.

57. Bunikowski R., Mielke M., Scarabis H. et al. Prevalence and role of serum Ige antibodies to the Staphylococcus aureus-derived superantigens SEA and SEB in children with atopic dermatitis // J. Allergy Clin. Immunol. 1999. - V.l. - № 1 Ptl.-P. 119-124.

58. Campbell W. N., Fitzpatrick M., Ding X., Jett M., P. Liemski, S.E. Goldblum. SEB is cytotoxic and alteres EC barrier function through protein tyrosine phosphorylation in vitro // Am. J. Physiol. 1997. - V. 273. - P. L 31-L 39.

59. Centers for disease control and prevention NNIS system. 2001. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System report, data summary from

60. January 1992-June 2001 // Am. J. Infect. Control. 2001. - issued August, 2. -P. 404-421.

61. Chastre J., Fagon J.Y., Ventilator-associated pneumonia // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002. - V.165. - P.867-903.

62. Coombs G.W., Nimmo G. R., Bell J.M., et al. Genetic diversity among methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains causing outpatient infections in Australia//J.Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. - № 10. - P. 4735^1743.

63. Copsgrove S.E., Sakoulas G., Perecevich E.N. et al. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin susceptible Staphylococcus aureus bacteremia; a meta-analysis // Clin.Infect.Dis. 2003. — V. 36. - P. 53-59.

64. Corne Ph., Marchandin H., Jonquet O. et al. Molecular evidence that nasal carriage of Staphylococcus aureus plays a role in respiratory tract infections of critically ill patients // J. Clinical Microbiol. 2005. - V. 43. - № 7. - P. 34913493.

65. Cucarella C., Solano C., Valle J. et al. Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation // J. Bacteriol. 2001. V. 183. - P. 28882896.

66. Deurenberg R.H., Vink C., Oudhuis J.G. et al. Different clonal complex of methicillin-resistant Staphylococcus aureus are disseminated in the Euregio Meuse-Rhine Region // Antimicrob.Ag. Chemoth. 2005. - V. 49. - № 10. - P. 4263-4271.

67. Dinges M. M., Orwin P.M. and Schlievert P.M. Exotoxins of Staphylococcus aureus II Clin. Microbiol. Rev. 2000. - V. 13. - № 1. - P. 16-34.

68. Dufour P., Gillet G., Bes M.et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in France: emergence of a single clone that produces Panton-Valentine leucocidine // Clin. Infect Dis. 2002. - V. 35. - № 7. - P. 819 -824.

69. Duran S.P., Kayser F.H., Berger-Bachi B. Impact of sar and agr on methicillin resistance in Staphylococcus aureus //FEMS Microbial. Lett. № 1996. - V. 141. -P. 255-260.

70. Edmond M.B., Wallace S.E., Moclish D.K., et al. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis // Clin. Infect Dis. -1999. V. 29. - № 2. - P. 239-244.

71. Enright M. С., Robinson D.A., Randle G. et al. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) // PNAS 2002. - V. 99. -P. 7685-7692.

72. Feil E.J., Cooper J.E., Grundmann H. et al. How clonal is Staphylococcus aureus? //J. Bacteriol. -2003. V. 185. -№ 11. - P. 3307-3316.

73. Finland M. Excursions into epidemiology; selected studies during the past four decades at Boston City Hospital. // J. Infect. Dis. 1973. - V. 128. - № 1. - P. 76 -124.

74. Fitzgerald J.R., Monday S.R., Foster T. J. et al. Characterization of putative pathogenicity island from bovine encoding multiple superantigens // J. Bacteriol. -2001.-V. 183. -№1. -P. 63-70.

75. Fournier В., Philpott D.J. Recognition of Staphylococcus aureus by the innate immune system // Clin. Microbiol. Rev. 2005. - V. 18. - № 3. - P. 521-540.

76. Fridkin S.K., Hageman J., Morrison M., Sanza L.T., Como-Sabetti K. Jernign J.A. et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease in three communities //N. Engl. J. Med. 2005. -V. 352. - № 1. - P. 1436-1444.

77. Fujikawa H., Igarashi H., Usami H, Tanaka S., Tamura H. Clearance of endotoxin from blood of rabbits injected with staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 // Infect. Immun. 1986. - V. 52. - № 1. - P. 134-137.

78. Fujimura and Murakami. Increase of methicillin resistance in Staphylococcus aureus caused by deletion of gene whose product is homologous to lytic enzymes //J. Bacteriol. 1997. - V. 179.-№20.-P. 6294-6301.

79. Giacometti A., Cirioni O., Schimizzi A.M. et al. Epidemiology and microbiology of surgical wound infections // J.Clin. Microbiol. 2000. — V. 38. — №2.-P. 9189-9192.

80. Griffiths C., Lamagni T.L., Crowcroft N.S, Duckworth G. et al. Trends in MRSA in England and Wales: analysis of morbidity and mortality data for 19932002 // Health Stat Q. 2004. - Spring (21). - P. 15-22.

81. Guidelines for the management of adults with hospital-acquried, ventilator-associated, and healthcare-associated pneumonia // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2005.-V.171.-P. 388-416.

82. Hamad A.R., Marrack P., Kappler J.W. Transcytosis of staphylococcal superantigen toxins // J.Exp. Med. 1997. - V. 185. - P. 1447-1454.

83. Hardy K. J., Ussery D.W., Oppenheim B. A., and P.M. Hawkey. Distribution and characterization of staphylococcal interspersed repeat units (SIRUs) and potential use for strain differention // Microbiol. 2004. - V. 150. - P. 40454052.

84. Hartman B.I., Tomasz A. // Low-affinity penicillin-binding protein associated with P-lactam resistance in Staphylococcus aureus II J. Bacteriol. — 1984. — V. 158. — № 2. -P.513-516. л

85. Hiramatsu K. Molecular evolution of MRSA // Microbiol. Immunol. 1995. -V. 39. -№ 8. -P.531-543.

86. Holden M. T.G., Feil E.J., Lindsay J.A. et al. Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance // PNAS 2004. - V. 101. - № 26. - P. 9786-9791.

87. Hookey J.V., Richardson J. F. and Cookson B. D. Molecular typing of Staphylococcus aureus on PCR restriction fragment length polimorphism and DNA sequence analysis of the coagulase gene // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36.-№4.-P. 1083-1089.

88. Hsu Li-Yang, Koh Tse-Hsien, Singh K. et al. Dissemination of multisusceptible methicillin-resistant Staphylococus aureus in Singapore // J.Clin. Micobiol. 2005. - V. 43. - № 6. - P. 2923-2925.

89. Huang S.S. and Piatt R. Risk of methicillin-resistant Staphylococus aureus infection after previous infection or colonization // Clin.Infect.Dis. 2003. — V. 36.-№3.-P. 281-285.

90. Jarraud S., Mougel Ch., Thioulouse J. et al. Relationships between Staphylococus aureus genetic background, virulence factors, agr groups (alleles), and human disease // Inf. and Immun 2002. - V. 70. - № 2. - P. 631-641.

91. Jevons M.P. "Celbenin"- resistant staphylococci // Br. Med. J. -1961. V. 1. -P. 124-125.

92. T.Ito, Katayama Y., Hiramatsu K. Cloning and nucleotide sequence determination of entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain //Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - V. 45. - № 6. - P. 14491458.

93. Ito Т., Okuma К., Ma X.X. et al. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC // Drug Resistance Updates. 2003. - V. 6. - P. 41-52.

94. Ito Т., Ma X.X., Takeuchi et al. Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccr // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - V. 48. - № 7. - P. 2637-2651.

95. Iwahara Т., Ichiyama S., Nada Т., Shimocata K., Nakashima N. Clinical and epidemiologic investigations of nosocomial pulmonary infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus //Chest. 1994. - V. 105. - № 3. - P. 826-831.

96. Kanafani Z.A., Fowler V.G. Staphylococcus aureus infections: new challenges from old pathogen // Enfermed. Inf. Microbiol. Clin. 2006. - V.24. - № 3 -P.182-193.

97. Kanzaki H., Ueda M., Morishita Y. et al. Producibility of exfoliative toxin and staphylococcal coagulase types of Staphylococcus aureus strains isolated from skin infections and atopic dermatitis // Dermatology 1997. - V.195. - № 1. - P. 6-9.

98. Katayama Y., Ito Т., and Hiramatsu K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus II Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - V. 44. - № 6. -P. 1549-1555.

99. Kaye K. S., Engelmann J. J., Mozaffari E., and Carmeli Ye. Reference group choice and antibiotic resistance outcomes // Emerg. Infect. Dis. -2004. — V. 10. — № 6. -P.l 125-1128.

100. Kerr S., Kerr G.E., Makintosh C.A, and Marples R.R. A survey of methicillin-resistant Staphylococcus aureus affecting patients in England and Wales // J. Hosp. Infect. 1990. - V. 16. - № 1. - P. 35^14.

101. Kluytmans J., van Belcum A., Verbruch H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanism and associated risks // Clin. Micro Rev. 1997. - V. 10. - № 3. - P. 505-520.

102. Ко K.W., Ji-Yong Lee, Ji Yoeun Suh, Won Sup Oh et al. Distribution of major genotypes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Asian Countries // J.Clinical. Microbiol. 2005. - V. 43. - № 1. - P. 421-426.

103. Kondo N., Kuwahara Arai K., Kuroda-Murakami H., et al. Eagle type methicillin-resistance: new phenotype of high methicillin resistance under mec regulator gene control // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - V. 45. — P. 815-824.

104. Kuroda M., Ohta Т., Uchiama I. et al. Whole genome sequencing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus II The Lancet 2001. — V. 357. — №21. - P. 1225-240.

105. Kuroda M., Yamashita At., Hirakawa H., Kumano M., et al. Whole genome sequence of Staphylococcus saprophiticus reveals the pathogenesis of uncomplicated urinary tract infection // PNAS 2000 V.5. - № 102. - P. 1327213277.

106. Kushnaryov V.M., MacDonald H.S., Reiser R.F., Bergdoll M.S. Reaction of toxic shock syndrome toxin 1 with endothelium of human umbical cord vein // Rev. Infect. Dis. 1989. V.l 1. - P. S282-288.

107. Lechmann H.S., Heaton Т., Mallon D. , Holt P.G. Staphylococcal enterotoxin-B-mediated stimulation of interleukin-13 production as a potential aetiologic factor in eczema in infants // Int. Arch. Allery Immunol. 2004. - V.135. - № 4. -P. 306-312.

108. Liassine N., Auckenthaler R., Descombes M.-C. et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated in Swizerland contains the

109. Panton-Valentine leukocidin or exfoliative toxin genes // J.Clin. Microb. 2004. — V. 42. - № 2. - P.825-828.

110. Linsday J.A., Rusin A., Ross H.F. et al. The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenity island in Staphylococcus aureus II Mol. Microbiol. 1998. -V. 29. P. 527- 543.

111. Lowy F.D. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus // J. Clin. Invest. 2003. - V.l 11. - № 9. - P. 1265-1273.

112. Luong T.T., Ouyang Shu, Bush K., Lee Ch.Y. Type 1 capsule genes of Staphylococcus aureus are carried in staphylococcal cassette cromosome genetic element // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - №13. - P.3623-3629.

113. Lyon B.R. and R.Skuray. Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus: Genetic Basis // Microbiol.Rev. 1987. - V.55. - №1. - P. 88-134.

114. Marples R.R., and E.M. Cooke. Workshop on methicillin-resistant Staphylococcus aureus //J. Hospital. Infect. 1985. - V.6. - P.342-348.

115. Matsuhashi M., Song M.D., Ishono F. et al. // J. Bacteriol. 1986. - V.167. -№13. - P.975-980.

116. McDonald K.L., Osterholm M.T., Hedberg C.W. et al. Toxic shock syndrome. A newly recognized complication of influenza and influenza-like illness // JAMA. 1987. - V. 257. - №8. - P.1053-1058.

117. Miethke Т., Duschec K., Wahl C., Heeg K., Wagner H. Pathogenesis of toxic shock syndrome: T cell mediated lethal shock caused by the superantigen TSST-1 //Eur. J. Immun. 1993. -V. 23. -P.1294-1300.

118. Naimi T.S., Ledell K.H., Boxrud J. et al. Epidemiology and clonality of commimity-acqured methicillin-resistant in Minnesota, 1996-1998. // Clin.Infect.Dis. 2000. - V. 33. - № 7. - P. 990-996.

119. Nakao A., Imai S., Takano T. Transposon-mediated insertional mutagenesis of the D-alanyl-lipoteichoic acid (dlt) operon raises methicillin resistance in Staphylococcus aureus II Res. Microbiol. 2000. - V. 151. - № 10. - P. 823-829.

120. National Committee for Clinical Laboratory Standarts. 2001. Performance standarts of antimicrobial susceptibility testing, 11th informational supplement,vol. 21, no.l. Naitional Committee for Clinical Laboratory Standarts, Wayne, Pa.

121. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004 // Am. J. Infect. Control. -V. 32. P. 470-485.

122. Novick R. P. (Ed.) Molecular Biology of Staphylococci / N.Y.: VHC Publishers, 1990. P. 583.

123. Novick R. P., Schlievert P., Rusin A. Pathogenecity and resistance islands of staphylococci // Microb. Infect. 2001. - V. 3. - P.585-594.

124. Novick R. P. Mobile genetic elements and bacterial toxinoses: the superantigen-encoding pathogenicity islands of Staphylococcus aureus II Plasmid 2003. - V.49. - № 2. - P. 93-105.

125. Novick R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence // Molecular Microbiol. 2003. - V. 48. - № 6. - P. 1429-1449.

126. O'Neill G. L., Murchan S., Gil-Setas A., and Ausken H.M. Identification and Characterisation of phage variants of strain of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus ( EMRSA-15) // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - № 4.-P. 1540-1548.

127. Okuma К., Iwakawa К., Turnidge J. D. et. al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - № 11. - P. 4289^294.

128. Oliveira D. C., Tomasz A, and de Lencastre H. Secrets of success of human pathogen: molecular evolution of pandemic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus II The Lancet Infect. Dis. — 2002. — V. 2. — № 3. — P. 180189.

129. Quie P.G., Verhoev J., Kim Y., Peterson Ph. Host determinants of staphylococcal infections / In: The Staphylococci // Proceedings of the Alexander Ogston Centennial Conference. / Ed. Macdonald A. Aberdeen University Press, 1981. - P.83-93.

130. Palmqwist N., Foster Т., Tarcowski A., Josefsson E. Protein A is a virulence factor in arthritis and septic death // Microb. Patog. 2002. - V.33. - № 5. - P. 239-249.

131. Projan S. J. Antibiotic resistance in Staphylococci / In: Fischetti V.A., Novick R.P., Feretti J.J., Portnoy D.A., Rood J.I. (Eds.). Gram-positive pathogens -Washington, D.C. : ASM Press, 2000. P. 463^70.

132. Revised guidelines for the control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in hospitals. Combined Working party of the British Society of

133. Antimicrobial Chemotherapy, the Hospital Infection Society and the Infection Control Nurses Association // J. Hosp. Infect. 1998. - V. 39. - P.253-290.

134. Richardson Judith. F., Chittasobhon Nuanchan, Marples R.R. Supplementary phages for the investigation of strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus II J. Med Microbiol. 1998. - V. 25. - P. 67-74.

135. Robinson D. Ash., Enright M.C. Evolutionary Models of the Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Antimicrob. Ag. Chemother. — 2003. V. 47. - № 12. - P. 3926-3934.

136. Robinson D. Ash., Kearns A.M., Holmes A. et al. Re-emergence of early pandemic as community-acquired methicillin-resistant clone // Lancet. 2005. — V. 365. - № 9466. - P. 1256-1258.

137. Rountree P.M. The origin and spread of virulent staphylococci / Recent Progress in Microbiol. Toronto, 1963. - P. 561-569.

138. Romero-Vivas J., Rubio M., Fernandez C., Picazo J.J. Mortality associated with nosocomial bacteraemia due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus II Clin. Infect. Dis. 1995. - V. 21. - № 6. - P. 1417-1423.

139. Rosenbach F.J. Micro-organismen bei den Wund-Infections-Krankheiten des Menschen. / Weisbaden, 1884.

140. Ross F. J., Studevant D. E., Mackie St. M. et al. Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus: Insights into the origin of methicillin-resistant strains and toxic shock syndrome epidemic // PNAS 2001. - V. 98. - № 15. - P. 88218826.

141. Rubin R.J., Harrington C.A., Poon A. et al. The economic impact of Staphylococcus aureus infections in New York City hospitals // Emerg. Infect. Dis.- 1999.-V. 5. — № 6. P. 9-17.

142. Rybak M.J., Pharm D. K.L. Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a review // Pharmacotherapy — 2005. V. 25- №.1- P. 74-85.

143. Saldago C.D., Farr B.M., Calfee D.P. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a meta-analysis of prevalence and risk factors // Clin. Infect. Dis. -2003. V. 36. № 2. - P. 133-139.

144. Sanford M.D., Widmer A.F., Bale M.J., Jones R.N., Wensel L.P. Efficient detection and long-term persistence of the carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Clin. Infect. Dis. 1994. - V. 19. - № 6. - P. 11231128.

145. Schlivert P.M. Staphylococcal enterotoxin В and toxic-shock syndrome toxin-1 are significantly associated with non-menstrual TSS // Lancet 1986. - V.l - № 8490-P. 1149-1150.

146. Schmidt H. and Hensel M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis // Clinical Microb. Rev. 2004. - V.17. - № 1. - P.14-56.

147. Shopsin В., Gomes M., Montgomery S.O., Smith D.H., et al. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains // J.Clin. Microbiol. -1999. V. 37. - № 11. - P. 3556-3563.

148. Shopsin В., Gomez M., Waddington M., Riehman M., and Kreiswirth B.N. Use of coagulase gene (coa) typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains // J.Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - № 9. - P. 3453-3456.

149. Shore A., Rossney A. S., Keane C., Enrigt M.C., Coleman D.C. Seven novel variants of the staphylococcal chromosome cassette mec in methicillin-resistant

150. Staphylococcus aureus isolates from Ireland // Antimicrob. Agents Chemother. -2005 V. 49. - № 5. - P. 2070-2083.

151. Sista R.R., Oda G., Barr J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in ICU patients //Anesthesiol.Clin. North. America. 2004. - V. 22. - № 3. - P. 405-435.

152. Smith T.L., Pearson M.L., Wilcox K.R. et al. Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus glycopeptide intermediate Staphylococcus aureus working group // N.England J. Med. 1999- V. 340. - № 7. - P. 493-501.

153. Song M.D., Wachi M., Doi M. et al. Evolution of an inducible penicillin-target protein in methicillin-resistant strains of Staphylococcus saprophyticus // Antimicrob. Agents Chemother. 1990 - V. 34. - P. 1780-1782.

154. Staali L., Monteil H., Colin D.A. The staphylococcal poreforming leukotoxins1. Л |open Ca channels in the membrane of human polymorphonuclear neutrophils // J. Membr. Biol. 1998. - V. 162. - P. 209-216.

155. Stone R. L., Schlivert P.M. Evidence for the involvement of endotoxin in toxic shock syndrome // J. Infect. Dis. 1987. - V. 155. - № 4. - P. 682- 689.

156. Stranden A., Frei R. and Widmmer A.F. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: can PCR replace pulced-field gel electrophoresis? 11 J. Clin. Microbial. 2003. - V. 41. - № 7. - P. 3181-3186.

157. Taskapan M.O., Kumar P. Role of staphylococcal superantigens in atopic dermatitis: from colonization to inflamation //Ann. Allergy Asthma Immunol., 2000. V. 84. - № 1. - P. 3-10.

158. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Электронный ресурс. // Доступ:-http://textbookofbacteriology.net/staph.htlm

159. Tomasz A., Nachman S. and Leaf H. Stable classes of phenotypic expression in methicillin-resistant clinical isolates of staphylococci // Antimicrob. Agents Chemother. 1991. -V. 35. -№ 1. - P. 124-129.

160. Turnridge J.D., Bell J.M. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus evolution in Australia over 35 years // Microb. Drug Resist. 2000. - № 3. - V. 6. - P. 223229.

161. Vojtov N., Ross H.F., Novick R.P. Global repression of exotoxin synthesis by staphylococcal superantigens // PNAS 2002. - V. 99. - № 15. - P. 1010210107.

162. Voss A., Milatovich D., Wallrauch-Schwarz C. et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. — V. 13.-№ l.-P. 50-55.

163. Wagner P. L. and Waldor M.K. Bacteriophage control of bacterial virulence // Infect. Immun. 2002. V.70. - № 8. - P. 3985-3993.

164. Wang J.T., Chen Y.C., Yang T.L., and S.C.Chang. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Taiwan // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2002. - V. 42. - № 3. - P.l99-203.

165. Wann E.R., Fenringer A.M., Esepchuk Yu.Y. et al. Staphylococcus aureus isolates from patients with Kawasaki disease express high levels of protein A // Infect. Immun. 1999. -V. 67. -№ 9. -P. 4737-^1743.

166. Wannet W.J.B., Spalburg E., Heck M.E.O.C. et al. Emergence of virulent methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains carrying Panton-Valentineleucocidin in Netherlands // J. Clinical. Microbiol. 2005. - V. 43. - № 7. - P. 3341-3345.

167. Wecke J., Madela K., Fisher W. The absence of D-alanine from lipoteichoic acid and wall teichoic acid alters surface charge, enhances autolysis and increase susceptibility to methicillin in Bacillus subtilis // Microbiol. 1997. — P. 29532960:

168. Wilcox M.H., Walker C., Winstanley N.G., Limb D.I. True identity of control Staphylococcus aureus strains and their performance in the tube coagulase test // J.Med. Microbiol. 1996. - V. 44. - № 6. - P. 496^199.

169. Williams R.E.O. Epidemic staphylococci // Lancet. 1959. V. 1- № 7065. - P. 190-195.

170. Williams R.E.O. Healthy carriage of Staphylococcus aureus: its prevalence and importance // Bacteriol. Rev. 1963. - V. 27. - P. 56-71.

171. Yarwood J.M., Schlievert P.M. Quorum sensing in Staphylococcus aureus infections // J. Clin. Invest. 2003. - V. 112. - № 11. - P. 1620-1625.

172. Yamaguchi Т., Nishifuji K., Sasaki M. et al. Identification of the Staphylococcus aureus etd pathogenecity island which encodes a novel exfoliative toxin, ETD, and EDIN-B // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - № 10. - P. 58355845.

173. Zueva V.S., Dmitrenko O.A., Nesterenko L.N., Akatov A.K. A new approach to establishing the set of phages for typing methicillin-resistant Staphylococcus aureus II J. Chemother. 1991. - V. 3. - № 5. - P. 283-287.

Информация о работе

Дмитриенко, Ольга Александровна
доктора медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы