Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis"

На правах рукописи

РГ5 ОД J 8 мп

ГОРШКОВ Олег Владимирович

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2000

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохраненш Российской Федерации (Саратов).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Попов

доктор медицинских наук, с. и. с. О.П. Плотников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.И. Смирнова

доктор медицинских наук, профессор И.А. Шагинян

Ведущая организация:

Научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнегс Востока

Защита состоится 2000 г. в часов на заседании

диссертационного совета при Российском научно-

исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерств; здравоохранения Российской Федерации (410005, Саратов, Университетская: 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧР "Микроб".

Автореферат разослан '¿'З" ¿-¿о^/х-Ч 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Г.А. Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Активизация в конце XX века ряда [рнродных очагов чумы Африки, Азии, Америки и Европы послужила [ричиной увеличения заболеваемости людей бубонной и легочной формами [анной инфекции, что указывает на нестабильность эпидемиологической Остановки (Онищенко с соавт., 1998 и др.). Возрастание числа эпидемических грояшгений чумы позволяет говорить об актуатьности изучения молекулярно-енетических основ патогенности Y. pestis, а также исследований, [аправленных на разработку новых критериев идентификации чумного шкроба. В то же время необходимость создания эффективной системы голекулярно-эпидемиологнческого мониторинга природных очагов чумы акже подтверждает перспективность поиска генетических маркеров штаммов pestis различной природно-очаговой принадлежности.

Существование большого количества схем внутривидовой лассификации Г. pestis, созданных, как правило, на основе результатов зучения фенотипа микроорганизма, свидетельствует об ограниченности одходов их построения, не позволяющих отразить генотипические собенности штаммов Г. pestis. Привлечение современных молекулярно-енетических методов исследования генома бактерий не только совершенствует существующую внутривидовую систематику чумного шкроба, но и позволит приблизиться к геносистематике возбудителя чумы.

Большинство традиционных методов идентификации бактерий сновывается на регистрации фенотипических признаков, которые могут быть метастабильны"' (Голо&тев, 1998). Неоднородность спектра :икробиологических свойств v популяций Г. pestis различной природно-чаговой принадлежности послужила причиной создания внутривидовой лассификации чумного микроба (Devignat R., 1951; Туманский, 1957; имофеева, 1972; Пейсахис, Степанов, 1975; Пейсахис с соавт., 1975; лассовский, Степанов, 1975 и др.). Однако, многочисленные случаи ыделения "атипичных" штаммов Y.pestis (Классовский, Петров, 1970; ольдфарб с соавт., 1971; Пейсахис с соавт., 1971; Бибикова с соавт., 1972; 1аманек с соавт., 1976; Мартиневский с соавт., 1984; Темиралиева с соавт., 978 и др.) и возможность циркуляции штаммов возбудителя чумы между риродно-очаговыми территориями (Щепотьев с соавт., 1979 и др.) зидетельствуют о существовании фенотипических отклонений, не шгываемых в схемах внутривидовой классификации Y. pestis, что может лзывать затруднение в определении подвидовой принадлежности зежевыделенных штаммов. Актуальность вопроса о формах сохранения ззбудителя чумы в межэпизоотический период (Домарадский с соавт., 1995; ултанов, Козлов, 1998; Солдаткин, Иванов, 1980), а также выделение в эиродных очагах чумы штаммов Salmonella, фенотипнчески сходных по

Фенотнпическдя изменчивость бактерий в рамках постоянного но хранимой информации гсноппта", которая гнерируется бактериями как способ адаптации к нестабильной среде и является результатом специфической рмы отбора" (Головлев, 1998).

признак)' бактериоциногении со штаммами Y. pestis (Стручкова, 1997; подтверждают необходимость поиска дополнительных критерисн идентификации чумного микроба.

Нестабильность и неоднородность микробиологических признаков возбудителя чумы требуют привлечения большого количества микробиологических и иммунохимических методов для идентификации различных штаммов чумного микроба. Все вышеперечисленное являете* весомым аргументом для поиска новых критериев типирования штаммов У. pestis, основанных не только на регистрации фенотипических признаков, не п на выявлении различий в структуре генома микроорганизма.

Генетические методы, используемые в систематике бактерий (Леванова. Блохина, 1987), такие как определение нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК-гибридизация, широко используются для геносистематики различны* групп организмов, но все же недостаточны для решения вопросов внутривидовой систематики возбудителя чумы из-за высокой стеиеш гомологии полинуклеотидных последовательностей ДНК штаммов У. pestis различных подвидов (Б&чахонов, 1987).

Одно из перспективных направлений исследования генетической организации }". pestis - дактилоскопия, основанная на изучении геномного полиморфизма. Аналогичный подход успешно используется на моделях таких возбудителей инфекционных заболеваний, как Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Moraxella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Listeria spp. (Grothues, 1989) и других. На модели возбудителя чумы работы по молекулярно-генетическому типированию штаммов Г. pestis единичны и не реализуют потенциал метода.

В подтверждение актуальности настоящего исследования, следует также отметить, что на проходившей в марте 1998 года (Атланта, США международной конференции по инфекционным заболеваниям рассматривался вопрос о расширении критериев лабораторной диагностики чумы, для решения которого была создана рабочая группа с целью разработки рекомендаций для молекулярного типирования штаммов }'. pestis с помощью методов молекулярно-генетического анализа (Сhu, 1998).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в выявлении полиморфизма геномов штаммов Г. pestis различной природно-очаговой принадлежности методами геномной дактилоскопии.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести анализ паспортных данных штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, и проверить стабильность микробиологических признаков выбранных штаммов в процессе коллекционного хранения.

2. Осуществить ПЦР-типирование природных штаммов чумного микроба различных подвидов с использованием праймеров, созданных на основе нуклеотидных последовательностей, фланкирующих тандемные повторы ДНК бактериофага М13.

!. Сравнить нуклеотидные последовательности генетических зондов, используемых для идентификации чумного микроба, и сконструировать ДНК-зонд на основе нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК Г. pestis для типирования штаммов возбудителя чумы различной природно-очаговой принадлежности, к Изучить геномный полиморфизм штаммов Г. pestis из различных природных очагов с использованием сконструированного генетического зонда и выяснить возможность использования этого критерия для таксономии чумного микроба. НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показана возможность межвидовой дифференциации патогенных гредставителей рода Yersinia путем ПЦР-типирования с праймерами, конструированными на основе нуклеотидных последовательностей, эланкирующих гипервариабельные последовательности ДНК бактериофага ¿13.

Впервые установлено, что генетические зонды, используемые для [дентификации чумного микроба - HRSIII/37; зонд на основе IS/00-элемента и ДК-зонд - имеют в своем составе идентичную по составу нуклеотидную юследовательность, размером 180 bp. Обнаруженная нуклеотидная юследовательность послужила основой нового генетического зонда, бозначенного "ВХ", позволяющего эффективно проводить типирование гтаммов }'. pestis различной природно-очаговой принадлежности.

Получены приоритетные данные по зависимости полученных енодактилоскопических картин штаммов }'. pestis от определенного вида осителя, в популяции которого они циркулируют. Установленные акономерности позволяют говорить о закреплении на генетическом уровне волюционной адаптации возбудителя чумы к организм}' грызунов и айцеобразных.

На основе фингерпринтного анализа предложена оригинальная схема ифференциации коллекционных штаммов Г. pestis на семь гнодактилоскопических вариантов, сопряженных с приуроченностью штаммов конкретным природным очагам. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Сконструирован ДНК-зонд, позволяющий эффективно проводить еттривидовое типирование штаммов Г. pestis, выделенных из различных риродных очагов.

Штамм Е. coli HBlOlpBX (KM 145) - источник ДНК-зонда ВХ депонирован в осударственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб". На основе результатов проведенных исследований оформлен патент i» 2160779) "ДНК-зонд для типирования чумного микроба (ВХ-зонд)". Геномная дактилоскопия с использованием ВХ-зонда рекомендована нами в ¡честве одного из дополнительных критериев классификации возбудителя

/'МЫ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на: «местном Американо-Российском семинаре в USAMRIID (Форт Детрик,

США, 1997); юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию 11И1-микробиологии МО РФ (Киров, 1998); научной конференции учреждений ш борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья i Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); юбилейной научно! конференции посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологи) (Оболенск, 1999 г); итоговой научной конференции РосНИПЧИ "Микроб (Саратов, 2000).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит i введения, двух глав обзора литературы, трех глав собственных исследований заключения, выводов и списка литературы, включающего 210 цитируемы; работ, из них 76 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 13< страниц. Текст иллюстрирован 13 таблицами и 19 рисунками.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В процессе коллекционного хранения штаммов Y. pestis лиофилизированном состоянии происходят изменения фенотипически: свойств и плазмидного состава клеток чумного микроба.

2. ПЦР-типирование с использованием праймеров, на основ* гипервариабельных последовательностей бактериофага М13, дае-возможность проведения межвидовой дифференциации патогенны: представителей рода Yersinia, но не приемлемо для дифференциацш штаммов Y. pestis различной подвидовой и природно-очагово! принадлежности.

3. Генетические зонды, используемые для идентификации чумного микроба н; основе HRSIII/37, IS 100 и МК, имеют в своем составе идентичнук нуклеотидную последовательность, определяющую специфичност] гибридизационных картин штаммов Г. pestis.

4. Закономерности локализации нуклеотидной последовательности составляющей ВХ-зонд, на хромосомной ДНК семидесяти штаммов Г. pesti. позволяют говорить о существовании генетических вариантов чумногс микроба, свойственных определенным видам носителей конкретны: природно-очаговых территорий.

Диссертационная работа выполнялась в рамках плановой НИР (003-96" "Изучение структурно-функциональной организации генома чумного микроб; и разработка генетических тест-систем для характеристики и идентификацш возбудителей опасных инфекционных заболеваний" (1996-2000) № Гос. регистрации. 01.9.70000638.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовано 70 штаммов Г. pestis, из них двадцать четыре проверены на стабильность микробиологических свойств в процессе коллекционного хранения в лиофилизированном состоянии. Были использованы также штаммы: У pseudotuberculosis (VI серовар), Y. enlerocolitica И-27, Е. coli HB101pHRSIII/37 и Е. coli JM109pMK, а также бактериофаги: чумной диагностический Л413"С", Покровской, псевдотуберкулезный, R-ЛПС-специфичный бактериофаг FP1. Бактерии культивировали на жидких и плотных питательных средах LB (рН 7,2) или Хоттингера (рН 7,2) с добавлением соответствующих антибиотиков. Для определения питательных потребностей изучаемых штаммов использовали агар Дифко ("Difco", США) с добавлением различных аминокислот.

Основные фенотипические характеристики штаммов определяли согласно "Наставлению по изучению свежевыделенных штаммов возбудителя чумы" (Алма-Ата, 1972), "Руководству по профилактике чумы" (1992), "Учебно-методическому пособию по лабораторной диагностике и изучению биологических свойств чумного микроба и возбудителей некоторых других природно-очаговых инфекций" (1972). Чувствительность штаммов ]'. pestis к R-специфическому бактериофагу FP1 определяли при двух температурных режимах выращивания культуры и инкубации с бактериофагом - 26 °С и 37 °С. Питательные потребности штаммов возбудителя чумы изучали согласно рекомендациям А.Н. Классовского и В.М. Степанова (1973).

Анимализацию штамма Г. pestis М-958 с целью селекции из популяции PgnT-клонов проводили путем заражения белых мышей внутрибрюшинно по три животных на каждую 'дозу, содержащую от 2x104 до 2x10s м.к./0,2 мл исследуемой культуры.

Скрининг штаммов иерсиний на присутствие плазмидных репликонов проводили по метод)' C.I Kado, S.-T Liu (1981) без модификаций.

Генно-инженерные манипуляции выполняли в соответствии с эуководством Т. Maniatis et al. (1982). В работе использовали ферменты производства НПО "MBI/Fermentas" (Литва). Передач)' рекомбинантной тлазмиды рВХ в штамм Е. coli НВ101 осуществляли методом "кальциевой" трансформации по S.N. Cohen & A.C.Y. Chang (1973) без модификаций. Задиоизотопное мечение ДНК-зонда [32-P]-dCTP выполняли с помощью ia6opoB для ник-трансляции фирмы "Amersham" (Англия) в соответствии с шструкцией фирмы-изготовителя. Нерадиоактивное мечение проводили с использованием детекционного набора DIG-dUTP фирмы "Boehringer-vlannheim" (Германия) согласно инструкции. ПЦР-реакцию осуществляли в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл) на грограммируемом амплификаторе "Терцик" ("ДНК-Технология", Россия) при ^пользовании олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе 1)'клеотидных последовательностей, фланкирующих тандемные повторы

бактериофага М13. Молекулярные массы изучаемых фрагментов ДНК определяли с использованием или маркеров молекулярных масс: BRL с фрагментами пх123 нп ("Gibco", США), или фрагментов ДНК плазмидь pBR328, полученных в результате совместного гидролиза рестриктазамп ВатШ, BglI и Hinñ, или фрагментов ДНК бактериофага L, гидролизованног ферментом Hind III.

Секвенирование2 нуклеотндной последовательности ДНК ВХ-зонд; проводили с использованием автоматического секвенатора "Model 373А DNA Sequencing System" (Applied Biosystems, США) на базе лабораторш секвенирования и картирования генома человека Института молекулярной биологии РАН (г. Москва) по метод}' Ф. Сэнгера (Краев, 1988)

Изучение и сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК-зондог проводили с использованием компьютерной программы Gene Runner Software v. 3 0. Расчет молекулярных масс рестрикционных фрагментов осуществлял1 на основе программы DNASIS, v. 3.0. Сканирование полученны: гибридизационных блотов, радиоавтографов и слайдов проводили с использованием планшетного сканера Mustek Paragon 6000 P/SP, полученные цифровые изображения обрабатывали в редакторе Adobe Photoshop, v. 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Микробиологические, биохимические и генетические характеристики коллекционных штаммов Г. ре si is различного срока хранения

Известно, что в процессе коллекционного хранения микроорганизмов могут происходить изменения клеточных структур и молекул (Сидякина, 1985; Калакуцкий, Сидякина, 1988). Исходя из этого, на первом этапе нашегс исследования, была проведена проверка стабильности фенотипических свойств, отображенных в паспортных данных штаммов чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности. В качестве критериев отбора штаммов возбудителя чумы, находящихся в лиофилизированном состоянии ш коллекционном хранении в Государственной коллекции патогенных бактерий института "Микроб", использовали: во-первых, наличие штамма-представителя природного очага в коллекции, во-вторых, изменчивость микробиологических свойств }• различных штаммов (например, вариации в питательных потребностях и ферментации Сахаров, различия в пигментсорбции и т.д.), в-третьих, принадлежность штамма чумного микроба к ранг}- типового.

По результатам анализа отобрано 24 штамма Y. pestis (период хранения от 10 до 50 лет), представляющих 22 автономных природных очага чума. Данные штаммы в соответствии с "Положением о музеях живых культур противочумных институтов и станций Министерства здравоохранения СССР" (1980) подверглись комплексной проверке паспортных характеристик по следующим пунктам: морфология роста в бульоне и на агаре Хоттингера

2 Благодарим аспиранта лабораторш! секвенирования и картирования генома человека инеппуга молекулярпо] биологии РАН (г. Москва) A.B. Будилова, за техническую и методологическою помощь в эксперименте и определению нлклеотндной последовательности ДНК ВХ-зонда.

(pH 7,2); чувствительность к бактериофагам Покровской, JI-413C, нсевдотубсркулезному, а также R-ЛПС-специфичному фагу FP1; фибринолитическая и плазмокоагулазная активность; продукция и чувствительность к нсстнцину I; рост на среде Хигучи-Смита при 37 °С; реакция пассивной гемагглютинации на выявление антигена фракция I; нигментсорбцпя; ферментация Сахаров; чувствительность к антибиотикам; нитрификация и денитрификация; питательные потребности; плазмидный состав.

У большинства изучаемых штаммов микробиологические свойства не изменились. Однако, у ряда штаммов отмечена нестабильность некоторых фенотипических признаков, таких как: фагочувствительности (Г. pestis А-1921), зависимости от ионов Ca_t (Y. pestis И-1251), пигментсорбции (Y. pestis С-533, Y.pestis А-1921, Y.pestis М-958, Y.pestis А-1822), нитрификации (Y.pestis И-1251), питательных потребностей (Т. pestis И-1251, Y.pestis С-534, Y.pestis А-436).

При проверке штаммов Г. pestis на чувствительность к диагностическим бактериофагам был проведен анализ фагочувствительности штаммов с использованием фага FP1, который является R-ЛПС-спенифичным и лизирует Rb-Rd варианты Salmonella spp. и Е. coli (Schmidt, Ludentz, 1969). Данный фаг также способен лизировать многие штаммы чумного микроба при совместной инкубации фага и клеток чумного микроба при 26 °С, но не 37 °С (Гремякова с гоавт., 1997). Определение чувствительности изучаемых штаммов Y.pestis к фагу FP1 выявило феномен лизиса клеток как при 26°С, так и при 37°С. Замечено, что штаммы 1". pestis, выращенные при различных температурах ;28°С и 37 °С) могут по-разному реагировать на действие фага FP1. Например, культура штамма Y.pestis А-1249 (Гиссарский природный очаг), выращенная при 28°С, не лизируется фагом FP1 ни при 26°С. ни при 37°С. В то же время, гот же самый штамм, выращенный при 37 °С подвержен лнтическому действию ¡¡ara при 26°С. но с отсутствием лизиса при 37 °С. Из данных таблицы 1 видно, ITO фагочувствительность 37°С-ной культуры штаммов Y.pestis при шкубировании в условиях 26 °С существенно повышается, что, вероятно, ;вязано с температурозавнсимыми изменениями ЛПС и, как следствие этого, .'силением фагорецепторных свойств клеток }". pestis. Чувствительность к фагу 7Р1 по результатам проводимого опыта не связана с плазмидным составом юследуемых штаммов Г. pestis, что соответствует данным, полученным Т.А. "ремяковой с соавт. (1997). Не удалось обнаружить какой-либо корреляции фагочувствительности штаммов с их подвидовой и природно-очаговой финадлежностыо. Однако полученные данные представляют интерес для 1альнейшего изучения иммунохимических и антигенных особенностей шпополисахарпдов природных штаммов чумного микроба, выращенных при )азличных температурах и определения роли ЛПС в адаптации бактериальной летки к изменяющим условиям окружающей среды.

При изучении зависимости роста клеток штамма Y. ¡ estis И-1251 от ионов на среде Хшучи-Смпта выявлен 100% рост клеток при 37 °С в отсутствие гонов кальция, но при наличии pCad-репликона у данного штамма. На наш

взгляд, это может быть обусловлено либо делениями в области, кодирующее экспрессию признака Cad-, либо регуляторным действием мобильны; генетических элементов (Филиппов с соавт., 1990).

Таблица 1. Лизис коллекционных штаммов У. pestis Л-ЛПС-спецнфичны\ бактериофагом FP1

№ JVs Штаммы Г pestis Наличие плазмиды 28 °С - культура I' pestis 37 "С - ку льту ра Г pes

_И инкубация с бактериофагом FP1 при

Ц. с. о с. =- 26 °С 37 °С 26 °С 37 °С

1 А436 - - - + + - +

2 Al 108 + - - + + н.и. н.и.

3 А1249 + + - - - - -

4 А1435 + + - - - - -

5 А1486 + + - - - - -

6 А1792 + + - - - н.и. н.и.

7 А1817 + + - - - - -

8 А1822 + + - - - - -

9 А1824 + + - - - - -

10 А1921 + + - - - - -

11 С527 4- + - + + н.и. н.и.

12 С528 + -1- - - - - -

13 С533 + + - - + - -

14 С534 + + - - + н.и. н.и.

15 С627 + + - - - - -

16 М638 + + - - - - -

17 М642 + + - - - н.и. н.и.

18 М958 + + - - - н.и. н.и.

19 И1251 + + - - - - -t-

20 И2377 + - - - - - -

21 И2422 - + - - - - -

22 И3223 + + - - - - +

23 231(708) + + - - - - -

24 805 + + - + - -

25 ЕВ НИИЭГ + + - + - н.и. н.и.

Примечание: "+" - наличие плазмиды лизиса; "-" - отсутствие плазмиды лизиса; "м.и." -

не исследовали.

В результате проверки признака пигментсорбции у 50% штаммов }". резН5 после коллекционного хранения выявлены несоответствия различной степени с паспортными характеристиками, заключающиеся в изменении процента пигментированных и непигментированных колоний. Штаммы 1". С-533.

У. ре5/лу А-1921 и У. резИз М-958 утратили способность к образованию пигментированных колонии на среде с гемином или Конго красным. Два штамма, а именно, Г. рек7/5 М-958 и }". резИз А-1822, изучены более подробно.

Штамм У. М-958 является представителем Волго-Уральского

песчаного очага и выделен в 1973 году от блох при раскопках нор грызунов.

По паспорту для данного штамма, кроме трех типичных плазмид (рРга, рСас!, рРв^, характерно наличие дополнительного плазмидного репликона размером около 30 МДа. Наличие типичных плазмид подтверждено С.Д. Дмитрюком (1990) на основании зондирования (дот-гибридизация) генома этого штамма с использованием генетических зондов - Р1, С1, Р1. Для штамма при выделении характерна пигментсорбция у 100% клонов. Проверка паспортных характеристик после коллекционного хранения (26 лет) выявило в 100 % случаев отсутствие признака при изучении около 5х103м.к.

Нами была проведена анимализация штамма Г. /?е5//5 М-958 с целью селекции из популяции Pgm+-клoнoв. Вновь выделенная культура, полученная от белых мышей (павших не было) на дифференциальной среде К.И. Дурихина (1980) давала стойкие Нтз'-колошш. Данная Нтэ'-культура характеризовалась авирулентностью для белых мышей при всех дозах заражения. Таким образом, в данном случае можно говорить о стабильной утрате признака пигментсорбции в процессе коллекционного хранения в лиофилизированном состоянии (срок наблюдения 1 год). Прн проведении плазмидного скрининга этого штамма также не был обнаружен репликон рРэ1 и, соответственно, этсутствовали фенотипические свойства, кодируемые им - фибринолизин-шагулазная активность и продукция пестицина I.

Таким образом, для штамма У. М-958 после коллекционного

-¿ранения в течение девяти лет отмечается стойкая утрата признака пигментсорбции и отсутствие плазмиды пестициногенности в автономном состоянии.

Штамм }'. резИэ А-1822 выделен из нор большой песчанки от блох в 1982 ~оду. Относится к Кызылкумскому автономному очагу, который является мстью Среднеазиатского пустынного природного очага. Одной из характерных эсобенностей данного штамма яачяется нестабильность клеток по признаку шгментсорбции. По паспортным данным изначальные Нтз~~-клетки на 7-8 ;утки образуют Нтз+-клоны с частотой 7-10х10"7. По результатам проверки физнака пигментсорбции данного штамма после коллекционного хранения 15 лет) было выявлено следующее. Первый высев клеток выявил 100%-ное !аличие признака пигментсорбции. На III посев (7-8 сут) зафиксировано юявление единичных Ншз~-клеток (0,56 %). Нтэ"-колонии подращивали на :екторах агара ЬВ (рН 7,2) в течение суток и 102 клеток рассевали на чашки с шфференциальной средой К.И. Дурихина (1980). В течение четырех пересевов [аблюдалось стойкое соотношение Нтз+- (~ 80 %) и Нтз~-клонов (~20 %). На [ятый высев количество Ншз'-клонов уменьшилось до 4 %. Таким образом, аметно отклонение от паспортных данных.

Зависимость роста клеток чумного микроба от различных аминокислот •тличается не только в разных природных очагах, но и в разных частях одного ; того же очага (Степанов с соавт., 1972, 1989; Пейсахис с соавт., 1975, 1978; ^лассовский с соавт., 1972 и др.). Эксперимент по проверке питательных отребностей проводили в два этапа: на первом, свойства штаммов изучали в

соответствии с паспортными данными по аминокислотам - метиопит, треонину, фенилалашшу, цистеину, а при наличии дополнительных питательных потребностей - лейцину, аргинину, пролину. Первичная проверка подтвердила паспортные данные отобранных штаммов, но для двух штаммов чумного микроба (Г. ре$ИБ И-1251 и }". резИз С-534) были получены либо неопределенные, либо отрицательные результаты. Для уточнения питательных потребностей этих штаммов был проведен второй этап определения аминокислотной зависимости по схеме Л.Н. Классовского и В.М. Степанова (1973). В результате установлено, что штамм )". реэИэ И-1251 характеризовался гетерогенностью популяций, то есть, имела место зависимость роста отдельных клеток от лейцина, а у штамма У. резИз С-534 выявлена дополнительная зависимость от лейцина - особенность, не зарегистрированная в паспорте. Интересно отметить, что, по нашим данным штамм У. А-436 является

ирототрофом, т.е. способен расти на "голодном" агаре Дифко, однако по данным комиссионной проверки (1986) этот штамм ранее обладал лейцинзависимостыо.

По результатам проведенного электрофоретического скрининга, у одиннадцати штаммов 1". реьИз наблюдали типичный плазмидный профиль из трех репликонов: -6 К/ГОа (кодирует синтез пестпцина I и активатора плазмшюгена); -45 МЭа (детерминирует продукцию У\У-антигенов и УОРз-белков); -65 МОа (определяет синтез антигена фракция I и «мышиного» экзотоксина). Плазмидный профиль других изученных штаммов Г. реэНэ отличался от типичного отсутствием классических или наличием дополнительных плазмидных репликонов. Интересно отметить, что у двух штаммов - У. реБИэ М-958 и У. резИз И-1251 изменение фенотипическнх признаков, кодируемых генами хромосомной локализации (пигментсорбцпя, нитрификация и потребность в аминокислотах), произошло одновременно с утратой одного из плазмидных репликонов. Нельзя исключать и вероятность того, что причина изменения фенотипа связана с неоднородностью микробиологических признаков пот'ляций бактерий до коллекционного хранения.

Таким образом, лабильность некоторых фенотипическнх признаков и плазмидного состава в процессе коллекционного хранения в лиофилизированном состоянии свидетельствует о необходимости, во-первых, периодического тестирования основных свойств коллекционных штаммов, во-вторых, дальнейшего совершенствования сред стабилизации для коллекционного хранения микроорганизмов и, в-третьих, поиска более стабильных критериев дифференциации штаммов возбудителя чумы.

2. Дактилоскопия генома природных штаммов чумного микроба

В настоящее время, дактилоскопия генома включает широкий спектр методов, позволяющих проводить молекулярно-генетическое типирование бактерий, в основе которого лежат два принципа: принцип ДНК-ДНК-гпбридизации с использованием специфических ДНК-зондов и принцип

амплификации ДНК с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров При геномной дактилоскопии в большинстве случаев используют "универсальные" ДНК-зонды (созданы на основе мобильных генетических элементов, кДНК, тандемных повторов бактериофага М13 и др.) и праймеры, сконструированные на основе произвольных нуклеотидных последовательностей (Vassart et al.., 1987; Булат с соавт., 1992; Рысков с соавт., 1988; Шагинян с соавт., 1991 и др.). К сожалению, использование методов генодиагностики для типирования штаммов возбудителя чумы, циркулирующих в природных очагах России и сопредельных государств, практически не реализовано. Недавно опубликованная работа М. Achtman et al. (1999) по изучению структуры генома представителей рода Yersinia, где получены оригинальные данные о происхождении биоваров возбудителя чумы, позволяет говорить об актуальности работ в данном направлении.

Исследование штаммов }'. pestis с привлечением ДНК-зонда на основе повторяющихся нуклеотидных последовательностей бактериофага М13 выявило два гибридизационных сигнала в геноме возбудителя чумы (Рысков с :оавт., 1988), что на наш взгляд, является недостаточным для генетической дифференциации штаммов чумного микроба по природно-очаговой принадлежности.

Исходя из этого, нами были использованы праймеры, сконструированные :ia основе повторяющихся последовательностей ДНК бактериофага М13, с :юмощью которых проведено генотипирование различных представителей рода Yersinia. Всего изучено 24 штамма чумного микроба из двадцати двух штономных природных очагов чумы России и сопредельных государств. В шализ также были взяты представители видов У. pseudotuberculosis и Г. enterocolitica.

Визуализация ПЦР-паттернов в 2% агарозном геле выявила от 3 до 10 1мпликонов, длина которых варьировала в диапазоне 100-1300 нп. Корреляции ТЦР-профилей по природно-очаговой принадлежности не наблюдали. Также не ¡ыявлены различия между подвидами Г. pestis. ПЦР-паттерны представителей ipynix патогенных Yersinia отличаются от таковых у штаммов Y. pestis. Наибольшее количество ампликонов (до восьми) отмечено у штамма '. enterocolitica И-27, причем ни один из фрагментов не совпадал с (етектируемыми фрагментами 1". pestis. Наименьшее количество ампликонов 3-4) наблюдали у штамма Y. pseudotuberculosis (VI серовар), два из которых 300 нп и 200 нп) были схожи по размерам с продуктами амплификации ДНК pestis.

Таким образом, ПЦР-анализ с помощью праймеров на основе ипервариабельных последовательностей бактериофага М13, показат озможность его использования для межвидовой дифференциации штаммов редставителей патогенных йерсшшй. Однако, он не позволяет проводить ипирование штаммов }'. pestis по природно-очаговой принадлежности.

Дальнейший поиск генетических маркеров, позволяющих эффективно роводить тшшрование штаммов чумного микроба различной природно-чаговой принадлежности, сконцентрировался на изучении известных ко

времени начала наших исследований генетических зондах, созданных на основе нуклеотндных последовательностей генома )'. peslis (Куличенко с соавт., 1991; Можаров с соавт., 1997; Бобров, Филиппов, 1997).

Существование нескольких генетических инструментов (ДНК-зондов) для достижения одной цели - молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагои обуславливает проблем)' выбора генетического зонда (Подладчикова с соавт., 1992; Норкина, с соавт., 1993; Можаров с соавт., 1997; Бобров, Филиппов, 1997). Кроме того, не выяснен вопрос о степени их подобия, в первую очередь существования гомологии между данными ДНК-зондами. Для решения этих задач мы провели сравнительное изучение структуры известных генетических зондов с помощью рестрикционного, гибридизационного и компьютерного анализов. При этом использовали следующие генетические зонды:

1.ДНК-зонд, сконструированный на основе одной из повторяющихся последовательностей чумного микроба HRSIII (Можаров с соавт., 1997).

2. Генетические зонды, сконструированные на основе мобильных элементов генома возбудителя чумы - IS700 и IS2S5 (Бобров, Филиппов, 1997):

3. Видоспецифический МК-зонд (Норкина с соавт., 1993), позволяющий проводить детекппю возбудителя чумы.

4. ДНК-зонд, созданный на основе криптической области плазмиды пестициногенности О.Н. Подладчиковой с соавт. (1992).

Сравнительное изучение структуры ДНК МК-зонда и HRSIII/37-зондов проводили с использованием в качестве доноров зондов штаммов Е. coli, содержащих гибридные плазмиды, JM109(pMK) и HB101(pHRSIII/37). По данным О.В. Норкиной с соавт. (1993) размеры ДНК МК-зонда составляли 980 нп., а HRSIII/37 (300 нп) является укороченным дериватом HRSIII.

Рестрикционный анализ МК-зонда и HRSIII/37-зонда с использованием эндонуклеаз Крп\, Bgll\, Psil, Hinü выявил наличие одного Ps/I-сайта и двух Я;>;П-сайтов рестрикции у МК-зонда, что дополняет данные О.В. Норкиной с соавт. (1993), и одного .%Л1-сайта рестрикции у HRSIII/37-зонда. Для выявления гомологии в структуре ДНК была проведена блот-гибридизация рестриктов ДНК зонда HRSIII/37 с ДНК МК-зонда, в результате которой был зарегистрирован гибридизационный сигнал в опытах, где использовали BgKl-Aj&al-pecTpiiicr ДНК зонда HRSIII/37, обозначенный нами как ВХ-зонд. Реципрокная блот-гибридизация ДНК ВХ-зонда с рестриктами ДНК МК-зонда показала наличие сходной нуклеотидной последовательности с низкомолекулярным /'¿/¡-фрагментом ДНК МК-зонда.

Исходя из данных по гомологии ДНК МК-зонда и ВХ-последовательности HRSIII/37, мы провели гибридизацию хромосомной ДНК штаммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагов. Сравнительный анализ радиоавтографа МК-зонда с DIG-BX-меченным блотом показал полную идентичность расположения сигнальных полос на рестрикционных треках ДНК хромосомы штаммов возбудителя чумы.

По данным О.В. Норкиной с соавт. (1993) в структуре ДНК МК-зонда находятся короткие повторяющиеся последовательности, обозначенные

авторами как А и В (рис I).

300

-4~

600

•лю

1200 и-

1500

1800

2100 Ч—

2400 «и

ч

is its

600'

Psíl

10ÜÜ

Bgkíl i 4I6Ü0

J¡ л

1

- 2 .... 3

.....1

1 - ЛЛ-В^/Н-фрагмент \S100-элемента (Бобров, Филиппов, 1997); 2 - МК-зонд с последовательностями типа А и В; 3 - последовательность ВХ-зонда; 4 - ДНК-зонд, сконструированный М.Лс^тап г/ а!. (1999).

Рисунок 1. Структурная схема 18/00-элемента и гомологичные ему области МК-зонда, ВХ-зонда и генетических зондов, сконструированных на основе К/ЯО-элемеита.

1

Учитывая результаты реципрокной гибридизации ДНК МК-зонда и HRSIII/37-зонда, мы предположили, что гомологичная область находится в районе повторяющейся последовательности типа В, так как родство с последовательностью типа А приводило бы к возникновению не одного, а двух гибридизанионных сигналов. При сопоставлении картин электрофоретического распределения Pí/I-рестриктов МК-зонда и картины гибридизации данных рестрнктов с ДНК ВХ-зонда выявлено, что гибридизационный сигнал эбусловлен iVI-.ßg/11-фрагментом МК-зонда (-490 нп).

Получив информацию о высокой степени родства ВХ-последователыюсти Ж5Ш/37-зонда с областью, включающую повторяющуюся последовательность типа В МК-зонда, мы провели сравнительный анализ с помощью программы Gene Runner Software v. 3.0. опубликованных ранее ;еквенсов ДНК МК-зонда (Норкнна с соавт., 1993), IS 100, IS285 (Filippov et al., 1995) и зонда, разработанного на основе плазмиды pPst (Подладчикова с соавт., 1992).

Сравнительный компьютерный анализ выявил следующее: IS2S5 не имел хшологип ни с МК-зондом, ни с зондом, сконструированным D.H. Подладчиковой с соавт. (1992). В то же время, обнаружена гомологичная область протяженностью примерно 78 нп у последовательности типа А (300 нп) i зонда из состава плазмиды пестицппогенности (145 нп); гомологии между последовательностью типа В и этим же зондом не найдено. По сообщению D.S. Torosian и M.R. Zsigray (1995), МК-зонд и ISyOO-элемент имеют высокую :тепень гомологии. В составе 18700-элемента были выявлены три неполных сопии последовательности типа А, впервые определена общая нуклеотидная юследователыюсть размером в 101 нп. между нуклеотидной

последовательностью типа В МК-зонда (103 ни) и IS700. Данная область гомологии расположена в /VI-.Sg/11-фрагменте (450 ни) IS/00-элемента, используемого в качестве зонда для генотииирования штаммов Г. pestis (Бобров, Филиппов, 1997). Поскольку область последовательности типа В у МК-зонда гомологична ВХ-зонду (170 нп) мы предполагаем, что последний имеет гомологию с ДНК-зондом, сконструированным на основе IS/00-элемента, а именно с ?5/1-Л^Л1-фрагментом (450 нп).

В целях получения более точных данных по выявлению родства вышеперечисленных ДНК-зондов было проведено секвенирование клонированного в pUC19 ВХ-зонда, размер которого составил - 180 нп. Он имел следующий нуклеотидный состав:

1 TCTAGAGGATCCCCAGCACCGCAGAAGCAACTCCAGTCGTTACGCTCACT 51 CAGCTTCATAGAACGTAATGAAAATATCGTATTACTGGGGCCATCAGGTG 101 TGGGGAAAACCCATCTGGCAATAGCGATGGGCTATGAAGCAGTCCGTGCA 151 GGTATCAAAGTTCGCTTCACAACAGCAGCA

Сравнение секвенса ВХ-зонда с нуклеотидной последовательностью /£100-элемента подтвердило наличие предполагаемой нами гомологии.

В контексте проведенного анализа обращает на себя внимание сообщение М. Achtman el al. (1999), в котором представлены результаты изучения геномного полиморфизма 49 штаммов }". pestis трех биоваров (antiqua, medievalis, orientalis) методами рестрикционного ангшза и генного зондирования. Авторами в качестве молекулярного зонда была использована нуклеотидная последовательность /¿'ЮО-элемента, размером 255 bp. В результате сравнения секвенсов данного ДНК-зонда и ВХ-зонда была выявлена их 100% гомология (рис. 1). Это обстоятельство делает возможным, в перспективе, проведение генодактилоскопического сравнительного анализа штаммов }'. pestis, исследованных зарубежными авторами и в наших экспериментах. Планируемый анализ будет иметь несомненную научную значимость, так как штаммы - различного происхождения.

В свете полученных данных о выявленной гомологии между IS 100-элементом и ВХ-зондом возникает закономерный вопрос о специфичности последнего данному мобильному генетическому элементу. Одним из возможных путей получения ответа на поставленный вопрос явились бы эксперименты по секвенировашпо генома нескольких штаммов }". pestis различного происхождения на предмет выявления в них полной нуклеотидной последовательности IS/00-элемента с входящей в его состав последовательностью ВХ-зонда.

Следует отметить, что при сравнительном изучении полного секвенса /5100-элемента с опубликованной и доступной на FTP-сервере Sanger Center нуклеотидной последовательностью хромосомной ДНК (~5,1 х 10б bp) вирулентного штамма Г. pestis СО-92 (Karlyshev et al., 1998), нами, при использовании программы Gene Runner, v. 3.0., было выявлено 156 участков гомологии различной степени протяженности (данные не приведены). В то же время, при сравнении нуклеотидных последовательностей ДНК }'. pestis СО-92 и ВХ-зонда обнаружено только 27 гомологичных фрагментов. Эти результаты позволяют предположить, что нуклеотидная последовательность ВХ-зонда не

служит абсолютным маркером IS/00-элемента и, возможно, выполняет самостоятельную роль в изменчивости чумного микроба, что заслуживает дальнейших исследовании.

Первичный анализ гибридизационных картин распределения ВХ-зонда на хромосомной ДНК У. pestis позволяет различить от 14 до 31 полосы. Выявлено, что минимальное количество гибридизационных сигналов (14-15) характерно для штаммов У. pestis, выделенных в Монголии; максимальное (до 31) - для представителей равнинных, равнинно-предгорных и степных очагов Центрального Кавказа, Прикаспия и Средней Азии.

Следует отметить, что почти 80 % гибридизационных сигналов, выявленных у штаммов }'. pestis из МНР, повторяются у штаммов возбудителя чумы, выделенных из других природных очагов (рис. 2). Возможное объяснение этого феномена может состоять в том, что монгольские штаммы чумного микроба, циркулирующие в популяциях пищух на территории Монголии, являются филогенетически наиболее "древним" вариантом возбудителя чумы Это подтверждает одну из гипотез происхождения чумного зооноза в Центратьной Азии (Ралль, 1965).

Недавно опубликованные данные M. Achtman et al.. (1999), по изучению структу ры генома штаммов У. pestis методами геномной дактилоскопии согласуются с полученными нами результатами и также свидетельствуют о наиболее древнем происхождении возбудителя чумы, циркулирующего на территории Центральной Азии.

Для интерпретации полученных результатов совокупность гибридизационных полос для каждого штамма была разделена на зоны, обозначенные буквами, а внутри каждой зоны отдельной полосе было присвоено цифровое обозначение (рис. 2). В итоге каждый штамм характеризуется буквенно-цифровым выражением, или генетической формулой, например:

GFEcoRI: А 10 В хо-8о С 20, 40-60 D 10i 20,40, 60-80 Е 70, so, 90 , где GF - genetic formula, "£coRI" - используемая рестриктаза, "А, В, С, D, Е" - зоны, "10, 20. 30..." - номера гибридизационных полос, обозначенные с интервалом в десять единиц. Таким образом, фингерпринты штаммов }'. pestis можно разделить на пять зон с количеством полос в каждой от 1 до 9. Размеры молекул ДНК в каждой зоне находятся ориентировочно в диапазонах: А - 1 -2 kb, В - 2-3 kb, С -3-5 kb, D - 5-10 kb. Е - 10-30 kb. Слияние гибридизационных сигналов в зоне Е ведет к затруднениям в ее визуальной оценки, поэтом}' нами отмечены только четко дифференцируемые полосы, присутствующие практически у всех штаммов pesas, а именно, три самых высокомолекулярных фрагмента (рис. 2, 3). Причина этого феномена, очевидно, кроется в малой величине пробега эестрикционных фрагментов в агарозном геле при электрофорезе, вследствие тего близкорасположенные высокомолекулярные фрагменты ДНК сливаются три гибридизашгонном анализе.

Для унификации в определении зон и фрагментов при дальнейших тсследованиях мы предлагаем в качестве маркеров гибридизационных зон юпользовать штаммы Г. pestis с минимальным количеством гибридизационных

сигналов - }'. pestis И-2422 (МНР), (Прибалхашский автономный очаг).

1

и максимальным - Y. pestis А-1921

kb 23.1

- ï'.l -(О 50 411

.та

-40

- .Ï0

¡0

70 M vt

......6,7

— 4.3

•■2.3

1 - штамм У. резНз А-1921 (песчаночий вариант); 2 - штамм }'. ре^ги И-2421 (пищуховый вариаит); 3 - маркер молек\лярных масс: ?. НтАШ.

Рисунок 2. Макет картин гибридизации геномной ДНК штаммов К реьйь с молекулярным зондом ВХ.

Степень подобия (S) между штаммами }". pestis вычисляли по формл'ле Жаккарда (Герхардт с соавт., 1984), используемой в нумерической таксономии бактерий: S = а / а+Ь, где "а" - количество положительно совпадающих признаков, а "Ь" - количество несовпадающих признаков. При этом в качестве признаков нами было использовано наличие или отсутствие гибридизационного сигнала на фингерпринты, что позволило применить формулу Жаккарда для вычисления степени подобия (коэффициента подобия) между штаммами pestis исходя из генодактилоскопических картин. Для автоматизации процесса обработки данных нами был создан шаблон обсчета результатов на базе электронных таблиц Microsoft Excel 2000, позволяющий вести базу данных полученных генодактилоскопических картин штаммов Г. pestis, преобразованных в двоичный код (наличие полосы гибридизации на блоте обозначали "1", а отсутствие - "0"), высчитывать степень подобия исследуемых штаммов с последующим распределением на группы (варианты).

1- И-2422 (МНР), 2- И-3130 (МНР). 3- С-533 (Зангезуро-Карабахский автономный очаг), 4-М-638 (Прикаспийский песчаный природный очаг). 5- М-642 (Волго-Уральский песчаный автономный очаг), 6- А-1435 (Муюшл-мский автономный очаг), 7- 231(708) (Аксайский автономный очаг). 8- А-1817 (Таллаский природный очаг), 9- И-3223 (Тувинский природный очаг)

Рпсмюк 3. Местоположение гпбрндизацнонных сигналов у нгтаммов Y. pestis, выделенных из различных природных очагов России п сопредельных государств.

Штаммы }'. pestis, имеющие, в большинстве случаев, значение S от 85 % до 100 %, были объединены в группы, при этом нами выделено семь вариантов генодактилоскопических картин (табл. 2, 3).

Специфичность расположения гибридизационных сигналов на рестрикционных треках ДНК штаммов Г. pestis различной природно-очаговой принадлежности позволила нам говорить о существовании эволюционной адаптации чумного микроба к определенным видам носителя на уровне генома. При этом можно выявить генетически закрепленные варианты чумного микроба, которые косвенно, на уровне феномена, уже были определены многими авторами, проводившими эксперименты по заражению конкретного вида грызуна штаммами К pestis, выделенными от различных носителей (Мартынова, 1979; 1980; Лухнова с соавт., 1979; Темиралиева с соавт., 1979 и др.). Результаты опытов по изучению питательных потребностей, ферментативной активности и их связи с физиологией грызунов (Степанов с соавт., 1972; Классовский с соавт., 1972 и др.), также подтверждают наши данные.

Различия в генодактилоскопической характеристике штаммов Г. pestis можно объяснить степенью адаптации различных вариантов возбудителя чумы к физиологическим особенностям носителей,- чем она выше, тем в большей

степени выражена изменчивость генетического аппарата Г. При этом

геном может подвергаться большому количеству структурных перестроек по типу адаптивных мутаций (Головлев, 1998) или при относительно неизменной структуре происходит изменение количества копий некоторого регуляторного элемента, в состав которого, возможно, входит нуклеотидная последовательность, используемая нами в качестве генетического зонда, что отражается на увеличении количества гибридизационных сигналов.

По определению М. П. Козлова (1973): "автономным очагом чумы следует считать территорию в пределах мировой зоны чумы, имеющую географические и экологические преграды для носителей, переносчиков и известных вариантов возбудителя чумы, где их циркуляция может осуществляться неопределенно долгое время в популяции одного или нескольких близкородственных в систематическом отношении видов грызунов". Мы предлагаем дополнить формулировку, уточнив ". известных генетических вариантов возбудителя чумы.", исходя из которой, при определении автономности природных очагов, мы считаем целесообразным учитывать ареал обитания носителей и циркулирующих в них генетических вариантов Г. рвБИБ.

Таблица 2 Генодактилоскопические варианты коллекционных штаммов У. _

№ пп Название варианта Организм-носитель Природный очаг Подвиды ]'. рс51и зиЬзр.

1 Песчаночий большая, полуденная, гребенщиковая, краснохвостая песчанка, песчанка Виноградова и малый суслик Среднеазиатский пустынный. Прикаспийский стенной и песчаный, Приараксинский, Кавказский равнинно-предгорный (Джейранчёль) резпэ

2 Полевочий обыкновенная полевка Закавказский высокогорный caucasica

3 Пшцуховый монгольская пищуха Монголия и^е1са

монгольская пищуха Го р н о - А лтайс ки й ака1са

4 Сурчиный серый и красный с%рок Тянь-Шанский. Алайский ре

5 Сусликовый длиннохвостый и да\рский суслик Тувинский, Забайкальский рея^

6 Полевоче-сурчиный красный сурок, арчевая и серебристая полевка Гиссарский, Таласский 1шзапса

7 Песчаночно-сусликовый горный суслик Центрально-Кавказский

Таблица 3. Средние значения степеней подобия между различными вариантами и подвариангами штаммов У. реяИз.

Подвиды У. pestis. pestis pestis pestis pestis altaica ulegeica hisserica caucasica

Варианты Песчаночий i >3 — "а ~ м О о — X Я Е Ъ (j Сусликовый Сурчиный Пищуховый Полевоче сурчиный Полевочий

Территориальное расположение Природные очаги Прикаспия >= 5 | < Ь 'i о — £ и ~ с. = и 2 ? О ^ Цсшралыю кавказский очаг Тувинский и забайкальский очаги Очаги Тянь-Шаня и Алая Горно-Алтайский природный очаг Монголия Гиссарский природный очаг Таласский природный очаг Дагестанский высокогорный природный очаг Закавкавказский высокогорный природный очаг

№№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 78,6 81,6 81,5 70,4 59,0 48,5 50,3 51,6 49,8 55.6

2 78,6 78,0 76,4 64,5 63,6 44,6 55,5 60,7 52.3 62,1

3 81.6 78,0 .НЮ 75,1 71,3 64,0 42,4 53,1 58,1 50.0 60,9

4 81,5 76,4 75,1 i» 80,2 64,2 53,7 54,3 55,4 58,5 53,2

5 70,4 64.5 1 71,3 80,2 70,7 51.2 56,7 58,1 56,5 49,3

6 59,0 63.6 64,0 64.2 70,7 Ш;>:: 48.8 77,0 72,4 57,1 61,9

7 48,5 44,6 42.4 53,7 51,2 48,8 1»! 64,0 56,3 57.2 51,5

8 50,3 55.5 53,1 54,3 56,7 77,0 64,0 'П'Ст 81,1 55,3 56,5

9 51,6 60,7 58,1 55,4 58,1 72,4 56,3 81,1 64,7 61,6

10 49,8 52,3 50,0 58,5 56,5 57,1 57,2 55,3 64,7 т 81,3

11 55,6 62,1 60,9 53,2 49,3 61,9 51,5 56,5 61,6 81,3 100

Примечание: "*" - включают равнинные, равнинно-предгорные и степные природные очаги Западного и Северного Прикаспия, а также природные очаги песчаночьего типа юго-¡ападной части Средней Азии.

Важным результатом, который мы хотим отметить в заключение, 1вляется то, что использованный нами подход поможет в решении проблемы 'атипичности" штаммов У. резИз, установления их генетической гринадлежности не только к виду У. ре$И5, но и к определенном}' диетическому варианту. При обнаружении новых очаговых территорий или внезапной эпизоотической активизации природного очага данный подход тозволит определить возможность заноса определенного геноварианта возбудителя чумы на территорию.

Исследования в этом направлении помогут не только усовершенствован схему внутривидовой дифференциации коллекционных и свежевыделенны> штаммов чумного микроба, но и, возможно, провести более объективную систематизацию природно-очаговых территорий.

Использование геномной дактилоскопии позволит определит! дополнительные критерии отбора типовых штаммов при подвидово! систематизации штаммов Y. pes lis и создаст экспериментальную базу дл; разработки системы молекулярно-эпидемиологического мониторинга.

ВЫВОДЫ

1. При анатизе двадцати четырех штаммов чумного микроба после коллекционного хранения в лиофилизированном состоянии выявлена нестабильность ряда микробиологических признаков, а именно фагочувствительности (1 штамм), зависимости от ионов Са*" (1 штамм) нитрификации (1 штамм), питательных потребностей (3 штамма) пигментации (4 штамма).

2. ЛПС-специфичный бактериофаг FP1 лизирует коллекционные штаммь }*. pestis независимо от места их выделения. Отмечень: температурозависимые различия в фагочувствительности тестируемые штаммов.

3. ПЦР-типирование коллекционных штаммов чумного микроба с использованием олигонуклеотидных праймеров на основе тандемны> повторов ДНК бактериофага М13 дает возможность дифференциации штаммов }". pestis от штаммов Г. pseudotuberculosis и Г. enterocolitica. Отличий штаммов }'. pestis различной подвидовой и природно-очаговой принадлежности по результатам ПЦР-типирования с использованием М13-праймеров не обнаружено.

4. На основе рестрикционного, гибридизационного и компьютерного аначиза ряда генетических зондов, используемых для идентификацш: чумного микроба (МК, IS 100, HRSIII/37), впервые выяатена общая нуклеотидная последовательность, на основе которой разработан низкомолекулярный (180 н.п.) генетический зонд, обозначенный "ВХ". Гибридизационный анализ с использованием ВХ-зонда дифференцирует штаммы }". pestis различной природно-очаговой принадлежности.

5. Приоритетные результаты по определению геномного полиморфизма штаммов Y. pestis из различных природных очагов с использованием сконструированного генетического зонда ВХ позволяют говорить о закрепленной на генетическом уровне эволюционной адаптации чумного микроба к определенном}' виду носителя.

6. Для интерпретации генодактилоскопических картин составлена генетическая формула, которая представляет собой буквенно-цифровое выражение совокупности гибридизационных полос на рестрикционных треках ДНК каждого штамма, разделенных по молекулярной массе на

зоны, обозначенные буквами, с цифровым обозначением гибридизационных полос внутри каждой зоны.

7. Результаты геномной дактилоскопии 70 коллекционных штаммов Г. />е.$/;'5 позволяют выделить семь генодактилоскопических вариантов чумного микроба, обозначенных нами: песчаночий, полевочий, пищуховый, сурчиный, сусликовый, полевоче-сурчиный, песчаночно-сусликовый.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горшков О.В., Пуденкова О.С., Плотников О.П.. Попов Ю.А., Солодовнико! Н.С. Характеристика типовых штаммов Yersinia peslis после коллекционного хранения различного срока // Проблемы общей биологии и прикладной генетики: Сб. трудов молодых ученых, Саратов, 1997. - Вып.1. - С. 33-34.

2. Горшков О.В., Савостина Е.П., Попов Ю.А., Плотников О.П. Геномна5 характеристика типовых коллекционных штаммов природных очагов чумы // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной науч. конфер., посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 30 ноября-1 декабря 1998 г.) / Под. ред. Е.В. Пименова, И.В. Дармова. - Киров: НИИ микробиологии МО РФ, 1998. - С. 76.

3. Горшков О.В., Савостина Е.П., Попов Ю.А., Шотников О.П. Сравнительное изучение структуры некоторых генетических зондов, используемых для типирования штаммов Yersinia pestis // Молектл. генетика. - 1999. - № 4. - С. 29-33.

4. Горшков О.В., Попов Ю.А., Плотников О.П., Виноградова H.A., Гремяковг Т. А.*, Савостина Е.П. Микробиологические свойства коллекционных штаммов Yersinia pestis // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Сборник тезисов докладов. Юбилейная научная конференция посвященная 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (14-15 декабря 1999 г., Оболенск). - Оболенск, 1999. - С. 48.

5. Савостина Е.П., Горшков О.В., Яшечкин Ю.И., Попов Ю.А., Плотников О. П. ПЦР-генетическое типирование представителей рода Yersinia // Scientific journal. - Ulaanbaatar, 1999. -№7. - С. 169.

6. Горшков O.B., Савостина Е.П., Попов Ю.А., Плотников О.П., Виноградова H.A., Солодовников Н.С. Генотипирование штаммов Yersinia pestis из различных природных очагов //Молекул, генетика. - 2000. -№3. - С. 12-17.

7. Горшков О.В., Савостина Е.П., Попов Ю.А., Шотников О.П. ДНК-зонд для типирования чумного микроба (ВХ-зонд) // Патент №2160779 RU, МПК C12N 15/31,' C12N 15/63, C12Q 1/68, С07К 14/24; Заявка № 99125600/13(027291); Заявлено 07.12.99; Опубл. 20.12.00; Бюл. изобретений. - 2000. - № 35.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность научным рз'ководителям моей кандидатской щссертации д.б.н., проф., Ю.А. Попову и д.м.н., с.н.с. О.П. Плотникову, за [робужденный во мне интерес к научному творчеству, за неоценимую помощь в ¡ыборе данного направления исследований, за ценные советы, за внимательное и 1перативное решешге проблем, возникавших по ход,' выполнения и написания [иссертащш.

С чувством особого удовольствия приношу искреннюю благодарность к.м.н., [.с. Е.П. Савостшгой за глубокую заинтересовашюсть к проблемам, освещенным в истоящем труде, за неоценимую помощь в выполнении исследований, за юстоянную заботу и внимание.

Выражаю искреннюю благодарность д.м.н., профессору, руководителю [аборатории аналитической микробиологии Научно-исследовательского института пидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Российской академии шдицинских наук д.м.н., профессору И.А. Шагиняну за глубокий анализ и высокую щенку нашей работы.

Выражаю глубокую признательность д.ф.-м.н., Dr. Habilit, профессор}- кафедры |птики Саратовского Государственного университета им. Н.Г. Чернышевского :.С. Ульянову за неоценимую консультативную помощь в проведешш тагистического анализа полученных результатов, за внимательное отношение и юложительную оценку нашей работы.

Считаю необходимым выразить признательность к.м.н., ведущему научному отрудшпу отдела микробиолопш чумы ГНЦГТМ Т. А. Гремяковой за предоставление [спользованных в дашюй работе литературных материалов и результатов обственных исследований.

Приношу искреннюю благодарность д.б.н., профессору Н.И. Смирновой за лубокий анализ и за высокую оценку нашей работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность оллективам лаборатории прикладной генетики и Государственной коллекции атогенных бактерий "Микроб", в особенности, лаборанту лаборатории прикладной енетики Т.Н. Каштановой и врачам-бактериологам ГКГТБ "Микроб" к.б.н. LA Виноградовой и к.м.н. Н.С. Солодовникову за помощь и ценные советы при ыполнении диссертационной работы.

Выражаю искреннюю признательность всем рецензентам настоящей работы за амечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде лучаев, помогли уточнить некоторые положения и формулировки.

Приношу глубокую благодарность В.А Пискунову и А.А Ивахненко, за еоценимую помощь в компьютерной обработке полученных данных и редостаатенную возможность поиска информации в сети Internet.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горшков, Олег Владимирович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ТАКСОНОМИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕШЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В ТАКСОНОМИИ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

2Л. Плазмидный анализ.

2.2. Рестрикционный анализ ДНК.

2.3. ДНК-и РНК-зондирование.

2.4. ПЦР-анализ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы бактерий, плазмиды и бактериофаги.

3.2. Питательные среды и условия культивирования бактерий.

3.3. Микробиологические методы.

3.4. Молекулярно-генетические методы.

Глава 4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ Y.PESTIS.

Глава 5. ДАКТИЛОСКОПИЯ ГЕНОМА ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА.

5.1. Геномная дактилоскопия коллекционных штаммов Y. pest is с использованием гипервариабельных последовательностей ДНК бактериофагаМ13.

5.2. Конструирование ДНК-зонда для внутривидовой дифференциации различных штаммов Y. pestis.

5.3 Геномная дактилоскопия коллекционных штаммов Y. pestis с использованием сконструированного ВХ-зонда.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Активизация в конце XX века ряда природных очагов чумы Африки, Азии, Америки и Европы послужила причиной увеличения заболеваемости людей бубонной и легочной формами данной инфекции, что указывает на нестабильность эпидемиологической обстановки (Онищенко с соавт., 1998 и др.). Возрастание числа эпидемических проявлений чумы позволяет говорить об актуальности изучения молекуляр-но-генетических основ патогенности Y. pestis, а также исследований, направленных на разработку новых критериев идентификации чумного микроба. В то же время необходимость создания эффективной системы молекулярно-эпидемиологического мониторинга природных очагов чумы также подтверждает перспективность поиска генетических маркеров штаммов Y. pestis различной природно-очаговой принадлежности.

Существование большого количества схем внутривидовой классификации Y. pestis, созданных, как правило, на основе результатов изучения фенотипа микроорганизма, свидетельствует об ограниченности подходов их построения, не позволяющих отразить генотипи-ческие особенности штаммов Y. pestis. Привлечение современных молекулярно-генетических методов исследования генома бактерий не только усовершенствует существующую внутривидовую систематику чумного микроба, но и позволит приблизиться к геносистематике возбудителя чумы.

Большинство традиционных методов идентификации бактерий основывается на регистрации фенотипических признаков, которые могут быть "метастабильны"1 (Головлев, 1998). Неоднородность спектра микробиологических свойств у популяций Y. pestis различной при-родно-очаговой принадлежности послужила причиной создания внутривидовой классификации чумного микроба (Devignat R., 1951; Туманский, 1957; Тимофеева, 1972; Пейсахис, Сте

1 "Фенотипическая изменчивость бактерий в рамках постоянного по хранимой информации генотипа", которая "генерируется бактериями как способ адаптации к нестабильной среде и является результатом специфической формы отбора" (Головлев, 1998). 7 панов, 1975; Пейсахис с соавт., 1975; Классовский, Степанов, 1975 и др.). Однако, многочисленные случаи выделения "атипичных" штаммов Y. pestis (Классовский, Петров, 1970; Гольдфарб с соавт., 1971; Пейсахис с соавт., 1971; Бибикова с соавт., 1972; Шаманек с соавт., 1976; Мартиневский с соавт., 1984; Темиралиева с соавт., 1978 и др.) и возможность циркуляции штаммов возбудителя чумы между природно-очаговыми территориями (Щепотьев с соавт., 1979 и др.) свидетельствуют о существовании фенотипических отклонений, не учитываемых в схемах внутривидовой классификации Y. pestis, что может вызывать затруднение в определении подвидовой принадлежности свежевыделенных штаммов. Актуальность вопроса о формах сохранения возбудителя чумы в межэпизоотический период (Домарадский с соавт., 1995; Султанов, Козлов, 1998; Солдаткин, Иванов, 1980), а также выделение в природных очагах чумы штаммов Salmonella, фенотипически сходных по признаку бактериоци-ногении со штаммами Y. pestis (Стручкова, 1997) подтверждают необходимость поиска дополнительных критериев идентификации чумного микроба.

Нестабильность и неоднородность микробиологических признаков возбудителя чумы требуют привлечения большого количества микробиологических и иммунохимических методов для идентификации различных штаммов чумного микроба. Все вышеперечисленное является весомым аргументом для поиска новых критериев типирования штаммов Y. pestis, основанных не только на регистрации фенотипических признаков, но и на выявлении различий в структуре генома микроорганизма.

Генетические методы, используемые в систематике бактерий (Леванова, Блохина, 1987), такие как определение нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК-гибридизация, широко используются для геносистематики различных групп организмов, но все же недостаточны для решения вопросов внутривидовой систематики возбудителя чумы из-за высокой степени гомологии полинуклеотидных последовательностей ДНК штаммов Y. pestis различных подвидов (Балахонов, 1987). 8

Одно из перспективных направлений исследования генетической организации Y. pestis — дактилоскопия, основанная на изучении геномного полиморфизма. Аналогичный подход успешно используется на моделях таких возбудителей инфекционных заболеваний, как Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Moraxella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Listeria spp. (Grothues, 1989) и других. На модели возбудителя чумы работы по молекулярно-генетическому типированию штаммов Y. pestis единичны и не реализуют потенциал метода.

В подтверждение актуальности настоящего исследования, следует также отметить, что на проходившей в марте 1998 года (Атланта, США) международной конференции по инфекционным заболеваниям рассматривался вопрос о расширении критериев лабораторной диагностики чумы, для решения которого была создана рабочая группа с целью разработки рекомендаций для молекулярного типирования штаммов Y. pestis с помощью методов моле-кулярно-генетического анализа (Chu, 1998).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в выявлении полиморфизма геномов штаммов Y. pestis различной природно-очаговой принадлежности методами геномной дактилоскопии. ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести анализ паспортных данных штаммов чумного микроба, выделенных из различных природных очагов, и проверить стабильность микробиологических признаков выбранных штаммов в процессе коллекционного хранения.

2. Осуществить ПЦР-типирование природных штаммов чумного микроба различных подвидов с использованием праймеров, созданных на основе нуклеотидных последовательностей, фланкирующих тандемные повторы ДНК бактериофага М13.

3. Сравнить нуклеотидные последовательности генетических зондов, используемых для идентификации чумного микроба, и сконструировать ДНК-зонд на основе нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК Y. pestis для типирования штаммов возбудителя чумы различной природно-очаговой принадлежности. 9

4. Изучить геномный полиморфизм штаммов Y. pestis из различных природных очагов с использованием сконструированного генетического зонда и выяснить возможность использования этого критерия для таксономии чумного микроба.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показана возможность межвидовой дифференциации патогенных представителей рода Yersinia путем ПЦР-типирования с праймерами, сконструированными на основе нуклеотидных последовательностей, фланкирующих гипервариабельные последовательности ДНК бактериофага М13.

Впервые установлено, что генетические зонды, используемые для идентификации чумного микроба - HRSIII/37; зонд на основе ISiOO-элемента и МК-зонд - имеют в своем составе идентичную по составу нуклеотидную последовательность, размером 180 bp. Обнаруженная нуклеотидная последовательность послужила основой нового генетического зонда, обозначенного "ВХ", позволяющего эффективно проводить типирование штаммов Y. pestis различной природно-очаговой принадлежности.

Получены приоритетные данные по зависимости полученных генодактилоскопических картин штаммов Y. pestis от определенного вида носителя, в популяции которого они циркулируют. Установленные закономерности позволяют говорить о закреплении на генетическом уровне эволюционной адаптации возбудителя чумы к организму грызунов и зайцеобразных.

На основе фингерпринтного анализа предложена оригинальная схема дифференциации коллекционных штаммов Y. pestis на семь генодактилоскопических вариантов, сопряженных с приуроченностью штаммов к конкретным природным очагам.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Сконструирован ДНК-зонд, позволяющий эффективно проводить внутривидовое типирование штаммов Y. pestis, выделенных из различных природных очагов.

Штамм Е. coli HBlOlpBX (KM 145) - источник ДНК-зонда ВХ депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб".

10

На основе результатов проведенных исследований оформлен патент (№2160779) "ДНК-зонд для типирования чумного микроба (ВХ-зонд)".

Геномная дактилоскопия с использованием ВХ-зонда рекомендована нами в качестве одного из дополнительных критериев классификации возбудителя чумы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на: совместном Американо-Российском семинаре в USAMRIID (Форт Детрик, США, 1997); юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998); научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); юбилейной научной конференции посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (Оболенск, 1999 г); итоговой научной конференции РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 210 цитируемых работ, из них 76 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 136 страниц. Текст иллюстрирован 13 таблицами и 19 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Горшков, Олег Владимирович

117 ВЫВОДЫ

1. При анализе двадцати четырех штаммов чумного микроба после коллекционного хранения в лиофилизированном состоянии выявлена нестабильность ряда микробиологических признаков, а именно: фагочувствительности (1 штамм), зависимости от ионов Ca (1 штамм), нитрификации (1 штамм), питательных потребностей (3 штамма), пигментации (4 штамма).

2. ЛПС-специфичный бактериофаг FP1 лизирует коллекционные штаммы Y. pestis независимо от места их выделения. Отмечены температурозависимые различия в фагочувствительности тестируемых штаммов.

3. ПЦР-типирование коллекционных штаммов чумного микроба с использованием оли-гонуклеотидных праймеров на основе тандемных повторов ДНК бактериофага М13 дает возможность дифференциации штаммов Y. pestis от штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Отличий штаммов Y. pestis различной подви-довой и природно-очаговой принадлежности по результатам ПЦР-типирования с использованием М13-праймеров не обнаружено.

4. На основе рестрикционного, гибридизационного и компьютерного анализа ряда генетических зондов, используемых для идентификации чумного микроба (МК, IS 100, HRSIII/37), впервые выявлена общая нуклеотидная последовательность, на основе которой разработан низкомолекулярный (180 н.п.) генетический зонд, обозначенный "ВХ". Гибридизационный анализ с использованием ВХ-зонда дифференцирует штаммы Г. pestis различной природно-очаговой принадлежности.

5. Приоритетные результаты по определению геномного полиморфизма штаммов Y. pestis из различных природных очагов с использованием сконструированного ге

119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неблагоприятная эпидемиологическая обстановка в мире по заболеваемости чумой (Онищенко с соавт., 1998 и др.) актуализирует проблему создания эффективной системы молекулярно-эпидемиологического мониторинга природных очагов чумы и подтверждает перспективность разработки новых критериев идентификации чумного микроба и поиска генетических маркеров штаммов Y. pestis различной природно-очаговой принадлежности.

Активное внедрение в практику таксономии и систематики микроорганизмов, современных молекулярно-генетических методов позволяет исследовать геном бактерий в его целостности, что является наиболее информативным по сравнению с методами изучения фенотипа. Использование данных подходов для анализа внутривидовой систематики возбудителя чумы с позиций природной очаговости перспективно в плане получения не только более объективной информации по систематизации природных очагов чумы, но и оригинальных данных по генетической изменчивости чумного микроба в организме различных носителей. Исходя из актуальности, цель настоящей работы состояла в выявлении полиморфизма геномов штаммов Y. pestis различной природно-очаговой принадлежности методами геномной дактилоскопии.

В работе были использованы природные штаммы Y. pestis, находящиеся на коллекционном хранении в лиофилизированном состоянии в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (Саратов). Известно, что в процессе коллекционного хранения бактериальная клетка фенотипически нестабильна, например, любой вид консервации индуцирует мутации у микроорганизмов, связанные с дегидратацией биомакромолекул (Сидякина, 1985; Имше-нецкий с соавт., 1982). Учитывая данный аспект, нами была проведена проверка микробиологических свойств отдельных штаммов возбудителя чумы после коллекционного хранения и сравнение полученных данных с паспортными характеристиками (см. главу 4). Результаты проведенного анализа свидетельствуют об изменении некоторых фенотипических при

112 знаков, а именно: фагочувствительности, зависимости роста клеток штаммов чумного микроба от ионов кальция, пигментации, нитрификации и питательных потребностей. Выявленные факты несоответствия с паспортными данными указывают на неоднородность популяции клеток некоторых штаммов возбудителя чумы при подготовке к лиофилизации, что свидетельствует о необходимости тестирования основных фенотипических свойств коллекционных штаммов Y. pestis в процессе хранения. Отметим, что изучение биологических свойств 42 штаммов возбудителя чумы основного подвида (Захлебная, 1988), лио-фильно высушенных при использовании в разных сериях семи стабилизаторов (сахарозо-желточный агар, сыворотка, молоко, желатин, молоко с лактозой, желатин с лактозой) показало, что ферментативная активность в отношении Сахаров, спиртов, способность восстановления нитратов в нитриты, фаголизабельность, наличие фракции I являются стабильными признаками и сохраняются независимо от состава сред высушивания. В отличие от данных О.Д. Захлебной (1988), мы выявили нестабильность чумного микроба после коллекционного хранения в лиофилизированном состоянии по признакам фагочувствительности и нитрификации-денитрификации. Исходя из вышеизложенного, очевидна необходимость совершенствования и поиска новых антиоксидантов сред стабилизации для коллекционного хранения микроорганизмов, которые позволят снизить уровень и степень изменчивости микробиологических признаков в процессе хранения.

Проверка пригодности использования ЛПС-специфичного бактериофага FP1 (Schmidt, Luderitz, 1969) для дифференциации штаммов Y. pestis различной природно-очаговой принадлежности не позволила выявить корреляцию фагочувствительности штаммов и места их выделения. Однако выявлены некоторые различия в уровне фагочувствительности тестируемых штаммов, выращенных при различных температурах, выяснение причин которых заслуживает дальнейших исследований.

Лабильность и неоднородность микробиологических признаков популяций чумного микроба как на одной природно-очаговой территории, так и на разных, в совокупности с

113 полученными данными нестабильности фенотипа в процессе коллекционного хранения являются обоснованием для интенсификации поиска новых критериев идентификации штаммов возбудителя чумы, основанных не только на регистрации фенотипических признаков, но и на изучении полиморфизма генома микроорганизма.

Принимая вышеизложенное во внимание, следующим этапом нашей работы был поиск и создание наиболее эффективного генетического инструмента для изучения штаммов Y. pestis, выделенных из различных природных очагов.

Использованный нами подход ПЦР-типирования (см. главу 5.1) с праймерами, сконструированными на основе нуклеотидных последовательностей, фланкирующих тандемные повторы бактериофага М13, не позволил выявить различия между 24 штаммами Y. pestis пяти подвидов различного природно-очагового происхождения, но дал возможность проведения межвидовой дифференциации патогенных представителей рода Yersinia: Y. pseudotuberculosis (VI серовар) и Y. enterocolitica И-27. На наш взгляд, проведение дополнительных исследований в данном направлении перспективно для создания экспресс-метода по видоидентификации представителей рода Yersinia.

Использование различных ДНК-зондов (на основе IS- и HRS-элементов) для решения поставленной проблемы - типирования штаммов Y. pestis различного происхождения - послужило причиной проведения их сравнительного изучения, а именно: ДНК-зонда, полученного на основе IS/00-элемента (Бобров, Филиппов, 1997), HRSIII/37-зонда (Можаров с соавт., 1997) и видоспецифического МК-зонда (Норкина с соавт., 1993) с использованием рестрик-ционного, гибридизационного и компьютерного анализов (см. главу 5.2). В результате проведенной работы была обнаружена общая нуклеотидная последовательность размером 180 н.п., обозначенная ВХ-зондом и являющаяся ответственной за специфичность картин гибридизации у штаммов Y. pestis, различного природно-очагового происхождения. Выявленный фрагмент ДНК был клонирован в векторную плазмиду pUC19. Рекомбинантная ДНК, состоящая из векторной плазмиды и фрагмента хромосомной ДНК чумного микроба, обо

114 значена рВХ и трансформирована в штамм Е. coli НВ101. Оригинальность сконструированного генетического зонда ВХ подтверждена патентом "ДНК-зонд для типирования чумного микроба (ВХ-зонд)" № Гос. регистрации 99125600/13(027291), положительное решение Федерального института промышленной собственности о выдаче патента от 20.06.2000.

При рассмотрении полученных нами экспериментальных материалов по генодакти-лоскопическому изучению 70 штаммов Y. pestis из 26 природных очагов России и сопредельных государств с использованием сконструированного низкомолекулярного ВХ-зонда привлекает внимание тот факт, что минимальное количество гибридизационных полос характерно для штаммов Y. pestis, выделенных в Монголии (14-15); максимальное (до 31) -для представителей равнинных, равнинно-предгорных и степных очагов Прикаспия, а также очагов Средней Азии (см. главу 5.3). Возрастание количества гибридизационных сигналов, возможно, связано с интенсивными структурными перестройками генома возбудителя чумы, которые сопряжены с увеличением числа копий нуклеотидной последовательности, используемой нами в качестве генетического зонда. С нашей точки зрения, данный процесс связан с механизмами адаптации чумного микроба к особенностям метаболизма носителя.

Для облегчения интерпретации полученных данных совокупность гибридизационных полос для каждого штамма разделена по молекулярной массе на зоны, обозначенные буквами, а внутри каждой зоны отдельная полоса имеет цифровое обозначение. В итоге, каждый штамм характеризуется буквенно-цифровым выражением, или генетической формулой, например:

GFEeoRI: Аю Вю-70 C2o,40-60 Di0,20,40,60-80 Е., где "GF" - genetic formula, "ЕсоШ" - используемая в работе рестриктаза, "А, В, С, D, Е" - зоны, "10,20,30 ." - номера гибридизационных полос. Размеры молекул ДНК в каждой зоне находятся ориентировочно в диапазонах: А - 1 -2 kb, В - 2-3 kb, С - 3-5 kb, D - 5-8 kb, Е - 8-23 kb.

Важно отметить, что местоположение почти 80 % гибридизационных сигналов, выявленных у штаммов Y. pestis из Монголии, идентично у штаммов возбудителя чумы, выде

115 ленных из других природных очагов. Возможное объяснение этого феномена состоит в том, что монгольские штаммы чумного микроба, циркулирующие в популяциях пищух на территории МНР, являются эволюционно наиболее "древним" вариантом возбудителя чумы, от которого возникали, при попадании в организм новых носителей, другие генетические варианты Y. pestis.

На данном этапе исследований нами предварительно выделено семь "генодактилоскопических" вариантов чумного микроба сопряженных с определенным видом носителей. Мы считаем целесообразным использование выявленной закономерности в качестве одного из элементов молекулярно-эпидемиологического мониторинга природных очагов чумы.

В связи с полученными результатами, очевидна актуальность и перспективность проведения исследований по изучению геномного полиморфизма штаммов Y. pestis из различных природных очагов России и сопредельных государств, в большинстве случаев недоступных для исследований зарубежными учеными.

В свете полученных данных особого внимания заслуживают итоги исследований зарубежных авторов, посвященных выяснению эволюционной близости представителей рода Yersinia и "микроэволюции" штаммов Y. pestis различных биоваров с помощью современных методов молекулярно-генетического анализа (ПЦР-типирование, генное зондирование, рестрикционный анализ). В частности, в работе М. Achtman et al. (1999), были представлены результаты изучения 49 штаммов Y. pestis трех биоваров (antiqua, medievalis, orientalis), выделенных на территории различных стран мира. Авторами при изучении структурной целостности вида Y. pestis был использован метод рестрикционного анализа и генного зондирования, где в качестве молекулярного зонда применяли нуклеотидную последовательность /5100-элемента, размером 225 bp. Гибридизацию проводили с .ЁсоЫ-рестриктами хромосомной ДНК штаммов Y. pestis. При этом М. Achtman et al. (1999) на молекулярно-генетическом уровне подтверждают существование трех биоваров, из которых биовар medievalis и antiqua являются наиболее эволюционно "древними", при этом биовар medievalis

116 берет начало на территории Центральной Азии. Интересен факт, что использованный нами ВХ-зонд и ДНК-зонд из работы М. Achtman et al. (1999) имеют 100 % гомологию по данным сравнения их секвенсов.

Обобщая изложенный материал, следует отметить, что только совокупный анализ данных по генетическому сходству штаммов Y. pestis различного происхождения, полученных за рубежом и отечественными авторами, позволит создать целостную картину эволюционных взаимоотношений между представителями не только рода Yersinia, но и отдельно взятого вида, в конкретном случае - Y. pestis.

Важным результатом, который мы хотим отметить в заключение, является то, что использованный нами подход поможет в решении проблемы "атипичности" штаммов Y. pestis, установления их генетической принадлежности не только к виду Y. pestis, но и к определенному генетическому варианту. При обнаружении новых очаговых территорий или внезапной эпизоотической активизации природного очага данный подход позволит определить возможность заноса определенного геноварианта возбудителя чумы на территорию.

Исследования в этом направлении помогут не только усовершенствовать схему внутривидовой дифференциации коллекционных и свежевыделенных штаммов чумного микроба, но и, возможно, провести более объективную систематизацию природно-очаговых территорий.

Использование геномной дактилоскопии позволит определить дополнительные критерии отбора типовых штаммов при подвидовой систематизации штаммов Y. pestis и создаст экспериментальную базу для разработки системы молекулярно-эпидемиологического мониторинга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горшков, Олег Владимирович, Саратов

1. Авдеева Н.Г., Карасева З.Н., Солодовников Н.С. Характеристика природного штамма чумного микроба М-777 по признаку пигментсорбции // Микробиол., лаб. диагностика и специфич. профилакт. карантинных инфекций. Саратов, 1989. - С. 18-21

2. Анисимов П.И., Можаров О.Т. К вопросу о таксономии чумного микроба // Мол. биология и микробиол. особо опасных инфекций. Саратов, 1986. - С. 3-14

3. Анисимов П.И., Попов Ю.А., Кокушкин A.M. Генетические исследования возбудителя чумы в практике противочумной работы // Генетика. 1996. - Т. 32, № 6. - С. 725-729

4. Арыкпаева У.Т. Потребности в факторах роста при 37° С у бактерий чумы из разных природных очагов СССР // Пробл. особо опасных инфекций. 1979. - Вып. 3(67). - С. 64-65

5. Балахонов С.В. Молекулярно-биологические критерии геномной близости в систематике бактерий рода Yersinia: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1987. - 21с.

6. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов Центрально-Азиатской зоны природной очаговости чумы // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1989. - № 4. - С. 39-42.

7. Балахонов С.В., Цэнджав С., Эрдэнбат А. Новые плазмидовары штаммов возбудителя чумы, изолированных в Монголи // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1991. - № 11. - С/ 27-29120

8. Берлин A.JI., Борзенков А.К. Рамнозопозитивные варианты и дифференциально-диагностическое значение среды с рамнозой // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. 1938. - Т. 17, вып. 3-4. - С. 238-246

9. Бессонова А.А. О двух разновидностях В. pestis, обнаруживаемых при росте на глицериновых средах // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. 1928. - Т. 7, вып. 3. -С. 250-253

10. Бибикова В.А., Классовский Л.Н., Пейсахис Л.А., Хрусцелевский В.П. К эпизоотологической оценке атипичных форм возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций. 1972. - Вып. 4(26). - С. 5-10

11. Бобров А.Г., Филиппов А. А. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1997. - № 2. - С. 36-40

12. Булат С.А., Кобаев O.K., Мироненко Н.В., Ибатуллин Ф.М., Лучкина Л.А., Суслов А.В. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. 1992. - Т. 28. - С. 19-28

13. Вершинина Т.И. О популяционной гетерогенности возбудителя чумы из природных очагов

14. Горного Алтая и Северо-Западной Монголии // Автореф. дисс. канд. мед. наук. Саратов, 1986. - 16с.

15. Головлев Е.Л. О старых проблемах новой систематики бактерий // Микробиология. 1998. -Т. 67, №2.-С. 281-286121

16. Гремякова Т.А., Волковой К.И., Шайхутдинова Р.З., Степанов А.В. Температурозависимые изменения иммунохимических свойств ЛПС Yersinia pestis II Вестник РАМН. 1999. - № 12. - С. 32-34

17. Григорьев М.П. Анализ популяционной структуры носителей в Центрально-Кавказском природном очаге чумы: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ставрополь, 1998. - 23с.

18. Диханов Г.Г., Подладчикова О.Н. Родоспецифический ДНК-зонд для детекции иерсиний // Мол. биология. 1990. - Т. 24, вып. 4. - С. 1010-1016

19. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы Саратов, 1993. -130 с.

20. Домарадский И.В., Мединский Г.М., Мишанькин Б.Н., Сучков Ю.Г. Проблема природной очаговости чумы: поиск путей её решения // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 1995. -№ 4. - С. 3-9

21. Дроздов А.В., Можаров О.Т., Анисимов П.И. Выявление высокоповторяющихся последовательностей ДНК в геноме чумного микроба // Мол. биология и микробиол. природно-очаговых инфекций. Саратов, 1986. - С. 71-78122

22. Дурихин К.И., Сурнина Н.С., Попова А.Е., Быкова О.И. Принципы конструирования питательной среды без гемина для определения Р+ детерминанта вирулентности // Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции. Волгоград, 1980. - С. 29-30

23. Елкин Ю.М., Розанова Г.Н., Осипова С.П., Грамотина Л.И., Лалазарова И.Г., Галоян В.О. Изменение свойств чумного микроба при пассировании через организм обыкновенных полевок // Пробл. особо опасных инфекций. 1978. - Вып. 4(62). - С. 16-20

24. Захлебная О.Д. Сохранение микроорганизмов I-II групп патогенности в коллекции музея -Иркутск, 1988. 12с.

25. Иванов П.Л. Геномная дактилоскопия: гипервариабельные локусы и генетическое маркирование // Мол. биология. 1989. - Т. 23, вып. 2. - С. 341-346

26. Иванов П.Л., Вербовая Л.В., Рысков А.П., и др. Геномный полиморфизм у диссоциативных форм Bacillus subtilis (Mesentericus) 76. Идентификация диссоциантов методом геномной "дактилоскопии" // Мол. биология. 1990. - Т. 24, № 2. - С. 560-565

27. Имшенецкий А.А., Лысенко С.В., Писаренко Н.Ф. О некоторых особенностях микроорганизмов, подвергнутых действию вакуума // Микробиология. 1982. - Т. 51, вып. 1.-С. 107-110

28. Калабухов Н.И., Ладыгина Н.М. Возникновение эколого-физиологических особенностей у млекопитающих под воздействием внешней среды // Зоологический журнал. 1953. - Т. 32, вып. 2. - С. 294-299

29. Калабухов Н.И., Пряхин В.А. Некоторые эколого-физиологические особенности песчанок: гребенщиковой (Meriones tamariscinus Pall.) и полуденной (Pallasiomys meridianus Pall.) // Зоологический журнал. 1954. - Т. 33, вып. 4. - С. 889-903

30. Калакуцкий Л.В., Сидякина Т.М. Анабиоз и консервация микроорганизмов // Криобиология. 1988. - № 4. - С. 3-9

31. Классовский Л.Н., Мартиневский И.Л., Степанов В.М. О факторах роста штаммов бактерий чумы, выделяемых на Закавказском нагорье от полевок и их блох // Пробл. особо опасных инфекций. 1972. - Вып. 1(23). - С. 186-188

32. Классовский Л.Н., Петров B.C. О классификации проявлений изменчивости возбудителя чумы на экологической основе // Пробл. особо опасных инфекций. 1970. - Вып. 5(15). - С. 5-11

33. Классовский Л.Н., Степанов В.М. К вопросу о систематическом положении бактерий чумы из Закавказского горного очага // Пробл. особо опасных инфекций. 1975. - № 1. - С. 45-49123

34. Классовский Л.Н., Степанов В.М. К методике определения характера потребностей в факторах роста у аксотрофных мутантов возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций. 1973. - Вып. 2(30). - С. 86-87

35. Классовский Л.Н., Степанов В.М., Шмутер М.Ф., Шаманек Т.П., Кондратьева О.В. О некоторых особенностях питания аргининзависимых форм возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекции. 1976. - Вып. 3(49). - С. 5-7

36. Козлов М.П. К вопросу об автономности природных очагов чумы // Пробл. особо опасных инфекций. 1973. - Вып. 6(34). - С. 5-9

37. Краев А.С. Простая система клонирования в фаге М13 и секвенирования ДНК с терминаторами // Мол. биология. 1988. - Т. 22, вып. 5. - С. 1164-1197

38. Леванова Г.Ф., Блохина И.Н. Применение основных критериев геносистематики к некоторым конкретным таксономическим группам бактерий // Биохимия и биофизика микроорганизмов (Межвузовский сборник). Горький, 1987. - С. 82-92

39. Леви М.И. Классификация разновидностей возбудителя чумы // Тез. докл. науч. конф. по природн. очаговости и профилактике чумы и туляремии (30 октября 2 ноября 1962 г.). -Ростов-на-Дону, 1962. - С. 72-74

40. Любищев А.А. О некоторых новых направлениях в математической таксономии // Журн. общей биологии. 1966. - Т. 27, № 6. - С. 688-696

41. Малафеева Л.С. Опыт установления связей между некоторыми эколого-физиологическими особенностями грызунов и степенью их резистентности к чуме на примере полуденных и гребенщиковых песчанок // Труды ин-та «Микроб». Саратов, 1959. - Вып. 3. - С. 242-250

42. Малафеева Л.С. Сезонные изменения восприимчивости к чуме полуденных и гребенщиковых песчанок // Труды ин-та «Микроб». Саратов, 1959. - Вып. 3. - С. 235-241124

43. Малинина З.Е., Акимович В.В., Гольдфарб J1.M., Земцова И.Н., Кузнецова Л.И. Изучение вирулентных свойств "атипичных" штаммов чумного микроба // Пробл. особо опасных инфекций. 1973. - Вып. 6(34). - С. 58-63

44. Маниатис Т.,Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование М.: Наука. - 1984. -479с.

45. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов М.: Медицина, 1969. - 295с.

46. Мартиневский И.Л. Таксономия рода Yersinia. Сообщение 1-3 // Матер. IV науч. конф. по природным очагам чумы. 1965. - С. 142-148

47. Мартиневский И.Л., Вашуркина Т.В., Кантарбаева М.К. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных в некоторых участках Среднеазиатского пустынного очага // Актуальные вопросы лаб. диагностики и биохимии возбудителей чумы и холеры. 1984. -С. 27-30

48. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов Нукус: Каракалпакстан, 1990. -152с.

49. Международный кодекс номенклатуры бактерий. М.: Наука, 1978. - 208с.

50. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхарда и др. Пер. с англ. под ред. Е.Н. Кондратьевой и Л.В. Калакуцкого, М.: Мир, 1984. Т.З. - 264с.

51. Михайлова Р.С. Характеристика свойств и классификация штаммов чумного микроба, выделенных на Кавказе: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1968 - 20 с.

52. Можаров О.Т. Оптимизация выделения собственных плазмид чумного микроба // Мол. биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций. 1982. - Ч. 1. - С. 48-49

53. Можаров О.Т., Савостина Е.П., Анисимов П.И., Солодовников Н.С. Выявление высокоповторяющихся последовательностей чумного микроба в плазмидных репликонах125

54. Yersinia pestis И Матер, науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сентября 1997 г.). Саратов, 1997. - Т. 2, - С. 92

55. Можаров О.Т., Савостина Е.П., Анисимов П.И., Солодовников Н.С., Балахонов С.В., Айкимбаев A.M. Высокоповторяющиеся элементы генома возбудителя чумы // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1997. - № 1. - С. 26-30

56. Монахова Е.В., Власов В.П., Москвитина Э.А., Алексеенко В.В. Перспективы применения геномной дактилоскопии в изучении возбудителя холеры // Матер. Рос. науч. конф. -Ростов-на-Дону, 1992. С. 100-103

57. Муйншан Ц., Зейнхе Ц., Цунхуа Ч., Йуншан X., Гуэйвин Ч. Плазмидный профиль штаммов Y. pestis в различных природных очагах чумы КНР // ЖМЭИ. 1993. - № 2. - С. 27-31

58. Навашин С.М., Шендеров Б.А. Современные принципы и методы изучения таксономии и идентификации микроорганизмов // ЖМЭИ. 1987. - № 12. - С. 88-93

59. Надирова И.М. Некоторые Пробл. современной таксономии бактерий // Усп. микробиологии. 1970. - №6. - С. 86-127

60. Наставление по изучению свежевыделенных штаммов возбудителя чумы Алма-Ата, 1972.-36с.

61. Некипелов Н.В. Эпизоотология чумы в Забайкалье и Монголии // Докл. . докт. биол. наук. Москва, 1962 - 42 с.

62. Нерсесов В, Цихистави Ш.Г. О механизме существования Yersinia pestis в природе // ЖМЭИ.- 1997.-№ 1.-С. 102-106

63. Норкина О.В., Куличенко А.Н., Шовадаева Г.А., Бошнаков Р.Х., Аксенов М.Ю., Попов Ю.А. и др. Конструирование видоспецифичного для Yersinia pestis хромосомного ДНК-зонда// Генетика. 1993. - Т. 29, № 3. - С. 417-422.126

64. Носкова Н.В., Андреева Г.С., Леванова Г.Ф. Таксономическое изучение представителей рода Yersinia II Биохимия и биофизика микроорганизмов. 1987. - С. 57-62

65. Определитель бактерий Берджи / Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса, 9 изд., Пер. с англ., под ред. Г.А. Заварзина. М.: Мир, 1997. - Т.1. -432с.

66. Орешкова С.Ф., Манохина О.В., Пучкова Л.И., Репин В.Е., Ильичев А.А. Идентификация и паспортизация штаммов микроорганизмов методом геномной дактилоскопии с использованием биотинилированной ДНК фага М13 // Генетика. 1996. - Т. 32, № 6. -С. 740-743

67. Пейсахис Л.А., Степанов В.М. Внутривидовая классификация возбудителя чумы по принципу географического районирования // Пробл. особо опасных инфекций, 1975. - №2.- С. 5-9

68. Пейсахис Л.А., Степанов В.М. Некоторые итоги изучения потребностей в факторах роста штаммов возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций. 1978. - Вып. 5(63). - С. 13-16

69. Пейсахис Л.А., Степанов В.М., Ларионов Г.М. Об экотипах возбудителя чумы в Среднеазиатском пустынном природном очаге // Пробл. особо опасных инфекций. 1975. -Вып. 1(41).-С. 23-27

70. Пейсахис Л.А., Степанов В.М., Пошевина Г.О. О глицериннегативных штаммах возбудителя чумы в Среднеазиатском пустынном очаге // Пробл. особо опасных инфекций. -1971. Вып. 4 (20). - С. 28-32

71. Петров П.А., Дятлов А.И., Голубев П.Д., Пшихачев Х.Х. Современный ареал и пространственная структура поселений горного подвида малого суслика на Центральном Кавказе // Пробл. особо опасных инфекций. 1979. - Вып. 4(68). - С. 17-21

72. Пехов А.П. Плазмиды бактерий М.: Медицина, 1986. - 224с.127

73. Положение о музеях живых культур противочумных институтов и станций Министерства здравоохранения СССР. Саратов, 1980. - 16с.

74. Попов Н.В., Варшавский Б.С. Активность природных очагов чумы на территории СНГ // Пробл. особо опасных инфекций. 1993. - № 3. - С. 3-15

75. Попов Ю.А. Конструирование и использование ДНК-зондов на представителях рода Yersinia II Генетика, микробиол. и совершенствование методов лаб. диагностики особо опасных инфекций. Саратов, 1991. - С. 3-13

76. Попов Ю.А. Структурная и функциональная организация плазмид и генно-инженерные разработки на этой модели: Дис. . докт. биол. наук. Саратов, 1991. - 248с.

77. Просняк М.И., Картель Н.А., Перебитюк А.Н., Лимборская С.А., Рысков А.П. Неизотопный вариант геномной "дактилоскопии", основанной на ДНК фага М13, в анализе родства у человека // Генетика. 1990. - Т. 26, № 1. - С. 134-136

78. Ралль Ю.М. Природная очаговость и эпизоотология чумы. М.: Медицина, 1965. - 363с.

79. Ригер Р., Михаэлис А. Генетический и цитогенетический словарь М.: Колос, 1967 - 607 с.

80. Розанова Г.Н., Лалазарова И.Г., Елкин Ю.М., Свешникова Л.П. Потребности в факторах роста чумного микроба из Закавказского нагорья // Пробл. особо опасных инфекций. -1976. Вып. 3(49). - С. 8-11

81. Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Сучков И.Ю. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Francisella tularensis с использованием неспецифических праймеров // Биотехнология. 1993. - № 6. - С. 8-10

82. Руководство по профилактике чумы / Под редакцией А.В. Наумова и Л.В. Самойловой. -Саратов, 1992. 275с.

83. Рысков А.П., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И., Иванов П.Л., Лимборская С.А. Геномная «дактилоскопия» организмов различных таксономических групп: использование в128качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13 // Генетика. 1988. - Т. 24, № 2. - С. 227-238

84. Рысков А.П., Фаизов Т.Х., Алимов A.M., Романова Е.А. Геномная "дактилоскопия": новые возможности в определении видовой принадлежности бруцелл // Генетика. -1990. Т. 26, № 1.- 1990.-С. 130-133

85. Сагимбеков У.А., Рахимов К.Р. О выделении лейцинзависимых штаммов чумного микроба из Саксаулдалы // Микробиол., лаб. диагностика и специфич. профилакт. карантинных инфекций. Саратов, 1989. - С. 102-105

86. Ю5.Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов. Консервация генетических ресурсов // Науч. центр биологических исследований АН СССР. Пущино, 1985. - 63с.

87. Юб.Слудский А. А. Природные очаги чумы полевочьего типа (структура и функционирование): Автореф. дис. докт. биол. наук. Саратов, 1998. - 43с.

88. Смирнов Е.С. Таксономический анализ рода // Журн. общей биологии. 1960. - Т. 21, вып. 2.-С. 89-103.

89. Солдаткин И.С., Иванов В.А. Современное состояние и перспективы изучения проблемы сохранения чумного микроба в межэпизоотический период // Пробл. природной очаговости чумы. 1980. - Ч. 2. - С. 19-20

90. Степанов В.М., Классовский Л.Н., Мартиневский И.Л. О мутантах с пониженными потребностями в факторах роста штаммов возбудителя чумы из Закавказского нагорья // Пробл. особо опасных инфекций. 1972, вып. 5(27). - С. 143-146

91. Ю.Степанов В.М., Пак Г.Ю., Мартиневский И.Л. Региональные референтные штаммы чумы для природных очагов Средней Азии и Казахстана // Микробиол., лаб. диагностика и специф. профилактика карантинных инфекций. Саратов, 1989. - С. 97-102

92. Ш.Стручкова О.В. Биология сальмонелл, продуцирующих пестициноподобный бактериоцин: Автореф. дис. канд. мед. наук. Алма-Ата, 1997. - 22с.

93. Султанов Г.В., Козлов М.П. Современные взгляды на изучение энзоотии чумы: гипотезы и факты // ЖМЭИ. 1998. - № 3. - С. 115-119129

94. Суров B.C., Тараненко Т.М. Сравнительное исследование липополисахаридов, продуцируемых OS- и OR-формами возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций.- 1979.-Вып. 1(65).-С. 5-8

95. Тарасова В.Е., Иннокентьева Т.Н. Восприимчивость и инфекционная чувствительность к чуме длиннохвостого суслика из Тувинского природного очага // Пробл. особо опасных инфекций. 1975. - Вып. 2(42). - С. 19-23

96. Темиралиева Г.А., Айкимбаев A.M., Казакбаева Р.А., Хрусцелевская Н.М. Характеристика свойств штаммов возбудителя чумы, выделенных в Среднеазиатском горном очаге от узкочерепных полевок // Пробл. особо опасных инфекций. 1978. - Вып. 5(63). - С. 20-21

97. Тимофеева JI.A. О таксономии чумного микроба // Пробл. особо опасных инфекций. -1972.-Вып. 1(23).-С. 15-22

98. П.Тимофеева JI.A., Апарин Т.П., Головачёва В.Я. Таксономия рода Yersinia II Современные Пробл. зоонозных инфекций. -1981. С. 90-92

99. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П., Головачёва В.Я., Миронова Л.П., Логачев А.И. Особенности культур чумного микроба, выделенных в Горном Алтае // Особо опасные инфекции в Сибири и на Дальнем Востоке. Кызыл, 1966. - С. 112-115

100. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П., Логачев А.И., Жамъянсурен П., Шура Н. Итоги изучения штаммов чумного микроба выделенных в Монголии // Эпидемиол. и профилактика особо опасных инфекций в МНР и СССР. Улан-Батор, 1978. - С. 64-67

101. Тимофеева Л.А., Жамьян С., Сотникова А.Н., Логачев А.И., Саран М. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969-1971гг. // Пробл. особо опасных инфекций. 1974. - Вып 3(37). - С. 37-42

102. Туманский В.М. О классификации разновидностей чумного микроба // ЖМЭИ. 1957. -№ 6.- С. 3-7

103. Учебно-методическое пособие по лабораторной диагностике и изучению биологических свойств чумного микроба и возбудителей некоторых других природно-очаговых инфекций- Иркутск, 1972. 69с.

104. Филиппов А.А., Олейников П.Н., Дроздов А.В., Проценко О.А. Роль IS-элементов Yersinia pestis (Lehmann, Neumann) в возникновении мутаций кальцийнезависимости // Генетика. -1990. Т. 26, № 10. - С. 1740-1748

105. Филиппов А.А., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов // ЖМЭИ. 1992. - № 3. -С. 10-13130

106. Филиппов С.Н., Кузнецов В.Д., Адо Н.Ю. Рестрикционный анализ ДНК Streptomyces chrysomallus и его нокардиоподобных вариантов // Микробиология. 1993. - № 4. - С. 773776

107. Фурсов В.В., Попов Ю.А. Исследование штаммов микроба чумы полевочьей разновидности методом электрофореза в агарозном геле // Профилактика природно-очаговых инфекций. Ставрополь, 1983. - С. 326-327.

108. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф., Рысков А.П. и др. Геномная дактилоскопия возбудителей сапронозов // ЖМЭИ. 1991. -№ 6. - С. 25-29

109. Шагинян И.А., Гинцбург A.J1. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1991. - № 12. - С. 1-9

110. Шагинян И. А., Гинцбург A.JI. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. - Т. 31, № 5. - С. 600-610

111. Шагинян И.А., Нестеренко J1.H., Терехов А.А., Гладкова К.К., Дмитренко О.А., Гинцбург A.JI. Исследование геномного полиморфизма метицилинустойчивых штаммов золотистого стафилококка // Генетика. 1994. - Т. 30, № 5. С. 627-634

112. Achtman M., Morelli G., Torrea G., Guiyole A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96,N. 24.-P. 14043-14048.

113. Allardet-Servent A., Bourd G., Ramuz M., Pages M., Bellis M., Roizes G. DNA polymorphism in strains of the genus Brucella II J. Bacteriol. 1988. V. 170, N. 10, - P. 4603-4607.

114. Amulthan G., Elumalat R.P., Ulaganathan K., Rajini R.D.B. Variation in plasmid profile of Xanthomonas of Indian origin // Indian J. Exp. Biol. 1992. - V. 30, N. 9. - P. 808-810

115. Barbour A.G., Carter C.J., Burman N., Freitag C.S., Garon C.F., Bergsrom S. / Tandem insertion sequence-like elements define the expression site for variable antigen genes of Borrelia hernsii // Infect. Immun. 1991. -V. 59. - P. 390-397

116. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // BioTechnology. -1991.-V.9.-P.553-557

117. Chu M.C. Plague diagnostic workshop // Emerging Infectious Diseases, 1998. V. 4, N. 3. - P. 501

118. Chu M.C., Dong X.Q. A novel 6-kb plasmid in Yersinia pestis associated with isolates from southeastern districts of Yunnan, China // 7th Intern. Congr. on Yersinia. Nijmegen, June 1416. - Medische Microbiol. - 1998. - V. 6. Suppl. II. - P. S21

119. Cohen S.N., Chang A.C.Y. Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1973. - V. 70. - P. 1293-1295.

120. Cirillo J.D., Barletta R.G., Bloom B.R., Jacobs W.R. A novell transposon trap for Mycobacteria: isolation and characterization of/51096 // J. Bacteriol. 1991. - V. 173, N. 24. - P. 7772-7780

121. Devignat R. Varietes de Tespese Pasteurella pestis. Nouvelle hypothese // Bull. World Health Organization. 1951. - V. 4, N. 2. - P. 247-263

122. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis II Infect, and Immun. 1981. - V. 31, N. 2. - P. 839-841

123. Filippov A.A., Oleinikov P.N., Motin V.L., Protsenko O.A., Smirnov G.B. Sequencing of two Yersinia pestis IS elements, IS2&5 and IS.00 //Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. - V. 13. -P. 306-309

124. Galli-Valerio B. Contribution a 18 stude des caractores morphlogigues et des cultures de Bacterium pestis et des rapport de ce bacille avec Bacterium psudotuberculosis rodentium. // Zbl. Bakt. I. Abt. Origin. 1903. - V.33. - P. 321-330

125. Galli-Valerio B. Contribution to the study of B. pestis its cultural and morphological characters and its relation with B. pseudotuberculosis rodentium. // Brit. Med. Journ. 1902. - V.2. - P. 956-961

126. Georges M., Lequarre A.-S., Castelli M., Hanset R., Vassart G. DNA fingerprinting in domestis animals using four different minisatellite probes // Cytogenet and Cell Genet. 1988. - V. 47, N. 3.-P. 127-131

127. Grothues D., Jarchan Т., Chakraborty T. Application of pulsed field gel electrophoresis in microbiology: taxonomic studies on pseudomonads and listeria // Forum Microbiol. 1989. -V. 12,N. 1-2.-P. 115

128. Grothues D., Tummler B. New approaches in genome analysis by pulsed-field gel electrophoresis: Application to the analysis of Pseudomonas species // Mol. Microbiol. 1991. -V. 5,N. ll.-P. 2763-2776

129. Guiyole A., Grimont F., Iteman I. et al. Plague pandemics investigated by ribotyping of Yersinia pestis strains // J. clin. Microbiol. 1994. - V. 32, N 3. - P. 634-641

130. Huey В., Hall J. Hypervariable DNA Fingerprinting in Escherichia coli: Minisatellite probe from bacteriophage M13 // J. Bacteriol. 1989. -V. 171, N. 5. - P. 2528-2532

131. Jayaaro B.M., Oliver S.P., Tagg J.R., Matthews K.R. Genotypic and phenotypic analysis of Streptococcus uberis isolated from bovine mammary secretions 11 Epidemiol, and Infec. 1991. -V.107,N. 3.-P. 543-555133

132. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable "minisatellite" regions in human DNA // Nature, 1985.-V. 314.-P. 67-73

133. Jeffreys A. J., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific "fingerprints" of human DNA // Nature, 1985.-V. 316.-P. 76-79

134. Kado C.I., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981.-Y. 145, N.3. - P. 1365

135. Kapperud G., Nesbakken Т., Aleksis S., Mollaret H.H. Comparison of restriction endonuclease analysis and phenotypic typing methods for differentiation of Yersinia enterocolitica isolates // J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28, N. 6. - P. 1125-1131

136. Kest el S.E., Marth E.H. Injury and death of frozen Listeria monocytogenes as affected by glycerol and milk components // J. Dairy Sci. 1991. - V. 74, N. 4. - P. 1201-1208

137. Kokotovic В., On S.L. High-resolution genomic fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by analysis of amplified fragment length polymorphisms // FEMS Microbiol. Lett.- 1999. -Y. 173, N. 1.-77-84

138. Lawton W.D., Fukui G.M., Surgalla M.J. Studies on the antigens of Pasterella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis II J. Immunol. 1960. - Y. 84, N. 5. - P. 475-479

139. Marconi R.T., Garon C.F. Phylogenetic analysis of the european isolates of Borrelia burgdorferi II J. Bacteriol. 1992. - V. 174, N. 1. - P. 241-244

140. Pasquier N. P., Quagued M., Picard В., Goullet P., Krishnamoorthy R. A simple, sensitive method of analyzing bacterial ribosomal DNA polymorphism // Electrophoresis, 1989, V. 10, N.3.-P. 186-189

141. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis Etiologic agent of plaque // Clin. Microbiol. Rev. -1997-P. 35-66

142. Plotnikov O., Vinogradova N., Guseva I., Markova L. The use of a new group of antioxidants for storage of bacteria // FEMS: International symposium on novel methods and standardization in microbiology, July 1-4. Kosice, Slovak Republik, 1996. - P.31

143. Pollitzer R. Plague World Health Organization, Monograph Serie. Geneva, 1954

144. Portnoy D.A., Blank H.F., Kingsbury D.T., Falkow S. Genetic analysis of essential plasmid determinants of pathogenicity in Yersinia pestis II J. Infect. Dis. 1983. - V. 148, N. 2. - P. 297 -304

145. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1981. - V. 148. - P. 877-883

146. Regnery R.L., Spruil C.L., Plikaytis B.D. Genotypic identification of Rickketsiae and estimation of intraspecias sequence for portions of two rickketsial genes // J. Bacteriol. 1991. - V. 173, N. 5.-P. 1576-1589

147. Ritter D.B., Gerloff R.K. Deoxyribonucleic acid hybridization among some species of the genus Pasteurella II J. Bacteriol. 1966, - V. 92, N. 6. - P. 1838-1839

148. Rogstad S.H., Patton J.C., Schaal B.A. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. V. 85, N. 23, -P. 9176-9178

149. Saiki R.K., Gelfend D.H., Stoffel S. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase // Science. 1998. - V. 239. - P. 487-491

150. Sander A., Ruess M., Bereswill S., Schuppler M., Steinbrueckner B. Comparison of different DNA fingerprinting techniques for molecular typing of Bartonella henselae isolates // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36, N. 10. - P. 2973-2981

151. Schmidt G., Luderitz O. Untersuchungen zur Typisierung von Salmonella-R-Formen // Zbl. Bakt. I. Abt. Origin. 1969. - V. 210, N. 3. - P. 381-387

152. Shangkuan Y.H., Tsao C.M., Lin H.C. Comparison of Vibrio cholerae 01 isolates by polymerase chain reaction fingerprinting and ribotyping // J. Med. Microbiol. 1997. - V. 46, N. 11. - P. 941-948135

153. Smith J.E., Thai E. A taxonomic study of the Pasteurella using a numerical technique. // Acta pathol. et microbiol. scandinav. 1965. — V. 64. - P. 213

154. Sneath P.H.A., Socal R.R. Numerical Taxonomy // Nature, 1962. V. 139, N. 48, - P. 53-58

155. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - Vol. 98. - P. 503-517

156. Stull T.L., LiPuma J.J., Edlind T.D. A broad-spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA // J. infect. Dis., 1988. V. 157, N. 2. - P. 280-286

157. Tacket C.O., Shanid N., Huq M.I., Alim A.R.M., Cohem M.L. Usefulness of plasmid profiles for differentiation of Shigella isolates in Bangladesh // J. Clin. Microbiol. 1984. - V. 20, N. 2. - P. 300-301

158. Taguchi M., Kobayashi K., Sugiyama N., Kakei F., Yasuda K. Study of genetic differentiation Salmonella enteritidis with the help of the analysis of plasmid profile // J. Jap. Assoc. Infec. Diseases, 1992. V. 66, N. 8. - P. 1067-1074

159. Tailliez P., Tremblay J., Ehrlich S. D., Chopin A. Molecular diversity and relationship within Lactococcus lactis, as revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) // Syst Appl Microbiol. 1998. - V. 21, N. 4. - P. 530-538

160. Tanaka H., Sawairi S., Okuda T. Application of the random amplified polymorphic DNA using the polymerase chain reaction for efficient elimination of duplicate strains in microbial screening // J. Antibiotics, 1994. V. 47, N. 2. - P. 194-200

161. Thomson-Carter F.M., Carter P.E., Pennington Т.Н. Differentiation of Staphylococcal species and strains by ribosomal RNA gene restriction patterns // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, N. 7.-P. 2093-2097

162. Traku I.S., Dance D.A.B., Pitt T.L. Differentiation of Pseudomonas pseudomallei by rDNA restriction profiles // J. Med. Microbiol. 1992. - V. 37, N. 1. - P. 4

163. Trinh T.X.M., Guiyoule A., Dao X.V., Dinh T.N.T., Do Т., Carniel E. Ribotyping of Yersinia pestis isolated in Vietnam // 7th Intern. Congr. on Yersinia, Nijmegen, June 14-16. Medische Microbiol., 1998. - V. 6, Suppl. II. - P. S30-31.

164. Van Loghem J.J. La classification du bacille pesteux. Ann. Inst. Pasteur. 1946. - V. 72, N. 11-12.-P. 975

165. Vassart G., Georges M., Monsieur R., Brocas H., Lequarre A.S., Christophe D. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA // Science, 1987. V. 235, N. 4789. - P. 683-684

166. Verger J.M., Grimont P.A.D., Greyon M. Taxonomy of the genus Brucella II Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. 1987. - V. 138, N. 2. - P. 235-238

167. Viering T.P., Fine D.P. Genetic analysis of Streptococcus pneumoniae serotypes with the use of DNA fingerprinting // J. Infec. Diseases, 1989. V. 160, N. 1. - P. 76-82

168. Weiser J.N., Maskell D.J., Butler P.D., Lindberg A.A., Moxon E.R. Characterization of repetitive sequences controlling phase variation of Haemophilus influenzae lipopolysacharide // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 3304-3309

169. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nuc. Acids Res. 1990. - V. 18, N. 24. - P. 7213-7218

170. Welsh J., McClelland M. Genomic fingerprints produced by PCR with consensus tRNA gene primers //Nuc. Acids Res. 1991. - V. 19, N. 4. - P. 861-866

171. Williams A.M., Collins M.D. DNA fingerprinting of Streptococcus uberis based on polymorphism of DNA encoding rRNA // Lett. Appl. Microbiol. 1991. - V. 12, N. 1. - P. 23-28

172. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphism's amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nuc. Acid Res., 1990. V. 18, N. 22.-P. 6531-6535

173. Yersin A. Bacille de la peste // Ann. Inst. Pasteur. 1894. - V. 8. - P. 666

174. Yersin A. La peste bubonicque a Hong-Kong // Ann. Inst. Pasteur. 1894. - V. 8. - P. 662-667

175. С чувством особого удовольствия приношу искреннюю благодарность к.м.н., н.с, Е.П. Савостиной за глубокую заинтересованность к проблемам, освещенным в настоящем труде, за неоценимую помощь в выполнении исследований, за постоянную заботу и внимание.

176. Считаю необходимым выразить признательность к.м.н., ведущему научному сотруднику отдела микробиологии чумы ГНЦДМ Т.А. Гремяковой за предоставление использованных в данной работе литературных материалов и результатов собственных исследований.

177. Приношу искреннюю благодарность д.б.н., профессору Н.И. Смирновой за глубокий анализ и за высокую оценку нашей работы.

178. Выражаю искреннюю признательность всем рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить некоторые положения и формулировки.

179. Приношу глубокую благодарность В.А. Пискунову и А. А. Ивахненко, за неоценимую помощь в компьютерной обработке полученных данных и предоставленную возможность поиска информации в сети Internet.