Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномный полиморфизм Streptococcus pyogenes различных emm-генотипов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Геномный полиморфизм Streptococcus pyogenes различных emm-генотипов"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Екатерина Михайловна

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ STREPTOCOCCUS PYOGENES РАЗЛИЧНЫХ EMM-ГЕНОТИПОВ

03.02.03 - Микробиология 03.02.07 - Генетика

005015929

3 MAR 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2012

005015929

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург).

Научный руководитель:

доктор биологических наук Дмитриев Александр Валентинович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Падкина Марина Владимировна (Санкт-Петербургский государственный университет)

доктор биологических наук, профессор Бойцов Алексей Геннадиевич (Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова)

Ведущая организация:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Защита состоится ......2012 г. в "ГлСГ" ч на заседании

объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан <(/Л» ¿¡'¿//^/У 20121

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.И.Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Streptococcus pyogenes - патогенный для человека микроорганизм, вызывающий различные формы гнойно-септической инфекции, тонзиллит, рожистое воспаление, скарлатину, синдром токсического шока и др. (Белькова Ю.А., 2005; Kumar R. et.al 2009; Scaber J., 2010). После перенесенных инфекций, вызванных S. pyogenes, возможно развитие таких осложнений, как сепсис, пневмония (Martic J. et.al., 2010; Mehta S. et.al., 2006; Zakikhany K. et.al., 2011), ревматизм и гломерулонефрит, способных привести к летальному исходу или инвалидизации пациентов (Белов Б.С. 2003; Наумова В.И. и др., 1996; Paula J.S. et.al., 2008).

Все штаммы S. pyogenes разделяют на М-серотипы или еот/и-генотипы, в зависимости от антигенной специфичности белка М или нуклеотидной последовательности 5'-конца кодирующего его гена етт соответственно (Facklam R.F. et.al., 2002). Определенные М-серотипы (или е/иот-генотипы) S. pyogenes нередко ассоциируются с развитием того или иного осложнения, в зависимости от характера которого штаммы S. pyogenes условно подразделяют на ревматогенные и нефритогенные. Так, развитие ревматизма часто связано с инфицированием человека штаммами серотипов М5, Мб и М18, а развитие гломерулонефрита - штаммами серотипов М1, М2, М4, М12, М25, М42, М49, М56, М57 и М60 (Facklam R.F. et.al., 2002).

Геномы штаммов S. pyogenes содержат большое количество мобильных генетических элементов, различия в составе и последовательностях которых в значительной мере обуславливают генетическое разнообразие вида. Так, суммарный размер ДНК умеренных бактериофагов может достигать 12% от общего размера генома S. pyogenes (Ferretti J.J. et.al., 2001; Beres S.B. et.al., 2002). Мобильные генетические элементы, в частности, профаги и транспозоны, могут содержать гены вирулентности и гены устойчивости к антимикробным препаратам (Brenciani А. et.al., 2004; Clermont D. et.al., 1997, Giovanetti E. et.al., 2005). Приобретение таких мобильных генетических элементов штаммами-возбудителями может привести к изменению их фенотипических свойств и, как следствие, к осложнению течения заболевания и/или снижению эффективности антибиотикотерапии. В последние годы наблюдается увеличение числа штаммов S. pyogenes, в том числе, штаммов генотипов emml и етт12, устойчивых к действию практически всех групп антибиотиков, за исключением бета-лактамных (Ardanuy С. et.al., 2010; Del Grosso М. et.al., 2011). Поэтому, важными задачами современной микробиологии являются изучение механизмов возникновения и быстрого распространения антибиотикоустойчивых штаммов S. pyogenes в микробной популяции и изучение роли горизонтального переноса мобильных генетических элементов в изменчивости S. pyogenes.

Таким образом, актуальным является изучение геномного полиморфизма S- pyogenes, в частности, опосредованного мобильными генетическими элементами.

Цель исследования.

Изучить генетическое разнообразие штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных в различных географических регионах.

Задачи работы:

1. Изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, обусловленного умеренными бактериофагами, и его влияния на фенотипические свойства S. pyogenes',

2. Изучение рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов S. pyogenes методом PFGE;

3. Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAPD;

4. Выявление мобильных генетических элементов у штаммов S. pyogenes.

Научная новизна.

- впервые выявлено выраженное генетическое разнообразие штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге (Россия) и в Пекине (КНР), обусловленное умеренными бактериофагами;

- показано, что среди штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12 наиболее распространенными являются гены бактериофагов speA, speH, speC, ssa, кодирующие токсины, и гены int4 и int7, кодирующие интегразы бактериофагов;

- предложен комплексный подход к анализу генетической неоднородности штаммов S. pyogenes на основании сравнения профилей фаговых генов, паттернов RAPD и PFGE;

- показана возможность применения стандартизованного метода RAPD для обнаружения мобильных генетических элементов S. pyogenes;

- у штаммов S. pyogenes выявлен ранее не обнаруженный транспозон, содержащий ген устойчивости к тетрациклину tetM, и установлена его геномная локализация;

- доказано, что наличие профага NZ131.2 в геноме S. pyogenes NZ131 влияет на культуральные свойства штамма.

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования.

Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о генетическом разнообразии штаммов S. pyogenes, циркулирующих в разных географических регионах, таких как Санкт-Петербург и Пекин, и могут быть использованы для дальнейших исследований с целью оценки эпидемиологической ситуации по стрептококковой заболеваемости и для прогнозирования ее развития в Санкт-Петербурге. Показана возможность применения метода RAPD в целях изучения генетической неоднородности и обнаружения мобильных генетических элементов штаммов S. pyogenes. Разработанный комплексный подход к исследованию геномного полиморфизма может быть использован для дальнейших исследований штаммов S. pyogenes с целью их эффективной дифференциации. Данные по транспозону, впервые обнаруженному у S. pyogenes и содержащему ген устойчивости к тетрациклину, могут послужить основой для дальнейших исследований, направленных на оценку эффективности и целесообразности применения данного антибиотика

при лечении стрептококковой инфекции. Нуклеотидные последовательности ДНК, определенные в настоящей работе, депонированы в базу данных GenBank под номерами JN799842, JN799843, JN799844 и JQ001862, и могут быть использованы для дальнейших научных исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 10 научных работах (из них 4 статьи и 6 тезисов). По материалам диссертации был сделан постерный доклад на международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Греция, 2008 г.). Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (2009, 2010 гг.) и на семинаре лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (2010 г.).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 30 рисунками, указатель литературы содержит 158 источников, в том числе 10 отечественных и 148 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использовали 86 штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине от носителей и больных с заболеваниями стрептококковой этиологии, и 2 штамма S. pyogenes генотипа етт49 (штамм NZ131, выделенный в Новой Зеландии от больного с острым гломерулонефритом, и его лабораторный вариант - NZ131var). Для отработки метода выявления фаговых генов в геноме S. pyogenes использовали 38 штаммов генотипа етт49, выделенных в различных географических регионах. Штаммы были получены из коллекций ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН и Пекинского детского госпиталя (Пекин, КНР).

Культивирование S. pyogenes осуществляли в жидкой питательной среде Todd-Hewitt Broth (ТНВ) (Hi-Media, Индия) и на 1,5% агаризованных средах при температуре 37°С. Для оценки гемолитической активности штаммов в агаризованную среду добавляли эритроцитарную массу до конечной концентрации 5%. Питательные среды готовили в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией.

Выделение хромосомной ДНК осуществляли методом фенол/хлороформенной экстракции. Выделение ДНК из агарозного геля проводили с использованием коммерческого препарата GeneJET™ (Fermentas, Литва) согласно прилагаемой инструкции.

Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли методом ПЦР с использованием специфических праймеров. Для анализа штаммов методом ПЦР со «случайной» затравкой (RAPD) использовали праймер 5'-

CCTCCCGCCACC-3'. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 1 % агарозном геле.

Гидролиз ДНК рестриктазой HindlW (Takara, Япония) осуществляли согласно протоколу производителя. Лигирование Hindlll фрагментов хромосомной ДНК с коммерческим препаратом pUC118 H/7?dIII/BAP (Takara) проводили при помощи Т4 ДНК-лигазы (Takara) согласно прилагаемой инструкции при температуре 16°С в течение ночи.

Секвенирующую ПЦР проводили с использованием набора «GenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit» (Beckman Coulter Inc., США). Секвенирование ДНК осуществляли с использованием секвенатора Beckman Coulter CEQ™ 8000 (Beckman Coulter Inc.).

Анализ штаммов методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле (PFGE) проводили согласно модифицированному протоколу Elliot J.A. et.al., 1998. Электрофорез проводили в аппарате CHEF-DR-III (Bio-Rad, США) в 1% агарозном геле в течение 24 часов при напряжении 6В/см2 и температуре 14°С. Продолжительности пульсов составили от 4,5 сек до 45 сек, и от 0,5 сек до 5 сек в зависимости от величины разделяемых фрагментов ДНК. Оценку подвижности рестрикционных фрагментов проводили по сравнению с конкатамерами ДНК фага лямбда (Lambda Ladder PFG Marker, New England Biolabs, США) и хромосомными ДНК Saccharomyces cerevisiae (Yeast Chromosome PFG Marker, New England Biolabs). Для визуализации ДНК в УФ-свете гель после электрофореза окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в электродном буфере в течение 30 минут.

Динамику роста штаммов оценивали по изменению оптической плотности при длине волны 600 нм в бульоне Todd-Hewitt с использованием спектрофотометра SmartSpec3000 (BioRad).

Оценку чувствительности штаммов к тетрациклину проводили при помощи дискодиффузионного метода с использованием бумажных дисков, пропитанных тетрациклином (НИЦФ, РФ), согласно соответствующим методическим указаниям (МУК 4.2.1890-04 Министерства здравоохранения и социального развития РФ).

Оценку выживаемости штаммов NZ131 и NZ131var в человеческой крови проводили согласно модифицированному протоколу Kwinn L.A. et.al, 2006.

Для оценки адгезивной способности штаммов S. pyogenes клетки вагинального эпителия человека суспендировали в PBS до концентрации 1x105 клеток/мл. Полученную суспензию разливали по двум пробиркам, одна из которых служила контролем, и отмывали при помощи PBS. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл PBS. К полученной суспензии эпителиальных клеток добавляли суспензию клеток S. pyogenes в концентрации 1х107 КОЕ/мл, перемешивали и инкубировали при температуре 37°С в течение 30 мин при покачивании. После инкубации суспензию промывали при помощи PBS, осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS, наносили на предметное стекло и подсушивали при 65°С до полного высыхания (10-15 мин). Фиксацию препарата осуществляли 96% этанолом в течение 10 мин. Препарат

последовательно окрашивали эозином (10 мин) и азуром (10 мин), промывали водой и подсушивали. Микроскопию эпителиальных и адгезировавших к ним бактериальных клеток проводили при 1000-кратном увеличении на микроскопе Leica DM500 (Германия).

Вирулентные свойства штаммов S. pyogenes определяли при помощи внутрибрюшинного заражения лабораторных животных (беспородные мыши, самцы, вес 16-18 г.). Исследуемые штаммы S. pyogenes выращивали в течение ночи при температуре 37°С в 100 мл ТНВ, клетки центрифугировали и отмывали при помощи PBS. Отмытые клетки ресупендировали в 2 мл PBS, затем вводили мышам внутрибрюшинно 1х108 КОЕ/животное в объеме 0,5 мл. Животным контрольной группы вводили по 0,5 мл PBS. Для каждого исследуемого штамма использовали группы по 10 мышей. Наблюдение вели в течение 10 дней после заражения и эксперимент для каждого штамма проводили дважды.

Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК проводили при помощи программ "Restriction Mapper Version 3", "BLAST" и "Chromas 2.3". Последовательности праймеров для ПЦР были сконструированы при помощи программ "OLIGO" и "Primer BLAST" на основании соответствующих нуклеотидных последовательностей, доступных в базе данных GenBank.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием критерия распределения Стьюдента и программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Геномный полиморфизм S. pyouenes. обусловленный умеренными бактериофагами, и его влияние на фенотипические свойства S. pyogenes

Распространенность генов бактериофагов среди штаммов S. pyogenes

С целью изучения распространенности генов бактериофагов у S. pyogenes был проведен ПЦР-анализ 86 штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине. Штаммы были проанализированы на присутствие в их геноме 9 генов, кодирующих функциональный белок бактериофага - интегразу (гены intl-int9), а также на присутствие 8 генов вирулентности (гены разных типов стрептококковых токсинов - spe, ген фосфолипазы А2 - sla и ген стрептококкового суперантигена - ssa). При анализе штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге, оказалось, что среди штаммов генотипа emml наиболее распространены были гены speA (100%), speCJ (100%), int4 (100%) и int7 (100%), а среди штаммов генотипа етт12 -гены spel (94,4%), speH (94,4%), speC (88,9%), int3 (77,8%) и int5 (94,4%) (рис. 1). Анализ распространенности фаговых генов среди штаммов генотипов emml и етт12, выделенных в Пекине, показал, что среди штаммов генотипа emml наиболее распространены были гены ssa (96,7%), speC (96,7%), speA (93,3%), speCJ (76,7%), int4 (100%) и int7 (93,3%), a среди штаммов генотипа emml2 -гены ssa (100%), speH (100%), speC (100%), spel (51,\%) и int4 (81,0%) (рис. 1).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Л Л «ï> ,t» Л Ä> Л «S> «?> ч<У- \<?- # # # # #

I етт1, Пет ербург и emm12, Пет ербург в emml, Пекин □ emm12, Пекин

Рисунок 1.

Распространенность генов бактериофагов среди штаммов S. pyogenes генотипов emml и emml2, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине.

Таким образом, для штаммов генотипа emml независимо от географического региона их выделения характерно наличие генов speA, speCJu int7, а для штаммов генотипа emml2 - генов speH и spei, что соответствует данным литературы в отношении штаммов генотипов emml и emml2, выделенных в различных странах Европы (Ekelund К. et.al., 2005; Maripuu L. étal., 2008; Schmitz FJ. et.al., 2003).

Независимо от генотипа, для штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге, было характерно наличие гена intS (65,7%), а для штаммов, выделенных в Пекине, - гена ssa (98,0%). Столь высокая распространенность гена ssa среди штаммов S. pyogenes характерна в основном для штаммов, выделенных в КНР, по сравнению со штаммами, выделенными в Европейских странах (Jing HB. et.al., 2006; Maripuu L. et.al., 2008; Schmitz FJ. et.al, 2003; Jing HB. et.al., 2006).

В целом, среди всех исследуемых групп штаммов, независимо от emm-генотипа или географического региона выделения штаммов, наиболее распространены были гены speA (58,1%), speH (62,8%), speC (75,0%), ssa (64,0%), int4 (68,0%) и int7 (59,3%) (рис. 1). Данный факт свидетельствует о том, что фаговые ДНК, содержащие гены speA, speH, speC, ssa, int4 и int7, интегрировали в геном S. pyogenes достаточно давно, предоставив штаммам-реципиентам определенные селективные преимущества, что позволило им широко распространиться в человеческой популяции.

Генетическая неоднородность штаммов S. pyogenes по профилям фаговых генов

Для оценки геномного полиморфизма штаммов S. pyogenes, обусловленного умеренными бактериофагами, был проведен сравнительный анализ профилей фаговых генов, т.е., наборов фаговых генов, содержащихся в геноме каждого из штаммов. В целом, при анализе 86 штаммов S. pyogenes на наличие 17 генов бактериофагов было выявлено 25 профилей фаговых генов.

Так, среди штаммов £ pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге, было обнаружено 5 и 8 профилей фаговых генов соответственно (табл. 1), а среди штаммов S. pyogenes генотипов emml и emml2, выделенных в Пекине, - 7 и 8 профилей фаговых генов соответственно.

Таблица 1. Профили фаговых генов штаммов S. pyogenes генотипа emml, выделенных в Санкт-Петербурге

Название профиля

AI A2 A3 A4 A5

Ген Число штаммов

6 1 1 8 1

speA + + + + +

spei - - - - -

speH - - - - -

speL - - - - -

speCJ + + + + +

ssa - + + - -

speC - - + + +

sla - + - - -

intl - + - - +

int2 - + - - +

inti - - - + +

int4 + + + + +

int5 - - + - -

int6 - - + - -

int7 + + + + +

int8 - + - - -

int9 - - - - -

«+» - наличие гена, «-» - отсутствие гена

Некоторые профили, обнаруженные у рассматриваемых групп штаммов, были идентичными. Например, профиль фаговых генов AI был выявлен у ряда штаммов генотипа emml, выделенных как в Санкт-Петербурге, так и в Пекине.

Локализация бактериофагов в геноме S. pyogenes

В результате ПЦР-анализа в геномах значительного числа исследуемых штаммов была установлена локализация четырех генов интеграз: int3, int4, int5 и int7. Так, локализация гена int3 была определена у 28 из 29 штаммов, гена int4 - у 43 из 69 штаммов, гена int5 - у 18 из 18 штаммов, и локализация гена int7 -у 44 из 51 штамма S. pyogenes, содержащих данные гены соответственно. Очевидно, что у ряда штаммов гены int3, int4 и int7 располагались в других участках генома. Не исключено, что профаги, содержащие гены int3, int4 и int7 с неустановленной локализацией, имеют иную последовательность attP сайта и, следовательно, интегрируют в другой участок генома S. pyogenes. С другой стороны, вероятно, что в геноме S. pyogenes присутствует несколько сходных attB сайтов, что обуславливает возможность интеграции бактериофага в разные участки бактериального генома (Beres S.B. et.al., 2002; Holden M.T . et.al., 2007; Nakagawa I. et.al., 2003).

Кроме того, в геноме ряда исследуемых штаммов были выявлены профаги, подобные профагам, описанным ранее для штаммов S. pyogenes SF370 и MGAS5005 (Ferretti JJ. et.al, 2001; Holden М.Т. et.al., 2007), т.е., профаги, содержащие те же гены и имеющие ту же геномную локализацию, что и профаги штаммов SF370 и MGAS5005. Так, в геноме 8 штаммов был выявлен профаг, подобный профагу SF370.1, (гены ШЗ и да/2), в геноме 17 штаммов -профаг, подобный профагу SF370.3 (гены int5, spei и speH), а в геноме 18 штаммов - профаг, подобный профагу 5005.1 (гены int7 и M5005_Spy_0995).

Влияние умеренных бактериофагов на свойства S. pyogenes

Известно, что приобретение или утрата профага бактериальным штаммом влечет за собой не только изменение структуры генома, но и может приводить к изменению биологических свойств этого штамма, в частности, характера роста или вирулентности. Однако подобные факты описаны для других видов бактерий, но не S. pyogenes. Поэтому одной из задач настоящей работы явился сравнительный анализ биологических свойств двух штаммов: штамма 5. pyogenes NZ131, содержащего профаг NZ131.2, и его лабораторного варианта -штамма NZ131var, не содержащего данный профаг.

В результате исследования адгезивности, вирулентности и выживаемости штаммов NZ131 и NZ131var в человеческой крови значимых отличий между штаммами выявлено не было. В то же время, установлено, что штаммы NZ131 и NZ131var отличались по характеру роста в жидкой питательной среде. Штамм NZ131var, утративший профаг, рос быстрее и давал большее количество биомассы, чем штамм NZ131 (рис. 2). Вероятно, это объясняется различиями в скорости репликации ДНК штаммов, поскольку утрата профага NZ131.2 привела к уменьшению размера генома штамма NZ131var примерно на 37,4 т.п.н. по сравнению с размером генома исходного штамма NZ131.

время,ч —о—NZ131

|__—»— NZ131var

Рисунок 2.

Кривые роста штаммов S. pyogenes NZ131 и NZ131var (для каждого штамма было проведено по три эксперимента и для полученных данных была вычислена ошибка среднего и построен доверительный интервал).

Таким образом, умеренные бактериофаги играют значительную роль в возникновении генетического разнообразия штаммов S. pyogenes, о чем

свидетельствует высокая вариабельность наборов фаговых генов среди штаммов S. pyogenes, а также корреляция определенных фаговых генов с конкретным еида-генотипом или географическим регионом выделения штаммов. Кроме того, интеграция ДНК фага NZ131.2 в геном pyogenes приводит к изменению фенотипических свойств бактериального штамма.

2. Изучение рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов S. pyogenes методом пульс-электрофореза

С целью выявления рестрикционного полиморфизма был проведен анализ Smal паттернов хромосомной ДНК штаммов S. pyogenes методом PFGE. Для этого хромосомные ДНК штаммов были выделены и гидролизованы рестриктазой Smal, а продукты гидролиза разделены в агарозном геле (рис. 3).

В результате исследования среди 17 штаммов генотипа emml, выделенных в Санкт-Петербурге, было обнаружено 2 паттерна PFGE, а среди 18 штаммов генотипа етт12, выделенных в Санкт-Петербурге - 8 паттернов PFGE. При исследовании 30 штаммов генотипов emml и 21 штамма генотипа emml2, выделенных в Пекине, было выявлено 11 и 10 паттернов PFGE соответственно.

В целом, среди 86 штаммов S. pyogenes всего выявлено 26 Smal паттернов PFGE. Три из них были выявлены у штаммов разных групп. В частности, паттерн ВЗ (рис. 3) был характерен для 9 штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге (генотип етт12), и для одного штамма, выделенного в Пекине (генотип emml2).

485 т.п.н. 436,5 т.п.н.

Рисунок 3.

Рестрикционные паттерны PFGE хромосомной ДНК штаммов S. pyogenes генотипа emml 2, выделенных в Санкт-Петербурге Треки 1 - 8: паттерны ВЗ-В10 соответственно.

Стрелками обозначены

молекулярные массы

соответствующие конкатамерам ДНК фага лямбда и хромосомным ДНК

Saccharomyces cerevisiae.

3. Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAP Г)

Гетерогенность паттернов RAPD штаммов S. pyogenes

Для сравнительного анализа штаммов методом RAPD была необходима предварительная стандартизация условий метода. Основанием для этого явились публикации, указывающие на невысокую воспроизводимость и

невозможность сопоставления результатов RAPD (Matthews R.C., 1993; Nandi S. et.al., 2008; Seppälä H., 1994), что ставило под сомнение целесообразность использования данного метода для сравнительного анализа штаммов. Таким образом, было необходимо выяснить, действительно ли результаты RAPD плохо воспроизводимы, и если это так, то не является ли причиной этого нестандартизованность условий реакций, применяемых в разных лабораториях. С этой целью был проведен ряд экспериментов, в которых для анализа одной и той же ДНК изменяли условия ПЦР (концентрация ДНК, модель амплификатора и компоненты ПЦР смеси). В результате проведенного исследования оказалось, что количество, размеры и интенсивности продуктов амплификации, получаемых для одного и того же штамма (паттерн RAPD) действительно зависят от ряда условий, например, модели амплификатора или реагентов одного наименования, но разных производителей. При этом в результате исследования было показано, что при использовании стандартизованных условий результаты RAPD анализа являются хорошо воспроизводимыми и позволяют эффективно проводить сравнительный анализ штаммов (рис. 4).

1 23 4 5 6 7 8 9 10 11

В целом, в результате исследования 86 штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге и Пекине, было выявлено 27 паттернов RAPD. В частности, среди штаммов S. pyogenes генотипов emml и emml2, выделенных в Санкт-Петербурге, было выявлено 3 и 5 различных паттернов RAPD соответственно, а при исследовании штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Пекине - 11 и 8 паттернов RAPD соответственно. В результате сравнительного анализа штаммов, выделенных в различных географических регионах и относящихся к разным етт-генотипам, идентичных паттернов RAPD выявлено не было.

Комплексный анализ штаммов В результате сопоставления данных, полученных при помощи методов RAPD, PFGE и ПЦР-анализа на наличие фаговых генов, было выявлено 16 генетических вариантов среди штаммов 5. pyogenes, выделенных в Санкт-

2000 п.н,—*■ 1200 п.н,—>

800 п.н.-»-400 п.н. —►

Рисунок 4.

Паттерны RAPD штаммов S. pyogenes генотипа emml, выделенных в Пекине Треки 1-11: паттерны С9-С19 соответственно. Стрелками обозначены молекулярные массы,

соответствующие маркерным фрагментам ДНК.

Петербурге (табл. 2), и 42 генетических варианта - среди штаммов, выделенных в Пекине. При этом, не было выявлено одинаковых генетических вариантов среди штаммов S. pyogenes, выделенных в различных географических регионах и относящихся к разным еття-генотипам. В то же время, ряд штаммов в пределах каждой из исследуемых групп (штаммы, выделенные в одном географическом регионе и принадлежащие к одному етя/и-генотипу) относились к одному и тому же генетическому варианту. Например, шесть штаммов генотипа emml, выделенные в Санкт-Петербурге, относились к генетическому варианту А1-В1-С1 (табл. 2). Это дало основание предположить, что данные штаммы являются близкородственными и, возможно, эпидемически связаны между собой. В целом, наблюдалось большее генетическое разнообразие штаммов, выделенных в Пекине, по сравнению со штаммами, выделенными в Санкт-Петербурге.

Таблица 2. Суммарные данные по генетической неоднородности штаммов, выделенных в Санкт-Петербурге

Число штаммов Профиль фаговых генов Паттерн RAPD Паттерн PFGE Генетический вариант

генотип emml

6 А1 В1 С1 А1-В1-С1

1 А2 А2-В1-С1

1 A3 В2 АЗ-В2-С1

7 А4 В1 С2 А4-В1-С2

1 С1 А4-ВЗ-С1

1 А5 ВЗ А5-ВЗ-С1

генотип етт!2

1 А6 В4 С6 А6-В4-С6

2 А7 В5 С4 А7-В5-С4

2 А8 В4 С5 А8-В4-С5

7 А7 СЗ А7-В4-СЗ

1 В5 С7 А7-В5-С7

1 А9 В4 С8 А9-В4-С8

1 А10 В6 С9 А10-В6-С9

1 All В7 СЗ А11-В7-СЗ

1 А13 В4 A13-B4-C3

1 А12 В8 С10 А12-В8-С10

4. Выявление и характеристика ранее не обнаруженного транспозона S. pyogenes

Обнаружение генов транспозона

При анализе паттернов RAPD штаммов S. pyogenes было показано, что у 39 из 86 исследуемых штаммов в структуре паттерна RAPD присутствовал фрагмент ДНК размером 536 п.н. (рис. 5). 5 из этих 39 штаммов были выделены в Санкт-Петербурге (1 штамм генотипа emml и 4 штамма генотипа emmI2), а 34 штамма - в Пекине (18 штаммов генотипа emml и 16 штаммов генотипа етт12).

1

Маркерный фрагмент ДНК размером 536 п.н. был выделен из геля, а его нуклеотидная последовательность секвенирована и депонирована в базу

данных GenBank. В результате анализа было обнаружено, что данная нуклеотидная последовательность на 100% гомологична фрагментам двух генов (SPT1915 и SPT1916) транспозона, характерного для штаммов Streptococcus pneumoniae, и не описанного ранее для S. pyogenes.

На основании полученных данных было предположено, что наличие маркерного фрагмента размером 536 п.н. в паттерне RAPD штаммов S. pyogenes может свидетельствовать о присутствии полноразмерного транспозона в геноме этих штаммов. Для проверки данного предположения на основании нуклеотидной последовательности S.

536 п.н. -

Рисунок 5.

Паттерн RAPD, содержащий маркерный фрагмент ДНК

размером 536 п.н. (трек 1) и pneumoniae были сконструированы пары

паттерн RAPD, не содержащий праймеров на пять генов транспозона (SPT1906,

этот фрагмент (трек 2). SPTJ907, SPT1915, SPT1916 и ген SPTJ931).

В результате ПЦР-анализа было показано, что все 39 штаммов S. pyogenes, в паттерне RAPD которых присутствовал фрагмент ДНК размером 536 п.н., содержали гены транспозона S. pneumoniae (SPT 1906, SPT_1907, SPT1915, SPT 1916 и SPT1931) (табл. 3). В геноме 17 из 47 штаммов, не имеющих маркерного RAPD фрагмента, также присутствовали гены SPT 1906, SPT_1907, SPT 1915, SPTJ916 и SPT1931. В геноме остальных 30 штаммов S. pyogenes транспозон выявлен не был.

Таблица 3. Результаты ПЦР-анализа штаммов и их устойчивость к тетрациклину

Число штаммов Наличие генов транспозона (SPT 1906, SPT 1907, SPT 1915, SPT 1916, SPT 1931) Наличие гена tetM Принадлежность tetM транспозону Устойчивость к тетрациклину

4 + + + +

1 + + + -

4 + + - +

7 + + - -

11 + - - +

12 + - - -

4 + + - +

6 + + - -

4 + - - +

2 + - - -

1 + + + +

30 - - - -

Определение локализации транспозона

Локализацию обнаруженного транспозона в геноме S. pyogenes определяли следующим образом (рис. б).

Рисунок б.

Схема эксперимента по определению локализации транспозона в геноме 5. pyogenes

Были проведены рестрикция хромосомной ДНК штамма S. pyogenes 94С, содержащего транспозон, рестриктазой НіпдШ и лигирование рестрицированной хромосомы с коммерческим препаратом pUC118 ЯшсШІ/ВАР. В результате лигирования молекул вектора с большим количеством фрагментов, полученных после рестрикции хромосомной ДНК, ожидалось образование разных вариантов рекомбинантных молекул вектора, отличающихся встроившимися в них фрагментами хромосомной ДНК. Искомая молекула представляла собой вектор pUC 118, содержащий вставку, состоящую из фрагмента хромосомной ДНК S. pyogenes и прилегающего к нему 5'-конца транспозона. Лигазную смесь использовали в качестве ДНК матрицы для ПЦР с двумя праймерами, один из которых соответствовал фрагменту вектора перед вставкой (М3(2)), а другой - 5'-концу транспозона (tnlr). В результате ПЦР должен был образоваться амлификат, состоящий из трех последовательностей: последовательность участка вектора перед вставкой (№1), последовательность, соответствующая хромосомной ДНК (№2), и последовательность №3, соответствующая 5'-концу транспозона. Как и ожидалось, в результате ПЦР был получен амплификат, секвенирование которого позволило определить, что

в геноме штамма 94С транспозон расположен рядом с хромосомным геном Бру_0237 (рис. 7).

carb

хромосома

fnlf

tn2f

tnlr

ген Spy_0237 ген SPT1906 ген SPT1907 reHSPT 1915

1916Ґ

Ül2r

tetM2r

транспозон

gggül — ген SPT_1916

У7////Л — ген tetM I I — ген SPT_1931 - ген Spy_0238

tn3f

tn3r^ cons

хромосома

Рисунок 7.

Локализация генов транспозона на хромосомной ДНК S. pyogenes. Стрелками обозначены праймеры на соответствующие гены.

Для подтверждения полученных данных были сконструированы соответствующие праймеры, и проведена ПЦР с парами праймеров carb-tnlr и tn3f-cons (рис. 7). В результате ПЦР и последующего секвенирования был выявлен сайт интеграции транспозона в геноме штамма S. pyogenes 94С, представляющий собой последовательность ТТТТТТАТТТТТАААА. При этом, в геномах лишь трех штаммов S. pyogenes (94С, 114С и 120С) транспозон расположен между хромосомными генами Spy_0237 и Spy_0238 (рис. 7), а у остальных штаммов локализован в других участках генома, и обнаружение этих сайтов интеграции требует дополнительных экспериментов.

Наличие у S. pyogenes гена устойчивости к тетрациклину tetM и его принадлежность транспозону

Исходя из того, что у штаммов S. pneumoniae в состав анализируемого транспозона входит ген tetM, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, было предположено, что исследуемые штаммы S. pyogenes, содержащие этот транспозон, также содержат ген tetM. ПЦР-анализ на наличие гена tetM показал, что данный ген присутствовал в геноме 27 штаммов S. pyogenes, содержащих обнаруженный транспозон (табл. 3). Пять из этих штаммов были выделены в Санкт-Петербурге, а 22 штамма - в Пекине.

Чтобы определить, входит ли ген tetM в состав данного транспозона, на основании нуклеотидной последовательности транспозона S. pneumoniae были сконструированы праймеры 1916f и tetM2r, где tetM2r - праймер на ген tetM, а 1916f- праймер на ген SPT_1916, расположенный рядом с геном tetM и также принадлежащий транспозону (рис. 7). В результате ПЦР-анализа было показано, что у всех 5 штаммов S. pyogenes, выделенных в Санкт-Петербурге, и лишь у одного штамма, выделенного в Пекине, ген tetM был ассоциирован с обнаруженным транспозоном. Вероятно, в геноме ряда штаммов ген tetM мог присутствовать в составе других генетических элементов. Данный факт не является неожиданным, т.к. для многих грамположительных бактерий показано присутствие гена tetM в составе различных коньюгативных элементов

семейства Tn916-Tnl545 (Clewell D.B. et.al., 1995), а у ряда штаммов S. pyogenes выявлено наличие гена tetO, высокогомологичного гену tetM, в составе одного из профагов (Brenciani А. et.al., 2010; Giovanetti Е. et.al., 2003).

Устойчивость штаммов S. pyogenes к тетрациклину

С целью выявить возможную взаимосвязь между наличием гена tetM и устойчивостью штаммов S. pyogenes к тетрациклину была проведена оценка чувствительности данных штаммов к тетрациклину. В результате исследования оказалось, что 28 из 86 исследуемых штаммов были устойчивы к тетрациклину. При этом наличие гена tetM было выявлено лишь у 13 из 28 устойчивых к действию тетрациклина штаммов. Учитывая, что у бактерий рода Streptococcus, помимо гена tetM, обнаружено еще 5 генов tet: tetK, tetL, tetO, tetQ и tetT, возможно, что устойчивость к тетрациклину остальных 23 штаммов была обусловлена наличием в их геноме какого-либо из этих генов (Chopra J. et.al., 2001; Clermont D. et.al., 1997). Кроме того, не все штаммы, содержащие ген tetM, были устойчивы к тетрациклину, что, вероятно, объясняется нарушениями в экспрессии гена tetM или белка TetM.

Результаты исследования дают основание утверждать, что в геноме S. pyogenes впервые выявлен транспозон, не обнаруженный ранее у данного вида бактерий и, возможно, приобретенный ими посредством межвидового горизонтального переноса генов от штаммов S. pneumoniae.

В целом, в настоящем исследовании была выявлена значительная генетическая гетерогенность штаммов S. pyogenes как генотипа emml, так и генотипа етт12. Продемонстрирована роль мобильных генетических элементов в возникновении геномного полиморфизма штаммов, а также влияние бактериофага NZ131.2 на характер роста S. pyogenes. Кроме того, проведенное исследование позволило обнаружить новый транспозон, ранее не описанный для штаммов S. pyogenes.

ВЫВОДЫ:

1. Штаммы S. pyogenes генотипов emml и emml2, выделенные в Санкт-Петербурге (РФ) и Пекине (КНР), гетерогенны по набору генов вирулентности и генов интеграз, входящих в состав умеренных бактериофагов.

2. На основании комплексного анализа паттернов RAPD, паттернов PFGE и профилей фаговых генов штаммов S. pyogenes установлено большее генетическое разнообразие штаммов, выделенных в Пекине по сравнению со штаммами, выделенными в Санкт-Петербурге.

3. Утрата профага NZ131.2 штаммом S. pyogenes NZ131 приводит к изменению характера роста штамма, но не оказывает влияние на его адгезивность, вирулентность и выживаемость в цельной человеческой крови.

4. Стандартизованный метод RAPD позволяет выявлять новые генетические элементы S. pyogenes. В геноме ряда штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, присутствует ранее не обнаруженный транспозон, содержащий ген устойчивости к тетрациклину tetM и локализованный между хромосомными генами Spy__023 7 и Spy_0238.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Полякова Е., Гао В., Янг Я., Суворов, Тотолян А. Молекулярно-генетическое сравнение штаммов Streptococcus pyogenes типов emml и emml2 по набору профаговых генов // ЖМЭИ. 2009. №2. С. 18-24.

2. Полякова Е.М., Дмитриев A.B. Ранее не обнаруженный транспозон штаммов Streptococcus pyogenes, устойчивых к действию тетрациклина // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. 2011. Т.З. №3. С.68-73.

Статьи в других изданиях:

3. Suvorov A.N., Polyakova Е.М., McShan W.M., Ferretti J.J. Bacteriophage content of M49 strains of Streptococcus pyogenes II FEMS Microbiology Letters. 2009. V.294. P. 9-15.

4. Полякова E.M., Мнацаканян E.C., Бурова JI.A., Дмитриев A.B. Генетическая гетерогенность штаммов Streptococcus pyogenes генотипа етт12 // Мед. Акад. Журн. 2010. Т.10. №1. С.39-44.

Тезисы:

1. Polyakova Е., Suvorov A., Gao W., Yang Н., Ferretti J. GAS strain from various sources have specific and different phage genes profiles // Abstracts of XVIIth Lancefield Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Greece, Porto Heli. 2008. P. 89.

2. Polyakova E., Mnatsakanyan E., Burova L., Totolian A., Dmitriev A. Genetic heterogeneity of emml2 genotype Streptococcus pyogenes strains isolated in Saint-Petersburg, Russia // 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Finland, Helsinki. 2009. R2151.

3. Полякова E.M., Дмитриев A.B. Генетическая гетерогенность штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных от детей в Санкт-Петербурге // 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XIX века», РФ, Пущино. 2009. С. 206-207.

4. Полякова Е.М., Дмитриев A.B., Дмитриева Н.Ф., Ещина A.C., Брико Н.И. Геномный полиморфизм штаммов Streptococcus pyogenes генотипа emml2, выделенных в различных географических регионах // «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», РФ, Санкт-Петербург. 2010. С.126-127.

5. Полякова Е.М., Дмитриев A.B. Выявление маркеров генетического полиморфизма Streptococcus pyogenes методом RAPD // «Молекулярная диагностика-2010», РФ, Москва. 2010. Т. III. С. 430-431.

6. Полякова Е.М. Обнаружение и характеристика нового транспозона Streptococcus pyogenes //Всероссийская научная конференция молодых ученых: «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», РФ, Санкт-Петербург. 2010. Т.10. №5. С. 90.

Подписано в печать 11.04.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 2588.

Отпечатано в ООО «Издательство "J1EMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://wwvv.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полякова, Екатерина Михайловна, Санкт-Петербург

61 12-3/1178

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Екатерина Михайловна

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ STREPTOCOCCUS PYOGENES РАЗ Л И ЧIIЫ X EMM-1 ЕII ОТ И П О В

03.02.03 - Микробиология 03.02.07 - Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.В. Дмитриев

Санкт-Петербург 2012

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СГА - стрептококки группы А

(т.)п.н. - (тысячи) пар нуклеотидов

ICE - интегрированный коньюгативный элемент

IS - инсерционная последовательность

ТНВ - Todd-Hewitt Broth, среда для культивирования

стрептококков

EDTA - этилен-диамин-тетрауксусная кислота

ТЕ - трис-EDTA буферный раствор

TBE - трис-боратный буферный раствор

SDS - додецил сульфат натрия

PBS - натрий-фосфатный буфер

КОЕ - колониеобразующая единица

ИА - индекс адгезии

ПИК% - процент инфицированных клеток

ОП - оптическая плотность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

RAPD - ПЦР-анализ со "случайной" затравкой

PFGE - гель-электрофорез в пульсирующем поле

MLST - типирование посредством мультилокусного

секвенирования

100 bp ladder - маркер молекулярных весов (100, 200, 300, ...1000 п.н.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ стр. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 7

2. ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 11

2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА STREPTOCOCCUS 11

2.1.1 Общие сведения 11

2.1.2 Классификация представителей рода Streptococcus 11

2.2 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О СТРЕПТОКОККАХ СЕРОГРУПЫ А 12

2.2.1 Идентификация S. pyogenes 13

2.2.2 Классификация S. pyogenes 14

2.2.3 Заболевания, вызываемые S. pyogenes, их лечение и

профилактика 18

2.3 ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМА S. pyogenes 20

2.3.1 IS элементы S. pyogenes 21

2.3.2 Транспозоны и интегрированные коньюгативные

элементы S. pyogenes 22

2.3.3 Бактериофаги S. pyogenes 24

2.3.3.1 Влияние умеренных бактериофагов на мутационный процесс у

S. pyogenes 27

2.3.3.2 Генетический полиморфизм S. pyogenes, опосредованный умеренными бактериофагами 28

2.3.3.3 Бактериофаги и антибиотикоустойчивость S. pyogenes 30

2.4 ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ S. pyogenes 32 2.4.1 Факторы патогенности, кодируемые хромосомными генами 32

2.4.1.1 Гиалуроновая капсула 32

2.4.1.2 Поверхностные белки S. pyogenes 32 2.4.1.2.1 Белок М 32

2.4.1.2.2 С5а-пептидаза 33

2.4.1.2.3 Фибронектинсвязывающие белки и Fc-рецепторы 34

2.4.1.3 Экстрацеллюлярные продукты 34

2.4.2 Факторы патогенности, кодируемые фаговыми генами 35

2.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ 38

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

3.1 Объекты исследования 40

3.2 Условия культивирования бактерий 41

3.3 Выделение хромосомной ДНК 41

3.4 Полимеразная цепная реакция 42

3.5 ПЦР со «случайной» затравкой 44

3.6 Электрофорез в пульсирующем электрическом поле 44

3.6.1 Приготовление препаратов ДНК в агарозных блоках 44

3.6.2 Рестрикция хромосомной ДНК эндонуклеазой Smal 45

3.6.3 Параметры электрофореза 45

3.7 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 46

3.8 Секвенирование 46

3.9 Рестрикция и лигирование ДНК 47

3.10 Оценка антибиотикочувствительности штаммов 47

3.11 Построение кривой роста штаммов 48

3.12 Прямой бактерицидный тест 49

3.13 Сравнение адгезивной способности штаммов S. pyogenes

по отношению к клеткам эпителия человека 49

3.14 Оценка вирулентности штаммов 50

3.15 Компьютерный анализ ДНК и статистическая обработка данных 51

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 52

4.1 Геномный полиморфизм S. pyogenes,

обусловленный умеренными бактериофагами 52

4.1.1 Распространенность генов бактериофагов

в геноме штаммов S. pyogenes 53

4.1.2 Сравнительный анализ штаммов по профилям фаговых генов 56

4.1.3 Локализация генов бактериофагов в геноме штаммов S. pyogenes 59

4.2 Влияние умеренного бактериофага NZ131.2 на

биологические свойства S. pyogenes 64

4.2.1 Получение лабораторного варианта штамма

S. pyogenes NZ131, не содержащего профаг NZ131.2 64

4.2.2 Установление генетического родства штаммов S. pyogenes

NZ131 и S. pyogenes NZ131 var 67

4.2.2.1 етт-генотигшрование 67

4.2.2.2 Наличие фаговых генов 68

4.2.2.3 Аллели гена гесР 68

4.2.2.4 Паттерны RAPD 69

4.2.2.5 Smal рестрикционные паттерны 69

4.2.3 Сравнительный анализ биологических свойств штаммов NZ131

и NZ131var 72

4.2.3.1 Рост штаммов в жидкой питательной среде 72

4.2.3.2 Адгезивность штаммов 73

4.2.3.3 Вирулентность штаммов 74

4.2.3.4 Выживаемость штаммов в человеческой крови 75

4.3 Анализ рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов

S. pyogenes методом пульс-электрофореза 76

4.4 Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAPD 81

4.4.1 Стандартизация метода RAPD 81

4.4.2 Гетерогенность паттернов RAPD штаммов S. pyogenes 83

4.5 Обнаружение и характеристика нового транспозона S. pyogenes 89

4.5.1 Обнаружение генов транспозона 89

4.5.2 Определение локализации транспозона 92

4.5.3 Наличие у S. pyogenes гена устойчивости к тетрациклину

tetM и его принадлежность транспозону 94

4.5.4 Устойчивость штаммов S. pyogenes к тетрациклину 94

5. ОБСУЖДЕНИЕ 96

5.1 Умеренные бактериофаги - основная причина генетического разнообразия штаммов S. pyogenes 96

5.1.1 Взаимосвязь между наличием фаговых генов, етт генотипом

и географическим регионом выделения штаммов 96

5.1.2 Ассоциированность генов вирулентности и генов интеграз 97

5.1.3 Локализация профагов в геноме S. pyogenes 100

5.1.4 Влияние умеренных бактериофагов на свойства

бактериальных штаммов 101

5.2 Комплексный анализ генетической неоднородности штаммов 103

5.3 Ранее не обнаруженный транспозон S. pyogenes 104

5.3.1 Значимость метода RAPD для обнаружения

мобильных генетических элементов 104

5.3.2 Транспозон как возможная причина устойчивости к

тетрациклину 105

6.ВЫВ ОДЫ 108 БЛАГОДАРНОСТИ 109 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110 ПРИЛОЖЕНИЯ 128

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Streptococcus pyogenes - патогенный для человека микроорганизм, вызывающий различные формы гнойно-септической инфекции, тонзиллит, рожистое воспаление, скарлатину, синдром токсического шока и др. (2, 78, 81, 94, 95, 123). После перенесенных инфекций, вызванных S. pyogenes, возможно развитие таких осложнений, как сепсис, пневмония, менингит (86, 87, 91, 115, 129, 154, 156), ревматизм и гломерулонефрит, способных привести к летальному исходу или инвалидизации пациентов (1, 5, 44,107, 155).

Все штаммы S. pyogenes разделяют на М-серотипы или егат-генотипы, в зависимости от антигенной специфичности белка M или нуклеотидной последовательности 5'-конца кодирующего его гена етт соответственно (53). Определенные М-серотипы (или егат-генотипы) S. pyogenes нередко ассоциируются с развитием того или иного осложнения, в зависимости от характера которого штаммы S. pyogenes подразделяют на ревматогенные и нефритогенные. Так, развитие ревматизма часто связано с инфицированием человека штаммами серотипов М5, Мб и Ml8, а развитие гломерулонефрита -штаммами серотипов Ml, М2, М4, М12, М25, М42, М49, М56, М57 и М60 (53).

Геномы штаммов S. pyogenes содержат большое количество мобильных генетических элементов, различия в составе и последовательностях которых в значительной мере обуславливают генетическое разнообразие вида. Так, суммарный размер ДНК умеренных бактериофагов может достигать 12% от общего размера генома S. pyogenes. Мобильные генетические элементы, в частности, профаги и транспозоны, могут содержать гены вирулентности и устойчивости к антимикробным препаратам (29, 40, 59, 66, 114). Приобретение таких мобильных генетических элементов штаммами-возбудителями может привести к изменению их фенотипических свойств и, как следствие, к осложнению течения заболевания и/или снижению эффективности антибиотикотерапии. В последние годы наблюдается увеличение числа

штаммов S. pyogenes, в том числе, штаммов генотипов emml и етт12, устойчивых к действию практически всех групп антибиотиков, за исключением бета-лактамных (13, 46, 71, 108, 133). Поэтому, важными задачами современной микробиологии являются изучение механизмов возникновения и быстрого распространения антибиотикоустойчивых штаммов S. pyogenes в микробной популяции и изучение роли горизонтального переноса мобильных генетических элементов в изменчивости S. pyogenes.

Таким образом, актуальным является изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, в частности, опосредованного мобильными генетическими элементами.

Изложенное выше определило цель и задачи исследования.

Цель исследования:

Изучить генетическое разнообразие штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных в различных географических регионах.

Задачи работы:

1. Изучение геномного полиморфизма S. pyogenes, обусловленного умеренными бактериофагами, и его влияния на фенотипические свойства S. pyogenes',

2. Изучение рестрикционного полиморфизма геномной ДНК штаммов S. pyogenes методом PFGE;

3. Сравнительный анализ штаммов S. pyogenes методом RAPD;

4. Выявление мобильных генетических элементов у штаммов S. pyogenes.

Научная новизна:

- впервые выявлено выраженное генетическое разнообразие штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12, выделенных в Санкт-Петербурге (Россия) и в Пекине (КНР), обусловленное умеренными бактериофагами;

- показано, что среди штаммов S. pyogenes генотипов emml и етт12 наиболее распространенными являются гены бактериофагов speA, speH, speC, ssa, кодирующие токсины, и гены int4 и int7, кодирующие интегразы бактериофагов;

- предложен комплексный подход к анализу генетической неоднородности штаммов S. pyogenes на основании сравнения профилей фаговых генов, паттернов RAPD и PFGE;

- показана возможность применения стандартизованного метода RAPD для обнаружения мобильных генетических элементов S. pyogenes;

- у штаммов S. pyogenes выявлен ранее не обнаруженный транспозон, содержащий ген устойчивости к тетрациклину tetM, и установлена его геномная локализация;

- доказано, что наличие профага NZ131.2 в геноме S. pyogenes NZ131 влияет на культуральные свойства штамма.

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования:

Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о генетическом разнообразии штаммов S. pyogenes, циркулирующих в разных географических регионах, таких как Санкт-Петербург и Пекин, и могут быть использованы для дальнейших исследований с целью оценки эпидемиологической ситуации по стрептококковой заболеваемости и для прогнозирования ее развития в Санкт-Петербурге. Показана возможность применения метода RAPD в целях изучения генетической неоднородности и обнаружения мобильных генетических элементов штаммов S. pyogenes. Разработанный комплексный подход к исследованию геномного полиморфизма может быть использован для дальнейших исследований штаммов S. pyogenes с целью их эффективной дифференциации. Данные по транспозону, впервые обнаруженному у S. pyogenes и содержащему ген устойчивости к тетрациклину, могут послужить основой для дальнейших исследований, направленных на оценку эффективности и целесообразности применения данного антибиотика

при лечении стрептококковой инфекции. Нуклеотидные последовательности ДНК, определенные в настоящей работе, депонированы в базу данных вепВапк под номерами Ж799842, Ж799843, Ж799844 и 10001862, и могут быть использованы для дальнейших научных исследований.

Апробация работы:

Материалы диссертации опубликованы в 10 научных работах (из них 4 статьи и 6 тезисов). По материалам диссертации был сделан постерный доклад на международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Греция, 2008 г.). Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (2009, 2010 гг.) и на семинаре лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (2010 г.).

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 30 рисунками, указатель литературы содержит 158 источников, в том числе 10 отечественных и 148 иностранных.

2. ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА STREPTOCOCCUS

2.1.1 Общие сведения

Бактерии рода Streptococcus являются грамположительными факультативно-анаэробными микроорганизмами и независимо от видовой принадлежности имеют сферическую или овальную форму от 0,5 до 2,0 мкм в диаметре. Деление их происходит только в одной плоскости, вследствие чего они располагаются парами и при росте на жидкой питательной среде образуют цепочки разной длины.

Стрептококки - хемоорганогетеротрофные организмы. Они растут на средах, обогащенных органическими соединениями, некоторые штаммы только в присутствии 5% СО2. Оптимальная температура роста 35-37°С, хотя они могут расти и в интервале температур 25-45°С. Эти микроорганизмы легко гибнут под воздействием высокой температуры, ультрафиолетового облучения или антисептиков, однако хорошо переносят высушивание, сохраняя жизнеспособность в высушенном состоянии длительное время (19).

2.1.2 Классификация представителей рода Streptococcus

Согласно классификации Берджи бактерии рода Streptococcus относятся к филе BXIII Firmicutes, классу Bacilli, семейству Streptococcaceae (3, 158).

Одной из двух наиболее распространенных классификаций стрептококков внутри рода является классификация, основанная на их гемолитической активности. Так, в 1919 г. Brawn выделил три варианта стрептококков по характеру роста на агаризованной среде с добавлением крови барана:

1. ß-гемолитические стрептококки (например, S. pyogenes), вызывающие гемолиз эритроцитов с формированием вокруг колоний прозрачной,

обесцвеченной зоны, ширина которой значительно варьирует и в отдельных случаях в несколько раз превышает размер колонии;

2. а-гемолитические стрептококки (например, S. viridans), образующие вокруг колоний ореолы серовато-зеленого цвета вследствие разрушения эритроцитов и превращения гемоглобина в метгемоглобин;

3. у-негемолитические стрептококки (например, S. anhaemoliticus), не образующие гемолизины и не вызывающие гемолиз эритроцитов вокруг колоний (31).

Данная классификация в основном используется на практике врачами-клиницистами при идентификации стрептококков из биологического материала.

В 1933 г. R. Lancefield предложила классифицировать стрептококки в зависимости от антигенных свойств полисахаридов, входящих в структуру их клеточной стенки. В результате исследования было выделено 17 серогрупп, обозначаемых латинскими буквами: от А до Н и от К до Т (31). Поскольку подавляюще большинство изолятов стрептококков группы А принадлежат к виду Streptococcus pyogenes, то в медицинской литературе оба термина часто рассматриваются как синонимы.

2.2 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О СТРЕПТОКОККАХ СЕРОГРУПЫ А

Стрептококки серогруппы А (,Streptococcus pyogenes), как и остальные представители рода Streptococcus, являются грамположительными факультативно-анаэробными микроорганизмами. Большинство типичных колоний, образуемых S. pyogenes на поверхности плотной питательной среды, имеет округлую форму с ровным краем, обычно диаметром 0,5-2 мм.

На поверхности плотной питательной среды S. pyogenes формирует 3 типа колоний: слизистые, матовые и блестящие. Слизистые колонии обычно большого размера и часто сливаются друг с другом. При прикосновении петлей обнаруживается их клейкая консистенция. Такие колонии формируются

штаммами, имеющими выраженную гиалуроновую капсулу. Матовые (matt) колонии (постслизистые), часто представляют собой результат высыхания (или гибели) слизистых колоний; они плоские с неровной шероховатой поверхностью и, как правило, содержат большое количество белка М. Блестящие (glossy) колонии имеют меньший размер по сравнению с другими формами; они куполообразные с блестящей поверхностью. Такие колонии обычно образуют штаммы, не имеющие хорошо выраженной капсулы и содержащие небольшое количество белкаМ (138).

2.2.1 Идентификация S. pyogenes

При заболеваниях, вызванных S. pyogenes, материалом для исследования, в зависимости от локализации и формы инфекции, является гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, моча, мокрота, спинно-мозговая жидкость, раневое отделяемое. Идентификация S. pyogenes проводится на основании морфологических особенностей роста, фенотипических характеристик и антигенной структуры.

Идентификацию S. pyogenes осуществляют по ряду морфологических, фенотипических и серологических характеристик штамма. Так, основным морфологическим критерием для идентификации является наличие (3-гемолиза при росте колоний на плотной питательной среде с добавлением дефибринированной крови барана, лошади или крупного рогатого скота.

Фенотипическую характеристику штамма осуществляют при помощи стандартных методов, таких как каталазная реакция, основанная на способности S. pyogenes за счет фермента каталазы разлагать перекись водорода до воды и кислорода, выделение которого сопровождается образованием пузырьков, что и свидетельствует о присутствии S. pyogenes в клиническом образце (10). Альтернативными способами идентификации S. pyogenes по фенотипическим признакам являются тест на чувствительность к бацитрацину и PYR-тест. Тест на чувствительность к бацитрацину основан на

способности данного соединения в определенной концентрации подавлять рост S. pyogenes, не оказывая влияния на рост других стрептококков. При этом зона з