Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномный полиморфизм стрептококка группы В-возбудителя заболеваний человека и животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Геномный полиморфизм стрептококка группы В-возбудителя заболеваний человека и животных"

На правах рукописи

ДМИТРИЕВ Александр Валентинович

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ В -ВОЗБУДИТЕЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

03.00.04-Биохимия 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в отделе молекулярной микробиологии ГУ "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук"

Научные консультанты: доктор медицинских наук, акад. РАМН

Тотолян Артем Акопович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корр. РАМН

Защита диссертации состоится 25 ноября 2004 г. в Л.'., часов на заседании Диссертационного совета Д.001.022.03 при ГУ "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук"

Киселев Олег Иванович доктор биологических наук, профессор Пиневич Александр Васильевич доктор медицинских наук Нарвская Ольга Викторовна

Ведущая организация: Военно-медицинская академия МО РФ

Автореферат разослан '

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Л.В.Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач медицинской науки и практического здравоохранения. Это объясняется распространенностью стрептококковых инфекций во всех странах мира и тяжелыми осложнениями, часто приводящими к летальным исходам.

За последние два десятилетия значительно возрос интерес к Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В, СГВ), который ранее рассматривался лишь в качестве возбудителя мастита крупного рогатого скота (Keefe G. et al., 1997). В настоящее время установлено, что этот микроб является также одним из ведущих патогенов человека при беременности и у новорожденных (Regan J. et al., 1996). Кроме того, СГВ оказались способными вызывать заболевания взрослых людей, такие как пиелонефрит, артриты, абсцессы, мастит, эндокардит, септицемию и др. Однако в России, до недавнего времени, инфекциям, вызываемым СГВ, не придавалось должного внимания. Причиной этого была и продолжает оставаться слабая лабораторно-диагностическая база, отсутствие нормативных документов по диагностике, профилактике и лечению инфекций, вызываемых СГВ, а также слабая информированность отечественных специалистов о патогенных свойствах СГВ. Как следствие, это привело к серьезной недооценке роли СГВ инфекции в акушеро-гинекологической практике и неонаталогии, где смертность от инфекций, вызванных СГВ, является крайне высокой (Regan J. et al., 1996, Schuchat A., 1998).

Уже более 70 лет иммунологический подход продолжает оставаться основным для идентификации и классификации патогенных стрептококков группы В (Lancefield R., 1934), среди которых выявляются девять различных серологических типов (la, Ib, II-VIII). Использование методов молекулярной генетики позволяет более подробно охарактеризовать стрептококки группы В и в пределах одного и того же серологического типа СГВ обнаружить различные генетические линии (Hauge M. et al., 1996). Совершенно очевидно, что реальное количество эпидемиологически значимых штаммов существенно превышает число известных серологических типов СГВ. Поэтому, использование методов молекулярной генетики с целью выявления генетических маркеров отдельных штаммов (клонов) СГВ, имеющих эпидемиологическое значение, может существенно повысить эффективность дифференцировки изолятов и изучения эпидемиологии заболеваний, вызываемых СГВ.

Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы позволяют детально охарактеризовывать штаммы СГВ, они все еще крайне редко используются при изучении эпидемиологии заболеваний, вызванных СГВ. Одной из основных причин редкого использования молекулярных методов является то, что сам выбор метода анализа не регламентирован, полностью зависит от опыта и возможностей экспериментатора, а условия проведения

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА I

исследований до сих пор не стандартизованы. Все это отрицательно сказывается на результатах анализов и точности диагностического заключения.

Очевидно, что изучение особенностей организации генома штаммов СГВ и разработка на этой основе комплекса стандартизованных молекулярных методов для изучения эпидемиологии стрептококковых инфекций, актуальны не только для медицинской науки, но и для практического здравоохранения. Новые знания о генетике и особенностях строения генома различных штаммов СГВ должны оказаться полезными для выявления эпидемиологически значимых клонов-возбудителей заболеваний и эпидемиологического надзора за распространением инфекций, вызванных стрептококками группы В.

Изложенное выше определило цель и задачи исследования.

Цель исследования:

Изучение геномного полиморфизма штаммов Streptococcus agalactiae и разработка на этой основе методов диагностики и дифференцировки стрептококков группы В - возбудителей заболеваний человека и животных.

Задачи работы:

1. Сравнительный анализ штаммов СГВ методами молекулярной генетики и определение критериев для дифференцировки штаммов, выделенных от человека и животных;

2. Изучение распространенности определенного набора генов вирулентности (bca, bac, scpB, Imb, cyl, hylB, cfb, scaB, glnA) и возможности существования "островов" патогенности у штаммов СГВ различных серотипов;

3. Изучение распространенности инсерционных последовательностей ДНК 1S1548, IS861, !SSa4, IS1381 и локализация сайтов их инсерции в хромосомную ДНК штаммов СГВ;

4. Определение организации фрагмента генома СГВ в области локализации гена вирулентности bac, кодирующего IgA связывающий белок;

5. Разработка и апробирование на клиническом материале методов ПЦР-диагностики стрептококков различных видов, вызывающих заболевания человека и животных.

Научная новизна:

Научная новизна работы заключается в комплексном сравнительном молекулярно-генетическом анализе СГВ, выделенных от человека и животных, и выявлении генетических маркеров для эффективной дифференцировки штаммов:

- впервые научно обосновано положение о существовании у стрептококков группы В "острова" патогенности, содержащего гены вирулентности scpB и Imb, кодирующие С5а пептидазу и белок, связывающий ламинин, соответственно;

- впервые установлена точная локализация гена вирулентности bac на хромосоме и обнаружен "остров" патогенности, содержащий ген bac и гены новой двухкомпонентной регуляторной системы, предположительно

позволяющей стрептококкам группы В адаптироваться и выживать в неблагоприятных условиях;

- впервые показано, что штаммы СГВ, выделенные от человека, отличаются от штаммов, выделенных от животных, наборами генов вирулентности и К элементов;

- установлено, что "горячими точками" для инсерции №8а4 в геном СГВ являются участки ДНК с высоким содержанием аденина и тимина, а число копий К элементов и их взаимное расположение в геноме СГВ может быть использовано в качестве эпидемиологического маркера штаммов;

- выявлены значительные различия в размерах геномов различных штаммов СГВ, при этом минимальный размер генома составил 2029 т.н.п., а максимальный - 2465 т.н.п., и впервые установлено значение 8ша1 рестрикционных фрагментов генома СГВ размерами от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. для дифференцировки штаммов;

- обнаружена область геномной ДНК, содержащая варьирующее количество прямых повторов размерами 44 н.п. и спейсерных участков размерами 16 н.п. у различных штаммов СГВ;

обнаружен новый ген кодирующий белок семейства

поверхностных а-подобных белков, участвующих в формировании вирулентности СГВ;

- обоснована целесообразность использования особенностей структуры генов $срВ и срп60 для ГЩР-дифференцировки штаммов различных видов стрептококков, вызывающих заболевания человека и животных.

Практическая значимость исследования:

В целом, исследование носит теоретический характер. Тем не менее, многие из полученных данных являются перспективными для дифференцировки штаммов СГВ с целью характеристики клона-возбудителя заболевания и для мониторинга инфекций, в частности, внутрибольничных инфекций, вызванных СГВ. В настоящее время метод ПНР-диагностики СГВ в биологических жидкостях человека апробирован на клиническом материале и используется в Научно-исследовательской лаборатории "Диагностика" (Санкт-Петербург) и Пекинском детском госпитале (Китай), а на основании предложенного подхода разрабатываются методические рекомендации МЗ и СР РФ по диагностике СГВ (Центр по молекулярной медицине МЗ и СР РФ, Санкт-Петербург). Предложенный экспресс-метод дифференцировки стрептококков различных видов, вызывающих мастит у крупного рогатого скота, используется в ветеринарной практике в Университете ветеринарной медицины (Кошице, Словакия).

Фрагменты ДНК, секвенированные в настоящем исследовании, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами: AY445916, ЛУ449757, ЛУ449758, ЛУ449759, ЛУ455996, AY455997, ЛУ459524, ЛУ461799, ЛУ461800, ЛУ461801, ЛУ487423, ЛУ487424, AY464086, ЛУ464087, ЛУ464088, ЛУ508648, ЛУ496926, AY598359, AY587557, ЛУ587556, ЛУ587555, ЛУ691895, ЛУ691897, ЛУ691898, ЛУ707990, ЛУ707991, ЛУ707993.

Положения, выносимые на защиту:

1. Анализ Smal рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. и анализ длин рестрикционных фрагментов, содержащих гены вирулентности и IS элементы стрептококков группы В, необходим для оценки степени генетического родства штаммов и является эффективным средством генетической дифференцировки штаммов;

2. Стрептококки группы В, содержащие ген вирулентности Ьас, кодирующий IgA связывающий белок, являются близкородственными и составляют отдельную генетическую линию. Ген вирулентности Ьас и гены двухкомпонентной регуляторной системы входят в состав "острова" патогенности СГВ;

3. Ген вирулентности scpB, кодирующий С5а пептидазу, и ген Imb, кодирующий белок, связывающий ламинин, входят в состав "острова" патогенности СГВ;

4. Штаммы СГВ, выделенные от человека, значительно отличаются от штаммов СГВ, выделенных от животных, распространенностью генов вирулентности scpB, Imb, bac и сочетаниями IS элементов IS1548, IS861, IS1381 и ISSa4;

5. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей и различия в количестве прямых повторов размерами 44 н.п. и спейсерных областей размерами 16 н.п. являются критерием для дифференцировки штаммов;

6. Белок, кодируемый геном alp5, относится к семейству а-подобных поверхностных белков СГВ, которые участвуют в формировании вирулентного фенотипа микроба;

7. ПЦР анализ с использованием праймеров на специфические области генов scpB и срп60 является перспективным подходом для дифференцировки патогенных стрептококков различных видов.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1) Высокой чувствительностью и специфичностью использованных молекулярно-генетических методов исследования (ПЦР, секвенирование, Southern гибридизация, рестрикционный анализ и др.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные;

2) Использованием современных компьютерных программ ("SEQAID", "OLIGO", "BLAST', "Multalin" и др.), электронных баз данных PubMed и Medline, а также базы данных GenBank для анализа ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 49 научных работах (из них 24 статьи и 25 тезисов) и доложены на 20 симпозиумах и конференциях: 5-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Виши (Франция) в 1998 г.; 1-ом Центрально-Европейском Конгрессе по ветеринарии, Будапешт (Венгрия) в 1999 г.; XIV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Окленд (Новая Зеландия), в 1999 г.; Международной

Конференции Чехословацкого Микробиологического общества "Актуальные проблемы микробиологии и иммунологии", Кошице (Словакия) в 1999 г.; 9-ом и Съезде Чешского и Словацкого Иммунологических обществ, Либерец (Чехия) в 2000 г.; Научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», Санкт-Петербург (Россия) в 2000 г.; 3-ем Международном Симпозиуме по антимикробным препаратам, Сеул (Южная Корея) в 2001 г.; 4-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург (Россия) в 2001 г.; 22-ом Конгрессе Чехословацкого Микробиологического Общества, Кошице (Словакия) в 2001 г.; 23-ем Международном Педиатрическом Когрессе, Пекин (Китай) в 2001 г.; VIII Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва (Россия) в 2002 г.; 6-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Эшвилл (США) в 2002 г.; Российско-Американском семинаре "Экология инфекционных заболеваний", Новосибирск (Россия) в 2002 г.; XV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Гоа (Индия) в 2002 г.; Международной конференции по функциональной геномике грамположительных микроорганизмов, Бавено (Италия) в 2003 г.; 13-ом Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Глазго (Шотландия) в 2003 г.; 10-ом Съезде Чешского и Словацкого Иммунологических обществ, Банска Быстрица (Словакия) в 2003 г.; Научно-практическом семинаре "Особенности идентификации, выделения и определения чувствительности пиогенных стрептококков", Санкт-Петербург (Россия) в 2004; 14-ом Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Прага (Чехия) в 2004 г.; 23-ем Конгрессе Чехословацкого Микробиологического Общества, Брно (Чехия) в 2004 г.

Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1998, 1999, 2000, 2002, 2003, 2004 гг.), лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (1998, 2000, 2001, 2002, 2004), кафедре микробиологии и иммунологии Университета ветеринарной медицины, Кошице (1999,2003).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 293 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 28 таблицами и 32 рисунками, указатель литературы содержит 319 источников, в том числе 9 отечественных и 310 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы 182 штамма СГВ, выделенных от человека в различных странах, и 101 штамм СГВ, выделенный из коровьего молока в Словакии, 1 штамм Streptococcus dysgalactiae и 1 штамм Streptococcus uteris, также выделенные из коровьего молока. В работе были использованы клинические изоляты Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aurevs. Штамм Escherichia coli JM109 использовали в качестве реципиента при трансформации. Все перечисленные штаммы были получены из микробиологических коллекций Национальных центров ВОЗ по изучению стрептококков в Санкт-Петербурге (Россия), г. Пекине (Китай) и г. Праге (Чехия), а также коллекции Университета Ветеринарной Медицины (г. Кошице, Словакия).

Штаммы стрептококков были группированы с использованием „Enzyme Latex Test" (BECTON DICKINSON, США). Серологическое типирование штаммов СГВ проводили с использованием набора типоспецифических антисывороток (Essum AB, Швеция) методом преципитации в агаре.

Для анализа присутствия живых культур СГВ, а также антигенных детерминант и ДНК СГВ в биологических жидкостях человека был проанализирован 71 образец крови и мочи, полученный от беременных женщин. Наличие стрептококковых антигенов в биологических жидкостях выявляли методом встречного иммуноэлектрофореза (Fung J., Wicher К., 1982).

Для культивирования стрептококков использовали среду ТНВ (Todd Hewitt Broth, Difco, США). Жидкую среду готовили и стерилизовали согласно инструкции производителя. На основе этого бульона готовили 2% агаризованные среды. Для выявления гемолитических колоний к расплавленному агару добавляли свежую баранью кровь или отмытые от консерванта бараньи эритроциты (5%). Устойчивость штаммов СГВ к действию эритромицина определяли согласно руководству (Courvalin P. et al., 1985). Штамм Е. coli JM109 с рекомбинантными плазмидами культивировали либо в жидкой среде LB (Luria Bertani) при встряхивании, либо на агаризованной среде LB с добавлением ампициллина в концентрации 75 мкг/мл при 37°С в течение ночи.

Для иммуноблотинга бактериальных клеток на чашку Петри с выросшими после 16 часов инкубации колониями стрептококков группы В накладывали нитроцеллюлозный фильтр (Hybond™-C, Amersham, Англия). Фильтр снимали через 2 мин. Нитроцеллюлозный фильтр с перенесёнными на него колониями инкубировали в 0,1% SDS и 0,2н NaOH, затем отмывали физиологическим раствором при рН=7,4 и инкубировали в 4% растворе обезжиренного молока, содержащего ДНКазу в концентрации 1 мкг/мл. После этого фильтр выдерживали 2 часа при комнатной температуре в 4% растворе обезжиренного молока, содержащего иммуноглобулины А человека (0,1 мг/мл), меченные пероксидазой хрена. Для иммунологической детекции IgA

связывающих штаммов стрептококков группы В использовали окрашивающий раствор, содержащий 3 мг/мл пара-фенилендиамина и 0,15% Н2О2.

Для выделения хромосомной ДНК бактериальные клетки осаждали центрифугированием, отМывали от питательной среды, осадок растворяли в Трис-глюкозном буфере (50 тМ Трис-HCl, рН=7,5; 8% глюкозы). Клетки лизировали добавлением лизоцима (1 мг/мл), EDTA до концентрации 10 тМ и SDS до 1%. Депротеинизацию ДНК осуществляли с помощью протеиназы К (0,5 мг/мл). Затем ДНК обрабатывали фенолом, смесью фенола с хлороформом и хлороформом. К раствору, содержащему ДНК, добавляли 2 объема 96% этанола и осаждали центрифугированием при 15000 об/мин в течение 5 минут. Осадок ДНК растворяли в ТЕ буфере.

Для экспресс-анализа ДНК методом ПЦР 1,5 мл ночной культуры осаждали центрифугированием, бактериальные клетки отМывали от питательной среды и ресуспендировали в 100 мкл 1% раствора Triton Х-100. Суспензию инкубировали при 95-100°С в течение 5-10 минут. Полученный после центрифугирования надосадок использовали для ПЦР. Для одной реакции было достаточно 5 мкл полученного препарата.

Для выделения препаратов ДНК из клинических образцов сыворотки крови и мочи, 5 мл образца центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин. Дальнейшие стадии выделения препаратов ДНК соответствовали методике выделения хромосомной ДНК.

Выделение плазмидной ДНК из рекомбинантных штаммов Е. coli проводили по ранее опубликованной методике (Birnboim H., Daly J., 1979).

Выделение фрагментов ДНК более 20 т.н.п. из агарозного геля осуществляли с использованием коммерческого препарата "QIAGEN" (USA), согласно прилагаемой инструкции. Выделение амплификатов размерами от 100 н.п. до 1500 н.п. осуществляли с помощью "Golden Beads PCR Product Purification Kit" (Китай) и "Wizard® PCR Preps DNA Purification System" (США).

Приготовление препаратов ДНК для электрофореза в пульсирующем электрическом поле проводили, как описано Elliot J. et al., 1998.

Электрофорез продуктов ПЦР, а также фингерпринтирование хромосомных ДНК проводили в 0,7-2,5% агарозном геле в горизонтальном аппарате с использованием ТВЕ (10 тМ Трис, 0,025% уксусной кислоты, 0,4 тМ EDTA) буфера. Время электрофореза и силу тока выбирали в зависимости от целей эксперимента.

Электрофорез Smal гидролизатов ДНК в пульсирующем электрическом поле проводили в 1% агарозном геле в аппарате CHEF DRIII (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием ТВЕ буфера. Время электрофореза и продолжительности импульсов выбирали в зависимости от размеров разделяемых фрагментов. Оптимальными импульсами для разделения фрагментов ДНК в пределах 55 т.н.п. - 65 т.н.п., 305 т.н.п. - 365 т.н.п., 440 т.н.п. - 495 т.н.п., 500 т.н.п. - 540 т.н.п. явились импульсы, равные 5 сек., 30 сек., 40 сек. и 50 сек., соответственно. Гель после электрофореза окрашивали

раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 30 минут. ДНК визуализировали в проходящих ультрафиолетовых лучах.

Маркерами для расчета размеров исследуемых фрагментов ДНК служили хромосомные ДНК Saccharomyces cerevisiae и конкатомеры ДНК фага X, BioRad Laboratories, (при анализе фрагментов от 20 т.н.п. до 2000 т.н.п.), ДНК фага к, гидролизованная рестриктазой Hindlll (при размере фрагментов ДНК от 500 н.п. до 20 т.н.п.) и 100 bp ladder (BioLabs, Англия) при анализе фрагментов ДНК от 100 н.п. до 1000 н.п.

Гидролиз ДНК рестриктазами проводили согласно руководству Maniatis Т. et al., 1982. При пульс-электрофорезе гидролиз препаратов ДНК достигался инкубированием 10 мм3 препарата в ТЕ буфере, содержащем 20 ед. рестриктазы Smal при 25°С в течение 4 часов.

Полимеразную цепную реакцию проводили по ранее опубликованным методикам (Saiki R. et al., 1988, Kawasaki E., 1990).

Для multiplex-PCR в одну и ту же реакционную смесь были добавлены праймеры на различные гены. В качестве матриц могли быть использованы и хромосомная ДНК, выделенная из одного штамма, и одновременно несколько хромосомных ДНК, выделенных из штаммов различных бактериальных видов.

Перенос ДНК из агарозного геля проводили по методу Southern E., 1975. Приготовление ДНК зондов и гибридизацию ДНК, перенесенной из геля, проводили в соответствии с протоколом фирмы "Roche" (Германия) к коммерческому набору "DNA Labeling and Detection Kit Nonradioactive".

Риботипирование штаммов СГВ было проведено с использованием ДНК зонда на ген rrs, кодирующего 16S рРНК. Для приготовления зонда была использована рекомбинантная плазмида pApal,8, кодирующая гены рибосомального оперона Enterococcus hirae. Плазмида была получена от Daneo-Moore L. (Sechi L., Daneo-Moore L., 1993).

Плазмида pApal,8 была гидролизована эндонуклеазами Apal и Smal. После электрофореза один из продуктов гидролиза размером около 450 т.н.п. (Apal - Smal фрагмент) был выделен из агарозы и использован в качестве ДНК зонда при риботипировании.

Для определения сайтов интеграции lSSa4 в хромосомную ДНК СГВ была выбрана следующая стратегия. Hindlll фрагменты хромосомной ДНК были дотированы в плазмидный вектор pGEM-7zf(+) (Promega, США), предварительно гидролизованный Hindlll. Амплификация лигазных смесей с праймерами, один из которых соответствовал фрагменту lSSa4, а другой -плазмиде, привела к синтезу различных продуктов, некоторые из которых были выделены из агарозного геля, очищены и секвенированы.

Секвенирование клонированных фрагментов ДНК, а также продуктов ПЦР проводили с использованием ABI Prism™ 377 Perkin-Elmer Sequencer и в соответствии с протоколом, прилагаемым фирмой "Applied Biosystems" (США) к коммерческому набору для секвенирования Big Dye Terminator Kit.

Размеры фрагментов ДНК, получающихся после электрофореза, наличие рестрикционных сайтов в последовательностях ДНК и др. рассчитывали по программе "SEQAID". Сравнительный анализ нуклеотидных

последовательностей ДНК проводили с использованием программ "BLAST' (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTA и "Multalin"

(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/). Последовательности праймеров для ПЦР были сконструированы при помощи программы "OLIGO" на основании соответствующих нуклеотидных последовательностей, доступных через базу данных GenBank (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/). Построение дендрограммы проводили согласно методике программы GelCompar™ 4.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение генов, обеспечивающих формирование вирулентного фенотипа

СГВ

У 172 штаммов СГВ, выделенных от человека и животных, была изучена распространенность потенциальных генов вирулентности Ьса, bас, scpB, Imb, cyl, hylB, cfb, scaB и glnA. Данные гены кодируют raß антигены, С5а пептидазу, белок, связывающий ламинин, гемолизин, гиалуронидазу, CAMP фактор, фактор адгезии и глутаминсинтетазу, соответственно (Воробьева Е. с соавт., 2004, Heden L. et al., 1991, Michel J. et al., 1993, Podbielski A. et al., 1994, Chmouryguina I. et al., 1996, Suvorov A. et al., 1997, Gase K. et al., 1998, Spellerberg B. et al., 1999). Основанием для проведения исследования явились крайне малые и порой противоречивые данные о распространенности этих генов у СГВ, выделенных от человека, и отсутствие данных о генах вирулентности у СГВ, выделенных от животных (Ferrieri P., 1988, Bevanger L., 1991, Mawn J. et al., 1993, Flores A., Ferrieri P., 1994, Kwam A. et al., 1994).

В результате анализа пять потенциальных генов вирулентности (glnA, cyl, hylB, scaB и cfb) были обнаружены у всех штаммов СГВ. Однако гены Ыа, bас, scpB, Imb были обнаружены лишь у части штаммов. Так, например, ген bm был выявлен у 69% штаммов, выделенных от человека, и у 51% штаммов, выделенных от животных. Ген bас, выявленный у 38% штаммов, выделенных от человека, не был обнаружен у штаммов, выделенных от животных. Гены scpB и Imb, присутствующие у всех штаммов, выделенных у человека, были обнаружены лишь у 21% штаммов, выделенных от животных (Таблица 1).

В целом, по наличию анализируемых генов вирулентности, штаммы, выделенные от человека, значительно отличались от штаммов, выделенных от животных. При этом, лишь одна из пяти возможных комбинаций генов вирулентности была обнаружена

среди штаммов, выделенных от обоих хозяев (Таблица 2). Логично предположить, что лишь отдельные штаммы СГВ способны инфицировать и устойчиво персистировать в организмах обоих хозяев. Наиболее вероятно, что для развития инфекционных заболеваний различных хозяев, вызываемых одним и тем же видом S. agalactiae, требуются определенные гены вирулентности.

Таблица 1

Распространенность потенциальных генов вирулентности у штаммов СГВ, выделенных от человека и животных

№ Ген Кодируемый белок Штаммы, Штаммы,

ПП выделенные от выделенные от

человека животных

1 bca Антиген а 96 (69%) 17(51%)

2 bac Антиген 3 53 (38%) 0 (0%)

3 scpB C5a пептидаза 139 (100%) 7(21%)

4 Imb Белок, связывающий ламинин 139 (100%) 7 (21%)

5 cyl Р-гемолизин 139(100%) 33 (100%)

6 hylB Гиалуронидаза 139 (100%) 33 (100%)

7 çfb CAMP фактор 139 (100%) 33 (100%)

8 scab Фактор агрегации 139(100%) 33 (100%)

9 glnA Глутаминсинтетаза 139 (100%) 33 (100%)

Всего штаммов 139 33

Таблица 2

Различные комбинации генов вирулентности, обнаруженные у штаммов СГВ

№ пп Комбинации генов вирулентности Штаммы, выделенные от человека Штаммы, выделенные от животных

№1 bac~bcascpB+ hylB+ Imb+ glnA* scaB* ф* суГ 43 (31%) 7(21%)

№2 bac* bca* scpB* hylB* Imb* glnA* scab+ ç/b+ cyt 53 (38%) 0%

Xs3 bac~ ЪссГ scpB* hylB+ Imb* glnA * scaB ' cfb* cyt 43(31%) 0%

№4 bac~ bca~scpB~ hylB* Imb glnA ' scaB* cfl* cyt 0% 16(49%)

№5 bac~ bca+ scpB~ hylB+ lmb~ glnA+scaBf cfl>+ cyt 0% 10(30%)

Всего штаммов 139 33

Для вышеперечисленных генов вирулентности были изучена их взаимная локализация на хромосомной ДНК СГВ. С этой целью хромосомные ДНК штаммов СГВ были гидролизованы эндонуклеазой Smal, а ДНК зонды на гены вирулентности гибридизованы со Smal рестрикционными фрагментами методом Southern гибридизации. Цель анализа заключалась в изучении возможности организации генов вирулентности в "острова" патогенности, поскольку на момент выполнения исследования "острова" патогенности у СГВ обнаружены не были.

Результаты настоящего исследования позволили установить сцепленность генов scpB и Imb и их локализацию на "острове" патогенности, что, впоследствии, было подтверждено и другими исследователями после секвенирования всего генома СГВ (Glaser P. et al., 2002, Tettelin H. et al., 2002).

Организация scpB-lmb межгенной области оказалась различной для штаммов СГВ (Рисунок 1). Всего было выявлено три типа scpB-lmb межгенной области. У ряда штаммов СГВ между генами &срВ и 1тЬ находился спейсерный участок ДНК размером 164 н.п. (тип №1). У других штаммов между генами $срВ и 1тЬ также находится спейсерный участок размером 164 н.п., однако, внутри него была обнаружена инсерционная последовательность ДНК К 1548 размером 1316 н.п. (тип №2). Кроме того, у некоторых штаммов СГВ в пределах 164 н.п. спейсерного участка мог находиться интрон GBSil размером 1857 н.п. (тип №3). Следует оmМетиIЪ, что все штаммы СГВ, выделенные от животных, которые имели гены &срВ и 1тЬ, характеризовались типом межгенной области № 1.

5' всрВ 164 н.п. 1тЬ „ 3'

9 н.п.^

5' ¡срВ 155 н.п. 151548,1316 н.п. 1тЪ 3'

б7н.п -а * 97 н.п.

5' .чсрВ ОВвП, 1857 н.п. 1тЬ 3

тип №1

тип №2

тип №3

Рисунок 1. Возможные типы ясрВ-1тЬ межгенной области.

Принимая во внимание небольшой размер спейсерного участка (164 н.п.) по сравнению с размером всего генома СГВ (~2200000 н.п.), вероятность транспозиции 181548 и GBSil в этот участок крайне мала. Тем не менее, существование штаммов СГВ с различными организациями scpB-lmb межгенных областей, по-видимому, свидетельствует о биологической значимости транспозиций К1548 и GBSil и представляет определенный интерес для дальнейшего изучения патогенных свойств СГВ.

Анализ штаммов, выделенных от коров на одной животноводческой ферме, выявил ряд генетически близкородственных и эпидемиологически связанных штаммов СГВ. При этом у некоторых штаммов, выделенных на данной ферме, были обнаружены гены вирулентности &срВ и 1тЬ, а у некоторых - не обнаружены. Учитывая сцепленность этих генов, очевидно, что в условиях биоценоза отдельные штаммы СГВ способны к приобретению генов $срВ и 1тЬ от других штаммов или к утрате данных генов (Рисунок 2).

Существование штаммов СГВ, лишенных генов $срВ и 1тЬ, и, преимущественно, выделяемых от животных, заставляет иначе взглянуть на проблему стрептококковой инфекции. Представляется вполне возможным, что штаммы СГВ без генов $срВ и 1тЬ не способны вызывать инфекционные процессы у людей. Однако вопрос о том, какие факторы стрептококков группы В действительно являются необходимыми для развития инфекционного

процесса у человека и животных, остается пока открытым. Для выявления этих факторов требуются дополнительные эксперименты, в основе которых может лежать использование микрочиповой технологии или вычитающей гибридизации, а также моделирование инфекционного процесса у лабораторных животных с целью изучения биологической активности каждого из потенциальных генов вирулентности.

Рисунок 2. Smal рестрикционные паттерны генетически близкородственных и эпидемиологически связанных штаммов СГВ. Трек 1 - штамм, не содержащий генов scpB и ЫЬ;

Трек 2 - штамм, содержащий гены scpB и ЫЬ на фрагменте размером 158 т.н.п.

В результате детального изучения фрагмента генома в области гена вирулентности bас у штамма D60, выделенного от беременной женщины, был секвенирован участок ДНК размером 10130 н.п. В пределах данного участка был выявлен фрагмент ДНК размером 8992 н.п., который к настоящему времени у СГВ обнаружен не был. Этот фрагмент содержал две прерванные (неполноразмерные) последовательности, гомологичные гену предполагаемой транспозазы S. pyogenes и инсерционной последовательности IS1167 S. pneumoniae, ген Ьас S. agalactiae, ген консервативного гипотетического белка, ген сенсорной гистидинкиназы и ген ДНК-связывающего белка регулятора ответа, гомологичные таковым S. pneumoniae, а также инсерционную последовательность ДНК IS 1381, ранее обнаруженную как у S. agalactiae, так и у S pneumoniae (Таблица 3). Дополнительные эксперименты показали, что фрагмент ДНК размером 8992 н.п. присутствует только у штаммов СГВ с геном Ьас.

Выявленные в этом фрагменте ДНК ген сенсорной гистидинкиназы и ген ДНК-связывающего белка регулятора ответа кодируют новую, ранее не обнаруженную у СГВ двухкомпонентную регуляторную систему, аналогичную описанной у S. pneumoniae (Hoskins J. et al., 2001, Tettelin H. et al., 2001), которая позволяет стрептококкам выживать в изменяющихся условиях окружающей среды. Не исключено, что именно эта двухкомпонентная система регулирует у СГВ экспрессию гена Ьас.

Таблица

Характеристика фрагмента ДНК штамма Б60 размером 10130 н.п., содержащего "остров" патогенности размером 8992 н.п.

3

Локализация на секвенированном фрагменте ДНК размером 10130 н.п. Размер, н.п. Кодируемый белок (название гена) Процент гомологии Характеристика гена Направление транскрипции по отношению к направлению репликации ДНК СГВ

1-670 Соответствует нуклеотидам 142048-142717 и 142015-142684 геномных ДНК полностью секвенированн 2603V/R, соответственно, не содержащих ген bac (Glaser P. et al., 2002, Tettelin H. et al. ых штаммов ИЕМЗ16 и 2002)

1-357 357 Белок семейства Band 7 100% (S. agalactiae) Отсутствует 5'-конец + / +

449-565 117 Консервативный гипотетический белок 100% (S. agalactiae) Полноразмерный Противоположное

671-9662 Область, специфичная для штамма D60, содержащего геи bac ("ост ров" патогенности размером 8992 н.п.)

752-1729 978 Предполагаемая транспозаза 70% (X pyogenes) Отсутствует З'-конец +/+

2008-2276 269 Инсерционная последовательность IS1167 80% (Ж pneumoniae) Отсутствует 5'-конец +/+

2431-5907 3477 Р антиген (ген bac) 99,9% (S agalactiae) Полноразмерный Противоположное

5987-6514 528 Консервативный гипотетический белок 86% (S. pneumoniae) Полноразмерный Противоположное

6623-7963 1341 Сенсорная гистидинкиназа 1-993 H.n.: 79% гомологии, 1196-1341 н.п.: 82% гомологии (S. pneumoniae) Полноразмерный Противоположное

7960-8613 654 ДНК-связывающий белок регулятора ответа 77% (S. pneumoniae) Полноразмерный Противоположное

8799-9662 864 Инсерционная последовательность IS1381 100% (S: agalactiae) 89% (S. pneumoniae) 2 полноразмерные открытые рамки считывания Противоположное

9663-10130 Соответствует областям геномных ДНК штаммов NEM316 и 2603V/R, начиная с нуклеотвдов 142919 и 142887

9723-9893 171 Гипотетический белок 97% (S. agalactiae) Полноразмерный Противоположное

Среди особенностей фрагмента ДНК СГВ размером 8992 н.п. можно выделить следующие:

1) фрагмент ДНК размером 8992 н.п. присутствует не у всех штаммов СГВ;

2) ген вирулентности Ьас и гены двухкомпонентной регуляторной системы находятся на геномной ДНК рядом друг с другом;

3) 8992 н.п. фрагмент содержит инсерционную последовательность IS 1381 и последовательность, гомологичную IS 7167 S. pneumoniae;

4) 8992 н.п. фрагмент содержит неполноразмерный ген, гомологичный гену предполагаемой транспозазы S. pyogenes;

5) Г+Ц состав анализируемой области (37,0%) отличается от Г+Ц состава (35,7% и 35,6%) полностью секвенированных геномов двух штаммов СГВ (Giaser P. et al., 2002, Tettelin H. et al., 2002).

Перечисленные особенности строения области ДНК СГВ размером 8992 н.п. являются характерными для большинства "островов" патогенности патогенных микроорганизмов (Романова Ю., Гинцбург А., 1999). Исходя из этого, можно заключить, что обнаруженный у СГВ фрагмент ДНК размером 8992 н.п. представляет собой "остров" патогенности.

Ряд штаммов СГВ, выделенных от человека и животных, были дополнительно проанализированы на наличие генов rib, bca, alp2, alрЗ и alp4, кодирующих семейство поверхностных а-подобных белков, участвующих в формировании вирулентности СГВ. В результате анализа было обнаружено, что все штаммы СГВ содержат какой-либо из генов а-подобных белков, а у двух штаммов СГВ, выделенных от животных, был обнаружен новый ген, состоящий из 852 н.п. При анализе соответствующей ему аминокислотной последовательности оказалось, что данная последовательность на 65-72% гомологична последовательностям а антигена и белков А1р2, А1рЗ, А1р4 и Rib, а ее С-терминальная область на 95-100% гомологична С-терминальным последовательностям перечисленных белков. В целом, полученные данные позволили назвать новый ген геном alp5, а соответствующий ему белок -белком А1р5 семейства а-подобных белков СГВ.

Принимая во внимание присутствие у всех штаммов СГВ какого-либо из генов а-подобных белков, перспективным представляется получение различных генно-инженерных рекомбинантных пептидов, соответствующих консервативным областям а-подобных белков для получения вакцинных препаратов против СГВ. Кроме того, получение моноклональных антител к таким рекомбинантным пептидам может явиться основанием для разработки диагностических наборов, позволяющих идентифицировать СГВ. Наибольшую ценность такие диагностические наборы могут иметь в ветеринарии и при производстве молочной продукции, так как в настоящее время диагностика и профилактика стрептококковых заболеваний крупного рогатого скота практически не производится.

Кроме уже упомянутых генов вирулентности, в настоящем исследовании 105 штаммов СГВ различных серотипов были проанализированы на наличие

генов тгеА и те/А, кодирующих устойчивость к действию эритромицина. В результате анализа было показано, что 91 штамм СГВ (87%) содержал хотя бы один из генов устойчивости к эритромицину, и лишь 14 штаммов (13%) не имели генов тгеА и те/А (Таблица 4).

Таблица 4

Сравнительный анализ устойчивости штаммов СГВ к эритромицину и наличия в геноме генов тгеА и те/А

Наличие генов устойчивости к эритромицину Характер устойчивости к эритромицину

Чувствительные Умеренно-устойчивые Устойчивые

тгеА+ те/А* (32 штамма) 13 15 4

тгеА+ те(А~ (59 штаммов) 27 21 11

тгеА~ те/А~ (14 штаммов) 14 0 0

Всего штаммов 54 (52%) 36(34%) 15 (14%)

105

При сравнении генотипа СГВ и устойчивости к действию эритромицина оказалось, что все 14 штаммов, не имеющие генов тгеА и те/А, являются чувствительными к эритромицину. Однако, среди 91 штамма, имеющего хотя бы один из генов устойчивости к эритромицину, лишь 51 штамм (56%) был идентифицирован устойчивым или умеренно-устойчивым к действию эритромицина. При этом 40 из 91 штамма СГВ (44%), имеющие хотя бы один из генов устойчивости к эритромицину, оказались чувствительными к этому препарату. Принимая во внимание, что 87% штаммов СГВ содержат, как минимум, один из генов устойчивости к эритромицину, при назначении антибиотикотерапии целесообразным представляется не только составление антибиотикограммы штамма, но и использование ПЦР анализа для характеристики его генотипа.

Молекулярно-эпидемиологический анализ СГВ и новые подходы для дифференцировки штаммов

В настоящем исследовании были выявлены новые генетические маркеры СГВ и предложены новые подходы для дифференцировки штаммов СГВ.

При анализе СГВ методом пульс-электрофореза была обнаружена гетерогенность 8ша1 рестрикционных паттернов ДНК, что привело к различиям в размерах геномов штаммов. Как оказалось, размеры геномов СГВ, выделенных от человека, варьировали от 2029 т.н.п. до 2294 т.н.п., а СГВ, выделенных от животных - от 2191 т.н.п. до 2465 т.н.п. Средний размер хромосомной ДНК штаммов составил 2212 т.н.п.

После локализации генов вирулентности на 8ша1 рестрикционных фрагментах ДНК были построены рестрикционные карты геномов СГВ. В целом, характер локализации генов на геноме и взаимное расположение 8ша!

рестрикционных фрагментов свидетельствовали о консервативности организации генома СГВ.

Анализ Smal паттернов ДНК в области от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. позволил обнаружить значительную гетерогенность Smal рестрикционных фрагментов, что позволило дифференцировать даже близкородственные штаммы СГВ (Рисунок 3). Эти данные, несомненно, заслуживают внимания эпидемиологов, поскольку обычно анализ штаммов СГВ методом пульс-электрофореза основывается на анализе электрофоретической подвижности Smal фрагментов ДНК размерами более 100-200 т.н.п. (Ferrieri P. et al., 1997, Elliot J. et al., 1998, Granlund M. et al., 1998, Rolland K. et al., 1999).

Таким образом, гетерогенность Smal паттернов ДНК в области от 42 т.н.п. до 100 т.н.п., существенно повысившую "разделяющую способность" пульс-электрофореза, можно расценивать в качестве нового генетического маркера для сравнительного анализа СГВ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рисунок 3. Гетерогенность Smal рестрикционных паттернов ДНК различных штаммов СГВ в области от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. при анализе методом пульс-электрофореза.

Треки 1-8: Smal рестрикционные паттерны ДНК различных штаммов СГВ; Трек 9 - маркер молекулярного веса

Штаммы СГВ с геном вирулентности bас продемонстрировали сходные Smal рестрикционные паттерны, отличающиеся от штаммов без этого гена (Рисунок 4).

Учитывая, что штаммы с геном bас проявляли и другие характерные особенности (сходные риботипы, серотипы, сходство в наличии 18 элементов и генов вирулентности), эти данные свидетельствуют в пользу близкородственности штаммов, содержащих ген bас. Как было отМечено ранее, ген bас, также как и гены двухкомпонентной регуляторной системы были обнаружены в пределах "острова" патогенности СГВ. Исходя из этого, логично предположить, что приобретение этого "острова" патогенности клоном-реципиентом СГВ могло обеспечить ему дополнительные биологические преимущества. Последнее привело к быстрому распространению данного клона внутри человеческой популяции и образованию новой генетической линии СГВ. Наиболее вероятно, что приобретенная способность СГВ связывать

иммуноглобулины А человека и фактора Н комплемента за счет в антигена, а также предполагаемая регуляция экспрессии гена bас с участием двухкомпонентной регуляторной системы, обусловили селективные преимущества данной генетической линии СГВ, обеспечив дополнительные средства защиты данного микроба от иммунной системы человека.

Рисунок 4. Smal рестрикционные паттерны ДНК штаммов СГВ. Треки 1-5: штаммы, не содержащие ген Ьас; Треки 6-11: штаммы, содержащие ген Ьж; Трек 12 - маркер молекулярного веса.

При риботипировании 45 эпидемиологически несвязанных штаммов СГВ, выделенных от человека, были обнаружены три Hindlll, девять ЕсоRI и двенадцать PvuII рибосомальных типов, а комплексный анализ результатов PvuII, Hindlll И EcoRI риботипирования выявил 21 комбинацию PvwII, Hindlll и EcoRI риботипов. При этом три генетических варианта, характеризующиеся риботипами Р1Н1Е1, Р1Н1Е2 и Р4Н1Е7, были наиболее распространены среди анализируемых штаммов.

Принимая во внимание, что корреляция рибосомных и серологических типов штаммов СГВ ранее установлена не была (Blumberg H. et al., 1992, Huet Н. et al., 1993, Chatellier S. et al., 1996), в настоящем исследования был проведен анализ возможной корреляции рибосомных типов штаммов СГВ и наличия различных генов вирулентности.

В результате анализа значительной корреляции Hindlll (или ЕсоШ) риботипов, генотипов и серотипов штаммов отМечено не было. С другой стороны, PvwII риботипирование продемонстрировало, что 21 из 22 штаммов СГВ, имеющих геном Ьас, относятся к риботипу Р1, и один штамм относится к риботипу Р5. Остальные 23 штамма, не содержащие ген Ьас, относились к риботипам Р2, РЗ, Р4, Р6-Р12 (Рисунок 5). Эти данные указывают на то, что PVMII риботипирование является достаточно информативным. Исключение составляли штаммы СГВ, имеющие ген Ьас. Поскольку штаммы с геном Ьас принадлежат отдельной генетической линии, как было отМечено выше, то сходство PvuII, Hindlll и ЕсоШ риботипов этих штаммов не является неожиданным.

^_ 365 т.н.п.

■*- 285 т.н.п.

<_ 225 т.н.п.

450 т.н.п.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рисунок 5. РУИЬЬриботипы штаммов СГВ. Треки 1-12 соответствуют риботипам Р1-Р12.

При сравнительном анализе результатов пульс-электрофореза и риботипирования оказалось, что эти методы являются взаимодополняющими, а для эпидемиологического анализа СГВ желательно одновременное использование обоих методов. Так, штаммы, обладающие сходными риботипами, могли быть дифференцированы с помощью пульс-электрофореза. В основном, это относится к штаммам с геном bас, многие из которых удалось дифференцировать лишь при анализе Smal фрагментов от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. С другой стороны, ряд штаммов, выделенных в различные периоды времени в различных географических зонах и имеющие идентичные Smal паттерны, оказалось возможным дифференцировать методом риботипирования.

Перспективным направлением исследований представлялось изучение у СГВ различных инсерционных последовательностей ДНК (IS элементов), которые часто влияют на вирулентность штаммов (Mahillon J., Chandler M, 1998). В качестве анализируемых IS элементов были выбраны известные у СГВ на момент исследования IS861, 1S1548, IS1381 и \SSa4 (Rubens С. et al., 1989, Granlund M. et al., 1998, Spellerberg В. et al., 2000, Tamura G. et al., 2000). В то же время, распространенность и возможные сочетания этих элементов у СГВ оставались практически неизученными. Кроме того, сведения о наличии IS элементов у штаммов СГВ, выделенных от животных, отсутствовали в научной литературе.

В результате сравнительного анализа 214 штаммов СГВ, выделенных от человека и животных, ни у одного из штаммов не было обнаружено всех четырех IS элементов, а 57 штаммов (26,6%) не содержали ни одного из IS элементов (Таблица 5).

Данные, полученные в настоящем исследовании, позволили оценить гетерогенность стрептококков группы В и обнаружить 12 различных генетических вариантов, отличающихся наличием IS элементов в геноме (10 вариантов - у штаммов, выделенных от животных, и шесть - у штаммов, выделенных у человека). С учетом того, что большинство штаммов СГВ, выделенных от животных, являются нетипируемыми по полисахаридной капсуле, гетерогенность наборов IS элементов (также как и генов

вирулентности) является тем генетическим маркером, который может быть использован в ветеринарии для целях молекулярной эпидемиологии. При сравнительном анализе были отсМечет! значительные отличия штаммов СГВ, выделенных от человека, по сравнению со штаммами, выделенными от животных. Так, например, генетический вариант СГВ, характеризующийся присутствием в геноме только 1$8а4, был обнаружен у штаммов, выделенных от животных (22,8% штаммов) и не был обнаружен у штаммов, выделенных от человека. В то же время генетические варианты 18861+181381+ ]88а4+ 181548 и 18861+181381+181548+ ISSa4-, характерные для 30,1% штаммов, выделенных от человека, не были обнаружены у штаммов, выделенных от животных (Таблица

5).

Таблица 5

Распространенность К элементов у штаммов СГВ, выделенных от человека и

животных

Генетический №61 151381 \SSa4 \S1548 Штаммы, Штаммы,

вариант выделенные от животных выделенные от человека

1 - - — - 28 (27,7%) 29 (25,7%)

2 - - + — 23 (22,8%) не обнаружен

3 - + + — 16(15,8%) не обнаружен

4 + - - — 12(11,9%) 12(10,6%)

5 + + - - 9(8,9%) 21 (18,6%)

6 - - + + 4(3,9%) не обнаружен

7 + - + + 2(1,9%) не обнаружен

8 + - « + 3 (2,9%) не обнаружен

9 — + - 1 (0,9%) 17(15,0%)

10 + + - 3 (2,9%) не обнаружен

11 + + + - не обнаружен 21 (18,6%)

12 + + — + не обнаружен 13(11,5%)

Количество штаммов 101 113

Всего штаммов 214

Лишь четыре из 12 генетических вариантов были обнаружены среди штаммов, выделенных от разных хозяев. Не исключено, что приобретение стрептококками группы В К элементов или последующее увеличение числа их копий могли инактивировать гены, ответственные за способность микроба инфицировать того или иного хозяина, что впоследствии привело к значительным отличиям штаммов, выделенных от человека, по сравнению со штаммами, выделенными от животных.

Использование в качестве дополнительного маркера интрона GBSil, также относящегося к мигрирующим генетическим элементам, позволило еще более эффективно дифференцировать анализируемые штаммы. Так, 113 штаммов СГВ, выделенных от человека и дифференцированных на шесть генетических вариантов по наличию В элементов (Таблица 5), с учетом GBSil

были дифференцированы на девять вариантов. При этом присутствие в геноме СГВ IS1548, ISSa4 и GBSil оказалось взаимоисключающим, по крайней мере, для штаммов, выделенных от человека.

Учитывая, что каждый из IS элементов (IS1548, ISSa4, IS1381, IS861) присутствует не у всех штаммов СГВ, логично предположить, что они могли быть приобретены стрептококками группы В от других микроорганизмов. Донором IS 1381 мог явиться S. pneumoniae, а донором IS 1548 - S. pyogenes, так как известно, что все штаммы S. pneumoniae и S. pyogenes содержат IS1381 и IS1548, соответственно (Sanchez-Beato A. et al., 1997, Ное N. et al., 1999).

У 113 штаммов СГВ, выделенных от человека, был проанализирован полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих IS элементы. Были выявлены шесть различных Hindlll рестрикционных паттернов ДНК (В1-В6), гибридизующихся с зондом на IS 1548, девять Hindlll паттернов (А1-А9), гибридизующихся с IS861, 13 Hindlll паттернов (D1-D13), гибридизующихся с lSSa4, и 38 ЕсоЯТ паттернов (С1-С38), гибридизующихся с зондом на IS1381 (Рисунок 6). В основе такой гетерогенности, несомненно, лежит различное количество копий IS элементов и их локализация на различных участках геномной ДНК штаммов СГВ.

В результате сравнительного анализа паттернов гибридизации с зондами на IS861, IS1548, lSSa4 и IS 1381 были обнаружены 53 различных сочетания А, В, С и D паттернов, характеризующих 84 штамма с одним или несколькими IS элементами, что позволило эффективно дифференцировать штаммы СГВ (Таблица 6).

Рисунок 6. Различные паттерны гибридизации гидролизатов хромосомных ДНК СГВ с зондами на соответствующие 18 элементы.

При сравнении серологического типа штамма и паттернов гибридизации с зондами на IS861, IS1548, lSSa4 и IS1381 была обнаружена определенная зависимость. Так, например, IS 1548 быш обнаружен лишь у штаммов серотипов III и III/R, a lSSa4 - только у штаммов серотипов II и II/с. По данным гибридизации с зондами на IS элементы, штаммы СГВ удалось дифференцировать на различные генетические кластеры. При этом, даже штаммы серотипов III и III/R, существенно отличающиеся от штаммов других серотипов, были дифференцированы на различные кластеры, что подтверждает

Таблица 6

Различные сочетания паттернов гибридизации с зондами на IS элементы

Паттерн гибридизации Число Паттерн гибридизации Число

№п.п. IS1548, IS 861, ¡SSa4, IS 1381, штаммов, № n.n. IS1548, IS861, IS.W, IS 1381, штаммов,

ЯЫШ ffiwdIII Htm1III EcoRI серотип ЯЫШ HMIII tfmdHI EcoRI серотип

— — -- -- 29 штаммов 27 - А2 — C9 II/c — 1,NT— 1

1 — — — C22 Ia-I 28 - А2 — C2 1I/R-2

2 — — — C24 Ia-2 29 - А2 — C4 II/R- 1

3 — — — C18 la-1, II/c — 1 30 - А2 — C13 II/R -1

4 — — -- C19 Ia/c-2 31 - А2 - C15 II/R -1

5 — — — C29 Ib/c-1 32 - А2 — C20 II/R -2

6 — — C36 Ib/c-1 33 — А2 « C33 II/R- 1

7 _ - — C12 ll/c-1 34 - А2 D2 C1 П-2, II/c-3

8 _ — — C26 III-l 35 — А2 D8 C1 II — 1

9 _ — _ C28 Ш-1 36 — А2 D7 C14 II — 1

10 _ — — C30 III —2 37 — А2 Dl Cll II/c-3

11 — — — C25 V-l 38 — А2 D3 C32 II/c - 1

12 _ — — C37 NT -1 39 - А2 D4 C1 II/c-3

13 — — — C38 NT— 1 40 - А2 D5 C31 II/c - 1

14 — A3 — — III-2 41 — А2 D6 C1 II/c -1

15 — A4 -- — III/R -7 42 - А2 D9 C3 II/c -1

16 — А5 - III-2 43 - А2 D10 C1 II/c - 1

17 - А7 - - IH-l 44 - А2 D12 C3 II/c - 1

18 — А2 - CIO Ia - 1, Ib/c — 2 45 - А2 D13 C35 II/c - 1

19 — А2 — C16 Ia/c-1 46 — А6 Dil C1 II/c - 1

20 — А9 — CIO Ia/c-1 47 вз AI — C5 III -1

21 — А2 — C17 Ib/c-1 48 В6 AI — C8 III -1

22 — А2 — C21 Ib/c-1 49 В1 AI — C6 III/R-2

23 — А2 - C23 Ib/c - I 50 В2 AI — C6 III/R-5

24 - А2 -- C27 Ib/c-1 51 В4 AI — C6 III/R- 1

25 - А2 -- C34 lb/c-l 52 В4 A8 — C6 1I1/R-2

26 - А2 - C1 II/c — 1 53 В5 AI - C7 III/R- 1

данные о существовании различных генетических линий у СГВ, в частности, в пределах серотипов III и III/R (Quentin R. et al., 1995, Chatellier S. et al., 1996, Ellis S. et al., 1996, Hauge M. et al., 1996, Dmitriev A. et al., 1997).

Для того, чтобы оценить, действительно ли паттерны гибридизации с зондами на IS элементы отражают степень генетического родства штаммов, штаммы СГВ были дифференцированы на различные кластеры методом пульс -электрофореза, и результаты сравнены с данными гибридизационного анализа с ДНК зондами на IS элементы. В результате была выявлена четкая корреляция, что подтвердило возможность использования рестрикционного полиморфизма фрагментов ДНК, содержащих IS элементы, для установления степени генетического родства штаммов СГВ.

В целом, данные о наличии IS элементов, количестве копий каждого из IS элементов и их локализации на геномной ДНК могут быть использованы для дифференцировки штаммов СГВ. Наиболее важным представляется то, что данные о наличии IS элементов и их локализации позволяют отнести штаммы СГВ к различным генетическим линиям, что не только коррелирует с результатами серологического типирования штаммов, но и позволяет дифференцировать штаммы в пределах одного и того же серотипа. Именно последнее может найти свое применение в целях молекулярной эпидемиологии СГВ.

В настоящем исследовании было выявлено девять сайтов инсерции ISSa4 в хромосомных ДНК различных штаммов СГВ. Основанием для проведения данного анализа явилось отсутствие информации о возможных "горячих точках" инсерции ISSa4 в геном СГВ, так как ни один из секвенированных к настоящему времени штаммов СГВ не содержал ISSa4 (Glaser P. et al., 2002, Tettelin H. et al., 2002). В результате исследований копии ISSa4 были обнаружены в "острове" патогенности, в гене "house keeping", в гене гипотетического белка, в межгенной области и др. Характерной особенностью сайтов инсерции явилось высокое содержание аденина и тимина (А+Т), что позволяет расценивать участки ДНК с высоким содержанием А+Т в качестве возможных "горячих точек" для инсерций ISSa4.

При анализе длин рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих гены вирулентности, было обнаружено, что наибольшим полиморфизмом характеризуются Hindlll рестрикционные фрагменты ДНК, содержащие ген brn (4,2 т.н.п.-7,7 т.н.п.) (Рисунок 7). Это может быть объяснено различным количеством ранее описанных повторяющихся последовательностей размерами 246 н.п. в центральной части гена brn, что, по мнению ряда авторов, коррелирует с вирулентностью штамма (Michel J. et al., 1993, Horensky D. et al., 1994).

В настоящем исследовании ряд штаммов, обладающих идентичными серологическими типами, ЕсоЫ, Hindlll и Pvull рибосомными типами и содержащих одинаковые наборы генов вирулентности и IS элементов, удалось дифференцировать лишь на основании размера Hindlll фрагмента, содержащего ген brn. Таким образом, установление числа повторов в гене brn (например,

методом ПЦР) может быть использовано для дифференцировки штаммов СГВ, что может найти свое применение в целях эпидемиологии.

Рисунок 7. Гибридизация Hindlll фрагментов хромосомной ДНК различных

штаммов СГВ с зондом на ген Ьса.

Треки 1-3, 5, 6 штаммы СГВ, содержащие ген Ьса,

Трек 4 штамм СГВ, не содержащий ген Ьса,

Трек 7 - маркер молекулярного веса

В настоящей работе была впервые обнаружена область геномной ДНК СГВ, содержащая различное количество повторяющихся последовательностей (прямых повторов) размерами 44 н п, разделенных спейсерными участками размерами 16 н п. (Рисунок 8).

Рисунок 8. Возможные варианты организации гена гипотетического белка у штаммов СГВ.

Символ О соответствует спейсерной области размером 16 н и Символ ^обозначает точечную мутацию в спейсерной области Прямоугольники с различной штриховкой соответствуют прямым повторам с различными точечными мутациями

Эта область была найдена в последовательности гена гипотетического белка, за 60 н.п. до которого могла произойти интеграция "острова" патогенности, содержащего ген bас и гены двухкомпонентной регуляторной системы (Таблица 3).

Последовательностью прямого повтора у штамма D60 явилась последовательность GCATACCCACGAGAGTAGACAAATCCGGCATCACGTG AAGGATA. а спейсерным участком - последовательность GCTTGATTCAGAAGGC. По сравнению с последовательностью прямого повтора у штаммов, имеющих одну такую последовательность (штаммы D60, A373, G-178), прямые повторы других штаммов могли содержать от одной до шести точечных мутаций. В то же время, спейсерные области были идентичны у всех штаммов СГВ, за исключением одной копии у штамма 833R (Рисунок 8). С учетом полиморфизма нуклеотидных последовательностей прямых повторов и спейсерных областей, у 10 проанализированных штаммов СГВ было обнаружено семь возможных вариантов организации гена гипотетического белка (Рисунок 8).

Прямые повторы сходного размера были найдены, в частности, у S. pyogenes и Mycobacterium tuberculosis; при этом количество прямых повторов и полиморфизм нуклеотидных последовательностей их спейсеров коррелировали с вирулентностью штамма и были эффективно использованы в эпидемиологии в качестве генетических маркеров (Groenen P. et al., 1993, Kamerbeek J. et al., 1997, Hoe N. et aL, 1999).

На сегодня остается не вполне понятным, являются ли обнаруженные в гене гипотетического белка СГВ 44 н.п. прямые повторы и 16 н.п. спейсерные области теми генетическими маркерами, которые могут быть эффективно использованы для дифференцировки штаммов. Не исключено, что дальнейшее изучение организации гена гипотетического белка у большего числа штаммов СГВ обнаружит те генетические особенности, которые найдут свое применение в молекулярной эпидемиологии заболеваний, вызванных стрептококками группы В.

Диагностика и дифференцировка стрептококков методом ПЦР

В качестве генетических признаков, позволяющих идентифицировать СГВ, были использованы особенности строения гена С5а пептидазы (scpB) и гена срп60, кодирующий 60 кДа белок теплового шока.

Известно, что ген С5а пептидазы scpB встречается лишь у стрептококков групп А, В, G, а характерной особенностью гена scpB является делеция размером 51 н.п. на 3'-конце гена, специфичная только для СГВ (Chmouryguina I. et al., 1996). С использованием праймеров на области гена scpB до и после делеции был разработан метод ПЦР-диагностики СГВ (Рисунок 9) и апробирован на клинических образцах крови и мочи. В результате была показана более высокая чувствительность и достоверность предлагаемого метода по сравнению с методами культивирования и встречного

иммуноэлектрофореза (Таблица 7), а специфичность анализа подтверждена данными Southern гибридизации.

Рисунок 9. Диагностика СГВ методом ПЦР с использованием праймеров на ген scpB.

Трек 1 - отрицательный контроль;

Трек 2 - маркер молекулярного веса (100 bp ladder);

Треки 3,4- стрептококки групп А и G (размер амплификата 306 н.п.);

Трек 5 - стрептококк группы В (размер амплификата 255 н.п.).

Таблица 7

Анализ биологических жидкостей человека методами культивирования, встречного иммуноэлектрофореза и ПЦР

Что касается гена срп60, то в результате сравнительного анализа последовательностей этого гена у различных бактерий (Goh S. et al., 1998, Brousseau R. et al., 2001) удалось выявить последовательности, специфичные только для конкретного вида. На эти последовательности были сконструированы праймеры и использованы не только для диагностики СГВ, но и для дифференцировки стрептококков различных видов (Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis) методом multiplex-PCR (Рисунок 10). Известно, что эти три вида стрептококков наиболее часто вызывают мастит у крупного рогатого скота (Phuektes P. et al., 2001), и поэтому предлагаемый подход может быть использован как в ветеринарии, так и для контроля качества при производстве молочных продуктов. Преимуществом использования гена срп60 в качестве генетического маркера является возможность избежать ложноположительные реакции и трудности при дифференцировке стрептококков с использовании генов рибосомального

оперона и гена CAMP фактора (Radstrom P. et al., 1994, Oleen P. et al., 1995, Baekman A. et al., 1999, Hassan A. et al., 2000, Phuektes P. et al., 2001).

400 н.п., S. uberis 310 н.п., S. agalactiae 192 н.п., S. disgalactiae

1 2 3 45 6 7 8 9

Рисунок 10. Multiplex-PCR анализ препаратов, содержащих S agalactiae, S.

uberis и S. dysgalactiae, с праймерами на ген срп60.

Трек 1: препарат, содержащий ДНК 5. agalactiae, S. uberis и S. dysgalactiae;

Трек 2: препарат, содержащий ДНК S. agalactiae и S. dysgalactiae;

Трек 3: препарат, содержащий ДНК S. agalactiae и S. uberis;

Трек 4: препарат, содержащий ДНК S. uberis и S. dysgalactiae;

Трек 5: препарат, содержащий ДНК только S. agalactiae;

Трек 6: препарат, содержащий ДНК только S. dysgalactiae;

Трек 7: препарат, содержащий ДНК только S. uberis;

Трек 8: отрицательный контроль;

Трек 9: маркер молекулярного веса (100 bp ladder).

С учетом обнаруженной в настоящем исследовании гетерогенности СГВ по наличию IS элементов и генов вирулентности, для экспресс-дифференцировки штаммов, вызывающих заболевания человека и животных, были выбраны гены вирулентности bac, Ъса, scpB и IS элементы IS 1381, IS861, IS1548,ISSa4 (Рисунки 11 и 12).

530 н.п. (ген bac)

255 н.п. (ген scpB) 1 184 н.п. (ген Ьса)

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 11. Multiplex-PCR анализ штаммов СГВ с праймерами на гены вирулентности.

Трек 1: отрицательный контроль; Трек 2: маркер молекулярного веса (100 bp ladder); Треки 3-5: штаммы СГВ, выделенные от животных; Треки 6-8: штаммы СГВ, выделенные от человека.

Использование multiplex-PCR позволило эффективно дифференцировать штаммы СГВ друг от друга, а также установить принадлежность штамма к конкретному генетическому варианту и отличить штаммы СГВ, выделенные от человека, от штаммов СГВ, выдел енных от животных. Именно эти обстоятельства позволяют заключить, что multiplex-PCR анализ штаммов СГВ является новым перспективным подходом для эпидемиологических исследований, тем более что этот метод является более чувствительным по сравнению с методами иммунодиагностики. Этот метод может быть использован в качестве дополнительного средства к иммунодиагностике с целью идентификации и точной характеристики клонов-возбудителей заболеваний.

Рисунок 12. Multiplex-PCR анализ штаммов СГВ с праймерами на К элементы 18861,181548, №а4 и К1381.

Треки 1-10 различные комбинации К элементов у штаммов СГВ.

Несомненными достоинствами предлагаемого метода multiplex-PCR являются также непродолжительное время анализа и существенное снижение затрат на проведение анализа по сравнению с проведением тремя-четырьмя независимыми амплификациями (с каждой парой праймеров).

Таким образом, используя multiplex-PCR, в течение несколько часов становится возможным охарактеризовать любой штамм СГВ и получить его генетическую характеристику в виде паттерна продуктов амплификации. Не исключено, что дальнейший поиск и использование дополнительных генетических маркеров позволит еще более быстро и эффективно выявлять клоны-возбудители заболеваний и вести эпидемиологический надзор за инфекциями, вызываемыми СГВ.

ВЫВОДЫ

1) У проанализированных штаммов СГВ впервые обнаружены два "острова" патогенности. В состав одного из них входят ген вирулентности Ьас, кодирующий IgA связывающий белок, и гены двухкомпонентной регуляторной системы, состоящей из сенсорной гистидинкиназы и ДНК-связывающего белка регулятора ответа. В состав другого "острова" патогенности входят ген

вирулентности scpB, кодирующий С5а пептидазу, и ген вирулентности Imb, кодирующий белок, связывающий ламинин;

2) Штаммы СГВ, содержащие ген вирулентности bас, имеют сходные рестрикционные паттерны, риботипы, серотипы, сходство в наличии IS элементов и генов вирулентности и принадлежат к отдельной генетической линии;

3) Построены генетические карты СГВ различных серотипов. Размеры геномов изученных штаммов СГВ варьируют от 2029 до 2465 т.н.п. Большинство штаммов СГВ, выделенных от людей, отличаются от штаммов, выделенных от животных, наборами генов вирулентности и IS элементов;

4) Рестрикционный анализ ДНК СГВ и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, содержащих гены вирулентности и IS элементы, позволяют оценить степень генетического родства штаммов и идентифицировать различные генетические линии СГВ;

5) В геноме СГВ обнаружен участок ДНК, содержащий прямые повторы размерами 44 н.п. и спейсерные области размерами 16 н.п. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей и различия в количестве прямых повторов и спейсерных областей могут быть использованы в качестве критерия для генетической дифференцировки штаммов;

6) Новый ген alp5 стрептококков группы В кодирует синтез белка, сходного по структуре с семейством a-подобных белков, участвующих в формировании вирулентного фенотипа СГВ;

7) Особенности строения гена scpB, кодирующего С5а пептидазу, и гена белка теплового шока, срп60, могут использоваться в качестве генетических маркеров для генодиагностики заболеваний, вызываемых S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Обзорные статьи:

1. А.Дмитриев, М.Кантикова, И.Микула, А.Тотолян. Факторы и генетика патогенности стрептококков группы В. ЖМЭИ, 2000, 5,92-97.

2. А.В.Дмитриев, Е.В.Шаклеина. Молекулярная эпидемиология патогенных стрептококков группы В. ЖМЭИ, 2003,2, 83-92.

3. Tkacikova L., Mikula I., Dmltriev A. Molecular epidemiology of group В streptococcal infections. Folia Microbiol., 2004,49,387-397.

Статьи:

1. А.Н.Суворов, А.В.Дмитриев. Генетический анализ патогенных стрептококков групп А и В. Вестник РАМН, 1998,12,49-54.

2. A.V.Dmitriev, M.Kantikova, L.Tkacikova, I.Mikula. Genetic diversity and the presence of virulence genes among group В streptococci of the bovine origin.

Proceedings of the 1th Middle-European Buiatrics Congress, Budapest, Hungary, 1999,78-81.

3. A.Dmitriev, L.Tkacikova, A.Suvorov, M.Kantikova, I.Mikula, A.Totolian. Comparative genetic study of group В streptococcal strains of human and bovine origin. Folia Microbiol., 1999,44,449-453.

4. Adong Shen, A.Dmitriev, Wang Yonghong, Zhang Guirong, Tong Yuejuan, Jiang Zaifang. Yang YH. Compararive genetic chracteristics study of group В streptococcus strains isolated from Chinese and St. Petersburg pregnant women. Chin. J. Microbiol. Immunol., 1999,19,459-460.

5. A.Dmitriev, M.Kantikova, I.Mikula, JJelinkova, A.Totolian. Genetic diversity and distribution of virulence genes among group В streptococci of bovine origin. Proceedings of XIV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, 2000,417-420.

6. A.Dmitriev, A.Shen, A.Suvorov, Y.Yang. Genetic characteristic of the clinical strains of group В streptococci by ribotyping, DNA-DNA hybridization and PCR. Proceedings of XIV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, 2000,179-183.

7. Adong Shen, Si Yue, Zhong Yan, A.Dmitriev, Huang Xinghua, Yang Yonghong. Transmission of neonatal group В streptococcal infection. Chin. J. Pediatr., 2000, 38, 9-12.

8. Dmitriev A, Tkacikova L., Totolian A, Mikula I. Features ofthe genome structure ofgroup В streptococci ofbovine origin. Folia Veterinaria, 2001, 45, 57-63.

9. A. H. Суворов, А. В. Дмитриев, А. А. Тотолян. Изучение генетических основ патогенности стрептококков групп А и В. Медицинский академический журнал, 2001,1(3), 12-22.

10. Shen Adong, Alexander Dmitriev, Yang Yonghong, Li Li, Zhang Guirong, Wang Yonghong, Tong Yue Jiuan, Jiang Zai Fang. Genetic characteristics of group В streptococcus by Southern blot and ribotyping. Chin. J. Perinat. Med., 2001, 4 (2), 105-107.

11. Dmitriev A., Hu YY., Shen AD., Suvorov A., Yang YH. Chromosomal analysis of group В streptococcal clinical strains; hoc gene positive strains are genetically homogenous. FEMS Microb. Lett., 2002,208,93-98.

12. Dmitriev A, Shakleina E, Tkacikova L, Mikula I, Totolian A. Genetic heterogeneity of the pathogenic potentials of human and bovine group В streptococci. Folia Microbiol., 2002, 47,291-295.

13. А.В.Дмитриев, YY Hu, AD Shen, А.Н.Суворов, YH Yang. Анализ клинических штаммов стрептококков группы В методами молекулярной генетики. Медицинский академический журнал, 2002,2 (2), 18-27.

14. А.В.Дмитриев, Young Ming, А.Н.Суворов, Yang Yonghong. Использование IS элементов для установления степени генетического родства штаммов стрептококков группы В различных серотипов. Вестник РАМН, 2002,12,36-38.

15. Yang M., Yang Y., Dmitriev A., Shen A., Tong Y., Shen X., Fan X. Erythromycin resistant genes in group В streptococcus. Chin. J. Pediatr., 2002, 40, 470-473.

16. A.Dmitriev, M.Yang. E.Shakleina, L.Tkacikova, A.Suvorov, I.Mikula, Y.H.Yang. The presence of insertion elements IS 1548 and 1S861 in group В streptococci. Folia Microbiol., 2003,48,105-110.

17. АВ.Дмитриев, A.D. Shen, Y.H. Yang, ААТотолян. Сравнительный анализ интегрированных последовательностей ДНК у штаммов стрептококков группы В. Медицинский академический журнал, 2003,3 (2), 36-42.

18. Shakleina Е., Dmitriev A., Tkacikova L., Suvorov A., Mikula I., Totolian A. Presence of IS elements in group В streptococci of bovine origin. Ind. J. Med. Red., 2004,119 (suppl.), 242-246.

19. Dmitriev A., Suvorov A., Shen AD., Yang YH. Clinical diagnosis of group В streptococci by scpB gene based PCR. Ind. J. Med. Res., 2004,119 (suppl.), 233-236.

20. Dmitriev A., Shen A., Shen X., Yang Y. ISSA-based differentiation of Streptococcus agalactiae strains and identification of multiple target sites for ISSa4 insertions. J. Bacteriol., 2004,186,1106-1109.

21. Dmitriev A., Shen AD., Tkacikova L., Mikula I., Yang YH. Structure of scpB-Imb intergenic region as criteria for additional classification of human and bovine group В streptococci. Acta Vet. Brno, 2004,73,215-220.

Тезисы в реферируемых журналах:

1. Dmitriev A., Shakleina E., Tkacikova L., Jelinkova J., Mikula I. New approach in epidemiology of Streptococcus agalactiae infection. Clin. Microbiol. Infect., 2003, 9 (supplement 1), 105.

2. Dmitriev A., Shen AD., Tkacikova L., Mikula I., Yang YH. Genetic structure of scpB-lmb region as a part of putative virulence island in human and bovine group В streptococci. Clin. Immunol. Allergol., 2003,13(3), 10-11.

3. Dmitriev A., Tkacikova L., Mikula I. срп60 gene based PCR identification of streptococcal species. Clin. Microbiol. Infect., 2004,10 (supplement 3), 520.

4. Dmitriev A., Tkacikova L., Mikula I. Identification of the novel a-like protein gene in group В streptococci. Clin. Microbiol. Infect., 2004,10 (supplement 3), 612.

Тезисы:

1. AV.Dmitriev, A.A.Totolian, A.N.Suvorov. Physical and genetic maps of the group В streptococcal genome. Abstracts of ASM Conference on Streptococcal Genetics, Vichy, France, 1998, 80.

2. A.Dmitriev, M.Kantikova, I.Mikula, J.Jelinkova, A.Totolian. Genetic diversity and the presence of virulence genes among group В streptococci of bovine origin. Abstracts of XIV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, Auckland, New Zealand, 1999, P4.23.

3. A.Dmitriev, A.Shen, A.Suvorov, Y.Yang. Genetic characteristics of the clinical strains of group В streptococci by ribotyping, DNA-DNA hybridization and PCR. Abstracts of XIV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, Auckland, New Zealand, 1999, P2.2.

4. A.Suvorov, A.Dmitriev, O.Vorobieva, I.Ustinovich, M.Wagner, A.Totolian. Studies of group В streptococcal genome and genes related with pathogeneity. Abstracts of XIV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, Auckland, New Zealand, 1999, P4.21.

5. A.Dmitriev, A.Shen, A.Suvorov, L.Tkacikova, M.Kantikova, I.Mikula, Y.Yang, A.Totolian. Comparative genetic study of group В streptococcal strains of human and bovine origin. Bulletin of Czechoslovakian Microbiological Society, 1999,40, 74.

6. Suvorov A., Dmitriev A., Vorobiova E., Ustinovich I., Wagner M., Mikula I., Totolian A. Group В streptococcal genes affecting host immune system. Abstracts of 9th Symposium of Czech and Slovakian Immunological Societies, Liberec, 2000, 51.

7. Е.Цибина, Е.Шаклеина, А.Дмитриев. Молекулярно-генетические методы анализа патогенных стрептококков группы В. Тезисы научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященной 110-летию Института экспериментальной медицины, 2000,184.

8. И.Морозова, А.Дмитриев. Детекция стрептококков группы В методом полимеразной цепной реакции. Тезисы научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященной 110-летию Института экспериментальной медицины, 2000, 111.

9. А. Дмитриев, М.Кантикова. Генетический анализ патогенных стрептококков группы В человеческого и животного происхождения, Тезисы научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященной 110-летию Института экспериментальной медицины, 2000,52.

10. Dmitriev А., Hu YY, Shen AD., Suvorov A., Yang YH. Chromosomal DNA analysis of group В streptococcal clinical strains. Abstracts of 3 rd International Symposium on Antimicrobial Agents and Resistance, Seoul, Korea, 2001, A-10.

11. Е.В.Шаклеина, А.В.Дмитриев. Изучение взаимной локализации генов вирулентности на хромосоме патогенных стрептококков группы В. Тезисы четвертой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2001,296.

12. Dmitriev A., Young Ming, Wang Jeming, Suvorov A., Yang Yonghong. Analysis of the presence, copy number and the chromosomal location of ISS67 and IS 1548 elements in group В streptococci. Abstracts of 22nd Congress of the Czechoslovak Society for Microbiology, Kosice, Slovakia, 2001,37.

13. Dmitriev A., Shakleina E., Tkacikova L., Mikula I., Totolian A. Differences in the genetic pathogenic potentials of human and bovine group В streptococci. Abstracts of 22nd Congress of the Czechoslovak Society for Microbiology, Kosice, Slovakia, 2001,142.

14. Young M., Dmitriev A., Yang Y. Erythromycin resistance genes in group В streptococci. Abstracts of 22nd Congress of the Czechoslovak Society for Microbiology, Kosice, Slovakia, 2001,341.

15. Shen A.D., Dmitriev A., Yang Y.H. Genetic characteristics of group В streptococcus by Southern blot and ribotyping. Abstracts of 23rd International Congress of pediatrics, Beijing, China, 2^0^|ГДЦИ0НД"ЛЬИ~ .

БИБЛИОТЕКА j СПетфвург • О» Ж »it j

16. А.В.Дмитриев, Yang Yonghong, А.Н.Суворов. Молекулярная эпидемиология и лабораторная диагностика стрептококков группы В. Материалы VIII Съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002,255.

17. A.VDmitriev, M.Young, E.V.Shakleina, A.N.Suvorov, YH.Yang. Comparative study of the presence of IS elements in human and bovine group В streptococci. Abstracts of 6th ASM Conference on Streptococcal Genetics, Asheville, USA, 2002, 90.

18. Dmitriev A, Suvorov A, Si Yue, Yang YH. Clinical diagnosis of group В streptococci by scpB gene based PCR. Abstracts of XV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, Goa, India, 2002, PA 15.

19. Shakleina E, Tkacikova L, Dmitriev A, Suvorov A, Mikula I, Totolian A. Presence of IS elements in group В streptococci of bovine origin. Abstracts of XV Lancefield International Symposium on streptococci and streptococcal diseases, Goa, India, 2002, P.4.31.

20. А.В.Дмитриев. Генетический анализ патогенных стрептококков и молекулярная эпидемиология стрептококковых инфекций. Материалы Российско-Американского семинара "Экология инфекционных заболеваний", Новосибирск, 2002, 9-10.

21. Dmitriev A., Shen A., Yang Y. Integration of ISSa4 in Streptococcus agalactiae genome: identification of the original target site and the multiple sites for lSSa4 duplication. Abstract ofthe International Conference "Functional Genomics of Grampositive Microorganisms, Baveno, Italy, 2003, 57.

Подписано в печать 22.10.2004. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/2210. П. л. 2.0. Уч.-изд. 2.0. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис», 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16

тел.: (812) 234 4333

»20 6 3

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Дмитриев, Александр Валентинович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ стр.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О СТРЕПТОКОККАХ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ В И ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Классификация стрептококков группы В

Стрептококки группы В - возбудителя заболеваний человека и животных

Лечение, профилактика и диагностика инфекций, вызванных СГВ 22 ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМА И ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В 24 Общая характеристика генома СГВ

Группоспецифический и капсульный полисахариды СГВ

Поверхностные и секретируемые белки СГВ - потенциальные факторы вирулентности

Особенности метаболизма СГВ

Адаптация СГВ к условиям стресса

Инсерционные последовательности ДНК СГВ

Острова" патогенности СГВ

ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В 36 Полисахаридная капсула СГВ

Антиген |3, связывающий иммуноглобулины А человека

Семейство поверхностных белков СГВ, устойчивых к действию трипсина

С5а пептидаза СГВ

Другие потенциальные факторы вирулентности СГВ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ,

ВЫЗВАННЫХ СТРЕПТОКОККАМИ ГРУППЫ В

Традиционные методы эпидемиологического анализа

Идентификация СГВ методом полимеразной цепной реакции

ПЦР-анализ с использованием "случайных" праймеров

Днализ рестрикционного полиморфизма хромосомной ДНК СГВ

1. Метод фингерпринтирования

2. Метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле 53 Риботипирование СГВ 57 Дифференцировка СГВ по наличию инсерционных последовательностей ДНК 60 Набор генов вирулентности - потенциальный генетический маркер штаммов СГВ 62 Сравнительный анализ штаммов СГВ, выделенных от человека и животных 62 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ 64 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 67 Бактерии, культуральные среды и условия роста 67 Иммуноблотинг бактериальных колоний 70 Выделение ДНК 70 Выделение хромосомной ДНК 70 Выделение препаратов ДНК для ПЦР 71 Выделение препаратов ДНК из клинических образцов сыворотки крови и мочи 71 Выделение плазмидной ДНК 71 Выделение ДНК из агарозного геля 72 Приготовление препаратов ДНК для электрофореза в пульсирующем электрическом поле 72 Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.5. Гидролиз ДНК рестриктазами

3.6. Полимеразная цепная реакция

3.6.1. Multiplex-PCR

3.7. Гибридизационный анализ ДНК

3.7.1. Риботипирование

3.8. Клонирование ДНК

3.9. Секвенирование ДНК

3.10. Компьютерный анализ ДНК

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И

ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. ГЕНЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ФОРМИРОВАНИЕ ВИРУЛЕНТНОГО ФЕНОТИПА СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В

4.1.1. Анализ наличия генов вирулентности у штаммов СГВ; полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, содержащих гены вирулентности

4.1.2. Изучение взаимной локализации генов вирулентности в геноме СГВ

4.1.3. Клонирование и секвенирование гена alp

4.1.4. Устойчивость штаммов СГВ к эритромицину и ее генетические детерминаты

4.1.5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1.5.1. Различия в наборах генов вирулентности у штаммов СГВ

4.1.5.2. Размеры рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих гены вирулентности, как критерии для дифференцировки штаммов СГВ

4.1.5.3. Использование а-подобных белков в молекулярной диагностике и профилактике инфекций, вызванных стрептококками группы В

4.2. ИНСЕРЦИОННЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В

4.2.1. Распространенность инсерционных последовательностей ДНК у штаммов СГВ

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих IS элементы

Локализация IS861 и IS1548 на хромосомной ДНК методом Southern гибридизации

Идентификация сайтов интеграции ISSa4 в геноме СГВ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гетерогенность штаммов СГВ по наличию IS элементов

Генетическая характеристика штаммов СГВ, выделенных от человека и содержащих ISSa

Использование IS элементов СГВ в качестве эпидемиологических маркеров

Использование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих IS элементы, для сравнительного анализа штаммов СГВ

АНАЛИЗ ШТАММОВ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В МЕТОДАМИ ПУЛЬС-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И

РИБОТИПИРОВАНИЯ

Характеристика генома штаммов СГВ методом пульсэлектрофореза

Риботипирование штаммов СГВ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гетерогенность рибосомных типов СГВ

Гетерогенность Smal рестрикционных паттернов ДНК и размеров генома штаммов СГВ

Картирование генома и сравнительный анализ штаммов

СГВ, выделенных от человека и животных

Сравнительный анализ рестрикционных паттернов ДНК

СГВ и наличия генов вирулентности

4.3.3.4.1. Генетическая однородность штаммов СГВ, содержащих ген bac

4.3.3.4.2. Анализ штаммов СГВ, выделенных от животных

4.4. ДИАГНОСТИКА СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В

И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА СТРЕПТОКОККОВ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

4.4.1. ПЦР-диагностика СГВ с использованием гена scpB в качестве

ДНК диагностического признака

4.4.2. ПЦР-диагностика СГВ с использованием гена српбО в качестве

ДНК диагностического признака

4.4.3. Использование multiplex-PCR для дифференцировки стрептококков

4.4.3.1. Multiplex-PCR с использованием праймеров на ген српбО

4.4.3.2. Multiplex-PCR с использованием праймеров на гены вирулентности СГВ

4.4.3.3. Multiplex-PCR с использованием праймеров на IS элементы СГВ

4.4.4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.4.4.1. Преимущества предлагаемых в настоящем исследовании подходов для ПЦР-диагностики СГВ

4.4.4.2. Использование предлагаемой ПЦР-диагностики СГВ для анализа образцов биологических жидкостей

4.4.4.3. Использование предлагаемых подходов для ПЦР-дифференцировки штаммов стрептококков, вызывающих заболевания человека и животных

4.5. ОРГАНИЗАЦИЯ ФРАГМЕНТА ГЕНОМА СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ В В ОБЛАСТИ ГЕНА bac

4.5.1. Клонирование и секвенирование гена bac

4.5.2. Клонирование и секвенирование гена консервативного гипотетического белка

4.5.3. Клонирование и секвенирование гена сенсорной гистидинкиназы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геномный полиморфизм стрептококка группы В-возбудителя заболеваний человека и животных"

Актуальность работы

Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач медицинской науки и практического здравоохранения. Это объясняется распространенностью стрептококковых инфекций во всех странах мира и тяжелыми осложнениями, часто приводящими к летальным исходам.

За последние два десятилетия значительно возрос интерес к Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В, СГВ), который ранее рассматривался лишь в качестве возбудителя мастита крупного рогатого скота (158). В настоящее время установлено, что этот микроб является также одним из ведущих патогенов человека при беременности и у новорожденных (238). Кроме того, СГВ оказались способными вызывать заболевания взрослых людей, такие как пиелонефрит, артриты, абсцессы, мастит, эндокардит, септицемию и др. Однако в России, до недавнего времени, инфекциям, вызываемым СГВ, не придавалось должного внимания. Причиной этого была и продолжает оставаться слабая лабораторно-диагностическая база, отсутствие нормативных документов по диагностике, профилактике и лечению инфекций, вызываемых СГВ, а также слабая информированность отечественных специалистов о патогенных свойствах СГВ. Как следствие, это привело к серьезной недооценке роли СГВ инфекции в акушеро-гинекологической практике и неонаталогии, где смертность от инфекций, вызванных СГВ, является крайне высокой (238, 255).

Уже более 70 лет иммунологический подход продолжает оставаться основным для идентификации и классификации патогенных стрептококков группы В (172), среди которых выявляются девять различных серологических типов (Ia, Ib, II-VIII). Использование методов молекулярной генетики позволяет более подробно охарактеризовать стрептококки группы Вив пределах одного

11 и того же серологического типа СГВ обнаружить различные генетические линии (131). Совершенно очевидно, что реальное количество эпидемиологически значимых штаммов существенно превышает число известных серологических типов СГВ. Поэтому, использование методов молекулярной генетики с целью выявления генетических маркеров отдельных штаммов (клонов) СГВ, имеющих эпидемиологическое значение, может существенно повысить эффективность дифференцировки изолятов и изучения эпидемиологии заболеваний, вызываемых СГВ.

Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы позволяют детально охарактеризовывать штаммы СГВ, они все еще крайне редко используются при изучении эпидемиологии заболеваний, вызванных СГВ. Одной из основных причин редкого использования молекулярных методов является то, что сам выбор метода анализа не регламентирован, полностью зависит от опыта и возможностей экспериментатора, а условия проведения исследований до сих пор не стандартизованы. Все это отрицательно сказывается на результатах анализов и точности диагностического заключения.

Очевидно, что изучение особенностей организации генома штаммов СГВ и разработка на этой основе комплекса стандартизованных молекулярных методов для изучения эпидемиологии стрептококковых инфекций, актуальны не только для медицинской науки, но и для практического здравоохранения. Новые знания о генетике и особенностях строения генома различных штаммов СГВ должны оказаться полезными для выявления эпидемиологически значимых клонов-возбудителей заболеваний и эпидемиологического надзора за распространением инфекций, вызванных стрептококками группы В.

Изложенное выше определило цель и задачи исследования.

12

Цель исследования:

Изучение геномного полиморфизма штаммов Streptococcus agalactiae и разработка на этой основе методов диагностики и дифференцировки стрептококков группы В - возбудителей заболеваний человека и животных.

Задачи работы:

1. Сравнительный анализ штаммов СГВ методами молекулярной генетики и определение критериев для дифференцировки штаммов, выделенных от человека и животных;

2. Изучение распространенности определенного набора генов вирулентности (Ъса, Ъас, scpB, Imb, cyl, hylB, cfb, scaB, glnA) и возможности существования "островов" патогенности у штаммов СГВ различных серотипов;

3. Изучение распространенности инсерционных последовательностей ДНК IS1548, IS861, lSSa4, IS 1381 и локализация сайтов их инсерции в хромосомную ДНК штаммов СГВ;

4. Определение организации фрагмента генома СГВ в области локализации гена вирулентности Ьас, кодирующего IgA связывающий белок;

5. Разработка и апробирование на клиническом материале методов ПЦР-диагностики стрептококков различных видов, вызывающих заболевания человека и животных.

Научная новизна:

Научная новизна работы заключается в комплексном сравнительном молекулярно-генетическом анализе СГВ, выделенных от человека и животных, и выявлении генетических маркеров для эффективной дифференцировки штаммов:

13 впервые научно обосновано положение о существовании у стрептококков группы В "острова" патогенности, содержащего гены вирулентности scpB и Imb, кодирующие С5а пептидазу и белок, связывающий ламинин, соответственно;

- впервые установлена точная локализация гена вирулентности bac на хромосоме и обнаружен "остров" патогенности, содержащий ген bac и гены новой двухкомпонентной регуляторной системы, предположительно позволяющей стрептококкам группы В адаптироваться и выживать в неблагоприятных условиях;

- впервые показано, что штаммы СГВ, выделенные от человека, отличаются от штаммов, выделенных от животных, наборами генов вирулентности и IS элементов;

- установлено, что "горячими точками" для инсерции в геном СГВ являются участки ДНК с высоким содержанием аденина и тимина, а число копий IS элементов и их взаимное расположение в геноме СГВ может быть использовано в качестве эпидемиологического маркера штаммов;

- выявлены значительные различия в размерах геномов различных штаммов СГВ, при этом минимальный размер генома составил 2029 т.н.п., а максимальный - 2465 т.н.п., и впервые установлено значение Smal рестрикционных фрагментов генома СГВ размерами от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. для дифференцировки штаммов;

- обнаружена область геномной ДНК, содержащая варьирующее количество прямых повторов размерами 44 н.п. и спейсерных участков размерами 16 н.п. у различных штаммов СГВ; обнаружен новый ген alp5, кодирующий белок семейства поверхностных а-подобных белков, участвующих в формировании вирулентности СГВ;

14

- обоснована целесообразность использования особенностей структуры генов $срВ и српбО для ПЦР-дифференцировки штаммов различных видов стрептококков, вызывающих заболевания человека и животных.

Практическая значимость исследования:

В целом, исследование носит теоретический характер. Тем не менее, многие из полученных данных являются перспективными для дифференцировки штаммов СГВ с целью характеристики клона-возбудителя заболевания и для мониторинга инфекций, в частности, внутрибольничных инфекций, вызванных СГВ. В настоящее время метод ПЦР-диагностики СГВ в биологических жидкостях человека апробирован на клиническом материале и используется в Научно-исследовательской лаборатории "Диагностика" (Санкт-Петербург) и Пекинском детском госпитале (Китай), а на основании предложенного подхода разрабатываются методические рекомендации МЗ и СР РФ по диагностике СГВ (Центр по молекулярной медицине МЗ и СР РФ, Санкт-Петербург). Предложенный экспресс-метод дифференцировки стрептококков различных видов, вызывающих мастит у крупного рогатого скота, используется в ветеринарной практике в Университете ветеринарной медицины (Кошице, Словакия).

Фрагменты ДНК, секвенированные в настоящем исследовании, были депонированы в базе данных ОепВапк под следующими номерами: АУ445916, АУ449757, АУ449758, АУ449759, АУ455996, АУ455997, АУ459524, АУ461799, АУ461800, АУ461801, АУ487423, АУ487424, АУ464086, АУ464087, АУ464088, АУ508648, АУ496926, АУ598359, АУ587557, АУ587556, АУ587555, АУ691895, АУ691897, АУ691898, АУ707990, АУ707991, АУ707993 (Приложения 1-27).

15

Положения, выносимые на защиту:

1. Анализ Sma\ рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. и анализ длин рестрикционных фрагментов, содержащих гены вирулентности и IS элементы стрептококков группы В, необходим для оценки степени генетического родства штаммов и является эффективным средством генетической дифференцировки штаммов;

2. Стрептококки группы В, содержащие ген вирулентности bac, кодирующий IgA связывающий белок, являются близкородственными и составляют отдельную генетическую линию. Ген вирулентности bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы входят в состав "острова" патогенности СГВ;

3. Ген вирулентности scpB, кодирующий С5а пептидазу, и ген Imb, кодирующий белок, связывающий ламинин, входят в состав "острова" патогенности СГВ;

4. Штаммы СГВ, выделенные от человека, значительно отличаются от штаммов СГВ, выделенных от животных, распространенностью генов вирулентности scpB, Imb, bac и сочетаниями IS элементов IS1548, IS861, IS 1381 и lSSa4;

5. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей и различия в количестве прямых повторов размерами 44 н.п. и спейсерных областей размерами 16 н.п. являются критерием для дифференцировки штаммов;

6. Белок, кодируемый геном alp5, относится к семейству а-подобных поверхностных белков СГВ, которые участвуют в формировании вирулентного фенотипа микроба;

7. ПЦР анализ с использованием праймеров на специфические области генов scpB и српбО является перспективным подходом для дифференцировки патогенных стрептококков различных видов.

16

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1) Высокой чувствительностью и специфичностью использованных молекулярно-генетических методов исследования (ПЦР, секвенирование, Southern гибридизация, рестрикционный анализ и др.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные;

2) Использованием современных компьютерных программ ("SEQAID", "OLIGO", "BLAST", "Multalin" и др.), электронных баз данных PubMed и Medline, а также базы данных GenBank для анализа ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 49 научных работах (из них 24 статьи и 25 тезисов) и доложены на 20 симпозиумах и конференциях: 5-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Виши (Франция) в 1998 г.; 1-ом Центрально-Европейском Конгрессе по ветеринарии, Будапешт (Венгрия) в 1999 г.; XIV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Окленд (Новая Зеландия), в 1999 г.; Международной Конференции Чехословацкого Микробиологического общества "Актуальные проблемы микробиологии и иммунологии", Кошице (Словакия) в 1999 г.; 9-ом и Съезде Чешского и Словацкого Иммунологических обществ, Либерец (Чехия) в 2000 г.; Научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», Санкт-Петербург (Россия) в 2000 г.; 3-ем Международном Симпозиуме по антимикробным препаратам, Сеул (Южная Корея) в 2001 г.; 4-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург (Россия) в 2001 г.; 22-ом Конгрессе Чехословацкого Микробиологического Общества, Кошице (Словакия) в 2001 г.; 23-ем Международном Педиатрическом Когрессе, Пекин (Китай) в 2001 г.; VIII Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов,

17 микробиологов и паразитологов, Москва (Россия) в 2002 г.; 6-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Эшвилл (США) в 2002 г.; Российско-Американском семинаре "Экология инфекционных заболеваний", Новосибирск (Россия) в 2002 г.; XV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Гоа (Индия) в 2002 г.; Международной конференции по функциональной геномике грамположительных микроорганизмов, Бавено (Италия) в 2003 г.; 13-ом Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Глазго (Шотландия) в 2003 г.; 10-ом Съезде Чешского и Словацкого Иммунологических обществ, Банска Быстрица (Словакия) в 2003 г.; Научно-практическом семинаре "Особенности идентификации, выделения и определения чувствительности пиогенных стрептококков", Санкт-Петербург (Россия) в 2004; 14-ом Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Прага (Чехия) в 2004 г.; 23-ем Конгрессе Чехословацкого Микробиологического Общества, Брно (Чехия) в 2004 г.

Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1998, 1999, 2000, 2002, 2003, 2004 гг.), лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (1998, 2000, 2001, 2002, 2004), кафедре микробиологии и иммунологии Университета ветеринарной медицины, Кошице (1999, 2003).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 293 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 28 таблицами и 32 рисунками, указатель литературы содержит 319 источников, в том числе 9 отечественных и 310 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дмитриев, Александр Валентинович

ВЫВОДЫ

1) У проанализированных штаммов СГВ впервые обнаружены два "острова" патогенности. В состав одного из них входят ген вирулентности bac, кодирующий IgA связывающий белок, и гены двухкомпонентной регуляторной системы, состоящей из сенсорной гистидинкиназы и ДНК-связывающего белка регулятора ответа. В состав другого "острова" патогенности входят ген вирулентности scpB, кодирующий С5а пептидазу, и ген вирулентности Imb, кодирующий белок, связывающий ламинин;

2) Штаммы СГВ, содержащие ген вирулентности bac, имеют сходные рестрикционные паттерны, риботипы, серотипы, сходство в наличии IS элементов и генов вирулентности и принадлежат к отдельной генетической линии;

3) Построены генетические карты СГВ различных серотипов. Размеры геномов изученных штаммов СГВ варьируют от 2029 до 2465 т.н.п. Большинство штаммов СГВ, выделенных от людей, отличаются от штаммов, выделенных от животных, наборами генов вирулентности и IS элементов;

4) Рестрикционный анализ ДНК СГВ и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, содержащих гены вирулентности и IS элементы, позволяют оценить степень генетического родства штаммов и идентифицировать различные генетические линии СГВ;

5) В геноме СГВ обнаружен участок ДНК, содержащий прямые повторы размерами 44 н.п. и спейсерные области размерами 16 н.п. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей и различия в количестве прямых повторов и спейсерных областей могут быть использованы в качестве критерия для генетической дифференцировки штаммов;

6) Новый ген alp5 стрептококков группы В кодирует синтез белка, сходного по структуре с семейством а-подобных белков, участвующих в формировании вирулентного фенотипа СГВ;

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность академику РАМН Тотоляну A.A. и профессору Суворову А.Н. за помощь в организации исследовательского процесса и в приобретении необходимых реактивов и оборудования, а также за ценные замечания при обсуждении результатов диссертационной работы.

Благодарю своих иностранных коллег Prof. Yonghong Yang, Dr. Adong Shen (Пекинский детский госпиталь, Китайская Народная Республика), Prof. Ivan Mikula, Doc. Ludmila Tkacikova (Университет Ветеринарной Медицины, Кошице, Словакия) за многолетние плодотворные совместные исследования.

Выражаю благодарность всем коллегам отдела молекулярной микробиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН за доброжелательное отношение и создание в коллективе творческой атмосферы.

Настоящее исследование было поддержано грантами 00-04-493 60а, 01-0406043, 02-04-06927 и 03-04-49760 Российского Фонда Фундаментальных Исследований, а также грантами Президента Российской Федерации МК-2782.2003.04 и НШ-2206.2003.4.

225

5. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование посвящено изучению особенностей организации генома и геномного полиморфизма S. agalactiae (стрептококки группы В, СГВ), а также разработке на основании полученных результатов методов диагностики и дифференцировки стрептококков - возбудителей заболеваний человека и животных. Актуальность исследования обусловлена недостатком знаний о геномных различиях между штаммами СГВ различных серотипов, патогенных для человека, крайне малой информацией о генетике СГВ, патогенных для животных, а также отсутствием стандартизованных методов диагностики и генотипирования штаммов СГВ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Дмитриев, Александр Валентинович, Санкт-Петербург

1. Берджи.: Краткий определитель бактерий Берджи. М.: Мир, 1980, 269280.

2. Боидаренко В.М.: Факторы патогеиности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. ЖМЭИ. 1999, 5, 34-39.

3. Бондаренко В.М.: "Острова" патогенности бактерий. ЖМЭИ. 2001, 4, 6774.

4. Булгакова Т.Н., Грабовская К.Б., Тотолян A.A.: Стрептококки группы В в патологии человека. ЖМЭИ. 1983, 8, 7-17.

5. Гинцбург А.Л.: 1998. Генодиагностика инфекционных заболеваний. ЖМЭИ. 3, 86-95.

6. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л.: Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий. ЖМЭИ. 1999,2, 22-29.

7. Устинович И.А., Гупалова Т.В., Тотолян A.A., Суворов А.Н.: Изучение IgA-рецепторного белка стрептококка группы В. Биотехнология. 2002, 1, 3-10.

8. Adams W.G., Kinney J.C., Schuchat A., Collier C.L., Papasian C.J., Kilbride H.W., Riedo F.X., Broome C.V.: Outbreak of early-onset group В streptococcal sepsis. Pediatr. Infect. Dis. J. 1993, 12, 565-570.226

9. Allardice J.G., Baskett T.F., Seshia M.M.K., Bowman N, Malazdrewicz R.: Perinatal group B streptococcal colonization and infection. Am. J. Obstet. Gynecol. 1982, 142,617-620.

10. Anderson B.E., McDonald G.A., Jones D.C., Regnery R.L.: A protective protein antigen of Rickettsia rickettsii has tandemly repeated, near-identical sequences. Infect. Immun., 1990, 58, 2760-2769.

11. Areschoug T., Stalhammar-Carlemalm M., Larsson C., Lindahl G.: Group B streptococcal surface ptoteins as targets for protective antibodies: identification of two novel proteins in strains of serotype V. Infect. Immun. 1999, 67, 6350-6357.

12. Arpin C., Daube H., Tessier F., Quentin C.: Presence of me/A and mefE genes in Streptococcus agalactiae. Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43, 944-946.

13. Backman A., Lantz P., Radstrom P., Oleen P.: Evaluation of an extended diagnostic PCR assay for detection and verification of the common causes of bacterial meningitis in CSF and other biological samples. Mol. Cell. Probes. 1999, 13,49-60.

14. Baker C.J.: Group B streptococcal infections. Clin. Perinatol. 1997, 24, 59-70.227

15. Baker C.J., Barrett F.F.: Transmission of group B streptococci among parturient women and their neonates. J. Pediatr. 1973, 83, 919-925.

16. Baker C.J., Barett F.F.: Group B streptococcal infections in infants. JAMA. 1974, 230, 1158-1160.

17. Baker C.J., Barrett F.F., Gordon R.C., Yow M.D.: Suppurative meningitis due to streptococci of Lancefield group B: a study of 33 infants. J. Pediatr. 1973, 82, 724729.

18. Baker C.J., Edwards M.S., Kasper D.L.: Role of antibody to native type III polysaccharide of group B streptococcus in infant infection. Pediatrics. 1981, 68, 544-549.

19. Baker C.J., Kasper D.L.: Correlation of maternal antibody deficiency with susceptibility to neonatal group B streptococcal infection. N. Engl. J. Med. 1976, 294, 753-756.

20. Baker C.J., Paoletti L.C., Rench M.A., Guttormsen H.-K., Carey V.J., Hickman M.E., Kasper D.L.: Use of capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine for type II group B Streptococcus in healthy women. J. Infect. Dis. 2000, 182, 11291138.

21. Baker C.J., Paoletti L.C., Guttormsen H.-K., Rench M.A., Hickman M.E., Kasper D.L.: Safety and immunogenicity of capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccines for group B streptocccal types la and lb. J.Infect. Dis. 1999, 179, 142-150.

22. Barton L.L., Feigin R.D., Lins R.: Group B beta hemolytic streptococcal meningitis in infants. J. Pediatr. 1973, 82, 719-721.

23. Bateman A., Eddy S.R., Chothia C.: Members of the immunoglobulin superfamily in bacteria. Protein Science. 1996, 5, 1939-1941.

24. Bayer A.S., Chow A.W., Anthony B.F., Guze L.B.: Serious infections in adults due to group B streptococci. Am. J. Med. 1976, 61, 498-501.228

25. Becker, I.D., Robinson, O.M., Bazan, T.S., Lopez-Osuna, M., Kretschmer, R.R.: Bactericidal capacity of newborn phagocytes against group B beta-hemolytic streptococci. Infect. Immun. 1981, 34, 535-539.

26. Beckmann C., Waggoner J.D., Harris T.O., Tamura G.S., Rubens C.E.: Identification of novel adhesins from group B streptococci by use of phage display reveals that C5a peptidase mediates fibronectin binding. Infect. Immun. 2002, 70, 2869-2876.

27. Benson J.A., Ferrieri P.: Rapid pulsed-field gel electrophoresis method for group B streptococcus isolates. J. Clin. Microb. 2001, 39, 3006-3008.

28. Benson K.D., Luchansky J.B., Elliott J.A., Degnan A.J., Willenberg H.J., Thornbery J.M., Kay H.H.: Pulsed-field fingerprinting of vaginal group B streptococcus in pregnancy. Obstet. Gynecol. 2002, 100, 545-551.

29. Bentley R. W., Leigh J. A.: Determination of 16S ribosomal RNA gene copy number in Streptococcus uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae and S. parauberis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996, 12, 1-7.

30. Betriu C., Culebras E., Gomez M., Rodriguez-A vial I., Sanchez B.A., Agreda M.C., Picazo J.J.: Erythromycin and clindamycin resistance and telithromycin susceptibility in Streptococcus agalactiae. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 1112-1114.

31. Bevanger L.: Ibc proteins as serotype markers of group B streptococci. Acta Path. Microb. Immunol. Scand. Sect. B, 1991, 231-234.229

32. Bevanger L., Brakstad O.G., Maeland J.A, Kvam A.I., Iversen G., Lyng R.V.: Aberrations in expression of the ß antigen of Streptococcus agalactiae. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 999 1001.

33. Bevanger L., Naess A.I.: Mouse protective antibodies against the Ibc proteins in group B streptococci. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B. 1985, 93, 121 124.

34. Bik E.M., Gouw R.D., Mooi F.R.: DNA fingerprinting of Vibrio cholerae strains with a novel insertion sequence element: a tool to identity epidemic strains. J. Clin. Microbiol. 1996, 34, 1453-1461.

35. Bingen E., Lambert-Zechovsky N., Mariani-Kurkdjian P., Doit C, Aujard Y., Fournerie F., Mathieu H.: Bacterial counts in cerebrospinal fluid of children with meningitis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.Dis. 1990, 9, 278-281.

36. Birnboim H.C., Daly J.: A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid. Res. 1979, 7, 1513-1523.

37. Blake M.S., Donets M., Carr D., Qi H., Tai J.Y.: Identification of the IgA binding domain on group B streptococcal ß antigen. Abstracts of XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Paris, France, 1996.

38. Bolotin A., Wincker P., Mauger S., Jaillon O., Malarme K., Weissenbach J., Ehrlich S.D., Sorokin A.: The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. Lactis IL1403. Genome Res. 2001, 11, 731-753.

39. Boyer K.M.: Neonatal group B streptococcal infections. Curr. Opin. Pediatr. 1995,7, 13-18.

40. Boyer K.M., Gadzala C.A., Burd L.I., Fischer D.E., Paton J.B., Gotoff S.P.: Selective intrapartum chemoprophylaxis of neonatal group B streptococcal early-onset disease. I. Epidemiologic rationale. J. Infect. Dis. 1983, 148, 795-801.

41. Brady L.J., Boyle M.D.: Identification of non-immunoglobulin A-Fc-binding forms and low-molecular-weight secreted forms of the group B streptococcal beta antigen. Infect. Immun. 1989, 57, 1573-1581.

42. Brady L.J., Hosana A., Askeland D., Tai J.: Cloning of non-IgA Fc binding forms of the group B streptococcal bata antigen. Abstracts of 4th International ASM Conference on Streptococcal Genetics, Santa Fe, USA. 1994, 33.

43. Brodeur B.R., Boyer M., Charlebois I., Hamel J., Couture F., Rioux C.R., Martin D.: Identification of group B streptococcal Sip protein, which elicits cross-protective immunity. Infect. Immun. 2000, 68, 5610-5618.

44. Brousseau R., Hill J.E., Prefontaine G., Goh S.H., Harel J., Hemmingsen S.M.: Streptococcus suis characterized by analysis of chaperonin 60 gene sequence. Appl. Envir. Microbiol. 2001, 67, 4828-4833.

45. Carstensen H., Christensen K.K., Grennert L., Persson K., Polberger S.: Early-onset neonatal group B streptococcal septicaemia in siblings. J. Infect. 1988, 17, 201204.

46. Chaffin D.O., Beres S.B., Yim H.H., Rubens C.E.: The serotype of type la and III group B streptococci is determined by the polymerase gene within the polycistronic capsule operon. J. Bacteriol. 2000, 182, 4466-4477.231

47. Chatellier S., Ramanantsoa C., Harriau P., Rolland K., Rosenau A., Quentin R.: Characterization of Streptococcus agalactiae strains by randomly amplified polymorphic DNA analysis. J. Clin. Microbiol. 1997, 35, 2573-2579.

48. Cheng Q., Finkel D., Hostetter M.K.: Novel purification scheme and functions for a C3-binding protein from Streptococcus pneumoniae. Biochemistry. 2000, 39, 5450-5457.

49. Christensen K.K., Svennigsen N., Pahlader K., Ingermasson E., Linden V., Christensen P.: Relation between neonatal pneumoniae and maternal carriage of B streptococci. Scand. J. Infect. Dis. 1982, 14, 261-266.

50. Chmouryguina I.I., Suvorov A.N., Ferrieri P., Cleary P.P.: Conservation of C5a peptidase genes in group A and B streptococci. Infect. Immun. 1996, 64, 2387-2390.

51. Cimolai N., Roscoe D.L.: Contemporary context for early-oneset group B streptococcal sepsis of the newborn. Am. J. Perinatol. 1995, 12, 46-49.

52. Clancy J., Dib-Hajj F., Petitpas J.W., Yuan W.: Cloning and characterization of a novel macrolide efflux gene, mreA, from Streptococcus agalactiae. Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41, 2719-2723.

53. Cleat P.H., Timmis K.N.: Cloning and expression in Escherichia coli of the Ibc protein genes of group B streptococci: binding of human immunoglobulin A to the beta antigen. Infect. Immun. 1987, 55,1151-1155.

54. Cochi S.L., Feldman R.A.: Estimating national incidence of group B streptococcal disease: the effect of adjusting for birth weight. Pediatr. Infect. Dis. J. 1983,2,414-415.

55. Colman G.: Typing of Streptococcus agalactiae (Lancefield group B). Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1988, 7, 226-231.

56. Courvalin P., Goldstein F., Philippon A., Sirot J. (eds.). 1985. L'antibiogramme. MPC-VIDEOM, Brussels, Belgium.

57. Mc Cracken G.H.Jr.: Group B streptococci: the new challenge in neonatal infections. J. Pediatr. 1973, 82, 703-705.

58. Cumming C.G.: Group B streptococcal cell surfaces. J. Med. Microbiol. 1984, 18, 151-155.

59. Dave S., Carmicle S., Hammerschmidt S., Pangburn M.K., McDaniel L.S.: Dual roles of PspC, a surface protein of Streptococcus pneumoniae, in binding human secretory IgA and factor H. J. Immunol. 2004, 173, 471-477.

60. Davin-Regli A., Abed Y., Charrel R.N., Bollet C., de Micco P.: Variations in DNA concentrations significantly affects the reproducibility of RAPD fingerprint patterns. Res. Microbiol. 1995, 146, 561-568.

61. Denning D.V., Bacer C.J., Troup N.J., Tompkins L.S.: Restriction endonucleases analysis of human and bovine group B streptococcus for epidemiologic study. J. Clin. Microb. 1989, 27, 1352-1356.

62. Dillon H.C., Khare S., Gray B.M.: Group B streptococcal carriage and disease: a 6-year prospective study. J. Pediatr. 1987, 110, 31-36.233

63. Dinger J., Muller D., Pargac N., Schwarze R.: Breast milk transmission of group B streptococcal infection. Pediatr. Infect. Dis. J. 2002, 21, 567-568.

64. Dmitriev A.V., Pak J.V., Suvorov A.N., Totolian A.A.: Analysis of pathogenic group B streptococci by pulsed field gel electrophoresis. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418,351-353.

65. Düben J., Jelinkova J., Neubauer M.: Group B streptococci in the female genital tract and nosocomial colonization of newborn. Infect. Immun. 1978, 23, 8994.

66. Duma R.J., Weinberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J.: Streptococcal infections: a bacteriologic and clinical study of streptococcal bacteremia. Medicine. 1969, 48, 87-127.

67. Edwards M.S., Kasper D.L., Jennings H.J., Baker C.J., Nicholson-Weiler A.: Capsular sialic acid prevents activation of the alternative complement pathway by type III, group B streptococci. J. Immunol. 1982, 128, 1278-1283.

68. Elliot J.A., Farmer K.D., Facklam R.R.: Sudden increase in isolation of group B streptococci, serotype V, is not due to emergence of a new pulsed-field gel electrophoresis type. J. Clin. Microbiol. 1998, 36, 2115-2116.

69. Ellis S., Kotiw M., Garland S.M.: Restriction endonuclease analysis of group B streptococcal isolates from two distinct geographical regions. J. Hosp. Infect. 1996, 33, 279-287.

70. Estuningsih S., Soedarmanto I., Fink K., Lammler C., Wibavan I.W.T.: Studies on Streptococcus agalactiae isolated from bovine masitis in Indonesia. J. Vet. Med. 2002, 49, 185-187.

71. DiFabrio J.L., Michon F., Brisson J.-R., Jennings H.J., Wessels M.R., Benedi V.-J., Kasper D.L.: Structure of the capsular polysaccharide antigen of type IV group B Streptococcus. Can. J. Chem. 1989, 67, 877-882.

72. Facklam R.R., Washington J.A.: Streptococcus and related catalase-negative gram-positive cocci. In: Manual of Clinical Microbiology, edited by Balows A., Hausler W.Jr. and Herrman K.L. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1991, 238-239.

73. Faxelius G., Bremme K., Christensen K.K., Christensen P., Ringertz S.: Neonatal septicemia due to group B streptococci perinatal risk factors and outcome of subsequent pregnancies. J. Perinat. Med. 1988, 16, 423-430.

74. Fasola E., Livdahl C., Ferrieri P.: Molecular analysis of multiple isolates of the major serotypes of group B streptococci. J.Clin.Microbiol. 1993, 31, 2616-2620.

75. Ferretti J.J., Suvorov A.N.: Islands of genetic novelity. Heredity. 2002, 89, 407-408.

76. Ferrieri P.: Surface-localized protein antigens of Group B Streptococci. Rev. Infect. Dis. 1988, 10, 363-366.

77. Ferrieri P.: GBS infections in the newborn infant: diagnosis and treatment. Antibiot. Chemoter., 1985, 35, 211-215.

78. Ferrieri P., Cleary P.P., Seeds A.E.: Epidemiology of group B streptococcal carriage in pregnant women and newborn infants. J. Med. Microb. 1977, 10, 103-114.235

79. Ferrieri P., Cho D.S., Livdahl C., Rubens C.E., Flores A.E.: DNA restriction profiles of nontypable group B streptococcal clinical isolates. Adv. Exp. Med. Biol. 1997,418,343-346.

80. Ferrieri P., Flores A.: Surface protein expression in group B streptococcal invasive isolates. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 635 637.

81. Ferrieri P., Gray E.D., Wannamaker L.W.: Biochemical and immunological characterization of the extracellular nucleases of GBS. J. Exp. Med. 1980, 51, 56 -58.

82. Flores A.E., Ferrieri P.: Molecular species of R-protein antigens produced by clinical isolates of group B streptococci. J. Clin. Microbiol. 1989, 27, 1050 1054.

83. Flores A.E., Ferrieri P.: Characterization of trypsin resistant proteins of group B streptococci (GBS). In: Pathogenic streptococci: present and future, edited by A.Totolian. St.Petersburg, Russia: Lancer Publications, 1994, 333-334.

84. Forsman P., Tilsala-Timisjarvi A., Alatossava T.: Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 16S-23S rRNA spacer regions. Microb. Reading. 1997, 143, 3491-3500.

85. Franciosi R.A., Knostman J.D., Zimmerman R.A.: Group B streptococcal neonatal and infant infections. J. Pediatr. 1973, 82, 707-710.

86. Fung J.C., Wicher K.: Comparison of slide agglutination test (Phadebact) with counterimmunoelectrophoresis for detection of streptococcal group antigens. Am. J. Clin. Pathol. 1982, 77, 608-610.

87. Gaillot O., Bregenholt S., Jaubert F., Di Santo J.P., Berche P.: Stress-induced ClpP serine protease of Listeria monocytogenes is essential for induction of listeriolysin O-dependent protective immunity. Infect. Immun. 2001, 69, 4938-4943.236

88. Gaillot O., Poyart C., Berche P., Trieu-Cuot P.: Molecular characterization and expression analysis of the superoxide dismutase gene from Streptococcus agalactiae. Gene. 1997, 204,213-218.

89. Gallagher P.G., Watanakunakorn C.: Group B streptococcal endocarditis: report of seven cases and review of the literature, 1962- 1985. Rev. Infect. Dis. 1986, 8, 175-188.

90. Ganapathy M.E., Rissing J.R.: Group B streptococcal vertebral osteomyelitis bacteremia. South. Med. J. 1995, 88, 350-351.

91. Gardam M.A., Low D.E., Saginur R., Miller M.A.: Group B streptococcal necrotizing fascitis and streptococcal toxic-shock-like syndrome in adults. Arch. Intern. Med. 1998, 158, 1704-1708.

92. Garland S.M., Kelli N.: Early-onse neonatal group B streptococcal sepsis: economics of various prevention strategies. Med. J. Aust. 1995, 162, 413-417.

93. Gase K., Ferretti J.J., Primeaux C., McShan W.M.: Identification, cloning, and expression of the CAMP factor gene (cfa) of group A streptococci. Infect. Immun. 1999, 67, 4725-4731.

94. Gase K., Ozegowski J., Malke H.: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase: completion of the sequence and expression analysis. Biochim. Biophys. Acta. 1998,1398, 86-98.

95. Gordillo M.E., Singh K.V., Baker C.J., Murray B.E.: Typing of group B streptococci: comparison of pulsed-field gel electrophoresis and conventional electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 1993, 31, 1430-1434.

96. Granlund M., Michel F., Norgren M.: Mutually exclusive distribution of IS1548 and GBSil, an active group II intron identified in human isolates of group B streptococci. J. Bacteriol. 2001, 183, 2560-2569.

97. Granlund M., Oberg L., Sellin M., Norgren M.: Identification of a novel insertion element, IS1548, in group B streptococci, predominantly in strains causing endocarditis. J. Infect. Dis. 1998, 177, 967-976.

98. Gravekamp C., Horensky D.S., Michel J.L., Madoff L.: Variation in repeat number within the alpha C protein of group B streptococci alters antigenicity and protective epitopes. Infect. Immun. 1996, 64, 3576-3583.

99. Greisen K., Loeffelholz M., Purohit A., Leong D.: PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, inclusing bacteria found in cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 1994, 32, 335-351.

100. Groisman E.A., Ochman H.: Pathogenicity islands: bacterial evolution in quantum leaps. Cell. 1996, 87, 791-794.

101. Gupta, R. S.: Evolution of the chaperonin families (Hsp60, HsplO and Tcp-1) of proteins and the origin of eukaryotic cells. Mol. Microbiol. 1995, 15, 1-11.

102. Gurtler V., Stanisich V.A.: New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology. 1996, 142, 3-16.

103. Hacker J.: Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annu. Rev. Microbiol. 2000, 54, 641-679.238

104. Hacker J., Blum-Oehler G., Muhldorfer I., Tschape H.: Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol. Microbiol. 1997, 23, 1089-1097.

105. Hall L.M., Duke B., Urwin G.: An approach to the identification of the pathogens of bacterial meningitis by the polymerase chain reaction. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995, 14, 1090-1094.

106. Hassan A., Abdulmawjood A., Yildirim A.O., Fink K., Lammler C., Schlenstedt R.: Identification of streptococci isolated from various sources by determination of cfb gene and other CAMP-factor genes. Can J. Microbiol. 2000, 46, 946-951.

107. Haug R.H., Hoiby E.A., Lermark G.: Serotyping and bacteriophage typing of group B streptococci. NIPH Ann. (Norway). 1983, 6, 119-123.

108. Hauge M., Jespersgaard C., Poulsen K., Kilian, M.: Population structure of Streptococcus agalactiae reveals an association between specific evolutionary lineages and putative virulence factors but not disease. Infect. Immun. 1996, 64, 919925.

109. Hoe N., Nakashima K., Grigsby D., Pan X., Dou S.J., Naidich S., Garcia M., Kahn E., Bergmire-Sweat D., Musser J.M.: Rapid molecular genetic subtyping of serotype Ml group A Streptococcus strains. Emerg. Infect. Dis. 1999, 5, 254-263.

110. Hollingshead S.K., Fischetti V.A., Scott J.R.: Size variation in group A streptococcal M protein is generated by homologous recombination between intragenic repeats. Mol. Gen. Genet., 1987, 207, 196-203.

111. Holmstrom B., Grimsley E.W.: Necrotizing fasciitis and toxic shock-like syndrome caused by group B streptococcus. South. Med. J. 2000, 93, 1096-1098.

112. Horaud T., de Cespedes G., Trieu-Cuot P.: Chromosomal gentamicin resistance transposon Tn3706 in Streptococcus agalactiae B128. Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 1085-1090.

113. Hunter P.R., Gaston M.A.: Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988, 26,361-362.

114. Hynes W.L., Ferretti J.J.: Sequence analysis and expression in Escherichia coli of the hyaluronidase gene of Streptococcus pyogenes. Infect. Immun. 1989, 57, 533539.

115. Iannelli F., Oggioni M.R., Pozzi G.: Allelic variation in the highly polymorphic locus pspC of Streptococcus pneumonaie. Gene. 2002, 284, 63-71.

116. Jackson P.J., Dao M.L., Lim D.V.: Cell-associated collagenolytic activity by group B streptococci. Infect. Immun. 1994, 62, 5647 5651.

117. Jennings HJ., Katzenellenbogen C., Lugowski C., Kasper D.L.: Structure of the native polysaccharide antigens of type la and lb group B Streptococcus. Biochemistry. 1983,22, 1258-1263.

118. Jennings HJ., Rossell K.-G., Katzenellenbogen C., Kasper D.L.: Structural determination of the capsular polysaccharide antigen of type II group B Streptococcus. J. Biol. Chem. 1983, 258, 1793-1798.

119. Jensen N.E., Aarestrup F.M.: Epidemiological aspects of group B streptococci of bovine and human origin. Epidemiol. Infect. 1996,117, 417-422.241

120. Jerlstrom P.J., Chhatwal G.S., Timmis K.N.: The IgA binding (3 antigen of the c protein complex of group B streptococci: sequence determination of its gene and detection of two binding regions. Molec. Microb. 1991, 5, 843-849.

121. Jerlstrom P.G., Talay S.R., Valentin-Weigland P., Timmis K.N., Chhatwal G.S.: Identification of an immunoglobulin A binding motif located in the b-antigen of the c protein complex of group B streptococci. Infect. Immun. 1996, 64, 2787-2793.

122. Jiang M., Babiuk L.A., Potter A.A., Jiang M.: Cloning, sequencing and expression of the CAMP factor gene of Streptococcus uberis. Microbial Pathogenesis. 1996, 20, 297-307.

123. Johnson D.R., Ferrieri P.: Group B streptococcal Ibc protein antigen: distribution of two determinants in wild-type strains of common serotypes. J.Clin. Microbiol. 1984, 19, 506-510.

124. Jones A.L., Knoll K.M., Rubens C.E.: Identification of Streptococcus agalactiae virulence genes in the neonatal rat sepsis model using signature-tagged mutagenesis. Molec. Microb. 2000, 37, 1444-1455.

125. Kasper D.L., Baker C.J., Jennings H.J.: Cell structure and antigenic composition of GBS. Antibiot. Chemoter. 1985, 35, 90-100.

126. Kawasaki E.: Amplification of genomic DNA. In: PCR protocols, edited by Innis M., Geland D., Sninsky J. and White T. San Diego: Academic Press, 1990, 1328.

127. Keefe G.P.: Streptococcus agalactiae mastitis: a review. Can. Vet. J. 1997, 38, 429-437.

128. Kiel J.A., Boels J.M., Ten Berge A.M., Venema G.: Two putative insertion sequences flank a truncated glycogen branching enzyme gene in the thermophile Bacillus stearothermophilus. DNA Seq. 1993, 4, 1-9.242

129. Kogan G., Uhrin D., Brisson J.R., Paoletti L.C., Blodgett A.E., Kasper D.L., Jennings H.J.: Structural and immunochemical characterization of the type VIII group B Streptococcus capsular polysaccharide. J. Biol. Chem. 1996, 271, 87868790.

130. Kong F., Gowan S., Martin D., James G., Gilbert G.L.: Molecular profiles of group B streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 620-626.

131. Lachenauer C.S., Creti R., Michel J.L., Madoff L.C.: Mosaicism in the alphalike protein genes of group B streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97, 9630-9635.

132. Lachenauer C.S., Madoff L.C.: Cloning and expression in Escherichia coli of a protecive surface protein from type V group B streptococci. Adv. Exp. Med. Biol. 1997,418,615-618.

133. Lagergard T., Shiloach J., Robbins J.B., Schneerson R.: Synthesis and immunological properties of conjugates composed of group B Streptococcus type III capsular polysaccharide covalently bound to tetanus toxoid. Infect. Immun. 1990, 58, 687-694.

134. Lammler C., Schwarz S., Wibawan I.W., Ott E., Bopp V., Martinez-Tagle A.: Comparison of streptococci of serological group B isolated from healthy carriers and active disease in Chile. J. Med. Microb. 1995, 42, 161-164.

135. Lancefield R.C.: A serological identification of human and other groups of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 1933, 57, 571-595.

136. Lancefield R.C.: A serological differentiation of specific types of bovine hemolytic streptococci (group B). J. Exp. Med. 1934, 59, 441-458.

137. Lancefield R.C., Freimer E.H.: Type-specific polysaccharide antigens of group B streptococci. J. Hyg. (Lond). 1966, 64, 191-203.

138. Lars B., Brakstad O.G., Maeland J.A., Kvam A.I., Iversen G., Lyng R.V.: Aberrations in expression of the beta antigen of Streptococcus agalactiae. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 999-1001.

139. Larsson C., Stalhammar-Carlemalm M., Lindahl G.: Experimental vaccination against group B streptococcus, as encapsulated bacterium, with highly purified preparations of cell surface proteins Rib and a. Infect. Immun. 1996, 64, 3518 3523.

140. Larsson C., Stalhammar-Carlemalm M., Lindahl G.: Protection against experimental infection with group B streptococcus by immunization with a bivalent protein vaccine. Vaccine. 1999, 17, 454-458.

141. Li Y.H., Lau P.C., Tang N., Svensater G., Ellen R.P., Cvitkovitch D.G.: Novel two-component regulatory system involved in biofilm formation and acid resistance in Streptococcus mutans. J. Bacteriol. 2002, 184, 6333-6342.

142. Lee C.A.: Pathogenicity islands and the evolution of bacterial pathogens. Infect. Agents Dis., 1996, 5, 1-7.

143. Lin B., Averett W.F., Novak J., Chatham W.W., Hollingshead S.K., Coligan J.E., Egan M.L., Pritchard D.G.: Characterization of PepB, a group B streptococcal oligopeptidase. Infect. Immun. 1996. 64: 3401-3406.

144. Lindahl G., Akerstrom B.: Receptor for IgA in group A streptococci: cloning of the gene and characterization of the protein expressed in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1989, 3, 239-247.

145. Lindahl G., Akerstrom B., Vaerman J.-P., Stenberg L.: Characterization of an IgA receptor from group B streptococci: specificity for serum IgA. Eur. J. Immunol. 1990, 20, 2241-2247.

146. Limansky A.S., Sutich E.G., Guardati M.C., Toresani I.E., Viale A.M.: Genomic diversity among Streptococcus agalactiae isolates detected by a degenerate oligonucleotide-primed amplification assay. J. Infect. Dis. 1998, 177, 1308-1313.245

147. Madoff L.C., Hori S., Michel J.L., Baker C.J., Kasper D.L.: Phenotypic diversity in the alpha C protein of group B streptococci. Infect. Immun. 1991, 59, 2638-2644.

148. Madoff L.C., Michel J.L., Gong E.W., Rodewald A.K., Kasper D.L.: Protection of neonatal mice from group B streptococcal infection by maternal immunization with beta C protein. Infect. Immun. 1992, 60, 4989-4994.

149. Madoff L.C., Paoletti L.C., Tai J.Y., Kasper D.L.: Maternal immunization of mice with group B streptococcal type III polysaccharide-beta C protein conjugate elicits protective antibody to multiple serotypes. J. Clin. Invest. 1994, 94, 286-292.

150. Maeland J.A., Brakstad O.G., Bevanger L., Kwam A.I.: Streptococcus agalactiae |3 gene and gene product variations. J. Med. Microbiol. 1997, 46, 9991005.

151. Mahillon J., Chandler M.: Insertion sequences. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998, 62, 725-774.

152. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

153. Martin D., Rioux S., Gagnon E., Boyer M., Hamel J., Charland N., Brodeur B.R.: Protection from group B streptococcal infection in neonatal mice by maternal immunization with recombinant Sip protein. Infect. Immun. 2002, 70, 4897-4901.

154. Martinez G., Harel J., Gottschalk M.: Specific detection by PCR of Streptococcus agalactiae in milk. Can. J. Vet. Res. 2001, 65, 68-72.

155. Martinez G., Harel J., Higgins R., Lacouture S., Daignault D., Gottschalk M.: Characterization of Streptococcus agalactiae isolates of bovine and human origin by randomly amplified polymorphic DNA analysis. J.Clin.Microbiol. 2000, 38, 71-78.

156. Mawn J.A., Heard S.R., Simpson A.J.: Detection of the C protein gene among group B streptococci using PCR. J. Clin. Pathol. 1993, 46, 633-636.

157. Mecsas J., Strauss E.J.: Molecular mechanisms of bacterial virulence: type III secretion and pathogenicity islands. Emerg. Infect. Dis. 1996, 2, 271-288.246

158. Melchers W.J., Bakkers J.M., Toonen M., van Kuppeveld F.J., Trijbels M., Hoogkamp-Korstanje J.A.: Genetic analysis of Streptococcus agalactiae strains isolated from neonates and their mothers. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003, 36, 111-113.

159. Meyer, J., Iida, S., Arber, W.: Does the insertion element IS1 transpose preferentially into A+T- rich DNA segments? Mol. Gen. Genet. 1980, 178, 471-473.

160. Michel J.L., Madoff L.C., Olson K., Kling D.E., Kasper D.L.: Large, identical, tandem repeating units in the C protein alpha antigen gene, bca, of group B streptococci. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, 89, 10060-10064.

161. Mickelson, M.N.: Glucose degradation, molar growth yields, and evidence for oxidative phosporylation in Streptococcus agalactiae. J. Bacteriol. 1972, 109, 96105.

162. Mileham A.J.: Identification of microorganisms using random primed PCR. Mol. Biotechnol. 1997, 8, 139-145.

163. Milligan, T.W., Doran, T.I., Straus, D.C., Mattingly, S.J.: Growth and amino acid requirements of various strains of group B streptococci. J. Clin. Microbiol. 1978, 7, 28-33.

164. Morales W.J., Dickey S.S., Bornick P., Lim D.V.: Change in antibiotic resistance of group B streptococcus: impact on intrapartum management. Am. J. Obstet. Gynecol. 1999, 181, 310-314.

165. Moyo S.R., Maeland J.A., Lyng R.V.: The putative R1 protein of Streptococcus agalactiae as serotype marker and target of protective antibodies. APMIS. 2001, 109, 842-848.

166. Murphy J., Sukes G., Gardiner M., Hannan A.: Group B Streptococcus carrier rate in pregnant women and their newborn infants. J. Infect. Dis. 1982, 5, 165-199.247

167. Musser J.M., Mattingly S.J., Quentin R., Goudeau A., Selander R.K.: Identification of a high-virulence clone of Streptococcus agalactiae (group B streptococcus). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989, 86, 4731-4735.

168. Nagano N., Nagano Y., Taguchi F.: High expression of a C protein beta antigen gene among invasive strains from certain clonally related groups of type la and lb group B streptococci. Infect. Immun. 2002, 70, 4643-4649.

169. Nagano Y., Nagano N., Takahashi S., Murono K., Fujita K., Taguchi F., Okuwaki Y.: Restriction endonuclease digest patterns of chromosomal DNA from group B p-haemolytic streptococci. J. Med. Microbiol., 1991, 35, P. 297-303.

170. Nair S., Frehel C., Nguyen L., Escuyer V., Berche P.: ClpE, a novel member of the HSP100 family, is involved in cell division and virulence of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 1999, 31, 185-196.

171. Nair S., Milohanic E., Berche P.: ClpC ATPase is required for cell adhesion and invasion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 2000, 68, 7061-7068.

172. Naredo-Sanchez E., Pozo F., Campos C., Uson J., Garcia-Perea A. and Martin-Mola M.: Streptococcus agalactiae septic arthritis associated with chondrocalcinosis in patient without predisposing systhemic disease. Clin. Exp. Reumatol. 1995, 12, 578-579.

173. Navarre W.W., Schneewind O.: Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999, 63, 174-229.

174. Noel G.J., Katz S.L., Edelson P.J.: The role of C3 in mediating binding and ingestion of group B Streptococcus serotype III by murine macrophages. Pediatr. Res. 1991,30, 118-123.

175. Oguro H.: A study of group B streptococcus with special reference to the relationship between serological type and virulence. J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1983, 58, 376-384.

176. Olcen P., Lantz P.G., Backman A., Radstrom P.: Rapid diagnosis of bacterial meningitis by a seminested PCR strategy. Scand. J. Infect. Dis. 1995, 27, 537-539.

177. Panthel K., Dietz P., Haas R., Beier D.: Two-component systems of Helicobacter pylori contribute to virulence in a mouse infection model. Infect. Immun. 2003, 71, 5381-5385.

178. Paoletti L.C.: Potency of clinical group B streptococcal conjugate vaccines. Vaccine. 2001, 19, 2118-2126.

179. Paoletti L.C., Kasper D.L.: Conjugate vaccines against group B Streptococcus types IV and VII. J. Infect. Dis. 2002, 186, 123-126.

180. Paoletti L.C., Pinel J., Kennedy R.C., Kasper D.L.: Maternal antibody transfer in Baboons and mice vaccinated with a group B streptococcal polysaccharide conjugate. J. Infect. Dis. 2000, 181, 653-658.

181. Paoletti L.C., Wessels M.R., Michon F., DiFabrio J., Jennings H.J., Kasper D.L.: Group B streptococcus type II polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 1992, 60, 4009-4014.

182. Pattison I.H., Matthews P.R.J., Howell D.G.: The type classification of group B streptococci, with special reference to bovine strains apparently lacking in type polysaccharide. J. Pathol. Bacteriol. 1955, 69, 51-60.

183. Phuektes P, Mansell PD, Browning GF.: Multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and streptococcal causes of bovine mastitis. J. Dairy. Sci. 2001, 84, 1140-1148.

184. Podbielski A., Blankenstein O., Lutticken,R.: Molecular characterization of the cfb gene encoding group B streptococcal CAMP-factor. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 1994, 183,239-256.

185. Portillo A., Ruiz-Larrea F., Zarazaga M., Alonso A., Martinez J.L., Torres C.: Macrolide resistance genes in Enterococcus spp. Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44, 967-971.

186. Portnoy D.A., Chakraborty T., Goebel W., Cossart P.: Molecular determinants of Listeria monocytogenes pathogenesis. Infect. Immun. 1992, 60, 1263-1267.

187. Poyart C., Pellegrini E., Gaillot O., Boumalia C., Baptista M., Trieu-Cuot P.: Contribution of Mn-cofactored superoxide dismutase (SodA) to the virulence of Streptococcus agalactiae. Infect. Immun. 2001, 69, 5098-5106.

188. Pridmore D., Stefanova T., Mollet B.: Cryptic plasmids from Lactobacillus helveticus and their evolutionary relationship. FEMS Microbiol. Lett. 1994, 124, 301305.

189. Pritzlaff C.A., Chang J.C., Kuo S.P., Tamura G.S., Rubens C.E., Nizet V.: Genetic basis for the beta-haemolytic/cytolytic activity of group B streptococcus. Mol. Microbiol. 2001, 39, 236-248.

190. Rainard P., Poutrel B.: Generation of complement fragment C5a in milk is variable among cows. J. Dairy Sci. 2000, 83, 945-951.

191. Rakonjac J.V., Robbins J.C., Fischetti V.A.: DNA sequence of the serum opacity of group A streptococci: identification of a fibronectin-binding repeat domain. Infect. Immun., 1995, 63, 622-631.

192. Riordan F.A., Thomson A.P., Sills J.A., Hart C.A.: Bacterial meningitis in the first three months of life. Postgrad. Med. J. 1995, 71, 36-38.

193. Rioux S., Martin D., Ackermann H.-W., Dumont J., Hamel J., Brodeur B.R.: Localization of surface immunogenic protein on group B streptococcus. Infect. Immun. 2001, 69, 5162-5165.

194. Riffon R., Sayasith K., Khalil H., Dubreuil P., Drolet M., Lagace J.: Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR. J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 2584-2589.

195. Rubens C.E., Heggen L.M., Haft R.F., Wessels M.R.: Identification of cpsD, a gene essential for type III capsule expression in group B streptococci. Mol. Microbiol. 1993, 8, 843-855.251

196. Rubens C.E., Heggen L.M., Kuypers J.M.: 1S861, a group B streptococcal insertion sequence related to IS 150 and IS3 of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1989, 171, 5531-5535.

197. Rubens C.E., Wessels M.R., Heggen L.M., Kasper D.L.: Transposon mutagenesis of type III group B Streptococcus: correlation of capsule expression with virulence. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987, 84, 7208 7212.

198. Rüssel H., Norcross N.L., Kahn D.E.: Isolation and characterization of Streptococcus agalactiae bacteriophage. J. Gen. Virol. 1969, 5, 315-317.

199. Russell-Jones G.J., Gotsclich E.C., Blake M.S.: A surface receptor specific for human IgA on group B streptococci possessing the Ibc protein antigen. J. Exp. Med. 1984, 160, 1467-1475.

200. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R, Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A.: Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239, P. 487-491.

201. Sanchez-Beato A.R., Garcia E., Lopez R., Garcia J.L.: Identification and characterization of IS 1381, a new insertion sequence in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 1997, 179, 2459-2463.

202. Schalen C.: Prevalence of IgA receptors in clinical isolates of Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae: serological distinction between the receptors by blocking antibodies. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993, 7, 39 46.

203. Schlivert P.M., Gocke J.L., Deringer J.R.: Group B streptococcal toxic shocklike syndrome: report of a case and purification of the associated pyrogenic toxin. Clin. Infect. Dis. 1993, 17, 26-31.

204. Schnitzler N., Haase G., Podbielski A., Kaufhold A., Lammler C., Lutticken R.: Human isolates of large-coloni-forming ß hemolytic group G streptococci form a252distinct clade upon 16S rRNA gene analysis. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 363365.

205. Schrag S.J., Zywicki S., Farley M.M., Reingold A.L., Harrison L.H., Lefkowitz L.B., Hadler J.L., Cieslak P.R., Schuchat A.: Group B streptococcal disease in the era of intrapartum antibiotic prophylaxis. N. Engl. J. Med. 2000, 342, 15-20.

206. Schuchat A.: Epidemiology of group B streptococcal disease in the United States: shifting paradigms. Clin. Microbiol. Rev. 1998, 11, 497-513.

207. Schuchat A., Deaver-Robinson K., Plikaytis B.D., Zangwill K., Mohle-Boetani J., Wenger J.D.: Multistate case-control study of maternal risk factors for neonatal group B streptococcal disease. Pediatr. Infect. Dis. J. 1994, 13, 623-629.

208. Schuchat A., Oxtoby M., Cochi S., Sikes R.K., Hightower A.W., Plikaytis B., Broome C.V.: Population-based risk factors for neonatal group B streptococcal disease: results of a cohort study in Metropolitan Atlanta. I. Infect. Dis. 1990, 162, 672-677.

209. Sechi L., L.Daneo-Moore.: Characterization of intergenic spacers in two rrn operons. J. Bacteriol. 1993, 175, 3213-3219.

210. Sechter I., Mestre F., Hansen D.S.: Twenty-three years of Klebsiella phage typing: a review of phage typing of 12 clusters of nosocomial infections, and a comparison of phage typing with K serotyping. Clin. Microbiol. Infect. 2000, 6, 233238.

211. Seppala H., Skurnik M., Soini H., Roberts M.C., Huovinen P.: A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes. Antimicrob. Agents Chemother. 1998, 42, 257-262.253

212. Shea J.E., Beuzon C.R., Gleeson C., Mundy R., Holden D.W.: Influence of the S.typhimurium pathogenicity island 2 type III secretion system on bacterial growth in the mouse. Infect. Immun. 1999, 67, 213-219.

213. Shankar V., Gilmore M.: Characterization of the Enterococcus faecalis alpha C protein homolog. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 1045 1048.

214. Shigeoka A.O., Rote N.S., Santos J.I. and Hill H.R.: Assessment of the virulence factors of group B streptococci: correlation with sialic acid content. J. Infect. Dis. 1983, 147, 857-863.

215. Southern E.M.: Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975, 98, 503-517.

216. Spellerberg B., Martin S., Franken C., Berner, C., Lutticken, R.: Identification of a novel insertion sequence element in Streptococcus agalactiae. Gene. 2000, 241, 51-56.

217. Spellerberg B., Pohl B., Haase G., Martin S., Weber-Heynemann J., Lutticken R.: Identification of genetic determinants for the hemolytic activity of Streptococcus agalactiae by ISS7 transposition. J. Bacteriol. 1999, 181, 3212-3219.

218. Spellerberg B., Rozdzinski E., Martin S., Weber-Heynemann J., Lutticken R.: rgf encodes a novel two-component signal transduction system of Streptococcus agalactiae. Infect. Immun. 2002, 70, 2434-2440.254

219. Squires C., Squires C.L.: The Clp proteins: proteolysis regulators or molecular chaperones? J. Bacteriol. 1992, 174, 1081-1085.

220. Sriprakash K.S., Hartas J.: Genetic mosaic upstream of scpG in human group G streptococci contains sequences from group A streptococcal virulence region. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 749-751.

221. Stalhammar-Carlemalm M., Areschoug T., Larsson C., Lindahl G.: Cross-protection between group A and group B streptococci due to cross-reacting surface proteins. J. Infect. Dis. 2000, 182, 142-149.

222. Stalhammar-Carlemalm M., Stenberg L., Lindahl G.: Protein Rib: A novel group B streptococcal cell surface protein that confers protective immunity and is expressed by most strains causing invasive infections. J. Exp. Med. 1993, 177, 15931603.

223. Stanley J., Baquar N., Threlfall E.J.: Genotypes and phylogenetic relationships of Salmonella typhimurium are defined by molecular fingerprinting of IS200 and 16S rrn loci. J. Gen. Microbiol. 1993, 139, 1133-1140.

224. Stewardson-Krieger P.B., Gotoff S.P.: Risk factors in early-onset neonatal group B streptococcal infections. Infection. 1978, 6, 50-53.

225. Stringer J.: The development of a phage-typing system for group-B streptococci. J. Med. Microbiol. (England). 1980, 13,133-143.

226. Suvorov A.N., Cleary P.P., Ferrieri P.: C5a peptidase gene from group B streptococci. In: Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, 1991,230-232.

227. Suvorov A., Dmitriev A., Ustinovich I., Schalen C., Totolian A.: Molecular analysis of clinical group B streptococcal strains by use of a and P gene probes. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997, 17, 149-154.255

228. Suvorov A.N., Ferretti J.J. Heterogeneity of group A pathogenic streptococci. In: Pathogenic streptococci: Present and future. (Totolian, A.A., Ed.) Lancer Publ., St. Petersburg, Russia, 1994, P. 21-24.

229. Suvorov A.N., Ferretti, J.J.: Comparative analysis of chromosomal organization of group A streptococcal strains. In: Proceedings of XIV Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases. 2000, 381-384.

230. Suvorov A. N., Flores A. E., Ferrieri P.: Cloning of the glutamine synthetase gene from group B streptococci. Infect. Immun. 1997, 65, 191-196.

231. Tamura G.S., Herndon M., Przekwas J., Rubens, C.E., Ferrieri, P., Hillier, S.L.: Analysis of restriction fragment length polymorphisms of the insertion sequence IS/357 in group B streptococci. J. Infect. Dis. 2000, 181, 364-368.

232. Tanaka D., Gyobu Y., Kodama H.: Typing of group B streptococci by pulsed-field gel electrophoresis. Kansenshogaku-Zasshi. 1995, 69, 455-460.

233. Tang W.M., Ho P.L., Yau W.P., Wong J.W., Yip D.K.: Report of 2 fatal cases of adult necrotizing fasciitis and toxic shock syndrome caused by Streptococcus agalactiae. Clin. Infect. Dis. 2000, 31, El5-17.

234. Teng L.J., Hsueh P.R., Tsai J.C., Chen P.W., Hsu J.C., Lai H.C., Lee C.N., Ho S.W.: GroESL sequence determination, phylogenetic analysis, and species differentiation for viridans group streptococci. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 31723178.256

235. Thomas-Bories I., Fitoussi F., Mariani-Kurkdjian P., Raymond J., Brahimi N., Bidet P., Lefranc V., Bingen E.: Clonal relationship between U.S. and French serotype V group B streptococcal isolates. J. Clin. Microb. 2001, 39, 4526-4528.

236. Timoney J.F., Walker J., Zhou M., Ding J.: Cloning and sequence analysis of a protective M-like protein gene from Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Infect. Immun., 1995,63, 1440-1445.257

237. Toresani I., Limansky A., Bogado I., Guardati M.C., Viale A., Sutich E.G.: Phenotypic and genotypic study of Streptococcus agalactiae in vagina of pregnant women in Argentina // Medicina (B Aires). 2001, 61, 295-300.

238. Uh Y., Jang I.H., Hwang G.Y., Yoon K.J., Song W.: Emerging erythromycin resistance among group B streptococci in Korea. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001,20,52-54.

239. Uhiara J.E.: Group B streptococcal carriage among parturiens and their neonates in Zaria, Nigeria. Afr. J. Med. Sci. 1993, 22, 831-879.

240. Wakhle (Joshi) L, Saigal SR.: Rapid and specific diagnosis of group B streptococcal infection by the polymerase chain reaction (PCR). Adv. Exp. Med. Biol. 1997,418, 347-349.

241. Whiley R.A., Hall L.M.C., Hardie J.M., Beighton D.: Intra-specific diversity within Streptococcus anginosus. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 367-369.

242. Watts J.L.: Etiological agents of bovine mastitis. Vet. Microbiol. 1988, 16, 4166.

243. Wibavan I.W., Lammler C., Smola J.: Properties and type antigen patterns of group B streptococcal isolates from pigs and nutrias. J.Clin.Microbiol. 1993, 31, 762764.

244. Wastfelt M., Stalhammar-Carlemalm M., Delisse A.M., Cabezon T., Lindahl G.: Identification of a family of streptococcal surface proteins with extremely repetitive structure. J. Biol. Chem. 1996, 271, 18892-18897.

245. Wastfelt M., Stalhammar-Carlemalm M., Delisse A-M., Cabezon T., Lindahl G.: The Rib and a proteins define a family of group B streptococcal surface proteins that confer protecive immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 1997, 418, 619 622.258

246. Wessels M.R., Paoletti L.C., Kasper D.L., DiFabio J.L., Michon F., Holme K., Jennings H.J.: Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin. Invest. 1990, 86, 1428-1433.

247. Wessels M.R., Paoletti L.C., Pinel J., Kasper D.L.: Immunogenicity and protective activity of a type V streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J. Infect. Dis. 1995, 171, 879-884.

248. Wessels M.R., Rubens C.E., Benedi V.J., Kasper D.L.: Definition of a bacterial virulence factor: sialylation of the group B streptococcal capsule. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989, 86, 8983-8987.

249. Yagupsky P., Menegus M.S., Powell K.R.: The changing spectrum of group B streptococcal disease in infants: an eleven-year experience in a tertiary care hospital. Pediatr. Infect. Dis. J. 1991, 10, 801-808.

250. Yamamoto S., Miyake K., Koike Y., Watanabe M., Machida Y., Ohta M., Iijima S.: Molecular characterization of type-specific capsular polysaccharide biosynthesis genes of Streptococcus agalactiae type la. J. Bacteriol. 1999, 181, 51765184.

251. Yildirim A.O., Lammler Ch., Weiss R.: Identification and characterization of Streptococcus agalactiae isolated from horses. Vet. Microbiol. 2002, 85, 31-35.

252. Yildirim A.O., Lammler C., Weiss R., Kopp P.: Pheno- and genotypic properties of streptococci of serological group B of canine and feline origin. FEMS Microbiol. Lett. 2002, 212,187-192.259

253. Yother J., Briles D.E.: Structural properties and evolutionary relationship of PspA, a surface protein of Streptococcus pneumoniae, as revealed by sequence analysis. J. Bacterid., 1992, 174, 601-609.

254. Yu W., Mireau I., Mars A., Johnson E., Dunny G., McKay L.L.: Novel insertion sequence-like element IS982 in lactococci. Plasmid. 1995, 33, 218-225.

255. Zaleznik D.F., Rench M.A., Hiller S., Krohn M.A., Platt R., Lee M.L., Flores A.E., Ferrieri P., Baker C.J.: Invasive disease due to group B Streptococcus in pregnant women and neonates from diverse population groups. J. Infect. Dis. 2000, 30, 276-281.

256. Zerbib D., Gamas P., Chandler M., Prentki P., Bass S., Galas D.: Specificity of insetion of IS 1. J. Mol. Biol. 1985, 185, 517-524.

257. Zhang Y., Isaacman D.J., Wadowsky R.M., Rydquist-White J., Post J.C., Ehrlich G.D.: Detection of Streptococcus pneumoniae in whole blood by PCR. J. Clin. Microb. 1995, 33, 596-601.

258. Zhang Y., Lei Y., Khammanivong A., Herzberg M.C.: Identification of a novel two-component system in Streptococcus gordonii V288 involved in biofilm formation. Infect. Immun. 2004, 72, 3489-3494.