Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium avium subspecies hominissuis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium avium subspecies hominissuis"

На правах рукописи

СТАРКОВА ДАРЬЯ АНДРЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

клинических изолятов Mycobacterium avium subspecies hormnissuis

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 ОКТ 2014

g(l —

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Нарвская Ольга Викторовна Официальные оппоненты:

Макарова Марина Витальевна, доктор биологических наук,

Государственное казенное учреждение здравоохранения «Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом» Департамента здравоохранения города Москвы, ведущий научный сотрудник отдела проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии

Черноусова Лариса Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук, заведующая отделом микробиологии Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном Ьюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адрес у: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, http://www.gabrich.ru

Автореферат разослан ¿О 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного

Защита состоится

часов на заседании

доктор медицинских наук

Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Микобактериоз — инфекционное заболевание животных и человека, возбудителями которого являются более 20 видов кислотоустойчивых медленно- и быстрорастущих убиквитарных нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ) (Оттен Т.Ф., Васильев A.B., 2005; Макарова MB., 2009). Несмотря на спорадический характер заболевания, в последнее десятилетие отмечен рост пораженное™ населения микобактериозом легких, что связывают, в основном, с распространенностью иммуносупрессивных состояний. У 20% больных СПИД, несмотря на профилактическое лечение, в течение года развивается диссеминированная форма инфекции с неблагоприятным прогнозом (Отген Т.Ф., Васильев A.B., 2005; Литвинов В.И. и др., 2008).

Среди НТМБ наиболее часто встречаются медленнорастущие бактерии Mycobacterium avium complex (MAC), представленные видами М. avium и М. intracellulare. Эти микроорганизмы - типичные обитатели окружающей среды, способные выживать в почве, воде, аэрозолях, системах водоснабжения и в биопленках (Falkinham J. et al., 2002; Yamazaki Y. et al., 2006), являются оппортунистическими патогенами диких и домашних животных (свиней и др.), птиц и человека (Turenne С et al., 2002).

Наиболее актуальным возбудителем микобактериоза человека является М. avium. Согласно современным представлениям, вид М. avium включает несколько подвидов, ассоциированных с определенным кругом хозяев, экологическими и географическими характеристиками штаммов, которые имеют специфические геномные паттерны. Так, М. avium subsp. hominissuis (МАН) вызывает заболевания у людей (в т.ч., у ВИЧ-инфицированных) и свиней; М. avium subspp. avium (MAA), silvaticum (MAS) и paratuberculosis (MAP) поражают в основном птиц, диких и домашних животных (Rindi L. et al., 2002; Turenne С. et al., 2002).

Степень разработанности темы исследования

Трудоемкость методов идентификации и генотипирования микобактерий отчасти объясняет относительно небольшое число зарубежных и отсутствие отечественных публикаций, посвященных оценке биоразнообразия М. avium. Лишь недавно для видовой идентификации М. avium стали использовать методы, основанные на гибридизации с ДНК-зондами (например, тест-система GenoType®Mycobacterium CM/AS, Hain Lifescience). Для изучения геномного полиморфизма М. avium за рубежом до настоящего времени используют различные инсерционные последовательности (Insertion Sequence, IS) - мобильные элементы, в частности IS1245. Метод IS/24J-RFLP-типирования позволяет проводить тонкую дифференциацию штаммов путем оценки количества и взаимного расположения фрагментов рестрикции в паттернах \SI245 (Van Soolingen D. et al., 1998; Inagaki T. et al., 2009; Johansen T. et al., 2005). Недостатками данного метода являются длительность и трудоемкость анализа, особые требования к качеству и количеству бактериальной ДНК, сложность интерпретации результатов при оценке мультибендовых паттернов рестрикции, что существенно ограничивает

применение данного метода в эпидемиологических исследованиях. В последнее десятилетие генотипирование М. avium осуществляют с использованием метода VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - типирования для оценки аллельного полиморфизма восьми локусов VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TRIO, TR32) (Thibault V. et al., 2007). Учитывая относительно невысокую вариабельность большинства из указанных локусов для типирования штаммов М. avium subspecies hominissuis, японские исследователи предложили схему, которая включает 15 локусов MATR (Mycobacterium Avium Tandem Repeats): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 (Inagaki T. et al., 2009).

Неполнота сведений о генетической структуре российской популяции М. avium subspecies hominissuis, отсутствие простых и чувствительных молекулярно-генетических методов и схем геноидентификации и типирования возбудителя ограничивают исследования в области эпидемиологии микобактериоза в нашей стране.

Цель исследования: генотипическая характеристика штаммов М. душот,выделенных от человека, с использованием комплекса молекулярных маркеров.

Задачи исследования:

1. Провести геноидентификацию клинических изолятов микобактерий с использованием молекулярно-генетических методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA- hsp65) и ПЦР-детекции инсерционных элементов IS900 и 901.

2. Изучить геномный полиморфизм изолятов М. avium, выделенных от различных групп больных микобактериозом (включая ВИЧ-инфицированных), с использованием комплекса методов анализа полиморфизма локусов VNTR, MATR и IS/24J-RFLP-типирования.

3. Установить распространенность и оценить генетическое родство штаммов М. avium различных генотипов.

4. Оценить дискриминирующую способность полиморфных локусов VNTR и MATR.

5. Разработать схему генотипирования российских штаммов М. avium.

Научная новизна исследования

Впервые на основе анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 и инсерционных элементов IS901 и IS900 с использованием методов, основанных на ПЦР, проведена идентификация и определена принадлежность к подвиду hominissuis 90 чистых культур М. avium, выделенных от больных микобактериозом легких (в т.ч., ВИЧ-позитивных) на территории Северо-Запада России.

Получены новые знания о структуре популяции М. avium subspecies hominissuis на Северо-Западе России на основе исследования геномного полиморфизма штаммов возбудителя, выделенных от больных микобактериозом, с помощью комплекса молекулярно-генетических методов (VNTR-, MATR-типирования и IS/24J-RFLP-типирования).

Разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов М. avium subsp. hominissuis, основанная на идентификации возбудителя по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом 1S/24J-RFLP, позволяющая

проводить мониторинг одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России.

Впервые изучена информативность (дискриминирующая способность) 23 локусов VNTR и М ATR для типирования российских штаммов М. avium subspecies hominissuis.

Установлено, что аллели 3' в локусе MATR-16 и 2' в локусе TRIO (MATR-9), имеющие делеции, являются маркерами российских изолятов М avium subspecies hominissuis.

Впервые последовательности ДНК клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis депонированы в GenBank: а) последовательности локуса TRIO, содержащие два идентичных интактных тандемных повтора 55 п.н. (accession по. JQ935977.1) и внутреннюю делецию размером 15 п.н. в первом из двух повторов (accession no. JQ918769.1); б) последовательность локуса MATR-16, содержащая делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (accession no. KF479191).

Теоретическая и практическая значимость исследования

Установлено, что российская популяция М. avium subspecies hominissuis, представленная в данной работе изолятами больных микобактериозом людей, неоднородна по маркерам геномного полиморфизма VNTR, MATR и IS J245, что позволяет оценить этиопатогенетическую роль штаммов различных генотипов в развитии микобактериоза на территории Российской Федерации.

Показано, что распространенность VNTR- и MATR-типов М. avium subspecies hominissuis неодинакова у штаммов возбудителя различного географического происхождения, что вносит существенный вклад в характеристику глобальной популяции микроорганизма данного вида.

С учетом информативности маркеров геномного полиморфизма разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов М. avium subspecies hominissuis по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS/245-RFLP, позволяющая установить генетическое родство между штаммами при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований микобактериоза и мониторинга популяции возбудителя.

В лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера создана и поддерживается коллекция ДНК 90 клинических штаммов М. avium subspecies hominissuis. Создана компьютерная база данных, содержащая профили VNTR-, MATR- и IS;245-RFLP-THnHpoBaHH3 90 клинических штаммов М. avium subspecies hominissuis.

Материалы исследования изданы в виде Информационно-методического письма «Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis - возбудителя микобактериоза человека» (утверждено директором ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера А.Б. Жебруном и директором ФГБУ НИИ фтизиопульмонологии П.К. Яблонским 18 апреля 2014 г.) и используются в научно-исследовательской работе лаборатории молекулярной

микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Акт о внедрении от 21 мая 2014 г.).

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Предметом исследования явилась характеристика геномного полиморфизма М. avium - возбудителя микобактериоза человека. Анализ научной литературы, посвященной оценке молекулярных маркеров, используемых для дифференциации штаммов М. avium subspecies hominissuis, проведён на основе формально-логических методов исследования. Работа выполнена в формате сравнительного открытого исследования с использованием микробиологических, молекулярно-генетических, аналитических и статистических методов.

Материалы и методы

Объектом исследования были 120 чистых культур М. avium complex, выделенных в 2008-2011 гг. в ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ) от жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Девяносто (из 120) штаммов, идентифицированные до вида М. avium, получены от больных микобактериозом легких (включая 27 ВИЧ-инфицированных), 18 - выделены от пациентов с подозрением на туберкулез. Эпидемиологические связи между случаями заболевания не установлены.

Микробиологический метод. Культивирование микобактерий осуществляли в лаборатории СПбНИИФ общепринятым методом на среде Левенштейна-Иенсена в течение 21 дня (Приказ № 109 Минздрава РФ от 23.03.2010); идентификацию чистых культур микобактерий проводили с использованием биохимических тестов (Оттен Т.Ф., Васильев A.B., 2005).

Молекулярно-генетические методы. ДНК из исследуемых культур микобактерий, а также из эталонных и коллекционных штаммов М. avium subsp. avium АТСС 35712, IWGMT49 и М avium subsp. paratuberculosis К10, предоставленных СПбНИИФ, выделяли согласно (van Embden et al. 1993). Геноидентификацию чистых культур микобактерий до вида и подвида проводили с использованием тест-системы GenoType®Mycobacterium CM/AS Hain Lifescience (Германия); методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA-hsp65) (Chimara Е. et al., 2008) и детекции инсерционных элементов IS900 и ISP0/ (Turenne С. et al., 2007).

Праймеры для ПЦР синтезированы в ООО «Синтол», г. Москва. Амплификацию ДНК 1S900 и IS901 методом ПЦР осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл: по 1 мкл прямого и обратного праймеров (конечная конц. 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), ЮхПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 - 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) - 0,2 мкл (1 ед.), деионизированная вода - до 25 мкл; 1 мкл ДНК. Условия проведения ПЦР для амплификации IS901: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 45 сек. - 95 °С, 45 сек - 63 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С; для амплификации IS900: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 45 сек. - 95 °С, 45 сек - 65 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С.

Аллельный полиморфизм штаммов M avium subsp. hominissuis изучали методом VNTR-типирования по 8 вариабельнь[м локусам TR: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3 TR7, TRIO, TR32 (Thibault et al., 2007) и методом MATR-типиров'ания по 15 вариабельным локусам MATR-: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 (Inagaki et al., 2009). Общий объем реакционной смеси для TR 292, ХЗ, 25, 47, 3, 7 и MATR-1, 2, 3, 4, 5,' 6, 7, 8, 13, 14, 15 составил 25 мкл: по 1 мкл прямого и обратного (конечная конц 200 мкМ/л) праймеров, dNTPmix - 3,5 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), 5хПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 - 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л) TaqF-полимераза (ИнтерЛабСервис, Москва) - 0,2 мкл (1 ед), вода - до 25 мкл. Общий объем реакционной смеси для TRlo' TR32 и MATR-U, MATR-12, MATR-16 составил 30 мкл: по 1 мкл прямого и обратного' (конечная конц. 200 мкМ/л) праймеров, dNTPmix - 4 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), ЮхПЦР-буфер - 5 мкл, MgCl2 - 2 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) - 0,2 мкл (1 ед.), диметил сульфоксид (DMSO) - 3 мкл, вода-до 30 мкл.

Условия проведения ГТЦР для амплификации локусов TR47, MATR-I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 30 сек. - 95 °С, 30 сек - 62 °С, 45 сек -72 °С, 10 мин - 72 °С; для локусов TR 10, TR 32 и MATR-9: 5 мин - 95 °С, 35 циклов- 30 сек. - 95 «С, 30 сек - 57 °С, 45 сек - 72 °С, 10 мин - 72 °С; для локусов TR292, TRX3, TR25, TR3, TR7: 5 мин - 95 °С, 35 циклов: 30 сек. - 95 °С, 30 сек - 58 °С, 45 сек - 72 "С, 10 мин - 72 °С. Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этвдием. В гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва) и 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Число тандемных повторов в локусах рассчитывали, исходя из молекулярных масс ампликонов (Thibault V.C. et al., 2007; Inagaki T. et al., 2009). MATR- и VNTR-профиль каждого штамма записывали в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах, в следующем порядке: TR (292, ХЗ, 25, 47, 3, 7, 10, 32) и MATR (-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -II, -12, -13, -14, -15, -16). Генотипирование изолятов М. avium методом ISI245-RFLP проводили согласно стандартному протоколу van Embden et al. (1993). Для ДНК-секвенирования продукты амплификации локусов TR10 и MATR-16 с праймерами 10F и 16F очищали с использованием набора реагентов GFX PCR DNA и Gel Band purification kit (GE Healthcare Life Sciences, США). Реакцию лимитированного секвенирования проводили с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Kits (PE Biosystems, version 2.0) и 4 пмоль соответствующего праймера. Капиллярный электрофорез выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Life Technologies, США).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием программного обеспечения и информационных баз данных. Расчеты зависимости между переменными (частота признака) проводили с использованием таблицы 2x2 для ввода данных пакета программ EpiCalc 2000 version 1.02. Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р<0,05). Степень родства между штаммами М. avium оценивали с использованием алгоритма Neighbor Joining (NJ) и графически отображали в виде дендрограммы, построенной с учетом полиморфизма локусов MATR-VNTR

s

П TRf . http://www.mini-vntrplus.org). Профили (паттерны) штаммов (наборы фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих участок нуклеотидной последовательности IS 1245) анализировали с использованием пакета программ BioNumerics 5.1 (Applied Maths, Бельгия). Степень родства между штаммами М. avium subsp. hominissuis графически отображали в виде дендрограммы, построенной с использованием иерархического алгоритма связывания UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Averages) на основе расчета коэффициента сходства Дайса (Dice coefficient) по формуле:

где пм - число общих фрагментов рестрикции ДНК у штаммов А и В; щ -число фрагментов у штамма А; пв - число фрагментов у штамма В. Для количественной оценки вариабельности локусов и дискриминирующей способности схем MATR-VNTR-и IS 12^5-1^РЬР-типирования рассчитывали индекс разнообразия Хантера-Гастона (Hunter Gaston Diversity Index (HGDI)) (Hunter P. et al., 1988) (URL:http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl). Уровень дискриминации методов рассчитывали по формуле: HGDI=l-l/N*(N-l)£?_i п * (п - 1), где N - общее число штаммов в выборке, s - число типов выявленных данным методом, п - число штаммов относящихся к j-тому типу. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ Sequence Scanner vi.О (Life Technologies, США) и Unipro

UGENE 1.12 (Россия).

Личное участие автора в получении результатов. Автором составлен план исследования, проведен аналитический обзор литературы, сформирована выборка изолятов микобактерий, выполнен весь объем молекулярно-генетических исследований. Культивирование и идентификация микобактерий, в том числе с использованием тест-системы GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Германия), проведены совместно с Т.Ф. Отген и В.Ю. Журавлевым - сотрудниками отдела лабораторной диагностики ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ). Лимитированное ДНК-секвенирование проведено совместно с А.Б. Комиссаровым (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава РФ). Автор провела анализ, статистическую обработку и систематизацию полученных данных, сформулировала выводы и практические рекомендации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Изоляты микобактерий, полученные от больных микобактериозом, принадлежали к М. avium subspecies hominissuis.

2. Клинические изоляты M. avium subspecies hominissuis, полученные от больных микобактериозом, были неоднородны по 8 локусам VNTRh 15 локусам MATR.

3. Для дифференциации клинических изолятов М. avium subspecies hominissuis и установления генетического родства между ними оптимальна схема типирования по 14 локусам MATR и VNTR с последующим анализом кластеров методом IS/245-RFLP.

Степень достоверности и апробация результатов.

Результаты исследования полиморфизма ДНК 90 клинических изолятов М. avium, в частности локусов VNTR и MATR, полученные с использованием современных высокочувствительных и специфичных молекулярно-генетических методов,

воспроизводимы. Экспериментальные данные подвергнуты обработке и систематизации с помощью методов описательной статистики, пакетов компьютерных программ и информационных баз данных и представлены в виде таблиц и графических изображений.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Федерального бюджетного учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (протокол № 5 от 21 мая 2014 г.).

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях: «Health and environment: environmental problems and infectious diseases», 19 марта 2012 г., г. Осака, Япония; 34th congress European society of mycobacteriology, 30 июня-03 июля 2013 г., г. Флоренция, Италия; международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций», 5-7 июня 2013 г., Санкт-Петербург; 8-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика», 18-20 марта 2014 г., Москва; научно-практическая конференция «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации», 23-25 апреля 2014 г., Санкт-Петербург; 35th congress European society of mycobacteriology, 29 июня-02 июля 2014 г., г. Вена, Австрия.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях журналах, 1 - в других изданиях, 6 - в материалах конференций.

Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 94 источника, в том числе 5 - отечественных и 89 - зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Генотипическая характеристика М. avium Генодентификация клинических изолятов микобактерий

В результате культивирования на среде Левенштейна-Иенсена был получен рост нефотохромогенных микобактерий. С помощью набора стандартных биохимических тестов и ДНК-стриповой технологии (GenoType®Mycobacterium CM/AS, Hain Lifescience) была установлена принадлежность 90 из 120 чистых культур медленнорастущих кислотоустойчивых микобактерий к виду М. avium.

Дальнейшее исследование образцов ДНК М. avium с помощью метода PRA-hsp65 с использованием рестриктаз Ä«EII и НаеIII, с одной стороны, подтвердило их видовую принадлежность, с другой стороны, выявило неоднородность изолятов (Рисунок 1).

Паттерны ÄriEII всех 90 изученных изолятов и референс-штамма М. avium АТСС 35712 были однородны и содержали два фрагмента рестрикции ДНК размерами 235 пар нуклеотидов (п.н.) и 210 п.н. (Рисунок 1а). Напротив, паттерны рестрикции Нае III М. avium оказались неоднородными: 83 (92,2%) изученных штаммов и М. avium АТСС 35712 содержали два фрагмента - 130 п.н. и 105 п.н., остальные имели дополнительный

фрагмент 60 п.н. (Рисунок 16). Указанные размеры фрагментов рестрикции AsíEII и НаеIII соответствовали опубликованным для штаммов М. avium, выделенных от различных источников (Chimara Е. et al., 2008).

, . BstEII ¡cz\ Haelll

(а)вп (6)

1004

Рисунок l - Профили рестрикционных фрагментов участка гена hsp65. (a): Ml - маркер длин фрагментов ДНК «100 bp Ladder»; 1 - паттерн рестрикции BstEII 90 штаммов М avium и референс-штамма М. avium АТСС 35712. (б): М2 - маркер длин фрагментов ДНК «50 bp Ladder»; 1 - паттерн рестрикции Нае III 83 штаммов М. avium и референс-штамма М. avium АТСС 35712; 2 - паттерн рестрикции Нае III 7 штаммов М. avium, имеющих дополнительный фрагмент рестрикции.

Паттерны SsíEII всех 90 изученных изолятов и референс-штамма М. avium АТСС 35712 были однородны и содержали два фрагмента рестрикции ДНК размерами 235 пар нуклеотидов (п.н.) и 210 п.н. (Рисунок 1а). Напротив, паттерны рестрикции Нае III М. avium оказались неоднородными: 83 (92,2%) изученных штаммов и М. avium АТСС 35712 содержали два фрагмента - 130 п.н. и 105 п.н., остальные имели дополнительный фрагмент 60 п.н. (Рисунок 16). Указанные размеры фрагментов рестрикции BstEII и Нае III соответствовали опубликованным для штаммов М. avium, выделенных от различных источников (Chimara Е. et al., 2008).

Анализ зарубежной литературы позволил оценить эффективность используемых в мировой практике методов и схем определения различных подвидов М. avium, в частности, основанных на выявлении инсерционных последовательностей IS901 и IS900 у штаммов различного географического происхождения. При этом полагают, что данные последовательности имеются лишь в геномах штаммов М. avium subspp. avium (ISíW), paratuberculosis (IS9O0) и silvaticum (IS901), выделяемых от животных и птиц (Bartos М. et al., 2006; Turenne С. et al., 2007). Таким образом, отсутствие продуктов ПЦР-амплификации инсерционных элементов IS90/ и ISP00 свидетельствовало о принадлежности всех 90 изученных клинических изолятов М. avium к подвиду hominissuis (МАН). Вместе с тем, наличие ISSW у ряда изолятов М. avium subsp. hominissuis, выделенных от больных микобактериозом людей в Японии, Германии, Чехии и Франции, по-видимому, свидетельствовало об общности источников заражения

животных и человека (Ichikawa К. et al., 2009; Pavlik 1. et al., 2000; Ritacco V. et al., 1998; Môbius P. et al., 2006).

Оценка аллельного полиморфизма штаммов M. avium subsp. hominissuis с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR

Аллельный полиморфизм штаммов М. avium subsp. hominissuis оценивали методом VNTR-типирования по 8 вариабельным локусам (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TRIO, TR32) согласно Thibault et al. (2007). Несмотря на ограниченную дискриминирующую способность, схема используется за рубежом для характеристики популяций М. avium subsp. hominissuis и при эпидемиологическом расследовании случаев микобактериоза среди людей и животных во Франции (Radomski N. et al., 2010; Thibault V.C. et a!., 2007), Словении (Pate M. et al., 2011), Японии (Inagaki T. et al., 2009; Iwamoto T. et al., 2012), Финляндии (Tirkkonen T. et al., 2010).

У 90 изученных нами штаммов M АН было выявлено 17 вариантов профилей (типов) VNTR. Степень родства между штаммами различных VNTR-типов отражена на рисунке 2. Девять (10,0%) штаммов МАИ имели индивидуальные 8-значные числовые профили VNTR. Из 17 профилей, восемь (40,0%) были представлены кластерами Ма81- Ма88, в состав которых входил 81 (90,0%) штамм. Наиболее крупный кластер Ма84 включал 46 (51,1%) штаммов с числовым профилем 22221128; кластер - Ма83 с числовым профилем 24221128 включал 13 штаммов (14,4%); остальные кластеры содержали два (Ма81), три (Ма82, Ма85, Ма86), четыре (Ма88) и семь (Ма87) штаммов МАН (Рисунок 2). При этом в состав кластеров входило большинство штаммов, полученных от больных микобактериозом - 80,2% (65 из 81), в том числе ВИЧ-позитивных - 88,8% (24 из 27).

Сравнительный анализ 8-локусных VNTR-профилей российских штаммов М. avium subsp. hominissuis с доступными данными зарубежных выборок показал различия популяций M avium subsp. hominissuis в России, Франции, Словении и Японии (Старкова Д.А. и др., 2013). Так, VNTR-профили изолятов большинства российских кластеров (Ма83, Ма82 и Ма85) описаны в Финляндии у изолятов, полученных от больных микобактериозом людей и от свиней (Tirkkonen T. et al., 2010). В частности, VNTR-профили кластеров Ма83 и Ма82 имели сходную долю в российской и финляндской популяциях М. avium subsp. hominissuis (Р>0,05): Ма82 - 3,3% и 6,9%, Ма83 - 14,4% и 17,2%, соответственно. В то же время, профиль 25221128 (кластер Ма81) явно доминировал в Финляндии (24,1% против 2,2%, Р=0,001), тогда как наиболее распространенный профиль 22221128 (кластер Ма84) российских штаммов был выявлен лишь у 6,90% изолятов из Финляндии (Р<0,0001). Наблюдаемое родство изолятов упомянутых генотипов из России и Финляндии можно объяснить общностью источников М. avium subsp. hominissuis, обусловленной территориальной близостью Северо-Западного региона Российской Федерации (включая Санкт-Петербург) и Финляндии. Вместе с тем, межпопуляционное неравновесие может отражать возникновение и циркуляцию большинства филогенетически удаленных штаммов М. avium subsp. hominissuis на единой территории, включавшей указанные страны более 100 лет назад, что не исключает возможности сравнительно недавнего формирования

доминирующего российского кластера Ма84 (профиль 22221128) (Старкова Д.А. и др.. 2013; Tirkkonen Т. et al., 201 0).

Рисунок 2 - Дендрограмма VNTR-профилей 90 штаммов М. avium subsp. hominissuis. H1V+ - ВИЧ-инфицированные. 2' - условное обозначение «усеченного» локуса TR10; • - штаммы, выделенные однократно при обследовании пациентов на туберкулез. Кластеры (Ма8) с идентичными числовыми профилями выделены прямоугольниками.

Подобный уровень кластеризации штаммов МАН с числовым профилем 22221128 в литературе ранее не описан, однако имеются сообщения о кластеризации нескольких десятков штаммов других VNTR-типов (Radomski N. et al., 2010; Pate M. et al., 2011; Inagaki T. et al., 2009).

Однократное выделение штаммов M. avium subsp. hominissuis различных VNTR-типов, не имеющее диагностического значения, может свидетельствовать о транзиторном носительстве возбудителя.

Анализ аллельного полиморфизма каждого из восьми локусов VNTR продемонстрировал разную степень их вариабельности по числу тандемных повторов. Наибольшим полиморфизмом отличались локусы TRX3 и TR25 (HGDI 0,624 и 0,392, соответственно); локусы TR3 и TR7 были однородны (Таблица 1).

Учитывая, что заражение человека осуществляется, в основном, от источников окружающей среды, высокий уровень кластеризации изученных штаммов М. avium subsp. hominissuis при отсутствии установленной связи между случаями заболевания можно объяснить невысокой вариабельностью (индекс разнообразия HGD1 0-0,61) восьми локусов VNTR (Таблица 1). При этом по числу повторов в локусах TR3 и TR7 штаммы вообще не различались, что согласуется с данными зарубежных исследователей (Inagaki T. et al., 2009; Thibault V.C. et al., 2007; Tirkkonen T. et al., 2010).

В этой связи, наличие в составе VNTR-кластеров изолятов, полученных от ВИЧ-позитивных больных микобактериозом, вряд ли можно рассматривать как показатель преимущественного распространения штаммов М. avium subsp. hominissuis определенных генотипов среди больных этой группы, особенно принимая во внимание отсутствие доказательств передачи возбудителя от человека к человеку.

Таблица 1 - Аллельный полиморфизм VNTR локусов 90 штаммов M avium subsp. hominissuis

Локус Число повторов HGDI

0 1 2 3 4 5 8 9

TR292 13 1 74 2 0,272

TRX3 2 50 5 14 19 0,624

TR25 66 20 4 0,392

TR47 1 72 17 0,314

TR3 90 0

TR7 90 0

TR10 1 87* 2 0,186

TR32 89 1 0,022

* 7 штаммов (кластер Mag7) из 87 имели делецию 15 п.н. в локусе TR10.

Обращает на себя внимание кластер Ма87 (числовой профиль 2533112'8), объединяющий семь штаммов М. avium subsp. hominissuis, у которых размер ПЦР-продукта локуса TRIO не соответствовал ожидаемому для кратного двум числа тандемных повторов в данном локусе. Секвенирование ДНК выявило внутреннюю делецию 15 п.н. в первом из двух повторов, что объясняет уменьшение размера амплифицированного фрагмента TRIO у штаммов кластера Ма87 по сравнению со штаммом М. avium 104 (Рисунок 3).

1952228 М.avium 104 CrAGA<:CC№TœCG<^GœœGCCGCœCCGGCTTCCXXGCGCrrTGCGACCGCCG

Strain 5607 Cp-AGACTGATGGCGGCGGCCCGC............. • -CGCGCTTGCGACCGCCG

40 п.н. ———

Л 9S2283 H.avium 104 crrACMCCGAT«;CGGC«KCCGCaÄX;CCCt;GCTTi:GTCa:GCTTKa»CX:GCCG

Strain 5607 ÇTAGACTGATGGCGGCGGœCGCTGCGCCCGGCTTCGCCGCGCTTQCGACCGCCG *-—--—-^

55 пл.

Рисунок 3 - Сравнение нуклеотидных последовательностей локуса TRIO (2') штаммов М. avium 104 (GenBank accession no. NC008595) и штамма M. avium subsp. hominissuis 5607 (GenBank accession no. KF479191).

Нуклеотидные позиции локуса и наименования штаммов приведены слева. Делеции нуклеотидов обозначены точками.

У большинства изученных штаммов размер ПЦР-продукта локуса TRIO соответствовал ожидаемому и включал два идентичных интактных тандемных повтора 55 п.н. (GenBank accession no. JQ935977.1), что согласуется с опубликованными данными (Thibault V. et al., 2007; Tirkkonen T. et al., 2010).

С целью повышения дискриминирующей способности типирования российских штаммов МАН был проведен анализ полиморфизма 15 локусов MATR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16), недавно описанных Inagaki et al. (2009).

В результате у 90 штаммов МАН было выявлено 35 вариантов профилей, степень родства между которыми отражена на дендрограмме (Рисунок 4).

Как видно из рисунка 4, индивидуальные 15-значные числовые профили MATR имели 26 (28,9%) штаммов. Остальные 64 (71,1%) штамма с идентичными числовыми профилями входили в состав девяти кластеров. Наиболее крупный кластер Ма,56 с числовым профилем 222231342532443' включал 37 (42,2%) штаммов, кластеры Ма,54 (224131342532443') и Ма|59 (425231322'432222) - по семь (7,7%) штаммов; остальные кластеры содержали 2-3 штамма.

Молекулярная масса продукта амплификации MATR-16, одинаковая у 72 (80,0%) из 90 штаммов, была меньше ожидаемых значений для различного числа тандемных повторов в этом локусе (Inagaki T. et al., 2009).

ГО-hrt. MRU-1

WHIV. 1

Я709 MV-I Я"®

S30»} »V. |

Uses! ЕВ]

_I лш

:?Ь7ыиу. |

JME IS«n|

ЛИЛ)

i'.-''Тп'.-:

iSa

ГГ«о51

№

I 7761 HIV. |

— И

ЩШ

Ш

Щ-'ишз

I s * г s з г <

Ма^з MaIS4

! г г : ; и .

' г j п п i г 1 ! ) и j г ? г : j ш г 1 зг « « j

г г ? э 1 ) 4 м з j г г г 5 i з « г > з г

• з I j < г v з г *

i о > з 2 > t * г • ■> г г г з

111««"11"11 Ма157 и i I : ; u : м I .' I )

II«I Г; I';; •!, !1 ма15в

)4П>с1м<

Ма,59

Рисунок 4 - Дендрограмма MATR-профилей 90 штаммов М. avium subsp. hominissuis. HIV+ - ВИЧ-позитивные. 2' - обозначение «усеченного» локуса MATR-9; 3' -обозначение «усеченного» локуса MATR-16; Кластеры (Ма15) с идентичными числовыми профилями выделены прямоугольниками.

Секвенирование амплифицированного фрагмента MATR-16 штамма М. avium subsp. hominissuis 5122 (типичный представитель данной группы) выявило делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе, что объясняет уменьшение размера амплифицированного фрагмента MATR-16 у таких штаммов по сравнению со штаммом М. avium 104 (Рисунок 5).

383197 М.avium 104 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGAGTTCGGT

Strain 5122 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGAGTTCGAT <------>

59 bp

383256 M. avium 104 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGAGTTCGGT

Strain 5122 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGA-TTCGA-<---->

57 bp

383315 M. avium 104 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCGGATCGATTCG

strain 5122 ............................GGCGCAGCGGGTCGCCCGGATCGATTCG

<->

28 bp

Рисунок 5 - Нуклеотидные последовательности локуса MATR-16 штаммов M. avium Нуклеотидные позиции локуса и наименования штаммов приведены слева. Делеции нуклеотидов обозначены точками.

Данный «усеченный» аллель (обозначен 3') описан нами впервые (GenBank accession : no. KLF479191). Остальные 18 штаммов имели два или три типичных интактных повтора в локусе MATR-16.

Сравнение 15-локусных MATR-профилей кластеров Mai5l-9 изученных российских штаммов с опубликованными данными не выявило кластеризации штаммов M avium subsp. hominissuis с аналогичными профилями в Японии, однако T. Inagaki с соавт. (2009) описан профиль 201222222232223, присущий кластеру, но в нашем исследовании выявленный только у одного штамма. Наоборот, числовой профиль кластера Ма154 (224131342532443') российских штаммов был выявлен лишь у одного японского штамма M avium subsp. hominissuis, у которого локус MATR-16 (аллель 3) не был «усеченным».

Аллель З'в локусе MATR-16, так же как и аллель 2'в локусе TR10, выявленные у изученных российских изолятов M avium subsp. hominissuis, не обнаружены у штаммов, выделенных от различных источников в других странах (Inagaki T. et al., 2009; Iwamoto T. et al., 2012; Pate M. et al., 2011; Radomski N. et al., 2010; Thibault V. et al., 2007; Tirkkonen T. et al., 2010). Таким образом, данные аллели, по-видимому, являются маркерными для изученных российских штаммов М. avium subsp. hominissuis.

Анализ аллельного полиморфизма каждого из 15 локусов MATR продемонстрировал разную степень их вариабельности по числу тандемных повторов (Таблица 2).

Таблица 2 - Аллельный полиморфизм локусов MATR 90 штаммов М. avium subsp.

hominissuis

Л о кус Число повторов HGD1

0 1 2 3 4 5 6

MATR-1 4 73 6 7 0,316

MATR-2 13 1 74 2 0,272

MATR-3 2 50 5 14 19 0,624

MATR-4 16 70 4 0,366

MATR-5 5 8 77 0,242

MATR-6 1 79 1 9 0,222

MATR-7 2 76 5 6 1 0,264

MATR-8 1 16 1 72 0,303

MATR-9 1 87* 2 0,186

MATR-11 13 3 15 59 0,531

MATR-12 89 1 0,022

MATR-13 91 0,000

MATR-14 1 22 67 0,367

MATR-15 22 1 67 0,367

MATR-16 18 12** 0,326

*Штаммы (п-7), несущие делецию 15 п.н. в первом из двух повторов в локусе MATR-9 (аллель 2'). **Штаммы (п=72), несущие делецию 28 п.н. в первом из двух повторов в локусе MATR-16 (аллель 3').

Как видно из таблицы 2, наиболее выраженным полиморфизмом отличались локусы MATR-1, MATR-3, MATR-4, MATR-8, MATR-9, MATR-1 1, MATR-14, MATR-15, MATR-16 (HGD1>0,100).

Таким образом, все 90 штаммов М. avium subsp. hominissuis послужили для оценки дискриминирующей способности методов MATR- и VNTR-типирования, основанных на анализе полиморфизма отдельных локусов и их различных комбинаций. Всего было оценено 23 локуса: 8 локусов VNTR и 15 локусов MATR.

Сравнительная оценка дискриминирующей способности 8- и 15-локусных схем типирования представлена в таблице 3.

Таблица 3 - Дискриминирующая способность схем VNTR- и MATR-типирования 90 штаммов М. avium subsp. hominissuis

Схема типирования Число профилей Число кластеров Число штаммов в кластере HGD1

8 локусов VNTR 17 8 2-46 0,714

15 локусов MATR 35 9 2-37 0,806

Как видно из таблицы 3, число кластеров в обеих схемах типирования существенно не различалось, однако увеличение общего числа профилей в случае MATR-типирования (п=35) по сравнению с 8-локусной схемой VNTR-типирования (п=17) объясняет более высокий индекс разнообразия 15-локусной схемы типирования (HGD1 0,806).

Сопоставление результатов типирования изученных штаммов М. avium subsp. hominissuis по восьми локусам VNTR и 15 локусам MATR выявило одинаковое число повторов в парах локусов TRX3 и MATR-3 (HGDI 0,624), TR292 и MATR-2 (HGD1 ; 0,272), TR10 и MATR-9 (HGDJ 0,186) (Таблица 1 и 2). Таким образом, идентичность трех локусов в обеих схемах типирования, отмеченная также японскими исследователями (Inagaki Т. et al., 2009; Iwamoto Т. et al., 2012), позволила исключить дублирующие локусы MATR-2, MATR-3 и MATR-9 и использовать комбинированную схему типирования штаммов М avium subsp. hominissuis, включающую 20 локусов.

Оптимизация схемы генотипирования М. avium subsp. hominissuis с учетом аллельного полиморфизма локусов VNTR и MATR

Сопоставление значений индекса разнообразия Хантера-Гастона для каждого из 20 локусов (12 - MATR и 8 - VNTR) показало, что наиболее «информативными» были 14 локусов: TR292, TRX3, TR25, TR47, TRIO, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16.

Оптимизированная 14-локусная схема типирования не отличалась по дискриминирующей способности от 20-локусной (HGDI 0,821), но была более эффективной, чем 8-локусная VNTR- (HGDI 0,714) и 15-локусная MATR- (HGDI 0,806) схемы типирования российских изолятов М. avium subsp. hominissuis.

Для анализа генетического родства и установления филогенетических связей между штаммами на основе полиморфизма 14 локусов MATR-VNTR использовали алгоритм построения минимального связывающего дерева (Рисунок 6).

| Ma,,3 |

^^ 22222223145433'

12222223145443' 23222223145443'

I Ma„1 |

25332*423124222

— ПЧЗЧ

Ma,j7

03335323044222

22222222145443'

322333324422

О ' о

33335323124223

Q22431212114222

05322121122222

05332223322223

О

01332222222223

Клональный комплекс

1 2

3

4

22222223145243'

Рисунок 6 - Минимальное охватывающее древо (Minimum spanning tree) профилей VNTR-MATR (14 локусов) 90 клинических штаммов М. avium subsp. hominissuis. Числовой профиль (число повторов в каждом из 14 локусов) показан у каждого узла. Размеры узлов пропорциональны числу изолятов с одинаковым генотипом. Линии между узлами и цифры показывают изменения, касающиеся: одного локуса (1) -сплошные жирные, двух локусов (2) - сплошные тонкие, трех и более локусов -различные варианты прерывистых линий. Родственные генотипы сгруппированы в клональные комплексы (clonal complex) 1-4, выделенные цветом и обозначенные цифрами.

В результате типирования по 14 (как и по 20) локусам MATR-VNTR у 90 штаммов М. avium subsp. hominissuis было выявлено 36 вариантов профилей. Индивидуальные профили MATR-VNTR имели 28 (31,1%) штаммов; 62 (68,9%) штамма с идентичными числовыми профилями были представлены кластерами Ма141- Ма)48. Наиболее крупный кластер Ма^б включал 37 (41,1%) штаммов с числовым профилем 22222223145443'; кластеры Ма142 (24222213145443') и Ма148 (25332'423124222) включали по семь (7,7%) штаммов соответственно, остальные содержали 2-3 штамма.

Как видно из рисунка 6, подавляющее большинство генетически близкородственных штаммов - 75,6% (68 из 90), имевших сходные 14-локусные профили (различия в числе копий касались не более двух локусов), входили в состав доминирующего клонального комплекса 1, который существенно (по 7 локусам) отличался от остальных штаммов. Это может свидетельствовать о единстве происхождения и клональной экспансии на территории Северо-Запада России штаммов кластера Ма146 (п=37), имеющих доминирующий профиль (22222223145443'), который можно рассматривать в качестве предкового по отношению к остальным.

Следует отметить, что все семь штаммов кластера Ма]48 имели «усеченный» локус TRIO (MATR-9) - аллель 2' и формировали кластеры Mag7 и Mai59 при 8- и 15-локусном типировании соответственно (Рисунок 6).

Характеристика полиморфизма клинических изолятов М. avium subsp. hominissuis на основе последовательности IS 1245

Для окончательной оценки генетического родства 62 изолятов М. avium subsp. hominissuis, входящих в состав кластеров согласно 14-локусной схеме MATR-VNTR типирования, было проведено дальнейшее генотипирование с использованием метода 1S/245-RFLP. У 59 из 62 изолятов М. avium subsp. hominissuis были получены мультибендовые профили рестрикции \S1245. Один изолят М. avium subsp. hominissuis не содержал инсерционного элемента IS 1245, профили двух изолятов были неудовлетворительного качества.

Всего у 59 изолятов М. avium subsp. hominissuis выявлен 51 тип профилей рестрикции IS 1245, при этом 47 типов были индивидуальны, а остальные представлены кластерами Mavl-Mav4, в состав которых входили 2-3 изолята (Рисунок 7). Число фрагментов рестрикции, соответствующее числу копий IS1245, варьировало от девяти до 33.

Несмотря на достигнутый высокий уровень дискриминации (HGD1 0,996), основным недостатком метода IS/245-RFLP, по сравнению с MATR-VNTR типированием, явилась сложность компьютерной обработки мультибендовых паттернов рестрикции (более 20 фрагментов). С другой стороны, данный метод позволил провести окончательную оценку генетического родства исследуемых изолятов М. avium subsp. hominissuis. В результате установлено, что из 59 изолятов, входящих в кластеры MATR-VNTR, лишь девять (15%) входили в состав четырех кластеров RFLP.

С.. .[.. U.. I ......- UHTO UATD

Рисунок 7 - Филогенетическое древо профилей рестрикции IS1245 59 штаммов М. avium subsp. hominissuis.

Таким образом, метод 18/245-КРЬР-типирования может быть использован для тонкой дифференциации клинических изолятов М. avium subsp. hominissuis и установления генетического родства между ними.

Кластеры Mav 1 и Mav2 включали по два штамма М. avium subsp. hominissuis ВИЧ-позитивных пациентов. Кластер Mav4 был представлен двумя штаммами больных микобактериозом, один из которых был ВИЧ-позитивным; Mav3 объединял три штамма М. avium subsp. hominissuis ВИЧ-негативных пациентов (Рисунок 8).

VNTR-MATR

кластеры

Ма,г2

51737 HIV+) >■! Т ill :л

53093 HIV+I 1 : I fff Vх м щ 1

Ма1£3

Ма„5

29021 I

299?

3094 I

6749

17979 Н1У+[

i га

Ма1йб I [5583 HiV-f | и1Ш I I 59954 HIV+1 Ц Л

si in i .11 :

RFLP

Mav 1

Mav 2

Mav 3

I I I I

|| П

Рисунок 8 - Профили рестрикции IS/2«, изолятов M. avium subsp. hominissuis.

Теоретически, результаты IS/245-RFLP-™nnpoBaHra штаммов М. avium subsp. hominissuis могут свидетельствовать о наличии общих источников и факторов передачи возбудителя в группах больных, чьи штаммы входили в состав кластеров, однако эпидемиологические исследования не выявили связей между случаями заболевания. Представленные данные согласуются с общепринятым мнением о роли объектов окружающей среды в качестве источника инфицирования (в том числе внутрибольничного) человека нетуберкулезными микобактериями.

Заключение

Использование независимых молекулярных маркеров геномного полиморфизма -тандемных повторов и инсерционных элементов позволяет провести исследование структуры популяции М. avium subspecies hominissuis. Установленное генетическое родство исследуемых штаммов М. avium subspecies hominissuis может служить доказательством общности источника заражения и наличия связей между случаями заболевания при наличии соответствующих данных эпидемиологического расследования.

Выводы

1. На основании результатов определения молекулярных маркеров полиморфизма участка гена hsP6S, IS900 и 1S90/ установлена принадлежность 90 клинических изолятов микобактерий к М. avium subspecies hominissuis.

2. Изоляты М. avium subspecies hominissuis, полученные от различных групп больных микобактериозом, не различались по локусам TR3, TR7 и MATR-13, но были полиморфны по остальным 20 локусам VNTR и MATR, среди которых наиболее информативными (HGDI>0,1) были 14 локусов: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR10 MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14 MATR-I5' MATR-16.

3. Анализ полиморфизма 14 локусов VNTR-MATR позволил выявить доминирующий генотип 22222223145443- (кластер Ма,«6) у 41,1% клинических изолятов М. avium subspecies hominissuis российского происхождения.

4. Аллель З'в локусе MATR-16 и аллель 2' в локусе TRIO (MATR-9), имеющие делении, являются маркерами изученных российских изолятов М. avium subspecies hominissuis.

5. IS/245-RFLP-™nHpoBaHHe, обладающее высокой дискриминирующей способностью (HGDI 0,996), выявило существенную гетерогенность 59 изолятов М. avium subspecies hominissuis, входящих в кластеры VNTR-MATR: лишь 9 из них группировались в четыре кластера по маркеру IS/245.

6. Схема генотипирования по 14 локусам MATR-VNTR (HGDI 0,821) с последующим анализом кластеров методом IS/245-RFLP (HGDI 0,996) эффективна для дифференциации российских изолятов М. avium subspecies hominissuis и установления генетического родства между ними.

Практические рекомендации

Схема генотипирования клинических штаммов М. avium subspecies hominissuis по 14 локусам VNTR и MATR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR14, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16) с последующей дифференциацией штаммов, входящих в кластеры, с помощью IS/245-RFLP-типирования может быть рекомендована для проведения мониторинга М. avium subspecies hominissuis в целях изучения структуры российской популяции возбудителя и повышения эффективности этиологической и эпидемиологической диагностики микобактериоза.

. Перспективы дальнейшей разработки темы

1. Продолжение исследований российской популяции М. avium путем изучения геномного полиморфизма изолятов М. avium subspecies hominissuis, полученных от человека, животных и источников окружающей среды, с использованием методов MATR-VNTR-типирования по 14 локусам и IS/245-RFLP для установления генетического родства между штаммами с целью доказательства общности источника и путей передачи возбудителя в эпидемиологических исследованиях.

2. Совершенствование предложенной схемы генотипирования путем оптимизации набора маркеров геномного полиморфизма по мере накопления данных о генотипах штаммов М. avium subspecies hominissuis, полученных от различных источников на территориях РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мокроусов, И.В. Высокоразрешаюшее типирование штаммов генотипа Beijing российской популяции Mycobacterium tuberculosis / И.В.Мокроусов, АЛ. Вязовая, Д.А. Старкова, О.В. Нарвская // Туберкулез и болезни легких. - 2012 - JV»7 - С. 46-53.

2. Старкова, Д.А. Молекулярно-генетическая характеристика Mycobacterium avium, выделенных от больных микобактериозом / Д.А. Старкова, A.A. Вязовая, И.в' Мокроусов, Т.Ф. Оттен, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционная безопасность в гематологии и службе крови». Вестник гематологии. - 2012. - Т. 8. - № 1. - С. 82.

3. Старкова, Д.А. Mycobacterium avium - актуальный возбудитель микобактериоза человека /ДЛ. Старкова // Инфекция и иммунитет - 2013 - Т 3 -№1.-С. 7-14.

4. Старкова, Д.А. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium avium subsp. hominissuis / Д.А. Старкова, Т.Ф. Огген, И.В. Мокроусов, A.A. Вязовая, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская // Генетика. - 2013. - Т. 49. - № 9. - С. 1048-1054.

Starkova, D.A. Genotypic characteristics of Mycobacterium avium subsp. hominissuis strains / D.A. Starkova, T.F. Otten, I.V. Mokrousov, B.I. Vishnevsky, O.V. Narvskaya // Russian Journal of Genetics. - 2013. - Vol. 49. - № 9. - P. 909-914.

5. Старкова, Д.А. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium avium subsp. hominissuis, выделенных на Северо-Западе России / Д. А. Старкова, Т.Ф. Отген, И.В. Мокроусов, A.A. Вязовая, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская //' Материалы международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3. - №2. - С. 174.

6. Старкова, Д. А. Геномный полиморфизм штаммов Mycobacterium avium subsp. hominissuis / Д.А. Старкова, И.В. Мокроусов, A.A. Вязовая, В.Ю. Журавлев, Т.Ф. Оттен, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2014. - № 4. - С. 7-12.

7. Старкова, Д.А. Геномный полиморфизм штаммов Mycobacterium avium subsp. hominissuis / Д.А. Старкова, A.A. Вязовая, И.В. Мокроусов, Т.Ф. Отген, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская И Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации». Инфекция и иммунитет. - 2014. - Т. 4. -№ 1. - С. 93.

8. Старкова, Д.А. Геномный полиморфизм штаммов Mycobacterium avium subsp. hominissuis /Д.А. Старкова, A.A. Вязовая, И.В. Мокроусов, Т.Ф. Отген, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская // Сб. трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014» - 2014 -Т. 1.-С. 48-49.

9. Starkova, D. Molecular characterization of Mycobacterium avium clinical strains from St. Petersburg, Russia / D. Starkova, T. Otten, I. Mokrousov, A. Vyazovaya, B. Vishnevskij

O. Narvskaya // ESM 34th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Abstract book. - Florence. - 2013. - P. 55-56.

10. Mokrousov, I. Polymorphism of human genes IFNG, TLR2, TLR4 and host susceptibility to tuberculosis in Russian Slavic population / I. Mokrousov, V. Zhuravlev, A. Vyazovaya, N. Solovieva, D. Starkova, T. Otten, B. Vishnevskiy, O. Narvskaya // 44th Union World Conference on Lung Health. Abstract book. - Paris. - 2013. - PC-977-03.

11. Starkova, D. Genetic diversity of Mycobacterium avium clinical strains from St. Petersburg, Russia / D. Starkova, A. Vyazovaya, T. Otten, V. Zhuravlev, 1. Mokrousov, O. Narvskaya // ESM 35th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Abstract book. - Vienna. - 2014. - P. 86-87.

Список сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота НТМБ - нетуберкулезные микобактерии п.н. - пара нуклеотидов П1ДР - полимеразная цепная реакция

IS - англ., Insertion sequence, инсерционная последовательность

МАЛ - М. avium subsp. avium

MAC - Mycobacterium avium complex

MAH - M. avium subsp. hominissuis

MAP -M. avium subsp. paratuberculosis

MATR - Mycobacterium avium Tandem Repeats

RFLP - англ., Restriction Fragment Length Polymorphism - полиморфизм длин

рестрикционных фрагментов

TR - англ., Tandem Repeats, тандемные повторы

VNTR - англ., Variable Number Tandem Repeats, вариабельное число тандемных повторов

Отпечатано в ООО "АРКУШ", Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 10, лит. Б ИНН 7825442972 / КПП 781301001 Формат 60x84/16, объем 1 печ. л. заказ №179/1, тираж 150 экз.