Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видовая идентификация ортопоксвирусов и обнаружение мутаций, обусловливающих устойчивость Mycobacterivm tvbercvlosis к рифампицину, гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапа, Сергей Анатольевич

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Использование метода гибридизации на биологических микрочипах для решения задач клинической диагностики и фундаментальных исследований.

1.1.1. Технологии производства биологических микрочипов.

1.1.2. Гибридизация на биологических микрочипах. Разнообразие задач и подходов к их выполнению.

1.1.3. Методы регистрации гибридизационного сигнала и увеличения чувствительности анализа.

1.1.4. Методы повышения эффективности гибридизации на биологических микрочипах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Видовая идентификация ортопоксвирусов и обнаружение мутаций, обусловливающих устойчивость Mycobacterivm tvbercvlosis к рифампицину, гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах"

Сегодня трудно представить существование и дальнейшее развитие современной практической медицины без широкого использования методов молекулярной биологии. Эта сравнительно молодая наука позволила вплотную приблизиться к пониманию молекулярных механизмов патологического процесса, изучить взаимодействие лекарственных препаратов с их мишенями в организме, эффективно и быстро диагностировать заболевания, а также конструировать новые, более эффективные и безопасные лекарственные средства. Кроме того, молекулярно-биологические методы нашли широкое применение в диагностике инфекционных заболеваний и в определении устойчивости их возбудителей к лекарственным препаратам, став весьма привлекательной альтернативой культуральным методам анализа. Наибольшее значение применение таких методов приобретает в случаях, когда требуется в кратчайшие сроки проанализировать образец на присутствие болезнетворного агента, например, для ограничения распространения высоко контагиозных заболеваний, либо, если диагностика классическими культуральными методами трудоемка и занимает продолжительное время (при туберкулезе бактериологическое подтверждение клинического диагноза занимает 1-3 месяца).

Изучение генетических детерминант устойчивости исследуемых объектов к лекарственным препаратам позволяет в качестве аналитической мишени использовать нуклеиновые кислоты, что сразу же ставит чувствительность анализа на принципиально иной уровень, благодаря возможности применения ПЦР. Тем не менее, разработка диагностических систем, основанных на ПЦР, сталкивается с рядом трудностей, таких как сложность параллельного анализа нескольких генетических локусов, проблематичность обнаружения минорного полиморфизма и конструирование систем с надежным внутренним контролем, гарантирующим качество и достоверность получаемых результатов. Биологические микрочипы представляют собой платформу с огромным потенциалом для разработки таких аналитических систем, тем самым определяя приоритетность данного направления исследований.

Применение гибридизационного анализа на олигонуклеотидных микрочипах не только упрощает процедуру исследования, но и предоставляет принципиально новые возможности для одновременной идентификации и изучения целого ряда генетических локусов микроорганизмов и вирусов.

Целью данной работы явилась разработка методов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе и создание универсальной методологии конструирования диагностических систем для идентификации патогенных агентов и анализа их устойчивости к лекарственным препаратам. В качестве объектов в настоящем исследовании были использованы возбудители социально опасных инфекций - туберкулеза и оспы бактериальной и вирусной природы, соответственно.

В данной работе отражены следующие результаты:

Сформулированы основные критерии методологии генетического анализа коротких фрагментов бактериальной и вирусной ДНК-мишени методом гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, обладающие достаточной универсальностью и рассматривающие такие аспекты как конструирование праймеров, пробоподготовка, гибридизация, интерпретация результатов и способы повышения их надежности.

Предложена мультиплексная гибридизация на микрочипе как средство повышения надежности результатов.

Для случая, когда специфика исследуемого объекта не позволяет использовать мультиплексную гибридизацию для повышения надежности результатов (например, в случае, когда анализируемые геномные детерминатны представлены полиморфизмом лишь одного локуса), предложен двухпараметрический метод гибридизации.

Впервые сконструирован микрочип, позволяющий достоверно и в кратчайшие сроки проводить детекцию и видовую идентификацию ортопоксвирусов в исследуемом образце.

Сконструирован микрочип, позволяющий проводить детекцию около 95% всех фенотипически устойчивых к рифампицину штаммов М. tuberculosis.

Все вышесказанное подтверждает универсальность разработанной методологии гибридизации на биологических микрочипах, что позволяет применять ее для генетического анализа широкого спектра биологических объектов.

1. Литературный обзор.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лапа, Сергей Анатольевич

Выводы.

1. Разработана унифицированная методология конструирования диагностических систем, основанных на гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами.

2. Разработанная методология успешно применена для конструирования микрочипов для видовой идентификации ортопоксвирусов и определения устойчивости к рифампицину штаммов М. tuberculosis. Метод гибридизации успешно применен для эпидемиологических исследований.

3. Предложен двухпараметрический метод анализа гибридизационной картины, основанный на применении внутреннего гибридизационного стандарта.

4. Разработан метод мультиплексной гибридизации, позволяющий проводить параллельный анализ нескольких генетических локусов на одном микрочипе.

Благодарности.

Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю профессору Андрею Дарьевичу Мирзабекову - идейному вдохновителю научного поиска, - за моральную поддержку, блестящие идеи и чуткое руководство, Владимиру Михайловичу Михайловичу и Александру Юрьевичу Соболеву- за всестороннюю помощь при выполнении работы и за ценные замечания при подготовке текста диссертации, Дмитрию Грядунову, активному участнику экспериментов, за активную поддержку. Кроме того, я весьма признателен А.Ю. Рубиной, В.Е. Барскому, В.В. Чупеевой, A.B. Чудинову, А.Ю. Турыгину, С. А. Суржикову, Э.Я. Крейндлину, Д.В. Прокопенко, С.В Панькову, О.С. Дябиной и другим сотрудникам нашей лаборатории, без участия которых данная работа вряд ли была бы возможна. Я благодарен Jl. Н. Черноусовой, О. И. Скотниковой и С. Н. Щелкунову за предоставленные образцы. Хочу также поблагодарить Александра Сергеевича Заседателева и Елену Ивановну Новикову за ценную редакторскую правку и советы.

Заключение.

Разработанная методология гибридизационного анализа на биологических микрочипах обладает достаточной степенью универсальности, что было показано на примере изучения участков ДНК протяженностью от 100 до 300 п.о. бактериального и вирусного геномов. Немаловажным фактором для метода, который предлагается в качестве широко использующегося в клинической и эпидемиологической практике, является его надежность. Этому вопросу уделено серьезное внимание и предложены средства повышения достоверности получаемых результатов. Применение методологии позволило разработать две независимые диагностические системы, которые к настоящему времени уже нашли применение в клинической и исследовательской практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапа, Сергей Анатольевич, Москва

1. Беланов Е.Ф., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б. Маренникова С.С., Репин В.Е., Сандахчиев JI.C. 1997. Выживаемость вируса натуральной оспы в корочках от больных. Докл. РАН. Т.354. С. 832-834.

2. А.А. Визель, М. Э. Гурылева. Туберкулез. Этиология, патогенез, клинические формы, диагностика, лечение. 208стр., илл. ГЭОТАР Медицина, Москва, 1999.

3. Лабораторная диагностика туберкулеза. Под ред. В.И. Литвинова, A.M. Мороза Москва, МНПЦБТ, 2002, 184с.

4. Alcami A., Khanna A., Paul N.L., Smith G.L. 1999. Vaccinia virus strains Lister, USSR and Evans express soluble and cell-surface tumor necrosis factor receptors. J. Gen. Virol. 80, 949-959.

5. Ball L.A. 1987. High-frequebcy Homologous recombination in vaccinia virus DNA. J.Virol. 61: 1788-1795.

6. Bao P., Frutos A., Greef C., Lahiri J., Muller U., Peterson Т., Warden L., Xie X. 2002. High-sensitivity detection of DNA hybridization on microarrays using resonance light scattering. Anal Chem. 74(8): 1792-1797.

7. Barskii Ya., Grammatin A., Ivanov A., Kreindlin E., Kotova E., Barskii V., Mirzabekov A. 1997. Wide-field luminescence microscopes for analyzing biological microchips. J. Opt. Technol. 65: 938-941.

8. Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A. 2001. Biochips as arrays of biosensors: equipment, fluorescence labels, and applications, (unpublished).

9. Battaglia C., Salani G., Consolandi C., Bernardi L.R, and De Bellis G. 2000. Analysis of DNA Microarrays by Non-Destruvtive Fluorescent Staining Using SYBR® Green II. BioTechniques, 29(1): 78-81.

10. Bavykin S., Akowski J., Zakhariev V., Barsky V., Perov A., Mirzabekov A. 2001. Portable system for microbial sample preparation and oligonucleotide microarray analysis. Appl Environ Microbiol. 67(2): 922-928.

11. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. 1999. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. Analytycal Biochemistry. 273: 221-228.

12. Bloom B.R., and C.J.L. Murray. 1992. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science. 257:1055-1064.

13. Borneman J, Chrobak M, Delia Vedova G, Figueroa A, Jiang T. 2001. Probe selection algorithms with applications in the analysis of microbial communities. Bioinformatics. 1: 39-48.

14. Broude N., Woodward K., Cavallo R., Cantor C., and Englert D. DNA microarrays with stem-loop DNA probes: preparation and applications. Nucleic Acids Res. 29(19), e92.

15. Bubendorf L. 2001. High-throughput microarray technologies: from genomics to clinics. Eur Urol. 40(2): 231-238.

16. Che D., Bao Y., Muller U.R. 2001. Novel surface and multicolor charge coupled device-based fluorescent imaging system for DNA microarrays. J Biomed Opt. 6(4) :450-456.

17. Chee M., Yang R., Hubbell E., Berno A., Huang X.C., Stern D., Winkler J., Lockhart D.J., Morris M.S., and Fodor S.P.A. 1996. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science 274: 610-614.

18. Cohen J. 1997. Is an old virus up to new tricks? Science 277: 312-313.

19. Cole S.T. & Telenti A. 1995. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Eur. Resp. Rev. 8: 701-713.

20. Cutler D., Zwick M., Carrasquillo M., Yohn C., Tobin K., Kashuk C., Mathews D., Shah N., Eichler E., Warrington J., Chakravarti A. 2001. High-throughput variation detection and genotyping using microarrays. Genome Res. 11(11): 1913-1925.

21. Czerny C.-P., Eis-Hubinger A.M., Mayr A., Schneweis K.E., Pfeiff B. 1991. Animal poxviruses transmitted from cat to man: current event with lethal end. J. Vet. Med. 38: 421-431.

22. DeRisi J., Penland L., Brown P.O., Bittner M.L., Meltzer P.S., Ray M., Chen Y., Su Y.A., Trent J.M. 1996. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nature Genetics. 14: 457-460.

23. DeRisi J., Vishwanath R.L., Brown P.O. 1997. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278: 680-686.

24. Drobniewski F.A., Watt B., Smith E.G., Magee J.G., Williams R., Holder J., and Ostrowski J. 1999. A national audit of the laboratory diagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases within the United Kingdom. J. Clin. Pathol. 52: 334-337.

25. Drobyshev A., Mologina N., Shick V., Pobedimskaya D., Yershov G., and Mirzabekov A. 1997. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of beta-thalassemia mutations. Gene. 188: 45-52.

26. Dubiley S., Kirillov E., Lysov Yu., and Mirzabekov A. 1997. Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization. Nucleic Acids Research. 25(12): 2259-2265.

27. C.F. Edman, D.E. Raymond, D.J. Wu, E. Tu, R.G. Sosnowski, W.F. Butler, M. Nerenberg, and M. J. Heller. 1997. Electric Field Directed Nucleic Acid Hybridization on Microchips. Nucleic Acids Res. 25: 4907-4914.

28. Esposito J., Condit R., Obijeski J. 1981. The preparation of orthopoxvirus DNA. J. Virol. Methods. 2: 175-179.

29. Felmlee, T.A., Q. Lin, and Whelen A.C. 1995. Genomic detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance: comparison of single-strand conformation polymorphism and dideoxy fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 33:1617-1623.

30. Fenner, F., Wittek, R. & Dumbell, K.R. 1989. The Orthopoxviruses. London: Academic Press.

31. Fodor, S.P.A., Read, J.L., Pirrung, M.C.,Stryer, L., Lu, A.T., Solas D. 1991. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251: 767-773.

32. Fotin, A.V., Drobyshev, A.L., Proudnikov, D.Y., Perov, A.N., and Mirzabekov A.D. 1998. Parallel Thermodynamic Analysis of Duplexes on Oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res. 26: 1515-1521.

33. Fuller C., Perry A. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnostic and investigative neuropathology. 2002. Brain Pathol. 12(l):67-86.

34. E. Gentalen and M. Chee. 1999. A novel method for determining linkage between DNA sequences: hybridization to paired probe arrays. Nucleic Acids Res., 27: 1485-1491.

35. K. Gunderson, X. Huang, M. Morris, R. Lipshutz, D. Lockhart, and M. Chee. Mutation Detection by Ligation to Complete n-mer DNA Arrays. 1998. Genome Res. 8:1142-1153.

36. D. Guschin, B. Mobarry, D. Proudnikov, D. Stahl, B. Rittmann, and A. Mirzabekov. Oligonucleotide Microchips as Genosensors for Determinative and Environmental Studies in Microbiology. Appl. Envir. Microbiol., 63: 2397-2402.

37. Hacia J., Brody L., Chee M., Fodor S., Collins F. 1996. Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nat Genet. 14(4): 441-7.

38. J.G. Hacia, S.A. Woski, J. Fidanza, K. Edgemon, N. Hunt, G. McGall, S.P.A. Fodor, and F.S. Collins. 1998. Enhanced High Density Oligonucleotide Array-Based Sequence Analysis Using Modified Nucleoside Triphosphates. Nucleic Acids Res. 26: 4975-4982.

39. Hahon N, Wilson B.J. 1960. Pathogenesis of Variola in Macaca irusmonkeys. Amer. J. Hyg. 71: 69-80.

40. Healey B., Matson R., Walt D. 1997. Fiberoptic DNA sensor array capable of detecting point mutations. Anal Biochem. 251(2): 270-279.

41. Heifets L., Cangelosi G. 1999. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: a neglected problem at the turn of the century. Int. J. Tubercle Lung. Dis. 3: 564-581.

42. Holliday, R. 1964. Genet. Res. 5: 282-304.

43. Hu F.-Q., Chan Y.S., Pickup D.J. 1994. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. Virology 204: 343-356.

44. Ibrahim,M.S., Esposito, J.J., Jährling, P.B. & Lofts, R.S. 1997. The potential of 5' nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in Orthopoxvirus. Molecular and Cellular Probes 11: 143-147.

45. Jobs M, Fredriksson S, Brookes AJ, Landegren U. 2002. Effect of oligonucleotide truncation on single-nucleotide distinction by solid-phase hybridization. Anal Chem. 74(1): 199-202.

46. Kempe C.H. and Beneson A.S. 1955. Smallpox and vaccinia. Symp. On unusual infection of childhood. Pediat. Clin. North America 2, 19-32.

47. Kent, P. T., and G. P. Kubica. 1985. Public Health Mycobacteriology a guide for the level III laboratory. U.S. Department of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta.

48. Khrapko, K., Lysov, Yu., Khorlin, A., Ivanov, I., Yershov, G., Vasilenko, S., Florentiev, V., Mirzabekov, A. A Method for DNA Sequencing by Hybridization With Oligonucleotide Matrix. DNA Sequence 1991, 375-388.

49. Khrapko, K.,R., Lysov ,Yu.P., Khorlin A.A., Shick V.V., Florentiev V.L. & Mirzabekov A.D. 1989. Hybridization of oligonucleotides as a method of DNA sequencing. FEBS Letters 258 118-122.

50. Kolchinsky A., Mirzabekov A. 2002. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips. Hum Mutat. 19(4): 343-360.

51. Kotwal, G.J., Moss, B. 1988. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant. Virology 167: 524-537.

52. Kricka L. 2002. Stains, labels and detection strategies for nucleic acids assays. Ann Clin Biochem. 39: 114-129.

53. M. Lane, T. Paner, I. Kashin, B. Faldasz, B. Li, F. Gallo, and A. Benight. The thermodynamic advantage of DNA oligonucleotide 'stacking hybridization' reactions: energetics of a DNA nick.

54. Lebed J., Chechetkin V., Turygin A., Shick V., Mirzabekov A. 2001. Comparison of Complex DNA with Generic Oligonuicleotide Microchip. J. Biomol. Struct. Dyn. 18: 813-823.

55. Li F., Stormo G. 2001. Selection of optimal DNA oligos for gene expression arrays. Bioinformatics. 17(11): 1067-1076.

56. Lipshutz R.J., Morris D., Chee M., Hubbell E., Kozal M.J., Shah N., Shen N., Yang R., and Fodor S.P.A. 1995. Using oligonucleotide probe arrays to access genetic diversity. BioTechniques. 19: 442-447.

57. Livshits M., Florentiev V., and Mirzabekov A. 1994. Dissociation of Duplexes formed by hybridization of DNA with Gel-Immobilized oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dyn. 11: 783-795.

58. Livshits M., and Mirzabekov A. 1996. Theoretical Analysis of the Kinetics of DNA hybridization with Gel-Immobilized Oligonucleotides. Biophys. J. 71:2795-2801.

59. Long R, Nobert E, Chomyc S, van Embden J, McNamee C, Duran RR, et al. 1999. Transcontinental spread of multidrug-resistant Mycobacterium bovis. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159: 2014-2017.

60. Lysov Y. P., Florentiev V. L., Khorlin A. A., Khrapko K. R., Shick V. V. & Mirzabekov A. D. 1988. Proc. USSR Acad. Sei. 303: 1508-1511.

61. Marennikova S.S., Nagieva F.G., Matsevich G.R., Shelukhina E.M., Khabahpasheva N.A., Platonova G.M. 1988. Monoclonal antibodies to monkeypox virus: preparation and application. Acta Virol. 32: 19-26.

62. Marennikova S.S. and Shchelkunov S.N. Orthopoxviruses pathogenic for humans. 1998. KMK Scientific Press Ltd, Moscow.

63. Markey L.A. & Breslauer K.J. 1987. Calculating thermodynamic data for transistion of any molecularity from equilibrium melting curves. Biopolymers. 26: 1601-1620.

64. Marton MJ. 1998. Drug target validation and identification of secondary drug target effects using DNA microarrays. Nature Med. 4:1293-301.

65. M. Masuko, S. Ohuchi, K. Sode, H. Ohtani, and A. Shimadzu. 2000. Fluorescence resonance energy transfer from pyrene to perylene labels for nucleic acid hybridization assays under solution conditions. Nucleic Acids Res. 28, e34.

66. Maughan NJ, Lewis FA, Smith V. 2001. An introduction to arrays. J Pathol. 195(1): 3-6.

67. Maxam A. M. & Gilbert W. 1977. A method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 560-564.

68. Mei R., Galipeau P., Prass C., Berno A., Grandour G., Patil N., Wolff R., Chee M., Reid B., Lockhart D. 2000. Genome-wide detection of allelic imbalance using human SNPs and high-density DNA arrays. Genome Res. 10: 1126-1137.

69. Meyer H., Pfeffer M. & Rziha H.-J. 1994. Sequence alterations within and downsream of the A-type inclision protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. Journal of General Virology. 75: 1975-1981.

70. Mirzabekov A. 1994. DNA Sequencing by Hybridization a Megasequencing method And a Diagnostic Tool? Trends Biotech. 12: 27-32.

71. Mirzabekov A.D. 1999. Biological Agent Detection and Identification. DARPA Conference Proceedings, April 27-30, Santa Fe, NM, pp. 57-67.

72. Molecular Probes SYBR Green II Product Information Sheet.

73. Mukinda V.B., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. 1997. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Monkeypox Epidemiologic Working Group. Lancet 349: 1449-1450.

74. Murray C.J.L., K. Styblo, and A. Rouillon. 1992. In.: D.T. Jamison and W.H. Mosle (ed.). Disease control priorities in developing countries. Oxford University Press foe the Wold Bank, New York.

75. Musser, J. M. 1995. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin. Microbiol. Rev. 8: 496-514.

76. Nadder T., Langley M. The new millennium laboratory: molecular diagnostics goes clinical. Clin Lab Sci. 2001. 14(4): 252-259.

77. Naef F, Lim DA, Patil N, Magnasco M. 2002. DNA hybridization to mismatched templates: A chip study. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 65: 4-10.

78. Nasedkina T, Domer P, Zharinov V, Hoberg J, Lysov Y, Mirzabekov A. 2002. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Haematologica. 87(4) :363-372.

79. S. Parinov, V. Barsky, G. Yershov, E. Kirillov, E. Timofeev, A. Belgovskiy, and A. Mirzabekov. 1996. DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides. Nucleic Acids Research. 24: 2998-3004.

80. Pease A.C., Solar D., Sullivan E.J., Cronin M.T., Holmes C.P, and Fodor S.P.A. 1994. Light-directed oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 91: 5022-5026.

81. Pfyffer. 1999. Multicenter evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs. J. Clin. Microbiol. 37: 45-48.

82. Pickup, D.J., Ink, B.S., Parsons, B.L., Hu, W., Joklik, W.K. 1984. Spontaneous deletions and duplications of sequences in the genome of cowpox virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6817-6821.

83. Proudnikov D., Kirillov E., Chumakov K., Donlon J., Rezapkin G., Mirzabekov A. 2000. Analysis of Mutations in Oral Poliovirus Vaccine by Hybridization with Generic Oligonucleotide Microchips. Biologicals. 28: 57-66.

84. Ramaswamy S., Musser J. 1998. Molecular Genetic Basis of Antimicrobial Agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 Update. Tub. Lang Dis. 79: 3-29.

85. R.G. Sosnowski, E. Tu, W. F. Butler, J.P. O'Connel, and M.J. Heller. 1997. Rapid determination of single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 1119-1123.

86. Roop S.L., Jin Q., Knight J.C., Massung R.F. & Esposito J.J. 1995. PCR strategy for identification and differentiation of smallpox and other orthopoxviruses. Journal of Clinical Microbiology. 33: 2069-2076.

87. Sanger F., Nichlen S. & Coulson A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467.

88. Schena M. 1996. Genome analysis with gene expression microarrays. Bioassays. 18: 427-431.

89. M. Schena, R. Heller, T. Theriault, K. Konrad, E. Lachenmeier, and . Davis. 1998. Microarrays: biotechnology's discovery platform for functional genomics. Trends In Bootech. 16: 301-306.

90. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270: 467^170.

91. F. Schwarz, S. Robinson, and J. Butler. 1999. Thermodynamic comparison of PNA/DNA and DNA/DNA hybridization reactions at ambient temperature. Nucleic Acids Res. 27: 4792-4800.

92. Sedger L. and McFadden G. 1996. M-T2: A poxvirus TNF receptor homologue with dual activities. Immunol. Cell Biol. 74: 538-545.

93. Shalon D, Smith SJ, Brown PO. 1996. A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using twocolor fluorescent probe hybridization. Genome Res. 6: 639^5.

94. M. Shchepinov, S. Case-Green, and E. Southern. 1997. Steric factors influencing hybridisation of nucleic acids to oligonucleotide arrays. Nucleic Acids Research. 25: 1155-1161.

95. Shick, V., Lebed, Y., and Kryukov, G. 1998. Identification of HLA DQA1 alleles by the oligonucleotide microchip method. Mol. Biol. 32: 679-688.

96. Snider D.E., G.M. Cauthen, and L.S. Farer. 1991. Drug-resistant tuberculesis. Am. Rev. Respir. Dis. 144: 732.

97. Telenti A, P. Imboden, F. Marchesi, D. Lowrie, S. Cole, M. J. Colston, L. Matter, K. Schopfer, and T. Bodmer. 1993. Detection of rifampin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet. 341: 647-650.

98. S. Tillib and A. Mirzabekov. 2001. Anvances in the Analysis of DNA Sequence Variations Using Oligonucleotide Microchip Technology. Current Opinion in Biotechnology. 12: 53-58.

99. Turner, P.C., Moyer, R.W. 1990. The molecular pathogenesis of poxviruses. Curr. Topics in Microbiol. And Immunol. 163: 125-151.

100. Vasiliskov, V., Prokopenko, D., Mirzabekov, A. 2001. Parallel multiplex thermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes by oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucl. Acids Res. 29: 2303-2313.

101. Walt D., Franz D. 2000. Biological warfare detection. Anal Chem. 72(23): 738A-746A.

102. J. Wang, E. Palecek, P. Nielsen, G. Rivas, X. Cai, H. Shiraishi, N. Dontha, D. Luo, and P. Farias. 1996. Peptide Nucleic Acid Probes for Sequence-Specific DNA Biosensors. J. Am. Chem. Soc. 118: 7667-7670.

103. Watterson S., Wilson S., Yates M., Drobniewski F. 1998. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 36: 1969-1973.

104. Weekly Epidemiological Record.1997a. Human monkeypox in Kasai Oriental, Zaire (1996-1997). Vol.72. No. 15. P. 101-104.

105. Weekly Epidemiological Record. 1997b. Monkeypox in the Democratic Republic Congo (former Zaire). Vol. 72. No.34.P.258.

106. Weekly Epidemiological Record.1997c. Human monkeypox in Kasai Oriental, Democratic Republic Congo (former Zaire). Vol.72.No.49.P.369-372.

107. J. Weiler, H. Gausepohl, N. Häuser, O. Jensen, and J. Hoheisel. 1997. Hybridisation based DNA screening on peptide nucleic acid (PNA) oligomer arrays. Nucleic Acids Research. 25(14): 2792-2799.

108. S. White, and T. Christopoulos. 1999. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin. Nucleic Acids Res. 27, e25.

109. WHO SE Series. 1986. Report of the fourth meeting of the Committee on Orthopoxvirus Infections. WHO/SE/86.163.

110. Whitney LW, Ludwin SK, McFarland HF, Biddison WE. 2001. Microarray analysis of gene expression in multiple sclerosis and EAE identifies 5-lipoxygenase as a component of inflammatory lesions. J Neuroimmunol. 121(1-2): 40-8.

111. Wienecke, R., Wolff, H., Schaller, M., Meyer, H., Plewig, G. 2000. Cowpox virus infection in an 11-year-old girl. J Am Acad Dermatol. 42: 892-4.

112. P. Wittung, P. Nielsen, and B. Norden. 1996. Direct Observation of Strand Invasion by Peptide Nucleic Acid (PNA) into Double-Stranded DNA. J. Am. Chem. Soc. 118: 7049-7054.

113. Wolff H.L., Croon J.J.A.B. 1968. The survival of smallpox virus (variola minor) in natural circumstances. Bull. WHO. 38: 492-493.

114. C. Xiang, Y. Chen. 2000. cDNA microarray technology and its applications. Biotechnology Advances. 18: 35^46.

115. Yamashita K, Takagi M, Uchida K, Kondo H, Shigeori T. 2001. Visualization of DNA microarrays by scanning electrochemical microscopy (SECM). Analyst. 126(8): 1210-1211.

116. M. Yang and D. Millar. 1996. Conformational Flexibility of Three-Way DNA Junctions Containing Unpaired Nucleotides. Biochemistry. 35: 7959-7967.

117. Yu J., Othman M., Farjo R., Zareparsi S., MacNee S., Yoshida S., Swaroop A. 2002. Evaluation and optimization of procedures for target labeling and hybridization of cDNA microarrays. Mol Vis. 26(8): 130-137.

118. Yuen L, Leslie D, Coloe P. 1999. Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia. J. Clin. Microbiol. 37: 3844-3850.