Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах

Коновалова, Елизавета Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах"

на правах рукописи УДК 577.2.08

Коновалова Елизавета Владимировна

РАЗРАБОТКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ГИДРОГЕЛЕВЫХ

МИКРОЧИПАХ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2006

Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН, на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ).

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный Рубина Алла Юрьевна сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Нечипуренко Юрий Дмитриевич

старший научный сотрудник ИМБ РАН

доктор биологических наук, профессор,

заведующий Лабораторией молекулярной Деев Сергей Михайлович иммунологии ИБХ РАН

ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Ведущая организация: Федерального агентства по

здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 22 » ноября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г.Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00,408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан октября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент <— ; ^ Братин В.Е.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечения рака, поскольку оно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение.

Для диагностики злокачественных новообразований и контроля за лечением в настоящее время широко используются опухолеассоциированные антигены (онкомаркеры), определяемые в сыворотке крови с помощью специфических моноклональных антител. Их уровень в крови, как правило, коррелирует с размером опухоли или стадией заболевания.

Количественный анализ онкомаркеров проводится иммунохимическими методами (ИФА) в основном на плашках (стрипах). Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, в то время как для постановки точного диагноза требуется анализ на содержание в крови нескольких онкомаркеров.

Эта проблема решается при помощи метода, представленного в данной диссертационной работе, позволяющего количественно анализировать содержание нескольких антигенов в образце с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования является разработка метода одновременного количественного анализа общей и свободной форм простага-специфическош антигена (ПСА) в сыворотке крови на биологическом микрочипе.

В связи с этим были поставлены следующие задача:

1. Разработать условия ковалентной иммобилизации белков в гелях с максимальным сохранением биологической активности.

2. Оптимизировать проведение иммуноанализа с использованием микрочипов на основе гидрогелей. Выбрать оптимальный состав геля.

3. Создать микрочип с ковалентно иммобилизованными антителами к ПСА. Ввести в состав биочипа внутреннюю калибровочную кривую (гелевые ячейки с иммобилизованным ПСА), позволяющую проводить количественное определение двух форм ПСА на одном микрочипе.

4. Оценить параметры количественного иммуноанализа ПСА на микрочипе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ ^ ;

В диссертационной работе предложен оригинальный метод количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе в формате «один образец - один микрочип». Данный метод не требует дополнительного построения калибровочных кривых при каждом проведении анализа.

Создан микрочип, содержащий иммобилизованные антитела против обшей и свободной форм ПСА и внутреннюю калибровочную кривую, представляющую собой гелевые ячейки с иммобилизованным в различных концентрациях ПСА. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипа с максимальным сохранением исходной активности белков.

Показано, что разработанный метод одновременного количественного анализа двух форм простата-специфического антигена па биологическом микрочипе позволяет с достаточной чувствительностью, воспроизводимостью и точностью проводить определение содержания двух форм данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови.

Созданный метод может служить основой для разработки тест-системы для ранней и дифференциальной диагностики рака предстательной железы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы докладывались на XIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (9-12 февраля, 2004, Москва). Отдельные фрагменты диссертационной работы многократно докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН.

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам диссертации опубликовано две научные статьи, опубликованы два тезиса докладов. Ссылки на работы даны в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение; выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на^ ^страницах машинописного текста, содержит ^ рисунков и ^ таблиц. Библиография включает ^^наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ß соответствии с целями и задачами данного исследования на первом этапе разработки метода количественного анализа онкомаркеров необходимо было подобрать условия для создания белковых микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела к двум формам ПСА и разработать процедуру проведения иммуноаиализа на микрочипе. На сконструированном микрочипе была проведена оценка надежности результатов количественного иммуноанализа, воспроизводимости измерений и чувствительности метода. IIa втором этапе работы, для определения концентраций двух форм ПСА на одном микрочипе без предварительного построения калибровочных кривых в ходе каждого анализа, в структуру биочипа были введены дополнительные элементы (ячейки с иммобилизованным в различных концентрациях ПСА), выполняющие функцию внутренней калибровочной кривой. Проведено сравнение результатов измерений двух форм ПСА, полученных на биочипах с помощью внутренней калибровочной кривой, и стандартными иммунохимическими методами.

1. Простата-специфический антиген (ПСА)

ПСА продуцируется клетками предстательной железы и представляет1 собой гликопротеин с молекулярной массой 32 кДа. С точки зрения биохимических свойств, ПСА является ферментом - сериновой протеазой с субстратным сродством к химотрипсину и, в меньшей степени, к трипсину. При поступлении в кровь ПСА связывается с ингибиторами протеаз, в результате чего в сыворотке крови он обнаруживается как в свободной форме, так и в различных связанных молекулярных формах, не обладающих специфической ферментативной активностью: преимущественно в комплексе с антихимотрипсином (AXT) — ПСА-АХТ и макроглобулином <МГ) — ПСА-МГ. Установлено, что доминирующей связанной формой в сыворотке крови (до 90%) является комплекс ПСА-АХТ, тогда как на долю комплекса ПСА-МГ приходится менее 1%. В сыворотке крови также всегда циркулирует не связанная с ингибиторами (свободная) форма антигена. Большая часть простата-специфического антигена, доступная для иммунологического определения, находится в комплексе с антихимотрипсином. Незначительная часть ПСА, связанная с макроглобулином, недоступна для определения обычными иммунными методами, так как молекула ПСА экранировала комплексом. Для исследования концентрации этой фракции требуются специальные методы лабораторной диагностики. Под определением двух форм ПСА имеется в виду определение концентрации свободного ПСА (ПСА^юс), и общего

ПСЛ (ПСАобщ). Общей формой ПСА называют сумму концентраций свободного ПСА и ПСА, связанного в комплекс с антихнмотрипсином.

Измерение концентрации общего и свободного ПСА в сыворотке крови больного, а также соотношения этих двух форм, позволяет различать злокачественные и доброкачественные заболевания предстательной железы. В норме у здорового мужчины и при доброкачественных заболеваниях соотношение [ЛСАсюеИПСА общ] в сыворотке крови более 0.25, а при РПЖ — менее 0.1. Принимая во внимание высокую клиническую значимость ПСА как диагностического маркера, было решено создать специальный микрочип для одновременного количественного определения двух форм ПСА, который может найти применение для ранней дифференциальной диагностики рака предстательной железы, включая массовое обследование населения.

2. Белковые микрочипы

В лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта разрабатываются микрочипы на основе трехмерных гидрогелей. Технология гидрогелевых микрочипов достаточно универсальна и может быть применена

J 1" 1 ' ' i " i -

для изготовления чипов, содержащих различные по своей природе иммобилизованные зонды: ДНК, РНК, белки, пептиды и пр. Олигопуклеотидные микрочипы уже используются для диагностики целого ряда инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний.

Биочип представляет собой подложку (пластик, стекло и др.), на которую нанесены полусферические гелевые элементы (ячейки). Каждый гелевый элемент микрочипа содержит иммобилизованный индивидуальный зонд.

Носителем для иммобилизации гидрогелей являются стеклянные пластинки, обработанные специальным агентом (Bind Si lane) для создания непредельной метакрнльной группы на поверхности стекла. Далее на активированное таким образом стекло роботом с пиновой технологией нанесения наносится полимеризационная смесь в виде микрокапель, содержащая иммобилизуемые зонды и гелеобразующие мономеры. Ячейки находятся на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом; число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента.

Ковалентная иммобилизация зондов происходит при облучении микрочипа ультрафиолетовым светом. Иммобилизация протекает одновременно с полимеризацией геля, т.е. происходит ковалентное связывание зонда с компонентами растущей полимерной цепи в ходе фотоиндуцируемой полимеризации.

УФ-излучение

[ Подложка]

!• Полимеризаанонная смесь; содержащая кйкиюйймы 1 гепй и иммобилизуемые , [ соединения •. . . , , ,■

Рисунок 1. Получение ячеек гидрогеля, содержащих молекулярный зонд, методом фотоиндуцированной сополимеризации.

Дня того чтобы участвовать в реакции ф отоиндуцируемой полимеризации, биологические соединения должны содержать активные группы, способные вступать в реакции замещения или присоединения с бифункциональными гелеобразующими мономерами (кросс-линкерами), В качестве таких активных групп могут выступать амияо- и сульфгидрильные группы. Биологические соединения, такие как белки, не нуждаются в дополнительной модификации, а олигонукпеотиды, ДНК и сахара перед проведением иммобилизации необходимо модифицировать введением в их структуру амин о- либо сульфгидрильных групп. В качестве гелеобразующих соединений в нашей работе использовали производные метакриламида и М^-метиленбисакриламид.

2.1. Регистрация сигналов гепевых ячеек микрочипа

Регистрацию результатов анализа осуществляли флуориметрически или хемилюминометрически непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Белки, используемые для детекции, содержали флуоресцентную метку (Су5) или являлись ферментами, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хемилюмииесценция). Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН) с использованием фильтров 650/670 нм (возбуждение/регистрация). Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала производили с помощью программного обеспечения 1таОе1А8зау (ИМБ РАН). Хемилюминссцентаые сигналы, полученные во время реакции окисления люминола перекисью водорода, катализируемой пероксидазой, в присутствии усилителей хемилюминесценции, регистрировали ССП-камсрой флуоресцентного микроскопа с выключенным источником света.

2.2. Подбор условий иммобилизации белков

В процессе образования полимерного геля белок подвергается различным денатурирующим воздействиям, в результате чего может происходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитической или биологической активности. Причиной искажения структуры белка могут быть неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между белком и носителем; инактивация может происходить под действием свободных радикалов, образующихся при радикальной полимеризации; также денатурацию белка могут вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь, мономер.

Важной задачей являлся подбор условий иммобилизации белков с сохранением ими биологической активности. Для решения этой задачи для иммобилизации на чипах были выбраны ферменты, как белки чувствительные к различным видам модификаций и позволяющие детектировать не только степень их иммобилизации на чипе, но и сохранение ферментативной активности. В качестве объектов были выбраны широко используемые в аналитической биохимии и иммунохимии пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза.

В первых экспериментах для изготовления белковых микрочипов использовали стандартные условия изготовления микрочипов, содержащих ДНК и олигонуклеотиды (время полимеризации , 90 мин, ультрафиолетовое излучение с максимумом при длине волны 312 нм). При проведении полимеризации в этих условиях, сигналы от ячеек, содержащих иммобилизованную пероксидазу, в концентрации 1мг/мл были всего на 10% выше фона. Предположили, что данные условия получения микрочипов могут приводить к инактивации белков. Было проверено действие ультрафиолетового излучения на активность пероксидазы и щелочной фосфатазы в растворе. Через определенные промежутки времени облучения отбирали аликвоты растворов и спектрофотометрически определяли активность ферментов по скорости взаимодействия с субстратами (реакция окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы (460нм) и реакция гидролиза п-нитрофенилфосфата в присутствии щелочной фосфатазы (405нм)]. Активность измеряли по тангенсу угла наклона прямолинейного начального участка кинетической кривой.

Рисунок 2. Инактивация пероксидазы (1) и щелочной фосфатазы (2) под действием ультрафиолетового излучения в течение времени. Раствор пероксидазы и фосфатазы (1мг/мл) облучали УФ-светом с максимумом излучения 312(А) и 350(») им.

Оказалось, что через 50 мин облучения пероксидазы УФ-света с длиной волны 312 им теряется более 90% активности.

Необходимо было подобрать более мягкие условия изготовления микрочипов. Для этого: (1) использовали УФ излучение с максимумом 350 им при полимеризации, (2) полимеризацию производили при охлаждении, чтобы температура полимеризационной смеси не превышала 20°С, (3) уменьшили время полимеризации до 50 мнн, (4) вводили в гель сахарозу в качестве стабилизирующей добавки (от 10 до 60%). Сигналы, получаемые от иммобилизованной пероксидазы в выбранных нами условиях, были в 20-30 раз выше, чем в стандартных условиях изготовления ДНК-микрочипов. Известно, что сахара препятствуют дегидратации и способствуют стабилизации белков. Поэтому в дальнейшем в работе использовали гели на основе мономеров, производных метакриламнда и амииосахаров.

Для измерения сохранения активности пероксидазы после иммобилизации на микрочипе в выбранных условиях, фермент иммобилизовали на микрочипе в разных концентрациях (10-60 мкг/мл геля). Получили зависимость интенсивности хемилюминнсцентного сигнала гелевых эелементов от концентрации иммобилизованной пероксидазы. По этим данным рассчитали удельную активность фермента (с учетом эффективности иммобилизации). Для измерения активности пероксидазы, не подвергающейся влиянию иммобилизации, фермент сорбировали на пустых гелевых

элементах; ферментативную активность определяли как интенсивность хемилюминесценции гелевых элементов после добавления субстрата (люминол и перекись водорода). Удельная ферментативная активность сорбированной пероксидазы составила 10s отн.ед., после иммобилизации 7-104 отн.ед. Таким образом, после иммобилизации фермент сохранил около 70% активности.

В результате были подобраны условия ковалентной иммобилизации белков в геле с сохранением ими биологической активности.

23 Выбор состава' геля для проведения иммуиоанализа на гелевых белковых

микрочипах на примере прямого анализа ПСА

Необходимо было выбрать состав геля, обладающий достаточной пористостью для проникновения антигена и образования бинарного комплекса антитело-антиген. Технология изготовления трехмерных гелевых микрочипов позволяет создавать гели различной пористости, необходимой для проведения анализа разных типов биомолекул, для иммобилизации антител.

Для выражения состава геля используют обозначения Т(%) — суммарная масса всех

•ч

гелеобразующих мономеров к объему геля, и С(%) — вес сшивки к суммарному весу всех гслеобразующих мономеров. Известно, что повышение пористости геля возможно достичь за счет уменьшения концентраций гелеобразующих мономеров (Т %). В то же время, размер лор также сильно зависит от концентрации добавляемого в раствор мономера "сшивающего" агента (С %). В случае акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с минимумом при концентрации сшивки около 5% [И.В. Берез ин, 1987].

Мы исследовали влияние процентного содержания мономера и сшивки на пористость получаемых гелей. Для этого изготовили' микрочипы с гелями различного состава, содержащими иммобилизованые антитела к ПСА в равных концентрациях. На этих микрочипах были получены кинетические кривые образования бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА-Су5 с моноклональными антителами (рис. Э). Раствор флуоресценто-меченного антигена в PBS (фосфатно-солевой буфер, 0.15 М NaCl, рН 7.2), содержащем 0.15% поливинилового спирта и 0.15% поливинилпирролидона, наносили на микрочипы, и регистрировали рост флуоресцентного сигнала на гелевых ячейках микрочипа с течением времени. Во всех гелях в качестве основного мономера использовали 2-метакриламидо-2-дезокси-С-глюкозу, в качестве сшивающего агента N^N-метил енбисакри ламид.

гл

<1) <2)

время (ч)

Рисунок 3. Кинетические кривые образования бинарного комплекса ПСА-Су5 с антителами к ПСА (0.6 мг/мл в геле), иммобилизованными в гелях состава ТЗ%С2.5% (1),Т4%С2.5% (2), ТЗ%С25% (3), Т5%С4% (4) и Тб%С5% (5). Концентрация антигена в буфере PBS 100 нг/мл. Т= 20°С.

Как видно из рисунка, максимального флуоресцентного сигнала удается достичь при использовании композиции ТЗ%С2.5%, минимальный сигнал был получен от ячеек с гелем Тб%С5%. Эффективность иммобилизации антител во всех гелях была примерно одинакова и составляла 30-40%. Таким образом установили, что гель с минимальной концентрацией мономеров и сшивки обладал наибольшей пористостью, что согласуется с данными, известными для акриловых полимеров. В дальнейшей работе для изготовления микрочипов был выбран гель состава ТЗ%С2.5%.

2.4. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов

Для изготовления белковых микрочипов используются различные технологии, в большинстве случаев белки закрепляют (за счет физической сорбции или ковалентно) на поверхности твердых носителей; такие микрочипы являются 'двумерными'.

Чтобы сравнить , трехмерную гелевую поверхность с двумерной, были изготовлены микрочипы, ,, содержащие антитела к ПСА,, иммобилизованные в различных концентрациях. Для получения двумерных чипов поверхность стеклянных слайдов обрабатывали реагентом (3>глицидилоксипропил)-триМетоксисиланом. Эпоксиднрование слайда даёт возможность получать спейсер, отделяющий белок от носителя, это имеет значение для уменьшения потери исходной активности белка за счет стерических затруднений, возникающих в процессе иммобилизации. В качестве трехмерных

микрочипов использовали гелевые микрочипы, изготовленные по технологии, описаннои выше.

Микрочипы инкубировали с раствором ПСА (в различных концентрациях), после инкубации промывали 20 мин PBS, содержащим 0.1% Tween-20, и проявляли антителами, специфичными к другому эпитопу, меченными Су-5 (15 мкг/мл), в течение 2 ч. Регистрацию сигналов проводили при помощи флуоресцентного микроскопа. Для двух типов микрочипов были получены графики зависимости интенсивности флуоресцентных сишалов от концентрации антигена (ПСА) в растворе (рис.4).

0.75 ■

3 х

* (2) ° 0.6 Е

(3) 0.45

- (4)

* (5)

15 30 45 [ПСА], НГ/МЛ

30 45

[ПСА], НГ/МЛ

Рисунок 4. Зависимость интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации ПСА в растворе в случае трехмерных (а) и двумерных (б) микрочипов. Концентрации иммобилизованных антител к ПСА в ячейках микрочипов: [I] - 220мкг/мл, [2] — 11 Омкг/мл, [3] - 50 мкг/мл, [4] — 25мкг/мл, [5] - 14мкг/мл.

Как видно из рисунка, флуоресцентные сигналы, соответствующие максимальной концентраций иммобилизованных антител в случае гелевых микрочипов на порядок превосходят сигналы от аналогичных ячеек двумерных микрочипов. В то же время, сигналы для минимальной концентрации антител в геле превышают сигналы от иммобилизованных на двумерных микрочипах антител в четыре раза. Это можно объяснить тем, что в случае двумерных микрочипов существует зависимость эффективности иммобилизации от исходной концентрации иммобилизуемого белка; и довольно быстро наступает пасыщение но количеству иммобилизованных молекул на единицу поверхности, при достижении которого не происходит дальнейшего увеличения количества иммобилизуемого соединения. Трехмерная структура геля повышает емкость иммобилизации по сравнению с поверхностным слоем, увеличивая возможное количество

иммобилизуемого белка в пересчете на единицу поверхности; при этом иммобилизованные соединения равномерно распределены по всему объему геля на достаточно удаленном расстоянии друг от друга (более 1000А) даже при высокой концентрации иммобилизуемых зондов [Rubina 2004]. Кроме того, иммобилизация в объеме гелевого элемента предохраняет молекулы от контакта с гидрофобной поверхностью подложки, что предотвращает денатурацию белков. Все это позволяет получить более высокую чувствительность анализа на гелевом микрочипе, по сравнению с двумерными микрочипами.

3. Определение констант ассоциации (Ка„) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами

При выборе антител важной характеристикой является их аффинность, характеризующаяся константой ассоциации. На микрочипах были измерены константы ассоциации для антител, специфически связывающих o6inyio(PSA-36) и свободную(Р8А-30) формы ПСА.

Для определения константы ассоциации образования бинарных комплексов ПСА, меченного флуоресцентным красителем Су-5 с иммобилизованными антителами к свободной и общей форме, на микрочипах получили зависимость интенсивноста флуоресцентных сигналов от концентрации ПСА-Су5 в растворе. Из л о лученных данных рассчитали К^ антигена с антителами (по формуле 1).

Рисунок 5. Определение константы ассоциации (К,„) образования бинарных комплексов между ПСА-Су5 и иммобилизованными на микрочипе антителами Р8А-30 и РЗА-Зб (200 мкг/мл в геле). Сигналы 1фЛуор для разных концентраций ПСА измерены в насыщении.

где I— интенсивность флуоресцентного сигнала; а — коэффициент пропорциональности; \ЛЬо\ — общая концентрация иммобилизованных антител в геле, [Ago\ — общая концентрация антигена в растворе. Более подробное описание расчета констант ассоциации представлено в [Rubina A. Yu, 2005].

График зависимости интенсивности сигнала от концентрации антигена в растворе, представленный в двойных обратных координатах, можно аппроксимировать в виде

прямой линии с углом наклона---, пересекающей ось ординат в точке-!-.

амА1 а[АЬ0)

Значение константы ассоциации может быть рассчитано из соотношения К^----— в

1 Л

точке у = 0.

Расчётная константа ассоциации для флуоресцентно-меченного ПСА и антител PSA-36 к общей форме составила

(1.5±0.4)*108 М"1 , для антител PSA-30 к свободной форме (1.1±0.4)*108 М"'. Полученные значения констант соответствуют значениям для данных антител, известных от производителей, что говорит об иммобилизации антител без потери биологической активности.

4. Белковый гидрогелевый микрочип для количественного анализа двух форм ПСА

Основной задачей данной работы являлось создание аналитической системы для одновременного количественного определения двух форм ПСА на основе гндрогелевого микрочипа. На первом этапе необходимо было создать мнкрочип с иммобилизованными антителами и оптимизировать процедуру анализа на микрочипе.

Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ. Сэндвич-вариант иммуноанализа возможен, если использовать антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антиген-иммобилизованное антитело; После образования комплекса микрочип обрабатывают проявляющими

флуоресцентно-меченными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце.

Для иммобилизации были выбраны моноклональные антитела против свободной формы ПСА (PSA-30) и общей формы ПСА (PSA36); в качестве проявляющих антител

■■ г

выбрали PSA66 фирмы CanAg (Швеция). Антитела PSA30 специфичны к участку сайта связывания ПСА с антихимотрипсином, антитела PSA-36 специфичны к открытому участку ПСА, общие проявляющие антитела PSA-66 специфичны к другому открытому участку ПСА. Иммуноанализ проводили следующим образом: микрочипы после полимеризации отмывали в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.2, содержащем 0.15 М NaCl (PBS) и 0.1% Tween-20, и затем дистиллированной водой. Для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы обрабатывали блокирующим раствором: 1% поливинилового спирта (ЛВС) в PBS, в течение 40 мин, затем промывали дистиллированной водой и наносили 30 мкл образца. Далее микрочипы инкубировали в течение 17 ч при 22-25°С. После инкубации микрочипы промывали 20 мин PBS, содержащим 0.1% Tween-20, и проявляли антителами PSA-66, меченными Су-5 (15 мкг/мл), в течение 2 ч.

Регистрацию и расчет интенсивности флуоресцентного сигнала проводили с помощью программного обеспечения ImaGelAssay; при анализе полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых ячеек.

.■{' I И J- ■

4.1. Характеристики количественного иммуноанализа ПСА на биочипах

На микрочипах, содержащих иммобилизованные антитела против ПСАобш и ПСА^и* была проведена оценка воспроизводимости измерений и чувствительности метода.

Для оценки воспроизводимости в серии экспериментов на 100 микрочипах получили графики зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антигена в растворе (рис. 6). Рабочий диапазон концентраций для определения ПСАобщ составляет 0,3 - 60 нг/мл, для ПСАсв — ОД - 20 нг/мл. Коэффициент вариации (К.В.), значение которого определяли как отношение стандартного отклонения к средней величине флуоресцентного сигнала, выраженное в процентах, для различных концентраций определяемого антигена

находился в интервале 7-10 % для серии из 10 калибровочных кривых, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости анализа ПСА на микрочипах.

Рисунок б. Сэндвич-иммуноанализ ПСА на микрочипах. Зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против ПСАобщ (а) и ПСАсвоб (б), от концентрации ПСА в растворе. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. На вставках к рис. (а) и (б) приведены начальные участки соответствующих кривых. На осях ординат показаны значения интенсивности флуоресценции нулевой пробы, 1о> а также Ь плюс два стандартных отклонения (1о + 250).

Чувствительность анализа, т.е. наименьшую определяемую концентрацию ПСА, рассчитывали как концентрацию, соответствующую значению флуоресценции, превышающему не менее чем на два стандартных отклонения флуоресцентный сигнал многократно измеренной (более 10 раз) нулевой калибровочной пробы, не содержащей анализируемого соединения. Чувствительность определения для ПСАобщ составила 0,3 нг/мл, а для ПСАсв - ОД нг/мл (рис. Зв, Зг). Результаты по воспроизводимости и чувствительности полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

2.5. Внутренняя калибровочная кривая

Для определения концентрации двух форм ПСА в образце в одном анализе в состав микрочипа, помимо гелевых ячеек с иммобилизованными антителами, были введены ячейки, содержащие иммобилизованный антиген (ПСА) в различных концентрациях. Структура микрочипз с внутренней калибровочной кривой приведена па рис. 7.

АЬ-ПСАо6щ АЬ-ПСАсв внутренняя калибровочная кривая

# # i ■ ■ ■* i i & Щ: • т.

■Í: Ж i I '-<"' 'Ф Щ" Ж i

тЩ i íf % т

¡ # ч? ш т Ш

12 3456 7 89

Рисунок 7. Флуоресцентное изображение гелевых ячеек микрочипа для количественного определения двух форм ПСА после проведения иммуноаналнза." Структура микрочипа: иммобилизованные антитела к ПСАобщ, 200 мкг/мл геля (ряд 1), иммобилизованные антитела к ПСАсв, 200 мкг/мл геля (ряд 2), иммобилизованный ПСА в концентрации 0 (рад 3), 7 мкг/мл (ряд 4), 14 мкг/мл (ряд 5), 25 (ряд 6) мкг/мл, 55 мкг/мл (ряд 7), 80 мкг/мл (ряд 8), 160 мкг/мл (ряд 9) мкг/мл геля. '' ''

При проведении сэндвич-анализа иммобилизованный ПСА взаимодействует с проявляющими флуоресцентно-меченными антителами; при этом интенсивность флуоресцентных сигналов от соответствующих гелевых ячеек пропорциональна концентрации иммобилизованного ПСА (рис. 8).

0 50 100 150

[ПСА], мкг/мл

Рисунок 8. Внутренняя калибровочная кривая — зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек от концентрации иммобилизованного на микрочипе ПСА. Каждая точка кривой является средним из измерений на 50 микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений.

Полученную зависимость использовали в качестве индивидуального калибровочного графика на каждом микрочипе (внутренняя калибровочная кривая). Концентрации ПСА для иммобилизации выбирали таким образом, чтобы интенсивности флуоресцентных сигналов соответствовали диапазону флуоресцентных сигналов калибровочных кривых для ПСАобщ и ПСАсвоб, получаемых в растворе (рис. 6 и 8), Ряд 3 не содержит иммобилизованного антигена, и служит, в том числе, для контроля неспецифического связывания с гелем.

Для оценки воспроизводимости внутренней калибровочной кривой па 50 микрочипах после проведения сэндвич-иммуноанализа, получили зависимость флуоресцентного сигнала от концентрации иммобилизованного в ячейках ПСА. Концентрацию ПСА в растворе варьировали от 0 до 60 нг/мл при постоянной концентрации проявляющих антител. Величина флуоресцентного сигнала от ячеек с иммобилизованным антигеном не зависела от концентрации антигена в растворе, коэффициент вариации для всех концешраций иммобилизованного антигена не превышал 10% (рис. 8).

43. Определение значений «эффективных» концентраций для внутренней калибровочной кривой

Для проведения количественного анализа на микрочипе с внутренней калибровочной кривой необходимо было соотнести флуоресцентные сигналы от ячеек, содержащих иммобилизованный антиген с сигналами, получаемыми от гелевых элементов с иммобилизованными антителами. Для этого флуоресцентные сигналы, полученные от ячеек с иммобилизованным антигеном, сравнивали с сигналами калибровочных кривых для ПСА в растворе (см. рис. б и 8), и каждой из ячеек с иммобилизованным антигеном присваивали значение «эффективной» концентрации, соответствующей данному сигналу, полученному от антигена в растворе. Было показано, что1 отнесение сигналов и определение «эффективных» концентраций можно производить один раз для большой (100 и более) партии микро чипов, и далее данные «эффективные» концентрации использовать при проведении анализа на каждом микрочипе этой партии.

4.4. Получение результатов иммуноанализа

Определение концентрации ПСАобщ в образце с использованием внутренней калибровочной кривой показано на рис. 9. После измерений интенсивности флуоресцентных сигналов гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАобщ (ряд 1 на рис. 9 ) и элементов внутренней калибровочной кривой (ряды 3-9 на рис. 7), строили зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации ПСА с 18

использованием предварительно полученных «эффективных» концентраций для ПСАоби по которой рассчитывали концентрацию ПСЛ^щ в образце (пунктирпая линия на рис. 9 ).

б-*

[ПС Ав«ш13 3 ТМ Г( МЛ

Рисунок 9. Получение результатов анализа ПСАо^щ с помощью внутренней калибровочной кривой на микрочипе. На диаграмме показаны флуоресцентные сигналы от гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСА^щ (ряд 1), сигналы внутренней калибровочной кривой (ряды 3-9) и «эффективные» концентрации, рассчитанные для ПСАобщ. В данном образце [ПСАобш] = 37 нг/мл.

Определение концентрации ПСА« проводили аналогичным образом по интенсивности флуоресценции гелевых элементов с иммобилизованными антителами против

ПСАсвоб

(ряд 2 на рис. 7) и «эффективным» концентрациям, рассчитанным для ПСА«об.

Для обработки результатов иммуноанализа на микрочипах была специально разработанна программа «1шаОе1Аззау» (ИМБ РАН). Программа регистрирует флуоресцентные сигналы от гелевых ячеек биочипа, строит калибровочные кривые но «эффективным» концентрациям и сигналам, полученным от ячеек с иммобилизованным антигеном. Затем по сигналам от ячеек с иммобилизованными антителами программа автоматически определяет концентрации двух форм ПСА и их соотношение в исследуемом образце.

4.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови

С использованием микрочинов с внутренней калибровочной кривой и программы «1таОе1Азэау» проведено определение концентраций двух форм ПСА в сыворотках крог:: доноров я больных раком предстательной железы. В качестве референсых зяачета:Й использовали концентрации двух форм ПСА, определенные методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы Сахъ^ (Швеция). Результаты измерений 17 сывороток в двух системах приведены на рис. 10а,б.

ПСАоещ, нг/мл (ИФА) ПСАп^ ш/мл (ИФА)

Рисунок 10. Сравнение результатов анализа общей (а) и свободной (б) форм ПСА ы микрочинах, содержащих внутреннюю калибровочную кривую, с результатами ИФА, полученными при использовании набора фирмы СъпА%, (Швеция).

Как видно из рисунка, полученные данные хорошо коррелируют между собой: коэффициент корреляций составил г - 0.988 для общей формы ПСА и г = 0.987 для свободной формы ПСА.

5. Стабильность мпкрочнпов с иммобилизованными антителами и ПСА

Иммобилизация в геле способствует стабилизации белков. В особенности это важно для ПСА, который является ферментом и, как известно, плохо хранится в растворе. Микрочипы с иммобилизованными антителами и ПСА хранили при +2 — 8°С. В данной работе были получены калибровочные кривые от антигена в растворе и внутренние калибровочные кривые на свежеизготовленных микрочипах и микрочипах, после хранения в течение года. Флуоресцентные сигналы в обоих случаях находились в

пределах допустимых значений разброса (К.В. < 10%). Минимально определяемая концентрация антигена не менялась в зависимости от хранения микрочипов.

[ПСА], мкг/мл [ПСА], нг/мл

Рисунок 11. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА. (а) Внутренняя калибровочная кривая. Флуоресцентные сигналы гелевых ячеек получены на биочипах непосредственно после изготовления (1) и после хранения биочипов в течение 6 месяцев при 2-8°С (2). (б) Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа общей формы ПСА, полученные на контрольных микрочипах (хранение в течение суток) (1) и после хранения в течение б месяцев при 2-8 °С (2).

Подобранный нами состав гелеобразующих мономеров, в который входят производные аминосахаров, препятствует дегидратации сформированных гелевых элементов при хранении микрочипов, что также способствует сохранению исходных свойств иммобилизованных белков.

выводы

1. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипов с максимальным сохранением исходной активности белков.

2. Разработан биологический микрочип для количественного анализа общей и свободной форм простата-специфического антигена. Подобраны условия для проведения одновременного иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе.

3. Показана возможность проведения количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела и внутреннюю калибровочную кривую, иммобилизованный антиген. Разработанный метод позволяет значительно упростить процедуру анализа, проводя его в формате один микрочип - один анализ.

4. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода: проведена оценка воспроизводимости и чувствительности иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе. Результаты полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

5. Показано, что результаты измерений содержания в сыворотках крови ПСАобщ и ПСАсв на биочипах коррелируют с результатами, полученными в стандартных тест-системах.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, A.A. Stomakhin, E.L. Darii, S.V. Pan'kov, V.E. Barsky, S.M. Ivanov, E.V. Konovalova, and A.D. Mirzabekov. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. //Biotechniques 34: 1008-1022 (May 2003)

2. E.B. Коновалова, А.Ю. Рубина. Разработка метода иммуноферментного анализа на гелевых микрочипах. Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI ( зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 9-12 февраля 2004г. С. 86-87.

3. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, E.H. Саввзтеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.КХ Барышников, A.C. Заседателев. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови. //Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 1, Т. 5, С. 49-57.

4. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, E.H. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, АЛО. Барышников, A.C. Заседателев. "Разработка диагностической тест-системы на основе биочипа на простатический специфический антиген (общую и свободную формы)". Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 1, Т. 5, С. 10.

Коновалова Елизавета Владимировна

Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гвдрогелевых микрочипах

Подписано • печать 19.10.06. Формат 60*84 '/и. Печать офсетная. Уел.печл.1,0. Уч -кздл.1,0 Тираж 60 жэ. Зеки № ф-

Государствекжк оС^взомтелшое учреждение икшего профессионильного обрюоаяння Московский фюико-технмческнй институт (государственный уитерсктсг) Отдел автоматизированных издательских систем "ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ* МПОО.Моек.обл., г.ДопгИФудныЯ, Институтский пер.,9

Г2' 9?

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Коновалова, Елизавета Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-генетические онкомаркеры и методы их определения.

1. 2. Иммунохимические опухолевые маркеры и методы их определения.

1. 3. Простата - специфический антиген.

1. 4. Белковые микрочипы.

1. 4.1 Двумерные белковые микрочипы для анализа онкомаркеров.

1. 4.2 Белковые микрочипы на основе гидрогелей.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Белковые микрочипы.

2. 1.2. Регистрация сигналов с гелевых ячеек микрочипа.

2. 1.3. Подбор условий иммобилизации белков.

2.1.4 Выбор состава геля на примере прямого анализа ПСА.

2.1.5. Сравнение двумерных и трехмерных микрочииов.

2.1.6. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональпыми антителами.

2.2. Белковый гидрогелевый микрочип для количественного анализа двух форм ПСА.

2.2.1. Характеристики количественного иммуноанализа ПСА на биочипах.

2.2.2. Внутренняя калибровочная кривая.

2.2.3. Определение значений «эффективных» концентраций для внутренней калибровочной кривой.

2.2.4. Получение результатов иммуноанализа.

2.2.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови.

2.2.6. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Приборы и реактивы.

3.2. Изготовление белковых микрочипов.

3.3. Окрашивание белков флуоресцентным красителем Су5.

3.4. Флуоресцентные и хемшпоминесцентные измерения.

3.5. Определение степени иммобилизации белков в геле.

3.6. Определение ферментативной активности белков в растворе.

3.7. Регистрация ферментативной активности белков на микрочипе.

3.8. Определение процента сохранения ферментативной активности пероксидазы после иммобилизации на чипе.

3.9. Прямой анализ пероксидазы на микрочипе с иммобилизованными антителами.

3.9.1 Сэндвич-иммуноанализ ПСА.

3.9.2. Кинетические измерения на микрочипах.

3.10. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами.

3.11. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) на 96-луночном планшете.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах"

Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечении рака, поскольку именно этот фактор именно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение.

Простатический специфический антиген (ПСА) относится к наиболее эффективным маркерам рака предстательной железы, получившим широкое внедрение в клиническую практику в целях диагностики и мониторинга РПЖ. Однако использование ПСА в ранней диагностике и скрининге РПЖ ограничено в связи с его низкой специфичностью, обусловленной повышением концентрации маркера у больных с незлокачественными заболеваниями ПЖ, а также у здоровых мужчин пожилого возраста. Остро стоящая перед клиницистами проблема дифференциальной диагностики РПЖ и доброкачественных заболеваний ПЖ требует повышения специфичности ПСА как опухолевого маркера. Использование для диагностики двух форм ПСА (общей и свободной) позволяет ближе подойти к решению этой проблемы: использование соотношения свободного и общего ПСА способствует значительному увеличению специфичности ПСА как опухолевого маркера в дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных заболеваний ПЖ.

Эта проблема решается при помощи метода, представленного в данной диссертационной работе, позволяющего одновременное количественное определение общей и свободной форм ПСА с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Коновалова, Елизавета Владимировна

выводы

2. Разработан биологический микрочип для количественного анализа общей и свободной формы простата-специфического антигена. Подобраны условия для проведения одновременного иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю Рубиной Алле Юрьевне за доброжелательное руководство, всестороннюю помощь и внимание к работе. Я искренне признательна Екатерине Игоревне Дементьевой и Марии Вадимовне Цыбульской за ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Елене Савватеевой, Марине Филлиповой и Сергею Иванову за помощь в работе и дружеское участие. Также выражаю признательность Татьяне Владимировне Осиповой и Татьяне Павловне Рябых за сотрудничество; Сергею Панькову, Кириллу Евсееву, Валентине Владимировне Чупеевой и Эдуарду Яковлевичу Крейндлину за подготовку микрочипов для проведения экспериментов; Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Коновалова, Елизавета Владимировна, Москва

1. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. //Биохимия.- 2000.- вып. 1.- С.127-138.

2. Карпищенко А.И., Антонов В.Г., Бутенко А.Б., Белохвостое А.С. и др. Онкомаркеры и их диагностическое значение. //Изд. Военно-медицинской академии. Санкт-Петербург: -1999.-48 С.

3. Белохвостов А.С., Новик А.А. Роль молекулярно-генетических маркеров в диагностике солидных опухолей. //Вопр. онкологии-1999.-Т.45, №6, С.599-606.

4. Chen X.Q. et al., Microsatellite alterations in plasma DNA of small sell lung cancer patiens.//Nat.med. 1996 2, 10033-1035.

5. Nawroz H. et al., Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients.//Nat.Med. 1996 2, 1035-1037.

6. Horwich A. and Ross G. Circulating tumor markers// Principles of Molecular Oncology, Eds Brouchud M.H. et al. Humans Press, Totowa, New Jersey 2000, 111-124 pp.

7. Kawasaki E.S.,Clark S.S., Coyne M.Y. et al. Diagnosis of chronic myeloid andacute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988.- Vol.85.- P.5698-5702.

8. Sell S. Cancer markers of the 1990s. Comparison of the new generation of markers defined by monoclonal antibodies and oncogene probes to prototypic markers. //Clin. Lab. Med.- 1990.-Vol.10, № 1.- P. 1-37.

9. Anker Ph., Lefort F., Vasioukhin V., Lyatey J., Lederrey C., Chen X.Q., StrounM. Mulcahy M.E. K-ras mutations are found in DNA extracted from the plasma of patients with colorectal cancer. //Gasrtoenterology. 1997.-Vol.112,-P.l114-1120

10. Ward R., Hawkins N., O'Grady R. et al. Restriction endonuclease-mediated selective polymerase chain reaction. A novel assay for the detection of K-ras mutations in clinical samples. //Am. J. Pathol.-1998.-Vol.153, N 2.-P.373-379

11. Wong IH, Lo YM, Zhang J, Liew CT, Ng MH, Wong N, Lai PB, Lau WY, Hjelm NM, Johnson PJ. Detection of aberrant pi 6 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients.//Cancer Res 1999 Jan l;59(l):71-3

12. Ligget W.H., Sidranski D. Role of the pi6 tumor suppressor gene in cancer.

13. J. Clin. Oncol. -1998.- N3.-P.1197-1206.

14. Raj С. V., Moreno J.G., Gomella L.G. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors.//Cancer.- 1998.-V.82. P.1419-1442.

15. Dong JT. Prevalent mutations in prostate cancer. //J Cell Biochem. 2006 Feb 15;97(3):433-47.

16. Schostak M, Krause H, Miller K, Schrader M, Weikert S, Christoph F, Kempkensteffen C, Kollermann J. Quantitative real-time RT-PCR of CD24 mRNA in the detection of prostate cancer. //BMC Urol. 2006 Mar 15;6:7.

17. Огнерубов H.A Маркеры злокачественных опухолей издательствою // «Инфа» Воронеж. 1996

18. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7.

19. А.М.Егоров, А.П.Осипов, Б.Б.Дзантиев, Е.М.Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. //М.: Высш.шк., 1991.

20. Aybay С. Development of an enzyme-linked immunoassay for sensitive detection of native and recombinant human interferon-gamma using whole IgG fraction as polyclonal tracer. //J Immunoassay Immunochem. 2004;25(4):321-34.

21. Arai K, Kanikawa S, Isomura M, Takemori Y, Kanda Y, Ishii M. Enzyme immunoassay of CEA using monoclonal antibody. //Gan To Kagaku Ryoho.1982 Dec;9(12):2161-7

22. Carvalho, A., Sanz, L., Barettino, D., Romero, A., Calvete, J., Romao, M. Crystal Structure of a Prostate Kallikrein Isolated from Stallion Seminal Plasma: A Homologue of Human Psa. //J.Mol.Biol. 2002. v322 pp.325.

23. A.C. Белохвостое, А.Г. Румянцев. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические, иммунохимические, биохимические анализы. //2-ое издание. Москва 2003.

24. Polascik TJ, Oesterling JE, Partin AW. Prostate specific antigen: a decade of discovery-what we have learned and where we are going. //J Urol. 1999 Aug; 162(2):293-306. Review

25. Young F., Li X, Ellet J., et al. Regions of prostate specific antigen (PSA) promoter confer androgen -independent expression of PSA in prostate cancer cell. //J Biol Chem 2000 Dec 29; 275(52): 40486-55.

26. Sadar M.D. Androgen-independent induction of prostate-specific antigengene expression viacross-talk between the androgen receptor and protein kinase a signal transduction pathways. //J Biol Chem -1999-Mar 19;-274 (12): 7777-83.

27. Zhu W., Young C.Y. Androgen-dependent transcriptional regulation of the prostate specific antigen by thyroid hormons 3,5,3-1-triiodthyrosinine. //J Androl 2001, Jan-Feb; 22(1): 136-41

28. Sadar M.D., Hussain M., Bruchowsky W. Prostate cancer: molecular bioliogy of early progression to androgen independence. //Endocr Relat Cancer. 1, 1999-Dec; 6(4):487-502

29. Xue W., Irvine R.A.,Yu M.C. et al. Susceptibility to prostate cancer: interaction between genotypes al the androgen receptor and prostate specificantigen loci. //Cancer Res 2000 Feb 15; 60(4):839-41.

30. Ablin RJ, Soanes WA, Bronson P, Witebsky E. Precipitating antigens of the normal human prostate. //J Reprod Fertil. 1970 Aug;22(3):573-4.

31. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. Purification of a human prostate specific antigen. //Invest Urol. 1979 Sep; 17(2): 159-63.

32. Papsidero LD, Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. A prostate antigen in sera of prostatic cancer patients. //Cancer Res. 1980 Jul;40(7):2428-32.

33. Pollen JJ, Dreilinger A. Immunohistochemical identification of prostatic acid phosphatase and prostate specific antigen in female periurethral glands. //Urology. 1984 Mar;23(3):303-4.

34. Lilja H, Christensson A, Dahlen U, Matikainen MT, Nilsson 0, Pettersson K, Lovgren T. Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin. //Clin Chem. 1991 Sep;37(9): 1618-25.

35. McCormack RT, Rittenhouse HG, Finlay JA, Sokoloff RL, Wang TJ, Wolfert RL, Lilja H, Oesterling JE. Molecular forms of prostate-specific antigen and the human kallikrein gene family: a new era. //Urology. 1995 May;45(5):729-44.

36. Lilja H. Structure, function, and regulation of the enzyme activity of prostate-specific antigen. //World J Urol. 1993; 11 (4): 188-91. Review.

37. Wang TJ, Hill TM, Sokoloff RL, Frankenne F, Rittenhouse HG, Wolfert RL. Dual monoclonal antibody immunoassay for free prostate-specific antigen. //Prostate. 1996 Jan;28(l):10-6.

38. Vessella RL, Lange PH. Issues in the assessment of prostate-specific antigen immunoassays. An update. //Urol Clin North Am. 1997 May;24(2):261-8.

39. Кушлинский H.E., Любимова H.B., Гориловский JI.M. ПСА при раке и доброкачественной гиперплазии предстательной железы. //Бюл.эксперим.биологии и медицины, 1997.-х. 124-№ 9-С. 327-330.

40. Carter НВ, Epstein JI, Chan DW, Fozard JL, Pearson JD. Recommended prostate-specific antigen testing intervals for the detection of curable prostate cancer.//JAMA. 1997 May 14;277(18):1456-60.

41. Pound CR, Partin AW, Epstein JI, Walsh PC. Prostate-specific antigen after anatomic radical retropubic prostatectomy. Patterns of recurrence and cancer control. //Urol Clin North Am. 1997 May;24(2):395-406.

42. Carter HB, Partin AW, Luderer AA, Metter EJ, Landis P, Chan DW, Fozard JL, Pearson JD. Percentage of free prostate-specific antigen in sera predicts aggressiveness of prostate cancer a decade before diagnosis. //Urology. 1997 Mar;49(3):379-84.

43. Pearson JD, Landis P, Fozard JL and Carter HB. When is PSA testing no longer necessary?//J.Urol., part 2, 159: 178A, abstract 681, 1998.

44. Oesterling JE, Jacobsen SJ, Chute CG, Guess HA, Girman CJ, Panser LA, Lieber MM. Serum prostate-specific antigen in a community-based population of healthy men. Establishment of age-specific reference ranges. //JAMA. 1993 Aug 18;270(7):860-4.

45. Alison Abbot. Betting on tomorrow's chips. //Nature Vol 415 lOjanuary 2002 112-114.

46. Robert F.Service. Searching for Recipes for protein chips. //Science 294, (2001)2080-2082

47. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions. //Genom Biology 2001,2(2) research 0004.1-0004.13.

48. Philipp Angenendt, Jorn Glokler, Derek Murphy, Hans Lehrach, and Dolores J. Cahill. Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials. //Analytical Biochemistry 309(2002) 253-260.

49. Nuzzo R.G., Allura D.L. //Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surface. //J. Amer. Chem. Soc. 1983, 105: 4481-4483.

50. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. //Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

51. Hengsakul M., Cass A.E.G. Protein patterning whis a photoactivatable derivative of biotin. //Bioconjugate Chem 1996, 7: 249-254.

52. Pirrung M.C., Huang, C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. //Bioconjug Chem. 1996 May-Jun;7(3):317-21.

53. Sean P.Lai, Richard I.Cristopherson and Sristobal G.dos Remedios. Antibody arrays: an embryonic but rapidly growing technology. //Drug Discovery Today Vol.7, No. 18 (Suppl.), 2002 143-149.

54. MacBeath G., Schreiber S. Priniting proteins as microarrays for high -throughput function determination. //Science. 2000 289, 1760-1763.

55. Sreekumar A., Nyati M., Varambally S., Barrette Т., Ghosh D., Lawrence Т., Chinnaiyan A. Profiling of Cancer Cells Using Protein Microarrays: Discovery of Novel Radiation-regulated Proteins. //Cancer. Res. 2001. 61, 7585-7593.

56. Schweitzer В., Roberts S., Grimwade В., Shao W., Wang W. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. //Nat. Biotechnol. 2002.20,359-365.

57. Zhu H, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M. Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips. //Science. 2001.293,2101-2105.

58. Houseman В., Huh J., Kron S., Mrksich M. Peptide chips for the quantitative evaluation of protein kinase activity. //Nature Biotechnol. 2002. 20, 270-274.

59. Paweletz C., Charboneau L., Bichsel V., Simone N., Chen Т., Gillespie J., Emmert-Buck M., Poli M.A., Rivera V.R., Hevetson J.F., Merril G.A. Detection of ricin by colorimetric and chemiluminescence ELISA. //Toxicon. 1994. 32, 1371-1377

60. Knezevic V., Leethanakul C., Bichsel V., Worth J., Prabhu V., Gutkind J., Liotta L., Munson P., Petricoin E. Proteomic profiling of the cancer microenvironment by antibody arrays //Proteomics. 2001. 1, 1271-1278

61. Thomas Kodadek. Protein microarrays: prospects and problems. //Chemistry & Biology 8 (2001) 105-115.

62. Emili AQ, Cagney G. Large-scale functional analysis using peptide or protein arrays. //Nat Biotechnol. 2000 Apr;18(4):393-7

63. Pavel Arenkov, Alexander Kukhtin, Anne Gemmel, Sergey Voloshchuk, Valentina Chupeeva and Andrei Mirzabekov. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions. //Analytical Biochemistry 278 (2000) 123131.

64. Ekins RP. Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays. //Clin Chem. 1998 Sep;44(9):2015-30.

65. Sobek J, Bartscherer K, Jacob A, Hoheisel JD, Angenendt P. Microarray technology as a universal tool for high-throughput analysis of biological systems. //Comb Chem High Throughput Screen. 2006 Jun;9(5):365-80.

66. Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. //Microbiol Rev. 1995 Mar;59(l):94-123.

67. Silzel JW, Cercek B, Dodson C, Tsay T, Obremski RJ. Mass-sensing, multianalyte microarray immunoassay with imaging detection. //Clin Chem. 1998 Sep;44(9):2036-43.

68. Peter Mitchell. A perspective on protein microarrays. //Nature Biotechnology Vol.20 march 2002 225-229

69. Carl A.K. Borrebaeck. Antibodies in diagnostics from immunoassays to protein chips. //Immunology today. Vol.21 No.8 (2000) 379-382

70. Cahill, D. Protein and antibody arrays and their medical applications. //J. Immunol. Methods (2001) 250, 81-91

71. Haab, В. B. Methods and applications of antibody microarrays in cancer research. //Proteomics (2003) 3, 2116-2122

72. Sreekumar, A., and Chinnaiyan, A. M. Using protein microarrays to study cancer. //BioTechniques suppl., (2002) 46-53

73. Nielsen, U. В., and Geierstanger, В. H. Multiplexed sandwich assays in microarray format. //J. Immunol. Methods (2004) 290, 107-120

74. Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. //Anticancer Res. 2004 Mar-Apr;24(2C):l 159-65.

75. Petrilc J. Diagnostic applications of microarrays. //Transfus Med. 2006 Aug;16(4):233-47

76. Zhang S. Hydrogels: Wet or let die. //Nat Mater. 2004 Jan;3(l):7-8.

77. Kiyonaka S, Sada K, Yoshimura I, Shinkai S, Kato N, Hamachi I. Semi-wet peptide/protein array using supramolecular hydrogel. //Nat Mater. 2004 Jan;3(l):58-64. Epub 2003 Dec 7.

78. Mezzasoma L, Bacarese-Hamilton T, Di Cristina M, Rossi R, Bistoni F, Crisanti A. Antigen microarrays for serodiagnosis of infectious diseases. //Clin Chem. 2002 Jan;48(l):121-30.

79. Bacarese-Hamilton T, Mezzasoma L, Ingham C, Ardizzoni A, Rossi R, Bistoni F, Crisanti A. Detection of allergen-specific IgE on microarrays by use of signal amplification techniques. //Clin Chem. 2002 Aug;48(8): 1367-70.

80. Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmell, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P. & Mirzabekov, A. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA and protein microchips. //Anal. Biochem. (1997) 250, 203-211.

81. Mirzabekov, A.D., A.Yu. Rubina, S.V. Pan'kov, A.N. Perov, and V.V.

82. Chupeeva, Enhelhart Institute of Molecular Biology of RAS, Moscow, Russia.

83. Composition for polymerization immobilization of biological macromolecules in hydrogels on forming of biochips, method for preparation of the composition, biochip and method for carrying out PCR on a biochip. //PCT/RU 01/00445, priority of 25.07.2001.

84. V.A. Vasiliskov, E.N. Timofeev, S.A. Surzhikov, A.L. Drobyshev, V.V. Shick, and A.D. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gel-ommobilized compounds on a chip by co-polymerization. //BioTechniques 1999 27:592-606.

85. Timofeev, E. & Mirzabekov, A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4,096-hexanucleotide microarray. //Nucl. Acids Res. (2000) 29 (12) 2626-2634

86. Dubiley, S., Kirillov, Eu., & Mirzabekov, A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. //Nucleic Acids Res. 1999 Sep 15;27(18):el9.

87. Zasedateleva O., Krylov A., Prokopenko D., Skabkin M., Ovchinnikov L.,

88. Kolchinsky A., Mirzabekov A. Specificity of mammalian Y-box binding proteinp50 in interaction with ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip. //J. Mol. Biol. (2002) 324 73-87.

89. Nasedkina, Т.; Domer, P.; Zharinov, V.; Hoberg, J.; Lysov, Yu.; Mirzabekov, A. Identification of chromosomal translocation in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. //Haematologica (2002) 87 (4) 363-372

90. АЛО. Рубина, C.B. Паньков, C.M. Иванов, Е.И. Дементьева, академик АД. Мирзабеков. Белковые микрочипы. //Доклады Академии Наук, 2001, том 381, №56 с.701-704

91. Stomakhin, V.Vasiliskov, Е. Timofeev, D.Schulga, R. Cotter, & A.

92. Mirzabekov. DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotidemicrochips: MALDI mass spectrometry identiofication of 5-mers contiguouslystacked to microchip oligonucleotides. //Nucl. Acids Res. 28 (5) (2000) 1193-1198

93. Gryadunov D., Mikhailovich V., Noskov A., Lapa S., Sobolev A., Pan'kov S., Rubina A., Zasedatelev A., & Mirzabekov A. Detection of Bacillus anthracis using multiplex PCR on the oligonucleotide biochip, //Dokl. Biochem. Biophys. (2001) 381 384-386

94. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JI. и др. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров. //ДАН. 2004. 395, 542-547.

95. Rubina A.Yu., Dyukova V.I., Dementieva E.I. et al. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips. //Anal. Biochem. 2005.340,317-329.

96. И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов и др. Иммобилизованные ферменты. //М.:Высш.шк. 1987 с.58-67

97. Zubtsov DA, Ivanov SM, Rubina AY, Dementieva EI, Chechetkin VR, Zasedatelev AS. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. //J Biotechnol. 2006 Mar 9; 122(1): 16-27. Epub 2005 Sep 22

98. Barsky V., Perov A., Tokalov A., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A Fluorescence data analysis on gel-based biochips. //J. Biomol. Screen. 2002. 7, 247-257

Информация о работе

Коновалова, Елизавета Владимировна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы