Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе

Зубцова, Жанна Исхаковна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе"

00461 ¿«Л

ЗУБЦОВА Жанна Исхаковна

АНАЛИЗ ДЕВЯТИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ОНКОМАРКЕРОВ НА ГИДРОГЕЛЕВОМ БИОЧИПЕ

03.01.03 - Молекулярная биология 03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2010

1 8 НОЯ 2010

004613453

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардга РАН и на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ)

Научный руководитель: кандидат химических наук

А. Ю. Рубина

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Г.Т.Гурия,

доктор физико-математических наук Ю. П. Лысов

Ведущая организация:

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

со

Защита диссертации состоится 2010 г. в часов на заседании Диссерта-

ционного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардга РАН по адресу 119991 г. Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардга РАН

Автореферат разослан _ .3 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного со] кандидат химических наук

Пушцнн

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФП - апьфа-фетопротсин

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДПР - доля достоверно положительных результатов

ДОР - доля достоверно отрицательных результатов

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИФА- иммуноферментный анализ

НСЕ- нейрон-специфическая енолаза

ПСА - простат-специфический антиген

ПСАсвоб - свободная форма простат-специфического антигена

ПСАобщ - общая форма простат-специфического антигена

РЭА- раково-эмбриональный антиген

СА 125 - опухоле-ассоциированный антиген 125

СА 15-3 - опухоле-ассоциированный антиген 15-3

СА 19-9 - опухоле-ассоциированный антиген 19-9

СуЗ - флуоресцентный краситель цианиновый третий

Су5 - флуоресцентный краситель цианиновый пятый

ХГЧ-хорионический гонадотропин человека

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Биологические микрочипы (биочипы), представляющие собой массивы ячеек, содержащих иммобилизованные биологические зонды (ДНК, РНК, олигонуклеотиды, белки, пептиды, олигосахариды, клетки и т.д.), были созданы для проведения шюгопараметрического анализа образцов. Иммобилизация зондов производится либо непосредственно на поверхности носителя, такого как стекло, пластик, металл, и др., либо в объеме трехмерных гелевых ячеек, закрепленных на подложке. В ИМБ РАН разработана одна из технологий изготовления трехмерных гидрогелевых микрочипов.

Одним из перспективных направлений исследований является разработка на основе технологии трехмерных гидрогелевых микрочипов метода одновременного количественного определения в сыворотке крови человека различных биологических параметров, например, таких, как уровень маркеров онкологических заболеваний (онкомаркеров). Онкомаркеры используются в клинической практике для подтверждения диагноза и мониторинга проводимой терапии. Одновременное определение нескольких онкомаркеров увеличивает возможности дифференциальной диагностики заболеваний. Выявление повышенной концентрации только одного онкомаркера не является доказательством для постановки диагноза онкопато-

логии, поскольку может быть связано с наличием у обследуемого человека воспалительного процесса. Анализируя только один онкомаркер у обследуемого пациента, можно пропустить повышение концентрации какого-либо из онкомаркеров, выявление которого может поменять сам диагноз. Для определения локализации опухоли также важно знать не только значения концентраций отдельных маркеров, но и их соотношения.

Для оценки диагностических возможностей разработанной тест-системы была определена достоверность определения концентраций девяти онкомаркеров в сыворотках крови пациентов и здоровых доноров в сравнении с общепризнанными и широко используемыми в клинической практике иммунохимическими тест-системами и проведено сравнение получаемых данных.

Для проведения клинической диагностики важно определять концентрации онкомаркеров с высокой чувствительностью. Нами была исследована возможность улучшения аналитических характеристик разработанного прототипа тест-системы за счет использования подложек для биочипов с зеркальным металлическим покрытием.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью диссертационной работы является разработка прототипа тест-системы для одновременного количественного анализа девяти маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека на гидрогелевом биочипе, и оптимизация метода с использованием подложек с зеркальным металлическим напылением.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создать биологический микрочип, содержащий массив гелевых элементов с иммобилизованными антителами против девяти онкомаркеров.

2. Разработать протокол проведения одновременного количественного иммуноанапиза девяти онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе.

3. Определить аналитические характеристики разработанного прототипа тест-системы.

4. Провести сравнение результатов одновременного определения девяти онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с применением традиционно используемых иммуноферментных тсст-систем.

5. Провести статистическую обработку полученных результатов одновременного количественного иммуноанализа онкомаркеров в сыворотках крови онкологических больных и доноров.

6. Изучить возможности оптимизации иммуноанализа онкомаркеров на биочипе при применении зеркальных подложек:

6.1. Исследовать физические факторы, влияющие на эффект усиления флуоресценции на гидрогелевых биочипах, изготовленных на подложках с зеркальным металлическим покрытием.

6.2. Оцепить чувствительность одновременного количественного иммуноанализа онкомаркеров на биочипе при использовании подложек с зеркальным покрытием.

6.3. Оценить возможность сокращения времени иммуноанализа при использовании подложек с металлизированной поверхностью.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

В рамках данной работы был впервые разработан прототип тест-системы для одновременного количественного анализа девяти маркеров онкологических заболеваний, часто применяемых в диагностике онкологических заболеваний. Был создан биочип, являющийся основной частью тест-системы и содержащий иммобилизованные антитела против девяти анализируемых онкомаркеров: альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионалыюго антигена (РЭА), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), опухоле-ассоциированного антигена 15-3 (СА 15-3), 125 (СА 125), 19-9 (СА 19-9), общей и свободной форм просгат-специфического антигена (ПСАобщ и ПСАсвоб), нейрон-специфической енолазы (НСЕ), и разработан протокол проведения одновременного количественного иммуноанализа девяти онкомаркеров.

В данной работе было впервые проведено исследование эффекта усиления флуоресцентного сигнала для трехмерных гидрогелевых микрочипов, нанесенных на подложку с зеркальным металлическим покрытием, и продемонстрирована возможность увеличения чувствительности иммунофлуоресцентного анализа. Были выявлены факторы, влияющие на данный эффект, и показало, что в отличие от микрочипов с иммобилизованными непосредст-

векно на металлизированной поверхности зондами, для которых усиление флуоресценции обусловлено, в основном, плазмонным механизмом , эффект усиления сигнала флуоресценции на гелевых микрочипах можно объяснить, не выходя за рамки геометрической оптики.

Разработанный метод анализа онкомаркеров был протестирован на 500 сыворотках крови больных и здоровых доноров. Была проведена статистическая обработка полученных данных и показано, что результаты одновременного определения концентраций девяти онкомаркеров в сыворотке крови человека на биочипе коррелируют с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с использованием стандартных коммерческих иммуноферментных тест-систем, с доказанной диагностической достоверностью определения.

Исходя из полученных результатов анализа сывороток пациентов с установленными другими методами диагнозами на биочипе, были определены диагностическая специфичность и чувствительность разработанного метода, а также были определены прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов. Разработанный прототип тест-системы может быть использован для проведения первичной диагностики заболеваний (скрининга) и мониторинга хода лечения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы докладывались на 51-й Научной конференции МФТИ (27-30 ноября, 2008, Москва), были представлены на Итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 годы в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (8-10 декабря, 2008, Москва, 25-27 ноября, 2009, Москва), на 2-ой Окружной научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (4 февраля, 2010, Зеленоград), на 9-ой Международной научно-практической конференции "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности" (22-23 апреля, 2010, Санкт-Петербург).

ПУБЛИКАЦИИ.

По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАКа, одна заявка на получение патента и 6 тезисов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, трех глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на

Joseph R. Lakowicz, «Radiative decay engineering 5: metal-enhanced fluorescence and plasmon emission», Analytical Biochemistry 337 (2005) 171-194

(Ц страницах машинописного текста, содержит 2-] рисунков и таблиц. Библиография включает наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Биологические микрочипы (биочипы)

Биочипы - массивы ячеек, содержащих различные молекулярные зонды - в отличие от общепризнанных методов позволяют проводить многопараметрический анализ образцов. В данной работе были использованы трехмерные гидрогелевые биочипы, изготовленные по технологии, разработанной в Институте молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН под руководством академика А. Д. Мирзабекова*. В основе технологии изготовления гидро-гелевых биочипов лежит метод фотоиндуцирусмой сополимеризации. Технология универсальна и позволяет изготавливать биочнны, содержащие различные по своей природе иммобилизованные зонды: ДНК, РНК, белки, сахариды и пр. После завершения процесса полимеризации каждый иммобилизованный молекулярный зонд ковалентно закреплен в полимерной сетке геля и равномерно распределен в объеме гелевой ячейки биочипа. Число гелевых ячеек и их расположение на подложке может варьировать и зависеть от задач и условий планируемого эксперимента.

В данном исследовании были разработаны микрочипы с иммобилизованными белками, для которых нами был подобран такой состав полимеризационной смеси, который обеспечивает достаточную для диффузии исследуемых белков пористость геля и позволяет проводить иммунологические реакции с образованием различных комплексов на микрочипе. В процессе изготовле1ия биочипа после завершения полимеризации и отмывки избытка гелеобра-зующих мономеров осуществлялась обработка биочипа блокировочным раствором, уменьшающим неспецифическое связывание, в результате чего биочип оказывался полностью подготовленным к проведению анализа.

2. Биочип для одновременного количественного анализа девяти оикомаркеров

В качестве объектов были выбраны следующие серологические маркеры: АФП, РЭА, ХГЧ, СА 15-3, СА 125, СА 19-9, ПСАобщ, ПСАсвоб, НСЕ (Таблица 1). Для проведения «сэндвич»-анализа для каждого маркера была выбрана такая пара моноклональных антител, которая не обладает перекрестным взаимодействием с другими антителами, используемыми в анализе, не взаимодействует с другими определяемыми онкомаркерами, обладают максимальным отношением величины каждого значимого сигнала к нулевому, а также дают наиболее выраженный рост на участке калибровочной кривой. На основании выбранных пар моноклональных антител были сконструирован биочип и создана проявляющая система

* Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков C.B. (2003) Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция дм его осуществления. Патент РФ N 2216547. Бюл. изобр. № 32

флуоресцентно окрашенных антител для количественного иммуноанализа девяти маркеров онкологических заболеваний. Структура биочипа приведена на рисунке 1. Таблица 1. Онкомаркеры, анализируемые на гидрогелевых биочипах.

Онкомаркер, принятое сокращение Концентрация в крови в норме Повышается при:

Альфа-фетопротеин (АФП) < ¡0 нг/мл (у мужчин и небеременных женщин) Гепатокарцинома, тератома, беременность

Раково-эмбриональный антиген (РЭА) < 5 нг/мл < 10 нг/мл (для курящих) Аденокарциномы кишечника, легких, молочной железы, С-клеточная карцинома щитовидной железы

Хорионический гонадо-тропин (ХГЧ) < 10 МЕ"/л (у мужчин и небеременных женщин) Рак легких, органов мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта, органов репродуктивной системы, хорионэпителиома, хорионкар-цинома, карцинома яичка и плаценты, тератомы яичника и яичек

Раковый антиген 15-3 (СА 15-3) <28 МЕ/мл (у небеременных женщин) Карцинома молочной железы, легких

Раковый антиген 125 (СА 125) < 35 МЕ/мл Рак яичников, сопутствующий маркер многих опухолей

Раковый антиген 19-9 (СА 19-9) <37 МЕ/мл Карцинома поджелудочной железы, кишечника, желудка, желчекаменные болезни, панкреатит

Простата-специфический антиген Общая форма (ПСАобщ) Свободная форма (ПСАсвоб) < 4 нг/мл (мужчины до 50 лет) ПСАсаоб/ПСАобщ >0.15 Рак простаты

Нейрон-специфическая енолаза (НСЕ) < 12.5 нг/мл Мелкоклеточный рак легких, опухоли нейроэн-докринного происхождения

"концентрация в Международных Единицах активности

Антитела

...-М:

Антитела против:

АФП У ОО О о НСЕ

ХГЧ \ о в ее ПСАобщ

РЭА О О © 0 С О © О! ПСАсвоб

САШ 4 в в • в Пустой гель

СА 15-3 V ;::'Л.--: м

СА 19-9 ««в«|

Рис. 1. Биочип для проведения одновременного количественного иммуноанализа девяти он-комаркеров (АФП, ХГЧ, РЭА, САШ, СА15-3, СА19-9, НСЕ, ПСАобщ, ПСАсвоб). Флуоресцентное изображение после иммуноанализа. Биочип содержит гелевые элементы, диаметром 120 мкм и объемом 0,1 нл (по четыре одинаковых элемента в ряду) с иммобилизованными моноклональными антителами против девяти онкомаркеров и контрольные ячейки, не со-

держащие биоматсрнала (пустые гслсвые элементы, положение которых показано пунктирными кругами). По краям биочипа расположены маркерные гслсвые ячейки (М) с иммобилизованным красителем цианиновым пятым (Су5).

2.1. Процедура одновременного количественного анализа девяти онкомаркеров

Для одновременного количественного определения содержания онкомаркеров в образце был выбран двустадийный «сэндвич»-иммуноанализ с флуоресцентной регистрацией сигнала: биочипы инкубировали на первой стадии реакционным раствором, содержащим анализируемый образец (или калибровочную пробу), на второй стадии инкубировали со смесью флуоресцентно меченых антител против исследуемых антигенов. После отмывки от иелро-реагировавших компонентов производили регистрацию флуоресцентных сигналов. Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала от каждой ячейки биочипа проводили с помощью программного обеспечения 1п^с1А5$ау (ИМБ РАН). Вычисление интенсивности флуоресценции каждого гелевого элемента биочипа производили следующим образом: изображение каждой ячейки окружалось концентрической окружностью. Флуоресцентный сигнал /•'определялся согласно формуле (I):

с В,/ с.

где 1т - медианный флуоресцентный сигнал, рассчитанный для ячейки микрочипа Для того, чтобы учесть пространственную неоднородность интенсивности источника излучения, био-чип заменяли красным стеклом с такими же геометрическими размерами. Получали фоновый сигнал от участков, соответствующих участкам изображения внутри концентрических окружностей (Вгг). Для учета шумов микроскопа флуоресцентный и фоновый сигналы корректировали шумовым сигналом ¡¡¿С:, измеренным при нулевой интенсивности источника.

При анализе полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых ячеек.

Для количественного определения концентрации антигена методом иммуноанализа на биочипе необходимо получить график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела, от концентрации соответствующего антигена в калибровочной пробе (калибровочную кривую). Для упрощения процедуры анализа были разработаны калибровочные пробы, содержащие одновременно все девять анализируемых онкомаркеров (АФП, ХГЧ, РЭА, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, НСЕ, ПСАобщ, ПСАсвоб) в диапазонах концентраций, необходимых для проведения клинического анализа. Нулевая калибровочная проба не содержала онкомаркеров. В качестве проявляющих антител использовали смесь антител против всех девяти онкомаркеров, и, таким образом, при постановке анализа получали одновременно девять калибровочных кривых. Калибровочные кривые строи-

лись с использованием кусочно-линейной интерполяции. Концентрацию каждого онкомар-кера в сыворотке крови определяли по соответствующей ему калибровочной кривой.

Для того, чтобы правильно определить концентрацию онкомаркера в сыворотке крови, важно избежать так называемого эффекта матрикса, когда на результат анализа влияет окружение, в котором находится анализируемое вещество. Необходимо, чтобы анализируемое вещество в образце взаимодействовало с иммобилизованными на биочипе и флуоресцентно-меченными антителами в тех же условиях, что и в калибровочных пробах, поэтому калибровочные пробы для анализа девяти онкомаркеров изготавливали на основе пулированной сыворотки крови здоровых доноров. При необходимости анализа сывороток с высокими концентрациями онкомаркеров для их разведения использовали нулевую калибровочную пробу.

2.2. Количественный анализ девяти онкомаркеров на биочипах

Для оценки воспроизводимости и аналитической чувствительности анализа была проведена серия экспериментов на семидесяти биочипах (по десять калибровочных кривых для одновременного анализа каждого из девяти онкомаркеров). Калибровочные кривые для определения онкомаркеров, полученные на биочипах, показаны на рисунке 2.

Для повышения достоверности данных анализа в состав биочипа включали четыре одинаковые гелевые ячейки для каждого иммобилизованного белка, при этом рассчитывали интенсивность флуоресценции как медианный сигнал по четырем ячейкам. Биочипы, у которых отклонения от среднего значения диаметра ячеек превышали 5%-е отклонение внутри биочипа и 8%-е отклонение между биочипами, отбраковывали. Простая методика постановки анализа и автоматический обсчет результатов анализа позволили уменьшить вероятность мануальных ошибок. Коэффициент вариации для различных концентраций определяемых антигенов не превышал 15%.

Известно, что одной из основных характеристик количественного анализа является чувствительность. Аналитическую чувствительность характеризует наименьшая определяемая концентрация, которую для каждого онкомаркера рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности флуоресценции, превышающей на два стандартных отклонения флуоресцентный сигнал многократно измеренной (десять раз) нулевой калибровочной пробы. Полученные значения аналитической чувствительности на биочипах были ниже значений нормы, определенной в индивидуальном анализе для каждого из онкомаркеров (Таблица 2), что дало основания рассматривать разработанный прототип тест-системы перспективным для клинического применения.

[АФП], hi т.'if (РЭА], иг/мл [ХГЧ]. МЕ/Л

[СА 12S), НЕ/МЛ [QA15-3], МВмл [СА19-SJ. Шыя

Рис.2. «Сэндвич»-иммуноанализ АФП, РЭА, ХГЧ, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, НСЕ, ПСАобщ и ПСАсвоб. Графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела, от концентрации соответствующего антигена в калибровочной пробе (калибровочные кривые). Каждая точка калибровочной кривой - среднее значение из измерений, полученных на десяти биочипах. На вставках приведены начальные участки соответствующих кривых с дополнительной растигровкой калибровочных проб, используемые для определения аналитической чувствительности анализа каждого онкомар-кера.

3. Определение содержания девяти онкомаркеров в сыворотках крови

Разработанный метод количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотке крови был апробирован на образцах более 500 сывороток крови больных онкологическими заболеваниями и здоровых доноров. Результаты исследований сопостанляли с таковыми, полученными традиционными методами ИФА («CanAg» («Fujirebio») (Швеция), DSL (США) для

ХГЧ). Результаты сравнительного определения девяти онкомаркеров двумя методами при-

ведены на рисунке 3.

Таблица 2. Аналитическая чувствительность анализа онкомаркеров на гидрогелевых биочипах на прозрачной и металлизированной подложках и в стандартных тест-системах.

Оико-маркер Концентрация в крови в норме Биочипы на прозрачной подложке Биочипы на металлизированной подложке Коммерческие тест-системы CanAg и DSL

АФП <10 нг/мл (у мужчин и небеременных женщин) 0,7 0,2 0,5

ХГЧ < 10 МЕ/л (у мужчин и небеременных женщин) 2,0 0,7 0,8

РЭА < 5 нг/мл < Юнг/мл (для курящих) 0,7 0,2 0,5

СА125 < 28 МЕ/мл (у небеременных женщин) 1,7 0,4 1,5

СА15-3 <35 МЕ/мл 7,0 1,7 1,0

СА19-9 < 37 МЕ/мл 0,4 0,1 1,0

ПСАобщ ПСАсвоб < 4 нг/мл (мужчины до 50 лет) ПСАиюб/ПСАобщ > 0.15 0,3 0,2 0,1 0,05 0,1 0,03

НСЕ <12.5 нг/мл 1,3 0,4 1,0

Коэффициент вариации при определении концентраций не превышал 15%.

Данные тестирования онкомаркеров с помощью стандартных тест-систем, принятые в качестве референсных значений, позволяют рассчитать для каждого онкомаркера долю достоверно положительных результатов (ДПР) и достоверно отрицательных результатов (ДОР), полученных на биочипе относительно стандартных тест-систем без учета пограничных значений концентраций каждого из онкомаркеров, находящихся близко к значению нормы. Значения пограничных зон концентраций для всех онкомаркеров были взяты из литературных источников*.

Показатели ДПР и ДОР рассчитывали по следующей схеме (Таблица 3): рассмотрим четырехпольную таблицу сопряженности, которая строится на основе результатов классифика-

В.П. Земляной, Т.Н. Трофимова, С.Л. Непомнящая, Т.В. Дементьева. Современные методы диагностики и оценки степени распространенности рака ободочной и прямой кишки. Практическая онкология. Т.6, № 2 (2005) 71-80

ции концентраций онкомаркеров, измеренных на биочипах, и концентраций онкомаркеров в этих же сыворотках, измеренных в ИФЛ тест-системах (Саш^ (Швеция)).

Биочип Биочип Биочип

Рис. 3. Результат корреляционного анализа концентраций девяти онкомаркеров (АФП, ХГЧ, РЭА, СА125, СА15-3, СА19-9, ПСАобщ, ПСАсвоб, НСЕ). Концентрации были получены после проведения одновременного количественного сэндвич-иммуноанализа девяти онкомаркеров на биочипе и в иддивидуадьном анализе с использованием традиционных тест-систем. Проведенные прямые соответствуют наилучшей линейной аппроксимации.

Таблица 3. Принцип расчета сопряженности полученных результатов на биочипах и стандартных тест-системах__

Стандартные тест-системы

Выше нормы Ниже нормы

Биочип Выше нормы П ЛП

Ниже нормы ло О

Обозначения:

• П - верно классифицированные положительные примеры, то есть значения концентраций онкомаркеров в сыворотках в обоих случаях были выше нормы (так называемые истинно положительные случаи);

• О - верно классифицированные отрицательные примеры, то есть значения концентраций онкомаркеров в сыворотках в обоих случаях были ниже нормы (истинно отрицательные случаи);

• ЛО - положительные примеры, ложно классифицированные как отрицательные, то есть на чипе значения измеренных концентраций онкомаркеров были ниже нормы, а на стандартных тест-системах они были выше нормы;

• ЛП - отрицательные примеры, ложно классифицированные как положительные, то есть на чипе значения измеренных концентраций онкомаркеров были выше нормы, а на стандартных тест-системах они были ниже нормы.

Доля достоверно положительных случаев:

ДПР = —---100% (2)

П + ЛО

Доля достоверно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы на

чипах:

Д0Р = —---100% (3)

Результаты корреляционного анализа, значения ДПР, ДОР и пограничные значения для каждого онкомаркера представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты корреляционного анализа онкомаркеров на биочипе.

Онкомаркер Коэффициент корреляции Биочип / ИФА Количество измерений Пограничные значения ДОР, % ДОР, %

АФП 0,91 130 5-Юнг/мл 92,3 100

ХГЧ 0,99 41 5-10 МЕ/л 92 70

РЭА 0,95 341 5-10нг/мл 100 99,2

САШ 0,97 125 30-40 МЕ/мл 100 87,5

СА 15-3 0,84 98 22-30 МЕ/мл 76,2 92,6

СА19-9 0,87 236 30-40 МЕ/мл 74,1 96,4

ВСЕ 0,97 26 10-12,5 нг/мл 92,9 61,5

ПСАобщ 0,95 120 4-10 нг/мл 100 100

ПСАсвоб 0,86 37 15-20% 75 100

Для всех измерений р<0,01, где р - уровень значимости, величина которого дополняет доверительную вероятность до единицы: р = 1 - Рдо> (Н. Джонсон, Ф. Лион Статистика и планирование эксперимента в технике и науке. Методы обработки данных. М.: Мир, 1980).

Как видно из рисунка 3 и таблицы 4, результаты одновременного определения девяти онкомаркеров в сыворотке крови человека на биочипе хорошо коррелируют с результатами,

полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с использованием общепризнанных по качеству коммерческих ИФА тест-систем (Саг^ (Швеция)).

4. Группировка онкомаркеров в соответствии с диагнозами

Анализируемые сыворотки обследуемых пациентов с известными диагнозами (569 лиц) были рассортированы по основным группам согласно международной классификации болезней (МКБ-10). Для каждой из групп сывороток были определены достоверные значения превышения нормы концентраций онкомаркеров, как для индивидуальных антигенов, так и комбинаций из нескольких онкомаркеров. В таблице 5 представлены данные количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотках крови, сгруппированные в соответствии с диагнозами: онкологические заболевания, неонкологические заболевания и здоровые доноры. В исследуемых сыворотках фиксировали превышение нормы концентрации любого из девяти онкомаркеров, поскольку у здорового человека уровень каждого из определяемых маркеров должен быть ниже верхней границы нормы.

Если оценивать результативность данной тест-системы с точки зрения возможности скрининга для выявления не только онкологических заболеваний, то на основе таблицы 4, а также формул (2) и (3) и сгруппировав все имеющиеся результаты анализов на биочипах в соответствии с диагнозами больной/здоров (Таблица б), можно вычислить чувствительность и специфичность разработанного теста. Чувствительность теста (Чв) в данном случае определялась как доля лиц с концентрацией хотя бы одного из девяти онкомаркеров, превышающей значение нормы, от общего числа лиц, имеющих заболевания (1), и оказалась равной Чв-73,7%, специфичность (Сл) - доля лиц с отрицательным результатом теста среди здоровых (2) и соответствовала значению Сп=94,1%. Исходя из полученных значений, можно сделать вывод, что разработанный прототип тест-системы можно использовать для проведения первичной диагностики заболеваний (скрининг населения).

Таблица 5. Данные количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотках крови пациентов и здоровых доноров

Группа Общее количество сывороток в группе Количество сывороток с концентрацией хотя бы одного онкомаркера выше нормы Количество сывороток с концентрацией хотя бы одного онкомаркера выше нормы, %

Онкологические больные 252 193 76,6%

Неонкологические больные 132 90 68,2%

Здоровые доноры 185 11 6,0%

Таблица б. Взаимоотношения между результатами теста и наличием или отсутствием заболевания

Обследуемые

бальной здоровый

Биочип Выше нормы П=193+90=283 ЛП=П

Ниже нормы Л0=252+132-193-90=101 0=185-11=174

Другой важной характеристикой тест-системы является ее прогностическая значимость. Прогностическая значимость положительного результата — это вероятность заболевания

Чв

при положительном результате теста:

• 100% = 92,6%. Прогностическая зна-

Чв + (100-Сл)

чимость отрицательного результата — это вероятность отсутствия заболевания при отрица-

Сп

тельном результате теста:

■100% = 78,2%. Не очень высокое значение по-

Сп+ (100-Чв)

следнего результата по сравнению с традиционными ИФА тест-системами означает, что для установления диагноза «здоров» необходимо дополнительное обследование.

На рисунке 4 представлено распределение сывороток с повышенным (выше нормы) содержанием онкомаркеров по группам для заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В первом случае (А) были выбраны сыворотки больных со злокачественными новообразованиями органов пищеварения. Во вторую группу (Б) были включены сыворотки больных с диагнозами язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, неинфекционный Э1пе-рит и колит, болезни желчного пузыря, желчевыводящих путей и поджелудочной железы и другие болезни органов пищеварения.

£100% § 90% « 80% 5 70% | «0% 3 50% 8 40% в 30% Ё 20% в 10% -51 о%

-40.8%-

16.2%

эв

-30.0%

30.0% ¿ь.

15.4%

сГеР

с-

Рис. 4. Профили частоты встречаемости значений концентраций онкомаркеров, превышающих верхнюю границу нормы для заболеваний желудочно-кишечного тракта. А - группа со

злокачественными новообразованиями органов пищеварения, всего 130 сывороток, Б -группа с неонкологическими заболеваниями органов пищеварения, всего 63 сыворотки. Погрешность измерений считалась по формуле погрешности для биномиального распределения ег = -.¡р( 1 - р) / и, где р - доля сывороток с концентрацией онкомаркера выше нормы, п - количество сывороток в группе.

При сравнении профилей частоты встречаемости значений, превышающих норму для он-

копатологий ЖКТ и доброкачественных заболеваний, видно, что для злокачественных новообразований органов пищеварения наиболее характерно повышение онкомаркеров РЭА (40,8%), СА 125 (30,0%) и СА19-9 (26,9%). Для неонкологичсских заболеваний ЖКТ наиболее часто наблюдается повышенные значения СА125. Из литературных данных известно, что повышение концентраций онкомаркеров РЭА и СА 19-9, наиболее часто происходит при злокачественных заболеваниях желудочно-кишечного тракта. С другой стороны, при неонкологических заболеваниях часто наблюдают повышенные значения СА125, что подтверждается полученными нами результатами. Также известно, что СА125 обладает наименьшей специфичностью к типу патологии, поэтому у здоровых людей значение его концентрации не превышает верхней границы нормы.

При увеличении выборки данных для статистического анализа, мы рассчитываем выявить комбинации онкомаркеров, характерных для других онкопатологий.

5. Микрочипы на металлизированных подложках

Было замечено, что использование подложек с металлическим покрытием значительно улучшает отношение сигнал/фон, определяющее чувствительность анализа*. Увеличение времени экспозиции приводит к увеличению сигналов, как от ячеек, так и от подложки микрочипа, тогда как отношение сигнал/фок остается неизменным при разных временах экспозиции. В наших экспериментах фоновые сигналы на чипах с прозрачной и металлизированной подложках были одинаковы.

Для проведения экспериментов по оценке усиления интенсивности флуоресценции на зеркальных подложках было изготовлено несколько серий биочипов, в каждой из которых гелевые ячейки, содержащие гелеобразующие мономеры и молекулярные зонды одинакового состава, были нанесены на прозрачные стеклянные и на зеркальные металлизированные подложки. Все эксперименты были трижды повторены в одинаковых условиях. Относительная погрешность в экспериментальных данных не превышала 15%. Данные, приведенные ниже, соответствуют медианному значению сигналов по четырем ячейкам с одинаковой концентрацией иммобилизованных зондов. Выявление факторов, определяющих усиление сигнала 5.1. Природа иммобилизованного зонда

' Н. Metiu. Surface enhanced spectroscopy. Prof. Surface Sci. 17 (1984) 153-320.

Для выявления зависимости усиления сигнала от природы исследуемого объекта проводили оценку усиления флуоресценции для гелевых микрочипов с металлизированными подложками по сравнению с гелевыми микрочипами на прозрачном стекле. В ячейках микрочипа были иммобилизованы флуоресцентно-меченный белок (бычий сывороточный альбумин-Су5) и олигонуклеотид (5'-АААТАТ-3'-Су5). Также сравнивали в аналогичных условиях сигналы, получаемые для различных типов иммунокомплексов, образующихся в результате иммуноанализа на биочипе (двойного, тройного и комплекса из 4 компонент). Во всех случаях на металлизированных микрочипах получали ~4-5-и кратное усиление сигнала флуоресценции.

5.2. Тип красителя

Была исследована зависимость эффекта усиления сигнала от типа красителя. Были исследованы два флуоресцентных красителя СуЗ и Су5 (длины волн возбуждения/эмиссии, 550/570 нм и 650/670 нм, соответственно). Оказалось, что усиление флуоресцентных сигналов для микрочипов, изготовленных на подложках с зеркальной поверхностью, практически одинаково (Таблица 6).

Таблица б. Усиление сигналов в разных условиях.

Краситель Сухие ячейки Набухшие ячейки Под буфером

Су5 4,0+5,0 8,0+10,0 2,0-н 3,0

СуЗ 4,5-5-5,0 9,0+10,0 2,3-5-3,0

5.3. Концентрация флуорофора

Для того чтобы оценить возможную нелинейность зависимости величины флуоресцентных сигналов от концентрации иммобилизованных зондов, мы использовали микрочипы с иммобилизованным в различных концентрациях флуоресцентно-меченным белком БСА-Су5. Соотношение числа молекул красителя на молекулу зонда для БСА-Су5 составило 4:1. Наблюдалась линейная зависимость величины флуоресцентного сигнала от концентрации красителя, при этом усиление сигнала флуоресценции от количества красителя не зависела. Отметим, что линейность наблюдалась в области, в которой величины сигналов превышают значение сигнала от наименьшей достоверно определяемой концентрации иммобилизованного зонда. Ее рассчитывали как величину, соответствующую интенсивности флуоресценции, превышающей на два стандартных отклонения многократно (более 10 раз) измеренный сигнал от ячейки, не содержащей иммобилизованного красителя. Экстраполяция линейной зависимости сигналов флуоресценции в сторону высоких значений концентраций зондов в гелевых элементах будет справедлива вплоть до ~ 10"4 - 10"3 М, при которых межмолекулярные расстояния между зондами становятся сравнимыми с их размерами. В наших услови-

ях количество красителя были ниже значения ~ 10° М, которое соответствует межмолекулярному расстоянию - 100 нм. Таким образом, в используемом диапазоне концентраций флуорофора наблюдается линейная зависимость сигналов флуоресценции от количества красителя, и коэффициент усиления флуоресцентных сигналов не зависит от концентрации флуорофора. На основании проведенных исследований в работе делаем вывод, что это справедливо для всех типов комплексов.

5.4. Влияние формы ячейки

При исследовании эффекта усиления сигнала для микрочипов, изготовленных на металлизированной подложке, по сравнению с микрочипами, нанесенными на прозрачное стекло, нами было обнаружено, что после процедуры отмывки и высушивания эффект усиления существенно снижается с 8-10 кратного для ячеек, насыщенных глицерином, до 4-5-кратного для сухих чипов. Мы предположили, что одним из факторов, влияющих на различие в усилении флуоресцентного сигнала, является форма гелевой ячейки, которая существенно меняется при высушивании (см. рис. 5А и 5Б).

Рис, 5. Фотографии гелевых ячеек микрочипа, полученные при помощи конфокального микроскопа, на стеклянной поверхности: (А) восстановленная водным раствором глицерина гелевая ячейка (высота ячейки составляет ~ 50 мкм); (Б) гелевая ячейка после отмывки и высушивания (высота ~ 25 мкм); и (В) набухшая гелевая ячейка, полученная после помещения высушенной ячейки под буферный раствор (высота - 50 мкм). Радиусы ячеек составляют приблизительно 60 мкм.

В результате исследований, проведенных на конфокальном микроскопе, были определены параметры гелевых ячеек микрочипа для различных состояний. Высота гелевых ячеек на стеклянных и металлизированных подложках после отмывки и высушивания составляла 25±3 мкм, радиусы - 60±2 мкм. Форма набухшей гелевой ячейки, полученная после помещения микрочипа под слой жидкости, соответствует форме ячейки после нанесения и полимеризации (см. рис. 5А и 5В). При добавлении водного раствора глицерина на сухой микрочип, гелевые элементы также приобретают набухшую полусферическую форму (рис. 5В). После удаления избытка раствора глицерина с поверхности гелевого элемента наблюдается усиление флуоресценции 8-10 раз по отношению к аналогичным ячейкам на стеклянной поверхности (ср. рис. 5А).

В рамках исследования было проведено сравнение усиления сигналов от ячеек плоской формы с относительным усилением сигналов от слоя геля с поперечными размерами 0,8смх 1,2см и толщиной 30 мкм, содержащим краситель Су5 в тех же концентрациях, что и в гелевых ячейках биочипа. Было получено четырехкратное усиление сигнала флуоресценции на зеркальной поверхности как для слоя геля с флуорофором, так и для высушенной гелевой ячейки с иммобилизованным флуорофором.

5.5. Влияние слоя жидкости

Рисунок 6 иллюстрирует влияние слоя жидкости на сигналы флуоресценции на микрочипах с иммобилизованным флуоресцентно-меченым БСА-Су5. Эксперименты проводили с использоватгем деионизированной воды. Чипы находились под пластиковыми камерами с внутренним объемом 25 мкл.

Слой воды, покрывающий ячейки, снижает коэффициент усиления с 4-5 до -2-2,5 раз.

Рис. 6. Влияние слоя жидкости на сигналы флуоресценции для гидрогелевого микрочипа с иммобилизованным флуоресцентно-меченным БСА: 1 - сухой микрочии без слоя воды; и 2 - микрочипы под слоем воды в камере высотой 250 мкм. Для каждой пары столбцов в диаграмме левые столбцы соответствуют сигналам от микрочипов на зеркальной подложке, а правые - на прозрачной подложке.

5.6. Механизм усиления флуоресцентных сигналов

Все наблюдаемые нами эффекты поддаются объяснению в рамках геометрической оптики (рис. 7). Пористый гель ячеек всегда содержит некоторое количество воды (белковые молекулы не теряют своей активности*), поэтому гелевые ячейки являются «гладкими» для длин волн 550 и 650 нм.

Очевидно, что зеркальная поверхность с высокой отражательной способностью усиливает возбуждающий свет па флуорофоре по сравнению с прозрачной подложкой (в два раза при 100% отражении) (см. также рис. 7Аа). Отражение флуоресцентного излучения от металлической поверхности дополнительно усиливает также в два раза регистрируемый сигнал

Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhifl A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., A.D. Mirzabekov. Hydrogel -based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. BtoTechni-ques. 34 (2003) 1008-1022.

(рис. 7А6). Вместе это приводит к четырехкратному усилению флуоресцентного сигнала, наблюдаемому для гелевых ячеек плоской формы.

Источник

Металл

К микроскопу

Металл

Жидкой^ Гелевая ячейка

í} $ ПИ Ф I'!' i '!' 'i''!' t

Рис. 7. Эффекты, объясняемые в рамках геометрической оптики, ответственные за усиление флуоресценции на гидрогелевых микрочипах с зеркальными подложками. А - отражение излучения возбуждения от зеркальной подложки приводит к эффективному двукратному усилению возбуждающего облучения флуорофора (а). Флуоресцентный микроскоп регистрирует как прямое, так и отраженное излучение, испущенное флуорофором (б). Б - выход излучения от флуорофора в слое геля. Лучи с углами падения 6 < 6r (sin 6, = !/ngs¡, где ngci - показатель преломления для геля) выходят из слоя геля и могут регистрироваться флуоресцентным микроскопом, в то время как лучи с углами падения 6 > 0Г полностью отразятся назад от внешней границы геля и уйдут сквозь прозрачную подложку, или рассеются к боковым торцам слоя геля в случае зеркальной подложки. В - выход излучения от флуорофора внутри полусферической ячейки. Г - выход излучения от флуорофора внутри полусферической ячейки под слоем жидкости.

Эффекты внутреннего отражения от внешних границ гелевой ячейки и выход отраженного излучения из ячейки могут объяснить зависимость усиления от формы ячейки и присутствия слоя жидкости над гелевыми ячейками (в последнем случае отражение от внешней границы буферного раствора также должно быть принято во внимание) (рис. 7Б-7Г). В третьей глазе диссертационной работы (Результаты и их обсуждение) приведены оценки выхода излучения для плоской и полусферической гелевых ячеек. При значениях показателя преломления геля ngd =1,47* часть излучения флуоресценции в плоской гелевой ячейке отразится обратно в результате полного внутреннего отражения и при этом либо уйдет через прозрачную поверхность подложки (если нет напыления), либо отразится от металлического слоя (если напыление присутствует) и после переотражений уйдет в боковые торцы ячейки

Ching-Yu Lin, Kui-Ming Huang, and Han-Min Chen. Use of backiit light plate to enhance visualization of imidazole-zinc reverse stained gels. BioTechniques 41 (2006) 560-564, p. 564

(рис. 7Б). Результирующее усиление сигнала флуоресценции в плоской гелевой ячейке равно 4-5. В сторону приемного устройства из полусферической ячейки выходит излучения примерно в два раза больше, чем из плоской ячейки. На металлизированной поверхности дополнительное усиление по сравнению с аналогичными ячейками на стекле указывает на выход из полусферической ячейки мод полного внутреннего отражения (рис. 7В). Эта часть излучения была бы потеряна при излучении флуоресценции из полусферических гелевых ячеек на прозрачной подложке. Интегральное усиление флуоресценции для полусферических ячеек на металлизированной подложке по сравнению с полусферическими ячейками на прозрачной поверхности достигало ~8-10 раз.

При наличии слоя жидкости полное внутреннее отражение излучения от внешней границы слоя жидкости над ячейкой микрочипа будет примерно таким же, как от границы плоской гелевой ячейки при отсутствии слоя жидкости (рис. 7Б и 7Г)- Поэтому усиление излучения от полусферической ячейки под слоем жидкости не может превышать соответствующего усиления (~ 4), получаемого от ячеек с плоской формой. Вследствие оптических потерь на границе гелевая ячейка-жидкость и, соответственно, менее эффективного возбуждения флуорофора в ячейке усиление излучения ячейки, находящейся под слоем жидкости, уменьшается до значения - 2-3.

6. Оптимизация иммуноапализа на микрочипах с металлическим напылением

Для оценки влияния эффекта усиления флуоресцентных сигналов на чувствительность анализа были получены калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа онкомаркеров на биочипах, изготовлешмх на стеклянных подложках и стеклянных подложках с золотым напылением фирмы Nunc, США.

Как видно из рисунка 8А (на примере калибровочных кривых для общей формы ПСА), при равных условиях проведения анализа, в том числе равном времени инкубации, получено 4-5-кратное усиление флуоресцентных сигналов на металлизированных подложках для всех концентраций антигенов. В точке с нулевой концентрацией антигена усиления флуоресцентных сигналов не наблюдали, так как, благодаря правильному подбору пар антител, не дающих неспецифического связывания, интенсивность флуоресценции от флуорофора, находящегося в гелевой ячейке с иммобилизованными антителами при нулевой концентрации антигена (по сути, сигнал неспецифического взаимодействия), находится за пределами чувствительности прибора.

а^Р—-,-,-,-,-, о

3 6 9 12 15 О

[ПСАобщ], нг/мл

го

[ПСАобш]. нг/мл

Рис. 8. Калибровочные кривые для сэндвич-иммуноанализа общей формы ПСА на гидроге-левых биочипах, изготовленных на стеклянной (1) и зеркальной (2) подложках: А - начальный участок кривых, в обоих случаях время инкубации составляло 20 часов; Б - на стеклянной подложке (1), время инкубации составляло 20 часов, на зеркальной подложке (2) - 3 часа.

Чем больше значение сигнала флуоресценции от заданной концентрации на калибровочной кривой, то есть чем больше угол наклона калибровочной кривой на начальном участке, тем выше точность анализа, что мы и видим из рисунка 8А и из данных таблицы 2.

Из приведенных данных видно, что чувствительность, получаемая в одновременном анализе девяти онкомаркеров на биочипах с металлизированными подложками выше, чем чувствительность, получаемая в индивидуальном анализе девяти онкомаркеров с помощью традиционных коммерческих иммуноферментаых тест-систем, и эта чувствительность удовлетворяет требованиям клиницистов, дальнейшее ее повышение нецелесообразно.

Другая возможность оптимизации анализа при использовании эффекта усиления флуоресценции на биочипах с металлизированными подложками состоит в сокращении времени анализа. Для биочипов, изготовленных на стеклянной подложке, нами было подобрано время инкубации 20 ч, исходя из уровней сигналов, обеспечивающих необходимую чувствительность анализа онкомаркеров. При инкубации образца в течение трех часов для большинства онкомаркеров чувствительность анализа на чипах на металлизированной подложке изменилась незначительно (рис. 8Б).

Таким образом, применение металлизированных подложек при изготовлении микрочипов позволяет оптимизировать два основных параметра иммуноанализа: повысить чувствительность и/или уменьшить время анализа.

выводы

1. Разработан прототип тест-системы для одновременного количественного определения девяти онкомаркеров: альфа-фетопротеина, раково-эмбрионалыюго антигена, хориони-ческого гонадотропина человека, раковых антигенов СА 125, СА 15-3, СА 19-9, двух форм простат-специфического антигена (ПСАобгц и ПСАсвоб), нейрон-специфической енолазы на биочипе. Установлены основные аналитические характеристики метода.

2. Показано, что результаты одновременного определения девяти онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе коррелируют с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с использованием стандартных им-муноферментных тест-систем.

3. Проведена статистическая обработка результатов одновременного количественного им-муноанализа девяти онкомаркеров в сыворотках крови. Определены чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов разработанного прототипа тест-системы.

4. Изучены факторы, влияющие на эффект усиления флуоресценции на гидрогелевых микрочипах. Основываясь на результатах наших исследований, эффект усиления флуоресценции на гидрогелевых микрочипах с металлическим напылением мы можем объяснить, не выходя за рамки геометрической огтгики. Показано, что использование подложек с зеркальным напылением позволяет оптимизировать процедуру иммуноанализа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Ж. И. Зубцова, М. А. Филиппова, Е. Н. Саватеева, Д. А. Зубцов, В. Р. Чечеткин, Е. В. Гришин, А. С. Заседагелев, А. Ю. Рубина. Усиление сигнала флуоресценции на гелевых биочипах с зеркальной поверхностью и оптитмизация процедуры иммуноанализа. Доклады Академии Наук, т. 427, №1,2009, с. 118-121.

2. Zubtsova Zh.I, Zubtsov D.A., Sawateeva E.N., Stomakhin A.A., Chechetkin V.R., Zasedate-lev A.S., Rubina A.Y. Hydrogel-based protein and oligonucleotide microchips on metal-coated surfaces: Enhancement of fluorescence and optimization of immunoassay. Journal of Biotechnology, v. 144,2009, p. 151-159.

3. Зубцова Ж. И., Савваггеева Е. Н., Зубцов Д. А., Поплетаева С. Б., Юрасов Р. А., Цыбульская М. В., Рубина А. Ю. Разработка многопараметрической тест-системы для диагностики онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. Труды МФТИ, Том 2, № 2 (6) 2010, с. 16-22.

Патентная заявка

1. Ж.И. Зубцова, E.H. Савватеева, A.A. Стомахин, М.В. Цыбульская, А.Ю. Рубина. Многопараметрическая диагностическая тест-система для обнаружения и мониторинга терапии рака молочной железы и рака яичников. Заявка №2009139323, дата приоритета от 27.10.2009.

Тезисы

1. Зубцова Ж. И. Исследование природы усиления сигнала флуоресценции на гидрогеле-вых биочипах с зеркальной поверхностью. 51 Научная Конференция МФТИ Россия, Москва 2008.

2. Ж. Зубцова, Е. Савватеева, М. Филиппова, М. Цыбульская, А. Рубина. Биологический микрочип для одновременного количественного анализа маркеров онкологических заболеваний. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». ИМБ РАН, Россия, Москва, 2008.

3. Зубцова Ж.И., Цыбульская М.В., Савватеева E.H., Филиппова М.А., Зубцов Д.А., Юра-сов P.A., Стомахин A.A., Рубина А.Ю. Биологический микрочип для одновременного количественного анализа маркеров онкологических заболеваний. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». ИМБ РАН, Россия, Москва, 2009.

4. Ж.И. Зубцова, E.H. Савватеева, М.А. Филиппова, М.В. Цыбульская, А.Ю. Рубина. Одновременный анализ девяти серологических онкомаркеров на биологическом микрочипе. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и био-нанотехнологии. ИБХ РАН, Россия, Москва, 2009.

5. Зубцова Ж. И., Зубцов Д. А., Стомахин А. А., Рубина А. Ю. Разработка метода изготовления подложек с контролируемой степенью гидрофобности для формирования гидроге-левых биочипов. 2-я Окружная научно-техническая конференция молодых ученых и специалистов. НП "Центр развития предпринимательства Зеленоградского административного округа города Москвы", Россия, Зеленоград, 2010.

6. Зубцова Ж.И., Поплетаева С.Б., Савватеева E.H., Бутвиловская В.И., Цыбульская М. В., Рубина А. Ю. Онкодиагносгический биочип для одновременного количественного анализа девяти белковых онкомаркеров и определения уровня аугоантител к онкоассоцииро-ванным сахаридам в сыворотке крови человека. 9-я Международная научно-практическая конференция "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности", Россия, Санкт-Петербург, 2010.

Подписано в печать:

25.10.2010

Заказ № 4361 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Зубцова, Жанна Исхаковна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микрочипов.

1.2. Применение микрочипов.

1.3. Изготовление микрочипов.

1.3.1. Методы иммобилизации белков на микрочипах.

1.3.2. Методы нанесения зондов.

1.4. Микрочипы на основе гидрогелей.

1.5. Опухолевые маркеры.

1.5.1. Индивидуальные опухолевые маркеры.

1.5.1.1. Альфа-фетопротеин.

1.5.1.2. Хорионический гонадотропин человека.

1.5.1.3. Раково-эмбриональный антиген.

1.5.1.4. Опухоле-ассоциированный антиген 125.

1.5.1.5. Опухоле-ассоциированный антиген СА 15-3.

1.5.1.6. Опухоле-ассоциированный антиген СА 19-9.

1.5.1.7. Нейрон-специфическая енолаза.

1.5.1.8. Простат-специфический антиген.

1.5.2. Одновременное определение нескольких онкомаркеров.

1.6. Белковые микрочипы для определения онкомаркеров.

1.7. Усиление флуоресценции вблизи металлической поверхности.

1.8. Усиление флуоресценции на микрочипах с металлическим напылением

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Буферные растворы.'.

2.3. Приготовление коньюгатов флуоресцентно-меченных проявляющих антител и их смеси.

2.4. Приготовление калибровочных проб.

2.5. Изготовление белковых микрочипов.

2.6. Сэндвич - иммуноанализ на биочипах.

2.7. Флуоресцентные измерения.

2.8. Обработка результатов анализа.

2.9. Аналитические характеристики метода.

2.9.1. Воспроизводимость анализа.

2.9.2. Аналитическая чувствительность (предел обнаружения).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Биочип для одновременного количественного анализа девяти онкомаркеров

3.2. Выбор объектов для одновременного количественного анализа.

3.3. Разработка процедуры одновременного количественного анализа девяти онкомаркеров.

3.3.1. Воспроизводимость анализа.

3.3.2. Аналитическая чувствительность (предел обнаружения).

3.4. Определение содержания девяти онкомаркеров в сыворотках крови.

3.5. Группировка онкомаркеров в соответствии с диагнозами.

3.6. Микрочипы на металлизированных подложках.

3.7. Выявление факторов, определяющих усиление сигнала.

3.7.1. Природа иммобилизованного зонда.

3.7.2. Тип металлизированного покрытия и тип красителя.

3.7.3. Влияние формы ячейки.

3.7.4. Концентрация иммобилизованного флуорофора.

3.7.5. Влияние слоя жидкости.

3.7.6. Механизм усиления флуоресценции.

3.7.7. Флуоресцентное изображение гелевых ячеек на гидрофильных и гидрофобных металлизированных подложках.

3.8. Оптимизация иммуноанализа на микрочипах с металлическим напылением

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе"

Одним из перспективных направлений исследований в области диагностики является разработка на основе технологии биочипов метода одновременного количественного определения различных биологических параметров в сыворотке крови человека, например, таких, как уровень маркеров онкологических заболеваний (онкомаркеров). Онкомаркеры широко используются в клинической практике для подтверждения диагноза и мониторинга проводимой терапии. Одновременное определение нескольких онкомаркеров увеличивает возможности дифференциальной диагностики заболеваний, позволяет повысить чувствительность скринингового анализа. Выявление повышенной концентрации только одного онкомаркера не является достаточным доказательством для постановки диагноза онкопатологии, поскольку может быть связано с наличием у обследуемого человека воспалительного процесса: На практике, анализируя только один онкомаркер у обследуемого пациента, можно пропустить повышение концентрации какого-либо из онкомакеров, выявление которого может поменять сам диагноз. Кроме того, для определения локализации опухоли важно знать не только значения концентраций отдельных маркеров, но и их соотношения.

В Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН разработан метод одновременного количественного иммунофлуоресцентного анализа нескольких антигенов на биочипе. В данной работе представлена разработка прототипа тест-системы, предназначенного для одновременного количественного определения девяти серологических онкомаркеров методом иммунофлуоресцентного анализа на биочипе. Для оценки диагностических возможностей разработанной тест-системы исследована статистическая достоверность определения концентраций девяти онкомаркеров в сыворотках крови пациентов и здоровых доноров в сравнении с общепризнанными и широко используемыми в клинической практике иммунохимическими тест-системами и проведено сравнение получаемых данных с диагнозами, определенными другими (инвазивными) методами. Кроме того, была исследована возможность улучшения аналитических характеристик разработанного метода за счет использования подложек для биочипов с зеркальным металлическим покрытием.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика микрочипов

Биологические микрочипы (биочипы) - массивы элементов, содержащие в каждой ячейке иммобилизованный индивидуальный зонд (ДНК, белки, олигосахариды клетки и др.) и закрепленные на поверхности подложки. Микрочипы являются миниатюрным аналитическим устройством, позволяющим производить параллельный анализ многих взаимодействий биологических молекул с использованием минимальных количеств анализируемого материала. В настоящее время с помощью биочипов можно изучать внутриклеточные процессы, определять точечные мутации, а также выявлять некоторые заболевания (онкозаболевания, туберкулез и др.) и определять, уровень токсичных веществ в образце. Темпы развития технологии биочипов, а; также спрос на биологические микрочипы в мире за последние несколько лет указывают на то, что они станут главным мощным инструментом в биохимии, молекулярной биологии, протеомике [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8; 9, 10] [11, 12, 13]. Технология производства ДНК-микрочипов широко развивается такими фирмами, как Affimetrix (США), Biacore (Швеция), Ciphergen Biosystems (США), Oxford GlykoSciences (Великобритания) и др., белковые чипы пока не получили широкого коммерческого распространения [8, 14, 15].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зубцова, Жанна Исхаковна

выводы

1. Разработан прототип тест-системы для одновременного количественного определения девяти онкомаркеров: альфа-фетопротеина, раково-эмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, раковых антигенов СА 125, СА 15-3, СА 19-9, двух форм простат-специфического антигена (ПСАобщ и ПСАсвоб), нейрон-специфической енолазы на биочипе. Получены основные аналитические характеристики метода.

3. Проведена статистическая обработка результатов одновременного количественного иммуноанализа девяти онкомаркеров в сыворотках крови. Определены чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов разработанного прототипа тест-системы.

4. Изучены факторы, влияющие на эффект усиления флуоресценции на гидрогелевых микрочипах. Основываясь на результатах наших исследований, эффект усиления флуоресценции на гидрогелевых микрочипах с металлическим напылением мы можем объяснить, не выходя за рамки геометрической оптики. Показано, что использование подложек с зеркальным напылением позволяет оптимизировать процедуру иммуноанализа.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Рубиной Алле Юрьевне за всестороннюю помощь и интеллектуальную поддержку, оказанные при выполнении и написании этой работы. Я искренне признательна Заседателеву Александру Сергеевичу, Чечеткину Владимиру Романовичу, Зубцову Дмитрию Александровичу, Резникову Юрию Петровичу, Масленникову Владимиру Валерьевичу, Винницкому Леониду Ильичу и Самохиной Ларисе Олеговне за критическое обсуждение экспериментов и их результатов; Савватеевой Елене, Цыбульской Марии, Филипповой Марине, Стомахину Андрею, Бутвиловской Веронике, Фейзхановой Гузель за помощь, моральную поддержку, теплое и дружеское отношение. Также выражаю признательность Дементьевой Екатерине за сотрудничество. Выражаю благодарность Юрасову Роману за разработку специальных компьютерных программ. Выражаю признательность Панькову Сергею Васильевичу, Крейндлину Эдуарду Яковлевичу, Гужову Владилену Павловичу, Моисеевой Ольге, Сомовой Ольге, Грачевой Маше, Юрасову Дмитрию и всей группе производства микрочипов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Зубцова, Жанна Исхаковна, Москва

1. Livshits М.А., Mirzabekov A.D. Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucleotides. Biophys. J. 1996, Vol. 71, pp: 2795-2801.

2. Kramer S., Joos Т.О., Templin M.F. Protein microarrays. Curr Protoc Protein Sei. Mar 2005, Vol. 23, pp. 23-25.

3. Gamby J., Abid J.P, Tribollet В., Girault H.H. Nanomosaic Network for the Detection of Proteins Without Direct Electrical Contact. Small. Apr 2008, Vol. 17.

4. Yang S.T., Zhang X., Wen Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays. Curr Opin Drug Discov Devel. Jan 2008, Vol. 11, l,pp. 117-127.

5. Mitchell P. A perspective on protein microarrays. Nature Biotechnology. Mar 2002, Vol. 20, pp. 225-229.

6. Templin M.F., Dieter Stoll, Monika Schrenk, Petra C.Traub, Christian F.Vohringer and Thomas O. Joos. Protein microarray technology. TRENDS in Biotechnology. 4, April 2002, Vol. 20, pp. 160-166.

7. MacBeath G. Protein microarrays and proteomics. Nature genetics supplement. Dec 2002, Vol. 32, pp. 526-532.

8. Lai S.P., Richard I.Cristopherson and Sristobal G.dos Remedies. Antibody arrays: an embryonic but rapidly growing technology. Drug Discovery Today. 18,2002, Vol. 7, pp. 143-149.

9. Abbot A. Betting on tomorrow's chips. Nature. Jan 2002, Vol. 415, pp. 112-114.

10. Mirzabekov A. D. and Alexander Kolchinsky. Emerging array-based technologies in proteomics. Current Opinion in Chemical Biology. 2001, Vol. 6, pp. 70-75.

11. Rubina A. Yu., Dyukova V. I., E. I. Dementieva, A. A. Stomakhin, V. A. Nesmeyanov, E. V. Grishin, A. S. Zasedatelev. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips. Anal. Biochem. 2005, Vol. 340, pp. 317-329.

12. Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov AA, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics. Feb 2008, Vol. 8, 4, pp. 817-31.

13. Angenendt P, Glokler J, Murphy D, Lehrach H, Cahill D.J. Toward optimized microarrays: a comparison of current microarray support material. Anal. Biochem. 2002, Vol. 309, pp. 253-260.

14. Service R.F. Searching for Recipes for protein chips. Science. 2001, Vol. 294, pp. 2080-2082.

15. Beier M, J.D. Hoheisel. Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips. Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, pp. 1970-1977.

16. Kodadek T. Protein microarrays: prospects and problems. Chemistry & Biology. 2001, Vol. 8, pp. 105-115.

17. Uetz P, Giot L, Cadney G, Mansfield ТА, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart P. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces serevisiae. Nature. 2000 г., Т. 403, стр. 623-627.

18. Heng Zhu, Klemic JF, Chang S, Berton P, Casamayor A, Klemic KG, Smith D, Gerstein M, Reed MA, Snyder, M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 2000, Vol. 26, pp. 283-289.

19. Moreno-Bondi Maria Cruz, Jean Pierre Alarie and Tuan Vo-Dinh. Multi-analyte analysis system using an antibody-based biochip. Analytical and Bioanalytical Chemistry. Oct 2002.

20. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions. Genom Biology. 2001, Vol. 2, 2.

21. Heng Zhu, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M,'

22. Snyder M. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 2001, Vol. 293, pp. 2101-2105.

23. Zhen Xiao, Bao-Ling Adam, Lisa H. Cazares, Mary Ann Clements, John W. Davis, Paul F. Schellhammer, Enrique A. Dalmasso, and George L. Wright, Jr.

24. Quantitation of Serum Prostate-specific Membrane Antigen by a Novel Protein Biochip Immunoassay Discriminates Binign from Malignant Prostate Disease. Cancer Research. Aug 15, 2001, Vol. 61, pp. 6029-6033.

25. Савватеева E.H., Дементьева Е.И., Цыбульская M.B., Осипова Т.В.,Рябых Т.П., Турыгин А.Ю., Юрасов Р.А., Заседателев А.С., Рубина А.Ю.

26. Биологический микрочип для одновременного количественного иммуноанализа маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека. Бюллетень экспериментальной биологии а медицины. 2009 г., Т. 6, стр. 679-683.

27. Wiesner A. Detection of tumor markers with ProteinChip technology. Curr Pharm Biotechnol. Feb 2004, Vol. 5, 1, pp.* 45-67.

28. Belov L, de la Vega O, dos Remedios CG, Mulligan SP, Ghristopherson RI.1.munophenotyping of leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray. Cancer Res. Jun 2001, Vol. 61, 11, pp. 4483-4489.

29. Seong S., Choi, C. Current status of protein chip development in terms of fabrication and application. Proteomics. 2003, Vol. 3, pp. 2176-2189.

30. Uzawa HJ Ito H, Neri P, Mori H, Nishida Y. Glycochips from polyanionic glycopolymers as tools for detecting Shiga toxins. Chembiochem. Nov 2007 г., Т. 8, 17, стр. 2117-2124.

31. Delehanty JB, Ligler FS. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal Chem. Nov 2002, Vol. 74, 21, pp. 5681-5687.

32. Heyries KA, Loughran MG, Hoffmann D, Homsy A, Blum LJ; Marquette CA. Microfluidic biochip for chemiluminescent detection of allergen-specific antibodies. Biosens Bioelectron. Jul 2008 г., Т. 23, 12, стр. 1812-1818.

33. Harwanegg C, Hutter S, Hiller R. Allergen microarrays for the diagnosis of specific IgE against components of cow's milk and hen's egg in a multiplex biochip-based immunoassay. Methods Mol Biol. 2007, Vol. 385, pp. 145-157.

34. Jahn-Schmid B, Harwanegg C, Hiller R, Bohle B, Ebner C, Scheiner O, Mueller

35. MW. Allergen microarray: comparison of microarray using recombinant allergens with conventional diagnostic methods to detect allergen-specific serum immunoglobulin E. Clin Exp Allergy. Oct 2003, Vol. 33, 10, pp. 1443-1449.

36. Avseenko NV, Morozova TY, Ataullakhanov FI, Morozov VN. Immunoassay with multicomponent protein microarrays fabricated by electrospray deposition. Anal Chem. Mar 2002, Vol. 74, 5, pp. 927-933.

37. Chen CS, Zhu H. Protein microarrays. Biotechniques. Apr 2006, Vol. 40, 4, pp. 423, 425,427.

38. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat Rev Drug Discov. Apr 2006, Vol. 5, 4, pp. 310-320.

39. Elam JH, Nygren H, Stenberg M. Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces. JBiomedMater Res. Oct 1984, Vol. 18, 8, pp. 953-959.

40. Mansur HS, Orefice RL, Vasconcelos WL, Lobato ZP, Machado LJ. Biomaterial with chemically engineered surface for protein immobilization. J Mater Sci Mater Med. Apr 2005, Vol. 16, 4, pp. 333-340.

41. Angenendt P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. Apr 2005, Vol. 10, 7, pp. 503-511.

42. Flemming C, Gobel H, Wand H, Gabert A, Bock W. Synthesis and properties of immobilized enzymes. X. Covalent binding of polygalacturonase to insoluble carriers. Acta Biol Med Ger. 1978, Vol. 37, 2, pp. 179-189.

43. Brockman A.H., Orlando R. New immobilization chemistry for probe affinity mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrum. 1996, Vol. 10, pp. 1688-1692.

44. Frei E, Levy A, Gowland P, Noll M. Efficient transfer of small DNA fragments from Polyacrylamide gels to diazo or nitrocellulose paper and hybridization. Methods Enzymol. 1983, Vol. 100, pp. 309-326.

45. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarosegels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.f

46. Proc Natl Acad Sei USA. 1977, Vol. 74, 12, pp. 5350-5354.

47. Scott JE, Hughes EW, Shuttleworth A. An 'affinity' method for preparing polypeptides enriched in the collagen-associated Ehrlich chromogen. JBiochem (Tokyo). Mar 1983, Vol. 93, 3, pp. 921-925.

48. Matsuura K, Akasaka T, Hibino M, Kobayashi K. Facile synthesis of stable and lectin-recognizable DNA-carbohydrate conjugates via diazo coupling. Bioconjug Chem. 2000, Vol. 11,2, pp. 202-211.

49. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Acad. Press: San Diego. 1996.

50. Falsey JR, Renil M, Park S, Li S, Lam KS. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays. Bioconjug Chem. 2001, Vol. 12, 3, pp. 346-353.

51. Zhang G, Zhou Y, Wu X, Yuan J, Ren S. Covalent attachment of DNA to glass supports using a new silane coupling agent and chemiluminescent detection. JTongji Med Univ. 2000, Vol. 20, 2, pp. 89-91.

52. Kulaev DV, Zuevsky W, Tsybulskaya MV. Use of silica matrix for immunosorbent preparation. Artif. Organs. 1987, Vol. 11, 6, pp. 503-504.

53. Хохлова ТД, Гаркавенко ЛГ, Никитин ЮС. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах. Прикл. Биохим. Микробиол. 1991 г., Т. 27," 5, стр. 720-724.

54. Lueking A., Horn М., Eickhov Н., Bussow К., Lehrach Н., Walter G. Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal. Biochem. 1999, Vol. 270, pp. 103-111.

55. Macbeth G., Schreiber S.L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 2000, Vol. 289, pp. 1760-1763.

56. Newman J.D., Turner A.P.F. Ink-jet printing for the fabrication of amperometric glucose biosensors. Anal. Chim. Acta. 1992, Vol. 262, pp. 13-17.

57. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High-density oligonucleotide arrays. Biosensors&Bioelectronics. 1996, Vol. 11, pp. 687-690.

58. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., van Dedem G.W.K. Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying. Journal of Aerosol Science. 1999, Vol. 30, pp. 551-552.

59. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., Schalkhammer Т., van Dedem

60. G.W.K. Miniaturized electrospraying as a technique for the production of reproducible micrometer-sized protein spots. Anal Chem. 2001, Vol. 73, pp. 2183-2189.

61. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active substance. Anal. Chem. 1999, Vol. 71, pp. 3110-3117.

62. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films. Anal. Chem. 1999, Vol. 71, pp. 1415-1420.

63. Kumar A., Whitesides G.M. Patterned Condensation Figures as Optical Diffraction Gratings. Appl. Phia. Lett. 1993, Vol. 63, p. 2002.

64. Lahiri J., Ostuni E., Whitesides G.M. Patterning ligands on reactive SAMs microcontact printing. Langmuir. 1999, Vol. 15, pp. 2055-2060.

65. Arenkov P., Alexander Kukhtin, Anne Gemmel, Sergey Voloshchuk, Valentina Chupeeva and Andrei Mirzabekov. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions. Analytical Biochemistry. 2000, Vol. 278, pp. 123-131.

66. Rubina A, Pan'kov SV, Ivanov SM, Dement'eva EI, Mirzabekov AD. Protein microchips. DoklBiochem Biophys. Nov 2001, Vol. 381, pp. 419-422.

67. V.A. Vasiliskov, E.N. Timofeev, S.A. Surzhikov, A.L. Drobyshev, V.V. Shick, and A.D. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gel-ommobilized compounds on a chip by co-polymerization. BioTechniques. 1999, Vol. 27, pp. 592-606.

68. Drobyshev A., Mologina N., Shick V., Pobedimskaya D., Yershov G., Mirzabekov A. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of beta-thalassemia mutations. Gene. 1997, Vol. 188, pp. 45-52.

69. Dubiley S., Kirillov Eu., Mirzabekov A. Polymorphism-analysis and gene detection by mini sequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucl. Acids Res. Sep 1999, Vol.27, 18,p. 27.

70. Tillib S., Strizhkov В., Mirzabekov A. Integration of multiple PCR amplification and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip. Analyt. Biochem. 2001, Vol. 292, pp. 155-160.

71. KrylovA., Zasedateleva O., et al. Massive parallel analysis of the binding specificity of HU protein with ss and ds DNA on generic oligonucleotide microchips. Nucl. Acids Res. 2001, Vol. 29, pp. 2654-2660.

72. Timofeev E., Mirzabekov A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4,096-hexanucleotide microarray. Nucl. Acids Res. 2000 г., Т. 29, 12, стр. 2626-2634.

73. NasedkinaT., Domer P., Zharinov V., Hoberg J:, Lysov Yu., Mirzabekov A. Identification of chromosomal translocation in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Haematologica. 2002, Vol. 87,4, pp. 363-372.

74. Dyukova«V.I., Dementieva E.I., Zubtsov D.A., Galanina OiE., Bovin N.V., Rubina,A.Yu. Hydrogel glycan microarrays. Anal. Biochem. 2005, Vol. 347, pp. 94-105.

75. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические, иммунохимические, биохимические анализы. Пособие для врачей. Макс Пресс. 2003 г.

76. Maruvada.P., Wang W., Wagner P.D., Srivastava S. Biomarkers in molecular medicine: cancer detection and diagnosis. Biotechniques. Suppl. 2005, pp. 9-15.

77. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstration of a new protein fraction in serum from human fetus. Scan. J. Clin. Lab. Invest. 1956, Vol. 8, pp. 174-176.

78. Muralt G., Roulet D.L.A. Immunological study of human.fetal serum proteins. Helv. Pediatr: Acta. 1961, Vol. 16, pp. 517-520.

79. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., Irlin I.S. Production of embryonal alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas. Transplantation. 1963 г., Т. 1,стр: 174-180.

80. Татаринов Ю.С. В кн. I Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы, 2. АН СССР. 1963 г., стр. 274.

81. Bellini G., Bonacci W., Parodi Е., Serra G. Serum alpha-fetoprotein in newborns. Clin. Chem. 1998, Vol. 44, 12, pp. 2548-2550.

82. Ruoslahti E., Seppala M. Studies of carcino-fetal proteins. 3. Development of a radioimmunoassay for a-fetoprotein. Demonstration of a-fetoprotein in serum of healthy human-adults. Int. J. Cancer. 1971, Vol. 8, 3, pp. 374-383.

83. Jones E.A., Clement-Jones M., James O.F., Wilson D.I. Differences between human'and mouse alpha-fetoprotein expression during early development: J. Anat. 2001, Vol. 198, 5, pp. 555-559.

84. Debruyne E.N., Delanghe J.R: Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma, with alpha-fetoprotein: new aspects and applications. Clin. Chim. Acta. 2008, Vol. 395, 1-2, pp. 19-26.

85. Koide N., Nishio A., IgarashiJ., Kajikawa S., Adachi W., Amano J: Alpha-fetoprotein-producing gastric cancer: histochemical analysis of cell proliferation, apoptosis, and angiogenesis. Am. J. Gastroenterol. 1999, Vol. 94, 6, pp: 1658-1663.

86. Ghan M.H., Shing M.M., Poon T.G., Johnson P. J., Lam C.W. Alpha-fetoprotein variants in a case of pancreatoblastoma. Ann. Clin. Biochem. 2000, Vol. 37, 5, pp. 681685.

87. Абелев Г.И. Альфа-фетопротеин взгляд в.биологию развития и природу опухолей. Соросовский образовательный журнал. 1998"г., Т. 9, стр. 8-13.

88. Татаринов Ю: С. Трофобластический бета-гликопротеин. Успехи совр. Биол. 1983 г., Т.95; 1, стр.- 57-64.

89. Ширшев С. В. Цитокины плаценты в регуляции иммуноэндокринных процессов при беременности. Успехи совр. Биол. 1994 г., Т. 114, 2, стр. 223-239.

90. Kawasaki E.S., Clark S.S.*, Coyne M.Y. Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988, Vol. 85, pp. 5698-5702.

91. Pierce J.G., Parsons T.F. Glycoprotein hormones: structure and function. Annu. Rev. Biochem. 1981, Vol. 50, pp. 465-495.

92. Wu H., Lustbader J.W., Liu Y., Canfield R.E., Hendrickson W.A. Structure of human chorionic gonadotropin at 2.6 ? resolution from MAD analysis of the selenomethionyl protein. Structure. 1994, Vol. 2, pp. 545-558.

93. Cole L.A., Kardana A., Park S.-Y., Braunstein G.D. The deactivation of hCG by nicking and dissotiation. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993, Vol. 76, pp. 704-713.

94. Norman R.J., Poulton T., Gard T., Chard T. Monoclonal antibodies to human chorionic gonadotropin: implications for antigenic mapping, immunoradiometric assay, and clinical application. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1985, Vol. 61, pp. 1031-1038.

95. Merkatz I.R., Nitowsky H.M., Macri J.N. Johnson WE. An association between, low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities. Am. J. Obstet-Gynecol. 1984, Vol. 148,№7,pp. 886-894.

96. Bogart H.M., Pandian M.R1, Jones O.W. Gonadotropin levels in pregnancies with fetal chro- mosome abnormalities. Prenat. Diagn. 1987, Vol. 7, pp. 623-630.

97. Wald N.J:, Watt H.C., Hackshaw A.K. Integrated screening for Down's syndrome on the basis of tests performed during the first and second trimesters. The New Engl. J. Med. 1999, Vol. 341, 7, pp. 461-467.

98. Krantz D.A., Larsen J.W., Buchanan P:D. First-trimester Down syndrome screening: free beta-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein A. Am. J. Obstet. Gynecol. 1996, Vol. 174, №2, pp. 612-616:

99. Miller S.M., Isabel J.Mi Prenatal screening tests facilitate risk assessment. MIO. 2002, Vol. 2, pp. 8-19.

100. Cole L.A. New perspectives in measuring human chorionic gonadotropin levels for/ measuring and monitoring trophoblast disease. J. Reprod. Med. 1994, Vol. 39, pp. 193200.

101. Mann K., Sailer. Bl, Hoermann R. Clinical use of HCG and hCG beta determinations. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1993, Vol. 216, pp. 97-104.

102. Hoshi S., Suzuki K., Ishidoya S., Ohyama C., Sato M. Significance of simultaneous determination of serum human chorionic gonadotropin (hCG) and hCG-beta in testicular tumor patients. Int. J. Urol. 2000, Vol. 7, pp. 218-223.

103. Macdonald J.S. Carcinoembryonic antigen screening: pros and cons. Semin. Oncol. 1999, Vol. 26, pp. 556-560.

104. Thomas P., Toth C.A., Saini K.S., Jessup J.M., Steele G. The structure, metabolism and function of carcinoembryonic antigen gene family. Biochim. Biophys. Acta. 1990, Vol. 1032, pp. 177-189.

105. Thompson J.A., Grunet F., Zimmermann W. Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives. J. Clin. Lab. Anal. 1991, Vol. 5, pp. 344-366.

106. Gold P., Freedman S.O. Demonstration of tumor-specific antigen in human colonic carcinomata by immunological tolerance and absorption technique. J. Exp. Med. 1965, Vol. 121, pp. 439-462.

107. Gold P., Freedman S.O. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp. Med. 1965, Vol. 122, pp. 467-481.

108. Boucher D., Cournoyer D., Stanners C.P., Fuks A. Studies on the control of gene expression of the carcinoembryonic antigen family in human tissue. Cancer Res. 1989, Vol. 49, pp. 847-852.

109. Thomson D.M.P., Krupey J., Freedman S.O., Gold P. The radioimmunoassay of circulating carcinoembryonic antigen of the human digestive system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969, Vol. 64, pp. 161-167.

110. Huerta S. Recent advances in the molecular diagnosis and prognosis of colorectal cancer. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2008, Vol. 8, 3, pp. 277-288.

111. Скворцов C.B., Храмченко И.М., Кушлинский H.E. Опухолевые маркеры в оценке степени распространенности опухолевого процесса при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта. Клин. лаб. диагн. 1999 г., Т. 9, стр. 26.

112. Y.C., Lee, et al., et al. Tissue polypeptide antigen and carcinoembryonic antigen as tumor marker in lung cancer. J. Formos. Med. Assoc. 1991, Vol. 90, pp. 631-636.

113. Карпищенко А.И., Антонов В.Г., Бутенко А.Б., Белохвостое А.С., Шелепина Е.П. Онкомаркеры и их диагностическое значение. ВМедА, 1999 г., стр. 47.

114. Sajid K.M., Parveen R., Durr-e-Sabih, Chaouachi К., Naeem A., Mahmood R., Shamim R. Carcinoembryonic antigen (CEA) levels in hookah smokers, cigarette smokers and non-smokers. J. Рак. Med. Assoc. 2007, Vol. 57, 12, pp. 595-599.

115. Tietz. Clinical Guide to Laboratory Tests, б.м.: Elsevier, 2006.

116. Кишкун А. А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. Москва : ООО «медицинское информационное агентство», 2006. стр. 239-271.

117. Таранов А.Г. Иммуноферментные и радиоиммунологические методы анализа. Новосибирск : Лабораторная диагностика, 1995. стр. 96-97.

118. Meier W, Eiermann W, Stieber P, Schneider A, Fateh-Moghadam A, Hepp H. Experiences with SCC antigen, a new tumor marker for cervical carcinoma. Eur J Cancer Clin Oncol. Nov 1989, Vol. 25, 11, pp. 1555-1559.

119. Сергеева H.C., Ермошина H.B., Мишунина М:П. Использование опухолеассоциированных маркеров для диагностики и контроля за эффективностью терапии у больных с распространенным раком яичников. . Москва : МНИОИ им. П.А. Герцена, 2002.

120. Алексеева М.Л., Андреева Е.Н., Фанченко Н:Д. Акушерство и гинекология. 1995 г., Т. 5, стр. 25-28.

121. Алексеева М.Л., Фанченко Н.Д., Новиков Е.А. Опухолевые маркеры в гинекологии. Акушерство и гинекология. 1995 г., Т. 5, стр. 35-37.

122. Sugiyama Т., Nishida Т., Komai К., Nishimura H., Yakushiji M. Comprison of CF 125 assays wits abdominopelvic computed'tomograchy and transvaginal ultrasound in monitoring of ovarien cancer. Int. Gyn. Obstet. 1998, Vol. 54, 3, pp. 251-256.

123. Методическое пособие ЗАО «Биохгшмак». б.м. : Fujirebio Diagnostics, 2008.

124. Лукьянов П.А., Журавлева Н.В. Современная гликобиология и медицина. Вестник ДВО РАН. 2004 г., Т. 3, стр. 24-34.

125. Bon G. G. Clinical relevance of the tumor marker CA 15-3 in the management of cancer patients. Netherlands : Acad Press, 1990. pp. 111-112.

126. Yager W., Kramer S., Palapels V. Breast cancer and clinical utility of CA 15-3 and CEA. Scand О Clin Lab Invest. 1995, Vol. 55, pp. 87-92.

127. Алексеева M. JI., Гусарова,E. В., Муллабаева G. M., Понкратова Т. G. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностического использования. Проблемы репродукции. 2005 г., Т. 3, стр. 65-79.

128. Белохвостое А.С., Новик А.А. Роль молекулярно-генетических маркеров в диагностике солидных опухолей. Вопр. Онкологии. 1999 г., Т. 45, 6, стр. 599-606.

129. Винницкий В.Б., Моисеенко М.Д., Глинских Г.В. Биология маркеров рака и беременности. Киев : Наук, думка, 1990. стр. 252.

130. Daffy M. Y., O'Sullivan F., O'Donoghue D. С A 19-9 a new marker for gastrointestinal malignancy. J. MedSei. 1985, Vol. 154, pp. 385-386.

131. Tempero M., Uchida E., Takasaki H. Relationship of carbohydrate antigen CA 19-9 and Lewis antigen in pancreatic cancer. Cancer Rec. 1987, Vol. 47, pp. 5501-5503.

132. Haglund C., Roberts P. Evaluation of С A 19-9 as a serum tumor marker in pancreatic cancer. Br О Cancer. 1986, Vol. 53, pp. 197-202.

133. Sail F., Rocher R., Bittner R., Beger H.G. CA 19-9 as,a marker for pancreatic cancer. О Tumor Marker Oncol. 1987, Vol. 2, pp. 187-194.

134. Кушлинский H. E. Возможности, неудачи и перспективы исследования опухолевых маркеров.в современной онкологической клинике. Часть 2.

135. Клиническая лабораторная диагностика. 1999 г., Т. 4, стр. 25-32.

136. Hanish.E.G., Uhlenbruck G., Dienst С. CA 125 and CA 19-9: two cancer-associated sialylsacharide antigens on a mucus glycoprotein from human milk. II. Eur J Biochem. 1985, Vol. 149, pp. 323-330.

137. ShetyeJ., Christenson В., Rubio C. The tumor-associated antigens BR 55-2, GA 73-3 and GICA 19-9 in normal and corresponding neoplastic human tissues, especially gastrointestinal tissues. II Anticancer Res. 1989, Vol. 9, pp. 395-404.

138. Walker R., Day S. Expression of the antigen detected by the monoclonal antibody CA 19-9 in human breast tissues. II Virchows Arch. 1986, Vol. A409, 3, pp. 375-383.

139. Loy T.S., Sharp S.C., Andershock C.J., Craig S.B. Distribution of CA 19-9 in adenocarcinomas and transitional cell carcinomas. An immunohistochemical study of 527 cases. II Am J Clin Pathol. 1993, Vol. 99, 6, pp; 726-728.

140. Souchon R., Souchon M.F., Boese-Landgraf J. Clinical experience with the tumor marker CA 19-9 in an unselected group of more 300 tumor patients. II Cancer Detect and Prey. 1985, Vol. 8, 12, pp. 101-109.

141. Ferrigno D., Buccheri G., Giordano С. Neuronspecific enolase is an effective tumour marker in non-small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer. 2003, Vol. 41, pp. 311-320.

142. Sung H.J., Cho J.Y. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics. BMBRep. 2008, Vol. 41, 9; pp. 615-625.

143. Riley R:D., Heney D:, Jones D.R., Sutton A.J., Lambert P.C., Abrams K.R., Young В., Wailoo A. J., BurchillS.A. A systematic review of molecular and.biological tumor markers in neuroblastoma. Clin. Cancer Res. 2004, Vol. 10, 1, pp. 4-12.

144. Poyner R.R., Cleland W.W., Reed G.H. Role of metal ions in catalysis by enolase: an ordered kinetic mechanism for a single substrate enzyme. Biochemistry. 2001, Vol. 40, 27, pp. 8009-8017.

145. Kaiser. E., Kuzmits R., Pregant P., Burghuber O., Worofka W. Clinical biochemistry of neuron specific enolase. Clin. Chim. Acta. 1989, Vol. 183, 1, pp. 13-31.

146. Andoh M., Gemma A., Takenaka K., Hisakatsu S., Yamada K., Usuki J., Hasegawa K., Sakonji M., Kudoh S., Tsuboi E. Serum Neuron Specific Enolase Level as a Prognostic Factor in Non-Small Cell Lung Cancer. Intern. Med. 1994, Vol. 33, 5, pp. 271-276.

147. Society, American Cancer. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. 2006.

148. Ablin R.J., Soanes W.A., Bronson P., Witebsky E. Precipitating antigens of the normal human prostate. J. Reprod. Fertil. 1970, Vol. 22, 3, pp. 573-574.

149. Wang M.C., Valenzuela L.A., Murphy G.P., Chu T.M. Purification of a human prostate specific antigen. Invest. Urol. 1979 г., Т. 17, 2, стр. 159-163.

150. Papsidero L.D., Wang M.C., Valenzuela L.A., Murphy G.P., Chu T.M. A prostate antigen in sera of prostatic cancer patients. Cancer Res. 1980, Vol. 40, 7, pp. 2428-2432.

151. Partin A.W., Oesterling J.E. The clinical usefulness of prostate specific antigen: update 1994. J. Urol. 1994, Vol. 152, 5, pp. 1358-1368.

152. Pollen. J.J^ Dreilinger A. Immunohistochemical identification of prostatic acid-phosphatase and prostate specific antigen in female periurethral glands. Urology. 1984 г., Т. 23, 3, стр. 303-304.

153. Young F., LiX,Ellet J: Regions of prostate specific antigen (PSA) promoter confer androgen -independent expression of PSA in prostate cancer cell: J. Biol. Chem. 2000, Vol. 275; 52, pp. 40486-40855.

154. Lilja H., Christensson A., Dahlen U., Matikainen M.T., NilssonO:, Pettersson K., Lovgren T. Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1 -antichymotrypsin. Clin. Chem. 1991, Vol. 37, 9, pp. 1618-1625.

155. Lilja H. Structure, function, and regulation of the enzyme activity of prostate-specific antigen. World. J. Urol. 1993-, Vol. 11, 4, pp. 188-191.

156. Gonzalgo M.L., Carter H.B. Update on PSA testing. J. Natl. Compr. Cane. Netw. 2007, Vol. 5, 7, pp. 737-742.

157. Margot H. Black, Maurizia Giai, Riccardo Ponzone, Piero Sismondi, He Yu, and Eleftherios P. Diamandis. Serum Total and Free Prostate-specific Antigen for Breast Cancer Diagnosis in Women. Clinical Cancer Research. 2000, Vol. 6, pp. 467473.

158. Резников Ю. П., Мазанов Г. П., Седова Т. Н. Оценка соотношения свободного и общего сывороточного простатического специфического антигена как дополнительного метода в диагностике рака простаты. Урология. 1996, Vol. 6,, pp. 41-43.

159. Карпищеико А.И., Антонов B.F., Бутенко А.Б., Белохвостое А.С., Шелешша Е.П. Онкомаркеры и га диагностическое значение. Санкт-Петербург : ВМедА, 1999; стр. 47.

160. Шелепова B;M. Использование опухолевых маркеров для выявления» локализации первичной опухоли у пациентов с метастазами неизвестного-происхождения. Российский биотерапевтический журнал. 2002 г., Т. 1, 3, стр. 3440. •

161. Carpelan-Holmstrom M., Louhimo J., Stenman U.H., Alfthan H., Jarvinen H., Haglund C. Estimating the probability of cancer with several tumor markers in patients with colorectal disease. Oncology. 2004 r., T. 66, 4, CTp. 296-302.

162. Bacarese-HamiltonT., Mezzasoma L., Ingham C., Ardizzoni A., Rossi R., Bistoni F., Crisanti A. Detection of allergen-specific IgE on microarrays by use of signal amplification techniques. Clin. Chem. 2002, Vol. 48, pp. 1367-1370.

163. Huang R.P. Cytokine protein arrays. Methods Mol. Biol. 2004, Vol. 264, pp. 215231.

164. Zhou X., Zhou J. Antibody-microarrays on hybrid polymeric thin film-coated slides for multiple-protein immunoassays. Methods Mol. Biol. 2007, Vol. 382, pp. 259271.

165. Haab B.B. Methods and applications of antibody microarrays in cancer research. Proteomics. 2003, Vol. 3, 11, pp. 2116-2122.

166. Bacarese-Hamilton T., Mezzasoma L., Ardizzoni A., Bistoni F., Crisanti A.

167. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. J. Appl. Microbiol. 2004, Vol. 96, pp. 10-17.

168. Feng Y., Ke X., Ma R., Chen Y., Hu G., Liu F. Parallel detection of autoantibodies with microarrays in rheumatoid diseases. Clin. Chem. 2004, Vol. 50,2, pp. 416-422.

169. Miller J.C., Zhou H., Kwekel J., Cavallo R., Burke J., Butler E.B., Teh B.S., Haab B.B. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera. Proteomics. 2003, Vol. 3, pp. 56-63.

170. Sreekumar A., Chinnaiyan A.M. Using protein microarrays to study cancer. BioTechniques. 2002, Vol. 1, pp. 46-53.

171. Nielsen U.B., Geierstanger B.H. Multiplexed sandwich assays in microarray format. J. Immunol. Methods. 2004, Vol. 290, pp. 107-120.

172. Ligler F.S., Taitt C.R., Shriver-Lake L.C., Sapsford K.E., Shubin Y., Golden

173. J.P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 2003, Vol. 377, pp. 469-477.

174. Ngundi M.M., Taitt C.R., McMurry S.A., Kahne D., Ligler F.S. Detection of bacterial toxins with monosaccharide arrays. Biosens. Bioelectron. 2006, Vol. 21, 7, pp. 1195-1201.

175. Wingren C., Borrebaeck C.A. Antibody microarrays: current status and key technological advances. OMICS. 2006, Vol. 10, 3, pp. 411-427.

176. Sun Z., Fu X., Zhang L., Yang X., Liu F., Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. Anticancer Res. 2004, Vol. 24, 2, pp. 1159-1165.

177. Chen C., Chen L.Q., Yang G.L., Li Y. Value of tumor markers in diagnosing and monitoring colorectal cancer and strategies for further improvement: analysis of 130 cases. Ai. Zheng. 2007, Vol. 26, 11, pp. 1221-1226.

178. Chen C., Chen L.Q., Yang G.L., Li Y. The application of C12 biochip in the diagnosis and monitoring of colorectal cancer: Systematic evaluation and suggestion for improvement. J. Postgrad. Med. 2008, Vol. 54, 3, pp. 186-190.

179. Chen C., Chen L.Q., Chen L.D., Yang G.L., Li Y. Evaluation of tumor markers biochip C12 system in the diagnosis of gastric cancer and the strategies for improvement: analysis of 100 cases. Hepatogastroenterology. 2008, Vol. 55, 84, pp. 991-997.

180. Wilson M.S., Nie W. Multiplex measurement of seven tumor markers using an electrochemical protein chip. Anal. Chem. 2006, Vol. 78, pp. 6476-6483.

181. Song S.-P., Li B., Hu J., Li M.-Q. Simultaneous multianalysis for tumor markers by antibody fragments microarray system. Analytica ChimicaActa. 2004, Vol. 510, pp. 147-152.

182. Jie Wu, Feng Yan, Xiaoqing Zhang, Yuetian Yan, Jinhai Tang, and Huangxian

183. Ju. Disposable Reagentless Electrochemical Immunosensor Array Based on a

184. Biopolymer/Sol-Gel Membrane for Simultaneous Measurement of Several Tumor Markers. Clinical Chemistry. 2008, pp. 1481-1488.

185. Zhang B, Zhang X, Yan HH, Xu SJ, Tang DH, Fu WL. A novel multi-array immunoassay device for tumor markers based on insert-plug model of piezoelectric immunosensor. Biosens Bioelectron. Aug 2007, Vol. 23, 1, pp. 19-25.

186. Wiese R., Belosludtsev Y., Powdrill Т., Thompson P., Hogan M. Simultaneous multianalyte ELISA performed on microarray platform. Clinical Chemistry. 2001, Vol. 47, 8, pp. 1451-1457.

187. В.Р.Чечеткин, Д.В.Прокопенко, А.А.Макаров, А.С.Заседателев. Биочипы для медицинской диагностики. Российские нанотехнологии. 2006 г., Т. 1, 1-2, стр. 13-27.

188. Joseph R. Lakowicz. Radiative decay engineering 5: metal-enhanced fluorescence andplasmon emission. Analytical Biochemistry. 2005, Vol. 337, pp. 171-194.

189. Drexhage K.H. Influence of a dielectric interface on fluorescence decay time. J. Luminesc. 1970, Vols. 1-2, pp. 693-701.208. —. Progress in OpticsXII. ed. E. Wolf. Amsterdam,: s.n., 1974. p. 165.

190. Ignacy Gryczynski, Joanna Malicka, Yibing Shen, Zygmunt Gryczynski, and Joseph R. Lakowicz. Multiphoton Excitation of Fluorescence near Metallic Particles: Enhanced and Localized Excitation. J Phys. Chem. 2002, Vol. 106, pp. 2191-2195.

191. Joanna Malicka, Ignacy Gryczynski, and Joseph R. Lakowicz. DNA hybridization assays using metal-enhanced fluorescence. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2003, Vol. 306, pp. 213-218.

192. Joanna Malicka, Ignacy Gryczynski, and Joseph R. Lakowicz. Enhanced Emission of Highly Labeled DNA Oligomers near Silver Metallic Surfaces. Anal. Chem. 2003, Vol. 75, pp. 4408-4414.

193. Joanna Malicka, Ignacy Gryczynski, Jiyu Fang, and Joseph R. Lakowicz.

194. Fluorescence spectral properties of cyanine dye-labeled DNA oligomers on surfaces coated with silver particles. Analytical Biochemistry. 2003, Vol. 317, pp. 136-146.

195. Zhi ZL, Powell AK, Turnbull JE. Fabrication of carbohydrate microarrays on gold surfaces: direct attachment of nonderivatized oligosaccharides to hydrazide-modified self-assembled monolayers. Anal Chem. 2006, Vol. 78, 14, pp. 4786-4793.

196. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. Москва : Мир, 1986.

197. Е. Le Moal, Е. Fort, S. Lefveque-Fort, F. P. Cordelie' res, M.-P. Fontaine-Aupart, and C. Ricolleau. Enhanced Fluorescence Cell Imaging with Metal-Coated Slides. Biophysical Journal. Mar 2007, Vol. 92, pp. 2150-2161.

198. Kadir Asian, Ignacy Gryczynski, Joanna Malicka, Evgenia Matveeva,, Joseph R Lakowicz and Chris D Geddes. Metal-enhanced fluorescence: an* emerging tool in biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 2005, Vol. 16, pp. 55-62.

199. Chandran R. Sabanayagam and Joseph R. Lakowicz. Increasing the sensitivity of DNA microarrays by metal-enhanced fluorescence using surface-bound silver anoparticles. Nucleic Acids Research. 2007, Vol. 35, 2.

200. Mathias PC, Ganesh N, Cunningham ВТ. Application of photonic crystal enhanced fluorescence to a cytokine immunoassay. Anal Chem. 1, 2008, Vol. 80, 23, pp. 9013-9020.

201. Christopher Lausted, Zhiyuan Hu and Leroy Hood.,. Quantitative Serum Proteomics from Surface Plasmon Resonance Imaging. Mol Cell Proteomics. 2008, Vol. 7, 12, pp. 2464-2474.

202. Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A. Fluorescence data analysis on gel-based biochips. J. Biomol. Screening. 2007, Vol. 7, pp. 247-257.

203. Шелепова B.M., Кадагидзе З.Г. Опухолевые маркеры в современной клинической практике. Вестник Московского Онкологического Общества. 2007 г., Т. 1.

204. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JL Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров. ДАН. 2004 г., Т. 395, стр. 542-547.

205. D. Wild: The Immunoassay handbook, s.l. : ELSEVIER Ltd, 2005. ISBN: 0-08044526-8.

206. В.П. Земляной, Т.Н. Трофимова, C.JI. Непомнящая, T.B. Дементьева.

207. Современные методы диагностики и оценки степени распространенности рака ободочной и прямой кишки. Практическая онкология. . 2005 г., Т. 6, 2.

208. Джонсон Н., Лион Ф.Статистика и планирование эксперимента в технике и науке. Методы обработки данных. Москва : Мир, 1980.

209. U. Sauer, С. Preininger, G. Krumpel, N. Stelzer, W. Kern. Signal enhancement, of protein chips. Sensors and Actuators. 2005, Vol. 107, pp. 178-183.

210. C.R. Sabanayagam, J.R. Lakowicz. Increasing the sensitivity of DNA microarrays by metal-enhanced fluorescence using surface-bound-silver nanoparticles. Nucleic Acids Res. 2007, Vol. 35, p. 13.

211. C.M. Strohsahl, BiL. Miller, T.D. Krauss. Preparation'and use of metal surface-immobilized DNA hairpins for the detection of oligonucleotides. Nature Protocols. 2007, Vol. 2, pp. 2105-2110.

212. G.W. Ford, W.H. Weber. Electromagnetic interactions of molecules with metal surfaces. Phys. Rep. 1984, Vol. 113, 4, pp. 195-287.

213. Yu.V. Prokopenko, Yu.F. Filipov, I.A. Shipilova, V.M. Yakovenko. Whispering gallery modes in* a hemispherical-isotropic dielectric resonator with a perfectly conducting planar surface. Technical Physics. 2006, Vol. 51, pp. 248-257.

214. D.A. Zubtsov, E.N. Sawateeva, A.Yu. Rubina,,S.V. Pan'kov, E.V. Konovalova, O.V. Moiseeva, V.R. Chechetkin, A.S. Zasedatelev. Comparison of surface and, hydrogel-based protein'microchips. Anal. Biochem. 2007, Vol. 368, pp. 205-213.

Информация о работе

Зубцова, Жанна Исхаковна
кандидата физико-математических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы