Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Одновременный количественный иммуноанализ маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови на биологическом микрочипе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Одновременный количественный иммуноанализ маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови на биологическом микрочипе"

Ü03453067

на правах рукописи

Савватеева Елена Николаевна

ОДНОВРЕМЕННЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ МАРКЕРОВ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

f I г. Г. Г 1

-о

Москва 2008

003453067

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской Академии Наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН.

А. Ю. Рубина

Бовин II. В. Демидкина Т. В.

Ведущая организация:

Всероссийский научный центр Молекулярной Диагностики и Лечения

Научный руководитель: кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор химических наук

Защита диссертации состоится ^ 2008 г. в __ ч. на заседании

Диссертационного совета Д002.235.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН по адресу 119991, г. Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН

Автореферат разослан _

^кСи'Лл

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФА - иммуноферментный анализ ПСА - простат-специфический антиген

ПСАсвоб - свободная форма простат-специфического антигена

ПСАобщ - общая форма простат-специфического антигена

АФП - альфа-фетопротеин

РЭА - раково-эмбриональный антиген

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

НСЕ - нейрон-специфическая енолаза

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Своевременная диагностика - одна из основных проблем онкологии. В настоящее время для ранней диагностики первичной опухоли и ее метастазов, а также мониторинга проводимой терапии широко используется определение онкомаркеров в сыворотке крови. Идеальный опухолевый маркер должен обладать высокой специфичностью и чувствительностью в отношении определенного вида опухоли, однако большинство известных в настоящее время опухолевых маркеров не отвечает этим критериям. Одновременное определение нескольких онкомаркеров повышает эффективность скринингового анализа и увеличивает возможности дифференциальной диагностики заболеваний. Большинство иммунохимических методов позволяет выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, поэтому в настоящее время большие надежды в области диагностики рака связывают с использованием мультиплексных систем, таких как микрочипы.

В данной работе предложен новый метод, позволяющий проводить одновременное количественное определение шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови с использованием трехмерных гидрогелевых биочипов.

В иммунодиагностических системах, основанных на «сэндвич»- принципе анализа, при высоких концентрациях аналита в пробе возможно возникновение так называемого хук-эффекта, при котором зависимость величины регистрируемого сигнала на твердой фазе от концентрации аналита становится обратно пропорциональной. В традиционных тест-системах проявление хук-эффекга можно выявлять и контролировать, только используя последовательные разведения анализируемого образца.

В данной работе впервые продемонстрирована возможность выявлять хук-эффект непосредственно при проведении анализа, что позволяет избежать искажения диагностической картины при высоких концентрациях аналита в пробе.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы является разработка метода одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать биологический микрочип с ковалентно иммобилизованными в гидрогеле антителами и антигенами, позволяющий проводить одновременный количественный анализ шести онкомаркеров в сыворотки крови.

2. Разработать протокол проведения иммуноанализа онкомаркеров на биочипе.

4

3. Оценить аналитические и диагностические характеристики одновременного количественного иммуноанализа онкомаркеров на биочипе.

4. Разработать способ контроля хук-эффекта.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В представленной работе впервые показана возможность одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека методом иммунофлуоресцентного анализа на трехмерных гидрогелевых биочипах. Создан биочип, содержащий как иммобилизованные антитела против анализируемых онкомаркеров, так и иммобилизованные антигены (онкомаркеры). Предложен оригинальный метод, позволяющий проводить на биологическом микрочипе одновременно одностадийный количественный иммуноанапиз онкомаркеров (общей и свободной форм простат-специфического антигена (ПСАобщ и ПСАсвоб), альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионального антигена (РЭА), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), нейрон-специфической енолазы (НСЕ)) и выявлять хук-эффект. Исследованы факторы, влияющие на проявление хук-эффекта, и определены параметры, позволяющие проводить анализ результатов в автоматическом режиме. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода: аналитическая чувствительность, воспроизводимость, значения «открытия» и «линейности» и показано, что полученные аналитические характеристики одновременного определения шести онкомаркеров на биочипе полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к традиционным иммунологическим тест-системам. Проведено тестирование разработанного метода с использованием сывороток крови больных онкологическими заболеваниями и здоровых доноров и показано, что результаты одновременного количественного определения шести онкомаркеров в образцах сывороток крови на биочипах хорошо коррелируют с результатами коммерческих ИФА тест-систем. На основании разработанного метода был создан набор реагентов ОМ-БИОЧИП, который прошел медицинские испытания в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, ГУ Российском Научном Центре Хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН, ФГУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента Российской Федерации и технические приемочные испытания в Институте стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ "НЦ

ЭСМП" Росздравнадзора. Набор реагентов ОМ-БИОЧИП для одновременного определения шести онкомаркеров рекомендован для применения в клинической практике РФ.

АППРОБАЦИЯРАБОТЫ

Результаты данной работы докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая, 200В, Новосибирск). Также были представлены на XX молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (11-15 февраля, 2008, Москва) и 16 международном конгрессе по противораковой терапии (1-4 февраля, 2005, Париж, Франция). Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН.

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, 9 тезисов, подана заявка на получение патента

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, трех глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на /^страницах машинописного текста, содержит ^^рисунков и ¿таблиц. Библиография включаетнаименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Биологические микрочипы (биочипы) Биочипы - массивы индивидуальных микроэлементов, содержащих различные молекулярные зонды - в отличие от стандартных методов позволяют проводить многопараметрический анализ образцов. В данной работе использованы трехмерные гидрогелевые биочипы, изготовленные по технологии, разработанной в Институте молекулярной биологии им. В.А Энгельгардга РАН под руководством академика А. Д. Мирзабекова. В основе технологии гпдрогелевых биочипов лежит метод фотоиндуцируемой (»полимеризации. Технология универсальна и позволяет изготавливать биочипы, содержащие различные по своей природе иммобилизованные зонды: ДНК, РНК, белки, сахариды и пр. При изготовлении биочипа на подложку (стекло, пластик или металл) с помощью робота наносят смесь иммобилизуемого зонда и гелеобразующих

мономеров. Иммобилизация зондов протекает одновременно с полимеризацией геля при облучении ультрафиолетовым светом определенной длины волны, при этом происходит ковалентное связывание зонда с компонентами растущей полимерной цепи. Иммобилизуемые соединения под действием свободных радикалов вступают во взаимодействие с бифункциональными гелеобразующими мономерами, которое происходит с участием амино-, сульфгидрильных или других активных групп, при этом белки, в отличие от олигонуклеотидов или Сахаров не нуждаются в предварительной модификации, поскольку содержат в своей структуре эти активные функциональные группы (лизины, цистеины и др.). После завершения процесса полимеризации каждый иммобилизованный молекулярный зонд закреплен в полимерной сетке геля и равномерно распределен в объеме гелевого элемента биочипа Число гелевых элементов и их расположение на подложке могут варьироваться и определяются задачей и условиями планируемого эксперимента.

В нашей работе использованы микрочипы с иммобилизованными белками, для которых был подобран оптимальный состав полимеризационной смеси, обеспечивающий достаточную для диффузии исследуемых белков пористость геля и позволяющий проводить все типы иммунологических реакций на микрочипе.

2. Биочип для одновременного количественного анализа шести опкомаркеров

Целью нашей работы являлось создание метода одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови на биологическом микрочипе. В качестве объектов были выбраны следующие серологические маркеры: ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА, ХГЧ и НСЕ (Табл. I).

Таблица 1. Онкомаркеры. анализируемые на гидрогелевых биочипах.

Онкомаркер Концентрация в крови в норме Заболевание, при котором концентрация маркера в крови повышена Диапазон определения на биочипах Аналитическая чувствительность определения на биочипах

Простата-специфический антиген Общая форма Свободная форма До 4 нг/мл (мужчины до 50 лет) ПСАсюб/ПСАобщ > 0.15 Рак простаты 0.3-70 нг/мл 0.2-60 нг/мл 0.3 нг/мл 0.2 нг/мл

Альфа-фетопротеин До 10 нг/мл (у мужчин и небеременных женщин) Рак печени и органов репродуктивной системы 1.0-600 нг/мл 1.0 нг/мл

Раково-эмбриональный антиген < 5 нг/мл < 10 нг/мл (для курящих) Рак желудочно-кишечного тракта, рак легких, рак печени 0.5-100 нг/мл 0.5 нг/мл

Хорионический гонадотропин < ЮМЕ/л (у мужчин и небеременных женщин) Рак органов репродуктивной системы, рак желудочно-кишечного тракта 3.0-400 МЕ/л 3.0 МЕ/л

Нейрон-специфическая енолаза < 12.5 нг/мл Мелкоклеточный рак легких, опухоли нейроэндокринног о происхождения 2.0-150 нг/мл 2.0 нг/мл

2.1. Выбор пары моноклональных антител для проведения «сэндвич»-анализа на биочипе (скрининг)

Технология биочипов позволяет проводить одновременный анализ образца по многим параметрам. Это преимущество можно использовать, в частности, для выбора оптимальной пары моноклональных антител для проведения «сэндвич»-анализа. Специфичность, чувствительность, форма калибровочных кривых, динамический диапазон концентраций и дискриминационное соотношение сигнал: шум «сэндвич»-анализа во многом определяется свойствами используемых иммобилизованных и проявляющих антител (так называемой пары антител). В нашей работе для каждого онкомаркера мы использовали пару моноклональных антител, специфичных к разным эпитопам антигена.

8

Необходимо отметить, что выбор пар антител в случае одновременного анализа нескольких онкомаркеров усложняется, поскольку для каждого онкомаркера необходимо выбрать такие пары антител, которые не имеют перекрестной реактивности с другими антителами, используемыми в анализе, а также не взаимодействуют с другими определяемыми онкомаркерами.

Выбор оптимальной пары антител для каждого антигена проводили по следующей схеме: для каждого антигена создавали биочип, на котором иммобилизовали панель антител к данному антигену; параллельно получали конъюгаты каждого из имеющихся к данному антигену антител с флуоресцентным красителем. «Сэндвич»-иммуноанализ на биочипе проводили с последовательным использованием в качестве проявляющего антитела каждого из флуоресцентно-меченых антител. Таким образом, в одном эксперименте получали данные для каждой возможной пары антител. После этого сравнивали чувствительность анализа, форму калибровочных кривых, динамический диапазон концентраций (линейный участок калибровочной кривой) и соотношение сигнал: шум для каждой из пар антител. Таким образом, была выбрана оптимальная пара антител для каждого онкомаркера, а именно, пара, обладающая максимальной дискриминацией между нулевым и каждым значимым сигналом, а также дающая наиболее выраженный линейный участок калибровочной кривой.

Следующим этапом работы была проверка специфичности выбранных пар антител: отсутствия перекрестной реактивности с другими выбранными антителами, а также отсутствие взаимодействия с другими определяемыми онкомаркерами. Специфичность отражает степень достоверности выявления анализируемого вещества по сравнению с другими компонентами пробы. Проверку специфичности выбранных пар антител проводили на биочипе с иммобилизованными антителами против каждого из шести онкомаркеров по следующей схеме: сначала проводили индивидуальный «сэндвич»-иммуноанализ каждого онкомаркера с проявкой антителом против данного онкомаркера, затем индивидуальный анализ каждого онкомаркера с проявкой смесью антител против всех шести онкомаркеров и, наконец, одновременный анализ смеси шести онкомаркеров с проявкой смесью антител против всех шести онкомаркеров. При наличии неспецифических сигналов заменяли пару антител, имеющую перекрестные взаимодействия и вновь проверяли специфичность выбранных пар антител для проведения одновременного анализа шести онкомаркеров.

2.2. Разработка процедуры одновременного количественного анализа шести онкомаркеров

На основании выбранных пар моноклональных антител был сконструирован биочип для количественного иммуноанализа шести маркеров онкологических заболеваний, структура которого приведена на рис. 1. В правой части чипа расположены гелевые элементы, содержащие иммобилизованные моноклональные антитела против анализируем ых онкомаркеров (ХГЧ, АФП, РЭА, ПСАсвоб, ПСАобщ, и НСЕ) по 4 одинаковых элемента в ряду. На биочипе также находятся элементы с иммобилизованными антигенами РЭА, ПСА, ХГЧ и АФП, флуоресцентные сигналы с которых также учитываются при обработке результатов иммуноанализа для выявления хук-эффекга. В структуру биочипа не включен антиген НСЕ, поскольку из-за высокой лабильности фермента к настоящему моменту нам не удалось получить значимые флуоресцентные сигналы от иммобилизованного НСЕ. По краям биочипа нанесены маркерные точки, содержащие флуоресцентный краситель Су5, для ориентации биочипа при проведении измерений.

Иммобилизованные антигены:

РЭА

ЯШ

■¡¡ш

ПСА

I НИК!

ХГЧ

И—-о |;Г::Ч »

АФП Г - —-------:

1--*» I > I

ПустоГ'.."-" (-^'И

Уш^А}' ТТТ

Иммобилизованные антитела против:

УТТ] . МАЬХГЧ

"г

"'1-

МАЬ АФП

МАЬРЗА,

?-----МАЬ ПСАСВ(

>4 >- * *Т

МАЬ ПСА.

' ЙЖьЛ*"'. Iй*' " *!

ш1т

общ

МАЬ НСЕ

Рис. 1. Биочип для анализа онкомаркеров. Фотография в проходящем свете. Биочип содержит гелевые элементы (по четыре одинаковых элемента в ряду) с иммобилизованными моноклонапьными антителами против шести онкомаркеров, иммобилизованными антигенами и пустые гели По краям биочипа расположены четыре маркерные точки, содержащие краситель Су5.

При разработке биочипа и способа иммуноанализа была поставлена задача максимально упростить процедуру проведения анализа и получения результатов так, чтобы сделать ее удобной для использования в лаборатории, клинике и др.

В процессе изготовления производится отмывка гелевых элементов биочипа от незаполимеризовавшихся мономеров, а также обработка блокировочным раствором, уменьшающим неспецифические связывания. Таким образом, биочип полностью подготовлен к проведению анализа.

Нами был использован одностадийный «сэндвич»-иммуноанализ с флуоресцентной регистрацией сигнала. Условия проведения одностадийного «сэндвич»-анализа

(концентрация иммобилизованных на биочипе и проявляющих антител, состав калибровочных проб, температура и время инкубации, соотношение объемов проявляющие антитела: образец) подбирали таким образом, чтобы полученный метод обладал необходимыми для клинического применения аналитическими характеристиками.

Процедура проведения анализа была максимально упрощена: раствор проявляющих флуоресцентно-меченых антител добавляли к анализируемому образцу (или калибровочной пробе) и инкубировали на биочипе; после процедуры отмывки производили регистрацию флуоресцентных сигналов. Флуоресцентные измерения проводили с использованием портативного флуоресцентного анализатора биочипов с возбуждением при помощи лазера с использованием фильтров 650/670 нм (возбуждение/регистрация), разработанного в ИМБ РАН (Регистрационное удостоверение № ФС 022а2004/0865-04) Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала от каждой ячейки биочипа проводили с помощью программного обеспечения 1п^е1А5зау (ИМБ, Москва). При анализе полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых ячеек.

Для количественного определения концентрации антигена методом иммуноанализа на биочипе необходимо получить график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела, от концентрации соответствующего антигена в калибровочной пробе (калибровочную кривую). Для упрощения процедуры анализа калибровочные пробы содержали одновременно все шесть анализируемых антигенов (онкомаркеров) в диапазонах концентраций, необходимых для проведения клинического анализа в сыворотке крови. Нулевая калибровочная проба не содержала ПСА, АФП, РЭА, ХГЧ и НСЕ. В качестве проявляющих антител использовали смесь антител против всех шести онкомаркеров, и при постановке анализа получали одновременно шесть калибровочных кривых.

При автоматической обработке результатов анализа программа 1п^е1А55ау (ИМБ, Москва) на основе полученных изображений биочипов с калибровочными пробами строит шесть калибровочных кривых по концентрациям онкомаркеров в калибровочных пробах и соответствующим флуоресцентным сигналам, полученным от ячеек с иммобилизованными антителами. Для построения калибровочных кривых использовали кусочно-линейную интерполяцию. Концентрацию каждого онкомаркера в сыворотке крови определяли по соответствующей калибровочной кривой.

Для того, чтобы правильно определить концентрацию онкомаркера в сыворотке крови, важно избежать так называемого эффекта матрикса, когда на результат анализа влияет окружение, в котором находится анализируемое вещество. Необходимо, чтобы

И

анализируемое вещество в образце взаимодействовало с иммобилизованными на биочипе и проявляющими антителами в тех же условиях, что и в калибровочных пробах, поэтому калибровочные пробы для анализа шести онкомаркеров изготавливали на основе сыворотки крови человека. При необходимости разведения сывороток с высокими концентрациями онкомаркеров использовали нулевую калибровочную пробу.

2.3. Характеристики количественного анализа шести онкомаркеров на биочипах

Для оценки воспроизводимости и аналитической чувствительности анализа была проведена серия экспериментов на шестидесяти биочипах (десять калибровочных кривых). Калибровочные кривые для определения онкомаркеров, полученные на биочипах, показаны на рис. 2.

23.1. Воспроизводимость анализа

Для повышения воспроизводимости анализа биочип содержит четыре одинаковых гелевых ячейки для каждого иммобилизованного белка, и интенсивность флуоресценции рассчитывается как медианный сигнал. К оценке качества биочипов предъявляются высокие требования: при производстве отбраковывают биочипы, отклонения от среднего значения диаметра ячеек которых превышают 5% внутри биочипа и 8% между биочипами. Кроме того, максимально простая методика постановки анализа и автоматический обсчёт результатов анализа позволили свести к минимуму вероятность мануальных ошибок. Коэффициент вариации для различных концентраций определяемых антигенов не превышал 15%.

23.2. Аналитическая чувствительность

Одной из основных характеристик количественного анализа является чувствительность. Аналитическую чувствительность анализа, наименьшую определяемую концентрацию каждого онкомаркера, рассчитывали как концентрацию, соответствующую значению флуоресценции, превышающему не менее чем на два стандартных отклонения флуоресцентный сигнал многократно измеренной (десять раз) нулевой калибровочной пробы (рис. 2). Полученные значения приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, анализ онкомаркеров с помощью биочипов обладает необходимой для клинического применения чувствительностью определения для каждого исследуемого онкомаркера.

20 40 60 [ПСА общ], нг/мл

20 40

[ПСА своб], нг/мл

100 200 300 [ХГЧ|, МЕ/л

400

25 50 75 [РЭА], нг/мл

Рис. 2. «Сэндвич»-иммуноанализ ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА, ХГЧ и НСЕ. Графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела, от концентрации соответствующего антигена в калибровочной пробе (калибровочные кривые). Каждая точка калибровочной кривой — среднее значение из измерений на десяти биочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. На вставках приведены начальные участки соответствующих кривых, используемые для определения аналитической чувствительности анализа для каждого онкомаркера.

2.33. Тест на «открытие»

Тест на "открытие" - это определение количества антигена в пробе, полученной при смешивании равных объемов калибровочной пробы и анализируемого образна биологического материала с известной концентрацией антигена.

Этот тест является одним из основных для решения вопроса о специфичности и правильности определения. Важность этого теста заключается также и в том, что при его постановке происходит сравнение того, как взаимодействует анализируемый антиген, находящийся в образце, и анализируемый антиген, находящийся в калибровочной пробе, с антителами. Если они взаимодействует по-разному, то это явление называется "матриксным эффектом", в результате чего появляются систематические ошибки.

При постановке теста на "открытие" смешивали равные объемы калибровочной пробы и образца сыворотки крови с известными концентрациями онкомаркеров. Тест на "открытие" проводили в десяти повторностях. В пробе, полученной таким образом, определяли концентрацию анализируемого антигена и сравнивали ее с расчетным значением по формуле (1):

калибровочному графику; С

- расчетное значение концентрации анализируемого антигена в пробе ОТ.

Значения «открытия» дая каждого из шести онкомаркеров при одновременном анализе на биочипах находились в пределах 90-110%, что полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммуноаналитическим системам.

23.4. Тест на «линейность»

Проведение этого теста заключается в последовательных разведениях калибровочной пробы с максимальным содержанием антигена, соответствующих разведениям калибровочного графика, с последующим сравнением полученных результатов с ожидаемым при этом разведении содержанием анализируемого антигена. Разведение производили с таким расчетом, чтобы тест охватывал все участки калибровочного графика, поэтому наряду с максимальной калибровочной пробой использовали калибровочные пробы со средним и низким содержанием анализируемого

(1)

где:

ОТ - "открытие", %; С

- концентрация анализируемого антигена в пробе ОТ, полученная по

вещества Для разведения использовали нулевую калибровочную пробу. Тест на "линейность" проводили в десяти повторностях. В пробах, полученных таким образом, определяли концентрацию анализируемого антигена, умножали на коэффициент разведения и сравнивали ее с расчетным значением по формуле (2):

калибровочному графику;

Стгор - расчетное значение концентрации анализируемого антигена в пробах Л.

Тест на "линейность" позволяет оценить правильность работы системы на всех участках калибровочного графика и выявить систематические ошибки, связанные с различной специфичностью анализа на каждой стадии калибровки.

Значения «линейности» для каждой пробы на линейность каждого из шести онкомаркеров при одновременном анализе на биочипах находились в пределах 90-110%, что полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммуноаналитическим системам.

3. Определение содержания шести онкомаркеров в сыворотках крови

Биочипы использовали для количественного анализа шести онкомаркеров в сыворотке крови больных онкологическими заболеваниями и здоровых доноров. Построение калибровочных кривых для всех шести маркеров проводили одновременно с анализом образцов. Во всех анализируемых сыворотках для сравнения определяли концентрации онкомаркеров методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы «CanAg» («РидгеЬю») (Швеция) для ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА, НСЕ и наборов фирмы «Иммунотех» (Россия) для ХГЧ. Результаты определения шести онкомаркеров двумя методами приведены на рис.3. Как видно из рисунка, результаты одновременного определения шести онкомаркеров в сыворотке крови человека на биочипе хорошо коррелируют с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с использованием стандартных ИФА тест-систем. Коэффициенты корреляции составили: 0.993 (п=25, р<0.01) для ПСАобщ, 0.994 (п=22,

(2)

где:

Л-линейность, %;

концентрация анализируемого антигена в пробах Л, полученная по

р<0.01) для ПСАсвоб, 0.989 (п=24, р<0.01) для АФП, 0.986 (п=18, р<0.01) для РЭА, 0.981 (п=20, р<0.01) для ХГЧ и 0.989 (п=18, р<0.01) для НСЕ.

[ПСАоб^.нг/ил (ИФА) [ПСАсв об], н гЛлп (И ФА)

|М>Щ,нг(Мл(ИФА) [РЭА], НГ/МП (ИФА)

Р<ГЧ], МОП (ИФА) [Н СЕ], нгАлл (ИФА)

Рис.3 Сравнение результатов анализа ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА ХГЧ и НСЕ в сыворотках крови доноров и больных онкологическими заболеваниями на биочипах с результатами ИФА, полученными при использовании наборов фирмы «СапАЁ» («Ри^геЫо») (Швеция) для ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА и НСЕ и наборов фирмы «Иммунотех» (Россия) для ХГЧ.

4. Хук-эффект

В иммунодиагностических системах, основанных на «сэндвич»- принципе анализа, при высоких концентрациях аналита в пробе возможно возникновение так называемого хук-эффекта, при котором зависимость величины регистрируемого сигнала на твердой фазе от концентрации аналита становится обратно пропорциональной.

При одностадийном иммуноанализе на биочипах мы также столкнулись с проблемой хук-эффекта. При выбранных нами условиях проведения одностадийного «сэндвич»-анализа на биочипах хук-эффект, т.е. уменьшение интенсивности флуоресценции ячеек с иммобилизованными антителами при увеличении концентрации антигена в растворе обнаруживается при концентрации ПСАобщ> 1500нг/мл, ПСАсвоб>1000нг/мл, АФП > 4000 нг/мл, РЭА > 2000 нг/мл, ХГЧ > 7000 МЕ/л, НСЕ > 3000 нг/мл. В качестве примера на рис. 4 приведена зависимость флуоресцентного сигнала ячеек с иммобилизованными антителами против АФП от концентрации АФП для высоких концентраций последнего.

Необходимо отметить, что проявление хук-эффекта начинается при концентрациях антигенов, для которых флуоресцентные сигналы становятся ниже, чем значение сигнала от максимального калибратора для данного антигена. Например, для АФП диапазон измеряемых концентраций составляет от 1 до 600 нг/мл, а хук-эффект начинается при 4000 нг/мл, и только при концентрации АФП выше 7000 нг/мл флуоресцентный сигнал становится ниже, чем сигнал от последней калибровочной пробы (рис. 4). Таким образом, при проведении анализа на биочипах в диапазоне концентраций АФП от 600 до 4000 нг/мл концентрация АФП определяется как "более 600 нг/мл", и только при АФП в анализируемом растворе выше 7000 нг/мл проявляется хук-эффект: высокая концентрация АФП определяется как концентрация ниже 600 нг/мл (рис. 4).

Для других анализируемых антигенов концентрации, при которых сигнал ниже, чем сигнал от последней калибровочной пробы, следующие: ПСАобщ > 20000 нг/мл, ПСАсвоб > 20000 нг/мл, РЭА > 15000 нг/мл, ХГЧ > 300000 МЕ/л, НСЕ > 125000 нг/мл.

Рис. 4. Хук-эффект для АФП. Зависимость флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела против АФП, от концентрации АФП при высоких концентрациях антигена. Концентрация АФП в последнем калибраторе 600 нг/мл, хук-эффект -уменьшение интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации АФП - начинается при концентрации АФП около 4000 нг/мл. Флуоресцентные сигналы становятся ниже, чем сигнал от последнего калибратора при концентрации АФП выше 7000 нг/мл.

4.1. Двустадийный «сэндвич»-иммуноанализ на биочипах

В подавляющем большинстве случаев в иммуноаналитических системах переход от одностадийного к двустадийному варианту «сэндвич»-иммуноанализа позволяет избежать хук-эффекта Этот вариант иммуноанализа отличается введением дополнительной стадии отмывки после стадии инкубации с анализируемым образцом. Нами было проверено это предположение для одновременного иммуноанализа шести онкомаркеров на биочипах. При проведении одностадийного «сэндвич»-анализа на гелевых биочипах стадии инкубации анализируемого раствора антигена с иммобилизованными на биочипе антителами и проявления биочипа флуоресцентно мечеными антителами были объеденены в одну; отмывка производилась только после проведения инкубации. В случае двустадийного анализа после каждой стадии следовала процедура отмывки. Для проведения как одностадийного так и двустадийного анализа использовали одинаковые концентрации проявляющих антител.

В качестве примера на рис. 5 приведена зависимость флуоресцентного сигнала ячеек с иммобилизованными антителами против АФП от концентрации АФП в растворе при проведении двустадийного «сэндвич»-анализа. Как можно видеть из рисунка при определенной концентрации АФП в растворе, сигнал от иммобилизованных антител выходит на плато. Аналогичные зависимости были получены для остальных антигенов.

в § 5 8 1

а, 2

Я Е и Я о и

I?

100 80 60 40 20 0

0 3000 6000 9000 12000 15000 ¡АФП]. нг/мл

Рис. 5. Двухстадийный «сэндвич»-иммуноанализ АФП. График зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела против АФП от концентрации АФП в растворе.

Таким образом, было показано, что при проведении одновременного двустадийного «сэндвич»-иммуноанализа на биочипе удается избежать хук-эффекта для каждого из шести онкомаркеров. Однако для практических приложений важно, чтобы протокол проведения анализа был наиболее простым. Введение дополнительной стадии усложняет процедуру анализа и увеличивает общее времени постановки анализа.

4.2. Сдвиг хук-эффекта в область более высоких концентраций

Причиной хук-эффекта при одностадийном варианте «сэндвич»-иммуноанализа является блокирование сайтов связывания как иммобилизованных, так и проявляющих антител при высокой концентрация анализируемого вещества в растворе. Поэтому, варьируя концентрации иммобилизованных и проявляющих антител и их соотношение, можно сместил, хук-эффект в область более низких или более высоких концентраций определяемого вещества.

В нашей работе мы исследовали влияние увеличения концентрации проявляющих антител на сдвиг хук-эффеета при проведении одновременного одностадийного анализа шести онкомаркеров. Для этого использовали стандартную смесь проявляющих антител, 5-кратную и 20-ти кратную. В качестве примера на рис. 6 приведены зависимости флуоресцентного сигнала ячеек с иммобилизованными антителами против АФП от концентрации АФП в растворе при различной концентрации проявляющих антител. Концентрация проявляющих антител против АФП составляла 12.0мкг/мл (кривая I) -

стандартные условия проведения анализа, бОмкг/мл (кривая 2) и 240мкг/мл (кривая 3). При концентрации проявляющих антител 12.0 мкг/мл хук-эффект обнаруживается при концентрации АФП в растворе > 4000 нг/мл (рис. 6, кривая /); при концентрации 60 мкг/мл (рис. 6, кривая 2) - больше 19000 нг/мл; при концентрации 240 мкг/мл (рис. 6, кривая 3) -кривая выходит на плато и хук-эффект не обнаруживается до концентрации 40000 нг/мл (максимальная концентрация АФП в рамках данного эксперимента). Для остальных онкомаркеров были получены аналогичные зависимости. Данные приведены в таблице 2.

3

1

10 000 20 000 30 000 40 000 [АФП], нг/мл

Рис. 6. Хук-эффект для АФП при увеличении концентрации проявляющих антител Зависимость флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела против АФП, от концентрации АФП при высоких концентрациях антигена. Концентрация проявляющих антител против АФП составляла 12 мкг/мл (кривая 1) - стандартные условия проведения анализа, 60 мкг/мл (кривая 2) и 240 мкг/мл (кривая 3).

Несмотря на существенный сдвиг хук-эффекта в область высоких концентраций при увеличении концентрации проявляющих антител для каждого из онкомаркеров, использование таких высоких концентраций флуоресцентно-меченных антител непригодно для практического использования, поскольку многократно удорожает стоимость анализа. Кроме того, при многократном увеличении концентрации проявляющих антител растет неспецифическая сорбция, что приводит к ухудшению чувствительности системы.

Таблица 2. Сдвиг хук-эффекта в область более высоких концентраций в одностадийном

«сэндвич»-иммуноанализе на биочипах.

Онкомаркер Концентрация проявляющих антител, мкг/мл Концентрация, при которой наблюдается максимум флуоресцентного сигнала от ячеек с иммобилизованными антителами, нг/мл*

3.5 1 500

ПСАобщ 17.5 4 000

70 > 15 000

3.5 1 000

ПСАсвоб 17.5 4 000

70 > 15 000

12 4 000

АФП 60 19 000

240 >40 000

3 2 000

РЭА 15 6 000

60 >22 000

2 7 000

ХГЧ 10 12 000

40 >30 000

5 3 000

НСЕ 25 25 000

100 > 45 000

* ДляХГЧ-МЕ/л

43. Способ контроля хук-эффекта В традиционных тест-системах проявление хук-эффекга можно выявлять и контролировать, проводя одновременный анализ образца и анализ последовательных разведений образца. Это усложняет постановку анализа и увеличивает стоимость его проведения. Нами был предложен оригинальный метод контроля хук-эффекта. Для этого мы использовали сигналы от иммобилизованных на биочипе антигенов.

В случае биочипов оказалось возможным контролировать хук-эффект по сигналам, получаемым от гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антигены ПСА, АФП, ХГЧ и РЭА. При проведении анализа на биочипе одновременно происходит образование

тройных комплексов (иммобилизованное антитело - антиген - проявляющее антитело) и бинарных комплексов (иммобилизованный антиген - проявляющее антитело). При высокой концентрации аналита в образце происходит конкуренция между антигеном, иммобилизованном на биочипе, и антигеном в растворе за связывание проявляющих антител. Поэтому одновременно происходит падение сигналов как от иммобилизованных антител, так и от иммобилизованных антигенов. Такая зависимость приведена на рис. 7 на примере АФП. Было показано, что в динамическом диапазоне концентраций сигнал от иммобилизованного антигена постоянен и не зависит от концентрации АФП в растворе (см. вставку к рис. 7, кривая 2). В диапазоне высоких концентраций можно видеть падение флуоресцентных сигналов как от иммобилизованных антител (рис. 7, кривая 1), так и от иммобилизованного антигена (рис. 7, кривая 2). Аналогичные зависимости были получены для остальных онкомаркеров.

Падение величины флуоресцентного сигнала от иммобилизованных антигенов позволяет определить ложно-заниженный результат анализа, и было использовано нами для выявления хук-эффеета при анализе сывороток с высоким содержанием аналита. В случае падения сигнала от иммобилизованных антигенов по сравнению с соответствующими сигналами, полученными на биочипах с калибровочными пробами, в программе для обработки результатов анализа «1п^е1А$5ау» (ИМБ, РАН) появляется сообщение о необходимости развести образец и указание, концентрация какого именно антигена в образце превышает динамический диапазон системы.

[АФП], нг/мл

Рис. 7. Зависимость интенсивности флуоресценции гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела против АФП, (кривая 1) и гелевых элементов с иммобилизованным АФП (кривая 2) от концентрации АФП. Уменьшение интенсивности флуоресценции гелевых элементов с иммобилизованным антигеном АФП позволяет обнаружить наличие хук-эффекта. На

вставке приведены начальные участки соответствующих кривых (динамический диапазон концентраций)

5. Хранение бночипов и наборов реагентов для иммуноаналнза на биочипах

Подобранный состав гелеобразующих мономеров, в который входят производные аминосахаров, препятствует дегидратации гелевых ячеек при хранении биочипов, что способствует сохранению исходных свойств иммобилизованных белков. Было показано, что иммобилизованные в гелевых ячейках биочипа антитела сохраняют активность по крайней мере в течение шести месяцев при хранении при температуре 2-8°С. На рис. 8а в качестве примера приведена калибровочная кривая для АФП, полученная на биочипах непосредственно после изготовления и после шести месяцев хранения. Флуоресцентные сигналы гелевых ячеек с иммобилизованными антителами против АФП находились в пределах допустимых значений разброса. Аналогичные данные были получены для иммобилизованных антител против ПСАобщ, ПСАсвоб, РЭА, ХГЧ и НСЕ.

Результаты проверки стабильности иммобилизованных анпигенов ПСА, РЭА, ХГЧ и АФП показаны на рис. 86. На рисунке представлены флуоресцентные сигналы, полученные на биочипах непосредственно после изготовления и после шести месяцев хранения. Флуоресцентные сигналы гелевых ячеек с иммобилизованными антигенами у биочипов после шести месяцев хранения практически такие же, как у свежеизготовленных.

С [АФП], нг/мл

Рис. 8. Стабильность биочипов с иммобилизованными белками. (А) Калибровочные кривые «сэндвич»-иммуноанализа АФП, полученные сразу после изготовления биочипов (1) и после хранения в течение 6 месяцев при 2-8°С (2). Каждая точка калибровочной кривой - среднее значение из 3 измерений. (Б) Флуоресцентные сигналы гелевых элементов с иммобилизованными антигенами, полученные после проведения анализа сразу после изготовления биочипов (1) и после хранения в течение 6 месяцев при 2-8°С (2). Каждый столбец - среднее значение из 18 измерений. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений.

Система для анализа онкомаркеров, помимо биочипов, включает в себя калибровочные пробы и смесь проявляющих флуоресцентно-меченных антител. Было проверено, что и эти компоненты системы хранятся с добавлением стабилизирующих агентов в течение шести месяцев: калибровочные пробы на основе сыворотки крови человека при температуре -70°С, а концентрированная (шестикратная) смесь проявляющих Су5-меченных антител при температуре 2-8°С.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод одновременного количественного определения общей и свободной форм простат-специфического антигена (ПСАсвоб и ПСАобщ), альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионального антигена (РЭА), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и нейрон-специфической енолазы (НСЕ) в сыворотке крови на биологическом микрочипе. Разработан биологический микрочип и протокол одностадийного «сэндвич»-иммуноанализа шести онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе.

2. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода: воспроизводимость, чувствительность, значения «открытия» и «линейности». Результаты полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

3. Показано, что результаты одновременного определения шести онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе хорошо коррелируют с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с использованием стандартных ИФА тест-систем.

4. Разработан метод, позволяющий выявлять хук-эффект непосредственно при проведении анализа на биочипе, что препятствует искажению диагностической картины при высоких концентрациях аналита в пробе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. D.A. Zubtsov, E.N. Savvateeva, A.Yu. Rubina, S.V. Pan'kov, E.V. Konovalova, O.V. Moiseeva, V.R. Chechetkin, A.S. Zascdatclcv. Comparison of surface and hydrogel-based protein microchips. Analytical Biochemistry. 2007; 368:205-213.

2. E.B. Коновалова, E.H. Савватеева, Е.И. Дементьева, М.А. Филиппова, А.Ю. Турыгин, Т.В. Осипова, Т.П. Рябых, А.Ю. Рубина, А.С. Заседателев. Разработка биочипа для количественного определения двух форм простата-специфического антигена с использованием внутренней калибровочной кривой. Молекулярная биология. 2007; Т. 41, №4, С. 734-738.

3. T.Osipova, T.Ryabykh, A Rubina, Е. Dementieva, Е. Savvateeva, Е. Konovalova, Z.Sokolova, V.Matveev, A.Baryshnikov, A.Zasedatelev. Biochip-based test-system for prostate cancer diagnostics. "NEW ASPECTS OF BIOTECNOLOGY AND MEDICINE.". Editors: A.M. Egorov and G.E. Zaikov. Nova Science Publishers, Inc. New York. Pub. Date: 2007. ISBN: 160021-465-7; pp. 15-28.

4. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, Е.Н. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.Ю. Барышников, А.С. Заседателев. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови. Российский биотерапевтический журнал. 2006; Т. 5, № 2, С. 49-57.

Патенты

1. А.Ю. Рубина, Е.И. Дементьева, В.И. Дюкова, ЕЛ. Савватеева, E.JI. Дарий, A.A. Стомахин, A.C. Заседателев. Биологический микрочип для множественного параллельного иммунопогического анализа соединений и способы иммуноанализа, в которых он используется. Патент PCT/RU2004/000524. Дата приоритета 28 декабря 2004 г Номер международной публикации WO 2006/071132 AI. Дата международной публикации 6 июля 2006 г.

Тезисы

1. Савватеева Е. Н., Дементьева Е. И., Цыбульская М. В., Рубина А. Ю. Иммуноанализ онкомаркеров на биологическом микрочипе. XII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии». Россия, Волгоград 2008.

2. Савватеева Е. Н., Дементьева Е. И., Цыбульская М. В., Осипова Т. В., Рябых Т. П., Рубина А. Ю., Заседателев А. С. Биочип для количественного анализа маркеров онкологических заболеваний. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Россия, Новосибирск 2008.

3. Савватеева E.H., Рубина А.Ю. Биологический микрочип для одновременного анализа маркеров онкологических заболеваний. XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Россия, Москва 2008.

4. Осипова Т.В., Рябых Т.П., Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Савватеева E.H., Соколова З.А., Матвеев В.Б., Барышников А.Ю., Заседагелев A.C. Тест-система на основе биочипа для диагностики рака простаты. Московская международная конференция «Биотехнология и медицина» Россия, Москва 2006.

5. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, E.H. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.Ю. Барышников, A.C. Заседагелев «Разработка диагностической тест-системы на основе биочипа на простатический специфический антиген (общую и свободную формы)» Российский биотерапевтический журнал №1/том5/2006. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Россия, Москва 2006.

6. Рябых Т.П., Осипова Т.В., Дементьева Е.И., Савватеева E.H., Филиппова М.А., Коновалова Е.В., Соколова З.А., Рубина А.Ю., Барышников А.Ю., Заседагелев A.C. Применение технологии белковых микрочипов для диагностики рака предстательной железы. VII Международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование в XXI веке» Россия, Москва 2006.

7. Рябых Т.П., Осипова Т.В., Савватеева E.H., Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JI., Заседагелев A.C., Барышников А.Ю. Новые подходы к диагностике злокачественных новообразований, основанные на технологии белковых микрочипов. Конференция «Биотехнология и онкология» Россия, Санкт-Петербург 2005.

8. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, E.H. Савватеева, А.Ю. Рубина, Е.Л. Дарий, A.C. Заседагелев, А.Ю. Барышников. Новые подходы к диагностике злокачественных новообразований, основанные на нанотехнологии - технологии биочипов. Российский биотерапевтический журнал №1/гом4/2005. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Россия, Москва 2005.

9. Т. Osipova, Т. Ryabykh, Е. Darii, Е. Dementieva , Е. Sawateeva, A. Rubina, А. Zasedatelev, A. Baryshnikov. A new approach to cancer diagnostics: protein microchips for tumor marker determination, 16й International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France 2005.

Подписано в печать 14.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 949 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Савватеева, Елена Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Опухолевые маркеры.

1.1.1. Индивидуальные опухолевые маркеры.

1.1.1.1. Простат-специфический антиген.

1.1.1.2.' Альфа-фетопротеин.

1.1.1.3. Раково-эмбриональный антиген.

1.1.1.4. Хорионический гонадотропин человека.

1.1.1.5. Нейрон-специфическая енолаза.

1.1.2. Одновременное определение нескольких онкомаркеров.

1.2. Белковые микрочипы.

1.3. Белковые микрочипы для определения онкомаркеров.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Буферные растворы.

2.3. Приготовление смеси флуоресцентно-меченных проявляющих антител.

2.4. Приготовление калибровочных проб и хук-образцов.

2.5. Изготовление белковых микрочипов.

2.6. «Сэндвич»-иммуноанализ на биочипах.

2.6.1. Одностадийный анализ.

2.6.2. Двустадийный анализ.

2.7. Флуоресцентные измерения.

2.8. Обработка результатов анализа.

2.9. Аналитические характеристики метода.

2.9.1. Воспроизводимость анализа.

2.9.2. Аналитическая чувствительность.

2.9.3. Тест на «открытие».

2.9.4. Тест на «линейность».

2.10. Твердофазный иммуноферментный анализ на 96-луночном планшете.

2.10.1. Определение общей формы простат-специфического антигена.

2.10.2. Определение свободной формы простат-специфического антигена.

2.10.3. Определение альфа-фетопротеина.

2.10.4. Определение раково-эмбрионального антигена.

2.10.5. Определение нейрон-специфической енолазы.

2.10.6. Определение хорионического гонадотропина человека.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Биочип для одновременного количественного анализа шести онкомаркеров.

3.1.1. Выбор пар моноклональных антител для каждого онкомаркера.

3.1.2. Иммобилизация антигенов.

3.1.3. Структура биочипа.

3.2. Метод одновременного определения шести онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе.

3.2.1. Концентрации иммобилизованных и проявляющих антител.

3.2.2. Состав калибровочных проб.

3.2.3. Температура и время инкубации.

3.2.4. Соотношение объемов проявляющие антитела/образец.

3.3. Аналитические характеристики количественного анализа шести онкомаркеров на биочипах.

3.3.1. Воспроизводимость анализа.

3.3.2. Аналитическая чувствительность.

3.3.3. Тест на «открытие».

3.3.4. Тест на «линейность».

3.4. Определение содержания шести онкомаркеров в сыворотках крови.

3.5. Хук-эффект.

3.5.1. Двустадийный «сэндвич»-иммуноанализ на биочипах.

3.5.2. Сдвиг хук-эффекта в область более высоких концентраций.

3.5.3. Способ выявления хук-эффекта.

3.5.4. Анализ сывороток с высоким содержанием аналита.

3.6. Хранение биочипов и наборов реагентов для иммуноанализа на 84 биочипах.

3.7. Практическая значимость полученных результатов.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Одновременный количественный иммуноанализ маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови на биологическом микрочипе"

Своевременная диагностика — одна из основных проблем онкологии. В настоящее время для ранней диагностики первичной опухоли и ее метастазов, а также мониторинга проводимой терапии широко используется определение опухолевых маркеров в сыворотке крови. Идеальный онкомаркер должен обладать высокой специфичностью и чувствительностью в отношении определенного вида опухоли, однако большинство известных в настоящее время опухолевых маркеров не отвечает этим критериям. Одновременное определение нескольких онкомаркеров повышает эффективность скринингового анализа и увеличивает возможности дифференциальной диагностики заболеваний. Большинство иммунохимических методов позволяет выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, поэтому в настоящее время большие надежды в области диагностики рака связывают с использованием мультиплексных систем, таких как микрочипы.

В иммунодиагностических системах, основанных на «сэндвич»-принципе анализа, при высоких концентрациях аналита в пробе возможно возникновение так называемого хук-эффекта, при котором зависимость величины регистрируемого сигнала на твердой фазе от концентрации аналита становится обратно пропорциональной. В традиционных тест-системах проявление хук-эффекта можно выявлять и контролировать, только используя последовательные разведения анализируемого образца.

Целью данного исследования является разработка метода одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе. Разработанный метод должен также обеспечивать выявление хук-эффекта непосредственно в ходе проведения анализа. Для достижения поставленной цели потребовалось: создать биологический микрочип с ковалентно иммобилизованными в гидрогеле антителами и антигенами, разработать протокол проведения одновременного количественного анализа шести онкомаркеров в сыворотке крови и получить основные аналитические и диагностические характеристики разработанного метода.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Савватеева, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод одновременного количественного определения общей и свободной форм простат-специфического антигена (ПСАсвоб и ПСАобщ), альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионального антигена (РЭА), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и нейрон-специфической енолазы (НСЕ) в сыворотке крови на биологическом микрочипе. Разработан биологический микрочип и протокол одностадийного «сэндвич»-иммуноанализа шести онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе.

2. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода: воспроизводимость, чувствительность, значения «открытия» и «линейности». Результаты полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

3. Показано, что результаты одновременного определения шести онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе хорошо коррелируют с результатами, полученными при индивидуальном определении концентрации каждого из онкомаркеров с использованием стандартных ИФА тест-систем.

4. Разработан метод, позволяющий выявлять хук-эффект непосредственно при проведении анализа на биочипе, что препятствует искажению диагностической картины при высоких концентрациях аналита в пробе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Рубиной Алле Юрьевне за всестороннюю помощь и интеллектуальную поддержку, оказанную при выполнении и написании этой работы. Я искренне признательна Цыбульской Марии, Дементьевой Екатерине за критическое обсуждение экспериментов и их результатов; Филипповой Марине, Коноваловой Лизе, Иванову Сергею, Зубцовым Жанне и Диме, Стомахину Андрею, Дарий Екатерине за помощь, моральную поддержку, теплое и дружеское отношение. Также выражаю признательность Осиповой Татьяне Владимировне и Рябых Татьяне Павловне за сотрудничество. Выражаю благодарность Турыгину Александру, Юрасову Роману, Прокопенко Дмитрию и Чечеткину Владимиру за разработку специальных компьютерных программ. Выражаю признательность группе производства микрочипов: Панькову Сергею, Крейндлину Эдуарду Яковлевичу, Моисеевой Ольге, Сомовой Ольге, Грачевой Маше, Юрасову Дмитрию и Черепанову Алексею.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Савватеева, Елена Николаевна, Москва

1. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. 2003. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические, иммунохимические, биохимические анализы. Пособие для врачей. М.: Макс Пресс.

2. Maruvada P., Wang W., Wagner P.D., Srivastava S. 2005. Biomarkers in molecular medicine: cancer detection and diagnosis. Biotechniques. Suppl, 915.

3. Ablin R.J., Soanes W.A., Bronson P., Witebsky E. 1970. Precipitating antigens of the normal human prostate. J. Reprod. Fertil. 22 (3), 573-574.

4. Wang M.C., Valenzuela L.A., Murphy G.P., Chu T.M. 1979. Purification of a human prostate specific antigen. Invest.Urol. 17(2), 159-163.

5. Papsidero L.D., Wang M.C., Valenzuela L.A., Murphy G.P., Chu T.M. 1980. A prostate antigen in sera of prostatic cancer patients. Cancer Res. 40 (7), 2428-2432.

6. Paitin A.W., Oesterling J.E. 1994. The clinical usefulness of prostate specific antigen: update 1994. J. Urol. 152(5 Pt 1), 1358-1368.

7. Pollen J.J, Dreilinger A. 1984. Immunohistochemical identification ofprostatic acid phosphatase and prostate specific antigen in female periurethral glands. Urology. 23 (3), 303-304.

8. Young F., Li X, Ellet J., et al. 2000. Regions of prostate specific antigen (PSA) promoter confer androgen -independent expression of PSA in prostate cancer cell. J. Biol. Chem. 275(52), 40486-40855.

9. Lilja H., Christensson A., Dahlen U., Matikainen M.T., Nilsson O., Pettersson K., Lovgren T. 1991. Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin. Clin. Chem. 37(9), 1618-1625.

10. Lilja H. 1993. Structure, function, and regulation of the enzyme activity of prostate-specific antigen. World. J. Urol. 11(4), 188-191.

11. Davis M.I., Bennett M.J., Thpmas L.M., Bjorkman PJ. 2005. Crystal structure of prostate-specific membrane antigen, a tumor marker and peptidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 5981-5986. (http://www.rcsb.org/pdb)

12. Кушлинский H.E. 1999. Возможности, неудачи и перспективы исследования опухолевых маркеров в современной онкологической клинике. Часть 2. Клиническая лабораторная диагностика. №4, С. 25-32.

13. Gonzalgo M.L., Carter Н.В. 2007. Update on PSA testing. J. Natl. Compr. Cane. Netw. 5(7), 737-742.

14. Bergstrand C.G., Czar B. 1956. Demonstration of a new protein fraction in serum from human fetus. Scan. J. Clin. Lab. Invest. 8, 174-176.

15. Muralt G., Roulet D.L.A. 1961. Immunological study of human fetal serum proteins. Helv. Pediatr. Acta. 16, 517-520.

16. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., Irlin I.S. 1963. Production of embryonal alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas. Transplantation. 1, 174-180.

17. Татаринов Ю.С. 1963. В кн. I Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы, 2, АН СССР, М.-Л., с. 274.

18. Bellini С., Bonacci W., Parodi Е., Serra G. 1998. Serum alpha-fetoprotein in newborns. Clin. Chem. 44(12), 2548-50.

19. Ruoslahti E., Seppala M. 1971. Studies of carcino-fetal proteins. 3. Development of a radioimmunoassay for a-fetoprotein. Demonstration of a-fetoprotein in serum of healthy human adults. Int. J. Cancer. 8(3), 374-383.

20. Jones E.A., Clement-Jones M., James O.F., Wilson D.I. 2001. Differences between human and mouse alpha-fetoprotein expression during early development. J. Anat. 198(5), 555-559.

21. Debruyne E.N., Delanghe J.R. 2008. Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein: new aspects and applications. Clin. Chim. Acta. 395(1-2), 19-26.

22. Koide N., Nishio A., Igarashi J., Kajikawa S., Adachi W., Amano J. 1999. Alpha-fetoprotein-producing gastric cancer: histochemical analysis of cell proliferation, apoptosis, and angiogenesis. Am. J. Gastroenterol. 94(6), 16581663.

23. Chan M.H., Shing M.M., Poon T.C., Johnson P.J., Lam C.W. 2000. Alpha-fetoprotein variants in a case of pancreatoblastoma. Ann. Clin. Biochem. 37 (5), 681-685.

24. Абелев Г.И. 1998. Альфа-фетопротеин — взгляд в биологию развития и природу опухолей. Соросовский образовательный журнал. 9, 8-13.

25. Macdonald J.S. 1999. Carcinoembryonic antigen screening: pros and cons. Semin. Oncol. 26, 556-560.

26. Gold P., Freedman S.O. 1965. Demonstration of tumor-specific antigen in human colonic carcinomata by immunological tolerance and absorption technique. J. Exp. Med. 121, 439-462.

27. Gold P., Freedman S.O. 1965. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp. Med. 122, 467-481.

28. Boucher D., Cournoyer D., Stanners C.P., Fuks A. 1989. Studies on the control of gene expression of the carcinoembryonic antigen family in human tissue. Cancer Res. 49, 847-852.

29. Thomson D.M.P., Krupey J., Freedman S.O., Gold P. 1969. The radioimmunoassay of circulating carcinoembryonic antigen of the human digestive system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 64, 161-167.

30. Thomas P., Toth C.A., Saini K.S., Jessup J.M., Steele G. 1990. The structure, metabolism and function of carcinoembryonic antigen gene family. Biochim.

31. Biophys. Acta. 1032, 177-189.

32. Thompson J.A., Grunet F., Zimmermann W. 1991. Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives. J. Clin. Lab. Anal. 5, 344-366.

33. Boehm M.K., Perkins S.J. 2000. Structural models for carcinoembryonic antigen and its complex with the single-chain Fv antibody molecule MFE23. FEBS Lett. 475, 11-16. ftittp://www.rcsb.org/pdb)

34. Huerta S. 2008. Recent advances in the molecular diagnosis and prognosis of colorectal cancer. Expert. Rev. Mol. Diagn. 8(3), 277-288.

35. Скворцов C.B., Храмченко И.М., Кушлинский H.E. 1999. Опухолевые маркеры в оценке степени распространенности опухолевого процесса при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта. Клин. лаб. диагн. № 9, с.26.

36. Lee Y.C.; Yang P.C.; Kuo S.H.; Luh K.T. 1991. Tissue polypeptide antigen and carcinoembryonic antigen as tumor marker in lung cancer. J. Formos. Med. Assoc. 90, 631-636.

37. Карпищенко А.И., Антонов В.Г., Бутенко А.Б., Белохвостов А.С., Шелепина Е.П. 1999. Онкомаркеры и их диагностическое значение. СПб.:ВМедА., 47 стр.

38. Sajid К.М., Parveen R., Durr-e-Sabih , Chaouachi К., Naeem A., Mahmood R., Shamim R. 2007. Carcinoembryonic antigen (CEA) levels in hookah smokers, cigarette smokers and non-smokers. J. Pak. Med. Assoc. 57(12), 595-599.

39. Pierce J.G., Parsons T.F. 1981. Glycoprotein hormones: structure and function. Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495.

40. Wu H., Lustbader J.W., Liu Y., Canfield R.E., Hendrickson W.A. 1994. Structure of human chorionic gonadotropin at 2.6 A resolution from MAD analysis of the selenomethionyl protein. Structure. 2, 545-558. (http://www.rcsb.org/pdb)

41. Cole L.A., Kardana A., Park S.-Y., Braunstein G.D. 1993. The deactivation of hCG by nicking and dissotiation. J. Clin. Endocrinol. Metab. 76, 704-713.

42. Norman R.J., Poulton Т., Gard Т., Chard T. 1985. Monoclonal antibodies to human chorionic gonadotropin: implications for antigenic mapping, immunoradiometric assay, and clinical application. J. Clin. Endocrinol. Metab. 61, 1031-1038.

43. Hoermann R., Berger P., Spoettle G., Gillesberger F., Kardana A., Cole L.A., et al. 1994. Immunological recognition and clinical significance of nicked human chorionic gonadotropin in testicular cancer. Clin. Chem. 40, 23062312.

44. Cole L.A. 1994. New perspectives in measuring human chorionic gonadotropin levels for measuring and monitoring trophoblast disease. J. Reprod. Med. 39, 193-200.

45. Mann K., Sailer В., Hoermann R. 1993. Clinical use of HCG and hCG beta determinations. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 216, 97-104.

46. Hoshi S., Suzuki K., Ishidoya S., Ohyama C., Sato M., et al 2000. Significance of simultaneous determination of serum human chorionic gonadotropin (hCG) and hCG-beta in testicular tumor patients. Int. J. Urol. 7, 218-223.

47. Ferrigno D., Buccheri G., Giordano C. 2003. Neuronspecific enolase is aneffective tumour marker in non-small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer. 41,311-320.

48. Sung H.J., Cho J.Y. 2008. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics. BMB Rep. 41(9), 615-625.

49. Riley R.D., Heney D., Jones D.R., Sutton A.J., Lambert P.C., Abrams K.R., Young В., Wailoo A.J., Burchill S.A. 2004. A systematic review of molecular and biological tumor markers in neuroblastoma. Clin. Cancer Res. 10(1 Pt 1), 4-12.

50. Poyner R.R., Cleland W.W., Reed G.H. 2001. Role of metal ions in catalysis by enolase: an ordered kinetic mechanism for a single substrate enzyme. Biochemistry. 40(27), 8009-8017.

51. Kaiser E., Kuzmits R, Pregant P., Burghuber O., Worofka W. 1989. Clinical biochemistry of neuron specific enolase. Clin. Chim. Acta. 183(1), 13-31.

52. Chai G., Brewer J., Lovelace L., Aoki Т., Minor W., Lebioda L. 2004. Expression, Purification and the 1.8 A Resolution Crystal Structure of Human Neuron Specific Enolase J. Mol. Biol. 341, 1015-1021.

53. Andoh M., Gemma A., Takenaka K., Hisakatsu S., Yamada K., Usuki J., Hasegawa K., Sakonji M., Kudoh S., Tsuboi E., et al. 1994. Serum Neuron Specific Enolase Level as a Prognostic Factor in Non-Small Cell Lung Cancer. Intern. Med. 33(5), 271-276.

54. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2006. http://www.cancer.org/downloads/STT/CAFF2006PWSecured.pdf.

55. Алексеева M.JI., Гусарова E.B., Муллабаева C.M., Понкратова Т.С. 2005. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностического использования. Проблемы репродукции. №3, С. 65-79.

56. Кушлинский Н.Е. 1999. Возможности, неудачи и перспективы исследования опухолевых маркеров в современной онкологической клинике. Часть 1. Клиническая лабораторная диагностика. №3, С. 25-32.

57. Liao Q., Zhao Y.P., Yang Y.C., Li L.J., Long X., Han S.M. 2007. Combined detection of serum tumor markers for differential diagnosis of solid lesions located at the pancreatic head. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 6(6), 641-645.

58. Саркисян Г.П., Булычева Т.И., Карагюлян С. Р., Точенов А. В., Шавлохов В. С. 2005. Возможности ранней диагностики опухолей. Терапевтический архив. №4, С 33-37.

59. Carpelan-Holmstrom М., Louhimo J., Stenman U.H., Alfthan H., Jarvinen H., Haglund С. 2004. Estimating the probability of cancer with several tumor markers in patients with colorectal disease. Oncology. 66(4), 296-302.

60. D. Wild. 2005. The Immunoassay handbook. ELSEVIER Ltd., ISBN: 0-08044526-8. 930 pages.

61. Earley M.C., Vogt R.F. Jr., Shapiro H.M., Mandy F.F., Kellar K.L., Bellisario R., Pass K.A., Marti G.E., Stewart C.C., Hannon W.H. 2002. Report from a workshop on multianalyte microsphere assays. Cytometry. 50(5), 239-242.

62. Kellar K.L., Iannone M.A. 2002. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Exp. Hematol. 30(11), 1227-1237.

63. Haab B.B. 2003. Methods and applications of antibody microarrays in cancer research. Proteomics. 3(11), 2116-2122.

64. Kingsmore S.F. 2006. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug Disc. 5(4), 310320.

65. Kricka L.J., Master S.R., Joos Т.О., Fortina P. 2006. Current perspectives in protein array technology. Ann. Clin. Biochem. 43(Pt 6), 457-467.

66. Zhang S. 2004. Hydrogels: Wet or let die. Nat. Mater. 3(1), 7-8.

67. Rubina A.Yu., Kolchinsky A., Makarov A. A., Zasedatelev A. S. 2008. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics. 8, 817-831.

68. Angenendt P. 2005. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov. Today. 10, 503-511.

69. Rusmini F., Zhong Z., Feijen J. 2007. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8(6), 1775-1789.

70. Ball V., Huetz P., Elaissari A., Cazenave J.P., Voegel J.C., Schaaf P. 1994. Kinetics of exchange processes in the adsorption of proteins on solid surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(15), 7330-7334.

71. Seurynck-Servoss S.L., Baird C.L., Rodland K.D., Zangar R.C. 2007. Surface chemistries for antibody microarrays. Front. Biosci. 12, 3956-3964.

72. PiiTung M.C., Huang, C.Y. 1996. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. Bioconjug. Chem. 7(3), 317-321.

73. Tinazli A., Tang J., Valiokas R., Picuric S., Lata S., Piehler J., Liedberg В.,

74. Tampe R. 2005. High-affinity chelator thiols for switchable and oriented immobilization of histidine-tagged proteins: a generic platform for protein chip technologies. Chemistry. 11(18), 5249-5259.

75. Cheng M.M., Cuda G., Bunimovich Y.L., Gaspari M., Heath J.R., Hill H.D., Mirkin C.A., Nijdam A.J., Terracciano R., Thundat Т., Ferrari M. 2006. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Curr. Opin. Chem. Biol. 10(1), 11-19.

76. Angenendt P., Glokler J., Murphy D., Lehrach H., Cahill D.J. 2002. Toward optimized microarrays: a comparison of current microarray support material. Anal. Biochem. 309, 253-260.

77. Vasiliskov V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev A., Shick V., Mirzabekov A. 1999. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechniques. 27, 592-606.

78. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., Chupeeva V., Voloschuk S., Mirzabekov A. 2000. Protein microchips: Use for immunoassay and enzymatic reactions. Anal. Biochem. 278, 123-131.

79. Bacarese-Hamilton Т., Mezzasoma L., Ingham C., Ardizzoni A., Rossi R., Bistoni F., Crisanti A. 2002. Detection of allergen-specific IgE on microarrays by use of signal amplification techniques. Clin. Chem. 48, 1367-1370.

80. Harwanegg C., Hutter S., Hiller R. 2007. Allergen microarrays for the diagnosis of specific IgE against components of cow's milk and hen's egg in a multiplex biochip-based immunoassay. Methods Mol. Biol. 385, 145-157.

81. Huang R.P. 2004. Cytokine protein arrays. Methods Mol. Biol. 264, 215-231.

82. Zhou X., Zhou J. 2007. Antibody-microarrays on hybrid polymeric thin film-coated slides for multiple-protein immunoassays. Methods Mol. Biol. 382,259.271.

83. Bacarese-Hamilton Т., Mezzasoma L., Ardizzoni A., Bistoni F., Crisanti A. 2004. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. J. Appl. Microbiol. 96, 10-17.

84. Feng Y., Ke X., Ma R., Chen Y., Hu G., Liu F. 2004. Parallel detection of autoantibodies with microarrays in rheumatoid diseases. Clin. Chem. 50(2), 416-422.

85. Miller J.C., Zhou H., Kwekel J., Cavallo R., Burke J., Butler E.B., Teh B.S., Haab B.B. 2003. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera. Proteomics. 3, 56-63.

86. Sreekumar A., Chinnaiyan A.M. 2002. Using protein microarrays to study cancer. BioTechniques. Suppl, 46-53.

87. Nielsen U.B., Geierstanger B.H. 2004. Multiplexed sandwich assays in microarray format. J. Immunol. Methods. 290, 107-120.

88. Ligler F.S., Taitt C.R., Shriver-Lake L.C., Sapsford K.E., Shubin Y., Golden J.P. 2003. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377(3), 469-477.

89. Ngundi M.M., Taitt C.R., McMurry S.A., Kahne D., Ligler F.S. 2006. Detection of bacterial toxins with monosaccharide arrays. Biosens. Bioelectron. 21(7), 1195-1201.

90. Wingren C., Borrebaeck C.A. 2006. Antibody microarrays: current status and key technological advances. OMICS. 10 (3), 411-427.

91. Sun Z., Fu X., Zhang L., Yang X., Liu F., Hu G. 2004. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. Anticancer Res. 24(2C), 1159-1165.

92. Yu D.Y. 2005. Application of multi-tumor markers protein chip assistance diagnostic system for detection of various tumors. China Trop. Med. 5, 414416.

93. Liang Z., Wang H.F., Wu A.Z., Fu S.M. 2005. Clinical value of 12tumor markers protein biochip detection of digestive system neoplasm. China Trop. Med. 5, 407-409.

94. Jiang Z.J., Zhou W.X., Lin W., Huang Q.X. 2005. Application of multi-tumor markers protein chip diagnose system in the diagnosing of intestinal neoplasms. J. Mod. Lab. Med. 20, 17-19.

95. Мои J.H., Li Z.P., Wang D., Ma Y., Xiao H.L., Zhang Q.H. 2005. Combined detection of multiple tumor marker and its diagnostic value in colorectal cancer. J. Digest. Surg. 4, 268-270.

96. Zhong Z.Y., Wang D., Li Z.P., Li M.X., Dai N., Cao X.J., et al. 2007. Clinical significance of C-12 multiple tumor marker protein chip detective system in diagnosing colorectal carcinoma. Chongqing Med. 36, 2406-2408.

97. Chen C., Chen L.Q., Yang G.L., Li Y. 2007. Value of tumor markers in diagnosing and monitoring colorectal cancer and strategies for further improvement: analysis of 130 cases. Ai. Zheng. 26(11), 1221-1226.

98. Chen C., Chen L.Q., Yang G.L., Li Y. 2008. The application of C12 biochip in the diagnosis and monitoring of colorectal cancer: Systematic evaluation and suggestion for improvement. J. Postgrad. Med. 54(3), 186-190.

99. Chen C., Chen L.Q., Chen L.D., Yang G.L., Li Y. 2008. Evaluation of tumor markers biochip C12 system in the diagnosis of gastric cancer and the strategies for improvement: analysis of 100 cases. Hepatogastroenterology. 55(84), 991-997.

100. Song S.-P., Li В., Ни J., Li M.-Q. 2004. Simultaneous multianalysis for tumor markers by antibody fragments microarray system. Analytica Chimica Acta. 510, 147-152.

101. Wilson M.S., Nie W. 2006. Multiplex measurement of seven tumor markers using an electrochemical protein chip. Anal. Chem. 78, 6476-6483.

102. Wiese R., Belosludtsev Y., Powdrill Т., Thompson P., Hogan M. 2001. Simultaneous multianalyte ELISA performed on microarray platform. Clinical Chemistry. 47(8), 1451-1457.

103. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В. 2003. Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления. Патент РФ N 2216547. Бюл. изобр. №32.

104. Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., Mirzabekov A.D. 2003. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. BioTechniques. 34, 1008-1022.

105. Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A. 2002. Fluorescence data analysis on gel-based biochips. J. Biomol. Screening. 7, 247—257.

106. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JI. и др. 2004. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров. ДАН. 395, 542-547.

107. Rubina A.Yu., Dyukova V.I., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Nesmeyanov V.A., Grishin E.V., Zasedatelev A.S. 2005. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips. Anal. Biochem. 340, 317-329.

108. Dyukova V.I., Dementieva E.I., Zubtsov D.A., Galanina O.E., Bovin N.V., Rubina A.Yu. 2005. Hydrogel glycan microarrays. Anal. Biochem. 347, 94-105.

109. Шелепова В.М., Кадагидзе З.Г. 2007. Опухолевые маркеры в современной клинической практике. Вестник Московского Онкологического Общества. №1.

110. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. 1991. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высшая школа, 288 с.

111. Тигранян Р.А., Калита Н.Ф., Роганов А.С. 1994. Методическое руководство по проведению контроля качества наборов реагентов для иммуноферментного анализа. Министерство Здравоохранения и Медицинской Промышленности РФ. Москва. 33 с.

112. Selby С. 1999. Interference in immunoassay. Ann. Clin. Biochem. 36, 704-21.

113. Killeen A.A., Ramey M.L., Dean J.J. 1993. High-dose hook effect in an immunoluminometric thyrotropin assay: the open-faced sandwich artifact. Ann. Clin. Biochem. 30, 413-414.1. Q Ь>а

114. Akamatsu S., Tsukazaki H., Inoue K., Nishio Y. 2006. Advanced prostate cancer with extremely low prostate-specific antigen value at diagnosis: an example of high dose hook effect. Int. J. Urol. 13, 1025-1027.

115. Vaidya H.C., Wolf B.A., Garrett N., Catalona W.J., Clayman R.V., Nahm M.H. 1988. Extremely high values of prostate-specific antigen in patients with adenocarcinoma of the prostate; demonstration of the "hook effect". Clin. Chem. 34, 2175-2177.

116. Dahlmann N. 1989. The hook effect as a cause of falsely lowered beta-HCG values. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 36-37.

117. Jassam N., Jones C.M., Briscoe Т., Horner J.H. 2006. The hook effect: a need for constant vigilance. Ann. Clin. Biochem. 43, 314-317.

118. Kuo C.Y., Fu J., Yeh M.Y., Su S.L., Lee C.Y. 1989. Generation of monoclonal antibodies to alpha-fetoprotein and application in solid-phase enzyme immunoassay. Biotechnol. Appl. Biochem. 11, 96—104.

119. Fernando S.A., Wilson G.S. 1992. Studies of the *hook' effect in the one-step sandwich immunoassay. J. Immunol. Methods. 151, 47-66.

120. Landsteiner K. 1946. The specificity of serological reactions. Cambridge, MA: Harvard University Press. 240-52.

121. Butch A.W. 2000. Dilution Protocols for Detection of Hook Effects/Prozone Phenomenon. Clin. Chem. 46, 1719-21.