Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты крови и мочи: особенности циркуляции, выведения и использование в диагностике

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты крови и мочи: особенности циркуляции, выведения и использование в диагностике"

На правах рукописи

БРЫЗГУНОВА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫЕ

КИСЛОТЫ КРОВИ И МОЧИ: ОСОБЕННОСТИ ЦИРКУЛЯЦИИ, ВЫВЕДЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2013

005537600

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

Лактионов Павел Петрович, к.б.н.

Официальные оппоненты:

Чердынцева Надежда Викторовна, д.б.н., профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт онкологии СО РАМН, зам. директора по науке.

Миронова Надежда Львовна, к.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН

Защита состоится «11» октября 2013 г. в 12-00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 10 » сентября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что в крови, лимфе, моче, слезе и других биологических жидкостях млекопитающих содержатся внеклеточные нуклеиновые кислоты (внНК). Такие внНК не однородны по размеру и составу, их концентрация зачастую повышается при травме, развитии онкологических или аутоиммунных заболеваний. Показано," что источниками ДНК во внеклеточном пространстве (внДНК) являются процессы некроза, апоптоза, онкоза, а также активная секреция. Известно, что внДНК, в отличие от чистых препаратов ДНК, могут длительное время циркулировать в крови (цирДНК), не деградируя под действием ДНК-гидролизующих ферментов крови. Действительно, было показано, что внДНК находятся в составе олигонуклеосом, апоптотических телец и других комплексов, а структура и упаковка ДНК в составе таких комплексов могут влиять на ее стабильность. В частности, метилирование цитозинов в СрО-богатых районах ДНК, способствуя переходу ДНК из В в 7-форму, может приводить к изменению нуклеосомной укладки ДНК или прямого взаимодействия ДНК с белками и, таким образом, стабильности и времени циркуляции определенных фрагментов ДНК в биологических жидкостях. Необходимо отметить, что аберрантно метилированные внДНК рассматриваются в настоящее время как наиболее перспективные потенциальные онкомаркеры. Однако циркуляция метилированных ДНК в крови не изучена, что не позволяет выработать общих подходов к поиску таких ДНК-маркеров, поскольку основная масса исследований цир/внНК ориентирована на поиск маркеров, которые могут быть использованы для неинвазивной диагностики рака. При этом поиск таких маркеров осуществляется прямым перебором аберрантно метилированных ДНК, характерных для опухолевой ткани, без учета их вклада в формирование пула цирДНК. Отсутствие рациональных подходов к поиску таких онкомаркеров в составе цир/внДНК является основной причиной, которая лимитирует развитие диагностики, основанной на использовании цир/внДНК.

Кроме цирДНК крови, внДНК мочи также представляют большой интерес в качестве источника диагностического материала для выявления опухолей предстательной железы, мочевого пузыря, почки. Однако отсутствие данных о размере и составе внНК мочи здоровых и больных, зависимости состава от пола пациентов, факторах, влияющих на время жизни внНК в этой биологической жидкости, не позволяет разработать и оптимизовать подходы, направленные на создание неинвазивных диагностических систем на эти, и, возможно, другие типы рака, основанные на использовании внДНК мочи.

Цель работы. Целью представленного исследования являлось изучение особенностей циркуляции и выведения цирДНК крови, исследование внДНК мочи, оценка возможности рационального поиска потенциальных аберрантно метилированных онкомаркеров и поиск таких онкомаркеров при помощи микрочипов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) разработать методологию исследования: методы выделения и

концентрирования цир/внДНК из крови и мочи, метод бисульфитной конверсии цир/внДНК; 2) исследовать особенности циркуляции метилированной и неметилированной ДНК, а также цирДНК в составе нативных нуклеопротеиновых комплексов; 3) исследовать внДНК мочи, а именно размер и состав внДНК, концентрацию внДНК в норме и при заболеваниях предстательной железы, наличие опухолеспецифичных последовательностей в пуле внДНК мочи; 4) исследовать влияние дезоксирибонуклеаз крови и мочи на концентрацию цир/внДНК; 5) исследовать возможность получения данных о статусе метилирования онкомаркеров методом прямого секвенирования цир/внДНК; 6) провести поиск аберрантно метилированных маркеров опухолей предстательной железы в пуле цирДНК крови при помощи микрочипов Human CpG island Microarray HCGI12k.

Научная новизна и практическая ценность работы. Для исследования вн/цирНК были разработаны методы выделения и концентрирования вн/цирДНК из крови и мочи. Впервые показано, что выведение метилированного и неметилированного ПЦР-продуктов из крови мыши имеет двухфазный характер; метилированная ДНК, вне зависимости от ее происхождения, более стабильна к действию нуклеаз крови, чем неметилированная. Впервые обнаружено, что концентрация свободной и связанной с поверхностью клеток крови цирДНК достоверно возрастает в группе пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы (ОЗПЖ) по сравнению со здоровыми донорами, а также установлена прямая корреляция между концентрацией свободных и связанных с клеточной поверхностью крови цирДНК. Показано, что в составе внНК мочи присутствуют как ДНК, так и РНК, размер фрагментов внДНК у мужчин и женщин отличается. Впервые обнаружено достоверное отличие концентраций внДНК в моче здоровых мужчин и пациентов с ОЗПЖ, а также выявлена корреляция между концентрацией цирДНК плазмы или общей (свободной+связанной) цирДНК крови и внДНК мочи. Впервые обнаружена корреляция между ДНКазной активностью крови/мочи и концентрациями цир/внДНК, а также между ДНКазной активностью мочи и ДНКазной активностью крови у пациентов с ОЗПЖ. Впервые показано, что данные об аберрантном метилировании внНК крови и мочи онкологических больных могут быть получены в результате прямого секвенирования цир/внДНК после их химической конверсии. При помощи микрочипов Human CpG island Microarray HCGI12k впервые проведен сравнительный анализ цирДНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с доброкачественной гиперплазией (Д111Ж) и раком (РПЖ) предстательной железы с целью рационального поиска диагностически значимых аберрантно метилированных онкомаркеров. Обнаружено 117 фрагментов, имеющих достоверные различия в уровнях метилирования у больных РПЖ и здоровых доноров, причем метилирование

39 фрагментов не зависит от возраста пациента, а 8 фрагментов являются уникальными последовательностями.

Апробация работы. По материалам диссертации получен 1 Российский патент и опубликовано 9 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на международных конференциях: «Фундаментальные науки-медицине» (Новосибирск, 2005); «The International conference on chemical biology» (Новосибирск, 2005); «CNAPS-IV, V, VI, VII» (Лондон, 2005, Москва, 2007, Гонг Конг, 2009, Мадрид, 2011); «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006); «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибирск, 2006 и 2007); VI международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); «60th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics» (Вашингтон, 2010); «AACR 102nd Annual Meeting» (Орландо, 2011).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов, Списка сокращений и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 180 страницах, содержит 44 рисунка и 14 таблиц. Библиография включает 456 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка методических подходов к исследованию циркулирующих ДНК крови и внеклеточных ДНК мочи 1.1. Подготовка образцов циркулирующих/внеклеточных ДНК

В формирование пула цирДНК крови, равно как и внДНК биологических жидкостей, вносят вклад клетки практически всех органов, в том числе и клетки опухолей, поэтому цир/внДНК, как правило, обнаруживаются в низких концентрациях и представляют собой набор фрагментов ДНК разного размера (Fleischhacker М, et al., 2007). Для эффективной детекции специфических последовательностей в пуле цир/внДНК необходимо использовать эффективные методы выделения, позволяющие получать достаточное количество внДНК. Наиболее подходящим методом выделения цирДНК на сегодняшний день является использование стекловолокнистых сорбентов (Qiagen, Norgen, FitAmp и т.д.), однако коммерчески доступные наборы для выделения ДНК не позволяют выделять внДНК из мочи с приемлемой эффективностью. Поэтому был разработан метод, позволяющий с эффективностью не менее 50% выделять как РНК, так и ДНК, длиной от 100 п.н до нескольких десятков тысяч п.н. из плазмы крови и мочи, основанный на использовании специально активированных стекловолокнистых сорбентов. Для выделения ДНК из больших объемов мочи (до 10 мл) был разработан отдельный протокол с использованием мелкодисперсного активированного стекла. Показано, что препараты НК, полученные по этим протоколам, пригодны для использования в ПЦР-анализе без дополнительных стадий очистки или концентрирования. Разработанные

методы выделения НК были использованы для выделения внНК из мочи здоровых доноров, пациентов с ДГПЖ и РПЖ.

Для увеличения концентрации цирДНК в микрочиповом анализе был разработан метод концентрирования ДНК. Была исследована эффективность осаждения/концентрирования цирДНК пятью разными способами (в качестве со-осадителя везде -использовали гликоген): 1) осаждение этанолом; 2) осаждение ацетоном в присутствии ацетата натрия; 3) осаждение ДНК в присутствии триэтиламина (ТЭА); 4) высушивание образцов на вакуумном концетраторе SpeedVac; 5) лиофилизация образцов на установке MLW-LGA 05. Поскольку большинство коммерческих наборов для выделения ДНК содержат в элюирующем буфере Трис-HCl, так же было оценено его влияние на процесс концентрирования ДНК. Оценку количеств оставшейся после концентрирования цирДНК проводили при помощи интеркалирующего красителея PicoGreen и при помощи количественной мультиплексной TaqMan ПНР (LINE1 повторы и а-сателлитные элементы ДНК человека). Было показано, что осаждение цирДНК ацетоном в присутствии ТЭА является лучшим для концентрирования цирДНК крови, обеспечивая хорошую сходимость результатов и высокий выход цирДНК (более 90%), что и было использовано в дальнейшей работе.

1.2. Бисульфитная конверсия внеклеточных/циркулирующих ДНК

Золотым стандартом исследования метилирования ДНК в настоящее время является процедура химической конверсии, позволяющая эффективно превращать неметилировнные цитозины в урацилы при стабильности метилированных, остающихся интактными. Для выбора оптимального варианта обработки ДНК с наименьшими ее потерями мы сравнили эффективность химической конверсии ДНК при помощи трех коммерчески доступных наборов, а именно EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Германия), EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research, США) и CpGenome Fast DNA Modification Kit (Chemicon, США). Для тестирования была использована цирДНК, выделенная из объединенной плазмы крови, полученной от 70 здоровых доноров (цирДНК-ЗД), и от 20 больных РПЖ (цирДНК-РПЖ), а также геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов здоровых доноров (гДНК), и полностью метилированная ДНК (гметДНК) (Billerica, США). Количество ДНК до и после химической конверсии оценивали при помощи количественной метил-независимой ПЦР LINE-1 повторов. В качестве стандартов для построения калибровочных кривых были использованы ПЦР-продукты, полученные из ДНК до и после конверсии. Эффективность химической конверсии отдельных цитозинов оценивали при помощи пиросеквенирования на платформе PSQ 96МА, которая позволяет определять уровень метилирования 10-12 CpG-динуклеотидов при секвенировании одного участка ДНК длиной до 80 н. (Dupont J, et al, 2004). Точность пиросеквенирования составила 96%.

Таблица 1. Степень метилирования (%) индивидуальных цитозинов в CpG-динуктеотидах гена RARbeta2 (Х56849.1, 951-1007)

Коммерческий набор ДНК ДНК нг Средняя* степень метилирования % и (SD) для индивидуальных CpG-сайтов (1-8) Среднее (SD), %

1 2 3 4 5 6 7 8 Все 8 сайтов

Qiagen гметДНК 10 99 (1.4) 99 (0.7) 96 (0.7) 99 (1.4) 100 (0.0) 100 (0.0) 83 (2.8) 100 (0.0) 97 (0.9)

500 96 (1.4) 97(1.4) 96 (1.4) 96 (1.4) 99 (0.0) 100(0.0) 84 (2.1) 100 (0.0) 96(1)

гДНК 10 5(0.7) 8(1.4) 5(0.7) 4(2.1) 10 (0.7) 17(1.4) 4 (2.8) 18 (4.2) 9(1.8)

500 6 (0.7) 6 (0.0) 7 (1.4) 6(0.7) 9 (0.0) 15 (0.7) 8 (1.4) 12 (0.7) 7 (0.7)

цирДНК-ЗД 80 6(1.4) 6(0.7) 7(1.4) 8 (2.1) 8 (0.7) И (0.7) 7(2.8) 10 (2.8) 8(1.6)

цирДНК-РПЖ 80 22 (1.4) 22 (1.4) 21 (1.4) 21 (0.7) 24 (0.7) 20 (2.1) 10 (2.8) 19 (1.4) 20 (1.5)

Zymo Research гметДНК 10 94 (3.5) 95 (0.7) 89 (7.1) 90 (6.4) 95 (3.5) 93 (4.9) 74(7.1) 90 (7.1) 90(5)

500 96 (0.7) 97 (0.7) 96 (0.7) 96 (0.7) 99 (0.7) 99 (0.7) 77 (3.5) 100 (0.0) 95(1)

гДНК 10 И (2.8) 5 (0.7) 11(2.8) 6(1.4) 8 (0.7) 7(0.7) 6 (2.8) 5(1.4) 7 (1.7)

500 4(0.7) 5(1.4) 6(1.4) 5 (0.0) 7(2.1) 9 (0.7) 5(1.4) 8 (0.7) 6(1.1)

цирДНК-ЗД 80 5 (2.8) 5 (1.4) 5 (2.8) 4(1.4) 6 (0.7) 8(1.4) 5 (2.8) 7(1.4) 6 (1.8)

цирДНК-РПЖ 80 20 (2.8) 16 (0.7) 29(7.1) 30 (3.5) 26 (4.9) 14 (4.9) 7(3.5) 12 (6.4) 19 (4.2)

Chemicon гметДНК 10 99 (0.7) 99 (0.7) 99 (0.7) 99 (0.7) 100 (0.7) 100(9.9) 74 (5.7) 100 (1.4) 96 (2.6)

500 98 (0.7) 98 (0.7) 97 (0.7) 98 (0.7) 100 (0.7) 99 (5.7) 72 (2.8) 97 (2.1) 95 (1.8)

гДНК 10 7(1.4) 9(2.1) 7(1.4) 7(2.8) 7(1.4) 5(2.8) 7(4.2) 5(2.1) 7 (2.3)

500 8 (0.0) 8 (0.7) 9 (0.0) 8 (0.7) 5 (0.7) 6(1.4) 3 (2.8) 5 (1.4) 7(1)

цирДНК-ЗД 80 4 (1.4) 4 (0.7) 5 (1.4) 5(2.8) 3 (1.4) 7 (2.8) 4(3.5) 4 (2.8) 5(2.1)

цирДНК-РПЖ 80 23 (2.8) 24 (1.4) 27(1.4) 27 (2.8) 30 (0.7) 16 (9.9) 9 (5.7) 15(2.1) 21 (3.4)

Было показано, что эффективность химической конверсии и уровень недоконверсии всех образцов ДНК при использовании всех коммерческих наборов в целом не отличаются. Уровень метилирования индивидуальных цитозинов после химической конверсии разными наборами также отличается незначительно (Таблица 1).

Данные о сходимости отражают эффективность извлечения ДНК разного размера, структуры и состава, и демонстрируют, что набор производства Zymo Research наиболее универсален по отношению к размеру вовлекаемой в конверсию ДНК и позволяет сохранить практически всю (Таблица 2) исходную ДНК.

Таблица 2. Выход (%) ДНК после обработки различными коммерческими наборами

ДНК Стартовое количество Qiagen Zymo Research Chemicon

Среднее % (SD) Среднее % (SD) Среднее % (SD)

гметДНК Юнг 5.8 (0.05) 92(8) 2.7 (0.2)

500 нг 22(4) 68(3) 19(7)

г ДНК Юнг 16(4) 81 (37) 14(2)

500 нг 20(4) 75 (9) 21(7)

цирДНК-ЗД 80 нг 16(2) 100 (5) 19(7)

цирДНК-РПЖ 80 нг 11(1) 100 (5) 41(13)

Среднее (SD) 15(3) 86(16) 19(7)

Сходимость, % (от/до) -71/+10 -9/+33 -87/+95

На основании полученных данных в дальнейшей работе мы использовали набор реактивов для химической конверсии ДНК EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research).

2. Циркулирующие/внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы

Работа со здоровыми донорами и больными онкологическими заболеваниями предстательной железы проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288). Получено разрешение этического комитета ИХБФМ СО РАН.

Образцы венозной крови собирали в антикоагуляционный раствор (К3ЭДТА). После отделения плазмы, которая являлась источником свободной цирДНК, проводили последовательную двустадийную обработку клеток крови: фосфатным буфером, содержащим 5мМ ЭДТА (ФБ-ЭДТА элюат), затем 0.125% раствором трипсина в условиях, не приводящих к лизису клеток (трипсиновый элюат) (ЬаЫопоу, Р., е/ а1, 2004).

2.1. Определение уровня общего простатического специфического антигена (ПСА) в крови здоровых доноров и онкологических больных

Поскольку концентрация общего ПСА в плазме крови здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ используется в клинической медицине в качестве одного из основных диагностических признаков РПЖ, у всех вовлеченных в исследование пациентов была определена концентрация общего ПСА. В плазме крови здоровых доноров концентрация ПСА соответствовала клинической норме и не превышала 2.8 нг/мл. В крови больных ДГПЖ и РПЖ концентрация ПСА составляла 0-31.7 нг/мл и 0-103.1 нг/мл, соответственно; концентрация ПСА у больных ДГПЖ была повышена в 36% случаев, а у больных РПЖ в 81% случаев.

2.2. Определение концентраций циркулирующих/внеклеточных ДНК при помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и PicoGreen

2.2.1. Определение концентраций циркулирующих ДНК в плазме крови

Концентрации цир/внДНК в образцах мочи, плазмы и элюатов с поверхностей клеток крови определяли при помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 (моча, трипсиновый элюат) и PicoGreen (плазма, ФБ-ЭДТА элюат) после выделения цир/внДНК. С учетом соотношения объемов плазмы, элюатов с клеточной поверхности и суммарной крови минимальный уровень детекции цирДНК в крови составил 0.4 нг/мл крови для плазмы, 2 нг/мл крови для ФБ-ЭДТА элюата и 20 нг/мл крови для трипсинового элюата. Средняя концентрация цирДНК в плазме здоровых доноров в возрасте от 37 до 60 лет составила 13±4 нг/мл крови (Р<0.01) (Рис. 1).

700-]

sooH

500^

2 300

100-

Рис.1. Концентрации

цир/внДНК в крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями

предстательной железы

(ОЗПЖ).

О—Здоровые доноры (п=40) □-Больные с ОЗПЖ (п=41)

Поскольку концентрации свободных и связанных с поверхностью клеток цирДНК в крови и внДНК в моче у пациентов с ДГПЖ достоверно не отличались от таковых у больных РПЖ, две эти группы больных были объединены в общую группу пациентов с ОЗПЖ. Концентрация свободной цирДНК крови в группе больных ОЗПЖ в возрасте от 45 до 84 лет достоверно отличается от концентрации в группе здоровых доноров (Р<0.01), детектируется в 100% случав и составляет 72±18 нг/мл крови (Р<0.01) (Рис. 1).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в крови здоровых доноров основная часть цирДНК связана с поверхностью клеток крови (Лактионов, П., и др., 2004), при развитии злокачественных новообразований желудка, легкого и молочной железы концентрация связанной цирДНК уменьшается. В этой работе были измерены концентрации цирДНК, связанных с поверхностью клеток крови, у пациентов с ОЗПЖ. ЦирДНК в концентрации выше уровня детекции были обнаружены в 41% образцов ФБ-ЭДТА элюатов здоровых доноров, составляя в среднем 3±0.5 нг/мл крови (Рис. 1) (Р<0.01). В крови пациентов с ОЗПЖ концентрация цирДНК в ФБ-ЭДТА элюате детектировалась в 83% случаев, составляя 12±2 нг/мл крови (Р<0.01) и достоверно отличаясь от таковой у здоровых доноров (Р<0.01).

В трипсиновых элюатах с поверхности клеток крови здоровых доноров концентрация цирДНК была ниже минимального уровня детекции только у четырех доноров, у остальных ее значение составляет в среднем 31±2 нг/мл крови (Р<0.01) (Рис. 1). В трипсиновых элюатах с поверхности клеток крови пациентов с ОЗПЖ цирДНК обнаружена у всех больных, ее концентрация составляет 47±4 нг/мл крови (Р<0.01) и достоверно отличается от таковой из крови здоровых доноров (Р<0.01).

Концентрация суммарных, связанных с клеточной поверхностью цирДНК (сум-скп цирДНК), в крови (ФБ-ЭДТА + трипсиновая фракции) в группе здоровых доноров в среднем составляет 32±2 нг/мл крови (Р<0.05), а в группе пациентов с ОЗПЖ - 59±5 нг/мл крови (Р<0.01) (Рис. 1) и достоверно отличается от таковой в крови здоровых доноров (Р<0.01). Используя критерий Манна-Уитни, нами были обнаружены достоверные отличия и в суммарных концентрациях всей цирДНК крови (свободной и связанной) между здоровыми донорами и пациентами с ОЗПЖ (Р<0.01) (47±5 нг/мл крови у здоровых и 135±21 нг/мл крови у больных пациентов).

При оценке отношения концентраций свободной цирДНК к суммарной цирДНК всей крови (Рис. 2) было обнаружено, что в плазме здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ в среднем находится 13% и 41% цирДНК, соответственно, и эти отличия являются достоверными (Р<0.01). При анализе цирДНК, связанной с клетками крови, оказалось, что во фракции ФБ-ЭДТА здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ содержится 4%±7% (Р<0.01) и 17%±14% (Р=0.03) от сумм-скп цирДНК, соответственно (Рис. 3), причем эти отличия также достоверны (Р<0.01).

100-] 80604020-

25%-75%

£ ?

* а. 60

больные

здоровые

больные

здоровые

Рис. 2. Относительное содержание цирДНК во фракциях свободной и связанной с клеточной поверхностью цирДНК в крови здоровых доноров и больных с ОЗПЖ.

Рис. 3. Относительное содержание цирДНК во фракциях цирДНК, связанной с клеточной поверхностью в крови здоровых доноров и больных с ОЗПЖ.

Обнаруженное нами изменение распределения уровня ДНК внутри группы сум-скп цирДНК с одновременным увеличением уровня цирДНК в плазме крови больных ОЗПЖ может являться следствием изменения активности протеаз и нуклеаз крови. Известно, что повышенный уровень металлопротеиназ обеспечивает опухоли ангиогенез и активную инвазию в прилежащие ткани (Клишо Е., и др., 2003), кроме того, при некоторых типах рака наблюдается повышенная активность протеаз крови (Farias Е, et al, 2000).

Кроме того, мы обнаружили достоверные корреляции между концентрацией свободной цирДНК в плазме и концентрацией цирДНК в ФБ-ЭДТА элюате (R=0.67, Р<0.01), а также между концентрацией цирДНК в ФБ-ЭДТА элюате и трипсиновом элюате (R=0.65, Р<0.01) у пациентов с ОЗПЖ. Такая зависимость свидетельствует о возможности обмена свободной цирДНК плазмы с скп-цирДНК и, возможно, отражает патобиохимические процессы, сопровождающие развитие заболевания.

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что для разделения групп здоровый-больной можно использовать все возможные корреляции и соотношения между цирДНК и скп-цирДНК, однако наибольшей достоверностью обладают данные о концентрации цирДНК внутри категории «сум-скп цирДНК». Следует отметить, что в качестве источника диагностического материала могут быть использованы цирДНК всех пулов. Действительно, ранее было показано, что аберрантно метилированные ДНК, характерные для клеток опухолевой ткани, могут быть обнаружены как в плазме, так и в ФБ-ЭДТА и трипсиновом элюатах (Skvortsova Т, et al, 2006). Полученные данные о возможности обмена разных пулов цирДНК позволяют предположить, что наиболее точная

диагностическая информация может быть получена при анализе суммарной (свободной и связанной) цирДНК крови.

2.2.2. Определение концентраций внеклеточных ДНК мочи

Известно, что ДНК крови выводятся из организма двумя основными путями: через печень (с желчью и последующим поступлением в кишечник) (Чернышева М., и др, 2010) и почки, проникая сквозь почечный барьер и выводясь, таким образом, из организма с мочой (Вандер А. 2000). Однако, согласно литературным данным, после попадания ДНК в печень и прохождение ее через кишечник в каловых массах цирДНК остаются лишь небольшие количества, а в мочу после прохождения сквозь почечный барьер может попадать внДНК, размер фрагментов которой и количество потенциально позволяют выявлять диагностически значимые маркеры (Geary R, et al, 2001; Botezatu I. 2000). Кроме того, ДНК в мочу может попадать и непосредственно из клеток мочеполового тракта (Zhang J, et al, 1999).

В представленной работе минимальный уровень детекции концентрации внДНК в моче составил 3.8 нг/мл мочи. ВнДНК в концентрации выше уровня детекции была обнаружена во всех образцах мочи, составляя 14±3 нг/мл (Р<0.01) у здоровых доноров и 60±15 нг/мл (Р=0.01) у больных ОЗПЖ (Рис. 1). Концентрации внДНК в моче здоровых доноров достоверно ниже, чем в моче пациентов с ОЗПЖ (Р<0.01). Нами не выявлено зависимости концентрации внДНК мочи от концентрации цирДНК плазмы или общих цирДНК крови (свободные+связанные с клеточной поверхностью) внутри исследуемых групп. Однако, если рассматривать всех пациентов и доноров вместе, то наблюдается корреляция между концентрацией цирДНК плазмы (R=0.31, Р<0.01) или общей цирДНК (R=0.26, Р=0.02) и внДНК мочи.

Причинами увеличения количества ДНК в моче при развитии онкологических заболеваний могут служить как патофизиологические изменения, так и изменение активности нуклеаз этой жидкости.

2.2.3. Исследование размера фрагментов внеклеточных нуклеиновых кислот мочи

Известно, что через юкстагломерулярный аппарат могут проникать молекулы ДНК размером не более 100 п.н. С учетом упаковки ДНК, ее циркуляции в крови преимущественно в виде нуклеосом, размер внДНК должен быть еще меньше. Тем не менее, было показано, что в моче может быть обнаружена ДНК клеток опухолей, локализованных вне мочеполовой системы, и, следовательно, такая ДНК транспортируется в мочу. Поскольку состав и размер внНК мочи интересен не только для детекци РПЖ, но и рака мочевого пузыря и рака почки, в исследование были включены клинически здоровые мужчины и здоровые женщины. Для определения состава внНК мочи здоровых доноров, выделенные из супернатанта мочи образцов внНК были обработаны ДНКазой I, РНКазой А и РНКазой Н (не обладающими перекрестными активностями) в условиях исчерпывающего гидролиза.

Основная часть внНК в моче мужчин и женщин представлена фрагментами ДНК размером 150-400 п.н. В моче женщин внНК менее фрагментированы и представлены размером от 1.5 т.п.н. до ~ 19 т.п.н. (Рис. 4).

180 п.н.

Рис. 4. ВнНК мочи. ВнНК были выделены из мочи здоровых мужчин (А) и женщин (Б) и проанализированы при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле, содержащем 0.0003% бромистого этидия, до и после проведения исчерпывающего гидролиза нуклеазами (ДНКазой I, РНКазой А и РНКазой Н).

2.3. Исследование нуклеазной активности при помощи иммуноферментного анализа

2.3.1. Исследование нуклеазной активности плазмы крови здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы

Известно, что экзогенные ДНК быстро деградируют в плазме крови (Sands Н, et al, 1994). Основными дезоксирибонуклеазами, присутствующими в крови человека, являются нейтральная ДНКаза I, кислая ДНКаза II и щелочная фосфодиэстераза I. Кроме того, в крови присутствуют и ингибиторы нуклеаз, например, мономерный актин (G-актин). Одной из причин достоверного увеличения концентрации цирДНК в плазме крови больных с ОЗПЖ может являться уменьшение активности ДНК-гидролизующих ферментов. Для того, чтобы выяснить, коррелирует ли активность ДНКаз крови с концентрацией цирДНК, мы измерили активность дезоксирибонуклеаз в плазме крови здоровых доноров и больных пациентов (Рис. 5).

В крови здоровых доноров ДНКазная активность детектировалась в 92% случаев и составляла 0.19±0.04 ед.акт/мл крови (Р<0.01), а в крови пациентов с ОЗПЖ детектировалась в 81% случае и составляла 0.06±0.007 ед.акт/мл (Р<0.01) крови (Рис. 5).

S 20-

S S 15-s s

î

о

-медиана

!_ 25%-75%

« | 10-

Щр

a Q 6_r 0 дй° Рис. 5. ДНКазная активность

3 0.4- о° плазмы крови и мочи у здоровых

Была обнаружена достоверная обратная корреляция между концентрацией свободной цирДНК и активностью ДНКаз плазмы крови как у здоровых доноров, так и у больных пациентов (R—0.57, Р<0.01). Мы не обнаружили достоверных корреляций между концентрацией цирДНК в ФБ-ЭДТА элюате или трипсиновом элюате и ДНКазной активностью плазмы крови внутри групп здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ. Однако, при анализе обеих групп вместе была обнаружена отрицательная корреляция между ДНКазной активностью плазмы крови и концентрацией цирДНК в ФБ-ЭДТА элюате (R=-0.36, PcO.Ol) или концентрацией цирДНК в трипсиновом элюате (R=-0.28, Р=0.02). Исходя из полученных данных о корреляциях концентраций цирДНК в разных фракциях крови и ДНКазной активности в плазме крови можно сделать вывод о частичном и незначительном влиянии ДНКаз на цирДНК, связанные с поверхностью клеток крови, что указывает на достаточно прочное связывание цирДНК с клетками.

Причины снижения интегральной активности ДНКаз в крови онкологических больных по сравнению со здоровыми донорами не исследованы. Возможно, при развитии новообразований в крови повышается концентрация ингибиторов ДНКаз (Pan С, et al, 2001), что может приводить к снижению нуклеазной активности. Кроме того, высокая концентрация цирДНК крови также может уменьшать детектируемую активность ДНКаз.

2.3.2. Исследование нуклеазной активности мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы

Известно, что в просвет нефрона могут проходить комплексы с диаметром не более 6.4 нм (Покровский В, и др., 1997) и молекулярным весом не более 70 кДа, таким образом, можно предположить возможность появления нуклеаз в моче не только из клеток мочеполового тракта, но и проникновения ДНКаз размером 38 кДа (ДНКаза I (Rosens treich D, et al, 1988)) и 36 к Да (ДНКаза II (Murai К, et al, 1980)) в мочу из крови. Было показано, что в моче здоровых мужчин ДНКазная активность составила 6.2±0.8 ед.акт/мл. В моче пациентов с

доноров и пациентов с ОЗПЖ.

плазма

моча

ОЗПЖ на фоне повышенной концентрации внДНК наблюдается достоверное понижение активности ДНКаз по сравнению со здоровыми донорами: 1.7±0.4 ед.акт/мл (Р<0.01) (Рис. 5). Ранее в нашей лаборатории было показано, что ДНКазная активность в моче здоровых женщин составляет 0.31±0.13 ед.акт/мл (Cherepanova A, et al, 2007). Именно отличия в ДНКазной активности могут быть причиной различий в размере внДНК в моче мужчин и женщин. К сожалению, мы не обнаружили корреляции между концентрацией внДНК и ДНКазной активностью в моче, а также концентрацией внДНК мочи и ДНКазной активностью в крови ни у здоровых доноров, ни у пациентов с ОЗПЖ. Однако у больных ОЗПЖ активность ДНКаз в крови коррелирует с таковой в моче (R=0.67, Р<0.05), что может указывать на инфильтрацию ДНКаз в мочу из крови у больных этой группы.

2.4. Исследование циркуляции и стабильности свободной ДНК и ДНК в составе биополимеров в крови

ЦирДНК представляют собой удобный материал для онкодиагностики, поскольку содержат в своем составе ДНК опухолевых клеток вне зависимости от локализации первичной опухоли. Одним из характерных признаков онкотрансформированных клеток является аберрантное метилирование промоторных областей генов опухолевой супрессии, причем аберрантно-метилированные ДНК считаются наиболее перспективными онкомаркерами в пуле цирДНК крови из-за их распространенности и особенностей анализа (Mikeska Т, et al, 2012). Тем не менее, циркуляция метилированной ДНК (метДНК) в крови мало исследована, хотя известно, что структура метДНК отличается от неметилированной ДНК склонностью к B-Z переходу, формированию триплексов и ассоциацией с рядом специализированных метил-цитозин связывающих белков. Очевидно, что эти факторы могут влиять на стабильность мет-цирДНК в крови. В связи с этим, было выполнено сравнительное исследование циркуляции свободных ДНК и метДНК, а также ДНК и метДНК в составе нуклеопротеиновых комплексов крови.

2.4.1. Исследование стабильности свободной ДНК и ДНК плазмы крови человека в крови мыши в экспериментах in vitro

Для исследования чувствительности свободной ДНК и метДНК к действию сывороточных нуклеаз были получены метилированные и неметилированные ПЦР-продукты (мПЦРп, нПЦРп) промоторной области гена GSTP1. Для исследования стабильности ДНК и метДНК в составе природных нуклеопротеиновых комплексов была использована плазма крови больного РПЖ, содержащая 70% метилированного и 30% неметилированного фрагмента промоторной области гена GSTP1. Ампликоны и плазму крови человека инкубировали с мышиной сывороткой в течение 5, 30, 60 и 120 мин (Рис. 6) и измеряли концентрацию ДНК-мишени при помощи количественной ПЦР. Было показано, что уже через 5 мин инкубации остается менее 7% нПЦРп, а через 60 мин менее 5% (Рис. 6А). МетПЦРп в несколько раз стабильнее: более

50% мГТЦРп остается после 5 мин и 45% после 60 мин инкубации (Рис. 6А). Повышенная стабильность мПЦРп может быть обусловлена менее эффективным гидролизом метДНК под действием ДНК-гидролизующих ферментов сыворотки крови или более эффективным связыванием метДНК с белками крови и экранированием ампликона от действия нуклеаз.

Иц«т№иров»>«»ц> ПЦР-праау*т Мвтнлирсяыымый ПДР-проду«

1

3 мв-

я

§ <о S

1

s •

О Суммарная ДНК -4r- Merivwpf аинап ДНК

5 ю i

îi

E>F"' км

Рис. 6. Стабильность ПЦР-продукта (164 п.н.), ПЦР-продукта, обработанного SssI метилазой, и циркулирующей ДНК плазмы человека в сыворотке мыши. 1 мкл ПЦР-продуктов инкубировали с 50 мкл мышиной сыворотки (А) в течение 5, 30 и 60 мин при 37°С. Десять микролитров плазмы здорового мужчины (Б) инкубировали с 25 мкл мышиной сыворотки в течение 5, 30, 60 и 120 мин при 37°С. Перед определением количества метилированной формы гена GSTP1 при помощи количественной ПЦР часть выделенной ДНК обрабатывали ресгриктазой Bshl236I. (В) Временная зависимость доли свободной метДНК человека в сыворотке мыши.

В результате исследования стабильности гДНК и гметДНК в мышиной сыворотке было обнаружено, что метилирование ДНК не влияет на ее стабильность. Однако в этом эксперименте в отличие от ранее описанного для определения концентрации ДНК вместо количественной ПЦР CpG богатого участка промоторной области гена GSTP1 были использованы количественные ПЦР a-Satellite элементов и LINE1 повторов, которые либо не содержат вовсе (LINE1), либо содержат лишь 3 (a-Satellite) CpG-островка в своем составе. Эти данные совпадают с результатами по стабильности нПЦРп (рис 6). По-видимому, принципиальной характеристикой ДНК, которая определяет ее стабильность, является не только метилирование цитозина в составе CpG динуклеотида, а плотность метилированных CpG динуклеотидов в ДНК. МетДНК в составе природных комплексов из плазмы крови человека также более стабильна по сравнению с ДНК (Рис. 6Б). После 120 мин ее количество в среднем составляет 10% (от 1 до 25%), а доля в пуле суммарной ДНК возрастает с 70% до -100% (Рис. 6В). Уровень же суммарной ДНК в среднем снижается до 60% (55%-65%), что, по-видимому, связано с гидролизом менее стабильной ДНК (Рис. 6Б).

2.4.2. Исследование циркуляции метилированной и неметшированной свободной ДНК и ДНК в составе природных комплексов in vivo

Для исследования стабильности ДНК ш vivo мПЦРп и нПЦРп промоторной области гена GSTP1 или аликвоту плазмы крови человека вводили в хвостовую вену мышей BALB/c, по истечению заданных промежутков времени кровь забирали из ретроорбитального синуса, выделяли ДНК и измеряли концентрацию ДНК-мишени при помощи количественной ПЦР. Через 5 мин после инъекции в крови мыши обнаруживается 10% введенного нПЦРп (Рис. 7А) и только 1% мПЦРп (Рис. 7Б). Однако концентрация нПЦРп быстро уменьшается (время полувыведения 4.1 мин), в то время как концентрация мПЦРп в крови уменьшается медленнее (время полувыведения 8.8 минут). Через 1 час в крови остается 0.01% мПЦРп (Рис. 7Б) и только 0.0013% нПЦРп (Рис. 7А), причем такая концентрация нПЦРп сохраняется на протяжении последующих 3-х часов, в то время как концентрация мПЦРп плавно уменьшается (до 0.0001% от введенного). Учитывая то, что мет-ампликон в сыворотке крови намного стабильнее неметилированного, такой характер циркуляции мет-ампликона может быть связан с его более эффективным накоплением в органах и тканях (Kawabata К, el al, 1995) и последующей диффузией из мест депонирования.

При одновременном введении мПЦРп и нПЦРп характеристический график, описывающий их циркуляцию в крови, представляет собой суперпозицию таковых для отдельно инъецированных ампликонов. Таким образом, наличие в циркуляции метДНК не влияет на циркуляцию немДНК и наоборот. Другими словами, эти ДНК, по-видимому, не конкурируют за связывание с нуклеазами или иными компонентами крови и тканей, компонентами системы выведения, во всяком случае, в области исследуемых концентраций (Рис. 7Г). Через 5 мин после введения в хвостовую вену мыши аликвоты плазмы крови больного РПЖ в кровотоке обнаруживается приблизительно 6% от введенной экзогенной ДНК, и в течение последующих 45 мин концентрация ДНК в циркуляции падает до 2%. Затем концентрация экзогенной ДНК в крови немного увеличивается: через 2 часа в кровотоке циркулирует около 6.1% ДНК и далее ее количество незначительно падает в течение последующих 2-х часов (5.7%) (Рис. 7В).

А

В

Г 1

i

i-Ы—^

Рис. 7. Временная зависимость концентраций экзогенной ДНК инъецированной в кровь мыши. (А)

ПЦР-продукт (164 п.н.), (Б) метилированный ПЦР-продукт, (В) 40 мкл человеческой плазмы (содержащей по данным количественной ПЦР 70% метилированной формы промоторной области гена GSTP1), (Г) оба мПЦРп и нПЦРп (одновременно) инъецировали в хвостовую вену мыши. Через 5, 10, 20, 40, 60, 120, 240 мин после инъекций из орбитальной вены мыши забирали кровь, выделяли ДНК из плазмы крови и определяли ее количество при помощи количественной ПЦР.

Эти данные связаны, по-видимому, с депонированием ДНК в тканях и последующей диффузией депонированной ДНК в кровяное русло (Sands Н, et al, 1994). Было показано, что в составе цирДНК крови может присутствовать до 10% и более ДНК опухолевых клеток (Jahr S, et al, 2001). Полученные данные демонстрируют, что эта величина сильно зависит от выбранной ДНК мишени и может быть справедлива для одной мишени и не справедлива для другой. Тем не менее, длительная циркуляция метилированных CpG богатых ДНК как свободных от биополимеров, так и находящихся в составе природных комплексов, подтверждает их ценность в качестве потенциальных ДНК-онкомаркеров. Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что 1) свободная ДНК длительно циркулирует в кровяном русле; 2) метДНК стабильнее неметилированной; 3) цирДНК плазмы человека циркулирует в кровотоке мыши в течение длительного времени и доля метДНК в пуле суммарных ДНК со временем возрастает, что говорит о большей стабильности метДНК по сравнению с неметилированной.

2.5. Исследование различий в паттернах метилирования циркулирующей/внеклеточной ДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы

Известно, что многие маркеры, часто встречаемые в образцах опухолевой ткани, обнаруживаются в составе цирДНК крови с существенно меньшей частотой. Очевидной причиной такого несоответствия является зависимость стабильности ДНК в крови от ее нуклеосомной укладки, упаковки в частицы, связывания с белками сыворотки крови и т.д. Концентрация ДНК опухолевых клеток в общем пуле цирДНК может варьировать в диапазоне от 0.005% до

93% (Diehl F, et al, 2008; Jahr S, et al, 2001). Для того, чтобы оценить возможность выявления онкоспецифических аберрантно-метилированных ДНК при помощи прямого анализа цирДНК, мы исследовали статус метилирования цитозинов промоторной области гена GSTP1 (1001-1302, Х08058) в пулах цир/внДНК, выделенных из крови и мочи здоровых доноров, больных ДГПЖ и РПЖ, методом секвенирования по Сенгеру. ЦирДНК обрабатывали бисульфитом натрия, амплификацировали промоторную область гена GSTP1 при помощи [32Р]-меченого прямого или обратного праймеров, не содержащих в своем составе CpG динуклеотидов. После очистки при помощи акриламидного гель-электрофореза полученные ПЦР-продукты подвергали анализу методом Сэнгера. Было обнаружено, что цир/внДНК, выделенная из мочи, плазмы крови, ФБ-ЭДТА и трипсиного элюатов с поверхностей клеток крови, у всех больных РПЖ имеет одинаковый профиль метилирования промоторной области гена GSTP1, который не зависит от стадии заболевания. Однако профиль метилирования цитозинов изучаемого гена во внДНК больных РПЖ отличается от профиля метилирования ДНК здоровых доноров и больных ДГПЖ. Все цитозины в составе промоторной области гена GSTP1 в группах здоровых доноров и больных ДГПЖ неметилированы, тогда как в группе больных РПЖ все цитозины метилированы. Полученные данные показывают, что, несмотря на присутствие в крови и моче больных РПЖ нем-фрагментов промоторной области гена GSTP1, количество мет-фрагментов этого гена достаточно для того, чтобы получить данные о локализации метилированных цитозинов прямым секвенированием цирДНК. Поскольку ДНК была амплифицирована с использованием праймеров, не содержащих CpG-динуклеотидов, можно сделать вывод о значительном вкладе цирДНК опухолевого происхождения в общий пул внДНК, по меньшей мере для некоторых мишеней. Необходимо отметить, что именно такие мишени представляют особый интерес для диагностики онкологических заболеваний.

Таким образом, была показана принципиальная возможность получать информацию относительно профиля метилирования областей отдельных генов при помощи секвенирования, что позволило перейти к следующему этапу работы - поиску онкомаркеров при помощи микрочипов, предназначенных анализа метилирования человеческой геномной ДНК.

2.6. Результаты исследования циркулирующей ДНК крови при помощи

CpG island microarray

ЦирДНК были выделены из плазмы 20 здоровых доноров, 20 больных ДГПЖ и 20 больных РПЖ. Средний возраст пациентов с ДГПЖ составил 68.5±9.2 года, РПЖ — 68.7±6.4 года, здоровых доноров - 46.3±6.5 лет. Все больные РПЖ имели опухоли, непосредственно расположенные в простате (без метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов (T2_3N0Mx)). Для унификации приготовления ДНК проб от онкологических больных и

здоровых доноров во всех образцах плазмы крови были определены уровень ПСА, который в норме не превышал 3 нг/мл, и концентрации выделенной ДНК методом мультиплексной ПЦР LINE1 элементов и á-satellite повторов. Концентрация цирДНК в плазме крови здоровых доноров составляет от 4 до 26 нг/образец, у пациентов с ДГПЖ от 3 до 75 нг/образец и у больных РПЖ от 4 до 73 нг/образец. Полученные данные анализа при помощи микрочипов были проанализированы с использованием программного обеспечения GenePix Pro software 6.1. и объектов BLAT сервера (www.ensembl.org). Первичные данные подвергались количественному контролю с последующей предварительной обработкой данных и статистическим анализом, как подробно описано в (Ponzielli R, et al, 2008). Для оценки возрастной зависимости между больными РПЖ и здоровыми донорами использовалась вторичная линейная модель (Linear Mixed Effect models) для идентификации участка, в котором модифицированный сигнал ассоциирован с возрастом.

При сравнении профиля метилирования цирДНК у больных ДГПЖ и РПЖ достоверных отличий обнаружено не было. При сравнении профиля метилирования цирДНК здоровых доноров и пациентов с РПЖ были выявлены изменения ДНК, связанные как с заболеванием, так и зависящие от возраста человека. Было обнаружено 117 фрагментов, имеющих достоверные различия в уровнях метилирования у больных РПЖ и здоровых доноров. Из них 39 фрагментов не зависят от возраста пациента, включая 8 фрагментов (Таблица 3) уникальных последовательностей, которые могут представлять интерес в качестве потенциальных онкомаркеров.

Таблица 3. Отличия в метилировании ДНК между здоровыми донорами и больными раком предстательной железы, не зависящие от возраста пациента (яСЮ.05)

№ ЗначениеР (РПЖ.ЗД) Положение в геноме ген Описание Функции

1 0.00013 chrl2:5383586 4-53836647 PRR13 пролин богатый 13 белок изоформа 2 регуляция транскрипции

2 0.00017 chrll-.6400138 8-64001774 DNAJC4 DnaJ (Hsp40) гомолог, подсемейство С, член 4 отвечает за «раскручивание» белков

3 9.86*10-5 chr20:3537393 1-35375109 NDRG3 N-myc 3 изоформа а дифференцирование клеток, негативное влияние на рост клеток, сперматогенез

4 0.00026 chrll-.2752831 0-27528744 LIN7C lin-7 гомолог С экзоцитоз

5 0.00018 chrX:6144076-6144388 NLGN4X X-linked предшественник нейролигина 4 положительная регуляция роста органов, развитие ствола мозга, адгезия клеток

6 0.00024 chr3:18628480 0-186285518 TBCCD1 ТВСС домен, содержащий белок 1 клеточный морфогенез, контроль местоположения аппарата Гольджи и центросомы, регуляция формирования клеток и их миграции

7 0.00026 chr3-.42001551 -42001688 ULK4 unc-51 -подобная киназа 4 Участие в развитии и функционировании реснитчатого эпителия

8 0.00036 chr22:3866826 5-38669098 TMEM18 4B Трансмембранный белок 184В

выводы

1. Показано, что концентрации свободной цирДНК, цирДНК, связанных с поверхностью клеточных элементов крови, и суммарных цирДНК (свободных и связанных с клетками) крови достоверно возрастают (Р<0.01) в группе пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы по сравнению со здоровыми донорами. Показано, что свободные цирДНК и цирДНК, связанные с клетками крови, могут обмениваться. Эти данные и данные о наличии онкоспецифических последовательностей в пулах цирДНК, связанных с клетками крови, демонстрируют, что относительную концентрацию аберрантно метилированных ДНК-маркеров необходимо определять не в пуле свободной цирДНК, а в общем пуле цирДНК крови.

2. Разработаны методы выделения и концентрирования внДНК (патент РФ № 2311640, 2006 г). Показано, что внНК мочи содержат как высокомолекулярную (до 19т.п.н.), так и низкомолекулярную (100-250 п.н.) фракции ДНК, концентрации внДНК в моче пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы достоверно возрастают по сравнению со здоровыми донорами (Р<0.01), и внДНК мочи могут быть использованы в качестве источника материла для диагностики рака предстательной железы.

3. Показано, что цирДНК, связанные с поверхностью клеток крови, более устойчивы к гидролизу под действием дезоксирибонуклеаз крови, а дезоксирибонуклеазы крови являются одним из основных факторов, определяющих концентрацию свободной цирДНК в этой биологической жидкости. У пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы обнаружена достоверная корреляция между активностями дезоксирибонуклеаз в крови и в моче (R=0.67, Р<0.05).

4. В экспериментах in vitro и in vivo показано, что в крови метилированные ДНК, как в виде чистых препаратов, так и в составе циркулирующих нуклеопротеиновых комплексов, стабильнее неметилированных, таким образом, с течением времени доля метилированных последовательностей в составе цирДНК крови возрастает.

5. Показано, что данные об аберрантном метилировании цирДНК крови онкологических больных могут быть получены в результате прямого секвенирования цирДНК после их химической конверсии. При помощи микрочипов Human CpG island Microarray HCGI12k проведен сравнительный анализ цирДНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с доброкачественной гиперплазией и раком предстательной железы и обнаружено 117 фрагментов, имеющих достоверные различия в уровнях метилирования между больными раком предстательной железы и здоровыми донорами (Р<0.05). Метилирование 39 фрагментов не зависит от возраста пациента и 8 фрагментов из них являются уникальными последовательностями и могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров онкологических заболеваний предстательной железы.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Bryzgunova, O.E., Skvortsova, Т.Е., Kolesnikova, E.V., Starikov, A.V., Rykova, E.Yu., Vlassov, V.V., Laktionov P.P. Isolation and comparative study of cell-free nucleic acids from human urine // Ann. NY Acad. Sei. -2006. -V. 1075. -P. 334340.

2. Брызгунова, O.E., Власов, B.B., Лактионов, П.П.. Современные методы диагностики рака предстательной железы // Биомедицинская химия. -2007. -Т. 53.-С. 128-139.

3. Cherepanova, A.V., Tamkovich, S.N., Bryzgunova, O.E., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. Deoxyribonuclease activity and circulating DNA concentration in blood plasma of prostate tumor patients // Ann. NY Acad. Sei. -2008. -V. 1137. -P. 218-221.

4. Bryzgunova, O.E., Morozkin, E.S., Yarmoschuk, S.V., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. Methylation-specific sequencing of GSTP1 gene promoter in circulating/extracellular DNA from blood and urine of healthy donors and prostate cancer patients // Ann. NY Acad. Sei. -2008. -V. 1137. -P. 222-225.

5. Тамкович, C.H., Черепанова, A.B., Брызгунова, O.E., Колесникова, Е.В., Пермякова, В.И., Власов, В.В., Лактионов, П.П. Активность дезоксирибонуклеаз в биологических жидкостях здоровых доноров и онкологических больных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. -Т. 145. -№ 7. -С. 97-100.

6. Брызгунова, O.E., Мак, В.В., Власов, В.В., Лактионов, П.П. Исследование стабильности и циркуляции метилированных ДНК — потенциальных онкомаркеров in vivo и in vitro // Молекулярная медицина. -2010. —№ 5. -С. 4247.

7. Bryzgunova, O.E., Bondar, A.A., Morozkin, E.S., Mileyko, V.A., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. A reliable method to concentrate circulating DNA // Anal. Biochem. -2011. -V. 408. -P. 354-356.

8. Córtese, R., Kwan, A., Lalonde, E., Bryzgunova, O., Bondar, A., Wu, Y., Gordevicius, J., Park, M., Oh, G., Kaminsky, Z., Tverkuviene, J., Laurinavicius, A., Jankevicius, F., Sendorek, D., Haider, S., Wang, S., Jarmalaite, S., Laktionov, P., Boutros, P., Petronis, A. Epigenetic markers of prostate cancer in plasma circulating DNA // Hum. Mol. Genet. -2012. -V. 21. -P. 3619-3631.

9. Bryzgunova, O.E., Laktionov, P.P., Skvortsova, Т.Е., Bondar, A.A., Morozkin, E.S., Lebedeva, A.O., Krause, H., Miller, K., Vlassov, V.V. Efficacy of bisulfite modification and recovery of human genomic and circulating DNA using commercial kits // Eur. J. Mol. Biol. -2013. -V. 1. -P. 1-8.

Ю.Лактионов, П.П., Тамкович, C.H., Скворцова, Т.Э., Брызгунова, O.E., Рыкова, Е.Ю., Власов, B.B. Способ выделения внеклеточных нуклеиновых кислот из мочи. Патент РФ на изобретение № 2311640. Приоритет от 27 марта 2006 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брызгунова, Ольга Евгеньевна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

0420136180?

На правах рукописи

БРЫЗГУНОВА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ КРОВИ И МОЧИ: ОСОБЕННОСТИ ЦИРКУЛЯЦИИ, ВЫВЕДЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Лактионов П.П.

Новосибирск - 2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................8

1Л Циркуляция дезоксирибонуклеиновых кислот в крови....................................................................8

1.1.1 Источники внеклеточных ДНК крови........................................................................................8

1.1:2 Состав циркулирующих в крови комплексов внеклеточных ДНК..........................................13

1.1.3 Факторы, влияющие на циркуляцию ДНК в крови..................................................................19

1.2 Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты мочи................................................................23

1.2.1 Механизмы появления внеклеточных ДНК в моче...................................................................23

1.2.2 ДНК-гидролизующие ферменты мочи......................................................................................26

1.3 Применение внеклеточных/циркулирующих ДНК в диагностике................................................28

1.3.1 ДНК-маркеры опухолевых клеток в состве внеклеточных ДНК крови................................28

1.3.2 ДНК-маркеры опухолевых клеток в составе внеклеточных ДНК мочи................................32

1.3.3 Методы исследования статуса метилирования ДНК...........................................................33

1.3.3.1. Выявление метилированных цитозинов без использования метилчувствительных нуклеаз рестрикции..............................................................................................................................................34

1.3.3.2. Выявление метилированных цитозинов в составе ДНК при помощи метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции........................................................................................................................39

1.3.3.3. Методы маштабного исследования метилирования геномов................................................42

1.3.4 Использование циркулирующих/внеклеточных ДНК в диагностике рака предстательной железы ......................................................................................................................................................48

1.3.4.1. Эпидемиология онкологических заболеваний предстательной железы..............................48

1.3.4.2. Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы ..................................................................................................................................................................49

1.4 Заключение..........................................................................................................................................55

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................................57

2.1. Материалы................................................................................................................................................57

2.1.1. Реактивы...........................................................................................................................................57

2.1.2. Оборудование....................................................................................................................................58

2.1.3. ПЦР системы, использованные в работе......................................................................................59

2.1.4. Клетки, используемые в работе......................................................................................................61

2.1.5. Лабораторные животные...............................................................................................................61

2.1.6. Клинические характеристики здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы...................................... ...........................................................61

2.2. Методы.....................................................................................................................................................64

2.2.1. Подготовка образцов крови и мочи................................................................................................64

2.2.1.1. Взятие образцов крови..............................................................................................................64

2.2.1.2. Приготовление плазмы крови и элюатов с поверхности форменных элементов крови.....65

2.2.1.3. Подготовка образцов мочи.......................................................................................................65

2.2.2. Определение нуклеазной активности в плазме крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы...................................................................66

2.2.2.1. Приготовление модифицированного субстрата.....................................................................66

2.2.2.2. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена.......................................................67

2.2.2.3. Определение ДНКазной активности иммуноферментным анализом...................................67

2.2.3. Выделение ДНК из образцов крови и мочи.....................................................................................68

2.2.3.1.Оптимизация методов выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови и мочи...............68

2.2.3.2. Выделение ДНК из образцов крови.........................................................................................69

2.2.3.3. Выделение ДНК из супернатанта мочи...................................................................................69

2.2.4. Культивирование клеток линии HeLa.............................................................................................69

2.2.5. Получение лейкоцитов человека......................................................................................................70

2.2.6. Выделение РНК из мембранно-цитозольной фракции клеток линии HeLa................................70

2.2.7. Выделение геномной ДНК из клеток линии HeLa и лейкоцитов человека..................................71

2.2.8. Приготовление стандарта фрагментированной геномной ДНК для последующего определения концентрации внДНКв моче...............................................................................................71

2.2.9. Определение концентраций цир/внДНК в крови и моче................................................................71

2.2.10. Определение концентрации простатического специфического антигена в плазме крови.....72

2.2.11. Исследование размера и состава внНК в моче здоровых мужчин и больных с онкологическими заболеваниями предстательной железы...................................................................72

2.2.12. Исследование циркуляции и стабильности препаратов очищенной ДНК и ДНК плазмы крови человека in vivo............................................................................................................................................73

2.2.12.1. Метилирование геномной ДНК..............................................................................................73

2.2.12.2. Приготовление ПЦР-продуктов промоторной области гена GSTP1..................................73

2.2.12.3. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени.......................................73

2.2.12.4. Оценка стабильности ДНК в сыворотке крови мыши.........................................................74

2.2.12.5. Эксперименты, выполненные на лабораторных мышах BALB/c.......................................74

2.2.12.6. Обработка крови мыши и выделение свободной цирДНК..................................................75

2.2.13. Секвенирование цир/внДНКметодом Сэнгера............................................................................75

2.2.13.1. Приготовление [32Р] меченых олигонуклеотидов.................................................................75

2.2.13.2. Бисульфитная модификация ДНК..........................................................................................76

2.2.13.3. Получение ДНК промоторной области гена GSTP1 (1001-1302, Х08058) при помощи полимеразной цепной реакции..............................................................................................................76

2.2.13.4. Секвенирование методом Сэнгера.........................................................................................77

2.2.14. Пиросеквенирование геномной ДНК и свободной цирДНК плазмы крови здоровых доноров и больных раком предстательной железы.................................................................................................77

2.2.14.1. Подготовка образцов ДНК......................................................................................................77

2.2.14.2. Модификация ДНК..................................................................................................................78

2.2.14.3. Количественная оценка ДНК до и после модификации......................................................78

2.2.14.4. Пиросеквенирование геномной и циркулирующей ДНК....................................................78

2.2.15. Исследование различий в паттернах метилирования внеклеточной ДНК плазмы крови здоровых доноров и больных аденокарциномой предстательной железы при помощи микрочипов 79

2.2.15.1. Оптимизация методов эффективного концентрирования цирДНК....................................79

2.2.15.2. Подготовка образцов цирДНК крови для сравнительного исследования при помощи CpG island microarray......................................................................................................................................80

2.2.15.3. Проведение микрочипового исследования CpG island microarray......................................80

2.2.16. Статистическая обработка данных...........................................................................................82

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................83

3.1 Разработка методических подходов к исследованию цирДНК крови и внДНК мочи.......................83

3.1.1. Измерение дезоксирибонуклеазной активности...........................................................................83

3.1.2. Подготовка образцов цир/внДНК...................................................................................................85

3.1.3. Бисульфитная конверсия внеклеточных ДНК...............................................................................92

3.2. Цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы..................................................................................................................................95

3.2.1. Определение уровня общего простатического специфического антигена (ПСА) в крови здоровых доноров и онкологических больных...........................................................................................95

3.2.2. Определение концентраций цир/внДНКпри помощи флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и PicoGreen.......................................................................................................................................96

3.2.2.1. Определение концентраций цирДНК в плазме крови............................................................96

3.2.2.2. Определение концентраций цирДНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови......................................................................................................................................................101

3.2.2.3. Определение концентрации внДНК мочи.............................................................................111

3.2.2.4. Исследование размера фрагментов внНК мочи....................................................................115

3.2.3. Исследование нуклеазной активности при помощи иммуноферментного анализа................118

3.2.3.1. Исследование нуклеазной активности плазмы крови здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы..............................................................118

3.2.3.2. Исследование нуклеазной активности мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы..............................................................122

3.2.4. Исследование циркуляции и стабильности свободной ДНК и ДНК в составе биополимеров в крови...........................................................................................................................................................124

3.2.4.1. Исследование стабильности свободной ДНК и ДНК плазмы крови человека в крови мыши в экспериментах in vitro.......................................................................................................................125

3.2.4.2. Исследование циркуляции метилированной и неметилированной свободной ДНК и ДНК в составе природных комплексов in vivo...............................................................................................128

3.2.5. Исследование различий в паттернах метилирования цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы..........................131

3.2.6. Исследование цирДНК крови при помощи микрочипового анализа CpG island microarray.....135

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................................................140

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................141

Список сокращений..........................................................................................................................................143

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................145

ВВЕДЕНИЕ

Внеклеточные нуклеиновые кислоты (внНК) в циркуляции крови как здоровых, так и больных людей были описаны еще в 1948 г [1]. Однако в то время эти данные не привлекли внимания научного сообщества. Исследование феномена внНК возобновилось только в 60-х годах прошлого века после того, как в крови больных системной красной волчанкой была достоверно обнаружена циркулирующая ДНК (цирДНК) [2]. В 70-х годах, повышение концентрации внеклеточной ДНК (внДНК) в крови было обнаружено и при развитии онкологических заболеваний [3]. Позднее, внНК были найдены в асцитной, лимфатической, спиномозговой и перитонеальной жидкостях, молоке, моче, слюне, желудочном и желчном соках, и даже в каловых массах [4].

Относительно механизмов генерации внНК, равно, как и механизмов, обеспечивающих их долговременную циркуляцию в кровотоке, нет единого мнения. По данным одних авторов основным источником циркулирующих нуклеиновых кислот в крови (цирНК) являются процессы некроза и апоптоза; другие ссылаются на возможную секрецию нуклеиновых кислот как здоровыми, так и опухолевыми клетками [5]. Известно, что внДНК могут циркулировать в крови в течение длительного времени, ускользая от действия ДНК-гидролизующих ферментов крови и, по-видимому, находясь в составе надмолекулярных комплексов. Действительно, по данным разных авторов, после введения в кровоток очищенных препаратов ДНК уже через 5 мин в крови детектируется менее 25% экзогенной ДНК [6-8], в то время как эндогенные ДНК, по-видимому, существенно более стабильны [9]. ЦирДНК в крови обнаруживают и в составе апоптотических телец, и в составе нуклеосом, кроме того, в составе белковых комплексов внДНК, по-видимому, не полностью экранирована белками, т.к. существуют методы ее детекции с использованием антител против ДНК [5, 10]. Помимо связывания цирДНК с белками плазмы крови [11-12], цирДНК взаимодействуют и с плазматической мембраной форменных элементов крови [13-15]. Известно, что основная часть цирДНК деградирует под действием нуклеаз [16-19], а оставшаяся часть распределяется по различным органам и тканям [8] и выводится из организма преимущественно с мочой [7]. Очевидно, что структура и упаковка ДНК могут влиять на ее стабильность, в частности, метилирование цитозинов способствует переходу ДНК из В в Ъ форму [20], может приводить к нарушению нуклеосомной укладки ДНК и состава нуклеопротеиновых комплексов и, таким образом, к изменению стабильности и времени циркуляции определенных фрагментов ДНК в биологических жидкостях.

В настоящее время большинство исследований вн/цирНК ориентировано на поиск диагностически значимых маркеров, которые могут быть использованы в медицинской диагностике. Однако, несмотря на лавинообразный рост публикаций в этой области,

наблюдающийся в последние 10 лет, в настоящее время на европейском рынке представлены лишь тест на рак кишечника «Epi proColon test», направленный на детекцию метилированной формы гена septin 9, и тест на рак легкого, основанный на выявлении гена SHOX2 (Epigenomics, Германия) в пуле цирДНК плазмы крови. Кроме того, как было отмечено в обзоре Maniesh van der Vaart [21], из 443 рассмотренных статей менее 6% обзорных статей описывают происхождение, время полужизни и выведение цирНК и менее 10% приводят данные относительно их роли в биологических системах. Большинство исследований посвящено изучению опухоле-ассоциированных изменений состава цирДНК, оценке диагностической эффективности известных окомаркеров количественными методами [22]. Однако, по мнению авторов аналитического обзора состояния дел в области исследований цирДНК, этого совершенно недостаточно для оптимизации подходов, направленных на поиск оптимальных онкомаркеров и разработки на их основе диагностических систем [21-22].

Целью представленного исследования являлось изучение особенностей циркуляции и выведения цирДНК крови, исследование внДНК мочи, оценка возможности рационального поиска потенциальных аберрантно метилированных онкомаркеров и поиск таких онкомаркеров при помощи микрочипов.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методологию исследования: методы выделения и концентрирования цир/внДНК из крови и мочи, метод бисульфитной конверсии цир/внДНК.

2. Исследовать особенности циркуляции метилированной и неметилированной ДНК, а также цирДНК в составе нативных нуклеопротеиновых комплексов.

3. Исследовать внДНК мочи, а именно размер и состав внДНК, концентрацию внДНК в норме и при заболеваниях предстательной железы, наличие опухолеспецифичных последовательностей в пуле внДНК мочи.

4. Исследовать влияние дезоксирибонуклеаз крови и мочи на концентрацию цир/внДНК.

5. Исследовать возможность получения данных о статусе метилирования онкомаркеров методом прямого секвенирования цир/внДНК.

6. Провести поиск аберрантно метилированных маркеров опухолей предстательной железы в пуле цирДНК крови при помощи микрочипов Human CpG island Microarray HCGI12k.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Циркуляция дезоксирибонуклеиновых кислот в крови

1.1.1 Источники внеклеточных ДНК крови

Еще в 60-х годах прошлого столетия появились первые сообщения о присутствии очень малых количеств ДНК в плазме крови человека и животных [2]. В настоящее время известно, что ДНК циркулирует в крови, как в норме, так и при развитии различных патологий. Концентрация внДНК в плазме здоровых доноров в среднем не превышает 53 нг/мл [4, 21, 2325]. При развитии онкологических заболеваний концентрация внДНК возрастает и, по данным разных авторов, составляет от 10-1200 нг/мл [26-28] до 2160 нг/мл [23]. В крови онкологических больных ДНК опухолевого происхождения в суммарном пуле цирДНК составляет от -1.9% [29