Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека

Морозкин, Евгений Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека"

На правах рукописи

МОРОЗКИН ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕРАЦИИ И СОСТАВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ДНК В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2012

005049189

1'аЬота выполнена в Институте химической о поло гни и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.б.н. Лактионов Павел Петрович

Официальные оппоненты:

Годовикова Татьяна Сергеевна, д.х.н., доцент Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, в.н.с.

Таранин Александр Владимирович, д.б.н. Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, зав. лабораторией.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится « 26 » декабря 2012 г. в 10:00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 20 » ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тот факт, что дезоксирибонуклеиновые кислоты постоянно присутствуют во внеклеточной среде культивируемых клеток in vitro, а также в биологических жидкостях и в межклеточном пространстве in vivo в настоящее время не вызывает сомнений. Показано, что внеклеточные ДНК (внДНК) имеют в основном эндогенное происхождение, стабильны в течение длительного времени, переносятся током крови и лимфы и могут быть обнаружены далеко от места локализации «родительских» клеток.

Перечисленные факты позволяют использовать внДНК как источник диагностического материала для выявления специфических маркеров заболеваний, связанных с нарушением функций генетического аппарата клеток, в частности онкологических заболеваний. Определенный успех исследователей в поиске ДНК-маркеров онкологических заболеваний привел к тому, что кровь или плазму крови стали называть "жидкой биопсией", так как анализ внДНК крови позволил с определенной чувствительностью и специфичностью не только диагностировать опухоль, но и определять тканевую принадлежность заболевания.

Однако, несмотря на то, что эта область интенсивно развивается, на рынке медицинских аналитических систем до сих пор нет аккредитованных FDA диагностических методов, основанных на анализе внДНК. Анализ неудач, показал, что наряду с очевидными факторами, такими как несовершенство используемых подходов, недостаточная чувствительность аналитических систем, отсутствие межлабораторных стандартов и несовпадение данных, полученных разными группами исследователей, выявляются более серьезные факторы, такие как несовпадение структуры и частот встречаемости ДНК-онкомаркеров в ткани и крови. Недостаток фундаментальных знаний о природе внДНК и процессах, обеспечивающих их генерацию, циркуляцию и выведение из кровотока не позволяет объяснить вышеперечисленные факты и, в конечном счете, осуществлять рациональный поиск циркулирующих ДНК-онкомаркеров для ранней малоинвазивной диагностики рака.

Во внеклеточной среде высших эукариот внДНК могут появляться в результате процессов клеточной смерти (апоптоз и некроз), а также по данным ряда авторов в результате секреции нуклеиновых кислот клетками и внеклеточного синтеза. Однако данные о секреции ДНК клетками и внеклеточном синтезе ДНК были получены более 30 лет назад и в настоящее время не представляются достаточно убедительными и требуют проверки с использованием современных молекулярно-биологических подходов. В отличие от механизмов активной секреции ДНК клетками, механизмы индукции и развития апоптоза изучены достаточно глубоко. Тем не менее, в контексте генерации внДНК ряд вопросов, принципиальных для понимания фундаментальных основ формирования пула внДНК, остаются открытыми. В частности, мало изученным остается алгоритм гидролиза различных участков хромосом при помощи апоптотических нуклеаз, который может определять относительную представленность последовательностей внДНК. Решение этих вопросов позволило бы не только оптимизировать поиск мишеней для диагностических методов, но и значительно продвинуться в изучении механизмов, участвующих в генерации внДНК и реализации их функций.

Целью работы являлось выявление клеточных механизмов, обеспечивающих генерацию внеклеточной ДНК, а также исследование влияния этих механизмов на состав последовательностей внеклеточной ДНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• Исследовать влияние индукторов и ингибиторов активной секреции и апоптоза на концентрацию внеклеточной ДНК в культурах клеток человека.

• Исследовать возможность синтеза ДНК вне клеток человека.

• Выявить отличия в представленности последовательностей между внеклеточной и геномной ДНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ с последующим клонированием и секвенированием выявленных районов хромосом.

Научная новизна н практическая ценность работы. В рамках первой части работы впервые было проведено комплексное исследование возможных механизмов генерации внДНК в культурах первичных эндотелиоцитов, фибробластов и клеток линии HeLa. При помощи индукции/ингибирования Гольджи-зависимого и Гольджи-независимых путей секреции белков было показано, что процессы активной секреции не участвуют в генерации внДНК. При помощи инкубации клеток с биотинилированным аналогом dUTP и последующим ПЦР анализом аффинно выделенной биотинилированной внДНК опровергнута гипотеза о возможности синтеза ДНК вне клеток. Показано, что внеклеточный синтез ДНК наблюдается только в культурах клеток, инфицированных микоплазмой. При помощи индукции/ингибирования апоптоза было показано, что основным источником внДНК в культуре клеток, культивируемых в нормальных условиях, является апоптоз. Во второй части работы был исследован состав последовательностей внДНК, генерируемых в результате апоптоза, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. В результате проведения двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ было обнаружено, что внДНК отличается по составу последовательностей от геномной ДНК. Отличия в представленности были обнаружены в составе прицентромерного района хромосомы 9, а также дистальных плечей акроцентрических хромосом. В результате микродиссекции флуоресцентно меченых зондов, гибридизующихся в районе 9ql2, с последующей амплификацией, клонированием и секвенированием было показано, что среди секвенированных клонов наиболее представлены фрагменты последовательности сателлита 3. Показанная ранее транскрипционная активность в районе 9ql2 и экспрессия сателлитной РНК 3 указывает на то, что процесс апоптоза приводит к обогащению внДНК декомпактизованными районами хромосом. Данные о том, что районы декомпактизованного хроматина перепредставлены в составе внДНК крови могут быть использованы для оптимизации поиска ДНК-онкомаркеров, патологически трансформированных клеток, с измененным относительно нормальных клеток профилем плотности упаковки хроматина.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты работы были представлены на международной конференции «Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids» (Новосибирск, Россия, 2003г), V, VI и VII международных конференциях «Circulating nucleic acids in plasma and serum» (Москва, Россия, 2007; Гонконг, Китай, 2009; Мадрид, Испания, 2011). Результаты диссертации были доложены на международной конференции «Физико-химическая биология»

(Новосибирск, Россия, 2011), на II международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, Россия, 2011).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит 43 рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 283 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Исследование механизмов генерации внеклеточной ДНК

Согласно литературным данным деградация геномной ДНК в результате апоптоза является одним из основных источников внеклеточных нуклеиновых кислот (внНК). Однако в некоторых исследованиях было показано, что эукариотические клетки способны спонтанно секретнровать ДНК, и этот процесс не связан с апоптозом (Anker Р. et al„ 1975). Кроме того, в ряде работ было показано, что ДНК может синтезироваться вне клеток в составе частиц, которые впоследствии получили название "виртозомы" (Anker Р. et а!., 1976; Gahan P.B. et al, 2010). В представленной работе было проведено исследование каждого из возможных механизмов генерации внДНК на примере линий клеток человека.

Для изучения процессов, которые приводят к появлению внДНК, в качестве модельных клеток были использованы клетки эндотелия пупочной вены новорожденных (HUVEC), первичные фибробласты и клетки цервикальной аденокарциномы (HeLa). Эти клетки обладают рядом свойств, предъявляемых к модельным объектам: их культивирование не требует особых условий, они быстро пролиферируют и не склонны к накоплению хромосомных аберраций в ходе культивирования. Следует отметить, что источником первичных эндотелиальных клеток и фибробластов служит доступный биологический материал. Кроме того, использование выбранных клеточных культур позволяет получить данные о механизмах генерации внДНК в нормальных и опухолевых клетках различной тканевой принадлежности.

Помимо внДНК в культуральной среде, нами была исследована внДНК, связанная с плазматической мембраной клеток. Поскольку связывание ДНК с цитоплазматической мембраной опосредовано белками, экспонированными на внешней поверхности плазматической мембраны, для элюции ДНК, связанной с клеточной поверхностью, клетки обрабатывали 0.25% раствором трипсина. Концентрация трипсина и время обработки клеток были оптимизированы с целью избегания лизиса клеток. Для измерения концентрации внДНК были разработаны методы ПЦР в реальном времени: TaqMan ПЦР на фрагмент последовательности LI повтора и TaqMan ПЦР на фрагмент гена Е7 папиллома вируса HPV-18, который содержится в составе геномной ДНК клеток HeLa. Последовательность LI повтора была выбрана на основании того, что использование в качестве мишени для ПЦР многокопийных повторов значительно повышает чувствительность определения концентрации ДНК по сравнению с использованием в качестве мишени однокопнйных генов. TaqMan ПЦР на фрагмент гена папиллома вируса был использован для селективного определения концентрации ДНК клеток HeLa.

Чувствительность методов ТаяМап ПЦР на 1Л элементы и фрагмент гена Е7 составила 5 и 50 пг геномной ДНК на реакцию, соответственно.

1.1. Исследование синтеза ДНК вне клеток

Нами было сделано предположение о том, что на роль автономных частиц (виртозом), способных к саморепликации в культуре клеток человека, и которые с трудом могут быть обнаружены с помощью световой микроскопии, с наибольшей вероятностью подходят клетки микоплазмы. Поэтому для изучения вклада внеклеточного синтеза в процесс появления ДНК во внеклеточной среде, нами были использованы клетки НеЬа без микоплазмы, а также клетки НеЬа, которые согласно видоспецифичному ПЦР анализу инфицированы микоплазмами М. ИуогЫпич и М. /егтеЫат.

Клетки НеЬа, содержащие и не содержащие микоплазму, культивировали в присутствии биотинилированного производного (ТИГР. Внеклеточную ДНК из культуральной среды и элюатов с поверхности клеток анализировали в агарозном геле с последующим саузерн-блотом. Биотинилированную ДНК визуализировали при помощи конъюгата авидина с щелочной фосфатазой (Рис. 1).

^ НеЬа тус+ НеЬа туе- ^ НеЬа тус+ НеЬа тус-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 т.п.н. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 * » —193

—2.69 —0.92

Рис. 1. Исследование включения биотинилированного производного dUTP клетками линий HeLa, содержащих и не содержащих микоплазму. ВнДНК анализировали в 1.5% агарозном геле с бромистым этидием (А), с последующим Саузерн-блотом и визуализацией биотинилированной ДНК при помощи конъюгата авидина с щелочной фосфатазой (Б). Дорожки 1,6 - внНК из культуральной среды; 2,7 - внНК из ФБ-ЭДТА элюата; 3,8 - внНК из трипсинового элюата; 4,9 - НК из мембранно-цитозольной фракции клеток, 5,10 - НК из ядерной фракции клеток; 11 - маркер молекулярного веса ДНК.

Было показано, что ДНК, содержащая остатки биотина, локализована главным образом на цитоплазматической мембране и в мембранно-цитозольной фракции клеток линии HeLa, содержащих микоплазму. В клетках, не инфицированных микоплазмой, присутствие биотинилированной ДНК в пуле внДНК не было обнаружено (Рис. 1).

В результате выделения биотинилированной ДНК при помощи авидин-сефарозы, с последующим ПЦР анализом фрагментов генов 16S рРНК микоплазмы и 28S рРНК

человека было показано, что биотин-содержащая фракция ДНК содержит только ДНК микоплазмы. Таким образом, на поверхности клеток действительно происходит синтез ДНК, но только в случае клеток содержащих микоплазму.

1.2. Влияние индукции апоптоза или стимуляции секреторной активности клеток на концентрацию внеклеточной ДНК

Для того чтобы оценить вклад апоптоза в формирование пула внДНК, в культурах первичных и опухолевых клеток апоптоз был индуцирован двумя способами: при помощи обработки клеток этопозидом или культивированием клеток в среде без эмбриональной сыворотки. Как известно, этопозид ингибирует лигазную активность топоизомеразы II, тем самым приводит к накоплению двуцепочечных разрывов в составе ДНК и индукции р53-зависимого апоптоза. При культивировании клеток в среде без эмбриональной сыворотки клетки не получают ростовых факторов, что приводит к индукции апоптоза в результате ингибирования экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2.

Было показано, что обработка клеток этопозидом в течение 24 часов приводит к значительному увеличению концентрации внДНК в культуральной среде и трипсиновом элюате (Рис. 2). Эффективность индукции апоптоза подтверждали окрашиванием клеток кальцеином и пропидий иодидом с последующей флуоресцентной микроскопией (данные не представлены).

А Б

и:

Без этопозида 30 мкМ этопозид Бел этопозида 50 мкМ этопозид

Рис. 2. Влияние обработки эндотелиоцитов, фибробластов и клеток НеЬа этопозидом на концентрацию внДНК. Клетки культивировали в течение 24 часов в присутствии 30 мкМ этопозида с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде (А) и трипсиновом элюате (Б) при помощи TaqMan ПЦР на Ь1 элементы.

В то же время ингибирование апоптоза с помощью обработки клеток ингибитором каспаз 2-УАО-РМК приводит примерно к 50% уменьшению концентрации ДНК в культуральной среде через 24 часа инкубации для всех клеточных линий (Рис. 3).

Изменение концентрации внДНК через 24 часа после индукции или ингибирования апоптоза в целом совпадает с ранее полученными данными о действии этопозида или 2-УЛП-РМК на клетки.

я х

Контроль

■■ НиУЕС

Не1_а ■Н Фибробласты

Рис. 3. Влияние ингибитора апоптоза 2-УАО-РМК на

концентрацию ДНК в культуральной среде первичных клеток и клеток линии НеЬа. Клетки культивировали в течение 24 часов в присутствии 50 мкМ г-УАБ-РМК. Концентрацию ДНК в культуральной среде измеряли при помощи ТацМап ПЦР на 1Л элементы.

50 мкМ г-удо-рмк

В результате индукции апоптоза в культуре первичных эндотелиоцитов с помощью сывороточного голодания в течение 24 часов наблюдается значительное увеличение концентрации внДНК (Рис. 4).

■ НУУИ СП 1

I фибробппсты

450

_ 400

350

300

1 250-

200

150-

100

в --0-

сл ни\'1-:(

СГ) Пс1_а ■■ Фибробласты

Бет ЭТС

10% ЭТС

Бе-! ЭТС

Рис. 4. Влияние сывороточного голодания на концентрацию внДНК в культуре первичных эндотелиоцитов, фибробластов и клеток НеЬа. Клетки культивировали в течение 24 часов в среде без эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде (А) и трипсиновом элюате (Б) при помощи TaqMan ПЦР на Ь1 элементы.

Напротив, культивирование первичных фибробластов в среде без сыворотки приводит к практически полному исчезновению ДНК из культуральной среды и одновременному трехкратному увеличению концентрации ДНК, связанной с поверхностью клеток. Культивирование клеток НеЪа в среде без сыворотки приводит к пятикратному уменьшению концентрации ДНК в культуральной среде и двукратному увеличению концентрации ДНК, связанной с поверхностью клеток по сравнению с клетками, культивируемыми без предварительного сывороточного голодания (Рис. 4).

В то же время добавление к фибробластам 10% сыворотки после 16 часов сывороточного голодания приводит к более чем десятикратному увеличению

концентрации ДНК в культуральной среде и одновременному трехкратному уменьшению концентрации ДНК, связанной с поверхностью клеток, по сравнению с клетками, культивируемыми без предварительного сывороточного голодания (Рис. 5). В результате окрашивания клеток пропидий иодидом с последующей флуоресцентной микроскопией было показано, что изменение концентрации внДНК под действием сыворотки не связано с индукцией апоптоза (данные не представлены).

70 60 504030 20 10 0

|10%ЭТС 3 10% ЭТС после сывороточного голодания

24 0 4 8

Время культивирования клеток, ч Рис. 5. Влияние стимуляции первичных фибробластов сывороткой после сывороточного голодания на концентрацию внДНК. К клеткам, предварительно культивированным в среде без сыворотки, добавляли среду с 10% ЭТС и культивировали течение 4, 8 и 24 часов с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде и трипсиновом элюате при помощи ТацМап ПЦР на 1Л элементы.

Повышение концентрации ДНК в культуральной среде фибробластов при стимуляции сывороткой может быть вызвано стимуляцией клеточной пролиферации, индукцией репликации и секрецией новосинтезированной ДНК во внеклеточную среду. Секреция новосинтезированной ДНК ранее уже наблюдалась при исследовании стимуляции лимфоцитов митогенами. Авторами было показано, что стимулированные лимфоциты после импульсного мечения [3Н]-тимидином секретируют в среду большую часть радиоактивной метки в составе ДНК. С другой стороны, после добавления сыворотки к предварительно «голодавшим» фибробластам наблюдается перераспределение уже имеющейся внДНК между культуральной средой и трипсиновым элюатом. Действительно, после удаления сыворотки концентрация внДНК в культуральной среде уменьшается, а на поверхности клеток возрастает, в то время как после стимуляции фибробластов сывороткой наоборот концентрация внДНК, связанной с поверхностью клеток уменьшается, а концентрация внДНК в культуральной среде увеличивается (Рис. 5).

Для того чтобы проверить приводит ли добавление сыворотки к клеткам, предварительно культивируемым в среде без сыворотки, к синтезу и секреции вновь синтезированной ДНК, клетки культивировали в присутствии [3Н]-тимидина по

схеме, представленной на рисунке 6. Результаты по определению удельной радиоактивности полученных образцов ДНК представлены в таблице 1.

1М0М - 10% этс

[ЗН]-Тимидин

1МОМ без ЭТС

1МОМ - 10% ЭТС

КС Клетки

1 2 КС Клетки

1МОМ- 10% ЭТС

1МОМ - 10% этс

1КЮМ без ЭТС

1МОМ по% этс

[ЗН]-Тимидин

1МРМ - 10% ЭТС

[ЗН]-Тимидин

5 КС

Клетки

Рис. 6. Схема эксперимента по исследованию секреции новосинтезированной ДНК первичными фибробластами человека. Первичные фибробласты культивировали в присутствии [3Н]-тимидина как показано на схеме. Концентрацию ДНК, выделенной из культуральной среды и ядер клеток, определяли при помощи TaqMan ПЦР на Ы элементы, радиоактивность образцов ДНК определяли методом жидкостно-сцинтилляционной радиометрии.

Таблица 1. Удельная радиоактивность образцов ДНК, полученных в результате мечения клеток [3Н]-тимидином.

Номер образца ДНК1 Удельная радиоактивность, срт/нг

1 19.3

2 18

3 17.6

4 16.9

5 НД2

6 НД

7 НД

8 10.8

порядковый номер указан на схеме (Рис. 5), - ниже уровня детекции.

Было показано, что культивирование клеток в присутствии [ Н]-тимидина приводит к включению [3Н]-тимидина в геномную ДНК клеток. Однако внДНК из культуральной среды клеток, предварительно культивированных в среде без сыворотки и затем стимулированных сывороткой, не содержит радиоактивной метки

вне зависимости от времени культивирования клеток и, следовательно, не является вновь синтезированной.

Для исследования влияния сыворотки на перераспределение внДНК между культуральной средой и трипсиновым элюатом фибробласты культивировали в среде без сыворотки в течение 16 часов в присутствии экзогенной нативной внДНК, полученной из культуральной среды клеток НеЬа. Затем клетки отмывали средой без сыворотки и добавляли свежую среду с 10% ЭТС. Через 4, 8 и 24 часа ДНК выделяли из культуральной среды и трипсинового элюата. Концентрацию экзогенной внДНК клеток НеЬа определяли с помощью ТацМап ПЦР на фрагмент гена Е7 папиллома вируса НРУ-18, который содержится в составе геномной ДНК клеток НеЬа. Результаты эксперимента представлены на рисунке 7.

50-

40-

30-

^ 20В

& 10-х

а =

■■ Купьтуральная Среда : | Трипсиновый элюат

О 5 10 15 20

Время культивирования клеток, ч Рис. 7. Влияние стимуляции первичных фибробластов эмбриональной сывороткой после сывороточного голодания на концентрацию экзогенной внДНК. Первичные фибробласты инкубировали 16 часов в среде без сыворотки в присутствии нативных комплексов внДНК клеток НеЬа. Затем к клеткам добавляли среду с 10% ЭТС и культивировали течение 4, 8 и 24 часов с последующим измерением концентрации ДНК в культуральной среде и трипсиновом элюате при помощи ТацМап ПЦР на фрагмент гена Е7 НРУ18.

Из полученных данных следует, что после добавления к клеткам сыворотки уже через 4 часа происходит диссоциация половины связанной с поверхностью клеток экзогенной внДНК в культуральную среду (Рис. 7). Следует отметить, что в течение первых 8 часов инкубации общее количество ДНК в культуральной среде и на поверхности клеток практически совпадает с исходным количеством ДНК, связанной с поверхностью клеток, до стимуляции клеток сывороткой. После 24 часов культивирования клеток половина экзогенной ДНК в культуральной среде деградирует.

Таким образом, при стимуляции фибробластов сывороткой после сывороточного голодания происходит диссоциация связанной с поверхностью ДНК в культуральную среду. Эта ДНК не синтезируется de novo, как полагали ранее.

1.3. Влияние ингибиторов секреции на концентрацию внеклеточной ДНК в культурах первичных фибробластов, эндотелиоцитов и клеток HeLa Для изучения вклада активного транспорта клеток в процесс появления внДНК исследуемые линии клеток культивировали в присутствии ингибиторов классического (Гольджи-зависимого) и неклассического (Гольджи-независнмого) путей секреции белков (Табл. 2). Эффективность Гольджи-зависимого транспорта оценивали по интенсивности секреции интерлейкина 6, который является индикатором неспецифического иммунного ответа и секретируется клетками по Гольджи-зависимому механизму.

Таблица 2. Ингибиторы транспорта и механизмы их действия.

Ингибитор Механизм действия

Монензин Ингибирование функций аппарата Гольджи

Глибурид Ингибирование мембранных транспортеров семейства ABC

Метиламин Ингибирование эндо-/экзоцитоза путем повышения рН эндо-/экзоциклических везикул

Оуабаин Ингибирование №+/К+-АТФ-азы

Цитохалазин Б Ингибирование полимеризации актиновых микрофиламентов

Хлорокин Повышает рН эндосом, везикул аппарата Гольджи и лизосом

Для оценки влияния ингибиторов секреции на концентрацию внДНК, первичные фибробласты, первичные эндотелиоциты и клетки НеЬа инкубировали в присутствии одного из указанных в таблице ингибиторов и, затем, определяли концентрацию ДНК в культуральной среде (Рис. 8).

Было показано, что культивирование клеток, растущих в нормальных условиях, а также фибробластов, стимулированных сывороткой после сывороточного голодания, в присутствии ингибиторов активной секреции белков не приводит к снижению концентрации внДНК в культуральной среде (Рис. 8). При этом обработка фибробластов ингибиторами Гольджи-зависимой секреции приводит к 90% ингибированию секреции клетками ИЛ-6. Полученные данные указывают на то, что классические и неклассические секреторные механизмы клеток не принимают участие в процессах, связанных с генерацией внДНК.

6-I

нави huvec | I HeLa ■■ Фибробласты

Рис. 8. Влияние ингибиторов клеточного транспорта на

концентрацию внДНК.

Эндотелиоциты, фибробласты и клетки НеЬа инкубировали в течение 4 часов с одним из ингибиторов: монензином (10 мкМ), глибуридом (50 мкМ), метиламином (10 мМ), оуабаином (100 мкМ), цитохалазином (100 мкМ) и хлорокином (100 мкМ). Концентрацию ДНК в культуральной среде измеряли при помощи TaqMan ПЦР на Ь1 элементы.

Суммируя полученные данные можно сделать вывод о том, что основным источником внДНК в культуре клеток, растущих в нормальных условиях, является апоптоз. Действительно, ингибирование классических и неклассических секреторных механизмов клеток не приводит к достоверному уменьшению концентрации внДНК. На примере экзогенной внДНК, связанной с клеточной поверхностью, было показано, что стимуляция клеток сывороткой после сывороточного голодания может приводить к диссоциации связанной с поверхностью ДНК в культуральную среду. Однако эта ДНК не синтезируется de novo и не секретируется, как полагали ранее, а имеет апоптотическое происхождение и появляется в результате перераспределения свободной и связанной с поверхностью клеток внДНК. Исследование возможности внеклеточного синтеза ДНК показало, что таковой имеет место, но только в случаях, когда клетки инфицированы микоплазмой. В клетках, свободных от микоплазмы внеклеточного синтеза ДНК не было обнаружено.

2. Исследование представленности различных последовательностей геномной ДНК в составе внеклеточной ДНК

Состав последовательностей внДНК был исследован при помощи метода флуоресцентной гибридизации in situ. Этот метод позволяет сравнивать представленность различных последовательностей ДНК в составе нескольких образцов на одном цитологическом препарате, что, в свою очередь, позволяет напрямую выявлять изменения в представленности хромосомных районов. Необходимым условием для получения этим методом корректных данных является получение из исследуемых образцов ДНК-зондов, с максимально пропорциональной представленностью последовательностей исходной ДНК. Поскольку выбор метода приготовления ДНК-зондов определяется фрагментацией исходной ДНК образца, на первом этапе необходимо было определить размер внДНК в культурах анализируемых линий клеток.

В результате исследования размера фрагментов внДНК при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле после 24 часов культивирования клеток было показано, что во всех клеточных культурах ДНК, выделенная из культуральной

среды, представлена фрагментами длинной от 180 до 3500 пар оснований. ДНК из трипсинового элюата представлена в основном высокомолекулярной фракцией с размером фрагментов около 20000 пар оснований (Рис. 9).

12 3 4 5

т.п.н. п.н.

19.3— 3.47—

I—600

Рис. 9. Электрофоретический анализ внДНК, выделенной из культуральной среды (дорожка 2), и трипсинового элюата (дорожка 3) клеток НеЬа в 1.5% агарозном геле с бромистым этидием. Внеклеточная ДНК была обработана РНК-азой А (20 мкг/мл, 37°С, 30 мин). Дорожки 1, 4 -маркеры молекулярного веса ДНК, дорожка 5 - геномная ДНК.

—200 —100

2.1. Получение ДНК-зондов при помощи метода ЬА-ПЦР

Основываясь на полученных данных о длине фрагментов внДНК, были выбраны две стратегии изготовления ДНК-зондов.

ДНК, связанная с поверхностью клеток, представлена высокомолекулярными фрагментами, и её сравнение корректно проводить непосредственно с геномной ДНК. Для выявления перепредставленных последовательностей в составе ДНК из культуральной среды нами была использована ДНК, выделенная из культуральной среды апоптотических клеток, которая совпадает по длине фрагментов с ДНК из культуральной среды интактных клеток. Схема получения ДНК зондов при помощи ЬА-ПЦР представлена на рисунке 10.

скпДНК

Геномная ДНК = Цитирование

,. • _ === ДНК адаптеров

Рис. 10. Общая схема получения ДНК-зондов из ДНК, связанной с поверхностью клеток, геномной ДНК, ДНК из культуральной среды нормальных и апоптотических клеток при помощи метода ЬА-ПЦР.

ДНК-зонды из геномной и внДНК анализируемых клеточных линий были получены в оптимизированных условиях согласно представленным выше схемам.

Продукты 1.А-ПЦР были проанализированы при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. Было показано, что в ходе ЬА-ПЦР клеточной и внДНК наблюдается амплификация фрагментов ДНК размером от 200 до 1200 п.н. (Рис. 11).

Геномная ДНК. связанная ДНК с поверхностью клеток

Г Н Е И Н

Лмоитотическая ДНК культуральной ДНК среды

19329 ll.ll.

2690 н.п.

KHHIii.ii.

500 ll.ll.

м м

Рис. 11. Электрофоретический анализ ДНК-зондов, полученных из геномной ДНК и ДНК, связанной с поверхностью клеток (А), а также ДНК-зондов, полученных из ДНК, выделенной из культуральной среды, и апоптотической ДНК (Б), в 1% агарозном геле. М - маркеры длины ДНК; Е - первичные эндотелиоциты, Б - первичные фибробласты, Н - НеЬа.

2.2. Цитогенетический анализ ДНК-зондов, полученных из геномной, апоптотической и внеклеточной ДНК

ДНК-зонды, полученные из внДНК, были мечены в результате ПЦР дигоксигенином, а ДНК-зонды, полученные из геномной и апоптотической ДНК -биотином. Совместную гибридизацию ДНК-зондов, полученных из геномной и внеклеточной ДНК, проводили с одним препаратом метафазных хромосом человека. ДНК-зонды детектировали при помощи антител к дигоксигенину, меченых флуоресцентным красителем Су-3, и стрептавидином, меченым флуоресцеином.

В результате анализа ДНК-зондов, полученных из ДНК, связанной с поверхностью клеток, и геномной ДНК первичных фибробластов, а также клеток НеЬа были выявлены отличия в представленности ДНК хромосом 1, 5, 9 и 19. При анализе ДНК-зондов, полученных из ДНК, связанной с поверхностью клеток, и геномной ДНК первичных эндотелиоцитов, отличие в представленности наблюдается только в хромосоме 9 (Рис. 12).

Для детального анализа выявленных районов хромосом были построены профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов (Рис. 13).

НиУЕС Фибробласты НсЬа

Рис. 12. Двухцветная FISH ДНК-зондов, полученных из геномной ДНК, меченых биотином (зеленый канал) и ДНК, связанной с поверхностью клеток, меченых дигоксигенином (красный канал) на метафазных хромосомах лейкоцитов человека.

Полученные данные демонстрируют, что в составе ДНК, связанной с поверхностью первичных фибробластов, по сравнению с геномной ДНК, перепредставлены фрагменты прицентромерного района хромосомы 9. В составе ДНК, связанной с поверхностью клеток НеЬа, перепредставлены прицентромерные районы 1, 5 и 9 хромосомы. При анализе ДНК-зондов, полученных из ДНК, связанной с поверхностью клеток, и геномной ДНК первичных эндотелиоцитов, отличие наблюдается только в хромосоме 9. В остальных хромосомах профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов внеклеточной и геномной ДНК совпадают.

ш vir

11срвпч11мс

ф, ЮрОО-KlC 11.1

mclit

хромосома I '>

Рис. 13. Анализ профилей относительной интенсивности флуоресцентных сигналов хромосом после проведения двухцветной FISH ДНК-зондов, полученных из геномной ДНК (зеленый канал) и ДНК, связанной с поверхностью клеток, (красный канал). Синий канал - флуоресцентный сигнал DAPI.

Аналогичным способом были исследованы отличия в представленности между ДНК-зондами, полученными из внДНК, выделенной из культуральной среды нормальных и апоптотических клеток.

В результате сравнения ДНК-зондов, полученных из внеклеточной и апоптотической ДНК первичных фибробластов, были выявлены отличия в интенсивности флуоресценции отдельных районов 1 и 9 хромосом, а также акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21, 22). При анализе ДНК-зондов, полученных из внДНК и апоптотической ДНК первичных эндотелиоцитов и клеток HeLa, отличий не было выявлено (Рис. 14).

11 UV IX' Фибробласты HeLa

у' » 1 ^15

. f" i 14—».

! ж" 9

Sfc о < ♦-21

IV % «k i 5 13—

% <.

Г л--1 ™ р I 15 ъК , с.

* t t**-21 <5

Э-г 9 /

и Imfr 14—». -A.

t V4 * ЧЛ» / " л—1« 9 1 1J—» 15 А 9 I JXä^if^ v >5 ,22 14--».У ^ JaL

J: ' J . ■»■*

Я ^ 1 V. ^^ . \ t vi * , 1

t „ -*-21 « Л*

Рис. 14. Двухцветная FISH ДНК-зондов, полученных из апоптотической ДНК, меченых биотином (зеленый канал) и ДНК, выделенной из культуральной среды, меченых дигоксигенином (красный канал) на метафазных хромосомах лейкоцитов.

Для детального анализа выявленных районов хромосом были построены профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов (Рис. 15). Полученные данные демонстрируют, что в составе внДНК первичных фибробластов перепредставлены фрагменты ДНК из прицентромерного района хромосомы 9 и дистальных плечей акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21, 22 по сравнению с апоптотической ДНК. Для клеток HUVEC и HeLa профили относительной интенсивности флуоресцентных сигналов апоптотической и внДНК совпадают. Однако следует отметить, что в составе ДНК-зондов, полученных из апоптотической и внДНК клеток HeLa, перепредставлены последовательности дистальных плечей акроцентрических хромосом 9, 14, 15 и 22.

Из полученных данных следует, чт"о для всех клеточных культур в составе ДНК, связанной с клеточной поверхностью, перепредставлен прицентромерный района хромосомы 9. В случае клеток линии HeLa кроме прицентромерного района хромосомы 9 наблюдается перепредставленность прицентромерных районов хромосом 1 и 5. Состав последовательностей ДНК, выделенной из культуральной среды нормально растущих и апоптотических клеток, не отличается для клеток HUVEC и HeLa. Однако в случае первичных фибробластов была обнаружена

перепредставленность прицентромерного района хромосомы 9 и дистальных плечей акроцентрическнх хромосом. Учитывая тот факт, что в культуре клеток, растущих при нормальных условиях, основным источником внДНК является апоптоз можно сделать вывод о том, что по представленности последовательностей апоптотическая ДНК отличается от геномной.

IllJVliC

¡■и ЩШШЩ

spS р ВЦ

хромосома! хромосома л хромосома 9 хромосома

Первичные фибробласты

I IcLa

хромосома1) хромосомам хромосома 15 хромосома 22

Рис. 15. Анализ профилей относительной интенсивности флуоресцентных сигналов хромосом после проведения двухцветной FISH ДНК-зондов, полученных из ДНК культуральной среды апоптотических клеток (зеленый канал) и ДНК из культуральной среды интактных клеток (красный канал). Синий канал -флуоресцентный сигнал DAPI.

3. Микродиссекция и секвеиирование ДНК-зондов, гибридизующихся

в районе 9ql2

Для детального исследования перепредставленных внДНК, гибридизующихся в районе 9ц12 была выполнена микродиссекция этого района после гибридизации флуоресцентно меченых ДНК-зондов. Для этого из внДНК были получены ДНК-зонды, меченые флуоресцентным красителем ТАМИА, которые гибридизовали с метафазными хромосомами человека, и, затем, проводили микродиссекцию района 9ц 12 под флуоресцентным микроскопом. Полученные при помощи микродиссекции образцы ДНК амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймера, комплементарного 5' и З'-концам ДНК-зондов (Рис. 16).

Микроднссскция раПона 9ql2

I. ПЦР i

J СсКК„„роИ,„.С| ЙЙЙЙ||ЗД"ЙЙЙ|

- NNNN GGAAT).NNNI

. NNNN(GGAAT)„NNNI

Рис. 16. Схема экперимента для определения перепредставленных последовательностей внеклеточной ДНК.

Полученные продукты ПЦР были клонированы в плазмиде pBluescript SK II(-), 100 клонов, содержащих вставку, было секвенировано по методу Сэнгера. Анализ секвенированных последовательностей был проведен с помощью базы данных BLAST сервера (http://vvwvv.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) и базы данных повторяющихся последовательностей генома RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/).

В результате определения удельного содержания различных классов и подклассов повторяющихся элементов генома в составе секвенированных последовательностей из диссектированного района 9ql2 было обнаружено, что во внДНК наиболее представлены повторы сателлитной ДНК (22%). В результате выравнивания последовательностей, соответствующих сателлитной ДНК, с помощью программного обеспечения Vector NTI, было обнаружено, что 20% секвенированных последовательностей содержат фрагменты консенсуса сателлита 3 (HSAT III), который состоит из прямых и инвертированных повторов пентаолигонуклеотида GGAAT, разделенных декаолигонуклеотидом CAAC(C/A)CGAGT.

Из литературных данных известно, что последовательности HSAT III на метафазных препаратах хромосом выявляются в прицентромерных районах большинства хромосом, за исключением хромосом 2, 6, 8, 11, 12, 18, 19 и X. Район 9ql2 содержит основную часть HSAT III повторов, по сравнению с другими хромосомами. Минорные сайты гибридизации ДНК-зондов, содержащих последовательности HSAT III, находятся в прицентромерных районах хромосом 1, 5, 10, 17, 20 и акроцентрических хромосом. То есть отличие в представленности между внеклеточной и геномной ДНК в прицентромерных районах 1, 5 и акроцентрических хромосом может дополнительно свидетельствовать о перепредставленности HSAT III повторов в составе внДНК.

Последовательности HSAT III, которые по нашим данным перепредставлены в составе внДНК, расположены в прицентромерных районах большинства хромосом и формируют конститутивный гетерохроматин. Как известно одним из критериев гетерохроматина является нетранскрибируемость этих участков сопровождающаяся гиперметилированием ДНК. Однако в некоторых случаях ДНК конститутивного гетерохроматина может транскрибироваться. Например, последовательности HSAT III транскрибируются в клетках, находящихся в условиях стресса, например, теплового шока или индукции апоптоза. Кроме того, было показано, что при старении клеток также происходит деметилирование HSAT III, что приводит к разрыхлению упаковки хроматина, и повышает доступность района 9ql2 для

нуклеазного гидролиза. Следовательно, перепредставленность в составе внДНК последовательностей района 9ц12 вероятно отражает влияние плотности упаковки исходной геномной ДНК на представленность определенных участков генома в составе внДНК. Установленная ранее связь между транскрипционной активностью и плотностью упаковки хроматина в районе 9ц 12 указывает на то, что генерация внДНК в результате апоптоза приводит к обогащению внДНК декомпактизованными районами хромосом.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано участие активной секреции ДНК, секреции de novo синтезированной ДНК, синтеза ДНК вне клеток и апоптоза в процессе генерации внеклеточных ДНК в культурах клеток линии HeLa, первичных эндотелиоцитов и фибробластов человека. Показано, что Гольджи-зависимые и Гольджи-независимые пути секреции не вовлечены в процесс генерации внеклеточной ДНК. De novo синтезированная ДНК также не секретируется клетками. Показано, что эукариотическая ДНК не синтезируется во внеклеточном пространстве первичных и трансформированных клеток. Внеклеточный синтез ДНК обнаружен только в культурах клеток, инфицированных микоплазмой. При помощи индукции/ингибирования апоптоза показано, что основным источником внеклеточной ДНК в культуре клеток является апоптоз.

2. Исследован состав последовательностей внеклеточной ДНК в исследуемых культурах клеток с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ. На основании анализа длин фрагментов внеклеточной, апоптотической и геномной ДНК выбран и оптимизирован метод LA-ПЦР, который позволяет получить ДНК зонды максимально идентичные исходным образцам ДНК. В результате проведения двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом профилей относительной интенсивности флуоресцентного сигнала хромосом показано, что внеклеточная ДНК отличается по составу последовательностей от геномной ДНК. Отличия в представленности были обнаружены в составе прицентромерного района хромосомы 9, а также дистальных плечей акроцентрических хромосом.

3. В результате микродиссекции флуоресцентно меченых зондов, гибридизующихся в районе 9ql2, с последующей амплификацией, клонированием и секвенированием было показано, что в составе внеклеточной ДНК перепредставлены фрагменты последовательности сателлита 3.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Fluorometric quantification of RNA and DNA in solutions containing both nucleic acids // Anal. Biochem. -2003. -V. 322. -P. 48-50.

2. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Bryzgunova O.E., Vlassov V.V. Release of nucleic acids by eukaryotic cells in tissue culture // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. -2004. -V.23. -P. 929-933.

3. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2004. -V. 1022. -P. 244-249.

4. Morozkin E.S., Babochkina T.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P. The effect of protein transport inhibitors on the production of extracellular DNA // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2008. -V. 1137. -P. 31-35.

5. Морозкин E.C., Сильников B.H., Рыкова Е.Ю., Власов В.В., Лактионов П.П. Внеклеточная ДНК в культуре первичных и трансформированных клеток, инфицированных и не инфицированных микоплазмой // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -2009. -Т. 147. -С. 67-71.

6. Морозкин Е.С., Лосева Е.М., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б., Власов В.В., Лактионов П.П. Исследование состава внеклеточной ДНК в культуре клеток человека с помощью FISH // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. -2010. -Т. 8. -С. 3-10.

7. Morozkin E.S., Loseva Е.М., Mileyko V.A., Zadesenets K.S., Rubtsov N.B., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Comparative study of extracellular DNA by FISH // Circulating nucleic acids in plasma and serum. Ed. Gahan P.B. Springer.-2011.-P. 143-146.

Подписано в печать 06.11.12г. Формат 60x84 1/16

Усл.печ.л. 1.5 Объем 24 стр. Тираж 130 экз. Заказ № 206

Отпечатано в ООО « Омега Принт» 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева. 6 email: omegap@yandex.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Морозкин, Евгений Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные физико-химические и биологические характеристики 9 внеклеточных нуклеиновых кислот

1.1. Общие физико-химические характеристики внеклеточной ДНК в 9 культурах клеток и организме человека

1.2 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в составе молекулярных 11 комплексов и надмолекулярных структур

1.2.1. Внеклеточные нуклеиновые кислоты в комплексах с белками и 11 другими биополимерами

1.2.2. Внеклеточные РНК в составе экзосом

1.2.3. Нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью клеток

1.3. Механизмы появления внеклеточных нуклеиновых кислот 20 1.3.1 Активный транспорт нуклеиновых кислот во внеклеточную среду 20 1.3.2. Появление внеклеточных нуклеиновых кислот в результате клеточной смерти

1.4. Представленность различных последовательностей в составе 30 внеклеточной ДНК

1.4.1. Современные методы сравнительного анализа ДНК

1.4.2. Исследование состава последовательностей внеклеточной ДНК

1.5. Биологические функции внеклеточных нуклеиновых кислот

1.5.1. Нуклеиновые кислоты в качестве сигнальных молекул

1.5.2. Участие внеклеточной ДНК в процессах горизонтального переноса 42 генов

1.5.3. Иммуностимулирующие свойства дезоксирибонуклеиновых кислот

1.5.4. Иммуностимулирующие свойства рибонуклеиновых кислот 49 Заключение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. МЕТОДЫ 52 2.2.1. Методы культивирования клеточных культур 52 2.2.1.1. Культивирование клеток цервикальной аденокарциномы (НеЬа)

2.2.1.2. Получение и культивирование первичных эндотелиоцитов 53 пупочной вены (HUVEC)

2.2.1.3. Получение и культивирование первичных фибробластов

2.2.2. Экспрессия тканеспецифических генов в культуре первичных 54 эндотелиоцитов

2.2.3. Детекция микоплазмы в культуре клеток человека

2.2.4. Тест на жизнеспособность клеток

2.2.5. Измерение пролиферативной активности клеток

2.2.6. Анализ культуральной среды и трипсинового элюата клеток с 56 помощью ТЭМ

2.2.7. Обработка клеток ингибиторами классического и неклассического 56 путей секреции белков

2.2.8. Исследование включения клетками биотинилированного 57 производного dUTP

2.2.9. Мечение клеток [3Н]-тимидином

2.2.10. Подготовка образцов периферических лимфоцитов из крови 58 человека

2.2.11. Выделение геномной ДНК из клеток человека

2.2.12. Выделение РНК из мембранно-цитозольной фракции 59 эукариотических клеток на стекловолокнистых сорбентах

2.2.13. Получение фракций, содержащих свободные и связанные с 59 клеточной поверхностью внеклеточные ДНК

2.2.14. Выделение ДНК из культуральной среды и трипсинового элюата

2.2.15. Выделение ДНК, содержащей биотин

2.3.16. Измерение концентрации ДНК с помощью флуоресцентного 60 красителя Hoechst

2.3.17. Условия проведения ПЦР и количественного TaqMan ПЦР

2.2.18. Введение радиоактивной метки в ДНК

2.2.19. Измерение концентрации ИЛ-6 в культуральной среде клеток

2.2.20. Получение ДНК-зондов при помощи метода LA-PCR

2.2.20.1. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.20.2. Получение ДНК с тупыми концами при помощи Pfu полимеразы

2.2.20.3. Лигирование адаптеров к ДНК по тупым концам

2.2.20.4. Лигирование адаптеров по липким концам ДНК

2.2.20.5. Амплификация продуктов реакции лигирования (LA-PCR)

2.2.20.6. Мечение ДНК-зондов при помощи ПЦР

2.2.21. Условия проведения флуоресцентной гибридизации in situ

2.2.21.1. Приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом 66 лейкоцитов

2.2.21.2. Гибридизация ДНК-зондов с метафазными хромосомами человека 66 in situ

2.2.21.3. Выявление на цитологических препаратах флуоресцентно 67 меченых ДНК-зондов

2.2.21.4. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом

2.2.22. Клонирование и секвенирование ДНК-зондов, полученных после 68 микродиссекции

2.2.22.1. Микродиссекция флуоресцентно меченых ДНК зондов

2.2.22.2. Приготовление компетентных клеток E.coli

2.2.22.3. Клонирование ДНК

2.2.22.4. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК

2.2.22.5. Выделение плазмидной ДНК

2.2.22.6. Селекция колоний, содержащих вставку

2.2.22.7. Секвенирование и анализ клонов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Культуры клеток первичных эндотелиоцитов, первичных 71 фибробластов и HeLa, как модели для изучения механизмов появления внеклеточной ДНК

3.2. Методы измерения концентрации внеклеточной ДНК

3.3. Получение фракций внеклеточной ДНК

3.4. Изменение концентрации внеклеточной ДНК в процессе 77 культивирования клеток

3.5. Исследование состава комплексов внеклеточной ДНК при помощи 79 трансмиссионной электронной микроскопии

3.6. Исследование стабильности эндогенной внеклеточной ДНК в 81 культуральной среде

3.7. Исследование механизмов генерации внеклеточной ДНК

3.7.1. Исследование внеклеточного синтеза ДНК как источника 85 внеклеточной ДНК

3.7.2. Влияние индукции апоптоза или стимуляции секреторной активности 88 клеток на концентрацию ДНК в культуральной среде и на поверхности клеток

3.7.3. Влияние ингибиторов секреции и апоптоза на концентрацию внеклеточной ДНК в культуре первичных фибробластов и эндотелиоцитов, а также клеток HeLa

3.8. Исследование представленности различных последовательностей геномной ДНК в составе внеклеточной ДНК

3.8.1. Стратегия получения ДНК-зондов для анализа внеклеточной ДНК с 103 помощью флуоресцентной гибридизации in situ

3.8.2. Оптимизация методов получения ДНК-зондов из геномной ДНК и 105 внеклеточной ДНК

3.8.2.1. Оптимизация условий лигирования адаптеров к ДНК по тупым 105 концам

3.8.2.2. Оптимизация методики получения ДНК с тупыми концами

3.8.2.3. Оптимизация условий проведения ПЦР продуктов реакции 108 лигирования по тупым и липким концам ДНК

3.8.3. Изучение представленности различных последовательностей в пуле 111 внеклеточной ДНК первичных фибробластов, эндотелиоцитов и HeLa, при помощи двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ

3.8.3.1. Получение ДНК-библиотек из клеточной и внеклеточной ДНК, 111 выделенной из первичных фибробластов, эндотелиоцитов и клеток HeLa

3.8.3.2. Цитогенетический анализ ДНК-зондов, полученных из геномной, 113 апоптотической и внеклеточной ДНК

3.8.3.3. Микродиссекция и секвенирование ДНК-зондов, гибридизующихся 119 в районе 9ql

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека"

Тот факт, что нуклеиновые кислоты постоянно присутствуют во внеклеточной среде культивируемых клеток in vitro, а также в биологических жидкостях и в межклеточном пространстве in vivo в настоящее время не вызывает сомнений. Не вызывает сомнений и то, что такие нуклеиновые кислоты имеют в основном эндогенное происхождение, стабильны в течение длительного времени, переносятся током крови и лимфы и могут быть обнаружены далеко от места локализации «родительских» клеток [1].

Перечисленные факты позволяют использовать внеклеточные нуклеиновые кислоты как источник диагностического материала для выявления специфических маркеров заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клеток, в частности онкологических заболеваний. Именно это применение внеклеточных ДНК и РНК в настоящее время интенсивно развивается [1,2].

Потенциальная возможность создать системы для ранней малоинвазивной диагностики рака, на основе внеклеточных ДНК крови, вызвало огромный интерес и экспоненциальный рост исследований в этой области. Определенный успех исследователей в поиске ДНК и РНК маркеров широкого спектра онкологических заболеваний привел к тому, что кровь или плазму крови стали называть "жидкой биопсией", так как в результате анализа внеклеточных ДНК и РНК крови стало возможным с определенной чувствительностью и специфичностью не только диагностировать рак, но и определять пораженный орган или ткань [3].

Однако, несмотря на то, что эта область интенсивно развивается, в практическом медицинском применении до сих пор не появилось надежных диагностических систем, основанных на анализе внеклеточной ДНК. Анализ неудач, показал, что наряду с очевидными причинами, такими как несовершенство используемых подходов, недостаточная чувствительность аналитических систем, отсутствие межлабораторных стандартов и несовпадение данных, полученных разными группами исследователей, выявляются более серьезные факторы, такие как несовпадение частот встречаемости онкомаркеров в ткани и в циркулирующей крови, неполное соответствие структуры ДНК-маркеров ткани и тех же ДНК в составе циркулирующих ДНК крови [4]. Недостаток фундаментальных знаний о природе внеклеточной ДНК и процессах, обеспечивающих их генерацию, циркуляцию и выведение из кровотока не позволяет объяснить вышеперечисленные факты и, в конечном счете, осуществлять рациональный поиск циркулирующих ДНК-онкомаркеров, пригодных для ранней малоинвазивной диагностики рака.

Во внеклеточной среде высших эукариот внеклеточные ДНК появляются в результате процессов клеточной смерти (апоптоз и некроз) [5], а также по данным ряда авторов и в результате секреции нуклеиновых кислот клетками [6]. Однако, данные о секреции ДНК клетками млекопитающих были получены более 30 лет назад и в настоящее время не представляются достаточно убедительными. В отличие от механизмов активной секреции ДНК клетками, механизмы индукции и развития апоптоза изучены достаточно глубоко [7]. Тем не менее, в контексте генерации внеклеточных ДНК остаются открытыми ряд вопросов, принципиальных для понимания фундаментальных основ формирования пула циркулирующих ДНК. Мало изучены структура и молекулярный состав апоптотических телец, а также алгоритм гидролиза различных участков хромосом при помощи апоптотических нуклеаз и их упаковки в циркулирующие апоптотические тельца. Механизмы активной секреции нуклеиновых кислот также требуют детального исследования и подтверждения. До сих пор не исследована представленность различных последовательностей в пуле внеклеточных нуклеиновых кислот, хотя решение этой задачи позволило бы исследователям не только найти оптимальные мишени для диагностических методов, но и значительно продвинуться в изучении механизмов, участвующих в генерации внеклеточных нуклеиновых кислот и реализации их функций.

Целью настоящей работы является изучения механизмов генерации внеклеточной ДНК первичными эндотелиоцитами пупочной вены человека (HUVEC), первичными фибробластами и клетками цервикальной аденокарциномы (HeLa), а также исследование представленности внеклеточных ДНК в культуре первичных и онкотрансформированных клеток с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Морозкин, Евгений Сергеевич

выводы

Заключение

В настоящей работе были исследованы механизмы генерации внДНК первичными эндотелиоцитами, фибробластами и клетками HeLa. Был оценен вклад апоптоза, активной секреции и внеклеточного синтеза на концентрацию внДНК культуральной среды и внДНК, связанной с клеточной поверхностью. Ингибирование классических и неклассических механизмов секреции белков не приводит к достоверному уменьшению концентрации внДНК. Однако на примере экзогенной внДНК, связанной с клеточной поверхностью, было показано, что процессы активной секреции первичными фибробластами при стимуляции 10% ЭТС после сывороточного голодания клеток могут приводить к диссоциации связанной с поверхностью ДНК в культуральную среду. В результате экспериментов по включению клетками [3Н]-тимидина было показано, что "секретируемая" ДНК не синтезируется de novo как полагали ранее, упакована в нуклеосомы и, по-видимому, имеет апоптотическое происхождение. Исследование возможности внеклеточного синтеза ДНК показало, что таковой нмеет место, но только в случаях, когда клетки инфицированы микоплазмой. В клетках, свободных от микоплазмы внеклеточного синтеза ДНК не было обнаружено. Таким образом, было показано, что основным источником внДНК в культуре клеток, растущих в нормальных условиях, является апоптоз.

С целью изучения влияния механизмов генерации на состав внДНК была исследована представленность внДНК в культурах анализируемых клеток с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ. В результате FISH анализа было показано, что для всех клеточных культур внДНК отличается по составу представленных последовательностей от геномной ДНК. Изменения в представленности касаются в основном прицентромерного района хромосомы 9, а также дистальных плечей акроцентрических хромосом. В результате микродиссекции флуоресцентно меченых зондов, гибридизующихся в районе 9ql2, с последующей амплификацией, клонированием и секвенированием было показано, что среди отсеквенированных клонов наиболее представлены фрагменты консенсусной последовательности сателлитной ДНК 3. Установленная связь между клеточным стрессом (в том числе н апоптозом) и транскрипционной активностью (деметилированием) района 9ql2 указывает на то, что генерация внДНК в результате апоптоза приводит к обогащению анализируемых фракций внДНК декомпактизованными районами хромосом.

Известно, что при онкотрансформации клеток происходит деметилирование генома и "разрыхление" части конденсированного хроматина [293], что может приводить к отличию в представленности последовательностей в составе апоптотической ДНК нормальных и раковых клеток. Действительно, в ряде работ было обнаружено, что в циркуляции обнаруживаются преимущественно ДНК-последовательности, характерные для раковых клеток, несмотря на то, что количество этих клеток ничтожно мало по сравнению с нормальными, которые также подвергаются апоптозу и вносят вклад в формирование пула циркДНК крови. Тот факт, что в составе внДНК перепредставлен транскрипционно активный хроматин позволяет, например, предположить, что оптимальными ДНК-онкомаркерами должны быть не гиперметилированные последовательности ДНК, а напротив гипометилированные, которые находятся в неконденсированном, транскрипционно активном виде. Поскольку апоптоз является основным источником циркДНК крови, поиск отличий в

123 относительной представленности определенных классов последовательностей в составе внДНК позволит оптимизировать поиск ДНК-онкомаркеров, которые могут быть гиперпредставлены в пуле циркДНК крови, и использованы в качестве ДНК-мишеней диагностических систем, направленных на раннюю и малоинвазивную диагностика рака.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Морозкин, Евгений Сергеевич, Новосибирск

1. Fleischhacker М., Schmidt В. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer a survey // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1775. P. 181-232.

2. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Circulating nucleic acids as a potential source for cancer biomarkers // Curr. Mol. Med. 2010. V. 10. P. 142-165.

3. Schwarzenbach H., Hoon D.S., Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients // Nat. Rev. Cancer. 2011. V. 11. P. 426-437.

4. Van der Vaart M., Pretorius P.J. Is the role of circulating DNA as a biomarker of cancer being prematurely overrated? // Clin. Biochem. 2010. V. 43. P. 26-36.

5. Stroun M., Anker P., Maurice P., Gahan P.B. Circulating nucleic acids in higher organisms // Int. Rev. Cytol. 1977. V. 51. P. 1-48.

6. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis // Nature. 2000. V. 407. P. 770-776.

7. Lorenz M.G., Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment // Microbiol. Rev. 1994. V. 58. P. 563-602.

8. Avery O.T., Mac Leod C.M., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types // J. Exp. Med. 1944. V. 79. P. 137-158.

9. Borenstein S., Ephrati-Elizur E. Spontaneous release of DNA in sequential genetic order by Bacillus subtilis //J. Mol. Biol. 1969. V. 45. P. 137-152.

10. Anker P., Stroun M., Maurice P. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system // Cancer Res. 1975. V. 35. P. 2375-2382.

11. Stroun M., Anker P., Lyautey J., Lederrey C., Maurice P.A. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1987. V. 23. P. 707-712.

12. Giacona M.B., Ruben G.C., Iczkowski K.A., Roos T.B., Porter D.M., Sorenson G.D. Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls // Pancreas. 1998. V. 17. P. 89-97.

13. Wu T.L., Zhang D., Chia J.H., Tsao K.H., Sun C.F., Wu J.T. Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range // Clin. Chim. Acta. 2002. V. 321. P. 77-87.

14. Raptis L., Menard H.A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. 1980. V. 66. P. 1391-1399.

15. Herrmann M. Molecular and cellular mechanisms of human hypersensitivity and autoimmunity // Alan R. Liss Inc. 1989.

16. Van Helden P.D. Potential Z-DNA-forming elements in serum DNA from human systemic lupus erythematosus // J. Immunol. 1985. V. 134. P. 177-179.

17. Tsumita Т., Iwanaga M. Fate of injected deoxyribonucleic acid in mice // Nature. 1963. V. 198. P. 1088-1089.

18. Gosse С., Le Pecq J.В., Defrance P., Paoletti C. Initial degradation of deoxyribonucleic acid after injection in mammals // Cancer Res. 1965. V. 25. P. 877-883.

19. Emlen W., Mannik M. Effect of DNA size and strandedness on the in vivo clearance and organ localization of DNA// Clin. Exp. Immunol. 1984. V. 56. P. 185-192.

20. Tsui N., Ng EK., Lo Y. Stability of endogenous and added RNA in blood speciment, serum, and plasma // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 1647-1653.

21. Adams D.H., Gahan P.B. The DNA extruded by rat spleen cells in culture // Int. J Biochem. 1983. V. 15. P. 547-552.

22. Adams D.H, Gahan P.B. Stimulated and non-stimulated rat spleen cells release different DNA-complexes // Differentiation. 1982. V. 22. P. 47-52.

23. Richmond T.J., Davey C.A. The structure of DNA in the nucleosome core // Nature. 2003. V. 423. P. 145-150.

24. Holdenrieder S., Stieber P., Bodenmueller H., Busch M., von Pawel J., Schalhorn A., Nagel D., Seidel D. Circulating nucleosomes in serum // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 945. P. 93-102.

25. Holdenrieder S., Stieber P., Bodenmueller H., Fertig G., Fuerst H., Schmeller N., Untch M., Seidel D. Nucleosomes in serum as a marker for cell death // Clin. Chem. Lab. Med. 2001. V. 39. P. 596-605.

26. Holdenrieder S., Stieber P., Chan L.Y.S., Geiger S., Kremer A., Nagel D., Lo D.Y.M. Cell-free DNA in serum and plasma: comparison of ELISA and quantitative PCR // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1544-1546.

27. Holdenrieder S., Mueller S., Stieber P. Stability of nucleosomal DNA fragments in serum // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1026-1028.

28. Pepys M.B., Butler P.J. Serum amyloid P component is the major calcium-dependent specific DNA binding protein of the serum // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 148. P. SOS-SIS.

29. Kawamura M.T., Paschoal M.E., da Costa Carvalho M.D. In vitro interaction of serum protein with circulating DNA of lung cancer patient // Int. J. Mol. Med. 1999. V. 4. P. 187-190.

30. Егорова B.A., Блинов М.Н. ДНК-связывающие белки сыворотки крови при гемобластозах // Вопросы медицинской химии. 1993. Т. 39. С. 36-38.

31. Leon S.A., Shapiro В., Servi P., Parsons R.G. A comparison of DNA and DNA-binding protein levels in malignant disease // Eur. J. Cancer. 1981. V. 17. P. 533-538.

32. Паутова JI.В., Рыкова Е., Лактионов П.П., Власов В.В. Исследование взаимодействия полиреактивных антител с нуклеиновыми кислотами с помощью алкилирующих производных олигонуклеотидов // Молекулярная биология. 1996. Т. 30. С. 941-950.

33. Laktionov P.P., Dazard J.E., Vives E., Rykova E.Y., Piette J., Vlassov V.V., Lebleu B. (1999) Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27, 2315-2324.

34. Van Schravendijk M.R., Dwek R.A. Interaction of Clq with DNA // Mol. Immunol. 1982. V. 19. P. 1179-1187.

35. Hoch S.O. DNA-binding domains of fibronectin probed using Western blots // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 106. P. 1353-1358.

36. Лактионов П.П., Рыкова Е., Крепкий Д.В., Брыксин А.В., Власов В.В. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 613-618.

37. Zou S., Magura С.Е., Hurley W.L. Heparin-binding properties of lactoferrin and lysozyme // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1992. V. 103. P. 889-895.

38. Wieczorek A.J., Rhyner C., Block L.H. Isolation and characterization of an RNA-proteolipid complex associated with the malignant state in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 3455-3459.

39. Wieczorek A.J. RNA proteoglycolipid from melanoblastoma serum transforms human bone marrow reticulum cells // Yale J. Biology. 1984. V. 57. P. 432.

40. Carr J.M., Dvorak A.M., Dvorak H.F. Circulating membrane vesicles in leukemic blood // Cancer Res. 1985. V. 45. P. 5944-5951.

41. Rosi A., Guidoni L., Luciani A.M., Mariutti G., Viti V. RNA-lipid complexes released from the plasma membrane of human colon carcinoma cells // Cancer Lett. 1988. V. 39. P. 153-160.

42. Ceccarini M., Guidoni L., Luciani A.M., Mariutti G., Rosi A., Viti V. Biochemical and NMR studies on structure and release conditions of RNA-containing vesicles shed by human colon adenocarcinoma cells // Int. J. Cancer. 1989. V. 44. P. 714-721.

43. Wright L.C., May G.L., Dyne M., Mountford C.E. A proteolipid in cancer cells is the origin of their high-resolution NMR spectrum // FEBS Lett. 1986. V. 203. P. 164-168.

44. El-Hefnawy T., Raja S., Kelly L., Bigbee W.L., Kirkwood J.M., Luketich J.D., Godfrey T.E. Characterization of amplifiable, circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 564-573.

45. Sisco K.L. Is RNA in serum bound to nucleoprotein complexes? // Clin. Chem. 2001. V. 47. P. 1744-1745.

46. Ng E.K., Tsui N.B., Lam N.Y., Chiu R.W., Yu S.C., Wong S.C., Lo E.S., Rainer T.H., Johnson P.J., Lo Y.M. Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 1212-1217.

47. Ratajczak J., Wysoczynski M., Hayek F., Janowska-Wieczorek A., Ratajczak M.Z. Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication // Leukemia. 2006. V. 20.1487-1495.

48. Fevrier B., Raposo G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. V. 16. P. 415-421.

49. Johnstone R.M. Exosomes biological significance: a concise review // Blood Cells Mol. Dis. 2006. V. 36. P. 315-321.

50. Stoorvogel W., Kleijmeer M.J., Geuze H.J., Raposo G. The biogenesis and functions of exosomes // Traffic. 2002. V. 3. P. 321-330.

51. Keller S., Sanderson M.P., Stoeck A., Altevogt P. Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function // Immunol. Lett. 2006. V. 107. P. 102-108.

52. Li X.B., Zhang Z.R., Schluesener H.J., Xu S.Q. Role of exosomes in immune regulation // J. Cell. Mol. Med. 2006. V. 10. P. 364-375.

53. Mignot G., Roux S., Thery C., Segura E., Zitvogel L. Prospects for exosomes in immunotherapy of cancer//J. Cell. Mol. Med. 2006. V. 10. P. 376-388.

54. Johnstone R.M. Adam M., Hammond J.R. Orr L., Turbide C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes) // J. Chem. Biol. 1987. V. 262. P. 9412-9420.

55. Lin X.P., Almqvist N., Telemo E. Human small intestinal epithelial cells constitutively express the key elements for antigen processing and the production of exosomes // Blood Cells MoI.Dis. 2005. V. 35. P. 122-128.

56. Raposo G., Nijman H.W., Stoorvogel W., Liejendekker R., Harding C.V., Melief C.J., Geuze H.J. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles // J. Exp. Med. 1996. V. 183. P. 11611172.

57. Kim V. N., Han J., Siomi M. C. Biogenesis of small RNAs in animals // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. V. 10. P. 126-139.

58. Croce C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer // Nat. Rev. Genet. 2009. V. 10. P. 704-714.

59. Tewari M. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. V. 105. P. 10513-10518.

60. Беляев Н.Д., Будкер В.Г., Горохова О.Е., Соколов А.В. Mg2+-3aBnciiMoe взаимодействие ДНК с эукариотическими клетками // Молекулярная биология. 1988. V. 22. Р. 1667-1672.

61. Budker V.G., Godovikov А.А., Naumova L.P., Slepneva I.A. Interaction of polynucleotides with natural and model membranes // Nucleic Acids Res. 1980. V.8. P. 2499-2515.

62. Lengyel A., Uhrikova D., Klacsova M., Balgavy P. DNA condensation and its thermal stability influenced by phospholipid bilayer and divalent cations // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2011. V. 86. P. 212-217.

63. McManus J.J., Radler J.O., Dawson K.A. Phase behavior of DPPC in a DNA-calcium-zwitterionic lipid complex studied by small-angle x-ray scattering // Langmuir. 2003. V. 19. P. 9630-9637.

64. Dorsch C.A. Binding of single-strand DNA to human platelets // Thromb. Res. 1981. V. 24. P. 119-129.

65. Fiedel B.A., Schoenberger J.S., Gewurz H. Modulation of platelet activation by native DNA // J. Immunol. 1979. V. 123. P. 2479-2483

66. Huss R.A. 42 kD erythrocyte surface membrane protein with binding capacity to polynucleotides shows functional lack in systemic lupus erythematosus. // Immunobiology. 1988. V. 178. P. 141-142.

67. Bennett R.M., Kotzin B.L., Merritt M.J. DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders. Induction by anti-DNA antibodies, antihistone antibodies, and antireceptor antibodies // J. Exp. Med. 1987. V. 166. P. 850-863.

68. Laktionov P.P., Chelobanov B.P., Rykova E.Y., Pyshnyi D.V., Marcus K., Meyer H.E., Vlassov V.V. Cell surface oligonucleotide-binding proteins of human squamous carcinoma A431cells // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003. V. 22. P. 1715-1719.

69. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Власов В.В. Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот//Биохимия. Т. 71. С. 725-741.

70. Rieber М., Bacalao J. An "external RNA" removable from mammalian cells by mild proteolysis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 4960- 4964.

71. Juckett D.A., Rosenberg B. Actions of cis-diamminedichloroplatinum on cell surface nucleic acids in cancer cells as determined by cell electrophoresis techniques // Cancer Res. 1982. V. 42. P. 3565-3573.

72. Aggarwal S.K., Wagner R.W., McAllister P.K., Rosenberg B. Cell-surface-associated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microcopy // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 928-932.

73. Chan T.M., Yu P.M., Tsang K.L.C., Cheng I.K.P. Endothelial cell binding by human polyclonal anti-DNA antibodies: relationship to disease activity and endothelial functional alterations // Clin. Exp. Immunol. 1995. V. 100. P. 506-513.

74. Koutouzov S., Cabrespines A., Amoura Z., Chabre H., Lotton C., Bach J-F. Binding of nucleosomes to a cell surface receptor: redistribution and endocytosis in the presence of lupus antibodies // Eur. J. Immunol. 1996. V. 26. P. 472-486.

75. Watson K., Gooderham N.J., Davies D.S., Edwards R.J. Nucleosomes bind to cell surface proteoglycans // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 21707-21713.

76. Schellekens P.T., Eijsvoogel V.P. Lymphocyte transformation in vitro. I. Tissue culture conditions and quantitative measurements // Clin. Exp. Immunol. 1968. V. 3. P. 571-584.

77. Sarma D.S., Zubroff J. Synthesis and fragmentation of DNA in phytohaemagglutinin-stimulated human peripheral blood lymphocytes // Immunol. Commun. 1973. V. 2. P. 277-85.

78. Rogers J.C. Characterization of DNA excreted from phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes //J. Exp. Med. 1976. V. 143. P. 1249-1264.

79. Rogers J.C., Boldt D., Kornfeld S., Skinner S.A., Valeri C.R. Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen. // Proc. Nat. Acad. USA. 1972. V. 69. P. 1685-1689.

80. Li J.Z., Steinman C.R. Plasma DNA in systemic lupus erythematosus: characterization of cloned base sequences // Arthritis Rheum. 1989. V. 32. P. 726-733.

81. Muller F., Tobler H. Chromatin diminution in the parasitic nematodes ascaris suum and parascaris univalens // Int. J. Parasitol. 2000. V. 30. P. 391-399.

82. Beermann S. The diminution of heterochromatic chromosomal segments in Cyclops (Crustacea, Copepoda) // Chromosoma. 1977. V. 60. P. 297-344.

83. Dorward H.M., Wyngaard G.A. Variability and pattern of chromatin diminution in the freshwater Cyclopidae (Crustacea: Copepoda) // Arch. Hydrobiol. Suppl. 1997. V. 107. P. 447465.

84. Goday C., Esteban M.R. Chromosome elimination in scarid flies // BioEssays. 2001. V. 23. P. 242-250.

85. Tobler H. The differentiation of germ and somatic cell lines in nematodes. In Results and problems in cell differentiation. V. 13. Edited by W. Hennig. Springer, Heidelberg, Germany. P. 2-69.

86. Drouin G. Chromatin diminution in the copepod Mesocyclops edax: diminution of tandemly repeated DNA families from somatic cells // Genome. 2006. V. 49. P. 657-665.

87. Muller F., Walker P., Aeby P., Neuhaus H., Felder H., Back E., Tobler H. Nucleotide sequence of satellite DNA contained in the eliminated genome of Ascaris lumbricoides // Nucleic Acids Res. 1982. V. 10. P. 7493-7510.

88. Teschke C., Solleder G., Moritz K.B. The highly variable pentameric repeats of the AT-rich germline limited DNA in Parascaris univalens are the telomeric repeats of somatic chromosomes // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 2677-2684.

89. Goto Y., Kubota S., Kohno S. Highly repetitive DNA sequences that are restricted to the germ line in the hagfish Eptatretus cirrhatus: a mosaic of eliminated elements // Chromosoma. 1998. V. 107. P. 17-32.

90. Nishimura S., Tanaka T., Fujita K., Itaya M., Hiraishi A., Kikuchi Y. Extracellular DNA and RNA produced in a marine photosynthetic bacterium Rhodovulum sulfidophilum // Nucleic Acids Res. Suppl. 2003. V. 3. P. 279-280.

91. Hamilton H.L., Domingues N.M., Schwartz K.J., Hackett K.T., Dillard J.P. Neisseria gonorrhoeae secretes chromosomal DNA via a novel type IV secretion system // Mol. Microbiol. 2005. V.55. P. 1704-1721.

92. Steinberger R.E., Holden P.A. Extracellular DNA in single-and multiple-species unsaturated bio films // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 5404-5410.

93. Matsui K., Ishii N., Kawabata Z. Release of extracellular transformable plasmid DNA from Escherichia coli cocultivated with algae // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 23992404.

94. Whitchurch C.B., Tolker-Nielsen T., Ragas P.C., Mattic J.C. Exracellular DNA required for bacterial biofilm formation // Science. 2002. V. 295. P. 1487.

95. Finkel S.E., Kotler R. DNA as a nutrient: novel role for bacterial competence gene homologs // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 6288-6293.

96. Yu X., Harris S.L., Levine A.J. The regulation of exosome secretion: a novel function of the p53 protein // Cancer Res. 2006. V. 66. P. 4795-4801.

97. Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous extracellular synthesis of DNA released by human blood lymphocytes // Cancer Res. 1976. V. 36. P. 2832-2839.

98. Van Cruchten S., van der Broeck W. Morphological and biochemical aspects of apoptosis, oncosis and necrosis // Anat. Histol. Embryol. 2002. V. 31. P. 214-223.

99. Alnemri E.S., Livingston D.J., Nicholson D.W., Salvesen G., Thornberry N.A., Wong W.W., Yuan J. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. // Cell. 1996. V. 87. P. 171-180.

100. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. // Annu. Rev. Biochem. 1999. V. 68. P. 383-424

101. Thornberry N.A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within. // Science. 1998. V. 281. P. 13121316

102. Green D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell. 1998. V. 94. P. 695-698.

103. Samejima K, Earnshaw WC. Trashing the genome: the role of nucleases during apoptosis //

104. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2005. V. 6. P. 677-688.

105. Widlak P., Garrard W. T. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G. //J. Cell. Biochem. 2005. V. 94. P. 1078-1087.

106. Widlak P., Li P., Wang X., Garrard W. T. Cleavage preferences of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) on naked DNA and chromatin substrates. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 8226-8232.

107. Li L. Y., Luo X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. // Nature. 2001. V. 412. P. 95-99.

108. Widlak P., Li L.Y., Wang X., Garrard W. T. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I. //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 48404-48409.

109. Shiokawa D., Shika Y., Tanuma S. Identification of two functional nuclear localization signals in DNase gamma and their roles in its apoptotic DNase activity // Biochem. J. 2003. V. 376. P. 377-381.

110. Shiokawa D., Kobayashi T., Tanuma S. Involvement of DNase gamma in apoptosis associated with myogenic differentiation of C2C12 cells // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 31031-31037.

111. Krieser R.J., MacLea K.S., Longnecker D.S., Fields J.L., Fiering S., Eastman A. Deoxyribonuclease II is required during the phagocytic phase of apoptosis and its loss causes perinatal lethality. // Cell Death Differ. 2002. V. 9. P. 956-962.

112. Didenko V.V., Hornsby P.J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis // J. Cell Biol. 1996. V. 135. P. 1369-1376.

113. Didenko V.V., Ngo H., Baskin D.S. Early necrotic DNA degradation: presence of blunt-ended DNA breaks, 3' and 5' overhangs in apoptosis, but only 5' overhangs in early necrosis // Am. J. Pathol. 2003. V. 162. P. 1571-1578.

114. Bartova E., Jirsova P., Fojtova K., Soucek K., Kozubek S. Chromosomal territory segmentation in apoptotic cells // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 979-990.

115. Choi J.-J., Reich III C.F., Pisetsky D.S. Release of DNA from dead and dying lymphocyte and monocyte cell lines in vitro // Scand. J. Immunol. 2004. V. 60. P. 159-166.

116. Deligezer U., Yaman F., Erten N., Dalay N. Frequent copresence of methylated DNA and fragmented nucleosomal DNA in plasma of lymphoma patients // Clin. Chim. Acta. 2003. V. 335. P. 89-94.

117. Giacona M.B., Ruben G.C., Iczkowski K.A., Roos T.B., Porter D.M., Sorenson G.D. Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls//Pancreas. 1998. V. 17. P. 89-97.

118. Diaz-Guerra M., Rivas C., Esteban M. Activation of the IFN-inducible enzyme RNase L causes apoptosis of animal cells // Virology. 1997. V. 236. P. 354-63.

119. Houge G., Robaye B., Eikhom T.S., Golstein J., Mellgren G., Gjertsen B.T., Lanotte M., Doskeland S.O. Fine mapping of 28S rRNA sites specifically cleaved in cells undergoing apoptosis // Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 2051-2062.

120. Del Prete M.J., Roblcs M.S., Guio A., Martinez-A C., Izquierdo M., Garcia-Sanz J.A. Degradation of cellular mRNA is a general early apoptosis-induced event // FASEB J. 2002. V. 16. 2003-2005.

121. Biggiogera M., Bottone M.G., Pellicciari C. Nuclear RNA is extruded from apoptotic cells // J. Histochem. Cytochem. 1998. V. 46. P. 999-1005.

122. Biggiogera M., Bottone M.G., Martin T.E., Uchiumi T., Pellicciari. Still immunodetectable nuclear RNPs are extruded from the cytoplasm of spontaneously apoptotic thymocytes // Exp. Cell Res. 1997. V. 234. P. 512-20.

123. Biggiogera M., Bottone M.G., Scovassi A.I., Soldani C., Vecchio L., Pellicciari C. Rearrangement of nuclear ribonucleoprotein (RNP)-containing structures during apoptosis and transcriptional arrest // Biol. Cell. 2004. V. 96. P. 603-615.

124. Halicka H.D., Bedner E., Darzynkiewicz Z. Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in apoptotic bodies during apoptosis // Exp. Cell Res. 2000. V. 260. P. 248256.

125. Hasselmann D.O., Rappl G., Tilgen W., Reinhold U. Extracellular tyrosinase mRNA within apoptotic bodies is protected from degradation in human serum // Clin. Chem. 2001. V. 47. P. 1488-1489.

126. Mehra N., Penning M., Maas J., van Daal N., Giles R., Voest E. Circulating mitochondrial nucleic acids have prognostic value for survival in patients with advanced prostate cancer. // Clin. Cancer Res. 2007. V. 13. P. 421-426.

127. Lichtenstein A.V., Melkonyan H.S., Tomei L.D., Umansky S.R. Circulating nucleic acids and apoptosis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 239-249.

128. Dufva M. Introduction to microarray technology // Methods Mol. Biol. 2009. V. 529. P. 1-22.

129. Lashkari D.A., McCusker J.H., Davis R.W. Whole genome analysis: experimental access to all genome sequenced segments through larger-scale efficient oligonucleotide synthesis and PCR // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 8945-8947.

130. Margulies M., Egholm M., Altman W.E. Genom sequencing in microfabricated high density picolitre reactors // Nature. 2005. V. 437. P. 376-380.

131. Bentley DR. Whole-genome re-sequencing // Curr. Opin. Genet. Dev. 2006. V. 16. P. 545-552.

132. Klein C.A., Schmidt-Kittler O., Schardt J.A. at al. Comparative genomic hybridization, loss of heterozygosity and DNA sequence analysis of single cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 4494-4499.

133. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E. et al. Degenerate oligonucleotide primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer // Genomics. 1992. V. 13 P. 718725.

134. Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D., Rutovitz D., Gray J.W., Waldman F., Pinkel D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors // Sience. 1992. V.258. P. 818-821.

135. Piper J., Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D., Rutovitz D., Gray J.W., Waldman F., Pinkel D. Computer image analyis of comparative genomic hybridization // Cytometry. 1995. V. 19. P. 10-26.

136. Cremer T., Popp S., Emmerich P., Lichter P., Cremer C. Rapid metaphase and interphase detection of radiation-induced chromosome aberrations in human lymphocytes by chromosomal suppression in situ hybridization // Cytometry. 1990. V. 11. P. 110-118.

137. Van der Vaart M., Pretorius P J. A method for characterization of total circulating DNA // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2008. V. 1137. P. 92-97.

138. Van der Vaart M., Semenov D.V., Kuligina E.V., Richter V.A., Pretorius P.J. Characterization of circulating DNA by parallel tagged sequencing on the 454 platform // Clin. Chim. Acta. 2009. V. 409. P. 21-27.

139. Suzuki N., Kamatak A., Yamaki J., Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma // Clin. Chim. Acta. 2008. V. 387. P. 55-58.

140. Beck J., Urnovitz H.B., Riggert J., Clerici M., Schutz E. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals // Clin. Chem. 2009. V. 55. P. 730-738.

141. Ueki S., Citovsky V. RNA commutes to work: regulation of plant gene expression by systemically transported RNA molecules // BioEssays. 2001. V. 23. P. 1087-1090.

142. Huang T., Boehlenius H., Eriksson S., Parcy F., Nilsson O. The mRNA of the Arabidopsis gene FT moves from leaf to shoot apex and induces flowering // Science. 2005. V. 309. P. 1694-1696.

143. Lucas W.J., Yoo B.-C., Kragler F. RNA as a long-distance information macromolecule in plants // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001. V. 2. P. 849-857.

144. Ding В., Itaya A., Qi Y. Symplasmic protein and RNA traffic: regulatory points and regulatory factors // Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V. 6. P. 596-602.

145. Кулигина E.A. Нуклеиновые кислоты человеческого молока структура и возможные фенкции. Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Кулигина Е.С. Институт химической биологии и фундаментальной медицины Новосибирск., 2005. -20 с.

146. Попова Т.И., Аглиуллина Д.Г., Винтер В.Г. Иммуномодулирующее действие низкомолекулярной РНК, выделяемой клетками асцитного рака Эрлиха // Эксперим. Онкология. 1991. Т. 13. С. 44-47.

147. Hefeneider S.H., Cornell К.А., Brown L.E., Bakke A.C., McCoy S.L., Bennett R.M. Nucleosomes and DNA bind to specific cell-surface molecules on murine cells and induce cytokine production// Clin. Immunol. Immunopathol. 1992. V. 63. P. 245-251.

148. Adams D.H., Diaz N., Gahan P.B. In vitro stimulation by tumour cell media of 3H.-thymidine incorporation by mouse spleen lymphocytes // Cell Biochem. Funct. 1997. V. 15. P. 119-126.

149. Beierle J.W. Cell proliferation: enhancement by extracts from cell surfaces of polyoma-virus-transformed cell // Science. 1968. V. 161. P. 798-799.

150. Folkman J., Merler E., Abernathy C., Williams G. Isolation of tumor factor responsible for angiogenesis // J. Exp. Med. 1971. V. 133. P. 275-288.

151. Benner S.A. Extracellular 'communicator RNA' // FEBS Lett. 1988. V. 233. P. 225-228.

152. Molin S., Tolker-Nielsen T. Gene transfer occurs with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced stabilization of the biofilm structure // Curr. Op. Biothechnol. 2003. V. 14. P. 255-261.

153. De la Taille A., Chen M.W., Burchardt M., Chopin D.K., Buttyan R. Apoptotic conversion: evidence for exchange of genetic information between prostate cancer cells mediated by apoptosis // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 5461-5463.

154. O.Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E., Folkman J., Klein G., Ernberg I., Falk K.I. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood. 1999. V. 93. P. 3956-3953.

155. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M., Bratt A., Folkman J.M., Spetz A., Holmgren L. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 6407-6411.

156. Bergsmedh A., Szeles A., Spetz A., Holmgren L. Loss of the p21Cipl/Wafl cyclin kinase inhibitor results in propagation of horizontally transferred DNA // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 575-579.

157. Bergsmedh A., Ehnfors J., Kawane K., Motoyama N., Nagata S., Holmgren L. DNase II and the Chk2 DNA damage pathway form a genetic barrier blocking replication of horizontally transferred DNA // Mol. Cancer Res. 2006. V. 4. P. 187-195.

158. Yan B., Wang H., Li F., Li C.Y. Regulation of mammalian horizontal gene transfer by apoptotic DNA fragmentation // Br. J. Cancer. 2006. V. 95. P. 1696-1700.

159. Garcia-01mo D., Garcia-Olmo D.C., Ontanon J., Martinez E., Vallejo M. Tumor DNA circulating in the plasma might play a role in metastasis. The hypothesis of the genometastasis // Histol. Histopathol. 1999. V. 14. P. 1159-64.

160. Garcia-01mo D., Garcia-Olmo D.C., Ontanon J., Martinez E. Horizontal transfer of DNA and the "genometastasis hypothesis" // Blood. 2000. V. 95. P. 794-795.

161. Spees J.L., Olson S.D., Whitney M.J., Prockop D.J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 1283-1288.

162. Krieg A.M. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts? // Nat. Med . 2003. V. 9. P. 831-835.

163. Yamamoto S., Yamamoto H., Shimada S., Kuramoto E., Yano O., Kataoka T., Tokunaga T. DNA from bacteria, but not vertebrates, induces interferons, activates natural killer cells and inhibits tumor growth // Microb. Immunol. 1992. V. 36. P. 983-988.

164. Messina J.P., Gilkeson C.S., Pisetsky D.S. Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA. // J. Immunol. 1991. V. 147. P. 1759-1764.

165. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation // Nature. 1995. V. 374. P. 546-549.

166. Krieg A.M. CpG motofs in bacterial DNA and their immune effects // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 709-760.

167. Klinman D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides // Nature Rev. Immunol. 2004. V. 4. P. 1-10.

168. Bauer S., Kirschning C.J., Hacker H., Redecke V., Hausmann S., Akira S., Wagner H., Lipford G.B. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. V. 98. P. 9237-9242.

169. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA // Nature. 2000. V. 408. P. 740-745.

170. Yi A.K., Tuetken R., Redford T., Waldschmidt M., Kirsch J., Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA activate leukocytes through the pH-dependent generation of reactive oxygen species //J. Immunol. 1998. V. 160. P. 4755-4761.

171. Takeshita F., Leifer C.A., Gursel I., Ishii KJ., Takeshita S., Gursel M., Klinman D.M. Catting edge: Role of toll-like receptor 9 in CpG DNA-induced activation of human cells // J. Immunol. 2001. V. 167. P. 3555-3558.

172. Ballas Z., Rasmussen W.L., Krieg A.M. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxinucleotides and bacterial DNA//J. Immunol. 1996. V. 157. P. 18401847.

173. Auf G., Carpentier A.F., Chen L., Le Clanche C., Delattre J.Y. Implication of macrophages in tumor rejection induced by CpG-oligodeoxynucleotides without antigen // Clin. Cancer Res. 2001. V. 7. P. 3540-3543.

174. Prud'homme G.J. DNA vaccination against tumors // J. Gene Med. 2005. V. 7. P. 3-17.

175. Miconnet I., Koenig S., Speiser D., Krieg A., Guillaume P., Cerottini J.C., Romero P. CpG are efficient adjuvants for specific CTL induction against tumor antigen-derived peptide // J. Immunol. 2002. V. 168. P. 1212-1218.

176. Jahrsdorfer В., Weiner G.J. Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides and antybody therapy of cancer // Semin. Oncol. 2003. V. 30. P. 476-482.

177. Wang X-S., Sheng Z., Ruan Y-B., Guang Y., Yang M.L. CpG oligodeoxynucleotides inhibit tumor growth and reverse the immunosuppression caused by the therapy with 5-fluorouracilin murine hepatoma // World J. Gastroenterol. 2005. V. 11. P. 1220-1224.

178. Wang Q., Carmichael G.G. Effects of length and location on the cellular response to double-stranded RNA // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V. 68. P. 432-452.

179. Clemens M.J. PKR a protein kinase regulated by double-stranded RNA // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. V. 29. P. 945-949.

180. Meurs E., Chong K., Galabru J., Thomas N.S., Kerr I.M., Williams B.R., Hovanessian A.G. Molecular cloning and characterization of the human double-stranded RNA-activated protein kinase induced by interferon // Cell. 1990. V. 62. P. 379-390.

181. Spanggord R.J., Vuyisich M., Beal P.A. Identification of binding sites for both dsRBMs of PKR on kinase-activating and kinase-inhibiting RNA ligands // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 4511-4520.

182. Kumar M., Carmichael G.G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 1415-1434.

183. Li X.L., Blackford J.A., Hassel B.A. RNase L mediates the antiviral effect of interferon through a selective reduction in viral RNA during encephalomyocarditis virus infection // J. Virol. 1998. V. 72. P. 2752-2759.

184. Alexopoulou L., Holt A.C., Medzhitov R., Flavell R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa В by Toll-like receptor 3 // Nature. 2001. V. 413. P. 732-738.

185. Matsumoto M., Kikkawa S., Kollase M., Miyake К., Seya Т. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 293. P. 1364-1369.

186. Hornung V., Barchet W., Schlee M., Hartmann G. RNA recognition via TLR7 and TLR8 // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. V. 183. P. 71-86

187. Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., MacLachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 457-462.

188. Sioud M. Single-stranded small interfering RNA are more immunostimulatory than their double-stranded counterparts: a central role for 2'-hydroxyl uridines in immune responses // Eur. J. Immunol. 2006. V. 36. P. 1222-1230.

189. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria // J. Clin. Invest. 1973. V. 52. P. 2745-2756.

190. Takada H, Mihara J, Morisaki I, Hamada S. Induction of Interleukin-1 and -6 in Human Gingival Fibroblast. Cultures Stimulated with Bacteroides Lipopolysaccharides // Infection And Immunity.1991; V. 59; N 1; P. 295-301.

191. Van Kuppeveld F.J., Melchers W.J., Willemse H.F., Kissing J., Galama J.M., van der Logt J.T. Detection of Mycoplasma pulmonis in experimentally infected laboratory rats by 16S rRNA amplification // J. Clin. Microbiol.1993. V. 31. P. 524-527.

192. Dussurget O, Roulland-Dussoix D. Rapid, sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sera // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 953-959.

193. Salic A., Mitchison TJ. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105. P. 2415-2420

194. Ausubel F. Short protocols in molecular biology. New York. Wiley &Sons, Inc. 1993.

195. Лактионов П.П., Тамкович С.II., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот. Заявка на изобретение № 2002126328. Приоритет от 02.10.2002.

196. Berger М., Wood H.G. Purification of the subunits of transcarboxylase by affinity chromatography on avidin-sepharose // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 927-933.

197. Lichter P., Cremer T., Borden J., Manuelidis L., Ward D.C. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries // Hum. Genet. 1988. V. 80. P. 224-234.

198. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Anoprienko O.V., Karamysheva T.V., Shevchenko A.I., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. Reorganization of the X chromosome in voles of the genus Microtus // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P 323-329.

199. Pober J.S., Cotran R.S. The role of endothelial cells in inflammation // Transplantation. 1990. V. 50. P. 537-544.

200. Mantovani A., Bussolino F., Introna M. Cytokine regulation of endothelial cell function: from molecular level to the bedside // Immunol. Today. 1997. V. 18. P. 231-40

201. Chen C.C., Manning A.M. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells // Cytokine. 1996. V. 8. P. 5865.

202. Bevilacqua M.P., Pober J.S., Mendrick D.L.,Cotran R.S., Gimbrone M.A. Identification of an indicible endothelial-Ieukocyte adhesion molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 84. P. 9238-9242.

203. Sadler J.E. Biochemistry and genetics of von Willebrand factor // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 395-424.

204. Smith C.W. Leukocyte-endothelial cell interactions // Semin. Hematol. 1993. V. 30. P. 45-53

205. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 64. P. 1094-1156.

206. Labarca, C., and Paigen, K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure // Anal. Biochem. 1980. V. 102. P. 344-352.

207. Gallagher S.R. Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2011. Appendix 3:3D.

208. Khan H., Smit A, Boissinot S. Molecular evolution and tempo of amplification of human LINE-1 retrotransposons since the origin of primates // Genome Res. 2006. V. 16. P. 78-87.

209. Sunami E., Vu A.T., Nguyen S.L., Giuliano A.E., Hoon D.S. Quantification of LINE1 in circulating DNA as a molecular biomarker of breast cancer // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008 V. 1137. P.171-174.

210. Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry: influence of endogenous endonucleases // Exp. Cell Res. 2002. V. 277. P. 1-14.

211. Hr¡stov M., Erl W., Linder S., Weber P.C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro // Blood. 2004. V. 104. P. 2761-2766.

212. Vlassov A.V., Magdaleno S., Setterquist R., Conrad R. Exosomes: Current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1820. P. 940-948.

213. De Almeida C.J., Linden R. Phagocytosis of apoptotic cells: a matter of balance // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 1532-1546.

214. Fadok V.A. Clearance: the last and often forgotten stage of apoptosis // J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 1999. V. 4. P. 203-211.

215. Radic M., Marion T., Monestier M. Nucleosomes are exposed at the cell surface in apoptosis // J. Immunol. 2004. V. 172. P. 6692-6700

216. Zhao H., Bose S., Tuominen E.K., Kinnunen P.K. Interactions of histone HI with phospholipids and comparison of its binding to giant liposomes and human leukemic T cells // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 10192-10202.

217. Allera C., Lazzarini G., Patrone E., Alberti I., Barboro P., Sanna P., Melchiori A., Parodi S., Balbi C. The condensation of chromatin in apoptotic thymocytes shows a specific structural change// J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 10817-10822.

218. Lincoln C.K., Gabridge M.G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination // Methods Cell. Biol. 1998. V. 57. P. 49-65.

219. Gahan P.B., Stroun M. The virtosome a novel cytosolic informative entity and intercellular messenger// Cell. Biochem. Funct. 2010. V. 28. P. 529-538.

220. Vollenbroich D., Pauli G., Ozel M., Vater J. Antimycoplasma properties and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 44-49.

221. Long B.H. Mechanisms of action of teniposide (VM-26) and comparison with etoposide (VP-16) // Semin. Oncol. 1992. V. 19. P. 3-19.

222. Montecucco A., Biamonti G. Cellular response to etoposide treatment // Cancer Lett. 2007. V. 252. P. 9-18.

223. Adams J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis // Genes Dev.2003. V. 17. P. 2481-2495.

224. Khammanit R., Chantakru S., Kitiyanant Y., Saikhun J. Effect of serum starvation and chemical inhibitors on cell cycle synchronization of canine dermal fibroblasts // Theriogenology. 2008. V. 70. P. 27-34.

225. Iyer V., Eisen V., Ross D. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. // Science. 1998. V. 283. P. 83-87.

226. Andersson U., Matsuda T. Human interleukin 6 and tumor necrosis factor alpha production studied at a single-cell level // Eur. J. Immunol. 1989. V. 19. P. 1157-1160.

227. Hilton H. Mollenhauer, D. James Morre, Loyd D. Rowe Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity // Biochim. Biophis. Acta. 1998. V. 1031. P. 225-246.

228. Hamon Y., Luciani M.F., Becq F., Verrier В., Rubartelli A., Chimini G. Interleukin-lbeta secretion is impaired by inhibitors of the ATP binding cassette transporter, ABC1. // Blood. 1997. V. 90. P. 2911-2915.

229. Nickel W. The mystery of nonclassical protein secretion. A current view on cargo proteins and potential export routes.//Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P 2109-2119.

230. Karres I., Kremer J.-P., Dietl I., Steckholzer U, Jochum M., Ertel W. Chloroquine inhibits proinflammatory cytokine release into human whole blood // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. 1058-1064

231. Slee E.A., Zhu H., Chow S.C., MacFarlane M., Nicholson D.W., Cohen G.M. Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone (Z-VAD.FMK) inhibits apoptosis by blocking the processing of CPP32 // Biochem. J. 1996. V. 315. P. 21-24.

232. Pepys M.B., Butler P.J. Serum amyloid P component is the major calcium-dependent specific DNA binding protein of the serum // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 148, P. 308313.

233. Dullea R.G., Robinson J.F., Bedford J.S. Nonrandom degradation of DNA in human leukemic cells during radiation-induced apoptosis // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3712-3718.

234. Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие // Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск. 2006.

235. Costa G.L., Weiner M.P. Polishing with T4 or Pfu polymerase increases the efficiency of cloning of PCR fragments // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. N. 2423.

236. Pheiffer В. H., Zimmerman S.B. Polymer-stimulated ligation: enhanced blunt- or cohesive-end ligation of DNA or deoxyribooligonucleotides by T4 DNA ligase in polymer solutions // Nucleaic Acid Res. 1983. V. 11. P. 7853-7869.

237. Лебедев И.Н., Черемных А.Д., Назаренко C.A., Светлаков А.В. Полиогеномная амплификация ДИК: современные достижения и перспективы использования в преимплантационной генетической диагностике // Проблемы репродукции. 2005. Т. 5. С. 60-67.

238. Li J., Harris L., Mamón H., Kulke М.Н., Liu W. Zhu P., Makrigiorgos G.M. Whole genom amplification of plasma-circulating DNA enables expanded screening for allelic imbalance in plasma // Journal of Molecular Diagnostics. 2006. V. 8. P. 22-30.

239. Valgardsdottir R, Chiodi I, Giordano M, Rossi A., Bazzini S., Ghigna C., Riva S., Biamonti G. Transcription of Satellite III non-coding RNAs is a general stress response in human cells. Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 423-434.

240. Shiels C., Coutelle C., Huxley C. Continuous arrays of satellites 1, 3, and beta form a 1.5-Mb domain on chromosome 22p // Genomics. 1997. V. 44. P. 35-44.

241. Therkelsen A. J., Nielsen A., Kolvraa S. Localization of the classical DNA satellites on human chromosomes as determined by primed in situ labelling (PRINS) // Hum. Genet. 1997. V. 100. P. 322-326.

242. Tagarro I., Fernandez-Peralta A.M., Gonzalez-Aguilera J.J. Chromosomal localization of human satellites 2 and 3 by a FISH method using oligonucleotides as probes // Hum. Genet. 1994. V. 93. P. 383-388.

243. Vodenicharov M., Markova D. Z., and Djondjurov L. P. Spontaneous apoptosis in mouse F4N-S erythroleukemia cells induces a nonrandom fragmentation of DNA // DNA Cell. Biol. 1996. V. 15. P. 287-296.

244. Gazit В., Panet A., and Cedar H. Reconstitution of a deoxyribonuclease I-sensitive structure on active genes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 1787-1790.

245. Gazit В., and Cedar H. Nuclease sensitivity of active chromatin // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. P. 5143-5155.

246. Metz A., Soret J., Vourch C., Tazi J., Jolly C. A key role for stress-induced satellite III transcripts in the relocalization of splicing factors into nuclear stress granules // J. Cell. Sci. 2004. V. 117. P. 4551-4558.

247. Enukashvily N.I., Donev R., Waisertreiger I.S., Podgornaya O.I. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is decondensed, demethylated and transcribed in senescent cells and in A431 epithelial carcinoma cells // Cytogenet. Genome Res. 2007. V. 118. P. 42-54.

Информация о работе

Морозкин, Евгений Сергеевич
кандидата химических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы