Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека

Чвартацкая, Оксана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека"

На правах рукописи

ЧВАРТАЦКАЯ Оксана Викторовна

ВОЗДЕЙСТВИЕ ФРАГМЕНТОВ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ, НАКАПЛИВАЮЩИХСЯ ВО ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК, НА СВОЙСТВА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

I ~ ПАП 2С14

Москва 2014 005549163

005549163

Работа выполнена на кафедре биоорганической химии и биотехнологии

биолого-химического факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский педагогический государственный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент СЕВАСТЬЯНОВА Галина Андреевна

Официальные оппоненты:

ПЛОТНИКОВ Егор Юрьевич доктор биологических наук, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, отдел биоэнергетики, лаборатория структуры и функции митохондрий, ведущий

научный сотрудник

КОСМАЧЕВСКАЯ Ольга Владимировна кандидат биологических наук, ФГБУ науки «Институт биохимии им. А.Н.Баха» РАН, лаборатория биохимии азотфиксации и метаболизма азота, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «30» июня 2014 г. в 15 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет» по адресу: 129164, г. Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп. 3 (учебный корпус № 5), ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет» по адресу: 119992, г. Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1 и на официальной сайте университета www.mpgu.edu

Автореферат разослан «./£». _2014 года.

Учёный секретарь л

диссертационного совета Холмогорова Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Внеклеточная ДНК (вкДНК) в норме присутствует в плазме крови человека и в межклеточном веществе. До сих пор остаются невыясненными вопросы ее происхождения, однако в литературе обсуждаются две главных модели. Первая из них предполагает, что появление вкДНК связано с гибелью клеток в организме, вероятнее всего, посредством апоптоза. Фрагменты ДНК погибших клеток поступают в кровь и циркулируют в организме. В рамках второй модели вкДНК появляется в межклеточном веществе в результате секреции клетками фрагментов ДНК. В ряде независимых исследований показано, что в крови пациентов с различными патологиями концентрации вкДНК существенно возрастают [Вейко и соавт., 2007]. Поэтому на данный момент наибольший интерес научного сообщества вызывает ее применение в диагностике различных заболеваний.

До недавнего времени предполагалось, что вкДНК не влияет на функционирование клеток организма. Однако было показано, что вкДНК существенно отличается от ядерной ДНК (яДНК) по ряду свойств. Установлено, что вкДНК в отличие от яДНК обогащена повторяющейся последовательностью - транскрибируемой областью рибосомного повтора (ТОрДНК) [Костюк и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2007], которая аналогично бактериальной ДНК является потенциальным иммуномодулятором, также было показано, что вкДНК и фрагмент ТОрДНК обладает стимулирующим действием на лимфоциты человека [Вейко и соавт., 2006]. Кроме того, отмечено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной системы опосредуется через белки семейства «Toll-like» рецепторов, обозначаемыми как TLR [Вейко и соавт., 2006].

Однако остается не известным, оказывают ли воздействие фрагменты вкДНК на свойства мезенхимальных стволовых клеток.

ткани. МСК достаточно легко выделяются из костной и жировой тканей, а также из других источников, и быстро растут в лабораторных условиях. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки способны оказывать иммуносупрессорное действие посредством индукции регуляторных Т-лимфоцитов и дендритных клеток [Stagg, 2007]. Эти свойства способствуют применению мезенхимальных стволовых клеток в практической медицине. В то же время не полностью изучена регуляция этих клеток и сигнальные пути, активирующиеся при их взаимодействии с клетками организма, поскольку эти сигнальные пути образуют сложную сеть.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение влияния внеклеточной ДНК и ее фрагментов на мезенхимальные стволовые клетки, посредством моделирования in vitro ситуации, когда эндогенные мезенхимальные стволовые клетки, мигрирующие из ниши в очаги повреждения, или мезенхимальные стволовые клетки, введенные в организм с целью терапии, контактируют с ГЦ-богатой вкДНК, которая в норме и при патологии содержится в плазме крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать адекватные условия культивирования МСК, полученных из жировой ткани;

2. Выявить рецепторы в МСК, которые активируются в ответ на действие вкДНК;

3. Изучить сигнальные пути, участвующие в ответе МСК на действие модельного ГЦ-богатого фрагмента вкДНК;

4. Проследить, какие механизмы выживаемости активируются в МСК при контакте с ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК;

Научная новизна. Впервые показано активирующее действие вкДНК и ГЦ-богатого фрагмента (ТОрДНК) на мезенхимальные стволовые клетки человека, сопровождающееся усилением синтеза РНК и высокой продукцией цитокинов ILIO и TNFa.

Установлено, что стимулирующее действие вкДНК и ТОрДНК на мезенхимальные стволовые клетки человека реализуется посредством активации рецепторов из семейства «toll-like» (в частности TLR9), которые узнают ГЦ-богатые последовательности ДНК.

Впервые показано, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ТОрДНК, активирует в мезенхимальных стволовых клетках ТЬЯ9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-сигнальные пути.

жизнеспособность пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, проводят предварительную обработку клеток, в частности, TNFa [Yao et al., 2009] или синтетическими олигонуклеотидами (ГЦ-ОДН) [Tomchuck et al.,

2008]. Эффективность этой предварительной обработки в значительной степени зависит от активации NF-kB и его транслокации в ядро [Yao et al.,

2009]. Полученные данные указывают на то, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию TLR9, что приводит к активации и транслокации NF-kB в ядро. П(рДНК) может быть использована для предварительной обработки культуры пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, наряду с предлагаемой обработкой стволовых клеток синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции TLR9.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международной конференции «CNAPS VII: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum» (Мадрид Испания, 2011), на научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011), на XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009) и на XXIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в список, рекомендованный ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, 4 главы, состоящих из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 113 страницах текста, иллюстрирована 27 рисунками, включает 6 таблиц. Список литературы состоит из 155 источников, из них 145 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований

Используемые мезенхимальные стволовые клетки были получены из жировой ткани операционного материала больных, доставленного из РОНЦ РАМН в течение часа после резекции опухоли. Экспрессию клетками поверхностных белков проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием антител, меченных флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) ("Becton Dickinson", США). В качестве модельных фрагментов ГЦ-ДНК генома человека использовали ГЦ - богатый фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора ДНК (ТОрДНК) - участок от 515 до 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank, встроенный в вектор pBR322 (р(ТОрДНК)). Выделение вкДНК из плазмы крови проводили фенольно-детергентным методом. Концентрацию вкДНК определяли

флуориметрически на люминесцентном спектрометре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) с использованием ДНК-связывающегося красителя Hoechst 33258, Хвозб =350 нм, Хфлу=450 нм. Выделение РНК из МСК проводили с помощью стандартной методики с использованием наборов YellowSolve (Клоноген, Санкт - Петербург). Определение концентрации полученной РНК проводили на люминесцентном спектрометре «LS 55» («PerkinElmer», Англия). Концентрацию РНК измеряли с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), лвозб=487 нм, лфлу=524 нм. Использовали метод ПЦР в реальном времени по принципу TaqMan, прибор Rotor Gene 300 ("Corbett Research", Австралия). Связывание антител с TLR9 анализировали с помощью антител к TLR9, меченных флуоресцирующим красителем фикоэритрином - PE-anti-TLR9 (еВ72-1665, «eBioscience», США). Секрецию цитокинов - интерлейкина 10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли (ФНО или TNF) определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ИФА) («Cytokine», С.-Петербург, Россия). Активность каспазы 3 определяли с помощью флуоресцирующего субстрата Z-DEVD-AFC (Molecular Probes Europe BV, Netherlands). Полученные результаты были подтверждены в трех независимых экспериментах на трех культурах клеток. На всех рисунках, представленных в работе, показаны усредненные значения и стандартное отклонение (SD). Достоверность различий анализировали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Рецепторы, отвечающие на действие ГЦ-богатой внеклеточной ДНК

Внеклеточная ДНК (вкДНК) в норме присутствует в плазме крови человека. Она значительно отличается от геномной ДНК по ряду свойств: вкДНК сильно обогащена ГЦ - повторами [Suzuki et al., 2008], аналогично бактериальной ДНК. Так, содержание ГЦ - богатой последовательности генома - транскрибируемой области рибосомного повтора (ТОрДНК) в составе вкДНК в несколько раз превышает содержание этого повтора в геномной ДНК [Костюк и др., 2008], и в то же время в составе внеклеточной ДНК отмечается снижение содержания AT - богатых последовательностей [Fan et al., 2008].

Возможная схема их накопления выглядит следующим образом: из здоровых или поврежденных клеток организма при апоптозе и некрозе или в составе фракции метаболической ДНК высвобождаются фрагменты ДНК и поступают в кровоток. Там они подвергаются гидролизу до моно- и олигонуклеосомных фрагментов под действием ДНКазы1. Элиминация этих фрагментов осуществляется в основном с помощью двух механизмов: почечной фильтрации и захвата клетками. Известно, что ГЦ-богатые последовательности более устойчивы к ДНКазному гидролизу, чем АТ-богатые. Это позволяет выявлять ГЦ-богатые фрагменты в биожидкостях,

даже при условии активного нуклеазного гидролиза. [Вейко Н. Н. и Спитковский Д.М., 2000]. Одна из возможных причин такого явления - ГЦ-богатая рДНК, содержащая однонитевые разрывы, обладает повышенной температурой плавления. По этой причине ГЦ-богатые последовательности остаются более длинными и хуже выводятся почками, и, следовательно, накапливаются в кровотоке. Основную часть этой ГЦ-богатой ДНК составляют повторы рибосомного гена ТОрДНК (рис.1).

Гндролщ:10 нщкомолгоу фрагментов \ I (Д11КЯ1Я 1)

Г б/"

Обогащение вкДНК фрагментами CpG-ДНК

Элиминация

коротких фрагментов <-

1. Попом!

2. Захшп клпкйми \

Рисунок 1. Гипотетическая схема, объясняющая накопление фрагментов CpG-ДНК в составе вкДНК.

При патологических состояниях концентрация фрагментов вкДНК значительно повышается. Происходит накопление вкДНК в плазме крови пациентов с различными заболеваниями, такими как инфаркт миокарда, атеросклероз, коронарная сердечная недостаточность. Была определена концентрация повторяющейся последовательности генома в плазме -транскрибируемой области рибосомного повтора человека (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22). Она представлена в геноме в количестве 300-700 копий [Вейко H.H. и соавт., 2003]. Ранее было показано, что фрагменты ТОрДНК устойчивы к двунитевым разрывам при нуклеазном гидролизе и накапливаются в сыворотке больных ревматоидным артритом [Вейко и соавт., 2006]. Измерение количества рДНК во вкДНК проводили методом количественной дот-гибридизации. Для определения количества ТОрДНК использовали зонд pHRGRR-28S, содержащий клонированный фрагмент гена 28S рРНК. Содержание рДНК в геномной ДНК равно 1,8 ± 0,2 пг/нг, что было принято за единицу, далее брали выборку пациентов с различными

Клетки оргянщмн

Ч /

"Метаболическая" ДНК

ЛПОПТО! (HCKpOl)

заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия, атеросклероз, коронарная сердечная недостаточность и выборка здоровых доноров (где N - количество исследованных образцов). Было выявлено, что при патологических состояниях содержание в плазме крови вкДНК значительно увеличивается: при ревматоидном артрите содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет 4,5 ± 0,2 пг/нг, N=14: при инфаркте миокарда содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет - 9,9 ± 0,1 пг/нг, N=7; при артериальной гипертензии содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет - 10,1 ± 0,2 пг/нг, N=64; при атеросклерозе содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет - 16,2 ± 0,2 пг/нг, N=30; при коронарной сердечной недостаточности содержание рДНК во вкДНК в среднем составляет - 18,2 ± 0,1 пг/нг, N=18 (рис. 2).

15-

гДНК

|М1ИТ|>1П|.|

L'llMilTolI'llllplll

артрнг

пкфирк!

М1ЮМ1|ХЭ»

UTPpncKimp I

Рисунок 2. Содержание генов рибосомных повторов (рДНК) во вкДНК по сравнению с содержанием рДНК в геномной ДНК (гДНК) здоровых людей и при различных заболеваниях. Измерение количества рДНК во вкДНК проводилось методом нерадиоактивной количественной дот-гибридизации, относительные единицы содержание рДНК в гДНК (1,8 ± 0.2 пг / нг). N - количество исследованных образцов крови. По критерию Манна-Уитни различия между содержанием рДНК во всех образцах вкДНК и гДНК статистически достоверны (р <0,05).

Обнаружено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной системы опосредуется через белки семейства «Toll-like» рецепторов, обозначаемые как TLR9 [Ermakov et al., 2011]. Белки семейства TLR играют определяющую роль в координации врожденного и приобретенного ответа иммунной системы [Не et al., 2009]. Активация TLR при взаимодействии с молекулами патогенов различной природы является ключевым моментом в способности организма отражать патогенны и вирусы. TLR могут узнавать не только экзогенные патогены, но и патогены эндогенной природы, появляющиеся при повреждении тканей, дегенерации и

асептическом воспалении [Takagi et al., 2011]. К эндогенным лигандам TLR9 также относят фрагменты ДНК погибших в процессе апоптоза и некроза клеток [Goulopoulou et al., 2012; li et al., 2012]. Стимуляция TLR9 приводит к передаче сигнала через эти рецепторы, активации адаптерных молекул, регуляции экспрессии каскада костимуляторных молекул и активации транскрипции генов, что сопровождается выбросом провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-1 p. IL-6. IL-12, IL-18 [Chi et al., 2006] и хемокинов.

Мы предполагаем, что мезенхимальные стволовые клетки, попадая в очаг повреждения, контактируют с фрагментами вкДНК и могут быть вовлечены в регуляцию иммунных ответов посредством активации TLR9 эндогенными лигандами [Malinovskaya et al., 2010: Raicevic et al., 2010]. В связи с этим необходимо определить характер воздействия фрагментов вкДНК на физиологическую активность МСК. Для этого мы смоделировали in vitro ситуацию, когда эндогенные МСК, мигрирующие из ниши в очаги повреждения, или мезенхимальные стволовые клетки, введенные в организм с целью терапии, «встречаются» с ГЦ-богатой вкДНК, которая содержит сайты - лиганды TLR9. Нами была исследована активация TLR9 сигнального пути и связанных с ним NFkB-, JNK/p38-, IRF- сигнальных путей в МСК при взаимодействии с ГЦ-богатыми ДНК.

Определение экспрессии мРНК TLR9 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной п(рДНК) и ДНК E.coli

Используемые мезенхимальные стволовые клетки были получены из жировой ткани операционного материала больных с аденокарциномой молочной железы, доставленного из РОНЦ РАМН в течение часа после резекции опухоли.

Чтобы подтвердить корректность используемого нами способа выделения МСК, для одной из культур проведен анализ экспрессии поверхностных белков (табл. №1).

Таблица 1. Маркеры гемопоэтических стволовых клеток, определенные методом проточной цитофлюориметрии.

Маркеры Гемопоэтических клеток Gp 105-120 CD34 -

Leukocyte common antigen CD45 -

HLA-DR -

Молекулы ГКГ (главного комплекса гистосовместимости) HLA-ABC +

Молекулы адгезии HCAM CD44 +

1CAM-1 CD54 +/- (low)

VCAM CD 106 -

Рецепторы к факторам роста endoglin CD 105 +/- (low)

c-kit CD117 -

Интегрины и другие маркеры ßl integrin CD29 +

a2ßl integrin CD49b +/- (low)

Thy-1 CD90 +

Было показано, что на поверхности МСК присутствуют молекулы ГКГ (главного комплекса гистосовместимости): HLA-ABC +, молекулы адгезии:СБ44 +, CD54 (low), CD 106 + . интегрины CD29 +, CD49b (low), CD90 +, рецепторы к факторам роста: CD 105 (low), но отсутствуют маркеры гемопоэтических клеток CD34 -, CD45 -, HLA-DR - и маркер к CD117 Полученный профиль (табл. 1) характерен для МСК. Кроме того, клетки в присутствии соответствующего индуктора дифференцировались в адипоциты.

Нами исследовано влияние образцов вкДНК (50 нг/мл, 3 часа), полученных из плазмы крови больных и здоровых доноров, на экспрессию мРНК в мезенхимальных стволовых клетках (рис 3).

Контроль гДНК вкДНК ' »K.IIIK вьДНК ' яцТНК ¡урДНК) Ш< "ИЧ ' ДНК июровызс рок инфарет рфяматоианыП {;< -ДИК АТ-ДНК F со([ .топоров rpy.nl миокарда apipiu

Рисунок 3. Уровень экспрессии гена TLR9 при культивировании МСК в присутствии гДНК, вкДНК больных и здоровых доноров, модельных фрагментов (п(рДНК) и п(СатШ)) и ДНК Е. coli (концентрации добавляемых фрагментов 50 нг/мл, время воздействия 3 часа).

(*) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р <0,05).

ВкДНК больных раком молочной железы, инфарктом миокарда и ревматоидным артритом повышает экспрессию TLR9 в 2-3 раза (р < 0.05). ВкДНК здоровых доноров статистически значимо не влияла на экспрессию TLR9 (рис 3). Активация TLR9 обусловлена наличием в составе вкДНК лигандов TLR9 - ГЦ-богатых неметилированных последовательностей, накапливающихся во вкДНК.

В дальнейшем нами было исследовано действие на МСК ГЦ-обогащенной ДНК, которая моделирует ТОрДНК. Плазмида п(рДНК), содержит ГЦ - богатый фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора ДНК в векторе pBR322. Исследованы свойства полученной модельной конструкции - плазмида(рДНК) обогащена неметилированными ГЦ-богатыми последовательностями, которые накапливаются во вкДНК. при нуклеазном гидролизе устойчива к двунитевым разрывам. Она включает сайты связывания с рецепторами TLR9 и может выступать в качестве лиганда этого рецептора.

Вектор pBR322 содержит помимо сайтов связывания с рецепторами TLR9 и последовательности - супрессоры TLR9 ((G)n), которые могут конкурентно ингибировать действие лигандов. Для сравнения использовали плазмиду п(СатШ). Вставка п(СатШ) обогащена АТ-ДНК (область 1 q 12 1-й хромосомы человека), которая не содержит ни лигандов, ни супрессоров TLR9. В п(СатШ) использовался такой же вектор pBR322, чтобы исключить его влияние на МСК в составе п(рДНК). В качестве положительного контроля использовали ДНК E.coli в концентрации 50 нг/мл, которая является известным лигандом, взаимодействующим с рецепторами TLR9 [Malinovskaya et al., 2010].

При действии фрагментов п(рДНК) и ДНК E.coli на МСК наблюдается увеличение количества мРНК TLR9 в 3,0 и в 2,9 раза соответственно по отношению к контролю (р < 0.05), п(СатШ) не оказывает влияния на экспрессию гена TLR9 (рис. 3). Таким образом, влияние вектора pBR322 в составе п(рДНК) на активацию TLR9 минимально.

ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, АКТИВИРУЮЩИХСЯ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ ФРАГМЕНТОВ п(рДНК) Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути - MyD88 в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК)

МСК экспрессируют все известные рецепторы семейства TLR. Поэтому мы предположили, что изменения в функциональной активности МСК в присутствии проб ДНК происходят с участием TLR9 - сигнального пути.

Для того чтобы ответить на вопрос, активируется ли Т1^9-сигнальный путь при действии фрагментов вкДНК. мы исследовали кинетику изменения количества мРНК TLR9 и адаптера TLR-сигнального пути - MyD88 в ответ

на стимуляцию МСК фрагментами п(ТОрДНК) и п(СатШ) и ДНК Е.соН (50 нг/мл, Зчаса) методом ПЦР в реальном времени в варианте ТаяМап. Экспрессия ТЬЯ9 возрастает через 20 мин после добавления в среду п(рДНК), достигает максимума через 1 час (4,2 раза) а к 3 суткам падает до контрольных значений. Экспрессия адаптера МуБ88 в МСК при действии п(рДНК) повторяет динамику роста экспрессии ТЬк9. однако, смещена во времени. Количество мРНК МуБ88 повышается и достигает максимума к 3 часам (4,6 раза), сохраняется на максимальном уровне в течение 24 часов и снижается через 3 дня (рис 4).

7/.ЙС

20 мин 1 час 2 часа 3 часа 24 часа 3 сут

Время культивирования МСК с п(рДНК), 50 нг/мл

Рисунок 4. Динамика накопления мРНК ТЬК9 и Му088 во времени при инкубации МСК в присутствии СС-богатых фрагментов - п(ТОрДНК) в концентрации 50 нг/мл.

Полученные для мРНК ТЬЯ9 данные подтвердились при исследовании динамики накопления белка ТЬГ19 в МСК методом проточной цитофлуориметрии (рис. 5). Для визуализации ТЬЯ9 использованы антитела, меченные фикоэритрином - РЕ-апй-ТЪК9 (рис. 5 Б). Нестимулированные МСК включают три типа клеток. Большинство клеток не содержит белка ТЬИ9 (ТЬЯ9-). Примерно 20% клеток экспрессируют очень низкие количества ТЬ1^9 (ТЬЯ91ош). И только около 6% клеток экспрессируют большие количества белка (ТЬЯ9+). Содержание субпопуляции клеток с высоким уровнем экспрессии ТЬЯ9 возрастает в 4,2 раза после 1,5 часов культивирования МСК в присутствии п(рДНК) и падало через 3,5 часа воздействия (рис. 5 В). Таким образом, при действии п(рДНК) (50 нг/мл, 1 час) мы обнаружили синхронное увеличение количества клеток Ти?9+ и увеличение количества мРНК ТЬК9. Геномная ДНК, в отличие от ГЦ-ДНК, снижала количество ТЬЯ9+ клеток.

Таким образом, ГЦ-обогащенная вкДНК больных людей и модельный фрагмент - п(рДНК) стимулируют увеличение экспрессии Т1Л9 в той же

степени, что и природный лиганд ДНК E.coli. Поскольку экспрессия адаптера MyD88 повышается позже, чем TLR9, 24 часа является оптимальным временем воздействия п(рДНК) на МСК для изучения молекул TLR-сигнального пути и путей, связанных с активацией TLR.

^ООцш

1000 0 1

контроль г ДНК. 50 иг мл п(рДНК), 50 иг/мл

Рисунок 5. Определение уровня белка ТЬЯ9 в МСК с помощью антител к ТЬЯ9. меченных флуоресцентным фикоэритрином. А - Данные флуоресцентной микроскопии (увеличение 100). Б - Данные проточной цитофлуориметрии. Область И - фракция клеток, экспрессирующих ТЬК9. В - Динамика накопления во времени (в области И) МСК, экспрессирующих ТЬЯ9 при добавлении п(рДНК) и гДНК (50 нг/мл).

Активация NFkB -, JNK/p38-, IRF- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК)

После связывания лиганда TLR образуют гомо- и гетеродимеры и передают сигнал внутрь клетки посредством гомологичного связывания TIR-TIR с одним из TIR-содержащих адаптерных белков (MyD88. TRIF/TICAM-1, TIR AP/MAL и TR AM/TIC AM-2/TIRP) или с комбинацией этих белков. Все TLR. за исключением TLR3, который передает сигнал через TRIF, используют один и тот же сигнальный путь и MyD88 в качестве адаптера [Akira et al., 2003]. Передача сигнала через TLR осуществляется посредством ряда процессов, главный из которых - обратимая ковалентная модификация путем фосфорилирования и убиквитинирования. Для всех TLR сигнальный путь начинается с IRAK и белков семейства TRAF. Далее сигнал передается на киназы промежуточного уровня, такие как ТАК-1 и TBK-1/IKKi, что приводит к активации сигнальных путей через МАР-киназы (JNK, р38 и ERK), IRF (а именно, IRF-3, IRF-5, и IRF-7) и NFkB [Suzuki et al., 2008: Akira et al., 2003] (рис. 6), что сопровождается повышением экспрессии генов и синтезом цитокинов и хемокинов.

житмшч If !"

ЛКП№Л101Я NFkB .U.I] №.ii|] IM МАРЬ

H№J>»JBM n-N иго I продуши

щкчнчпа'лпсголы* ISIfOMHOB

Рисунок 6. Схема проведения сигнала по ТЬК-сигнальным путям.

Мы подействовали п(рДНК) на МСК в концентрации 50 нг/мл в течение 24 часов и обнаружили изменение экспрессии генов адаптеров Т1Л~ сигнального пути в ответ на добавление п(рДНК). Количество мРНК МУБ88, ТШАР, Н8РШ, МАР2К возрастает в 5-9 раз, количество мРНК Т1САМ2,

8АЯМ1, ТОЬЫР, НЯА8, Н8РА1А и МАРК81РЗ повышается в 2-3,5 раза. Незначительно, в 1,4 раза увеличивается экспрессия генов РЕЫ1 и Я1РК2 (рис. 7).

10,00 9,00 8.00 7.00 6.00 5,00 •¡.00 3,00 2,00 1.00 0.00

L; 1

■ МСК 50 иг/мл п(рДНК). 24 часа

■ контроль МСК

Ши

<Л

? <5> ^ о^

Рисунок 7. Динамика накопления мРНК адаптеров TLR-сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии ГЦ-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05).

Повышается также экспрессия генов эффекторов TLR-сигнального пути. Мы обнаружили увеличение количества мРНК генов E1F2AK2, PPARA в 3,5 - 5 раз. Экспрессия генов TRAF6, UBE2N повышается в 2 раза. В 1,5-2 раза возрастало количество мРНК FADD. IRAKI, MAP3K7IP1, IRAK2 и IRAKI (рис.8).

о Л.™ .<£"

« МСК 50 нг/мл п(рДНК|, 24 часа ■ контроль МСК

Рисунок 8. Динамика накопления мРНК эффекторов ТЬИ-сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии ГЦ-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50

нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05).

При действии п(рДНК) на МСК мы наблюдали активацию генов кВ - сигнального пути. Количество мРНК МАРЗК1, МАР4К4, №КВ1 А, ЯЕЬ возрастало в 3,5 - 5,5 раз, мРНК 1КВКВ, Яе1А (р65), №ЯКВ в 2 - 3 раза, мРНК №КВ 1 и ЫРКВ2 в 1,4 раза (рис. 9).

« <и 8

X н 7

§ 5

(Я & 4

К з -

<1>

Я я 2 -

и 1 ■

и1шиш

/ / 4 V

■ МСК 50 мг/мл п(рДНК). 24 часа I контроль МСК

Рисунок 9. Динамика накопления мРНК ИИ-кВ - сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии СС-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05).

Таким образом, ГЦ-богатые последовательности ДНК, накапливающиеся в составе вкДНК, повышают экспрессию большинства генов молекул, участвующих в проведении сигнала через ТЫ?-сигнальный путь, что сопровождается транслокацией в ядро фактора транскрипции кВ, увеличивая экспрессию генов №-кВ- сигнального пути.

Последовательное фосфорилирование киназ активировало в МСК ЖК/р38- сигнальный путь. Количество мРНК ИОЭ, МАР2КЗ, МАРЗК1, МАРК8 возрастало в 2,6-5 раз, мРНК ЕЬК1 и МАР2К4 - в 1,4-1.9 раза (рис. 10).

■ МСК БОнг/мл п(рДНК),

* МСН контроль

МАРЗК1 МАР2К4 МАРК8 ELK 1 FOS

Рисунок 10. Динамика накопления мРНК JNK/p38 - сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии GC-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05).

Активация генов IRAK и TRAF может вызывать стимуляцию синтеза интерферона (IFN) в результате активации IRF-7. Действительно, в МСК при действии на них п(рДНК) возрастало количество мРНК IFNal (в 5 раз), IFNßl (в 2 раза), IRF3 (в 2.6 раза), IRF1 (в 1.4 раза), IFNy (в 5раз) (рис. 11).

« 5

■ МСК БОнг/мл п(рднк). 24часа

■ МСК коитроль

Рисунок 11. Динамика накопления мРНК ШИ - сигнального пути во времени при инкубации МСК в присутствии йС-богатых фрагментов - п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл. На рисунке указаны гены, показавшие наибольшее изменение экспрессии по сравнению с необработанным контролем (р <0,05).

Транслокация ^-кВ в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК)

При активации ЫР-кВ-сигнального пути ингибитор 1кВ фосфорилируется под действием 1кВ-киназы и деградирует, фактор ЫИ-кВ освобождается и перемещается в ядро, где взаимодействует со специфическими последовательностями в регуляторных участках генов и

активирует транскрипцию определенных групп генов, в частности, цитокинов (TNFa, IL-1 и др.).

Транслокация NF-kB в ядро является центральным событием активации NF-kB - сигнального каскада, поэтому мы проанализировали количество NF-kB компонента Reí А (р65) в МСК (рис. 12), используя метод флуоресцентной проточной цитометрии (FACS).

2 s -

■

а»

l!Í г-, I

i'¡n И I

< о L_L_L--■

«j Koirrpoib г ДНК п(рДНК)

Рисунок 12. Накопление в МСК компонента р65 NFkB при инкубации клеток в присутствии п(рДНК) и гДНК в концентрации 50 нг/мл в течение 3 часов. Данные проточной цитофлуориметрии.

* Отличия от контроля статистически значимы (р <0,05).

После инкубации с п(рДНК), средняя интенсивность флуоресценции МСК увеличилась в 4 раза, что указывает на увеличение содержания р65 в клетке, которое коррелирует с усилением экспрессии гена Reí А. Для сравнения использовали геномную ДНК (гДНК). При действии гДНК количество р65 в МСК увеличивалось в меньшей степени, чем при действии ГЦ-богатой ДНК (п(рДНК)) - в 1,6 раза по сравнению с исходным уровнем (рис. 12).

Основным доказательством NF-kB активации в присутствии ГЦ-ДНК была его транслокация из цитоплазмы в ядро МСК, выявленная с помощью флуоресцентной микроскопии на фиксированных МСК, обработанных первичными антителами к NF-kB (р65) и вторичными, меченными F1TC. В контрольных образцах МСК около 65 ± 10% общего количества клеток содержат очень низкое количество NF-kB в цитоплазме, в 20 ± 5% клеток NF-kB присутствует в цитоплазме, но не в ядре, в оставшихся 15 ± 5% клеток NF-kB локализуется в ядре.

Воздействие п(рДНК), 50 нг/мл, на МСК в течение 30 минут приводит к увеличению доли клеток с NF-kB, светящимся в цитоплазме, в то время как число клеток с NF-kB в ядре остается таким же, как в контроле (Р> 0,05). От 1 часа и до трех часов после начала воздействия на МСК 50 нг/мл п(рДНК), произошла транслокация NF-kB в ядро из цитоплазмы - NF-kB светился в ядре почти во всех клетках популяции МСК, однако через 24 часа процент активированных клеток снизился в 2 раза, одновременно с уменьшением

средней интенсивности флуоресценции. гДНК существенно не изменяла процент клеток с локализацией №-кВ в ядре по сравнению с контролем, (рис. 13).

Контроль 30 мин

Рисунок 13. Данные флуоресцентной микроскопии (увеличение 40): л(рДНК) вызывает транслокацию в ядро NF-kB через 1-3 часа после начала воздействия.

Таким образом, ГЦ-богатые последовательности ДНК, накапливающиеся в составе вкДНК, повышают экспрессию большинства генов молекул, участвующих в проведении сигнала через TLR-сигнальный путь, что сопровождается транслокацией в ядро фактора транскрипции NF-kB, повышая экспрессию генов NF-kB - сигнального пути. П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов ILIO и TNFa

Конечным событием активации TLR -зависимых сигнальных путей в клетке является продукция цитокинов [Yao et al., 2009]. Мы провели анализ секреции цитокинов TNFa и IL-10, которые, как было показано в ряде работ [Yao et al., 2009], модулируют терапевтическую активность стволовых клеток.

При действии п(рДНК) в концентрации 50 нг/мл на МСК через 3 часа возрастало количество мРНК TNFa в 4 раза, через 24 часа - в 1,9 раз по сравнению с контролем (рис. 14 В).

TLR

MyDM TRIF

+ i

JHlüpM МАРК

TNF 41 +

провоспалтелкмыи ответ

IL-10 i

1ип1воспаяит*пьиь1и ответ

О >-

JLil

Л часа

24 чага

Вргмя культипирокаинн MCTv с ДНК. 50иг ш

3 часа 24 часа Время культивирования

МСК с ДНК. ?0иг МСЛ

Рисунок 14. А - Схема проведения сигнала по TLR-сигнальным путям. В - Динамика накопления мРНК TNFa и IL-10 в МСК во времени при культивировании с п(рДНК) (50 нг/мл).

Через 3 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) экспрессия иммуносупрессора ILIO возрастала в 1,7 раз, через 24 часа - в 9 раз (рис. 14 В)

Кроме того, методом иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что секреция цитокинов TNFa и IL-10 в среде культивирования МСК при действии п(рДНК) также повышается по сравнению с контролем. Концентрация TNFa повышается через 3 часа в 1,5 раза и через 24 часа в 2 раза, концентрация IL-10 через 3 часа повышается в 3 рада, и в 1,6 раза повышается через 24 часа культивирования МСК в присутствии п(рДНК) (рис. 1S). Геномная ДНК не вызывала ни повышения экспрессии генов TNFa и IL-10, ни усиления продукции белка TNFa и IL-10.

Время воздействия

контроль i(pflHK), 50 нг/мл гДНК

Время воздействия

Рисунок 15. Изменение концентрации 1Ь-10 (А) и ТЫРа (В) во времени при культивировании МСК в присутствии п(рДНК) (50 нг/мл) Отличия от контроля статистически значимы (р <0.05).

Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных фрагментов внеклеточной ДНК

Имплантирование МСК могут подвергаться апоптозу , что влияет на эффективность терапии, поэтому важно исследовать влияние фрагментов вкДНК на апоптоз МСК. Мы проследили изменения активности одного из ферментов апоптоза - каспазы 3 при действии модельных фрагментов вкДНК: п(ТОрДНК) и п(СатШ) и ДНК E.coli (50 нг/мкл, 3 часа) с помощью флуоресцирующего субстрата QAc-DEVD-AFC. Суммируя результат двух независимых экспериментов на двух различных культурах МСК, выявили, что действие всех проб ГЦ-ДНК снижало активность каспазы 3 в клеточных лизатах: п(ТОрДНК) - на (12 ± 3)%, п(СатШ) - на (40 ± 17)%, а ДНК E.coli -на (31 ±7)% (рис. 16).

Активность каспазы 3. отн ед

Контроль п(ТОрДНК) ДНК E.coli п(СатШ)

Рисунок 16. Активность каспазы 3 в клеточных белковых лизатах после культивирования МСК в присутствии п(ТОрДНК), п(СатШ), ДНК Е.соН и в контроле, отн ед .

Проведенное впервые в рамках данной работы исследование позволило выявить новые данные о влиянии вкДНК на свойства МСК.

Мы показали, что фрагменты вкДНК - ТОрДНК оказывают активирующее воздействие на МСК. Ранее предполагалось, что ДНК не влияет на функционирование клеток организма. Однако эксперименты проводились с использованием геномной ДНК, которая по своим свойствам существенно отличается от внеклеточной ДНК. ГЦ-богатые последовательности в составе вкДНК играют существенную роль в функционировании мезенхимальных стволовых клеток.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что культивирование МСК с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию ТЬЯ9, что приводит к активации и транслокации в ядро ЫИ-кВ почти во всех клетках, включая клетки, не экспрессирующие ТЬЯ9. П(рДНК) может использоваться для предобработки культуры пересаживаемых МСК, наряду с предлагаемой обработкой СК синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции ТЬЯ9 [ТошсЬиск й а!., 2008]. Преимущества использования плазмиды п(рДНК) - в низкой действующей концентрации, потому как обычно используемая концентрация синтетических ГЦ-ОДН - более 1000 нг/мл [ТошсЬиск й а1., 2008].

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ГЦ-вкДНК воздействует на мезенхимальные столовые клетки через рецепторы семейства Т1Л.

2. Выявлено, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ГЦ-вкДНК, активирует в МСК Т1Л9-сигнальный путь и связанные с ним ОТ-кВ-, ,)МК/р38-, Щр-сигнальные пути.

3. Обнаружено, что в результате активации МСК фрагментами ГЦ-вкДНК транскрипционный фактор №-кВ освобождается и перемещается в ядро, что ведет к усилению экспрессии антиапоптотических генов и подавлению экспрессии проапоптотических генов, что повышает выживаемость МСК.

4. Установлено, что в результате активации МСК фрагментами ГЦ-вкДНК усиливается синтез ТОТа, который важен для выживаемости МСК в условиях стресса, и 1Ь-10, который имеет большое значение в снижении интенсивности аутоиммунных реакций организма, что может играть существенную роль для стимуляции и повышения жизнеспособности при неблагоприятных воздействиях на организм как эндогенных МСК так и МСК, введенных в организм с целью терапии.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1. Ковшик в, Ьоэеуа Р, Ск\'аНаЫкауа О, ЕгеИоуа Е, Згшгпоуа Т, МаНпоуэкауа Е, 1*о£1пко О, Кигтш V, 1гЬеувка1а V, Вагапоуа А, Ст1ег Е,

Veiko N. Extracellular GC-rich DNA activates TLR9- and NF-kB-dependent signaling pathways in human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs).// Expert Opinion on Biological Therapy 2012, vol.12, Suppl. 1, pp. 99-111. (1,38 п.л.) (доля авторского участия - 50%) (журнал цитируется в системе ISI, SCOPUS).

2. Костюк С.В., Малиновская Е.М., Ермаков А.В., Смирнова Т.Д., Каменева JI.B., Чвартацкая О.В., Лосева П.А., Ершова Е.С., Любченко Л.Н., Вейко Н.Н. Фрагменты внеклеточной ДНК усиливают транскрипционную активность генома мезенхимальных стволовых клеток человека, активируют TLR-зависимый сигнальный путь и ингибируют апоптоз.// Биомедицинская химия Т.58, вып.б (ноябрь -декабрь) 2012, с.673-683. (1,27 п.л.) (доля авторского участия — 50%).

3. Костюк С.В., Чвартацкая О.В., Севастьянова Г.А., Вейко Н.Н. Активация TLR9-, Nf-kB-, JNK/p38- и IRF- сигнальных путей в мезенхимальных стволовых клетках человека.//Вестник Московского государственного областного университета, серия «Естественные науки». 2013, №2, с. 38-44. (0,8 п.л.) (доля авторского участия - 80%).

4. О. Chvartatskaya, S.V. Kostjuk, P. Loseva, E. Ershova, T.D. Smirnova, L. Kameneva, E. Malinovskaya, L. Lubchenko, O. Roginko, V. Kuzmin, N.N. Veiko. GC-rich cell-free DNA (GC-cfDNA) activates TLR-, NFkB-, JNK/p38- and IRF-dependent signaling pathways in adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC).//CNAPS VII: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum, 24-25 October 2011, Madrid, Spain, vol.2, supplement 1, P. 10. (0,05 п.л.) (доля авторского участия не разделяется).

5. Чвартацкая О.В., Костюк С.В., Севастьянова Г.А. GC-богатые фрагменты внеклеточной ДНК активируют TLR-, NFkB-, JNK/p38- и IRF- сигнальные пути в мезенхимальных стволовых клетках человека. // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» 14-17 ноября 2011г., Москва, сборник тезисов, Т.2 конкурс молодых ученых, С. 74. (0,06 п.л.) (доля авторского участия - 80%).

6. Чвартацкая О.В., Костюк С.В., Севастьянова Г.А. Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на мезенхимальные стволовые клетки человека.// XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-11 февраля 2009, сборник тезисов, С. 47. (0,06 п.л.) (доля авторского участия не разделяется).

7. Чвартацкая О.В., Костюк С.В., Севастьянова Г.А. Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на мезенхимальные стволовые клетки человека.// XXIII международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, Москва, 7-10 февраля 2011, сборник тезисов, С. 74. (0,06 п.л.) (доля авторского участия не разделяется).

Подписано к печати 28.04.2014 Объем 1,25 п.л. Заказ № 32 Тираж 100 экз.

ГУ Т.МПГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чвартацкая, Оксана Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ МОСКОВСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

04201458786

На правах рукописи

Чвартацкая Оксана Викторовна

Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток

человека

Специальность 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Севастьянова Г.А.

Москва-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения и аббревиатуры............................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................7

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК

человека................................................................................................................................................12

1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях......................................13

1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК..............................................................14

1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК..................................................16

1.2 Происхождение фрагментов внеклеточной ДНК в организме..........17

1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК..............................................................................20

1.4 Взаимодействие внеклеточной ДНК с клетками..................................................................................................................................................22

1.4.1 Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR)....................................................23

1.4.1.1 Лиганды для белков TLR9..............................................................................................................25

1.5 ТЬК9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-сигнальные пути....................................................................................................................27

1.6 Роль цитокинов в организме..................................................................................................36

1.6.1 Провоспалительные цитокины..........................................................................................37

1.6.2 Противовоспалительные цитокины................................................................................39

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................42

2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток........................................................................................................................................................42

2.1.2 Исследование экспрессии клетками поверхностных

белков........................................................................................................................................................45

2.2 Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови..............................................................................................................46

2.3 Конструирование плазмиды п(рДНК)....................................................................48

2.4 Выделение РНК из мезенхимальных стволовых клеток......................................................................................................................................................49

2.4.1 Обработка выделенной РНК ДНКазой......................................................................50

2.4.2 Определение концентрации РНК......................................................................................50

2.5 Выделение ДНК из мезенхимальных стволовых клеток........................................................................................................................................................50

2.5.1 Определение концентрации ДНК....................................................................................51

2.6 Постановка полимеразцой цепной реакции..........................................................51

2.6.1 Проведение реакции обратной транскрипции....................................................51

2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени..................52

2.7 Иммуногистохимия..................................................................................................................54

2.7.1 Связывание антител с №-кВ............................................................................................54

2.7.2 Связывание антител с ТЫ19................................................................................................54

2.8 Иммуноферментный анализ секреции цитокинов..........................................55

2.8.1 Иммуноферментный анализ секреции цитокина 1Ь-10..............................55

2.8.2 Иммуноферментный анализ секреции цитокина ТЫБа..............................58

2.9 Определение активности каспазы 3................................................................................61

2.10 Статистическая обработка результатов......................................................................61

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ........................................................................62

3.1 Рецепторы, отвечающие на действие Св-богатой внеклеточной ДНК............................................................................................................................................................................62

3.1.1 Определение экспрессии мРНК ТЫ19 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной

п(рДНК) и ДНК Е.соН....................................................................................................66

3.2 Исследование сигнальных путей, активирующихся в мезенхимальных стволовых клетках в ответ на действие фрагментов п(рДНК)......................................................................................................................73

3.2.1 Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК ТЫ19 и адаптера ТЬЯ-сигнального пути - МуЭ88 в ответ на стимуляцию

мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК)............................................................................... 73

3.2.2 Активация ЫР-кВ ЖК/р38-, ¡ИР- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК)........................................................................ 76

3.2.3 Транслокация МР-кВ в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК)........................................... 84

3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов ИЛОиЮТа.................................................................... 87

3.3 Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных

фрагментов внеклеточной ДНК............................................ 89

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................... 90

ВЫВОДЫ..................................................................... 94

4 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................ 95

Принятые сокращения и аббревиатуры

CpG-ОДН - CpG-содержащие олигонуклеотидные аналоги; GAPDH - глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа; IL - интерлейкин;

IRAK - (от англ. interleukin-1 receptor-associated kinase ) - интерлейкин-1 рецептор - связанная киназа;

IRF3/7 - фактор, регулирующий транскрипционную активность гена интерферона;

JNK (англ. c-Jun N-terminal kinase; c-Jun N-концевые киназы) - стресс-активируемые протеинкиназы

МАРК - митоген активируемая протеинкиназа;

MyD88 - (от англ. Myeloid differentiation primary response gene) - ген

миелоидной дифференцировки первичного ответа;

NF-kB (ядерный фактор «каппа-би»; англ. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells, NF-kB) — универсальный фактор транскрипции

PAMP - (от англ. pathogen-associated molecular pattern) -патоген-связывающий молекулярный паттерн;

real-time PCR - полимеразная цепная реакция в реальном времени;

SDS - додецилсульфат натрия;

SSC - стандартный солевой раствор;

ТВР - ТАТА-связывающий белок;

TCR - Т-клеточный рецептор;

TIR- (от англ. toll-interleukin-1 receptor) - толл-интерлейкин-1 рецептор; TLR - (от англ. toll-like receptor) - семейство толл-подобных рецепторов; TNF - фактор некроза опухоли; АПК - антигенпредставляющие клетки;

вкДНК - внеклеточная ДНК; г ДНК - геномная ДНК;

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости;

инг-ОДН - ингибирующие олигодезоксинуклеотиды;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИФН - интерферон;

КД - контрольные доноры;

МСК - мезенхимальные стволовые клетки;

НК-клетки - клетки нормальных киллеров;

ОДН - олигодезоксинуклеотиды; ОНП - однонуклеотидный полиморфизм;

п(рДНК) - фрагменты рибосомной ДНК, встроенные в плазмиду

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РАИЛ - рецептор антагонистов интерлейкинов;

СатШ - клонированный фрагмент субфракции сателлита 3;

ТАТА - короткий А-Т-обогащенный участок (типичная последовательность

— ...ТАТААА...) гена эукариот;

ТКР - Т-клеточный антигенраспознающий рецептор;

ТОрДНК - транскрибируемая область рибосомного повтора человека; ТФР(3 - трансформирующий фактор роста бета;

ФНОа - фактор некроза опухоли а;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; я ДНК - ядерная ДНК;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Внеклеточная ДНК (вкДНК) в норме присутствует в плазме крови человека и в межклеточном веществе. До сих пор остаются невыясненными вопросы ее происхождения, однако в литературе обсуждаются две главных модели. Первая из них предполагает, что появление вкДНК связано с гибелью клеток в организме, то есть циркулирующая вкДНК в кровотоке -это фрагменты ДНК клеток, подвергшихся апоптозу. В рамках второй модели вкДНК появляется в межклеточном веществе в результате секреции клетками фрагментов ДНК. Показано, что в крови пациентов с различными патологиями концентрации вкДНК существенно возрастают. Поэтому на данный момент наибольший интерес научного сообщества вызывает ее применение в диагностике различных заболеваний.

До недавнего времени предполагалось, что вкДНК не оказывает влияния на клетки организма. Известно, что геномная ДНК млекопитающих не обладает иммуностимулирующим действием, так как содержит незначительное количество неметилированных CpG-мотивов в своем составе, а также включает иммуносупрессорные последовательности. Однако вкДНК существенно отличается от ядерной ДНК (яДНК) по ряду свойств. Установлено, что вкДНК в отличие от яДНК обогащена повторяющейся последовательностью - транскрибируемой областью рибосомного повтора (ТОрДНК) [Калашникова и соавт., 2006; Костюк и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2007], которая аналогично бактериальной ДНК является потенциальным иммуномодулятором, также было показано, что вкДНК и фрагмент ТОрДНК обладает стимулирующим действием на лимфоциты человека [Вейко и соавт., 2006]. Кроме того, отмечено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной системы опосредуется через рецепторы семейства Toll-like, или TLR - (от англ. toll-like receptor) [Вейко и соавт., 2006].

За последнее время достигнуты большие успехи в изучении биологии стволовых клеток, но остается еще много вопросов, связанных с их взаимодействием с клетками микроокружения, а также ролью различных сигнальных путей в регуляции стволовых клеток. Стволовые клетки обладают уникальными свойствами: они представляют собой неспециализированные клетки, не имеют тканеспецифических маркеров и поддерживают статус недифференцированных клеток. При действии определенных биологических сигналов стволовые клетки способны дифференцироваться в специализированные клетки [Morrison et al., 2006]. Применение эмбриональных стволовых клеток открывает широкие возможности для клинической практики, но вызывает большое количество этических проблем. Поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению свойств стволовых клеток из других источников. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками клеток мезенхимальной линии, это хрящи, кости, сухожилия, жир, мышцы. МСК достаточно легко выделяются из костной и жировой тканей, а также из других источников, и быстро растут в лабораторных условиях. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки способны оказывать иммуносупрессорное действие посредством индукции регуляторных Т-лимфоцитов и дендритных клеток [Stagg, 2007]. Эти свойства способствуют применению мезенхимальных стволовых клеток в практической медицине. В то же время не полностью изучена регуляция этих клеток и сигнальные пути, активирующиеся при их взаимодействии с клетками организма, поскольку эти сигнальные пути образуют сложную сеть.

Известно, что стволовые клетки локализованы и функционируют в

определенном микроокружении, называемом "нишей" [Morrison et al., 2008].

Нишу образуют клетки микроокружения, продуцирующие факторы роста и

другие регуляторные молекулы, и внеклеточный матрикс, представленный

базальными мембранами на границе эпителиальных и мезенхимных тканей. «Ниша» обеспечивает жизнеспособность, самоподдержание и самовоспроизведение стволовых клеток, а также длительное их пребывание в состоянии покоя и дифференциацию дочерних транзиторных клеток, тем самым она защищает стволовые клетки от внешних воздействий [Morrison et al., 2008]. При определенных условиях стволовые клетки могут покидать ниши (процесс мобилизации стволовых клеток), сохраняя жизнеспособность и возвращаться в свои ниши («хоуминг» CK) [Lapidot et al., 2005]. Повреждение ткани стимулирует переход стволовых клеток к пролиферации, поскольку стволовые клетки являются пролиферативным резервом при регенерации ткани [Lehrer et al., 1998]. Свойство стволовых клеток способствовать репарации поврежденных тканей активно используется в практической медицине. В очаг повреждения либо вводятся аутологичные стволовые клетки, либо стимулируются к пролиферации эндогенные стволовые клетки, либо активируется мобилизация стволовых клеток из других источников с помощью ряда цитокинов с их последующей миграцией в зоны повреждения [Daniels, 2007]. Однако процессы, происходящие со стволовыми клетками в очаге повреждения, также остаются малоизученными.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать адекватные условия культивирования МСК, полученных из жировой ткани;

2. Выявить рецепторы в МСК, которые активируются в ответ на действие вкДНК;

3. Изучить сигнальные пути, участвующие в ответе МСК на действие модельного ГЦ-богатого фрагмента вкДНК;

4. Проследить, какие механизмы выживаемости активируются в МСК при контакте с ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК;

Научная новизна. Впервые было показано активирующее действие вкДНК и ГЦ-богатого фрагмента (ТОрДНК) на мезенхимальные стволовые клетки человека, сопровождающееся усилением синтеза РНК и высокой продукцией цитокинов IL10 и TNFa. Стимулирующее действие вкДНК и ТОрДНК на мезенхимальные стволовые клетки человека реализуется посредством активации рецепторов семейства «toll-like» (в частности TLR9), которые узнают ГЦ-богатые последовательности ДНК. Установлено, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ТОрДНК, активирует в мезенхимальных стволовых клетках ТЫ19-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-сигнальные пути.

Научно-практическая значимость работы. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения тканей, остается серьезной проблемой в транспланталогии. Для того, чтобы повысить жизнеспособность пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, проводят предварительную обработку клеток, в частности, TNFa [Yao et al., 2009] или синтетическими олигонуклеотидами (ГЦ-ОДН) [Tomchuck et al., 2008]. Эффективность этой предварительной обработки в значительной степени зависит от активации NF-kB и его транслокации в ядро [Yao et al., 2009]. Полученные данные указывают на то, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию TLR9, что

приводит к активации и транслокации №-кВ в ядро. П(рДНК) может быть использована для предварительной обработки культуры пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, наряду с предлагаемой обработкой стволовых клеток синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции ТЫ19.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК человека

История изучения биологии циркулирующих нуклеиновых кислот ведет свое начало с 1948 года, когда исследователи Мендель и Метаис впервые обнаружили их в плазме крови человека. С тех пор нуклеиновые кислоты были обнаружены как в различных циркулирующих жидкостях в организме животных, так и в межклеточном веществе в тканях, а также в средах культивирования различных клеток растений [Gahan et al., 2008]. Этот факт был подтвержден также на бактериях и клетках растений [Peters and Pretorius, 2011]. Фрагменты ДНК, которые были выделены из жидкостей организма, принято называть внеклеточной ДНК (вкДНК), экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, ДНК плазмы, cell-free DNA, circulating DNA [Gahan et al., 2008; Peters and Pretorius, 2011]. Особое внимание уделяется вкДНК после того, как современные методы позволили провести анализ первичной структуры очень маленьких фрагментов ДНК. Отдельное внимание уделяется совершенствованию методов анализа фрагментов измененной ДНК опухоли, которые циркулируют в крови пациента, или ДНК плода, частицы которой можно обнаружить в крови матери. ВкДНК используется как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях, диабете, травмах, инсультах, инфарктах миокарда и т.д. Вопросу использования феномена вкДНК в диагностике различных заболеваний посвящено много работ и обзоров (обзор [Tong et al., 2006]). Для того, чтобы понять влияние вкДНК на жизненноважные процессы организма, необходимо изучить свойства вкДНК и характер взаимодействия фрагментов вкДНК с клеткам�

Информация о работе

Чвартацкая, Оксана Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.04

Диссертация

Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы