Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения

Малиновская, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения"

На правах рукописи УДК 575.224

Малиновская Елена Михайловна

ИЗМЕНЕНИЯ КОМПЛЕКСА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА В ПРОЦЕССЕ ЕСТЕСТВЕННОГО И РЕПЛИКАТИВНОГО

СТАРЕНИЯ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003459299

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГУ Медико-генетического научного центра РАМН

Научные руководители: доктор биологических наук,

Вейко Наталья Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ревазова Юлия Анатольевна

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Защита состоится 2 февраля 2009 г. в \2 часов на заседании диссертационного совета Д 001.016.01 в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медико-генетического научного центра РАМН

Автореферат разослан / 6 Л 2003г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Захарова Екатерина Юрьевна

доктор медицинских наук,

Зинченко Р. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Рибосомные гены (РГ), кодирующие рибосомные РНК (28S, 18S, 5.8S рРНК), имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки. Для обеспечения синтеза большого количества молекул рРНК, в геноме человека содержится от 250 до 700 копий РГ. В соматической клетке человека транскрибируется 30-50% копий РГ, которые называют активными копиями (АкРГ). К варьирующим признакам генома также относят количество метилированных копий РГ.

В литературе уже давно дискутируется вопрос о возможной связи характеристик комплекса РГ генома млекопитающих и старения. В нескольких работах сообщалось об уменьшение числа копий РГ при старении тканей человека и животных (Strehler B.L. et al., 1979; Johnson L.K. et al., 1975; Gaubatz J. et al., 1976). В более поздних работах было показано, что при старении клеток организма мышей (Ono T. et al., 1985; Peterson C.R. et al., 1984), крыс (Halle J.P. et al., 1997) и человека (Peterson C.R. et al., 1984) не происходит существенного изменения числа копий РГ в геноме. Столь же противоречивые данные получены при исследовании изменения метилирования РГ при старении. Сообщалось об увеличении метилирования при старении культивируемых фибробластов кожи человека (Machwe A. et al., 2000), клеток крысы (Oakes С.С. et al., 2003) и мыши (Swisshelm К, et al., 1990). По данным других авторов, при старении млекопитающих уровень метилирования РГ не изменяется или снижается (de Carvalho C.V. et al., 2000). Практически нет работ, в которых одновременно оценивали бы изменения нескольких характеристик РГ при старении, а также изучали бы взаимосвязь между свойствами РГ и уровнем окислительного стресса, который рассматриваются в настоящее время в качестве основной причины старения.

Цель и задачи исследования. Изучение изменений комплекса РГ человека в процессе старения и установление возможной связи между этим процессом и продолжительностью жизни, а также анализ изменения свойств комплекса РГ при старении культивируемых клеток человека (репликативное старение). Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. сравнить свойства комплекса РГ (число копий, количество АкРГ и уровень метилирования) в выборке людей 80 лет и старше и в выборке лид молодого и среднего возраста;

2. исследовать изменение свойств комплекса РГ при репликативном старении 5 штаммов фибробластов кожи доноров различного возраста, геномы которых значительно различаются по свойствам комплекса РГ;

3. исследовать взаимосвязь свойств комплекса РГ и маркеров старения (содержание теломерного повтора, уровень апоптоза, максимальное число пассажей) для 5 штаммов фибробластов кожи человека;

4. изучить влияние свойств комплекса РГ культивируемых фибробластов на устойчивость клеток к апоптозу, индуцируемому окислительным стрессом.

Научная новизна. Впервые показано, что количество АкРГ у людей, достигших 80-летнего возраста, варьирует в пределах достаточно узкой «адаптивной» нормы. Впервые найдено объяснение противоречивым результатам относительно снижения числа копий и изменения уровня метилирования РГ при старении: обнаружено, что при старении происходит потеря высокометилированных кластеров неактивных РГ, если таковые присутствовали в геноме. Впервые показано, что свойства комплекса РГ не влияют на нормальное репликативное старение культивируемых фибробластов, но влияют на устойчивость клеток к апоптозу, который индуцируется факторами внешней среды (в данном случае хроматом калия). Впервые обнаружено, что клетки с большим количеством АкРГ характеризуются значительно более высоким уровнем эндонуклеазной активности, чем в контроле.

Научно-практическая значимость работы. Данные о количестве АкРГ в геномах людей старческого возраста могут быть полезным при составлении прогнозов длительности жизни и риска развития патологии, индуцируемой окислительным стрессом, у различных возрастных групп населения. Данные о влиянии количества АкРГ в геноме клетки на изменения уровня апоптоза при действии повреждающих факторов внешней среды могут оказаться полезными при разработке схем клеточкой терапии. Описана схема анализа ряда маркеров, которые позволяют прогнозировать различия в длительности пролиферативного периода и в уровне спонтанного апоптоза в культурах клеток уже на ранних пассажах, что также может иметь значение для клеточных технологий.

Положения, выносимые на защиту.

1. В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ. Комплекс РГ старых людей практически не содержит высокометилированных кластеров «молчащих» рибосомных копий.

2. При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека геном теряет высокометилированные кластеры копий РГ. При репликативном старении происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении данных real-time ПЦР.

3. Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения (содержание теломерного повтора и уровень спонтанного апоптоза) не зависят от свойств комплекса РГ и от возраста доноров кожи.

4. При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме.

5. Уровень эндонуклеазной активности в лизатах (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях индуцированного окислительного стресса положительно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клеток.

Личный вклад автора. Основные результаты исследования получены и оформлены лично автором в лаборатории молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 148 источников, из них 15 отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа изложена на 116 страницах машинописи. Текст содержит 38 рисунков и 6 таблиц.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на семинаре ГУ Медико-генетического центра РАМН 15 октября 2008г. Результаты были представлены на 70-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2005); на международной конференции «Новые направления в радиобиологии» (Москва, 2007); на 6 европейском конгрессе «Healthy and active ageing for all Europeans» (Санкт-Петербург, 2007); на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализируемая выборка. Образцы периферической крови у людей старческого возраста (100 доноров в возрасте от 80 до 100 лет, средний возраст 83 ± 3 , мужчины и женщины) собраны сотрудниками госпиталя №1 ветеранов войны (г. Москва, главврач Местергази Г.М.) и предоставлены нам сотрудниками лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН (рук.проф. Ляпунова H.A.). Сбор образцов периферической крови у контрольной группы проводился сотрудниками Медико-генетического научного центра РАМН (г. Москва). Обследовано 336 доноров в возрасте от 19 до 70 лет (средний возраст 46 ± 15 лет). У пяти из этих доноров были получены биопаты кожи для исследования репликативного старения.

ДНК выделяли из 0,5 мл периферической крови, суспензии клеток или среды культивирования фибробластов методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию ДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) с использованием красителя, малозависимого от длины ДНК (RiboGreen®, Хиозб =487нм, >.фяу=525нм) и зависимого (Hoechst 33528, Хвю5 =350 нм, /,фЛ>=450 нм).

Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), ^ВЮб=487 нм, ХфЯу=524 нм.

Содержание повторяющихся последовательностей генома определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации с фотобиотинированными зондами, который подробно описан ранее (Вейко H.H. и соавт., 2003). Для определения количества рДНК использовали зонд pHRGBB-28S (порядковый номер нуклеотидов 9346-10783, HSU 13369, GeneBank), описанный ранее (Вейко H.H. и соавт., 1996).

Приготовление препаратов метафазных хромосом, окраску ядрышка лимфоцитов серебром, определение количества АкРГ и анализ активных РГ в интерфазных ядрах лимфоцитов проводили сотрудники лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН Косяковой Н.В., Мандрон И.А., Еголиной H.A., Мхитаровой Е.В., Цветковой Т.Г. (рук. проф. Н.А.Ляпунова), применяя вариант метода Ag - окраски, разработанный в лаборатории (Ляпунова H.A. и соавтр., 2001). Для анализа мы использовали микроскоп Axioplan и цифровую камеру RETIGA 2000R («IMAGING», Канада). Изображения анализировали с использованием компьютерной программы анализа изображений («ИнтерЭВМ», Москва). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь не менее чем в 150 интерфазных ядрах.

Культивируемые линии фибробластов были получены из образцов кожи доноров сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН Т.Д. Смирновой и Л.А. Каменевой. Клетки культивировали в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в условиях насыщающей влажности в атмосфере 3-5% С02. Клетки (1/3 от общего количества) пересевали примерно 1 раз в три дня, далее культивировали до субконфлуентного состояния и вновь пересевали.

Схема эксперимента по исследованию действия хромата калия. В лунки 24-луночного планшета («Nunc») вносили 30-50 тыс. клеток, культивировали 3 суток до образования монослоя (100-200 тыс. клеток). Добавляли в среду 4 или 6 мкМ К2Сг04 и инкубировали 4 часа («ранний» ответ на стресс) и 24 часа. Заменяли среду и культивировали клетки в течение 72 часов («поздний» ответ). Для каждой концентрации К2СЮ4 и в контрольных вариантах через определенные интервалы времени анализировали клетки с трех-шести лунок планшета.

Ферментативную активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах клеток с использованием субстрата QAc-DEVD-AFC , ^воз6=400 нм, А.флу=490 нм. Реакцию проводили при 33°С в течение 1 часа. Активность каспазы 3 выражали в расчете на единицу ДНК.

Нуклеазную активность определяли методом, разработанным в лаборатории Молекулярной биологии ГУ МГНЦ РАМН, с использованием модельного субстрата - комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5'-конце флуоресцентную группу, а на 3'-конце тушитель флуоресценции. При гидролизе эндонуклеазами целостность молекулы олигонуклеотида нарушается, что приводит к разгоранию флуоресценции R6G (Хвозб=524 нм, /Цлу=558 нм). Для калибровки использовали стандартный раствор ДНК азы 1.

Для количественной оценки содержания гена 18S рРНК в геномной

ДНК применили метод ПЦР по принципу «TaqMan». Использовали модифицированные олигонуклеотиды («Синтол», Москва), которые на 5'-конце содержали карбоксиметилфлуоресцеин (R6G) или флуоресцеин (FAM), на 3'-конце - тушитель флуоресценции BQH1. Реакцию ПЦР проводили в приборе Rotor Gene 300 (Corbett, Австралия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics, Statistica 6.0 и StatPlus. Распределения анализировали по методу Колмогорова-Смирнова. Средние значения величин сравнивали с использованием t-критерия. На всех графиках, если не оговорено особо, приводится стандартная ошибка (SE).

Число копий РГ в геноме Количество АкРГ, усл.ед.

Рис. 1. Частотное распределения общего числа копий РГ (а) и относительного количества АкРГ (б) в геномах людей СВ и ГС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Число копий РГ и относительное количество АкРГ в геномах людей старческого возраста (СВ) и группы сравнения (ГС)

В табл. 1 и на рис. 1 приведены данные об общем числе копий РГ и об относительном количестве АкРГ в геномах людей СВ и ГС. Наблюдается значительное сужение распределения числа копий РГ в группе СВ по сравнению с ГС: уменьшается интервал варьирования и снижается величина дисперсии. По критерию Фишера дисперсии для выборок СВ и ГС различаются.

£5 о

ÍI0

Таблица 1.

Общее число копий и относительное количество АкРГ в геномах ГС и СВ

Анализируемые группы Общее число копий РГ (К) Кол-во АкРГ (А), усл.ед.

Интервал значений Среднее SD п Интервал значений Среднее SD п

Группа ГС 205-699 431 112 336 15,5-22,6 19,2 1,7 219

Группа СВ 272-568 397 57 78 16,3-22,1 19,1 1,2 90

Средние значения АкРГ в лимфоцитах людей СВ и ГС не различаются, при этом, как и в случае общего числа копий, наблюдается уменьшение интервала варьирования и величины дисперсии для СВ в сравнении с ГС.

Оценка количества метилированных копий РГ в геномах людей старческого и среднего возраста На наличие в геноме кластеров «молчащих» рибосомных генов (КМРГ) указывает величина отношения общего числа копий РГ (К) к числу активных копий РГ (А), К/А> 26±1 (Вейко H.H., 2001). КМРГ не транскрибируются и, как правило, высокометилированы. На рис. 2а приведены распределения величины К/А в геномах группы СВ и ГС. В отличие от ГС, в группе СВ редко встречаются индивиды, у которых в геноме есть небольшие КМРГ.

Поскольку КМРГ высокометилированы, их отсутствие в геноме должно коррелировать со сниженным уровнем метилирования РГ. Мы провели сравнительный анализ метилирования РГ в геномах ГС и СВ. Для этого определили показатель М, равный отношению гибридизационных сигналов НраП- и Mspl- гидролизатов геномной ДНК (Вейко H.H., Ляпунова H.A. и соавтр., 2008), полученных при гибридизации с зондом на рДНК. Последовательность РГ содержит много сайтов MsplHpall. Фрагменты, получающиеся при гидролизе неметилированных копий РГ, имеют малую длину, что препятствует их эффективной иммобилизации на нитроцеллюлозной мембране. Чем больше метилированных копий РГ в геноме, тем выше показатель М.

,10 д4 я

5 О

В"

40 20 0

а ГС

¡Iii 80

- ; ■

1 ;

Ь". : 0

СВ

«II

Ш&4 и^шш т 40

! П

ГС

СВ

Рис. 2.

а. Частотное распределение величины К/А для 41 индивида из ГС и для 71 индивида из группы СВ.

б.Распределение индивидов ГС(п=Зб) и старческого возраста (п =38) по группам метилирования.

13 18 23 28 33 38 43

Величина (К/А)

IM 2М ЗМ Группа метилирования

Мы выделили три группы, различающиеся по показателю М. Для доноров группы 1М значения М варьируют от 1,1 до 1,7 , для группы 2М показатель метилирования изменяется от 1,7 до 2,5 и для группы ЗМ - от 2,5 до 3, 1. Более 80% анализируемых образцов ДНК группы СВ были отнесены к группе 1М (мало метилированных копий РГ). Таким образом, в геномах людей СВ снижено содержание КМРГ и это коррелирует со сниженным уровнем метилирования РГ.

Возникает вопрос: теряются ли КМРГ при старении организма или до старости доживают преимущественно те индивиды, у которых в геноме изначально нет копий КМРГ? В последнем случае отсутствие КМРГ в геноме можно было бы рассматривать как прогностический маркер долголетия.

Поскольку мы не располагаем возможностью проследить изменение количества КМРГ в геноме на протяжении всей жизни одних и тех же индивидов, для ответа на поставленный вопрос мы обратились к модельной системе - репликативному старению культивируемых фибробластов кожи человека, которое многими авторами рассматривается как адекватная модель изучения механизмов старения млекопитающих.

Анализ влияния свойств комплекса РГ на скорость репликативного старения фибробластов кожи человека Для отбора доноров кожи применили два критерия - возраст донора и количество АкРГ в геноме, определенных ранее в культивируемых лимфоцитах. Основные характеристики штаммов приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Характеристики анализируемых в работе штаммов фибробластов

№ Основные характеристики Порядковый номер штамма фибробластов кожи

2206 2207 2208 2211 2212

1 Возраст донора (год) 21 35 52 52 35

2 Максимальное число пассажей (МЧГТ) 60 66 62 56 47

3* Число клеток в субконфлуентной культуре, млн 3,0 ± 0,3 2,7 ± 0,2 1,5 ±0,1 1,7 ±0,1 1,9 ±0,1

4 Число клеток (40 пас.) в субконфлуентной культуре, млн 1,4 ±0,2 2,3 ± 0,2 1,7 ±0,2 1,0 ±0,1 0,5 ±0,1

5* Содержание ТП, пг/нгДНК 0,59± 0,05 1,06± 0,04 0,74± 0,01 0,40± 0,03 0,35 ± 0,03

6* Количество АкРГ, (усл.ед) 17,7 ±0,1 17,1 ±0,1 21,5 ±0,1 16,7 ±0,1 20,0 ± 0,2

7* Число копий РП 590 ± 40 670 ±70 470 ± 60 370 ± 20 470 ± 40

8* Показатель К/А 35 39 22 21 22

9* Степень метилирования РГ, показатель М 1,7 ±0,2 1,9 ±0,2 1,12± 0,03

10* РНК, мкг/мкг ДНКклетки 1,6 ± 0,2 1,7 ±0,2 3,3 ± 0,3 1,4 ±0,1 2,4 ±0,2

и* вкДНК, (% от ЮЩНК) 3,3 ±0,5 2,2 ± 0,3 2,9 ± 0,4 3,0 ±0,5 7,4 ± 1,1

12* Фрагментация вкДНК 2,7 ±0,4 2,1 ±0,2 5,2 ±0,4 2,1 ±0,7 3,0 ±0,9

13* Активность каспазы 3,ед.фл./ 1мкг ДНК 33 ±2 26 ± 3 29 ±2 35 ±3 45 ±5

14* Активность нуклеаз, ед.фл./ 1мкгДНК 42 ±4 40 ±4 . 58 ±3 48 ±4 90 ±4

*) характеристики определены для субконфлуентных клеток на 5-м пассаже

Свойства комплекса РГ. Число копий РГ в геномах клеток 5-го пассажа варьировало от 370 до 670, относительное количество АкРГ - от 16,7 до 21,5 усл.ед. Для клеток штаммов 2206 и 2207 значения показателя К/А оказались выше порогового значения 26, что позволяет предположить присутствие в геноме КМРГ. Для остальных штаммов величины К/А находились в интервале значений, характерных для геномов, в которых КМРГ отсутствуют. Для трех штаммов с разными значениями отношения К/А (2206, 2207 и 2208) был определен показатель метилирования. Сравнение значений К/А и М выявило высокую положительную корреляцию между этими параметрами (к = 0,997; р = 0,05; N = 3), что подтверждает предположение о наличии в геномах штаммов 2207 и 2206 высокометилированных кластеров РГ, которые составляют соответственно примерно 33 % и 26 % всех копий РГ. Количество РНК, определенное в расчете на 1 мкг клеточной ДНК (табл.2, строка 9), отражает, прежде всего, количество рРНК, т.к. рРНК составляет от 80 до 90% клеточной РНК. Мы наблюдали положительную зависимость количества РНК от количества АкРГ в геноме клеток (рис. 3).

Рис.3,

Зависимость количества РНК в клетках фибробластоь 5 штаммов от количества АкРГ в их геномах. Приведены данные линейной регрессии (сплошная линия). На рис.3 и далее на всех рисунках штаммы с большим количеством АкРГ показаны черными кружками.

Маркеры репликативного старения (1) Максимальное число пассажей (МЧП). Скорость репликативного старения характеризуется величиной МЧП клеток культуры (строка 2, табл. 2). Показатель МЧП изменялся от 47 (штамм 2212) до 66 (штамм 2207). Для определения МЧП необходимы длительные эксперименты по культивированию клеток. Мы определили, что можно прогнозировать скорость старения,

г-

Количество РНК, мкг/мкг ДНК

Х-

к « о.ва

р = 0,004

17 18 19 20 Количество АкРГ, ус.ч.ел.

определяя некоторые параметры культуры, коррелирующие с МЧП, задолго до того, как клетки перестанут делиться.

(2) Число клеток на фиксированной площади на 40-м пассаже (строка 4) коррелирует с МЧП (показатели линейной регрессии, к = 0,99; р < 0,01; п = 5) и также отражает старение культуры - «старые», неделящиеся клетки занимают большую площадь, чем «молодые» и пролиферирующие.

(3) Содержание теломерного повтора в клетках 5-го пассажа. В последние годы получены доказательства того, что уменьшение содержания в геноме ТП - это следствие (маркер), но не причина старения (Оловников A.M., 2003). Содержание ТП в геномах клеток 5-го пассажа (строка 5, табл.2) коррелирует с МЧП (к = 0,99; р < 0,01; п = 5) и может рассматриваться как прогностический маркер старения. Содержание ТП на 5-м пассаже и число клеток на 40-м пассаже также связаны линейной зависимостью (к = 0,97; р = 0,005; п = 5).

Уровень спонтанного апоптоза в клетках 5-го пассажа оценивали по двум показателям: активность в клеточных лизатах одного из ключевых ферментов апоптоза - каспазы 3 (табл. 2, строка 13) и количество внеклеточной ДНК (вкДНК) по отношению к общему количеству ДНК в лунке планшета (строка 11). Значения этих маркеров апоптоза (рис. 4) отрицательно коррелируют с МЧП (и с содержанием ТП).

Рис. 4. Зависимость активности каспазы 3 (а) и количества вкДНК (б) в культуре клеток 5-го пассажа от МЧП.

Таким образом, культуры клеток с относительно низкой скоростью репликативного старения на ранних пассажах характеризуются высоким содержанием в геноме ТП и низким уровнем спонтанного апоптоза

Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения. Методом линейной регрессии мы проанализировали зависимость свойств комплекса РГ клеток 5-го пассажа (число копий, количество АкРГ, показатели К/А и М) от

маркеров старения (МЧП, содержание ТП, спонтанный апоптоз). Характеристики комплекса РГ клеток практически не влияли на скорость пролиферативного старения. К моменту начала культивирования вне организма клетки находятся в определенном состоянии, которое характеризуется уровнем спонтанного апоптоза и содержанием ТП и не зависит от свойств комплекса РГ. Это состояние определяет длительность пролиферативного периода клеток в условиях нормального культивирования при отсутствии внешних воздействий, которые могут индуцировать дополнительный окислительный стресс.

Изменения некоторых свойств генома при репликативном старении Изменение содержания контрольной последовательности (ТП). На рис. 5 показано содержание ТП в геномной ДНК, выделенной из клеток различных пассажей.

Содержание теломерного повтора, пг/нг ДНК

Рис 5.

Зависимость содержания ТП в ДНК, выделенной из клеток штаммов фибробластов, от числа пассажей культуры Обозначения штаммов: а - 2207fi - 2208, о - 2206, Д - 2211, ж - 2212. Прямая линия построена по уравнению линейной регрессии. Относительная стан дартная ошибка 5-10°о.

Число пассажей

В содержании ТП в ДНК клеток 5-го пассажа наблюдается вариабельность и отрицательная зависимость между содержанием ТП и числом пассажей культуры (к = - 0,7; р < 0,0001; N = 45). Весь период культивирования клеток можно условно разбить на два отрезка: «ранние пассажи» (5-31), когда наблюдается выраженное снижение содержания ТП в ДНК при делении клеток (к= - 0,53; р = 0,01; N = 20) и «поздние пассажи», когда содержание ТП в ДНК клеток незначительно изменяется в последующих генерациях клеток (к = - 0,33; р = 0,1; N = 25). На рис. 6а приведены данные по среднему содержанию ТП в ДНК клеток «ранних» и «поздних» пассажей. Для всех штаммов выявлено достоверное снижение содержания ТП в ДНК клеток «поздних» пассажей.

Изменение содержания РГ и уровня метилирования РГ. Сравнение среднего содержания РГ в ДНК клеток «ранних» и «поздних» пассажей демонстрирует тенденцию к уменьшению общего числа копий РГ в геномах фибробластов при репликативном старении (рис. 66). В случае штаммов 2207 и 2206, которые содержат КМРГ, уменьшение статистически значимо. Геномы этих штаммов теряют соответственно примерно 36 % и 26 % всех копий РГ.

Естественно предположить, что теряются, прежде всего, метилированные КМРГ, содержание которых в геномах клеток «ранних» пассажей близко к количеству теряемых на «поздних» пассажах копий РГ.

р п р и Р 2206 2207 2208 2211 2212 Порядковый номер штамма фнбробластов

Рис. 6. Средние значения содержания ТП (а) и РП (б) в ДНК культивируемых фибробластов «ранних» (светлые столбики) и «поздних» (темные столбики) пассажей. * - различия в содержании РГ на «ранних» и «поздних» пассажах достоверны (р <0,001).

Для того чтобы подтвердить это предположение, мы сравнили показатели метилирования РГ для штаммов 2206, 2207 и 2208 на пятом и последнем пассажах (соответственно 57-, 66- и 62-ом). Результаты представлены на рис. 7. На последних пассажах штаммов 2206 и 2207 наблюдается значительное снижение показателя М, в геноме практически не остается высокометилированных копий РГ.

57 5 66 S 62

2206 2207 2208

Анзлщируемый штамм

Рис. 7. Значения показателя М, определенные для ДНК трех штаммов фибробластов на 5-м (светлые столбики) и на последнем (обозначен цифрой, темные столбики) пассаже.

* - штаммы, для которых различия между показателями метилирования достоверны (р<0,01).

Приведенные данные позволяют сделать вывод: при репликативном старении фибробластов кожи человека из генома удаляются неактивные кластеры высокометилированных РГ.

Повреждение рибосомных генов яри репликативном старении Мы сочли целесообразным подтвердить данные об изменении числа копий РГ при старении фибробластов, полученные с помощью метода дот-гибридизации, методом «real-time» ГШР (рис. 8).

2206

л ç

и® SSL10

U® 0=£ II

Oi-г- о

s О

S 66 GAPDH

5 61 ISSpflHK

5 57 5 57 5 66 ISSpflHK GAPDH 18БрДН!<

Определяемая последовательность Рис. 8. Относительное содержание гена 18S рРНК и гена GAPDH в ДНК фибробластов 5-го (светлые столбики) и одного из последних (темные столбики) пассажей. Цифры под столбиками - номер пассажа. * - различия в содержании анализируемых генов в ДНК достоверны (р < 0,001).

Анализ содержания фрагмента 188рДНК длиной 269 п.н. в варианте «TagMan» ПЦР был проведен для ДНК штаммов 2206, 2207 и 2208, для которых мы наблюдали наибольшие изменения количества РГ при старении клеток. Для сравнения в тех же образцах ДНК анализировали содержание уникального гена GAPDH. В качестве внутреннего стандарта использовали ген Myd88. Содержание 18SpflHK в ДНК клеток «поздних» пассажей снижалось значительно сильнее, чем можно было ожидать, ориентируясь на данные количественной дот-гибридизации. Изменения в содержании гена GAPDH при старении были разнонаправленными, поэтому низкую эффективность ПЦР в случае рДНК

клеток последних пассажей нельзя объяснить ингибиторами, которые могли бы содержаться в образцах ДНК клеток поздних пассажей. Трудно допустить, что на самом деле содержание РГ в геноме при старении снижается на порядок, тем более что по данным количественной дот-гибридизации потери не превышают 40 %. Низкую эффективность ПЦР в этом случае можно объяснить модификацией последовательности РГ в «старых» фибробластах. Известно, что при старении снижается эффективность ответа клеток на повреждающие воздействия. Некоторые виды повреждений в РГ репарируются с гораздо меньшей скоростью, чем аналогичные повреждения последовательностей генома, транскрибируемых РНК полимеразой II (Stevnsner Т. et al., 1993). Однонитевые разрывы и модификация оснований приводят к тому, что, во-первых, снижается эффективность комплексообразования используемых в ПЦР праймеров с ДНК-мишенью, и, во-вторых, полимераза Taql не способна «прочитать» весь анализируемый фрагмент. Модификация последовательности РГ в клетке, по-видимому, должна сопровождаться снижением количества транскрибируемых копий РГ, поскольку повреждение ДНК является препятствием для работы РНК полимеразы 1. Таким образом, мы можем высказать предположение, что, несмотря на относительно небольшое снижение общего числа копий РГ при репликативном старении, количество неповрежденных копий, которое потенциально способно транскрибироваться, снижается в несколько раз. Это может являться одной из причин (возможно, решающей) блокирования пролиферации.

Влияние свойств комплекса РГ на функционирование культивируемых фибробластов кожи в условиях окислительного стресса, вызываемого

хроматом калия

Репликативное старение, равно как и естественное старение организма, зависит от двух основных факторов - свойств генома и свойств среды культивирования (обитания). Действие неблагоприятных факторов среды может значительно ускорять старение и сокращает продолжительность пролиферативного периода культивируемых клеток. В англоязычной литературе введен специальный термин - стресс-индуцированное преждевременное старение (SIPS) (Toussaint О. et all., 2000). Стресс-индуцированное старение сопровождается значительным снижением длины теломеры уже на ранних пассажах культивируемых клеток (Toussaint О. et all., 2000). В нашей работе мы исследовали действие К2СЮ4 на культивируемые фибробласты кожи здоровых людей, чтобы оценить, могут ли свойства комплекса РГ влиять на последствия действия на клетки неблагоприятных факторов среды, которые индуцируют сильный окислительный стресс и ускоряют процесс старения. Исследование влияния К2СЮ4 на штаммы фибробластов 5-го пассажа, включало 2 этапа, которые были спланированы на основании проведенных ранее исследований кинетики действия К2СЮ4 на фибробласты здорового донора (Вейко H.H., Терехов С.М. и соавтр., 2005):

1. «Ранний» ответ на стресс, который мы тестировали после действия «малых» доз К2СЮ4 (4 часа культивирования в присутствии 4 и 6 мкМ К2СЮ4);

2. «Поздний» ответ, индуцированный заменой среды культивирования, после действия 4 и 6 мкМ К2СЮ4 хромата в течение суток. Анализ проводили через 72 часа после смены среды.

«Ранний» ответ фибробластов на действие «малых» доз К2Сг04 Изменение количества клеточной РНК. Действие малых доз К2СгО( вызывает увеличение количества РНК в культивируемых фибробластах 4-го пассажа здорового молодого донора (Вейко H.H., Терехов С.М. и соавтр., 2005). Анализ изменения количества РНК при действии малых доз хромата в клетках пяти штаммов в связи с параметрами, приведенными в таблице 2 (маркеры старения, свойства комплекса РГ, возраст), выявил только одну зависимость - от возраста донора (рис. 9). Очевидно, что в фибробластах, полученных от доноров 52 лет, наблюдается снижение количества РНК в присутствии хромата, в отличие от клеток молодых доноров, для которых количество РНК при действии К2СЮ4 увеличивается на 40-70 %.

4 мкМ хромата калия

Возраст/ 21 35 52

Рис. 9. Изменение количества РНК в клетках 5 (светлые столбики) и 22 (темные столбики) пассажей относительно контроля (5 и 22 пассаж без К2СЮ4) при действии 4 мкМ К2Сг04 (4 часа).

Ранее было обнаружено, что эффект изменения количества РНК при действии 4 мкМ К2Сг04 снижается по мере увеличения числа пассажей, т.е. по мере старения культуры. Мы дополнили эти данные, сравнив изменения количества клеточной РНК при действии 4 мкМ К2Сг04 для пяти культур на 5 и 22 пассажах (рис. 9). Для всех штаммов на 22-м пассаже («постаревшие» клетки), за исключением 2206 (донору 21 год), наблюдается достоверное снижение количества РНК при действии 4мкМ хромата, т.е. тот же эффект, что и для фибробластов 5-го пассажа для 52-летних доноров. Полученный результат достаточно интересен. Наши данные и данные других авторов показали, что репликативное старение фибробластов не зависит от возраста донора кожи. Однако изменения количества РНК при действии окислителя указывают на то, что «молодые» клетки доноров старше 50 лет по некоторым свойствам похожи на «состарившиеся» клетки доноров младшего возраста. Возможно, эти особенности клеток «старых» доноров, не влияя на репликативное старение в

нормальных условиях, будут влиять на скорость старения, обусловленного ) дополнительным стрессом.

Изменения уровня апоптоза. На рис. 10 приведены данные относительного изменения величин, характеризующих апоптоз, при действии на фибробласты малых (4*4 и 6*4 мкМ*ч) доз К2СЮ4. Активность каспазы 3 имеет j тенденцию к снижению при действии меньшей дозы окислителя (эффект достоверен только для штамма 2208) и немного возрастает при действии большей дозы. Ранее было показано, что количество клеток с признаками J апоптоза при раннем ответе на действие 4мкМ хромата не увеличено по сравнению с контролем (Вейко H.H., Терехов С.М. и соавтр., 2005).

Среднее

( + SD)

АкРГ, усл.ед.

ТП, i 0,59 гтг/вгДНКI-

Рис. 10. Изменения активности каспазы 3 (темные столбики) и количества вкДНК (светлые) клеток 5-го пассажа в присутствии малых доз К2СЮ4. За единицу приняты значения соответствующих параметров клеток в отсутствие К ¡Сг О4,

На фоне незначительных изменений активности каспазы 3 при действии 6 мкМ К2Сг04 возрастает количество вкДНК. Исключение составляет штамм 2212, для которого наблюдается значительное снижение количества вкДНК по отношению к контролю при обеих дозах хромата. Одной из причин увеличения количества вкДНК может быть ускорение процесса деградации уже апоптотических клеток при действии окислительного стресса. Нельзя также исключить, что при действии малых доз окислителя в ответ на дополнительный стресс происходит синтез новых последовательностей генома (СаЬап С.в. а!., 2008). Изменения количества вкДНК при действии К2СЮ4 коррелируют с маркерами репликативного старения (МЧП и содержанием ТП в геноме (к =

0,85, р = 0,05, N=5)). Максимальное увеличение количества вкДНК при действии 4мкМ хромата наблюдается у клеток штаммов с высоким содержанием ТП, т.е. у штаммов с замедленным репликативным старением. Мы не обнаружили какой-либо зависимости между изменениями параметров, характеризующих апоптоз относительно контроля, и свойствами комплекса РГ.

«Поздний» ответ фибробластов на действие хромата калия

Известно, что смена среды культивирования индуцирует пролиферацию в контрольных субконфлуентных клетках и арест клеточного цикла и апоптоз в экспонированных клетках (Pritchard D.E., 2001). Исследование кинетики изменения маркеров апоптоза, проведенное ранее на фибробластах здорового молодого донора, показало, что максимальные изменения наблюдаются на 72 часу культивирования после смены среды, в которой клетки инкубировали 24 часа (4 и 6 мкМ К2Сг04) (Вейко H.H., Терехов С.М. и соавтр., 2005). В нашей работе мы воспроизвели эти условия.

Уровень апоптоза клеток через 72 часа после стимуляции апоптоза путем смены среды мы оценили по активности каспазы 3 и количеству фрагментов вкДНК в среде культивирования. Абсолютные значения активности каспазы 3 в клеточных лизатах экспонированных клеток зависят от маркеров старения (рис. 11): чем выше содержание ТП в геноме штамма (МЧП), тем меньшее число клеток подвергается апоптозу при действии окислительного стресса. Свойства комплекса РГ не влияют на абсолютные значения активности каспазы 3.

80-|

60-

50-

40-

Активность каспазы 3, ед.фп71икгДНК

к = -0,99 р= 0,001

Puc.ll.

Зависимость активности в клеточных лизатах каспазы 3 от маркера старения (содержания ТП) через 72 часа после индукции апоптоза, вызванного действием КзСгО* (6 мкМ, 24 часа, далее замена среды иа свежую, без К:СгО^

oi4 ' ае ~08 1 Г

Содержание 171, пг/нг

Однако относительные изменения активности каспазы 3 при действии К2Сг04 меньше в клетках, геном которых содержит большие количества АкРГ (рис. 12а) и не зависят от маркеров старения. Аналогичную зависимость мы наблюдали для другого маркера апоптоза - вкДНК (рис. 126).

Относительные изменения количества вкДНК при действии б мкМ хромата по сравнению с контролем (клетки без хромата) тем больше, чем меньше активных копий РГ содержит геном.

Таким образом, интенсивность апоптоза клеток, вызванного окислителем, определяется маркерами старения (содержанием ТП, МЧП), которые отражают способность клетки противостоять окислительному стрессу (Fuster J.J. et al., 2006; Duan J. et al., 2005; Houben J.M. et al., 2008). Относительные изменения уровня апоптоза в культуре клеток при действии окислителя зависят от количества активных копий РГ в геноме. Можно ожидать, что из двух штаммов клеток, которые характеризуются одинаковыми маркерами старения, более устойчивой к индуцируемому внешним воздействием апоптозу будет культура с большим количеством активных копий РГ в геноме.

Относительная активность каспазы 3, отн.ед.

к =-0,81 р = о,оэ

Изменение -

вкДНК

вкДНК + яДНК

-.отн.ед.

к = -0,83 р = 0,04

19 20 АкРГ.услед.

19 20 21

АкРГ, усл. ед.

Рис. 12. Зависимость изменения активности каспазы 3 (а) и количества вкДНК (б) в экспонированных клетках относительно контроля от количества АкРГ в геноме штамма. Условия: а - приводятся средние значения для ¿>су'Л' концентраций хромата; б - клетки инкубировали в присутствии бм/Ф! хромата.

Количество АкРГ и активность нуклеаз в лизатах клеток Исследования нуклеазной активности (НА) имеют прямое отношение к проблеме старения. С возрастом увеличивается уровень апоптоза клеток, возрастает количество вкДНК. В составе вкДНК накапливаются неметилированные CpG-богатые фрагменты, в том числе и рибосомные гены, которые могут выступать в роли лигандов для рецепторов TLR9, стимулируя синтез цитокинов и вызывая дополнительный окислительный стресс. С возрастом концентрация РГ в сыворотке крови возрастает, особенно при заболеваниях, связанных с увеличением гибели клеток (Вейко H.H. и соавтр., 2007, 2008). Поскольку количество неметилированных копий РГ

пропорционально количеству активных копий, то чем больше количество АкРГ, тем большее количество фрагментов РГ - лигандов TLR9 будут переходить в состав вкДНК при апоптозе одной клетки. Для «нейтрализации» (путем гидролиза) этих фрагментов необходима повышенная НА. Анализируемые штаммы фибробластов представляют удобную модель для проверки предположения о влиянии количества АкРГ на уровень НА клеток.

Мы охарактеризовали НА клеточных лизатов интактных клеток и показатель, отражающий степень фрагментации вкДНК (табл. 2). Основным ферментом, обуславливающим тестируемую в наших условиях Mg^-зависимую эндонуклеазную активность, является ДНКаза1 (Campbell V.W., Jackson D.A., 1980). Экспрессия этого фермента увеличивается при гипоксии клеток (Kominato Y. et all., 2007). Известно, что ДНКаза 1 играет существенную роль в процессе элиминации фрагментов вкДНК из организма (среды культивирования).

Уровень НА в клетках при различных условиях культивирования 5 штаммов клеток 5-го пассажа мы разделили на две группы - с малым количеством АкРГ (2207, 2207 и 2211) и большим (2208 и 2212). А 40] Б 4<Ь В 32 i Г

>,4

X i_

5 5 40 £ ® I ч

2<У

16,7-17,7 20-21,5

16,7-17,7 20-21,6 16,7-17,7 20-21,5 - 18,7-17,7 20-21,5

15-1

4Н

«ё raS

ОГО 2 -

4 -

18,7-17,7 20-21,5

16,7-17,7 20-21,5 " 1S,7-17,7 20-21,5 16,7-17,7 20-215

АкРГ, усл.ед.

Рис. 13. Средние значения НА (А-Г) и показателя фрагментации (а-г) в группе клеток с относительно малыми (светлые столбики) и большими (темные) количествами АкРГ (усл.ед.) в геноме. Варианты: А,а -стандартное культивирование; Б,б - действие малых доз (приводятся средние значения для двух доз) К2СЮ4; В,в и Г,г - апоптоз, вызванный соответственно действием 4 мкМ или 6 мкМ К2Сг04 («поздний ответ»). (*) -отмечены значения, которые различаются с вероятность р < 0,05.

Для этих групп были определены средние значения показателя фрагментации и НА (рис. 13). При стандартных условиях культивирования значения НА (рис. 13А) и уровень фрагментации ДНК (рис. 13а) в клетках с большим количеством АкРГ примерно в 2 раза выше, чем в клетках с низким

количеством АкРГ. «Ранний» ответ на действие хромата калия (4 часа, 4 или 6 мкМ) сопровождается значительным снижением НА клеток (рис. 13Б). Вероятно, окислительный стресс уменьшает возможности клеток эффективно деградировать вкДНК. Значения НА и степени фрагментации (рис. 136), как и в случае спонтанного апоптоза клеток, зависят от количества АкРГ в геноме. Уровень НА клеток, в которых протекает процесс апоптоза («поздний» ответ), индуцированный 4мкМ (рис. 13В) или 6 мкМ (рис. 13Г) К2Сг04 также положительно коррелирует с количеством в геномах штаммов АкРГ. Таким образом, для трех состояний клеток (стандартное культивирование, «ранний» и «поздний» ответ на окислительный стресс) мы обнаружили одни и те же закономерности: уровень М§2+-зависимой нуклеазной активности клеток в штаммах с высоким относительным количеством АкРГ значительно выше, чем в клетках с низким количеством АкРГ. В большинстве случаев это соответствует более высокой степени фрагментации вкДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе большинства теорий старения лежит предположение об определяющей роли окислительного стресса, который вызывается как эндогенными причинами (функционирование митохондрий), так и экзогенными (действие окружающей среды и образа жизни). Устойчивость организма (клетки) к действию свободных радикалов и, следовательно, скорость старения, ассоциированные со старением заболевания и продолжительность жизни - это производная функционирования большого числа генов, среди которых весьма трудно выделить определяющие процесс естественного старения. Свойства комплекса РГ индивида (клетки) - это фон, на котором развивается клеточный ответ на окислительный стресс. Для эффективного ответа на стресс клетке необходимо достаточное количество рибосом, которые обеспечат синтез нужного количества белков, участвующих в процессах детоксикации, репарации и апоптоза поврежденных клеток. Именно поэтому рибосомные гены давно привлекают внимание исследователей процесса старения.

Количество активных копий РГ в геноме - определяющая характеристика РГ, напрямую связанная с количеством клеточной РНК. Мы обнаружили, что для группы СВ по сравнению с ГС наблюдается сужение распределения по количеству АкРГ (рис. 14). Данные многолетних наблюдений сотрудников лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН, а также данные литературных источников говорят о том, что относительное количество АкРГ (количество копий РГ в потенциально-активной фракции РГ (Сопсош А., 1992)) в геноме клеток - врожденная характеристика организма, не изменяющаяся с возрастом.

M^itk.'

JbL_L_\ ^Д»

14 16 ~T8 20 22 24

Количество АкРГ, усл.ед.

Рис. 14. Сравнение распределений по количеству АкРГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло-серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ((Шубаева Н.О., 2003), темно-серый цвет) и больных шизофренией ((Вейко H.H., Еголина H.A. и соавтр., 2003), черный цвет).

Таким образом, сужение распределения по количеству АкРГ в группе СВ говорит о том, что до 80 лет не дожили индивиды с минимальными и с максимальными количествами АкРГ в геноме. Мы предположили, что индивиды с малым количеством АкРГ (менее 16,5 усл.ед.) не доживают до старческого возраста, в том числе и потому, что их клетки обладают сниженной устойчивостью к окислительному стрессу. Относительно небольшие повреждения клеток сопровождаются индукцией апоптоза, что приводит к более раннему старению органов и тканей. Это предположение подтвердилось при исследовании действия окислительного стресса, вызываемого малыми дозами хромата калия, на 5 линий фибробластов кожи доноров с различным количеством АкРГ в геноме. Относительные изменения в уровне показателей апоптоза при действии на клетки с низкими количествами АкРГ были в несколько раз больше, чем в клетках с большими количествами АкРГ. Аналогичные данные были получены ранее для фибробластов кожи больных ревматоидным артритом (РА) (Шубаева Н.О., 2003). В этой связи интересно отметить, что у большей части больных РА, который является социально значимым заболеванием, сокращающим продолжительность жизни на 10-15 лет, ранее наблюдали более низкие, чем у возрастной нормы, количества АкРГ в геноме (см. рис. 14). Больные РА составляют подгруппу людей с низкими количествами АкРГ среди людей среднего и молодого возраста, которые, при прочих равных условиях, имеют вероятность не дожить до 80 лет.

Индивиды с большим количеством АкРГ (более 22 усл.ед.) также не представлены в выборке СВ. Мы объясняем это двумя причинами. Как показали данные модельного исследования действия К2СЮ4 на культивируемые фибробласты, клетки с большим количеством АкРГ повышенно устойчивы к апоптозу, индуцируемому генотоксическим агентом. Благодаря более высокой активности синтеза белка (большего количества рРНК, а значит и рибосом) клетки с поврежденной ДНК могут выжить и не подвергнуться апоптозу. Но при этом возрастет вероятность мутаций в ДНК, что может привести к

£ 30 g

020 <

возникновению опухоли или других заболеваний, сокращающих продолжительность жизни.

Вторая возможная причина - это наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение количества АкРГ и не высокая продолжительность жизни. Из литературы известно пока только одно заболевание (исключая синдром Дауна с трисомией по 21 хромосоме), при котором было обнаружено для части больных значительное увеличение количества АкРГ в геноме - это шизофрения (Вейко H.H., Еголина H.A. и соавтр., 2003) (рис. 14). Авторами этих работ высказано предположение, что увеличение активности РГ связано с наличием врожденной генетической патологии, для компенсации которой необходим интенсивный синтез белка и, следовательно, большое количество АкРГ в геноме.

Общее число копий РГ зависит от количества АкРГ в геноме и от количества метилированных КМРГ. Результаты, полученные в нашем исследовании, позволяют сделать вывод, что при старении геном, с большой вероятностью, теряет высокометилированные КМРГ. Эти данные могут отчасти объяснить противоречивость полученных ранее разными авторами результатов об изменении количества и метилирования РГ при старении клеток и тканей животных. В зависимости от наличия или отсутствия КМРГ в геноме исследуемых клеток можно обнаружить или не обнаружить статистически значимое снижение содержания РГ в геноме. КМРГ не транскрибируются, являясь своеобразным «балластом» генома. Потеря этих последовательностей при старении не должна сказываться на количестве синтезируемой РНК-полимеразой 1 рРНК. Также важен обнаруженный нами факт, что в состарившихся клетках, имеет место повреждение цепи рДНК в значительном числе копий рДНК. Эти нарушения могут приводить как к блокированию клеточного цикла, так и к низкой устойчивости к стрессу. Оба этих события сопутствуют старению и смерти организма.

Наши данные показали, что распределение по числу копий РГ в геноме для людей старше ВО лет значительно сужено по сравнению с выборкой здоровых людей среднего возраста (см. рис. 15). По-видимому, значительное уменьшение доли высокопийных по рДНК геномов в группе СВ происходит вследствие трех причин: (1) потеря в течение жизни КМРГ, которые встречаются только в геномах с большим числом копий (Вейко H.H., 2001), (2) снижение числа людей с большим количеством АкРГ, которым соответствуют большое число копий РГ и (3) наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение общего числа копий РГ и не высокая продолжительность жизни. Увеличение общего числа копий РГ, также как и количества АкРГ, ранее наблюдали для геномов больных шизофренией (см. рис. 15). Небольшое уменьшение доли низкокопийных по рДНК геномов в выборке СВ связано, по-видимому, с уменьшением в выборке СВ людей с низкими количествами АкРГ, геномы которых содержат мало КМРГ.

Рис. 15. Сравнение распределений по числу копий РГ для выборки СБ (белое поле), группы среднего возраста (светло серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ((Вейко H.H., Шубаева Н.О. и соавтр., 2006), темно-серый цвет) и больных шизофренией ((Вейко H.H., Еголина H.A. и соавтр., 2003), черный цвет).

Исследование репликативного старения показало, что длительность пролиферативного периода культур с количеством АкРГ в геномах от 16,7 до 21,5 усл.ед. не зависит от свойств комплекса РГ и диктуется определенным состоянием клетки к началу культивирования вне организма. Это состояние может быть охарактеризовано не зависящими от свойств комплекса РГ, но коррелирующими между собой параметрами - содержанием теломерного повтора в геноме, показателями спонтанного апоптоза клеток (активность каспазы 3 и количество вкДНК). Штаммы с максимальными содержаниями ТП в геноме имеют минимальные показатели уровня апоптоза на раннем пассаже и переживают максимальное число пассажей. Однако интенсивность ответа клеток ранних пассажей на экзогенное повреждающее воздействие напрямую зависит от количества АкРГ: чем больше АкРГ в геноме, тем меньше относительное увеличение активности каспазы 3 и количества вкДНК в культуре.

При изучении репликативного старения и ответа клеток на окислительный стресс обнаружен новый факт, имеющий принципиальное значение для развития дальнейших исследований роли РГ в процессах старения. Оказалось, что от количества АкРГ в геноме фибробластов напрямую зависит эндонуклеазная активность клеток, которую мы тестировали в клеточных лизатах. Положительную корреляцию между НА и количеством АкРГ в геноме мы обнаружили в интактной субконфлуентной культуре клеток, при действии на клетки малых доз хромата калия и при индукции апоптоза клеток. Повышенную НА в клетках с большим количеством АкРГ нельзя объяснить увеличением общего уровня синтеза белка в клетках с более активным синтезом рРНК. При действии малых доз хромата калия в одном из штаммов с большим количеством АкРГ наблюдалось снижение количества клеточной РНК, но уровень НА оставался высоким. Для клеток с большим количеством АкРГ и соответственно

более высоким уровнем НА, мы наблюдали, как правило, значительно более сильную фрагментацию внеклеточной ДНК.

В работе мы высказали предположение, что повышенная НА клеток с большим количеством АкРГ в геноме - это возможная компенсаторная реакция клетки на более высокие концентрации CpG-богатых фрагментов РГ в внеклеточной среде, которые могут нанести вред, индуцируя дополнительный окислительный стресс путем взаимодействия с рецепторами TLR9. Очевидно, для окончательного вывода о роли высоких значений НА в функционировании клеток с большим количеством АкРГ требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

2. У людей старческого возраста снижено содержание в геноме высокометилированных кластеров молчащих рибосомных генов. При репликативном старении геном человека теряет высокометилированные кластеры неактивных копий РГ.

3. При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении показателей real-time ПЦР.

4. Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения не зависят от геномной дозы РГ и от возраста доноров кожи.

5. При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клетки: минимальные изменения в уровне апоптоза демонстрируют штаммы с большим количеством РГ.

6. Уровень эндонуклеазной активности фибробластов (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях окислительного стресса положительно коррелирует с количеством активных копий РГ в геноме штамма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Малиновская Е.М. Изменения комплекса рибосомных генов человека при старении./ Малиновская Е.М., Смирнова Т.Д., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Мандрон И.А., Мхитарова Е.В., Костюк C.B., Терехов С.М., Местергази Г.М., Вейко H.H., Ляпунова H.A. // Медицинская генетика. - 2008. -Т.7, №2., С.10-16.

2. Ермаков A.B. Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в адаптирующих дозах, являются фактором стресс-сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями. / Ермаков A.B., Костюк C.B., Еголина H.A., Малиновская Е.М., Вейко H.H., Спитковский Д.М. // Рад.биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47, №2. - С.133-140.

3. Ермаков A.B. Сигнализация между лимфоцитами человека после индукции эффекта свидетеля ионизирующей радиацией в адаптирующих дозах. / Ермаков A.B., Костюк C.B., Еголина H.A., Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н.,

Малиновская Е.М., Вейко Н.Н. // Рад.биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47, №6, С.650-657.

4. Ermakov A.V. Factors of stress signaling X-irradiatid and noniradiated human lymphocytes. / Ermakov A.V., Kostyuk S.V., Konkova M.S., Egolina N.A., Malinovskaya E.M., Veiko N.N. // Ann N Y Acad Sci. - 2008 -V.l 137. - P.41-46.

5. Малиновская E.M. Количественные характеристики комплекса рибосомных генов у индивидов старческого возраста. / Малиновская Е.М. // Материалы 70-й юбилейной итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». I часть. - Уфа. 2005. - С.15-16.

6. Вейко Н.Н. Фрагменты внеклеточной ДНК - факторы клеточной стресс-сигнализации при действии ионизирующей радиации. / Вейко Н.Н., Ермаков А.В., Костюк С.В., Малиновская Е.М., Еголина Н.А., Замулаева И.А., Саенко А .С. // Тез. Докл. Международной конференции "Новые направления в радиобиологии" - Москва, 2007. - С. 10-13.

7. Konkova M.S. The cell-free DNA fragments are factors of stress-signaling from irradiated to non-irradiated human lymphocytes after exposure by low doses of the X-radiation. / Konkova M.S., Ermakov A.V., Kostyuk S.V., Egolina N.A., Malinovskaya E.M., Veiko N.N. // CNAPS-V ("Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum"): Abstracts. - Moscow, 2007. - P. 16.

8. Egolina N.A. Human ageing is not accompanied by decreasing of genomic dosage of ribosomal genes. Тез. 6-го европейского конгресса «Healthy and active ageing for all Europeans». / Egolina N.A., Lyapunova N.A., Veiko N.N., Mkhitarova E.V., Tsvetkova T.G., Mandron I.A., Kosyakova N.V., Malinovskaya E.M., Agapova R.K., Porokhovnik L.N., Mestergazi G.M. // Успехи геронтологии. - 2007. - T.20, №3.-C.30.

9. Малиновская E.M. Изменения комплекса рибосомных генов при репликативном старении фибробластов кожи человека. / Малиновская Е.М., Вейко Н.Н. // Тезисы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». -Москва. 2008. -С.261-262.

Список используемых сокращений АкРГ - активные копии рибосомных генов; вкДНК - внеклеточная ДНК; ГС - группа сравнения;

КМРГ - кластеры «молчащих» (т.е. неактивных) генов; МЧП - максимальное число пассажей; НА - нуклеазная активность; РА - ревматоидный артрит; РГ - рибосомные гены; РП - рибосомный повтор; СВ - люди старческого возраста; ТП - теломерный повтор; MyD88 -миелоидный фактор дифференцировки; TLR - «То11-Нке»-рецепторы.

Подписано в печать: 19.12.2008

Заказ № 1393 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малиновская, Елена Михайловна

СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Молекулярные механизмы старения.

1.1 Роль соматических мутаций.

1.2 Митохондриальная теория старения и роль окислительного стресса.

1.3 Накопление измененных белков.

1.4. Нарушения метаболизма Сахаров.

1.5 Метилирование ДНК и старение.

1.6 Репарация ДНК и старение.

1.7 Утрата теломер и старение.

1.8 Апоптоз и продолжительность жизни.

2. Изменение основных характеристик рибосомных генов млекопитающих при старении.

2.1 Структурно-функциональная организация рибосомных генов.

2.2 Основные характеристики комплекса рибосомных генов и их варьирование в различных возрастных группах млекопитающих.

2.2.1 Число копий рибосомных повторов в геноме человека.

2.2.2 Изменение числа копий рДНК при старении.

2.3 Активные копии рибосомных генов в геноме человека.

2.3.1 Селективная окраска ядрышкообразующих районов метафазных хромосом.

2.3.2 Изменение активности рибосомных генов при старении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Анализируемая выборка.

2. Выделение ДНК из периферической крови, клеточной массы и среды культивирования фибробластов.

3. Определение концентрации ДНК.

4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома человека в я ДНК и в вкДНК.

5. Определение относительного количества активных РГ (АкРГ).

6. Исследование репликативного старения и действия хромата калия на культивируемые фибробласты.

7. Количественная оценка гена 18S рРНК методом real-time ПЦР.

9. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Свойства комплекса РГ людей среднего и старшего возраста.

1.1 Число копий РГ в геноме.

1.2 Анализ содержания трех контрольных повторяющихся последовательностей генома человека в группе СВ и ГС.

1.2.1 Теломерный повтор.

1.2.2 Гистоновые гены.

1.2.3 Сателлит 3 (lql2).

1.3 Относительные количества активных копий РГ.

1.4 Изменение количества метилированных копий РГ при старении.

2. Влияние свойств комплекса РГ на репликативное старение.

2.1 Основные характеристики штаммов фибробластов кожи человека.

2.1.1 Свойства комплекса РГ.

2.1.2 Маркеры репликативного старения.

2.1.3 Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения.

3. Изменения свойств комплекса РГ при репликативном старении.

3.1 Изменение содержания контрольных повторов (ТП и СатШ).

3.2 Изменение содержания РП и уровня метилирования РП.

3.3 Повреждение ДНК рибосомных генов при репликативном старении.

4. Влияние свойств комплекса РГ на функционирование культивируемых фибробластов кожи в условиях окислительного стресса, вызываемого хроматом калия.

4.1 «Ранний» ответ фибробластов на действие «малых» доз К2СЮ4.

4.1.1 Изменение количества клеточной РНК.

4.1.2 Изменение активности ядрышка.

4.1.3 Изменения уровня апоптоза.

4.2 «Поздний» ответ фибробластов на действие хромата калия.

5. Влияние количества АкРГ в геноме на нуклеазную активность клеток.

5.1 Уровень нуклеазной активности в штаммах фибробластов при стандартных условиях культивирования.

5.2 Изменения НА клеток при действии малых доз хромата калия.

5.3 Изменение НА в процессе апоптоза клеток («поздний» ответ на действие К2СЮ4).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения"

Актуальность темы. Рибосомные гены (РГ), кодирующие рибосомные РНК (28S, 18S, 5.8S рРНК), имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки. Для обеспечения синтеза большого количества молекул рРНК, необходимых для функционирования клеток организма, в геноме человека содержится от 250 до 700 копий РГ [Bross К. et al., 1972, Вейко Н.Н. и соавтр., 1996, 2003]. В соматической клетке человека транскрибируется только 30-50% копий РГ от общего количества [Вейко Н.Н., 2001], которые называют активными копиями РГ (АкРГ). Помимо этого, к варьирующим признакам генома можно отнести количество метилированных копий РГ. В литературе уже давно дискутируется вопрос о возможной связи характеристик комплекса РГ генома млекопитающих и старения. Однако опубликованные данные противоречивы. В нескольких работах сообщалось об уменьшение числа копий РГ при старении тканей миокарда [Strehler B.L. et al., 1979а; Johnson L.K. et al., 1975] и мозга человека [Strehler B.L. et al., 1979b], тканей мозга, селезенки и печени крыс [Gaubatz J.W. et al., 1976]. В ряде работ было обнаружено, что при старении клеток сердца, селезенки, печени и мозга мышей [Ono Т. et al., 1985; Peterson C.R. et al., 1984], а также при репликативном старении фибробластов кожи крыс [Halle J.P.et al., 1997] и человека [Peterson C.R. et al., 1984] не происходит существенного изменения числа копий РГ в геноме. Столь же противоречивые данные получены при исследовании изменения метилирования РГ при старении. Сообщалось об увеличении метилирования при старении культивируемых фибробластов кожи человека [Machwe A. et al., 2000], печени и сперматозоидов крысы [Oakes С.С. et al., 2003] и тканей имбредных линий мышей [Вейко Н.Н. и соавтр., 2007]. По данным других авторов, при старении млекопитающих уровень метилирования РГ не изменяется или снижается [de Carvalho C.V.et al., 2000]. Практически нет работ, которые оценивали бы изменения количества активных копий РГ при старении, а также оценивали взаимосвязь между уровнем окислительного стресса, который рассматривают в качестве основной причины старения, и свойствами комплекса РГ.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась (1) в оценке возможного влияния свойств комплекса РГ человека на продолжительность жизни и (2) в анализе изменения свойств комплекса РГ при старении организма (естественное старение) и культивируемых клеток человека (репликативное .старение). Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1) сравнить свойства комплекса РГ (число копий, количество АкРГ и уровень метилирования) в выборке людей 80 лет и старше и в выборке лиц молодого и среднего возраста;

2) исследовать изменение свойств комплекса РГ при репликативном старении 5 штаммов фибробластов кожи доноров различного возраста, геномы которых значительно различаются по свойствам комплекса РГ;

3) исследовать взаимосвязь свойств комплекса РГ и маркеров старения для 5 штаммов фибробластов кожи человека;

4) изучить влияние свойств комплекса РГ культивируемых фибробластов на устойчивость клеток к апоптозу, индуцируемому окислительным стрессом.

Научная новизна. Впервые показано, что количество АкРГ у людей, достигших 80-летнего возраста, варьирует в пределах достаточно узкой «адаптивной» нормы. Впервые найдено объяснение противоречивым результатам относительно снижения числа копий и изменения уровня метилирования РГ при старении: обнаружено, что при старении происходит потеря высокометилированных кластеров неактивных РГ, если таковые присутствовали в геноме. Впервые показано, что свойства комплекса РГ не влияют на нормальное репликативное старение культивируемых фибробластов, но влияют на устойчивость клеток к апоптозу, который индуцируется дополнительным окислительным стрессом. Впервые обнаружено, что клетки с большим количеством АкРГ характеризуются значительно более высоким уровнем эндонуклеазной активности.

Научно-практическая значимость работы. Данные о распределении количества АкРГ в геномах старых людей могут помочь при составлении прогнозов длительности жизни и риска развития патологии, индуцируемой окислительным стрессом, у различных групп населения. Данные о влиянии количества АкРГ в геноме клетки на изменения уровня апоптоза при действии повреждающих факторов внешней среды могут оказаться полезными при разработке схем клеточной терапии. Описана схема анализа ряда маркеров, которые позволяют прогнозировать различия в длительности пролиферативного периода и в уровне спонтанного апоптоза нескольких культур клеток уже на ранних пассажах, что также может иметь значение для клеточных технологий .

Положения, выносимые на защиту.

1) В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ. Комплекс РГ старых людей практически не содержит высокометилированных кластеров «молчащих» рибосомных копий.

2) При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека геном теряет высокометилированные кластеры копий РГ. При репликативном старении происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении данных real-time ПЦР.

3) Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения (содержание теломерного повтора и уровень спонтанного апоптоза) не зависят от свойств комплекса РГ и от возраста доноров кожи.

4) При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме.

5) Уровень эндонуклеазной активности в лизатах (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях индуцированного окислительного стресса положительно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клеток.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Малиновская, Елена Михайловна

выводы

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в основе большинства теорий старения • лежит предположение об определяющей роли окислительного стресса, который вызывается как эндогенными причинами (функционирование митохондрий), так и экзогенными (действие окружающей среды и образа жизни). Свободные радикалы повреждают клеточные структуры, вызывая нарушения в функционировании и гибель клеток органов и тканей (см. Обзор литературы). Устойчивость организма (клетки) к действию свободных радикалов и, следовательно, скорость старения, ассоциированные со старением заболевания и продолжительность жизни - это производная функционирования большого числа генов, среди которых весьма трудно выделить определяющие процесс старения. Исключение составляют редкие случаи прогерии, обусловленные мутациями в конкретных генах. Свойства комплекса рибосомных генов индивида (клетки) - это фон на котором развивается клеточный ответ на окислительный стресс. Для эффективного ответа на стресс клетке необходимо достаточное количество рибосом, которые обеспечат синтез нужного количества белков, участвующих в процессах детоксикации, репарации и апоптоза поврежденных клеток. Именно поэтому рибосомные гены давно привлекают внимание исследователей процесса старения. В нашей работе мы интересовались двумя вопросами: (1) влияют ли свойства комплекса РГ индивида (число копий, количество АкРГ и уровень метилирования) на продолжительность жизни и (2) изменяются ли свойства комплекса РГ при старении. Для решения этих вопросов мы сравнили свойства комплекса РГ у людей старше 80 лет и людей среднего возраста и исследовали репликативное старение и ответ на окислительный стресс культивируемых фибробластов кожи доноров с охарактеризованными свойствами комплекса РГ.

Количество активных копий РГ в геноме - определяющая характеристика РГ, напрямую связанная с количеством клеточной рРНК (рис. 2-2). Мы обнаружили, что для группы СВ по сравнению с ГС наблюдается сужение распределения по количеству АкРГ (рис. 4-1, см. также п. 1): в геномах

СВ практически не встречаются как низкие значения АкРГ (ниже 16,3 усл.ед.), так и высокие (выше 22,1 усл.ед.).

Количество АкРГ, усл.ед.

Рис. 6-1. Сравнение распределений по количеству АкРГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло-серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ([Шубаева Н.О., 2003], темно-серый цвет) и больных шизофренией ([Вейко Н.Н,, Еголина Н.А. и соавтр., 2003J, черный цвет).

Данные многолетних наблюдений сотрудников лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН, а также данные литературных источников [Conconi А., 1992] говорят о том, что относительное количество АкРГ (количество копий РГ в потенциально-активной фракции РГ [Conconi А., 1992]) в геноме клеток - врожденная характеристика организма, не изменяющаяся с возрастом. Таким образом, сужение распределения по количеству АкРГ в группе СВ говорит о том, что до 80 лет не дожили индивиды с минимальными и с максимальными количествами АкРГ в геноме (рис. 4-1). Мы предположили, что индивиды с малым количеством АкРГ (менее 16,5 усл.ед.) не доживают до старческого возраста, в том числе и потому, что их клетки обладают сниженной устойчивостью к окислительному стрессу. Относительно небольшие повреждения клеток сопровождаются индукцией апоптоза, что приводит к более раннему старению органов и тканей. Это предположение полностью подтвердилось при исследовании действия генотоксического окислительного стресса, вызываемого малыми дозами хромата калия, на 5 линий фибробластов

94 кожи доноров с различным количеством АкРГ в геноме. Относительные изменения в уровне показателей апоптоза (активность каспазы 3 и количество вкДНК) при действии на клетки с низкими количествами АкРГ были в несколько раз больше, чем в клетках с большими количествами АкРГ. Аналогичные данные были получены ранее для фибробластов кожи больных ревматоидным артритом (РА) [Шубаева Н.О., 2003]. В этой связи интересно отметить, что у большей части больных РА, который является социально значимым заболеванием, сокращающим продолжительность жизни на 10-15 лет, ранее наблюдали более низкие, чем у возрастной нормы, количества АкРГ в геноме (см. рис. 6-1, распределение обозначено красным цветом, цитируется по работе [Шубаева Н.О., 2003]). Больные РА составляют подгруппу людей с низкими количествами АкРГ среди людей среднего и молодого возраста, которые, при прочих равных условиях, имеют вероятность не дожить до 80 лет. Очевидно, что вредные факторы окружающей среды и стиль жизни (экология, курение, алкоголь и т.д.), которые индуцируют дополнительный окислительный стресс в клетках организма, также должны значительно сильнее воздействовать на продолжительность жизни индивидов с очень низким количеством АкРГ в геноме.

Индивиды с очень большим количеством АкРГ в геномах (более 22 усл.ед.) также не представлены в выборке СВ. Мы объясняем это двумя основными причинами. Как показали данные модельного исследования действия хромата калия на культивируемые фибробласты, клетки с большим количеством АкРГ повышенно устойчивы к апоптозу, индуцируемому генотоксическим агентом. Благодаря более высокой активности белкового синтеза (большего количества рРНК, а значит и рибосом) клетки с поврежденной ДНК могут выжить и не подвергнуться апоптозу. Но при этом возрастет вероятность мутаций в ДНК, что может привести к возникновению опухоли или других заболеваний, сокращающих продолжительность жизни.

Вторая возможная причина отсутствия среди лиц СВ индивидов с большим количеством АкРГ - это наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение количества АкРГ и не высокая продолжительность жизни. Из литературы известно пока только одно заболевание (исключая синдром Дауна с трисомией по 21 хромосоме), при котором было обнаружено для части больных значительное увеличение количества АкРГ в геноме — это шизофрения [Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003] (рис. 4-1). Высказано предположение, что увеличение активности РГ связано с наличием врожденной генетической патологии, для компенсации которой необходим интенсивный синтез белка и, следовательно, большое количество АкРГ в геноме. Нельзя исключить, что есть и другие врожденные хронические заболевания, при которых активность РГ увеличена.

Общее число копий РГ зависит от количества АкРГ в геноме и от количества метилированных . КМРГ. Результаты, полученные при использовании двух моделей старения, позволяют сделать вывод, что при старении геном, с большой вероятностью, теряет высокометилированные КМРГ. Эти данные могут отчасти объяснить противоречивость полученных ранее разными авторами результатов об изменении количества и метилирования РГ при репликативном старении клеток и старении тканей животных. В зависимости от наличия или отсутствия КМРГ в геноме исследуемых клеток можно обнаружить или не обнаружить статистически значимое снижение содержания РГ в геноме. По литературным данным от 1 до 3-х КМРГ различных размеров содержатся в геномах приблизительно 50% людей [Ляпунова Н.А. и соавтр., 2001]. КМРГ не транскрибируются, являясь своеобразным «балластом» генома. Потеря этих последовательностей при старении не должна сказываться на количестве синтезируемой РНК-полимеразой 1 рРНК. Гораздо важнее обнаруженный нами факт, что в состарившихся культивируемых клетках, имеет место повреждение цепи рДНК в значительном числе копий рДНК. По-видимому, в условиях стареющего организма в различных тканях также происходит накопление копий рДНК, которые не могут при транскрипции дать полноразмерную копию рРНК. Эти нарушения могут приводить как к блокированию клеточного цикла, так и к низкой устойчивости к стрессу.

Рис. 6-2. Сравнение распределений по числу копий РГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ([Вейко Н.Н., Шубаева Н.О. и соавтр., 2006], темно-серый цвет) и больных шизофренией ([Вейко Н.Н., Бголина Н.А. и соавтр., 2003), черный цвет).

Наши данные показали, что распределение по числу копий РГ в геноме для людей старше 80 лет значительно сужено по сравнению с выборкой здоровых людей среднего возраста (см. рис. 6-2). По-видимому, значительное уменьшение доли высокопийных по рДНК геномов в группе СВ происходит вследствие трех причин: (I) потеря в течение жизни КМРГ, которые встречаются только в геномах с большим числом копий [Вейко Н.Н., 2001], (2) снижение числа людей с большим количеством АкРГ, которым соответствуют большое число копий РГ и (3) наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение общего числа копий РГ и не высокая продолжительность жизни. Увеличение общего числа копий РГ, также как и количества АкРГ, ранее наблюдали для геномов больных шизофренией (см. рис, 6-2). Небольшое уменьшение доли низкокопийных по рДНК геномов в выборке СВ связано, по-видимому, с уменьшением в выборке СВ людей с низкими количествами АкРГ, геномы которых содержат мало КМРГ.

Метилирование рДНК в геномах людей СВ значительно снижено по сравнению с метилированием в ГС. Снижение уровня метилирования происходит прежде всего за счет потери КМРГ, о чем свидетельствуют низкие значения показателя К/А, который отражает количество КМРГ в геноме. Низкий уровень метилирования рДНК наблюдали ранее в группе больных РА, однако в этом случае не происходило потери КМРГ и низкий уровень метилирования объясняли неэффективной работой метилтрансфераз [Шубаева Н.О., 2003 ].

При изучении репликативного старения и ответа клеток на окислительный стресс обнаружен новый факт, имеющий принципиальное значение для развития дальнейших исследований роли рибосомных генов в процессах старения. Оказалось, что от количества АкРГ в геноме фибробластов напрямую зависит эндонуклеазная активность клеток, которую мы тестировали в клеточных лизатах. Положительную корреляцию между НА и количеством АкРГ в геноме мы обнаружили в интактной субконфлуентной культуре клеток, при действии на клетки малых доз хромата калия (4 и 6 мкМ, 4 час) и при индукции апоптоза клеток сменой среды после действия больших доз хромата (4 и 6 мкМ, 24 часа). Ранее положительную зависимость НА сыворотки от количества АкРГ в геноме лимфоцитов наблюдали в выборке больных РА [Шубаева Н.О., 2003]. Повышенную НА в клетках с большим количеством АкРГ нельзя объяснить увеличением общего уровня синтеза белка в клетках с более активным синтезом рРНК. При действии малых доз хромата калия в одном из штаммов с большим количеством АкРГ наблюдалось снижение количества клеточной РНК, но уровень НА оставался относительно высоким. Для клеток с большим количеством АкРГ и соответственно более высоким уровнем НА, мы наблюдали, как правило, значительно более сильную фрагментацию внеклеточной ДНК.

Возможно следующее объяснение обнаруженного факта. В последние годы было показано, что транскрибируемая область РП (ТОрДНК) содержит много мотивов связывания с рецепторами TLR9. Лигандами для этих рецепторов являются неметилированные CpG-богатые фрагменты ДНК. Показано также, что фрагменты ТОрДНК накапливаются в составе вкДНК крови здоровых людей и, особенно, при хронической патологии, сопровождающейся усилением процессов гибели клеток. Функция этих фрагментов в составе вкДНК остается пока не ясной, но имеются данные опытов in vitro, что при действии на клетки иммунной системы модельных фрагментов CpG-ДНК значительно возрастает продукция провоспалительных цитокинов, активируется фактор транскрипции NF-каппа В и возрастает концентрация активных форм кислорода и азота, т.е. наблюдается окислительный стресс. Рецепторы TLR9 экспрессируются многими клетками организма, в том числе стволовыми, кардиомиоцитами, эндотелиальными и т.д. Было показано, что содержание ТОрДНК в крови увеличивается с возрастом, особенно большие количества этих фрагментов детектировали в сыворотке пожилых людей с ишемической болезнью сердца и гипертензией [Вейко Н.Н., Булычева Н.В. и соавтр., 2008]. Высокие концентрации ТОрДНК в крови могут наносить вред организму, изменяя функционирование многих типов клеток путем взаимодействия с TLR9. В силу высокого GC-состава ТОрДНК значительно труднее гидролизуется эндонуклеазами крови до низкомолекулярных фрагментов, чем другие фрагменты вкДНК [Вейко Н.Н., Спитковский Д.М., 2000]. Количество неметилированных копий ТОрДНК в геноме (лигандов для TLR9) пропорционально количеству АкРГ. Таким образом, чем больше количество АкРГ в геноме клеток, тем больше фрагментов ТОрДНК - лигандов TLR9 будет находится в составе вкДНК и тем выше должна быть нуклеазная активность клеток, чтобы элиминировать опасный избыток этих фрагментов. Повышенная НА клеток с большим количеством АкРГ в геноме - это возможная компенсаторная реакция клетки на более высокие концентрации фрагментов ТОрДНК в внеклеточной среде, которые могут нанести вред, индуцируя дополнительный окислительный стресс. Очевидно, для окончательного вывода о роли высоких значений НА в функционировании клеток с большим количеством АкРГ требуются дальнейшие исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малиновская, Елена Михайловна, Москва

1. Анисимов, В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. /

2. B.Н. Анисимов С.Петербург: Наука. - 2003.

3. Вейко, Н.Н. Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека: Автореферат дисс. докт. биол. наук / Н.Н. Вейко — ГУ МГНЦ РАМН, Москва 2001.

4. Вейко, Н.Н. Рибосомные гены человека в транскрибируемой области содержат прочно связанные с ДНК белки. / Н.Н. Вейко, Н.А. Ляпунова, А.И. Богуш, Д.М. Спитковский // Молекулярная биология. 1998. - Т.32. - С.629-634.

5. Вейко, Н.Н. Определение количества рибосомных генов в индивидуальных геномах человека./ Н.Н. Вейко, Н.А. Ляпунова, А.И. Богуш, Т.Г. Цветкова, Э.В. Громова // Молекулярная биология. — 1996. -Т.30. -С.1076-1084.

6. С.М. Терехов, Н.О. Шубаева, Т.Д. Смирнова, С.М. Иванова, Н.А. Еголина, Т.Г. Цветкова, Д.М. Спитковский, Н.А. Ляпунова // Молекулярная биология. 2005. - Т.39. - С.264-275.

7. Костюк, С.В. Фрагменты рибосомных генов в составе внеклеточной ДНК факторы стресс — сигнализации: Афтореферат дисс. канд. мед. наук / С.В. Костюк - ГУ МГНЦ РАМН, Москва. - 2007.

8. Квочко, А.Н. Синтез белка в почках мериносовых овец в послеродовом онтогенезе. / А.Н. Квочко // Цитология. 2001. - Т.43, №12. - С.1174-1178.

9. Дерффель, К. Статистика в аналитической химии. / К. Дерффель // Москва: Изд-во «Мир». 1994.

10. Ляпунова, Н.А. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа. / Н.А. Ляпунова, Н.А. Еголина и др. // Биол. мембраны. 2001. - Т. 18. - С. 189199.

11. Оловников, A.M. Редусомная гипотеза старения и контроля биологического времени в индивидуальном развитии. / А.М.Оловников // Биохимия. 2003. - Т.68. - С.7-41.

12. Шубаева, Н.О. Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и интенсивность процессов гибели клеток у больныхревматоидным артритом: Афтореферат дисс. канд. мед. наук / Н.О. Шубаева-ГУ МГНЦРАМН, Москва.-2003.

13. Adams, R.L. DNA methylation in eukaryotes. / R.L. Adams, R.H. Burdon // CRC Crit Rev Biochem. 1982. - V.13, №4. - P.349-384.

14. Akerman, J. Alexis Carrel: Nobel Prize for physiology and medicine, 1912. / J. Akerman // Transplant Proc. 1987. - V. 19, №4. - P.9-11

15. Ames, B.N. Endogenous DNA damage as related to cancer and aging. / B.N. Ames // Mutat Res. 1989. - V.214, № 1. - P.41-46.

16. Attardi, G. Structure and synthesis of ribosomal RNA / G. Attardi, F. Amaldi // Annu. Rev. Biochem. 1970. - V.39. - P.l83-226.

17. Barja, G. Endogenous oxidative stress: relationship to aging, longevity and caloric restriction. / G. Barja // Ageing Res Rev. 2002. - V.l, №3. - P.397-411.

18. Bedard, K. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. / K. Bedard, K.H. Krause // Physiol Rev. -2007. V.87, №1. -P.245-313.

19. Begega, A. Age-related changes of the nucleolar organizer regions without neuron loss in medial mamillary bodies (hypothalamus) in old rats. / A. Begega, M. Cuesta, S. Rubio, L.J. Santin, J.L. Arias // Mech. Ageing Dev. -1999.-V.108,№3.-P.l 13-125.

20. Beneke, S. Poly(ADP-ribosyl)ation in mammalian ageing. / S. Beneke, A. BUrkle // Nucleic Acids Res. 2007. - V.35, №22. - P.7456-7465.

21. Berletch, J.B. A method to study the expression of DNA methyltransferases in aging systems in vitro. / J.B. Berletch, S.M. Phipps, S.L. Walthall, L.G. Andrews, Т.О. Tollefsbol // Methods Mol Biol. 2007a. - V.371. - P.81-87.

22. Berletch, J.B. A method to detect DNA methyltransferase I gene transcription in vitro in aging systems. / J.B. Berletch, L.G. Andrews, Т.О. Tollefsbol // Methods Mol Biol. 2007b. - V.371. - P.73-80.

23. Birnstiel, M.L. Kinetic complexity of RNA molecules. / M.L. Birnstiel, B.H. Sells, I.F. Purdom // Mol. Biol. 1972. - V.63, №1. -P.21-39.

24. Blasco, M.A. Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. / M.A. Blasco // Nat Rev Genet. 2005. - V.6, №8. - P.611-622.

25. Boerrigter, M.E. DNA repair and Alzheimer's disease. / M.E. Boerrigter, J.Y. Wei, J. Vijg // J Gerontol. 1992. - V.47, №6. -P.177-184.

26. Boiteux, S. Properties and biological functions of the NTH and FPG proteins of Escherichia coli: two DNA glycosylases that repair oxidative damage in DNA. / S. Boiteux // J Photochem Photobiol B. 1993. - V.19, №2. - P.87-96.

27. Bonnefoy, M. Antioxidants to slow aging, facts and perspectives. / M. Bonnefoy, J. Drai, T. Kostka // Presse Med. 2002. - V.31, №25. - P.1174-1184.

28. Borsatto, B. Reduction of the activity of ribosomal genes with age in Down's syndrome. / B. Borsatto, M. Smith // Gerontology. 1996. - V.42, №3. -P.147-154.

29. Brash, D.E. DNA damage and repair in vivo. / D.E. Brash, R.W. Hart // J Environ Pathol Toxicol. 1978. -V.2, №1. -P.79-114.

30. Bross, K. On the number of ribosomal RNA genes in man. / K. Bross, W. Krone//Human Genet 1972. - V.l 4. - P. 137-141.

31. Bross, K. Ribosomal cistron and acrocentric chromosomes in man. / K. Bross, W. Krone // Human Genet. 1973. - V.18. - P.71-75.

32. Burkle, A. Physiology and pathophysiology of poly(ADP-ribosyl)ation. / A. Burkle // Bioessays. 2001. - V.23, №9. - P.795-806.

33. Butler, M.G. Effects of age, sex and multiple endocrine neoplasia type-II on silver stained nucleolar organizer regions. / M.G. Butler, J.R. Lane // Mech. Ageing Dev. 1989. - V.47, №1. - P. 17-24.

34. Buys, H.M. Abundance of protein bound sulfhydril- and disulfide group at chromosomal nucleolus organizer regions. / H.M. Buys, J. Osinga // Chromosoma. 1980. - V.77. - P. 1-11.

35. Campisi, J. From cells to organisms: can we learn about aging from cells in culture? / J. Campisi // Exp Gerontol. 2001. - V.36, № 4-6. - P.607-618.

36. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. / J. Campisi // Cell. 2005. -V. 120, №4. - P.513-522.

37. Carrard, G. Impairment of proteasome structure and function in aging. / G. Carrard, A.L. Bulteau, I. Petropoulos, B. Friguet // Int J Biochem Cell Biol. — 2002. V.34, № 11. - P.461 -474.

38. Ceriello, A. Oxidative stress and glycemic regulation. / A. Ceriello // Metabolism. 2000. - V.49, №2. - P.27-29.

39. Cote, B.D. Quantitation of in situ hybridization of ribosomal ribonucleic acids to human diploid cells. / B.D. Cote, O.C. Uhlenbeck, D.M. Steffensen // Chromosoma. 1980. - V.80. - P.349-357.

40. Cristofalo, V.J. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: A revaluation. / V.J. Cristofalo, R.G. Allen, R.J. Pignolo, B.G. Martin, J.C. Beck // PNAS USA. 1998. - V.95. - P.10614-10619.

41. Cutler, R.G. Oxidative stress and aging: catalase is a longevity determinant enzyme. / R.G. Cutler // Rejuvenation Res. 2005. - V.8, №3. - P.138-140.

42. Dante, R. Methylation of the 5r flankihg sequences of the ribosomal DNA human cell lines and in a human-hamster hybrid cell line. / R. Dante, M.E. Percy, A. Baldini et al. // Cell Biochem. 1992. - V.50. - P.357-362.

43. Denton, Т.Е. The relationship between aging and ribosomal gene activity in humans as evidenced by silver staining, f Т.Е. Denton, S.L. Liem, K.M. Cheng, J.V. Barrett // Mech. Ageing Dev. 1981. - V. 15, № 1. - P. 1 -7.

44. Dittes, H. Biochemical and cytogenetic studies on the nucleolus organizing regions (NOR) of man. II. A family with the 15/21 translocation. / H. Dittes, W. Krone, K. Bross, M. Schmid, W. Vogel // Human Genet. 1975. - V.26, №1. -P.47-59.

45. Duan, J. Irreversible cellular senescence induced by prolonged exposure to H2O2 involves DNA-damage-and-repair genes and telomere shortening. / J. Duan, J. Duan, Z. Zhang, T. Tong // Int J Biochem Cell Biol. 2005. - V.37. -P.1407-1420.

46. Evans, H.J. Location of the genes coding for 18S and 28S ribosomal RNA in the human genome. / H.J. Evans, R.A. Buckland, M.L. Pardue // Chromosoma.- 1974.-V.48.-P. 405-426.

47. Facchini, F.S. Hyperinsulinemia: the missing link among oxidative stress and age-related diseases? / F.S. Facchini, N.W. Hua, G.M. Reaven, R.A. Stoohs // Free Radic Biol Med. 2000. - V.29, № 12. - P.1302-1306.

48. Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. / S. Fakan // Methods Achiev. Exp. Pathol. 1986. - V.l2. - P. 105-140.

49. Fusco, D. Effects of antioxidant supplementation on the aging process. / D. Fusco, G. Colloca, M.R. Lo Monaco, M. Cesari // Clin Interv Aging. 2007. -V.2, № 3. - P.377-387.

50. Fuster, J.J. Telomere biology and cardiovascular disease. / J.J. Fuster, V. Andres // Circ Res. 2006. - V.99. - P. 1167-1180.

51. Gahan, P.B. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments. / P.B. Gahan, R. Swaminathan // Ann N Y Acad Sci. 2008. -V.l 137. — P.1-6.

52. Garcia Moreno, L.M. NOR activity in hippocampal areas during the postnatal development and ageing. / L.M. Garcia Moreno, J.M. Cimadevilla, H. Gonzalez Pardo, M.C. Zahonero, J.L. Arias // Mech. Ageing Dev. 1997. -V.9, №2. -P. 173-181.

53. Gaubatz, J. Hybridization of ribosomal RNA labeled to high specific radioactivity with dimethyl sulfate. / J. Gaubatz, R.G. Cutler // Biochemistry. — 1975. V.14. - P.760-765.

54. Gaubatz, J. Ribosomal RNA gene dosage as a function of tissue and age for mouse and human. / J. Gaubatz, N. Prashad, R.G. Cutler // Biochim Biophys Acta. 1976. - V.418, №3. - P.358-375.

55. Gerson, S.L. DNA repair in stem cell maintenance and conversion to cancer stem cells. / S.L. Gerson, J. Reese, J. Kenyon // Ernst Schering Found Symp Proc. 2006. - V.5. - P.231-244.

56. Goessens, G. The nucleolus-organizing regions (NORs): recent data and hypotheses. / G. Goessens, A. Lepoint // Biol. Cell. 1979. - V.35. - P.211-220.

57. Goessens, G. Relations between fibrillar centres and nucleolus-associated chromatin in Ehrlich tumour cells. / G. Goessens // Cell Biol. Int. Rep. 1979.- V.3, №4. P.337-43.

58. Goessens, G. Nucleolar structure. / G. Goessens // Int. Rev. Cytol. 1984. -V.87. -P.107-158.

59. Goodpasture, C. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. / C. Goodpasture, S.E. Bloom // Chromosoma. 1975. - V.53. -P.37-50.

60. Green, D.R. A matter of life and death. / D.R. Green, G.I. Evan // Cancer Cell.- 2002. V.l, №1. — P.19-30.

61. Halle, J.P. Copy number, epigenetic state and expression of the rRNA genes in young and senescent rat embryo fibroblasts. / J.P. Halle, S. Muller, A. Simm, G. Adam // Eur J Cell Biol. -1997. V.74, №3. - P.281-288.

62. Harley, C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? / C.B. Harley //MutatRes. 1991. - V.256, № 2-6. -P.271-282.

63. Harman, D. Free radical theory of aging: history. / D. Harman // EXS. 1992. -V.62.-P.1-10.

64. Hayflick, L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell srtains. / L. Hayflick // Exp Cell Res. 1965. - V. 37. - P.614-636.

65. Houben, J.M. Telomere length assessment: biomarker of chronic oxidative stress? / J.M. Houben, H.J. Moonen, F.J. van Schooten, G.J. Hageman // Free Radic Biol Med. 2008. - V.44, №3. - P.23 5-246.

66. Howell, W.M. Chromosome core structure revealed by silver staining. / W.M. Howell, T.C. Hsu // Chromosoma. 1979. - V.73, №1. -P.61-66.

67. Hozak, P. Three-dimensional reconstructions of nucleolus-organizing regions in PHA-stimulated human lymphocytes. / P. Hozak, J.T. Novak, K. Smetana // Biol. Cell. 1989. - V.66, №3. -P.225-33.

68. Hozak, P. Site of transcription of ribosomal RNA and intranucleolar structure in HeLa cells. / P. Hozak, P.R. Cook, C. Schofer, W. Mosgoller, F. Wachtler // J. Cell Sci. 1994. - V. 107, №2. - P.639-648.

69. Huard, S. Targeting human telomerase in cancer therapy. / S. Huard, C. Autexier // Curr Med Chem Anticancer Agents. 2002. - V.2, № 5. - P.577-587.

70. Johnson, L.K. Cardiac hypertrophy, aging and changes in cardiac ribosomal RNA gene dosage in man. / L.K. Johnson, R.W. Johnson, B.L. Strehler // Mol Cell Cardiol. 1975. - V.7, №2. - P.125-133.

71. Kirsch-Volders, M. Telomere and centromere association tendencies in the human male metaphase complement. / M. Kirsch-Volders, L. Hens, C. Susanne // Human Genet. 1980. - V.54. - P.69-77.

72. Kirkwood, T.B. Understanding the odd science of aging. / T.B. Kirkwood // Cell. 2005. -V. 120, № 4. - P.437-447.

73. Krause, K.H. Aging: a revisited theory based on free radicals generated by NOX family NADPH oxidases. / K.H. Krause // Exp Gerontol. 2007. - V.42, № 4. - P.256-262.

74. Kuo, B.A. Human ribosomal RNA variants from a single individual and their expression in different tissues. / B.A. Kuo, I.L. Gonzalez, D.A. Gillespie, J.E. Sylvester // Nucleic. Acids Research. 1996. - V.24, №23. - P.4817-4824.

75. Lee, H.C. Oxidative stress, mitochondrial DNA mutation, and apoptosis in aging. / H.C. Lee, Y.H. Wei // Exp Biol Med (Maywood). 2007. - V.232, № 5. - P.592-606.

76. Lezhava, T.A. The activity of nucleolar organizer regions of human chromosomes in extreme old age. / T.A. Lezhava // Gerontology. 1984. — V.30, №2. - P.94-99.

77. Long, E.O. Repeated genes in eukaryotes. / E.O. Long, I.B. Dawid // Ann. Rev. Biochem. 1980. - V.49. - P.727-764.

78. Machwe, A. I. Accelerated methylation of ribosomal RNA genesduring the cellular senescence of Werner syndrome fibroblasts. / A. Machwe, D.K. Orren, V.A. Bohr // Faseb. 2000. - V.14. - P. 1715-1724.

79. McKay, J.A. Folate and DNA methylation during in utero development and aging. / J.A. McKay, E.A. Williams, J.C. Mathers // Biochem Soc Trans. -2004. V.32, №6. - P. 1006-1007.

80. Medvedev, Z.A. Possible role of repeated nucleotide sequences in DNA in the evolution of life spans of differentiated cells. / Z.A. Medvedev // Nature. — 1972. V.237, № 5356. - P.453-454.

81. Meissner, C.Z. Mutations of mitochondrial DNA cause or consequence of the ageing process? / C.Z. Meissner // Gerontol Geriatr. - 2007. - V.40, № 5. -P.325-333.

82. Mikelsaar, A.V. Populational polymorphisms in silver staining of nucleolus organizer regions (NORs) in human acrocentric chromosomes. / A.Y. Mikelsaar, T. IIus // Human Genet. 1979. - V.51. - P.281-285.

83. Miller, D.A. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells / D.A. Miller, V.G. Dev, R. Tantravahi, O.J. Miller // Exp. Cell Res. 1976. - V. 101. - P.235-243.

84. Miller, D.A. Regulation of rDNA genes expression in a human 14p+ marker chromosome. / D.A. Miller, W.R. Breg, D. Warburton, Y.G. Dev, O.J. Miller // Human Genet. 1978. - V.43. - P.289-297.

85. Monti, D. Apoptosis—programmed cell death: a role in the aging process? / D. Monti, L. Troiano, F. Tropea, E. Grassilli et al. // Am J Clin Nutr. 1992. -V.55, №6. - P.1208-1214.

86. Morley, A. Somatic mutation and aging. / A. Morley // Ann N Y Acad Sci. -1998. V.20, №854. - P.20-22.

87. Mosgoeller, W. Ribosomal gene transcription is organized in foci within nucleolar components. / W. Mosgoeller, C. Schofer, J. Wesierska-Gadek, M.

88. Steiner, M. Muller, F. Wachtler // Histochem. Cell Biol. 1998. - V.109, №2.t- P.l 11-118.

89. Muiras, M.L. Lack of association between human longevity and genetic polymorphisms in drug-metabolizing enzymes at the NAT2, GSTM1 and

90. CYP2D6 loci. / M.L. Muiras, P. Verasdonck, F. Cottet, F. Schachter // Hum Genet. 1998. - V. 102, №5. - P.526-532.

91. Mullaart, E. DNA damage metabolism and aging. / E. Mullaart, P.H. Lohman, F. Berends, J. Vijg // Mutat Res. 1990. - V.237, №5-6. - P. 189-210.

92. Nass, N. Advanced glycation end products, diabetes and ageing. / N. Nass, B. Bartling et al. // Z Gerontol Geriatr. 2007. - V40, № 5. - P.349-356.

93. Nystrom, T. Conditional senescence in bacteria: death of the immortals. / T. Nystrom // Mol Microbiol. 2003. - V.48, №1. - P. 17-23.

94. Oakes, C.C. Aging results in hypermethylation of ribosomal DNA in sperm and liver of male rats. / C.C. Oakes, D.J. Smiraglia, C. Plass, J.M. Trasler, B. Robaire // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. - V.100, №4. P. 17751780.

95. Ohmura, H. Telomere, cellular senescence and transformation. / H. Ohmura, M. Oshimura //Nippon Rinsho. 1993. - V.51, № 7. - P. 1899-1906.

96. Olert, J. Cytological and histochemical studies on the selective silver staining of nucleolus organizer regions (NOR). / J. Olert, G. Sawaitzki, H. Klin, J. Gebauer // Histochem. 1979. -V.60. -P.91-99.

97. Ono, T. Absence of gross change in primary DNA sequence during aging process of mice. / T. Ono, S. Okada, T. Kawakami, T. Honjo, M. Getz // Mech Ageing Dev. 1985. - V.32. - P. 227-234.

98. Payao, S.L. Ribosomal RNA in Alzheimer's disease and aging. / S.L. Payao, M.A. Smith, L.M. Winter, P.H. Bertolucci // Mech. Ageing Dev. -1998. V.105, №3. - P.265-272.

99. Rea, I.M. Paraoxonase polymorphisms PON1 192 and 55 and longevity in Italian centenarians and Irish nonagenarians. A pooled analysis. / I.M. Rea, P.P. McKeown, D. McMaster, I.S. Young et al. // Exp Gerontol. 2004. -V.39, №4. - P.629-635.

100. Pedrazzini, E. Age related decrease of NOR activity in bone marrow metaphase chromosomes from healthy individuals. / E. Pedrazzini, N. Mamaev, I. Slavutsky // Mol. Pathol. 1998. - V.51, №1. - P.39-42.

101. Peterson, C.R. Constancy of ribosomal RNA genes during aging of mouse heart cells and during serial passage of WI-38 cells. / C.R. Peterson, J.R. Cryar, J.W. Gaubatz // Arch Gerontol Geriatr. 1984. - V.3, №2. -P.l 15-125.

102. Petriv, O.I. Lack of peroxisomal catalase causes a progeric phenotype in Caenorhabditis elegans. / O.I. Petriv, R.A. Rachubinski // J Biol Chem. 2004. - V.279, №19. - P. 19996-20001.

103. Richardson, B. Impact of aging on DNA methylation. / B. Richardson // Ageing Res Rev. 2003. - V.2, №3. - P.245-261.

104. Serman, A. DNA methylation as a regulatory mechanism for gene expression in mammals. / A. Serman, M. Vlahovic, L. Serman, F. Bulic-Jakus // Coll Antropol. 2006. - V.30, №3. - P.665-671.

105. Shay, J.W. Use of telomerase to create bioengineered tissues. / J.W. Shay, W.E. Wright // Ann N Y Acad Sci. 2005. - V.l057. - P.479-491.

106. Shay, J.W. Hallmarks of telomeres in ageing research. / J.W. Shay, W.E. Wright // J Pathol. 2007. - V.211, № 2. - P.l 14-123.

107. Shi, H. CpG islands: their potential as biomarkers for cancer. / H. Shi, M.X. Wang, C.W. Caldwell // Expert Rev Mol Diagn. 2007. - V.7, № 5. -P.519-531.

108. Skulachev, V.P. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms. / V.P. Skulachev // Mol Aspects Med. 1999. - V.20, № 3. - P. 139-184.

109. Soti, С. Molecular chaperones and the aging process. / C. Soti, P. Csermely // Biogerontology. 2000. - V.l, №3. - P.225-233.

110. Soti, C. Aging and molecular chaperones. / C. Soti, P. Csermely // Exp Gerontol. -2003. -V.38, №10. P. 1037-1040.

111. Soti, C. Apoptosis, necrosis and cellular senescence: chaperone occupancy as a potential switch. / C. Soti, A.S. Sreedhar, P. Csermely // Aging Cell. 2003. - V.2, № 1. - P.39-45.

112. Squier, T.C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. / T.C. Squier // Exp Gerontol. 2001. - V.36, №9. - P. 1539-1550.

113. Staniszewska, M. Biochemical properties and clinical significance of protein glycation products. / M. Staniszewska, A. Gamian // Postepy Hig Med Dosw. 2003. - V.57, № 2. - P.123-147.

114. Stevnsner, T. Repair of ribosomal RNA genes in hamster cells after UV irradiation, or treatment with cisplatin or alkylating agents. / T. Stevnsner, A. May, L.N. Petersen et al. // Carcinogenesis. 1993. - V. 14. - P. 1591-1596.

115. Strehler, B.L. Roles and mechanisms of rDNA changes during aging. / B.L. Strehler // Birth Defects Orig. Artie. Ser. 1978. - V.14, № 1. - P.449-462.

116. Strehler, B.L. Loss of hybridizable ribosomal DNA from human postmitotic tissues during aging: I. Age-dependent loss in human myocardium. / B.L. Strehler, M.P. Chang, L.K. Johnson // Mech Ageing Dev. 1979a. -V.l 1, №5-6. - P.371-378.

117. Thiry, M. Ultrastructural study of the relationships between the various nucleolar components in Ehrlich tumour and HEp-2 cell nucleoli after acetylation. / M. Thiry, G. Goessens // Exp. Cell Res. 1986. - V.164, №1. -P.232-242.

118. Thomas, S. A longitudinal study of human age-related ribosomal RNA gene activity as detected by silver-stained NORs. / S. Thomas, A.B. Mukherjee // Mech. Ageing Dev. 1996. - V.92, № 2-3. - P. 101 -109.

119. Thorpe, S.R. Role of the Maillard reaction in diabetes mellitus and diseases of aging. / S.R. Thorpe, J.W. Baynes // Drugs Aging. 1996. - V.9, № 2. -P.69-77.

120. Tritschler, H.J. Mitochondrial DNA alterations as a source of human disorders. / H.J. Tritschler, R. Medori // Neurology. 1993. - V.43, № 2. -P.280-288.

121. Tong, T.J. Mechanisms of aging and its theories. / T.J. Tong, Z.Y. Zhang // Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. 2007. - V.38, № 1. - P. 14-18.

122. Van Dyke, D.L. Chromosome polymorphism and twin zygosity. / D.L. Van Dyke, C.G. Palmer, W.E. Nance, P.L. Yu // Human Genet. 1977. -V.29.-P.431-437.

123. Vaniushin, B.F. DNA methylation and epigenetics. / B.F. Vaniushin // Genetika. 2006. - V.42, № 9. - P. 1186-1199.

124. Varley, J.M. Patterns of silver staining of human chromosomes. / J.M. Varley // Chromosoma. 1977. - V.61. -P.207-214.

125. Vijg, J. Somatic mutations and aging: a re-evaluation. / J. Vijg // Mutat Res. -2000. V.447, № 1. - P. 117-135.

126. Wachtler, F. Nucleolar changes in human phytohaemagglutinin-stimulated lymphocytes. / F. Wachtler, A. Ellinger, H.G. Schwarzacher // Cell Tissue Res. 1980. - V.213, №2. - P.351-60.

127. Wallace, D.C. Mitochondrial diseases in man and mouse. / D.C. Wallace // Science. 1999. V.283, № 5407. - P. 1482-1488.

128. Warner, H.R. Involvement of DNA repair in cancer and aging. / H.R. Warner, A.R. Price // J Gerontol. 1989. - V.44, № 6. - P.45-54.

129. Warner, H.R. Aging and regulation of apoptosis. / H.R. Warner // Curr Top Cell Regul. 1997. -V.35. - P. 107-121.

130. Wei, Y.H. Oxidative stress and mitochondrial DNA mutations in human aging. / Y.H. Wei // Proc Soc Exp Biol Med. 1998. - V.217, №1. - P.53-63.

131. Yankiwski, V. Nuclear structure in normal and Bloom syndrome cells. / V. Yankiwski, R.A. Marciniak, L. Guarente, N.F. Neff// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. - P.5214-5219.

132. Yoder, F.E. Cytogenetic and linkage studies of a familial 15pplus variant. / F.E. Yoder, W.B. Bias et al. // Human Genet. 1974. - V.26. -P.535-548.

133. Young, B.D. A new estimate of human ribosomal gene member. / B.D. Young, A. Hell, G.D. Birnie // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.454. -P.535-548.

134. Zafiropoulos, A. Preferential loss of 5S and 28S rDNA genes in human adipose tissue during ageing / A. Zafiropoulos, E. Tsentelierou, M. Linardakis, A. Kafatos, D.A. Spandidos // Biochem. Cell Biol. 2005. - V.37, №.2. -P.409-415.

Информация о работе

Малиновская, Елена Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы