Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вовлеченность полиморфизмов некоторых структурных генов и функциональной активности рибосмных генов в формирование вентральных грыж у человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Вовлеченность полиморфизмов некоторых структурных генов и функциональной активности рибосмных генов в формирование вентральных грыж у человека"

На правах рукописи

Барт Илья Иванович

ВОВЛЕЧЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ В ФОРМИРОВАНИЕ ВЕНТРАЛЬНЫХ ГРЫЖ У ЧЕЛОВЕКА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005059089

Белгород - 2013

е иди ш

005059089

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Научный руководитель:

Иванов Владимир Петрович

заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Асанов Алий Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России, заведующий кафедрой медицинской генетики

Должиков Александр Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ, заведующий кафедрой анатомии и гистологии человека

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита диссертации состоится Ж ¿/^Х_2013 года в ""»^асов на

заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ.

Автореферат разослан»*^ г!/-^ 2013 года

Ученый секретарь совета по защите диссерта,,,"'і на соискание ученой степени кандидата наук, ученой степени доктора наук, д.б.н.

В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы ' Послеоперационная вентральная грыжа является самым распространенным послеоперационным осложнением абдоминальной хирургии, достигая 20% уровня после срединной лапаротомии. Рядом рандомизированных исследований показано, что после аутопластики грыжевых выпячиваний около 50% послеоперационных грыж рецидивируют. В связи с этим пациенты вынуждены переносить очередное оперативное вмешательство, что сопровождается дополнительными рисками (Ноег J et al., 2002).

Одна из основных проблем возникновения вентральных грыж, в частности послеоперационного грыжеобразования, заключается в отсутствии достоверных прогностических признаков появления данного заболевания. В связи с этим нас заинтересовали более глубокие механизмы патогенеза, механизмы, лежащие на генном уровне.

Ранее некоторые хирурги по ходу выполнения своих исследований, ставили перед собой одну из целей — изучение экспрессии ряда генов, и получали положительные результаты. Так, например, U. Klinge, V. Schumpelick (2001) нашли повышение количества коллагена III типа с одновременным снижением соотношения коллаген 1 / коллаген III за счет повышения последнего у больных с послеоперационными и, особенно, рецидивными грыжами по сравнению с контролем более чем в два раза. Из наших соотечественников данной проблемой занимался профессор A.A. Гостевской (2008), он описал достоверное увеличение экспрессии гена коллагена III и соотношения коллагенов III/I у больных с клиническими признаками неспецифической дисплазии соединительной ткани выявлено по сравнению с контролем. Кроме того, выявлено достоверное увеличение продукции ММР I у больных с послеоперационными вентральными грыжами (Гостевской A.A., 2008).

При этом в научной литературе отсутствуют комплексные исследования генетических аспектов послеоперационного грыжеобразования в частности и всех вентральных грыж в целом.

Цель исследования

Изучить функциональную активность рибосомных генов и полиморфизм некоторых структурных генов и их вовлеченность в формирование вентральных грыж у человека.

Задачи исследования

1. Изучить соотношение коллагенов I и III типов в коже и апоневрозе у людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы.

2. Изучить функциональную активность рибосомных генов в группе людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы.

3. Изучить полиморфизм генов матриксных металлопротеиназ и генов цитокинового ряда в группе людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы.

4. Изучить комплексное влияние и взаимовлияние полиморфизмов исследуемых генов и функциональной активности рибосомных генов на формирование вентральных грыж.

5. На базе полученных данных разработать метод прогнозирования вентральных грыж и рекомендации по профилактике вентральных грыж с использованием молекулярно-генетических и цитогенетических подходов.

Новизна исследования

Впервые осуществлен комплексный подход, заключающийся в анализе клинических, морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических факторов такого значимого, распространенного и опасного осложнения, как послеоперационная вентральная грыжа в частности и все вентральные грыжи в общем. Установлено, что отношение типов коллагена I к коллагену III у больных с вентральными грыжами было в 2 раза меньше, чем у лиц без вентральных грыж. Установлены взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных с риском развития заболевания, у больных с вентральными грыжами была достоверно снижена функциональная активность рибосомных генов за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы О. Помимо этого, реализованный в настоящей работе комплексный подход, включающий стандартные методы генетической эпидемиологии, статистической генетики и компьютерного моделирования, позволил установить 3 генетических маркера предрасположенности к грыжеобразованию: ММРЗ -1171 5А->6А, ТОРВ1 С-509Т, БОБ А+6Ю. Данные нашего исследования наглядно демонстрируют наличие индивидуальных генетических особенностей, формирующих норму реакции организма, реализующуюся в условиях воздействия стрессорного фактора в отношении грыжеобразования.

Практическая значимость работы

Полученные в ходе исследования данные о взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных генов, результаты типирования полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ и цитокинов открывают перспективы для превентивной диагностики послеоперационных осложнений. С учетом того, что ранее не было комплексных генетических исследований причин возникновения вентральных грыж, данное исследование открывает перспективы для дальнейшего более углубленного и более точного исследования генетических детерминант развития вышеописанного заболевания.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: 75-й итоговой Всероссийской конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Курск, 2010), 76-й итоговой Всероссийской конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Курск, 2011), IV международном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2011), пятидесятой юбилейной международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2012), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 2013).

Личный вклад автора

Автором лично определены цели и задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведено клиническое обследование всех больных вентральными грыжами. Автор проводил контроль результатов морфологического исследования, лично выполнял цитогенетическое и молекулярно-генетическое исследования, проводил обработку, анализ и обобщение полученных результатов, апробацию результатов исследования, подготовку основных публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных с вентральными грыжами определяется достоверное снижение соотношения коллагенов 1/1И типа в коже и апоневрозе в сравнении с пациентами контрольной группы.

2. При всех клинических формах вентральных грыж наблюдается снижение функциональной активности рибосомных генов в сравнении с контролем. Доказано, что снижение происходит за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы О, что может служить прогностическим признаком для послеоперационного грыжеобразования.

3. Полиморфизмы генов ММРЗ -1171 5А->6А, ТОРВ1 С-509Т, ЕОР А+6Ю достоверно ассоциированы с развитием вентральных грыж.

4. Разработаны метод прогнозирования и практические рекомендации для превентивной диагностики послеоперационного грыжеобразования.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в работу Курской областной клинической больницы, лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета и лаборатории «Генетика» Курского государственного университета, а также в учебный процесс на кафедре хирургических болезней № 1.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 14 рисунков. Библиографический список используемой литературы включает 187 источников, из которых 100 зарубежные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика выборки

Материалом для исследования послужила выборка из 313 пациентов.

Группа больных с вентральными грыжами включала 156 человек. Из них 122 женщины и 34 мужчины. Средний возраст больных составил 54,4 ± 10,9 года. Преобладающей возрастной группой были люди от 51 до 60 лет (59 человек). Вторыми по величине были возрастные группы 41-50 лет и 61-70 лет, по 21,2% и 23,1% соответственно. 9% и 7,8% составили больные в возрасте 3140 лет и 71 год и более лет соответственно. Самой наименьшей возрастной группой была группа больных моложе 30 лет, в нее вошли всего 2 человека (1,2%). Все они представители русской национальности, уроженцы Курской области, находились на лечении в клинике хирургических болезней № 1 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России на базе БМУ «КОКБ» с 2009 по 2012 гг. Забор материала проводился на месте.

Контрольная группа составила 157 человек. В нее вошли люди без грыжевой болезни, без тяжелых соматических патологий, таких как онкологические заболевания, сахарный диабет, тяжелые формы ишемической болезни сердца (в том числе инфаркты миокарда), артериальной гипертензии и др. Из них 125 женщин и 32 мужчины. Средний возраст их составил 51,2 ± 12,6 года. Преобладающей возрастной группой, так же как и в экспериментальной группе, были лица 51-60 лет (49 человек). Контрольная группа сформирована из 82 человек, находившихся на стационарном лечении в отделении общей хирургии, и 74 человек, ДНК которых было взято из биобанка кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Клиническая характеристика

Формирование выборки осуществлялось сплошным методом, по мере поступления больных в отделение общей хирургии КОКБ на протяжении 20092012 гг. В экспериментальную группу включались пациенты с вентральными грыжами, из которых 109 (70%) человек имели послеоперационные вентральные грыжи, в меньшей степени пупочные грыжи — 34 (21,6%) человека, и самая немногочисленная группа - это больные, находившиеся на лечении по поводу грыжи белой линии живота — 13 (8,4% человек). Все вентральные грыжи были разделены по размеру на малые, средние и большие (эта группа объединила в себе и большие, и гигантские). Из них больших и гигантских - 40%, средних - 38% и малых - 22%.

В связи с подавляющим большинством послеоперационных грыж в структуре заболеваемости вентральными грыжами, они и представляли для нас наибольший интерес. Больные с пупочными грыжами и грыжами белой линии живота были объединены в одну немногочисленную группу — «прочие грыжи».

Методы исследования

Клннико-анамнестический метод

Всем пациентам проводилось стандартное клиническое обследование для верификации диагноза «вентральная грыжа». Экспериментальную группу составили пациенты с диагнозами послеоперационная вентральная грыжа, грыжа белой линии живота и пупочная грыжа.

У всех обследованных пациентов производился забор венозной крови.

Молекулярно-генетический и цитогенетический анализ проводился на базах научно-исследовательской лаборатории «Генетика» Курского государственного университета и лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета.

Морфогистологический метод

Всем больным интраоперационно производилась биопсия кожи из области операционного доступа: после рассечения кожи, ее край фиксировали хирургическим пинцетом. Скальпелем иссекали один кожный фрагмент размером 4,0 X 4,0 мм, глубиной на всю толщу кожи (без подкожной клетчатки). Биопсию апоневроза выполняли следующим образом: после рассечения кожи, подкожно-жировой клетчатки, выделяли область грыжевого мешка. После его иссечения от края апоневроза брали фрагмент размером 4,0 X 4,0 мм. Полученные препараты помещали в приготовленный заранее стеклянный контейнер с 10% раствором формалина, полностью покрывающим препарат, и закрывали герметичной резиновой пробкой. После 24-часовой экспозиции в растворе формалина, биоптат заключали в парафиновый блок по схеме Меркулова. Полученный препарат нарезали на микротоме (сечение 5 (дт), фиксировали на предметном стекле и окрашивали красителем Sirius Red (сириус красный). После чего препарат исследовали в обычном и поляризованном свете с использованием поляризационного микроскопа Altami Polar 2, увеличение хЮО, х250 и х400, хбЗО, а также водной иммерсии.

Применялась вставка в окуляр, ограничивающая поле зрения. Фотосъемка микропрепаратов осуществлялась с использованием цифровой окулярной камеры Altami 3 Мрх, выполнялась съемка 10 полей зрения при различном увеличении.

Оценка соотношения типов коллагена (ТК) основывалась на отличиях в цветовой гамме, характерной для каждого типа и переходных форм: I тип коллагена - красный, III тип коллагена - зеленый. Определение соотношения коллагена I и III типов осуществлялось с использованием программного комплекса Altami Studio 3.0 и ImageJ 1,47а, на основании изучения цветовой гистограммы выбранного участка в каждом поле зрения. Выделение цветовых диапазонов проводилось на основе гистограммы каждого из цветов. Абсолютные значения красного и зеленого цветов спектра, получаемые посредством визуально-программных комплексов для каждого поля зрения, переводились в относительные с учетом стандартного отклонения. В последующем рассчитывалась величина соотношения ТК.

Цитогенетический метод

Получение цитогенетических препаратов проводили с помощью микрометода из лимфоцитов периферической крови человека (Захаров А.Ф., 1982). Обработка культур лимфоцитов и приготовление из них препаратов метафазных хромосом осуществлялись с применением ряда последовательных методических процедур: колхицинизации, гипотонизации культур, фиксации клеток смесью этилового спирта с уксусной кислотой, нанесения клеточной взвеси на предметные стекла (Захаров А.Ф., 1982).

Для выявления районов ядрышковых организаторов использовался метод дифференциальной окраски хромосом нитратом серебра, предложенный Howell и Black, с некоторыми модификациями (Сабанаева Е.В., 1989; Howell W.M., 1975; Howell W.M., 1977). Для каждого случая средний показатель суммарной активности 10 ЯОР рассчитывался без кариотипирования хромосом в 20 клетках. Количество активных РГ лимфоцитов периферической крови оценивалось визуально по пятибалльной шкале. Для анализа отбирались метафазные пластинки с завершенной Ag-окраской (Стабровская Н.В., 2010).

Молекулярно-генетические методы

У обследуемых проводился забор крови из кубитальной вены в пластиковые пробирки с 0,5 М раствором ЭДТА (рН=7,8) в количестве 5 мл. Потом кровь замораживали и хранили при —20°С.

Выделение ДНК производилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции из замороженной венозной крови (Маниатис Т., Фрич Э., 1984). В рамках настоящего исследования было генотипировано 6 полиморфных вариантов 6 генов, четыре из которых являются генами цитокинового ряда: TGFB1 С-509Т, ICAM-1 Lys469Glu, TNF -238 G>A, EGF A+61G и два гена коллагеназ: ММРЗ -1171 5А->6А, MMP9 С-1562Т.

Амплификацию фрагментов ДНК проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Рестрикция амплифицированных фрагментов (5-10 мкл амплификата) производилась с помощью эндонуклеаз. Реакция протекала в присутствии буферов и при 8

температурных условиях, рекомендованных производителями эндонуклеаз -ОАО «Сибэнзим». Продукты рестрикции фракционировались с помощью электрофореза в агарозных гелях различной концентрации и окрашивались в этидиумбромиде. Образовавшиеся в результате структуры визуализировались в проходящем УФ-свете на приборе GDS-8000 ("UVP", США) и программного аналитического пакета LabWorksTM V 4.5 (США).

Статистические методы

Статистический анализ полученных данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 фирмы StatSoft Inc.

(США) и MS Excel.

Обработка цитогенетических данных осуществлялась по стандартным методикам вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990; Реброва О.Ю.; 2006,

Урбах В.Ю., 1975).

Прежде всего был проведен анализ характера распределения признаков в рассматриваемой выборке с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и по Шапиро-Уилку. Отклонения считались статистически значимыми при р<0,05.

Так как распределение количественных признаков в большинстве случаев не отклонялось от нормального, то при их описании использовались методы параметрической статистики: расчет среднего значения, среднеквадратичного отклонения, 95% доверительного интервала для среднего значения, минимального и максимального значения признака, медианы, верхнего и нижнего квартиля (Реброва О.Ю., 2006). При обработке качественных показателей вычислялись: размер выборочной доли в процентах и ошибка выборочной доли. Для проверки достоверности различий между совокупностями использовался непараметрический критерий Манна-Уитни (Реброва О.Ю., 2006). Для выявления связей между количественными, а также порядковыми качественными признаками использовался корреляционный анализ, по методу Спирмена. Для анализа влияния рассматриваемых полиморфизмов на уровень показателей ФАРГ, использовали однофакторный

дисперсионный анализ.

Анализ влияния парных сочетаний рассматриваемых полиморфизмов на показатели уровня ФАРГ проводили с помощью многофакторного анализа.

Для оценки соответствия распределений генотипов и для сравнения частот аллелей и генотипов в выборках больных и здоровых людей использовали критерий Хи-квадрат Пирсона с поправкой Иетса на непрерывность. Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei, а относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) по формуле:

D=(H0 - Не) / Не, где НО и Не - наблюдаемая и ожидаемая

гетерозиготность соответственно.

Частоты гаплотипов рассчитывали с помощью программы EH (Rockefeller University, США). Гаметические корреляции и величины неравновесия по сцеплению между парами ДНК-маркеров проводилась по W.G. Hill (Hill W.G., 1974). Гаметические корреляции рассчитывались методом максимального правдоподобия исходя из частот генотипов в таблицах сопряжения 3x3 при

9

условии кодоминирования между оцениваемыми полиморфизмами отдельного гена. Для оценки величины неравновесия по сцеплению между парами ДНК-маркеров использовали нестандартизированный коэффициент Б - показатель, отражающий различия между наблюдаемыми и ожидаемыми отношениями гаплотипов специфических аллелей двух локусов при нулевой гипотезе о независимости их наследования (ЯоЬЫпз Я.В., 1998; Ье\уоШт Я.С., 1988). Уровень статистической значимости для Б рассчитывали с помощью критерия Хи-квадрат для таблицы сопряженности 2x2 при НО независимости наследования аллелей.

Для сравнения частот аллелей и генотипов между группами больных и здоровых людей также использовали критерий Хи-квадрат с поправкой Йетса на непрерывность (Пузырев В.П., Фрейдин М.Б. и др., 2009). Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к вентральным грыжам судили по величине отношения шансов (ОЯ) (Реагсе N.. 1993; Реброва О.Ю., 2003) - показателю, отражающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе «случай» (больные) отличается от вероятности оказаться в группе «контроль» (здоровые) для носителя изучаемого генотипа: ОЯ = (А/В)/(С/П), где А и В - количество больных, имеющих и не имеющих вариантный аллель или генотип соответственно; О и С - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих вариантный аллель или генотип соответственно. Если ОЯ=1 - говорили об отсутствии ассоциации; ОЯ>1 - наличие положительной ассоциации ДНК-маркера «фактор риска» и болезни; ОЯ<1 - отрицательные ассоциации ДНК-маркера «фактор устойчивости» с заболеванием.

Для анализа влияния парных сочетаний генотипов на показатели комплекса ФАРГ был использован двухфакторный дисперсионный анализ.

Во всех случаях уровень статистической значимости принимали за 95% (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфологическое исследование образцов кожи и апоневроза

В приведенной ниже таблице 1 представлены результаты морфологического исследования кожи у пациентов с вентральными грыжами и пациентов контрольной группы - без грыжевой болезни. Также были составлены пропорции соотношения коллагена I типа к коллагену III типа.

Таблица 1

Характеристика коллагена I и III типа в коже у больных исследуемой ____и контрольной групп _

Группа Коллаген I типа Коллаген III типа Соотношение коллагена I и III типа

Больные с грыжами N=46 51,48±1,83* 48,52±1,83* 1,06±0,1

Контрольная группа ^ 49 69,07±2,66* 30,93±2,66* 2,26±0,29

Примечание. *-р<0,05

При исследовании гистологических препаратов кожи у больных 1 группы (исследуемой) было установлено, что среднее содержание коллагена I и III типа составляет 51,48±1,83% и 48,52±1,83% соответственно.

Были изучены гистологические препараты образцов апоневроза у больных с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы. Аналогично, как и в исследовании образцов кожи, были составлены коэффициенты соотношения типов коллагена 1/Ш (табл.2).

Таблица 2

Характеристика коллагена I и III типа в апоневрозе у больных _ исследуемой и контрольной групп _

Группа Коллаген I типа Коллаген III типа Соотношение коллагена І н III типа

Больные с грыжами N=46 52,35±2,97* 47,65±2,97* 1,11±0,15

Контрольная группа 49 69,11±2,68* 30,89±2,68* 2,27±0,3

Примечание. *-р<0,05

Таким образом, у больных с вентральными грыжами отмечается достоверное снижение соотношения типов коллагена как в препарате кожи, так и апоневроза в сравнении с больными без грыж.

При сравнительном анализе полученных результатов можно отметить, что у больных исследуемой и контрольной групп между сериями (сравнение результатов кожи и апоневроза в одной группе) достоверных отличий не выявлено. В связи с чем была определена закономерность соотношения коллагена в коже и апоневрозе. Таким образом, уровень соотношения типов коллагена в коже и апоневрозе аналогичен у больных одной группы.

Исследуя соотношение типов коллагена в коже у больных без грыж и с грыжами были выявлены достоверные отличия содержания коллагена. Соотношение типов коллагена у пациентов без вентральных грыж составило 2,26, а у больных с грыжами это соотношение достоверно ниже - 1,06.

Сравнивая соотношение коллагена в апоневрозе у больных с грыжами и без них, также выявлены достоверные отличия, заключающиеся в снижении этого соотношения у больных с грыжами. Так соотношение коллагена в апоневрозе у больных без грыж составило 2,27, а у больных с грыжами — 1,12.

При анализе полученных результатов можно сделать заключение, что имеются достоверные отличия содержания коллагена как в коже, так и в апоневрозе у больных без грыж и с грыжами.

У больных с грыжами соотношение коллагена I и III типа в коже — 1,06, в апоневрозе — 1,12, что, в свою очередь, также говорит о высокой корреляционной связи и отсутствии достоверных отличий. Оценивая показатели коллагена 1 и III типа в контрольной и исследуемой группах отмечено, что имеются достоверные отличия. Снижение процентного содержания коллагена I и III типа является одной из причин развития послеоперационных грыж.

Функциональная активность рибосомных генов у больных с вентральными грыжами

В результате проведенного анализа распределения показателей на нормальность выявлен всего один показатель в каждой группе, который не отвечал критериям нормальности. В связи с этим сравнительный анализ проводился с использованием критерия Стьюдента. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, статистически достоверные различия между больными с вентральными грыжами и контрольной группой наблюдались по показателю суммарной функциональной активности рибосомных генов (ИД), коэффициент Стьюдента по данному параметру достиг достаточно высоких значений (1=3,8). Также достаточно высокие статистически достоверные коэффициенты Стьюдента были при сравнении функциональной активности рибосомных генов хромосом группы Є 0=2,2), по количеству всех активных рибосомных цистронов (1=2,7) и по количеству активных рибосомных цистронов группы О 0=2,9).

Таблица 3

Сравнительный анализ показателей функциональной активности __рибосомных генов между группами___

Показатель Контроль Больные 1 Р Р Р

X ±Эх X

КО 19,2 усл.ед. 1,3 18,4 усл.ед. 1,0 3,8* 0,0002 1,7 0,06

ІКЗО 11,6 усл.ед. 1Д 11,3 усл.ед. 1,1 1,4 0,2 1,1 0,8

ЯС в 7,6 усл.ед. 1,3 7,1 усл.ед. 1,2 2,2* 0,02 1,04 0,9

ЯС 8,6 0,6 8,3 0,6 2,7* 0,007 1,01 0,9

КС О 5,2 0,5 5,1 0,6 0,8 0,4 1,7 0,06

ясв 3,4 0,4 3,1 0,5 2,9* 0,003 2,2* 0,005

Примечание:

I - коэффициент Стьюдента /<■ - коэффициент Фишера * статистически значимые различия (р<0,05)

Сравнительный анализ полиморфизмов генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ в группе больных с вентральными грыжами и в контрольной группе

Следующим этапом настоящего исследования было изучение ассоциаций аллелей и генотипов генов матриксных металлопротеиназ и цитокинов с риском развития вентральных грыж. В таблице 4 представлены частоты аллелей изучаемых полиморфных генов и результаты их сравнительного анализа между выборкой больных с вентральными грыжами и контрольной группой.

Таблица 4

Сравнительный анализ частот аллелей полиморфных вариантов

Ген Полиморфизм Аллели Частоты аллелей Критерий различий х2(р) еж (С195%)

Больные Контрольная группа

тога/ С-509Т -509 С 288 0,427 234 0,568 7,27 (0,007)* 1,61 (1,252,50)

-509 Т 0,573 0,432

ІСАМ-1 -469 АЛЗ 469 А 286 0,674 304 0,727 1,8(0,18) 1,29 (0,911,84)

469 в 0,326 0,273

Т№А -238 ОЛ -238 в 312 1,0 0 214 1,0 0(1) -

-238 А 0

ясг А+6Ю +61 в 272 0,570 292 0,682 7,04 (0,01)* 1,61 (1,152,28)

+61 А 0,430 0,318

ММРЗ -1171 5А->6А -1171 5А 256 0,609 308 0,727 8,5 (0,001)* 1,71 (1,202,43)

-1171 6А 0,391 0,273

ММР9 С-1562Т -1562 С 238 0,890 260 0,869 0,32 (0.57) 0,83 (0,481,42)

-1562 Т 0,110 0,131

Примечание. *-р<0,05

Из приведенной выше таблицы следует, что статистически значимые различия между выборками по частотам аллелей были выявлены в гене ТОРВ! (ОН. 1 61 С195% 1,25-2,50). В гене ЕСР различия по частотам аллелей так же были 'статистически значимыми (ОЯ 1,61, С195% 1,15-2,28), как и по гену ММРЗ (ОЯ 1,71, С195% 1,20-2,43). Это может свидетельствовать о положительной ассоциации изучаемых полиморфизмов данных генов с

вентральными грыжами.

Так как анализ ассоциации аллелей не дает полной картины о характере взаимосвязи рассматриваемых полиморфизмов с предрасположенностью к грыжеобразованию, было проведено исследование влияния генотипов исследуемых полиморфизмов на риск развития вентральных грыж. В таблице 5 представлены результаты сравнительного анализа частот генотипов между группой больных с вентральными грыжами и контрольной группой.

Ген

ТвРВІ

IСАМ1

ТЫРА

ЕСР

ММРЗ

ММР9

Таблица 5

Сравнительный анализ частот генотипов полиморфных вариантов _исследуемых генов у больных и здоровых людей _

Полиморфизм

С-509Т

469 АЛЗ

-238 Є>А

А+6Ю

-1171 5А->6А

Генотипы

-509 СС

-509 СТ

-509 ТТ

469 АА

469 Ав

469 вй

С-1562Т

-238 Ов

-238 ОА

-238 АА

Частоты генотипов

Больные

+61 Св

+61 в А

+61 АА

-1171 5А5А

-1171 5А6А

-1171 6А6А

-1562 СС

Примечание. *-р<0,05

-1562 СТ

-1562 ТТ

22,2

Контрольная группа

41,0

36,8

49,3

36,1

14,6

100

36,8

117

152

157

36,0

41,9

22,1

35,9

46,9

17,2

79,8

16,8

146

40,2

23,1

55,2

35,1

9,7

Критерий различий X2 (Р)

6,65 (0,01)*

0,02 (0,9)

5,72 (0,02)*

1,03(0,31)

0,04 (0,85)

100

49,3

1,64 (0,2)

(Ж

(С195%)

0,49 (0,290,85)

1,03(0,63-1,70)

1,94(1,12-2,5)

0,79 (0,501,25)

1,05 (0,651,68)

37,7

13.0

154

13,4

130

51,9

39,0

9,1

55.8

35,1

5,07 (0,02)*

1,58 (0,783,20)

0,58 (0,360,93)

0,53 (0,47)

4,01 (0,05)"

7,25(0,01)*

7,29 (0,18)

4,11 (0,04)*

0,69 (0,41)

9.1

0,83 (0,36)

1,19(0,74-1,92)

1,89(1,01-3,55)

0,52 (0,320,84)

1,38(0,86-2,22)

2,08(1,01-4,25)

0,77 (0,72,38)

0,01 (0,9)

0,74 (0,391,41)

1,1 (0,225,58)

По данным таблицы 5 было установлено, что вариантный генотип 509ТТ гена ЮР ассоциировался с повышенным риском развития вентральных грыж (СЖ 1,94 С195% 1,12-2,5), при этом количество диких гомозигот 509 СС этого же гена было статистически значимо выше в контрольной группе (ОЛ 0,49 С195% 0,29-0,85). Частота гомозигот 61 АА гена ЕС И среди людей' с вентральными грыжами было выше, чем в контрольной группе (ОЯ 1,89 С195% 1,01-3,55). В данном гене частота дикого генотипа 61 вв также была 14

статистически значимо выше в контрольной группе (СЖ 0,58 С195% 0,36-0,93). В гене ММРЗ была выявлена положительная ассоциация генотипа 1171 6А6А связана с вентральным грыжеобразованием (ОЯ 0,58 С195% 0,36-0,93). Генотип 1171 5А5А имел обратный эффект и статистически значимую отрицательную ассоциацию с вентральным грыжеобразованием (СЖ 2,08 С195% 1,01-4,25). По остальным генотипам статистически значимых различий не выявлено.

Влияние парных межгенных взаимодействий генов цитокинового ряда и генов матрнксных металлопротеиназ на предрасположенность к формированию вентральных грыж

В основе наследственной предрасположенности к большинству мультифакториальных заболеваний лежит сочетание аллельных вариантов различных генов (Фогель Ф„ Мотульски А., 1990; Бочков Н.П., 2002; Пузырев В.П., 2003). Определенные комбинации генов, каждый из которых в отдельности характеризуется незначительным проявлением на уровне фенотипа, зачастую обладают суммарным (аддитивным) эффектом, который в совокупности с факторами внешней среды способен вызвать заболевание или предопределить его более тяжелое течение.

Важно понять индивидуальное поведение организма при сочетании вариантов генотипов исследуемых генов и, как следствие, оценить их значимость в формировании вентральных грыж.

В таблице 6 приведены особенности взаимодействия полиморфных вариантов генов при помощи анализа парных межгенных сочетаний генотипов. Одни сочетания были патогенетически важными и, усиливая друг друга, способствовали развитию изучаемого заболевания. Из них самыми значимыми были сочетания вариантных генотипов генов ММРЗ и 767В/ (011=4,49 С195% 1,25-16,19), вариантного генотипа гена ММРЗ и гетерозиготного генотипа гена 1САМ 1 (ОЯ=3,86 С195% 1,25-16,19), вариантного генотипа гена ММРЗ и дикого генотипа гена ММР9 (ОЯ=3,07 С195% 1,12-8,4), вариантного генотипа гена ТСГВ! и гетерозиготного генотипа гена £GF (011=2,33 С195% 1,03-5,3).

Другие сочетания генотипов оказывали протективное действие, то есть снижали риск развития заболевания. Из них наиболее значимые: сочетание диких генотипов генов ММРЗ и 767В/(ОЯ=0,34 С195% 0,16-0,75), сочетания диких генотипов ММРЗ и ЕСЕ (0я=0,42 С195% 0,23-0,89), диких генотипов ММРЗ и ММР9 (01*=0,57 С195% 0,33-0,99), диких генотипов 767В/ и £67 (011=0,34 С195% 0,15-0,76), диких генотипов ТОРВ! и 1САМ{ОЯ=0,4 С195% 0,2-0,8), диких генотипов 767В/ и ММР9 (ОК=0,48 С195% 0,25-0,92).

Как, одни комбинации генов в большей степени способствовали проявлению признака, другие в меньшей и оказывали защитное действие на организм в отношении развития исследуемого заболевания. Сочетание вариантных генотипов генов ММРЗ и 767/?/ оказывало достоверное влияние на развитие вентральных грыж. При этом их суммарное влияние было выше, чем их влияние по отдельности, отношение шансов для парного взаимодействия составило 4,49 (С195% 1,25-16,19), а отношения шансов для них в отдельности составили 2,08 (С195% 1,01-4,25) и 1,94 (С195% 1,12-2,5) для ММРЗ и 767В/ соответственно. В то же время сочетание их

доминантных генотипов достоверно оказывало протективное воздействие. Аналогично описанной выше ситуации, суммарное действие диких генотипов оказывало большее влияние, нежели их влияние в отдельности, (Ж для парных генотипов 0,34 (С195% 0,16-0,75), (Ж для отдельных генотипов 0,52 (С195% 0,320,84) и 0,49 (С195% 0,29-0,85) соответственно для ММРЗ и ТСРВ1. На основании вышеизложенного можно говорить о стойком синергизме изучаемых полиморфизмов вышеописанных генов в предрасположенности к развитию вентральных грыж.

Таблица 6

Ассоциации парных межгенных комбинаций генотипов генов цитокинов

и матриксных металлопротеиназ с предрасположенностью к развитию _>__вентральной грыжи_

Парные комбинации генотипов Частоты комбинаций генотипов Критерий различии, х' (Р) OR (С195%)

Больные Контрольная группа

n % п %

ММРЗ-1171 5А5А х ТС,FBI -509 CC¿ 10 8,1 24 20,5 7,56 (0,01) 0,34(0,16-0,75)

ММРЗ -1171 6А6А х ТО FBI -509 ТТТ 13 10,6 3 2,6 6,18(0,01) 4,49(1,25-16,19)

ММРЗ -1171 5А5А х EGF+ 61 GGÍ 14 12,3 34 23,8 5,52 (0,02) 0,42 (0,230,89)

ММРЗ Л\1\ 6А6А х 1С AM-1 469 AGt 9 7,3 3 2 4,53 (0.03) 3,86(1.02-14.59)

ММРЗ-WIX 5А5Ах ММР9-\5b2CCl 29 .29,3 54 42,2 4 (0,05) 0,57 (0,330,99)

ММРЗ-т\ 6А6А х MfAP9 -1562 CCt 13 13,1 6 4,7 5,19 (0,02) 3,07(1,12-8,4)

TGFB1 -509 СС х EOF +61 GG4- 10 7,6 22 19,5 7,46(0,01) 0,34 (0,150,76)

TGFB1 -509 TT x EGF +61 GAÍ 22 16,8 9 8 4,26 (0,04) 2,33 (1,03-5,3)

TGFBl -509 CC x 1CAM-1 469 AAl 15 10,8 27 23,1 6,99 (0,01) 0,4 (0,2-0,8)

TGFBl -509 CC x MMP9 -1562 CC4- 19 16,7 29 29,6 5,03 (0,02) 0,48 (0,250,92)

Примечаине:

4- - ослабление патогенного действия Т-усиление патогенного действия

Также было отмечено усиление протективного действия на организм при сочетании диких генотипов генов ММРЗ и ЕСР. Их суммарное влияние ((Ж=0,42 С195% 0,23-0,89) было более значимым, чем их отдельное воздействие, для ММРЗ (Ж=0,52 (С 195% 0,32-0,84), для £№СЖ=0,58 (С195% 0,36-0,93).

Было выявлено, что сочетание диких генотипов ТО ЕВ/ и ЕйЕ также снижает шанс развития заболевания в большей мере, чем их отдельное влияние. Отношение шансов для их парного сочетания 0,34 (С195% 0,15-0,76), по отдельности отношение шансов для ГОга/ и ЕСЕ составили соответственно 0,49 (С195% 0,29-0,85) и 0,58 (С195% 0,36-0,93). Сочетание вариантного генотипа гена ТОЕВ1 с гетерозиготным генотипом гена ЕСЕ имело более достоверно высокое влияние на развитие вентральных грыж, чем изолированное влияние ТС ЕВ! на развитие данного заболевания. ОЯ ддя парного генотипа 2,33 (С195% 1,03-5,3), ОЯ для одиночного 1,94 (С195% 1,12-2,5). Стоит отметить, что гетерозиготный генотип +6ЮА гена ЕСЕ не имел достоверных различий между группой больных с вентральными грыжами и

контрольной группой.

По полиморфизму гена 1САМ1 не было найдено статистически достоверных различий между частотой его встречаемости в группе больных с вентральными грыжами и лицами контрольной группы. Однако сочетание его дикого генотипа и дикого генотипа гена ТСЕВ1 усиливало протективное действие последнего. Сочетание гетерозиготного генотипа гена 1САМ1 с вариантным генотипом гена ММРЗ усиливало ассоциации с вентральными грыжами последнего, о. чем свидетельствует более высокий уровень отношения шансов (ОЯ=3,86, С195% 1,0214 59) в сравнении с действием ММРЗ отдельно (ОЯ= 2,08, С195% 1,01-4,25).

Также, полиморфизм -1562 С/Т гена ММР9 не имел достоверных различий по частоте встречаемости среди группы больных с вентральными грыжами и лицами контрольной группы. Но сочетание его дикого генотипа с диким генотипом гена ММРЗ или гена ТСЕВ1 обладало защитным действием к формированию вентральной грыжи. Однако, было выявлено, что сочетание того же дикого генотипа гена ММР9 с вариантным генотипом гена ММРЗ усиливало ассоциацию с развитием заболевания.

Прогнозирование риска возникновения вентральной грыжи на основе анализа данных функциональной активности рибосомных генов и генотипирования полиморфизмов генов-кандидатов

Среди всех оцененных статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития вентральных грыж была модель, включающая следующие предикторы: количество активных рибосомных цистронов хромосом группы О, полиморфизм -1171 5А->бА гена ММРЗ, полиморфизм С-509Т гена ТСЕВ1, полиморфизм А+6Ю гена ЕСЕ и наличие отрицательного резус-фактора (ЯЬ-). Параметры логистической регрессионной

модели представлены в таблице 7.

Уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были менее 0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск возникновения вентральной грыжи. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели - составляла 54,7, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения ¡-го признака шанс возникновения вентральной грыжи увеличивается более чем в 50 раз. Указанная модель корректно предсказывает в 73% случаев вероятность возникновения

вентральных грыж и в 68% случаев правильно классифицирует здоровых индивидов.

Таблица 7

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска _возникновения вентральных грыж _

Независимые (объясняемые) признаки (Лі) и их градации Регрессионные коэффициенты, А;

Интерцепт (константа) 1,05

КС в (0-4) -0,84

ММРЗ -1171 5А->6А (1, 2, 3) 0,72

ТСРВІ С-509Т (1, 2, 3) 0,32

А+6Ю (1, 2, 3) 0,85

Резус-фактор (0, 1) -1,48

Параметры лог-регоессионной модели: Уровень значимости модели в целом р=0,00043 (х2=22,475; (1145, СЖ=54,7); Процент правильной классификации: больные ВГ- 73% , здоровые - 68%.'

ВЫВОДЫ

1. В апоневрозе и в коже у больных с вентральными грыжами процентное содержание коллагена I и III примерно равно, тогда как в контрольной группе количество коллагена I типа было в 2 раза выше, чем содержание коллагена III типа.

2. Показатели функциональной активности рибосомных генов у людей с вентральными грыжами ниже, чем у лиц контрольной группы, за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы G.

3. Генетические варианты ММРЗ -1171 5А5А (OR=2,08), TGFB1 -509СС (OR=l,94), EGF +61АА (OR=l,89) ассоциированы с развитием вентральных грыж.

4. Сочетания генотипов ММРЗ -1171 5А5А х TGFB1 -509 СС (OR=0 34) ММРЗ -1171 5А5А х EGF+61 GG (OR=0,42), ММРЗ -1171 5А5А х ММР9 -1562 СС (OR=0,57), TGFB1 -509 СС х EGF+ß\ GG (OR=0,34), TG FBI -509 СС x ICAM-1 469 AA (OR=0,4), TG FBI -509 С С x MMP9 -1562 СС (ORK),48) оказывали протективное действие на развитие вентральных грыж, а комбинации генотипов ММРЗ -1171 6А6А х TGFB1 -509 TT (OR=4,49), ММРЗ -1171 6А6А х ICAM-1 469 AG (OR=3,86), ММРЗ -1171 6А6А х ММР9-1562 СС (OR=3,07), TG FBI -509 TT x EGF +61 GA (OR=2,33) были ассоциированы с повышенным риском развития заболевания.

5. Получено уравнение логистической регрессии, позволяющее прогнозировать риск развития вентральных грыж: Y = -1,05 + (-0,84) х (RC G (0-4) + 0,72 х (ММРЗ -1171 5А->6А (1, 2, 3)) + 0,32 х (TGFB1 С-509Т (1 2 3)) + 0,85 х (EGFA+бЮ (1, 2, 3)) + (-1,48) х Rh (0,1).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью индивидуального прогнозирования послеоперационных осложнений представляется целесообразным введение в лабораторную диагностику оценки показателей функциональной активности рибосомных генов наряду с общеклиническими данными.

2. Введение в практику медико-генетического консультирования типирования по двум полиморфизмам генов-цитокинов (TGFB1 С-509Т, EGF A+61G) и одному полиморфизму гена матриксной металлопротеиназы 3 (ММРЗ -1171 5А->6А) для определения индивидуального фона реагирования биосинтеза основных белков соединительной ткани на действие триггерного фактора для диагностики послеоперационных вентральных грыж.

3. С использованием разработанной нами модели логистической регрессии формировать индивидуальную тактику хирургического лечения с учетом риска развития послеоперационной вентральной грыжи.

4. В рамках высшего медицинского образования в курсах медицинской и клинической генетики шире освещать проблемы функционирования рибосомных генов и роль генетических детерминант в развитии хирургических заболеваний в частности и всей мультифакториальной патологии в целом.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Барт, И.И. Генетические факторы и их вовлеченность в формирование послеоперационных осложнений и рецидивов вентральных грыж / И.И. Барт // Молодежная наука и современность : материалы 75-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием, посвящ. 75-летию КГМУ (Курск, 20-21 апр. 2010 г.). - Курск, 2010. - Ч. 1. -С. 79.

2. Барт, И.И. Функциональная активность рибосомных генов у больных с послеоперационными вентральными грыжами. / И.И. Барт, Д.В. Гаврилов, Е.В. Трубникова // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.).-Курск, 2011.-Ч. 1.-С. 89.

3. Барт, И.И. Функциональная активность рибосомных генов у больных с послеоперационными вентральными грыжами / И.И. Барт, Е.В. Трубникова // Санкт-Петербургские научные чтения - 2011 : материалы IV Междунар. молодежного мед. конгр. (Санкт-Петербург, 7-9 дек. 2011 г.). -СПб., 2011.-С. 177-178.

4. Барт, И.И. Особенности функционирования белоксинтезирующего аппрата у больных с послеоперационными вентральными грыжами и возможности профилактики послеоперационного грыжеобразования / И.И. Барт // Студент и научно-технический прогресс : материалы 50-й юбилейной Междунар. науч. студенческой конф. (Новосибирск, 13-19 апр. 2012 г.). -Новосибирск, 2012. - С. 7-8.

5. Барт, И.И. Функциональная активность рибосомных генов и её вовлеченность в формирование вентральных грыж у человека / И.И. Барт,

B.П. Иванов, C.B. Иванов // Курск, науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2012. -№ 3. - С. 37-41.

6. Вовлеченность полиморфизма гена трансформирующего фактора роста в развитие абдоминальных грыж у человека / И.И. Барт, В.П. Иванов,

C.B. Иванов, Е.В. Трубникова // Соврем, пробл. науки и образования. - 2013. -№1.-С. 14.

7. Особенности ассоциации соотношения коллагенов в апоневрозе передней брюшной стенки и полиморфизма матриксных металлопротеиназ / И.И. Барт, В .А. Лазаренко, И.С. Иванов, В.П. Иванов // Фундаментальные исследования. -2013. -Хэ 3. - С. 28-34.

8. Вовлеченность полиморфизмов генов ММРЗ -1171 5А->6А ММР9 С-1562Т в формирование вентральных грыж у человека / И.И. Барт, И.С. Иванов, И.В. Булгакова, О.В. Бобынцева, Е.В. Левченко // Материалы VII Междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков (Курск, 1-2 марта 2013 г.). -Курск, 2013.-T. 1.-С. 98-102.

9. Критерии прогнозирования грыжевой болезни / C.B. Иванов, В.П. Иванов, И.С. Иванов, И.И. Барт // Вестн. Нац. мед.-хирург. Центра им. Н.И. Пирогова. - 2013. - № 1. - С. 84-88.

10. Роль полиморфизма эпидермального фактора роста в формировании послеоперационных вентральных грыж / И.И. Барт, В.П. Иванов, C.B. Иванов, Е.В. Трубникова // Материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН, посвящ. 78-летию КГМУ (Курск, 7 февр. 2013 г.). - 2013. - Т. 1. - С. 199-200.

Список условных сокращений

ММП - матриксные металлопротеиназы

ФАРГ - функциональная активность рибосомных генов

ЕС/7- эпидермальный фактор роста

ІСАМ - интерцеллюлярная адгезивная молекула

ММРЗ - матриксная металлопротеиназа 3

ММР9 - матриксная металлопротеиназа 9

ЯС - суммарное количество активных рибосомных цистронов

КС О - количество активных рибосомных цистронов хромосом группы О

ЯС О - количество активных рибосомных цистронов хромосом группы О

- суммарная функциональная активность рибосомных генов ІШ Б - функциональная активность рибосомных генов хромосом группы Б 1Ю Сг - функциональная активность рибосомных генов хромосом группы в ЮРБІ - трансформирующий фактор роста бета-1 ТЫРЛ - фактор некроза опухоли альфа

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 17.04.2013 г. Подписано в печать18.04.2013 г. Формат 30х42!/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 243"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Барт, Илья Иванович, Белгород

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации,

а правах рукописи

04201357352

УДК: 577.21:617.55-007

БАРТ ИЛЬЯ ИВАНОВИЧ

ВОВЛЕЧЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ В ФОРМИРОВАНИЕ ВЕНТРАЛЬНЫХ ГРЫЖ У ЧЕЛОВЕКА

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.02.07 — генетика

Научный руководитель:

профессор, доктор медицинских наук

Иванов В.П.

Курск-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список условных сокращений...................................................6

Введение...............................................................................7

Глава 1. Обзор литературы......................................................11

1. Проблема вентральных грыж и патогенетические аспекты их возникновения...............................................................11

2. Диффузные заболевания соединительной ткани....................20

3. Молекулярно-клеточная биология соединительной ткани.......22

4. Молекулярно-генетические аспекты функционирования соединительной ткани...........................................................................28

4.1. Характеристика матриксных металлопротеиназ.....................28

4.2 Роль цитокинов...............................................................30

4.3. Адгезивные белковые молекулы...........................................33

5. Рибосомные гены и их функциональная активность при различных

физиологических состояниях....................................................34

Глава 2. Материалы и методы исследования....................................40

2.1.1. Общая характеристика выборки............................................40

2.1.2. Клиническая характеристика.................................................44

2.2. Методы исследования..............................................................45

2.2.1. Технология выполнения биопсии кожи и апоневроза для гистологического исследования, приготовление и анализ препаратов......45

2.2.2. Цитогенетические методы.....................................................46

2.2.3. Молекулярно-генетические методы.........................................49

2.2.4. Статистические методы.........................................................51

РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 3. Морфологическое исследование образцов кожи и апоневроза....55

Глава 4. Функциональная активность рибосомных генов у больных с вентральными грыжами.............................................................62

4.1. Показатели функциональной активности рибосомных генов у больных с вентральными грыжами.......................................................62

4.2. Показатели функциональной активности рибосомных генов у лиц контрольной группы............................................................64

4.3. Сравнительный анализ показателей функциональной активности рибосомных генов у больных с вентральными грыжами и у контрольной группы.............................................................................67

4.4. Анализ показателей функциональной активности рибосомных генов при дискриминации по полу......................................................73

4.5. Многомерный анализ функциональной активности рибосомных генов..............................................................................79

Глава 5. Ассоциации полиморфизмов генов матриксных металлопроетиназ и генов цитокинов с развитием вентральных грыж у человека................83

5.1. Распределение генотипов генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ у больных с вентральными грыжами.................84

5.2. Анализ ассоциаций полиморфизма генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ в группе больных с вентральными грыжами и лицами контрольной.............................................................................96

Глава 6. Многомерный анализ ассоциаций межгенных взаимодействий и функциональной активности рибосомных генов с предрасположенностью к развитию вентральных грыж.............................................................91

6.1. Влияние парных межгенных взаимодействий генов цитокинового ряда и генов матриксных металлопротеиназ на предрасположенность к формированию вентральных грыж............................................................................91

6.2 Анализ связи сочетаний полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ и генов цитокинов с показателями комплекса функциональной активности рибосомных генов у больных вентральными грыжами..................................................................................106

6.3. Регрессионный анализ..........................................................109

Заключение.............................................................................114

Выводы..................................................................................123

Практические рекомендации.......................................................124

Список использованной литературы.............................................125

Список условных сокращений

ВГ - вентральные грыжи

ММП — матриксные металлопротеиназы

ПОВГ - послеоперационные вентральные грыжи

ПХТ - полихимиотерапия

РГ - рибосомные гены

ФАРГ - функциональная активность рибосомных генов

ФНО - фактор некроза опухоли

ЧАЭС - Чернобыльская атомная электростанция

ЯОР - ядрышкообразующие районы

БвР - эпидермальный фактор роста

1САМ - интерцеллюлярная адгезивная молекула

ММРЗ - матриксная металлопротеиназа 3

ММР9 - матриксная металлопротеиназа 9

ЯС - суммарное количество активных рибосомных цистронов

ЯС О - количество активных рибосомных цистронов хромосом группы Б

КС О - количество активных рибосомных цистронов хромосом группы в

Я/л - суммарная функциональная активность рибосомных генов

1Ю Б - функциональная активность рибосомных генов хромосом группы О

ИХ} й - функциональная активность рибосомных генов хромосом группы в

ТОРВ1 - трансформирующий фактор роста бета-1

Т№А - фактор некроза опухоли альфа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Послеоперационная вентральная грыжа является самым распространенным послеоперационным осложнением абдоминальной хирургии, достигая 20% уровня после срединной лапаротомии. Рядом рандомизированных исследований показано, что после аутопластики грыжевых выпячиваний около 50% послеоперационных грыж рецидивируют. В связи с этим пациенты вынуждены переносить очередное оперативное вмешательство, что сопровождается дополнительными рисками. (Hoer J. et al. 2002)

Одна из основных проблем возникновения вентральных грыж, в частности послеоперационного грыжеобразования, заключается в отсутствии достоверных прогностических признаков появления данного заболевания. В связи с этим нас заинтересовали более глубокие механизмы патогенеза, лежащие на генном уровне.

Ранее, некоторые хирурги, по ходу выполнения своих исследований, ставили перед собой одной из целей - изучение экспрессии ряда генов, и получали положительные результаты. Так, например, Klinge U., Schumpelick V. 2001 нашли повышение количества коллагена III типа с одновременным снижением соотношения коллаген I/ коллаген III за счет повышения последнего у больных с послеоперационными и особенно рецидивными грыжами по сравнению с контролем более чем в два раза. Из наших соотечественников данной проблемой занимался профессор Гостевской A.A. (2008г.). Он описал достоверное увеличение экспрессии гена коллагена III и соотношения коллагенов III/I у больных с клиническими признаками неспецифической дисплазии соединительной выявлено по сравнению с контролем. Кроме того, выявлено достоверное увеличение продукции ММР I у

больных с послеоперационными вентральными грыжами. (Гостевской A.A., 2008г).

При всем при этом в научной литературе отсутствуют комплексные исследования генетических аспектов послеоперационного грыжеобразования в частности и всех вентральных грыж в целом.

Цель исследования

Изучить функциональную активность рибосомных генов и полиморфизм некоторых структурных генов и их вовлеченность в формирование вентральных грыж у человека

Задачи исследования

1. Изучить соотношение коллагенов I и III типов в коже и апоневрозе у людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы

2. Изучить функциональную активность рибосомных генов в группе людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы

3. Изучить полиморфизм генов матриксных металлопротеиназ и генов цитокинового ряда в группе людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы

4. Изучить комплексное влияние и взаимовлияние полиморфизмов исследуемых генов и функциональной активности рибосомных генов на формирование вентральных грыж

5. На базе полученных данных разработать метод прогнозирования вентральных грыж и разработать рекомендации по профилактике вентральных грыж с использованием молекулярно-генетических и цитогенетических подходов.

Новизна исследования

Впервые осуществлен комплексный подход, заключающийся в анализе клинических, морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических факторов такого значимого, распространенного и опасного осложнения как послеоперационная вентральная грыжа в частности и всех

вентральных грыж в целом. Установлено, что соотношение типов коллагена I к коллагену III у больных с вентральными грыжами было в 2 раза меньше, чем у лиц без вентральных грыж. Установлены взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных с риском развития заболевания. У больных с вентральными грыжами достоверно снижена функциональная активность рибосомных генов за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы G. Помимо этого реализованный в настоящей работе комплексный подход, включающий стандартные методы генетической эпидемиологии, статистической генетики и компьютерного моделирования, позволил установить 3 генетических маркера предрасположенности к грыжеобразованию: ММРЗ -1171 5А->6А, TGFB1 С-509Т, EGF A+61G. Полученные данные нашего исследования наглядно демонстрируют наличие индивидуальных генетических особенностей, формирующих норму реакции организма, реализующуюся в условиях воздействия стрессорного фактора в отношении грыжеобразования.

Практическая значимость работы

Полученные в ходе исследования данные о взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных генов, результаты типирования полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ и цитокинов открывают перспективы для превентивной диагностики послеоперационных осложнений. С учетом того, что ранее отсутствовали комплексные генетические исследования причин возникновения вентральных грыж, настоящее исследование восполняет это и открывает перспективы для дальнейшего более углубленного и более полного исследования генетических детерминант развития вышеописанного заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных с вентральными грыжами определяется достоверное снижение соотношения коллагенов I/III типа в коже и апоневрозе в сравнении с пациентами контрольной группы.

- 102. При всех клинических формах вентральных грыж наблюдается снижение функциональной активности рибосомных генов в сравнении с контролем. Доказано, что снижение происходит за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы G, что может служить прогностическим признаком для послеоперационного грыжеобразования.

3. Полиморфизмы генов ММРЗ -1171 5А->6А, TGFB1 С-509Т, EGF A+61G статистически достоверно ассоциированы с развитием вентральных грыж.

Разработаны метод прогнозирования и практические рекомендации для превентивной диагностики послеоперационного грыжеобразования.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, учебный процесс кафедры хирургических болезней № 1 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, работу областной медико-генетической консультации ГМУ «Курская областная клиническая больница».

Апробация и публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных для публикаций ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 41 таблицу и 14 рисунков. Библиографический список используемой литературы включает 187 источника, из которых 100 зарубежные.

Глава 1. Обзор литературы

1. Проблема вентральных грыж и патогенетические аспекты их возникновения

Наружной грыжей живота называют заболевание, при котором через различные отверстия в мышечно-апоневротическом слое передней или задней брюшной стенки и тазового дна происходит выпячивание внутренних органов вместе с пристеночным листком брюшины при целостности кожных покровов. Эти отверстия ("слабые места") могут являться естественными анатомическими образованиями, такими как пупочное кольцо, щели в белой линии живота, паховый канал, бедренное кольцо, треугольник Пти, промежуток Грюнфельда-Лесгафта и т.д., либо возникают вследствие травм, операций или заболеваний. Внутренними называют такие грыжи живота, которые образуются внутри брюшной полости в брюшинных карманах и складках или проникают в грудную полость через естественные или приобретенные отверстия и щели диафрагмы [33, 69].

Количество грыженосителей на протяжении десятилетий остается стабильным и составляет 3-6% численности населения [49, 57, 69, 75]. В общехирургических стационарах пациенты с грыжами составляют до 10%, а операция герниопластика является одной из распространенных достигая 1021% [10, 14, 173, 159]

Послеоперационные вентральные грыжи

В структуре грыжевой болезни ведущее место занимают послеоперационные вентральные грыжи [56]. Являясь сложным, многоплановым состоянием, их лечение представляет собой серьезную проблему любого хирургического стационара, так как большие грыжи, помимо повреждений кожного покрова и мышц, могут вызывать нарушения дыхательной системы и внутренних органов [40, 68, 175]. Послеоперационная вентральная грыжа — частое осложнение в абдоминальной хирургии, возникающее, по данным разных авторов, у 2—15% больных, перенесших

лапаротомическое вмешательство [100, 128, 76, 39]. Примерно в 50% случаев послеоперационные вентральные грыжи развиваются в течение первых 2 лет с момента хирургического вмешательства [160].

Современная тенденция такова, что послеоперационные вентральные грыжи рассматриваются как самостоятельное полиэтиологическое и комплексное заболевание с нарушением функций внутренних органов, ухудшением деятельности дыхательной и сердечно-сосудистой систем, изменением взаимодействия мышечно-апоневротических образований брюшной стенки, дистопией органов живота, выраженными косметическими дефектами [5, 19, 40, 67, 68, 69, 167].

Этиология и патогенез

Этиологические факторы многообразны и проявляют себя лишь при определённых условиях. В одних случаях возникновение дефекта в мышечно-апоневротическом слое является следствием ранних послеоперационных осложнений, эвентраций или глубоких подапоневротических нагноений. В других - нарушение функции передней брюшной стенки развивается постепенно, вследствие дряблости и атрофии мышц, истончения и дегенерации апоневрозов и фасций. И, наконец, третья группа причин находится в непосредственной связи с качеством регенераторных процессов в ушитой послеоперационной ране, когда образующиеся рубцы слишком податливы и непрочны, чтобы противодействовать внутрибрюшному давлению [19].

Морфологическая недостаточность тканей может быть не только результатом эвентрации или обширного нагноения. Примером может служить частое образование грыжи у пожилых и престарелых больных. С возрастом мышцы, апоневрозы и фасции живота теряют свою эластичность и прочность вследствие истончения мышечных и коллагеновых волокон, появления между ними включений жировой клетчатки [19].

Определённое количество послеоперационных грыж возникает исподволь при, казалось бы, вполне благоприятном заживлении раны. Почему они

возникают? Ответ на этот вопрос базируется на трёх моментах. Во-первых, может наблюдаться резко замедленная регенерация. Наиболее частыми причинами, как мы уже указывали, являются расстройства обменных процессов и авитаминоз, способствующие нарушению нормального заживления раны. Во-вторых, - чрезмерная физическая нагрузка на ещё не сформировавшийся рубец (тяжёлая физическая работа в раннем послеоперационном периоде, беременность, запоры, расстройства мочеиспускания). В-третьих, -техническое несовершенство операции. Сюда следует отнести, прежде всего, применение кетгута для сшивания апоневроза и фасций, который рассасывается быстрее, чем образуется полноценный рубец, а также те случаи, когда хирург нарушает анатомичность соединения слоев, накладывает слишком редкие швы, в результате чего в одних случаях резко ухудшается кровоснабжение сшиваемых тканей, а в других - недостаточно равномерно сопоставляются края раны [19].

Безусловно, одним из главных факторов возникновения послеоперационных грыж является выполнение оперативных доступов большой длины и часто - без учёта топографо-анатомического строения передней брюшной стенки. Это ведёт к пересечению большого �