Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ генома животных и человека с использованием ДНК-маркеров

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сулимова, Галина Ефимовна, Москва



/ 7 - / -//? У -9

российская академия наук

институт общей генетики им. н.и. вавилова

на правах рукописи УДК 575.113:577.21.08:599.9:599.735.5

СУЛИМОВА Галина Ефимов!

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ

(03.00.15. - генетика)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

1. введение 3-14

2. структура исследования 15-18

3. результаты и обсуждение 19-166

3.1. ОБЩИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА BOS TAURUS 19-43

3.1.1. Материалы и методы. 22-24

3.1.2. Термическое фракционирование ДНК и характеристика AT- и GC-обогащенных фракций 24-26

3.1.3. Анализ транскрипционной активности генома в разных органах Bos taurus на основе кинетики гибридизации поли(А)-мРНК с кДНК. 27-40

3.1.4. Заключение 41-43

3.2. АНАЛИЗ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ЛОКУСОВ: ГЕНЫ КАЗЕИНОВ И ГЕНЫ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОДСЕМЕЙСТВА ВОМИАЕ 44-128

3.2.1. Материалы и методы. 44-48

3.2.2. Сравнительная характеристика полиморфизма ДНК генов

казеинов у представителей подсемейства Воутае. 49-75

3.2.2.1. Полиморфизм гена бета-казеина у крупного рогатого скота. 54-56

3.2.2.2. Сравнительный анализ полиморфизма гена каппа-казеина

у представителей подсемейства Во^тае. 56-73

3.2.2.3. Заключение. 74-75

3.2.3. Сравнительная характеристика полиморфизма ДНК генов главного комплекса гистосовместимости у крупного

рогатого скота. 76-103

3.2.3.1. Сравнительная характеристика полиморфизма локусов йРВ

и 0<ЭВ на основе ПЦР-анализа области, кодирующей Ы-домен 84-89

3.2.3.2. Сравнительный анализ уровня полиморфизма функционально различных областей гена ООБ 89-98

3.2.3.3. Анализ генетического сходства и генетических расстояний исследованных популяций на основе данных по полиморфизму

генов 01ЧВ и ООВ.

3.2.3.4. Заключение.

3.2.4. Возможности практического применения ДНК-маркеров, полученных на основе гена каппа-казеина и гена Во1_А-ОРШЗ.

3.2.4.1. Создание ДНК-маркеров на основе гена каппа-казеина (ПЦР-ПДРФ маркеры, аллель-специфичные маркеры), пригодных для использования в селекционных программах по улучшению качества молока.

98-101 102-103

104-128

104-107

3.2.4.2. Генотипирование аллелей гена Во1-А-ОРВЗ у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу

3.2.4.3. Заключение.

107-126 126-128

3.3. АНАЛИЗ ОТДЕЛЬНЫХ ХРОМОСОМ: ДНК-МАРКЕРЫ ХРОМОСОМ 3 И 13 ЧЕЛОВЕКА.

3.3.1. Материалы и методы.

3.3.2. Создание ЭТЭ-маркеров на основе последовательностей, прилегающих к ЫоИ-сайтам хромосомы 3 человека.

3.3.3. Создание ЕБТ-маркеров на основе библиотеки кДНК человека, обогащенной последовательностями хромосомы 13 человека.

3.3.4. Заключение.

129-147 132-134

135-141

141-146 147

3.4. АНАЛИЗ ОТДЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА:

КАРТИРОВАНИЕ РАЙОНА 13я14.3 ХРОМОСОМЫ 13 ЧЕЛОВЕКА, ЧАСТО УТРАЧИВАЕМОГО ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ

В-КЛЕТОЧНОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ. 148-166

3.4.1. Материалы и методы. 152-154

3.4.2. Построение физической карты области 13я14.3 генома 154-164 человека на основе вставок мега- и мидиУАС-клонов

3.4.2.1. Скрининг УАС-библиотеки /СЯ?Я генома человека по маркерам ИВКрЬ Мвв15 и 013825. 156-158

3.4.2.2. ПЦР анализ мега У А С клонов библиотеки СЕРН

по маркерам Р!ВКрЬ Мвв15 и 013825. 158

3.4.2.3. Создание вТЭ маркеров на основе концевых участков

вставок в У А С. 158-160

3.4.2.4. ПЦР-анализ 19 УАС-клонов по 10 вТв-маркерам из области 13ц14.3. 160

3.4.2.5. ПЦР-анализ построенного контига УАС-клонов с

И/¡-ЭТЭ-маркерами и маркером АРМ30ШВ5. 161-164

3.4.3. Заключение 165-166

4. ВЫВОДЫ

167-170

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

171-211

1. ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. С 1953 года, когда было показано,что материальным носителем гена является ДНК, генетика получила новый импульс для своего развития. На передний план выдвигаются исследования на молекулярном уровне структурной организации гена и генома в целом, что позволило перейти и к изучению механизмов функционирования генов. Исследования генома с использованием молекулярно-генети-ческих методов привели к быстрым успехам в первую очередь на прокариотах. Сведения о молекулярной структуре генома высших эукариот к началу данного иследования (конец 60-х годов) практически отсутствовали. Прогресс в молекулярно-генетическом анализе генома эукариот сдерживался не только высокой сложностью их, но и отсутствием достаточного количества удобных и информативных маркеров.

Для создания генетических маркеров использовались различные методические подходы. Наиболее эффективными оказались молекулярные методы, позволившие создать тест-системы на уровне продуктов генов (белковый полиморфизм), а позднее на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК). Более 25 лет наиболее широко использовались маркеры, полученные на основе белкового полиморфизма. С их помощью был сделан настоящий прорыв в исследованиях попу-

ляционной генетики [Алтухов, Рычков, 1972; McKusick, 1983; Ай-ала,1984; Алтухов, 1977, 1981, 1989; Алтухов и др., 1996]. Однако, со временем стали заметны и существенные ограничения белковых маркеров, обусловленные низким уровнем белкового полиморфизма в некоторых популяциях (домашних животных, птиц, культурных растений) [Hojny, Stratil, 1978; Baker, Manwell, 1980; Washburn et al.,1980], а также наличием аминокислотных замен, не приводящих к изменению суммарного заряда или конфигурации белковой молекулы, что делает невозможным тестирование таких аллельных вариантов с помощью электрофореза. Но основным ограничением при использовании белковых маркеров можно считать тот факт, что анализ белков позволяет тестировать изменения только в белок-кодирующих последовательностях ДНК, и только у экспрессирующихся генов. Если учесть, что в геноме высших эукариот значительную долю составляют повторяющиеся последовательности с часто неизвестной нам функцией, а сами гены сильно интронированы, то становится очевидным, что при анализе белкового полиморфизма от внимания исследователей ускользает большая часть (более 90%) генома. При этом в состав не анализируемых последовательностей могут входить функционально значимые участки. Так, современные представления о механизмах реализации генетической информации отводят важную роль регуля-

торным участкам, расположенным вне гена, иногда на значительном расстоянии от кодирующей последовательности.

Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфных последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК, эффективность применения которых впервые была обоснована в работе [Во1э1ет а1., 1980]. Наследственная изменчивость генетического материала обусловливает гетерогенность участков ДНК одного и того же локу-са у разных индивидов. Когда доля хромосом, несущих измененный вариант последовательностей нуклеотидов данного ло-куса превышает в популяции 1%, эти различающиеся последовательности нуклеотидов называют полиморфизмом ДНК [СиэеНа, 1986]. Использование в качестве маркерных систем полиморфных последовательностей ДНК позволяет тестировать генетический полиморфизм не на уровне продуктов экспрессии гена, а на уровне генотипа. Точнее, варианты нуклеотидной последовательности ДНК, являющиеся первопричиной всех последующих фенотипических изменений (белкового продукта, морфологических или физиологических признаков и т.п.) и сами по себе являющиеся фенотипическим проявлением генотипа, могут быть зарегистрированы на молекулярном уровне. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любой интересующий ис-

следователя участок ДНК, в том числе не кодирующий участок, что является принципиальным преимуществом ДНК-маркеров перед традиционно используемыми генетическими маркерами эукариот. Характеристики этого полиморфизма - повсеместность распространения, менделевское наследование для ядерной ДНК и материнское - для ДНК клеточных органелл, множественность аллелей и высокая гетерозиготность, кодоминантное выражение и стабильность наследования, селективная нейтральность, простота и надежность тестирования, а также отсутствие плейотропного эффекта в отношении хозяйственно важных признаков, привели к широкому использованию полиморфизма молекулы ДНК в качестве типа генетического маркера нового поколения [см. обзоры: Beckmann, Soller, 1983; Kaplan, 1984; Fields et al., 1994; Weber and May, 1989; Weber, 1990; Beckmann, 1992; Cohen et al., 1993; Watkins, 1988; Сули-мова, 1989, 1993]. Применение в теоретических и прикладных исследованиях такой маркерной системы имеет ряд преимуществ: возможность проведения исследования на материале любых тканей и на любой стадии развития (в том числе и для пренатального исследования), возможность ретроспективных исследований (за счет длительного сохранения образцов ДНК) и возможность получения информации о характере изменения гена. При этом следует отметить, что исследуемые участки гено-

ма не ограничиваются белок-кодирующими последовательностями, что позволяет применить генетический анализ к любому участку генома, а в качестве материала для анализа возможно использование любых тканей и органов, независимо от места синтеза кодируемого данным геном белка.

С введением ДНК-маркеров наметился прогресс в моле-кулярно-генетическом анализе генома эукариот. В обозримой перспективе генетический анализ признаков, кодируемых определенными локусами хромосом, будет вероятно базироваться на знании полной последовательности нуклеотидов соответствующих локусов и знании вариантов этих последовательностей -аллелей. Однако, пока такая информация для геномов человека и хозяйственно ценных видов животных не получена. На современном этапе исследование отдельных областей генома или отдельных локусов возможно при наличии сцепленных с этим локусом полиморфных маркеров. Несмотря на их очевидные преимущества, ДНК-маркеры до сих пор не получили массового распространения при исследовании генома животных (в особенности это относится к генетическим и генетико-селекционным исследованиям в нашей стране) и до сих пор существует необходимость их создания, исследования и использования для решения различных генетических задач.

ЦЕЛЬЮ нашего исследования был молекулярно-генетический анализ генома человека и животных на нескольких уровнях организации: на уровне целого генома, на уровне индивидуальных хромосом и отдельных их областей, на уровне индивидуальных локусов (генов). Одной из целей работы было показать также эффективность применения новых молекулярно-генетических подходов для решения традиционных генетических задач, таких как картирование геномов, исследование генетического разнообразия популяций на межвидовом и внутривидовом уровне, анализ аллельного полиморфизма и др..

Исследования генома на молекулярно-генетическом уровне можно условно разделить на четыре этапа:

1-ый этап - исследования структурно-функциональной организации генома в целом. Этот этап исторически также был первым.

2-ой этап - анализ структуры и функции отдельных генов и групп генов, включая анализ полиморфизма и аллельного разнообразия генов, анализа их нуклеотидной последовательности. Создание целой серии разнообразных ДНК-маркеров. На этом этапе появляется возможность практического использования научных данных в сельскохозяйственной и медицинской практике.

3-ий этап - создание хромосом-специфичных ДНК-маркеров различных типов и их локализация на хромосоме, т.е. создание "системы координат", относительно которой будут локализованы гены.

4-ый этап - физическое картирование областей генома на основе ДНК-маркеров. На этом этапе появляется возможность практического применения данных для диагностики и лечения наследственных заболеваний.

В нашей работе, согласно поставленной цели, представлены все четыре этапа исследований генома. Подробная структура исследований представлена в соответствующем разделе.

ОБЪЕКТАМИ ИССЛЕДОВАНИЙ были выбраны человек и различные виды подсемейства Bovinae (Бычьи). Многие виды, относящиеся к этому подсемейству, широко используются в хозяйственной деятельности человека (крупный рогатый скот (к.р.с.), зебу, яки, буйволы). Некоторые виды подсемейства находятся на грани исчезновения (например, зубры).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Геном млекопитающих на молекулярном уровне неоднороден как по своей структурной организации, так и по функциональной активности, что было установлено с использованием молекулярных методов анализа генома Bos taurus.

2. Уровень изменчивости функционально-различных областей генов различен - наиболее консервативна 5'-нетранслируемая область генов.

3. ДНК-маркеры более эффективны для достоверной оценки генетического разнообразия, чем маркеры, созданные на основе продуктов экспрессии гена^, поскольку позволяют оценивать полиморфизм любых областей генома (или гена), а не только его белок-кодирующих областей, на любых стадиях развития организма, в любых органах и тканях независимо от уровня экспрессии исследуемого гена. В данной работе на уровне ДНК был исследован полиморфизм генов класса II главного комплекса гистосовместимости и гена каппа-казеина (к-казеина) у диких видов подсемейства Воутае, что практически неосуществимо на уровне белкового полиморфизма.

4. Информативность ДНК-маркеров достаточна для исследования генетической изменчивости популяций не только на межвидовом, но и на внутривидовом уровнях (породы, линии, семьи), как это было продемонстрировано нами при исследовании генетического разнообразия различных пород к.р.с. и родственных видов по локусу к-казеина и локусам класса II главного комплекса гистосовместимости (гены ВоЬА-ОРВ и -РОВ).

5. Анализ аллельного полиморфизма на уровне последовательности нуклеотидов исследуемого гена позволяет также

выявить функциональную значимость различных аллелей гена в формировании исследуемого признака. Так, в данной работе выявлены аллели гена BoLA-DRB3, определяющие устойчивость или, напротив, предрасположенность к.р.с. к заболеваемости лейкозом.

6. Молекулярно-генетические методы обеспечивают возможность насыщения генома маркерами и его картирования (с построением физических карт любого уровня разрешения) без использования трудоемких традиционных методов генетического картирования. В данном исследовании была построена физическая карта длиной 2000т.п.н. в области 13q14.3 хромосомы 13 человека на основе нуклеотидных последовательностей ДНК человека, клонированных в искусственных хромосомах дрожжей (УАС-клоны).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ: В ходе выполнения данной работы впервые показано наличие в геноме Bos taurus протяженных областей (более 10 т.п.н.), резко различающихся по целому ряду параметров: нуклеотидному составу, степени метилирования, организации нуклеотидных последовательностей. Уровень транскрипции различных генов неодинаков. Выявлены три дискретные группы генов, различающиеся по уровню транскрипции. Количество копий мРНК для генов разных групп различается в 10-100 раз.

Впервые проведены молекулярно-генетические исследования генома у представителей подсемейства Bovinae (зебу, як, буйвол и зубр), использующихся в хозяйственной деятельности человека, по генам казеинов и генам главного комплекса гисто-совместимости (DRB и DQB). Получены сведения об их генетическом разнообразии, проведен анализ межвидового и внутривидового полиморфизма генов, что имеет особую значимость для научного планирования генетико-селекционной работы и для сохранения генофонда редких видов. Ранее исследование вышеназванных видов животных проводилось, в основном, на уровне белкового полиморфизма.

Описаны новые аллели гена к-казеина у к.p.c. и родственных видов подсемейства Bovinae, определены нуклеотидные последовательности вариабельных областей и выявлены нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам в новых аллелях. Предложена схема эволюции аллелей гена к-казеина у подсемейства Bovinae.

Впервые показан разный уровень изменчивости функционально-различных областей генов (на примере генов казеинов и генов класса II главного комплекса гистосовместимости).

На основе ДНК-полиморфизма генов к-казеина и генов BoLA-DRB и -DQB созданы генетические маркеры, информативность которых позволяет исследовать генетическую изменчи-

вость популяций не только на межвидовом, но и на внутривидовом уровнях (породы, линии, семьи). При исследовании аллель-ного полиморфизма гена Во1_А-РРВЗ у черно-пестрого и айр-ширского скота отечественной селекции выявлены аллели, обусловливающие устойчивость или восприимчивость к лейкозу.

Созданы 46 ДНК-маркеров генома человека: 22 ЭТЭ-маркера, маркирующие последовательности, прилегающие к Ыо11-сайтам хромосомы 3 человека, 16 ЕЭТ-маркеров на основе библиотеки кДНК, обогащенной последовательностями хромосомы 13 человека, и 8 ЭТв-маркеров для области 13д14.3 генома человека. Построена физическая карта длиной 2000т.п.н. в области 13я14.3 хромосомы 13 человека на основе вставок ме-га- и миди-УАС-клонов

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Н�