Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis"

003468177

На правах рукописи

Омельченко Андрей Владимирович

Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы ОагехвЫа итвехиаШ

Специальность 03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О

Москва 2009

003468177

Работа выполнена на Кафедре органической и биологической химии Биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета и в Лаборатории организации генома Института биологии гена РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор, член - корр. РАН

Севастьянова Галина Андреевна

Рысков Алексей Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шишкин Сергей Сергеевич доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН»

Диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129278, Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп. 3 (учебный корпус №5), ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119992, Москва, ГСП - 2, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан « Ж » апреля 2009 года. Ученый секретарь

Защита состоится « 26 » мая 2009 г. в

/5 час. а®

мин. на заседании

Диссертационного совета

Холмогорова Н.В.

Обшая характеристика работы Актуальность проблемы

Выяснение молекулярных механизмов и характеристика процессов нестабильности генома про- и эукариот являются актуальными вопросами молекулярной биологин и биохимии нуклеиновых кислот. Микросателлитные последовательности ДНК выступают как один из факторов нестабильности генома. Микросателлиты представляют собой тандемные повторы ДНК с размером мономерного звена от 2 до 6 нуклеотидов. Микросателлитный кластер занимает в среднем от 20 до 60 пар нуклеотидов (за исключением экспансии триплетных повторов, наблюдаемой при некоторых наследственных болезнях человека). Микросателлиты имеют высокие скорости мутирования от 10"2 до 10"5 в зависимости от типа микросателлита [Ellegren, 2004], что приводит к накоплению популяпионно-специфических мутаций и позволяет использовать информацию об изменчивости микросателлитных локусов для анализа структуры популяций [Rosenberg eí al., 2002]. Тамдемные повторы в целом и микросателлитные последовательности ДНК в частности наделяются рядом исследователей важной ролью в функционировании генома на биохимическом, молекулярном и субклеточном уровнях [Зимницкий с соавт., 2005]. В настоящее время к наиболее изученным относятся микросателлиты человека, рада животных и растений [Neff, Gross, 2001; Животовский, 2006]. В то же время, однополые виды животных с клональным типом размножения остаются исе еще малоизученными как с точки зрения молекулярной биологии и биохимии ДНК, так и с точки зрения генетической изменчивости [Tokarskaya et al., 2001]. Уникальной природной моделью для проведения исследований по характеристике и анализу микросателлитных последовательностей ДНК является облигатно-партеногенетические виды кавказских скальных ящериц рода Darevskia (Lacerta -saxícola complex) [Arribas, 1999], и в частности партеновид Darevskia unisexualis, который имеет гибридное происхождение от родоначальных двуполых видов D. raddei и D. valeníini. Среди всего спектра микросателлитных последовательностей особое значение имеют динуклеотидиые микросателлиты, которые наиболее широко представлены в геномах зукариот [Sharma et al., 2007], являясь эволюционно-консервативными генетическими маркерами ДНК [Neff, Gross, 2001]. Практическое использование подобных маркеров невозможно без применения адекватной системы количественной оценки генетического разнообразия. Однако, распространенные математические модели в большинстве своем адаптированы для исследований популяций двуполых видов и не приспособлены для популяций партеновидов [Петросян с соавт., 2003]. В связи с этим, актуальной представляется молекулярная характеристика динуклеотидных микросателлитных локусов, а также разработка и реализация математической модели на основе этих данных, количественно определяющая вклад популяций в генофонд партеногенетических видов.

Цель и задачи исследования

Цель работы - получение и молекулярная характеристика локусов, содержащих микросателлитные динуклеотидиые последовательности генома

партеногенетической ящерицы В. итзехиа'^, для оценки их изменчивости и вклада в генетическое разнообразие партеновидов.

Для достижения указанной цели в данной работе решались следующие задачи: .

1") поиск': вариабельных динуклеотидных микросателлитных . , последовательностей ДНК генома В. гатехиаИх:

. 2) определение молекулярной . природы. микросателлитных локусов в "., популяциях Б.итзехиаНв\

" 3)' исследование биохимических и молекулярно-биологических параметров , микросателлитных локусов и их аллельных вариантов для характеристики и 'формализации процессов изменчивости молекулы ДНК; 4) разработка и применение системы количественной оценки вариабельности микросателлитных локусов как генетических маркеров для оценки внутри- и межпопуляционных характеристик у партеновида О. итзехиаНз.

Научная новизна работы

. В представленной работе впервые проведена характеристика мономорфных и полиморфных динуклеотидных микросателлитных локусов генома партеновида А итяехиаН? на уровне первичной структуры молекулы ДНК. Изучены мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных мастеров. Показано, что мутации микросателлитов отражаются на таких молекулярно-биологических и биохимических характеристиках молекулы ДНК как: нуклеотидный состав, СС-содержание, энергия Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5'-3' и 3'~5' последовательностей. Дана количественная оценка изменений этих параметров характеризующих и объясняющих направление и интенсивность биохимических реакций и взаимодействий при формировании вторичной структуры, репликации и репарации молекулы ДНК. На основе изучения соотношений и частот встречаемости аллельных вариантов микросателлитных локусов в популяциях £>. штехиаШ разработана и реализована математическая модель генетико-лопуляционной структуры партеновидов.

Практическое значение работы

Выделенные микросателлитные локусы представляют новую систему молекулярных маркеров, которые могут быть использованы, как в рамках существующих систем оценки генетического разнообразия природных популяций, так и в рамках предложенной в данной работе математической модели, разработанной, специально для популяций партеногенетпческих видов. Данные количественные оценки и математическая модель могут быть широко применимы в практической работе по охране редких видов позвоночных животных в целом и партеновида О. итзехгшШ в частности.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: XVI. XVII, XVIII, XIX, XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии"

(Москва, 2004, 2005, 2006, 2007, 2009 гг.), XX зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии"(Москва, 2008 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи и 7 тезисов докладов и материалов конференций.

Объем к структура работы

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Библиография включает в себя 151 источник. Работа проиллюстрирована 62 рисунками и 8 таблицами.

Содержание работы Объект и методы исследования

В экспериментах исходным материалом была кровь, полученная от взрослых самок Darevskia unisexualis, Darevskia raddei и Darevskia valentini, отловленных в популяциях северной (Степанаван), северо-западной (Артик, Гош, Папанино) и центральной Армении (Такярлу, Кулак) и побережья оз. Севан (Загалу, Лчап, Норадуз) в июне - июле 2001 г. и консервированная в 0.05 М ЭДТА рН 8.0.

Исследование проводили стандартными методами молекулярной биологии и биохимии нуклеиновых кислот включающие: выделение ДНК из крови, скрининг геномной библиотеки на наличие (TG)„ - последовательностей, выделение рекомбикантных ДНК, рестрикционный анализ плазмидной ДНК, электрофорез рестрикционных фрагментов в агарозном геле, блоттинг, блот-гибридизацию, секвенирование рекомбинантной и амлифицированной ДНК, содержащей (TG)n -последовательности, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), электрофорез нативной и денатурированной ДНК в 8% и 6% полиакриламядных гелях (ПАЛГ). Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерных программ пакета DNASTAR Inc., OMIKO-MCS vl.l (разработана автором данной работы) и UnaFold-3.6.

Результаты и их обсуждение

Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (TG)„-микросателлиты. из геномной клонотеки D. unisexualis. Анализ изменчивости микросателлитных локусов у партеновида D. unisexualis.

В работе использовали ранее полученную геномную клонотеку D. unisexualis [Корчагин с соавт., 2004]. С помощью олигонуклеотида (TG)5 проводили скрининг 1000 рекомбинантных клонов. В результате было отобрано 5 клонов, дающих сильные позитивные сигналы гибридизации. Блот-гибридизационный анализ подтвердил наличие в этих клонах (GT)„-последовательностей. С помощью секвенирования была установлена первичная структура клонированных ДНК. В таблице 1 приведены последовательности

микросателлягкых кластеров в составе клонов, размеры секвенированных ДЫК и номера нуклеотидных последовательностей, депонированных в молекулярной базе данных ОепВапк.

Таблица 1 - Локусы, содержащие (ОТ)п-микросателлиты

Название локуса Микросателлитный кластер Размер локуса, п.н.

Ри231 (Ас. № ЕШ52540) (ОТ),4 573

Ри365 (Ас. № ЕШ52543) ОТООА(ОТ)22 540

Ри255 ("Ас. № ЕШ52541) (СТМАТЪ 657

Ри2.14 (Ас. № ЕШ52542) (СТЬ 558

Ри183 (Ас. № Е11252539) (ТС)10(АС)7(О)7(АОО)10 368

На основе секвенированных последовательностей были подобранны праймеры для монолокусного ПЦР-анализа этих ДНК (см. табл.2).

С помощью ПЦР-амплификацни было проанализировано 65 образцов ДНК особей из пяти популяций О. штехиаШ. Все локусы оказались фиксировано гетерозиготными. При этом, участки ДНК соответствующие локусам Ри231, Ви255 и Ри365 были электрофоретически мономорфными, а участки лскусов Он 183 и Ои214 - полиморфными, содержащими в данной выборке 3 и 6 аллельных вариантов соответственно (см. рис. 1).

Для определения природы аллельного полиморфизма локусов Ри214 выделены и секвенированы все варианты ПЦР-продуктов этих локусов, показанных на рисунке 1. Структура микросателлитных кластеров аллельных вариантов Ри214 и Ои183 представлена на рисунке 2 и в таблице 4. Оказалось, что аллели значительно различаются по строению и количеству мономеров микросателлитов. В случае локуса Би214 аллели подразделялись на две группы по наличию двойных нуклеотидных замен в начале микросателлитного кластера: в -Т (аллели 1, 3, 5, и 6) и А - А (аллель 2 и 4).

Был проведен анализ частоты встречаемости аллельных вариантов более полиморфного локуса (Ри214) в популяциях Д итвехиаИй. Полученные данные представлены в таблице.З.

ПНР-анализ локусов. гомологичных Рих83. Ри214. Ри231. Ри255 и Ри365, у двуполых родительских видов РагеузИа гаа'с!е'1 и РагеузЫа уакпИт.

Поскольку партеновид Д. ит$ехьаИ$ образовался в результате межвидовой гибридизации двуполых видов Д гаМе1 и Д. уакппт, интересным представлялось изучить . гомологичные локусы у этих родительских видов. Данные электрофоретического фракционирования ПЦР-продуктов ортологичных локусов родительских видов показывают, что бисексуальные виды гетерозиготны и высоко полиморфны по всем изучаемым, локусам. На рисунке 3 в качестве примера показаны картины электрофоретического разделения , ПЦР-амплификантов локусов Д гасПех и Д \alentini - гомологичных локусу Ри214 Д ип1зехиаИэ. Сходные картины были получены и для других локусов.

Таблица 2 - Условия ПЦР-амплификации пяти микросателлитных локуссв партековида D. unisexualis. _ ___

Название локуса Пара праймеров Температура отжига, °C Размер ПЦР-продукта. п.н.

Du231 5'TCAAGAGGCCTCCCGAAAAG 3' (F) 56 160

5'TGAGCCAGCTACCGTCATTCA3! (R)

Du365 5'GGGGCCCATTGTGTAAATACTGTA 3' (F) 55 254

5'GGATTAAGGGGTTTTCTCAGGACA3' (R)

Du255 5TCGCAGAGTGGCAGC-AAACAAT 3' (F) 212

5'TGCATCCAGCTCAACCAAAATACC 3' (R)

Dul 83 5'ACAGACAAACACTCATAGAACACAT 3' (F) 51 201

5'AATCAACAAGCCAAGAACAAAC3' (R)

Du214 L 5'TCACTTAAGGTTGACGCTGACTCA 3' (F) 50 223

5:CTGAACAAGTTGTCCACCTCTGC3' (R)

200 п.н.

Рисунок i - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПДР-продуктов локуса Dul83 - А и локуса Du214 - Б партековида D. unisexualis. Цифрами указаны аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса использовали 50 bp Ladder ("Fermentas", Литва) с шагом 50 п.н.

Таблица 3 - Количественная оценка вариабельности локуса Du214 у партеновида D. unisexualis. _ _

Популяция Аллельный вариант 1 Общее число особей

1 i 3 4 5 6

Кутчак 0 8 7 : 2 2 1 10

Лчап 0 10 10 0 0 0 10

Загалу 0 и 11 0 0 0 11

Норатус 0 17 17 0 0 0 17

Такярлу 12 ¡7 5 0 0 0 L . 17

По всем популяциям 12 63 50 2 1 1 65

ellele" ellelo2 8Üele3 aUeM alleles а1!е!е6

alielel a!ioi02 a'ie!e3 aliele4 а!1е1з5

10 20 30 40 50 60 70

CTGAACAAGT Г 6ТСС АС'СТСТ GC ССТ С A A A GT Т С A GA Т А С A A ACT GT SAT Т Т GG.CT Т .С С A GT Т ТТ б А С С Т CTGAACAAGTTGTCGAC ОТ CTGCCCTCAAAGTTCAGATACAAACTGT GA ТТТ QGCT Т CCAGTTTTGACCT СТGAACAAGTTGTCCACCTCTGCCCTCfAAGTT СAGAТАСАААОТGTSATТТGGCТТС СА ОТТТТGÁССТ CTGAACAhGTTGTCCACCTCTGCCCTCAAAGTTCA3A7ACAAAC;TGTSATTTGGCTTCCAGTTTTGACCT CTGAACAAGTTGTCCACCTCT GCССТСАААОТТСAGAТАСАААСТGTGATTтGSCTTССAGTТТТGAСОТ CTGAACAAGTTSTCCACCTCTGCCCT.CAAÁSTTCAGATACAAAÓTGTGATTTGG.CTTCCAGT-TTGACCT

93

ССТ CCTGAGCAAAAC3AA CCTCCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA ССТ CCTGAGCAAAAGAA ССТ CCTGAGCAAAAGAA CCTCCTGAGCAAAAGAA

160 _

gGTGTSTGTGTGTGT IGTGTGTGTGTGTGT

Igtgtgtstgtgtgt Ígtgtgtgtgtgtgt |gtgtgtgtgtgtgt igt gtgtgtgtstgt

1ЕГ

lio

gtgtgtgtgtc

gtgtgtc5tgtc gtgtgtgtgtc gt gt gtvqt gt g gt gt gt gt gtgtgtgt gt gt gt st'gt gt gt 3tgtg 140 gtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgtgt gtst gt..... 136

ГGTGTgtgtGTGTGTGTGTGTGT- - -

ГGTST GTGT GTCT GT GT.........

t GT gt GTGT GTGTSTGT GT GT GTGT-T GTGT GT GTGT GTGT GTGT...... -

8llele2 ■ ■ ■

a!iele3 . . -

at¡ele4 - - -alíete* T GT GT

эИе1е6 ■ - .

lio

AAAGCCACTTTT AAAGCCACTTT T AAAGCCACTTTT AAAGCCACTTTT AAAGCCACTTTT AAAGCCACTTTT

léo

ИГ

lie

2¿0

21C

ATGATATCAAAGCAAAAT ATGA TATCAAAGCAAAAT AT GAT ATOAAAQCAAAAT ATGATATCAAAGCAAAAT ATGATATCAAAGCAAAAT ATGATATCAAAGCAAAAT

AT GCA GT GT A AT GCA GT GT A ATGCAGTGTA A T GCA GT GT A A T GC A GT GT A AT GCAGTG

aileiel alleles allele3 allele* allelaS. alletoe

2¿0 ?30

GAGY CAGCGTCAACCTT AAGT GA GAGT CAGCGTCAACCTTAAGT GA GAGTCAGCGTCAACCTTAAGTGA GAGTCAGCGTCAACCTTAAGTGA GAGTCAGCGTCAACCTTAAGTGA GAGTCAGCGTCAACCTTaagtga

AAAACAAAACAAAAAACCCTTCAAT 202

AAAACAAAACAAAAAACCCTTCAAT 1S6

А А А А С A A A ACA AÁAAACCCTTCAAT 20«

AAAACAAAACAAAAAACCCTTCAAT 196

AAAACAAAACAAAAAACCCTTCAAT 210 AAAACAAAACAAAAAACCCTTCAAT 200

. 219 227 221

Рисунок 2 - Нуклеотидные последовательности партеногенетического вида £>. итяехиаНя. прямоугольной рамкой. Фиксированные нуклеотидные вариации показаны серым прямоугольником

ДНК аллелей локуса Du2!4 (GT)n-toiacTepbi выделены

D. raddei Jl

D.valentini

250 п.н.

200 п.н.

Рисунок 3 - Электрофорез в 8% нативном Г1ААГ выборки ПТДР-продуктов соответствующих локусу Du214 у D. raddei и D. valentini. В качестве маркера молекулярного веса использовали 50 bp I,adder ("Feraientas") с шагом 50 я.н.

Чтобы определить какие аллели локуса Du214 родительских двуполых видов наследованы партеновидом, были выделены и секвенированы разные варианты ПЦР-продуктоБ D. raddei и D. valentini. Оказалось, что аллели Du214 партеновида, содержащие двойные нуклеотидные замены G-T, наследованы от D. raddei, а содержащие А-А - от D.valentini (см, рис 4).

В

Г

>I®3TGTSTGTGTG,rSTGTGTGTGTGTGTGTSTGTGTGlGTGTGTGT5TGTGTGTGTGTG'; UMCCXCTtf

iüSsT&TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT------------------------UUiGCCACTTT

SlffiGTGTGTGTG'TGTGTGTGTGTGT'GTGTGTGTGTGTG'ÍGTGTGTGT---------------UAGCCACTTT

¡TfflpTGTGTGTGTGTGTGTGT&TGTG'rGTG'rGTGTeTGTGTGT---------------------lAftGCCACTTT

Рисунок 4 - Нуклеотидные последовательности мякросателлитных кластеров ортологичных локусов родительских видов. (ОТ)п-кластеры выделены прямоугольной рамкой. Нуклеотидные вариации показаны серым прямоугольником.

Сравнительный анализ биохимических и физико-химических характеристик микросателлитных локусов генома D. unisexualis.

В серии предыдущих работ были подробно изучены молекулярные и генетические свойства тетра нуклеотидных микросателлитных локусов (Du215, Du281, Du323) у ряда однополых и двуполых видов ящериц рода Darevskia [Korchagin et al., 2007; Малышева с соавт., 2007; Давоян с соавт., 2007; Вергун А.А. с соавт., 2007]. Характерной особенностью было то, что эти локусы имели разный уровень полиморфизма в зависимости от видовой принадлежности. Так, например, локус Du281 был наиболее полиморфен у партеновида D.unisexualis, тогда как у партеновида D.dahli более полиморфным был локус Du2I5, а мовоморфный у D.unisexualis локус Du323 оказался полиморфным у D.armeniaca. При этом, нуклеотидные последовательности микросателлитных кластеров ортологичных локусов у разных яартеновидов могли отличаться существенно. По-видимому, генетические свойства (изменчивость) этих локусов могут быть связаны с биохимическими и физико-химическими характеристиками нуклеотидных последовательностей ДНК. Поэтому следующей задачей работы было проведение сравнительного анализа биохимических и физико-химических характеристик микросателлит содержащих ДНК с целью выявления их возможной корреляции с генетическими свойствами (уровнем полиморфизма) локусов. Исследования проводили на локусах, изучаемых в данной работе (см. табл.1), и охарактеризованных ранее (Du215, Du281 и Du323).

Изучение первичной структуры участков молекулы ДНК соответствующих локусам Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365 показало, что влияние микросателлктного кластера на биохимические и физико-химические параметры молекулы ДНК в данных областях различно в зависимости от протяженности и сложности микросателлитного кластера. Количественная и качественная оценка указанных зависимостей в случае динуклеотидных и тетрануклеошдных микросателлитов представлена в таблицах 4 и 5. При этом в таблице 5 приведена оценка возможности увеличения или уменьшения того или иного параметра при увеличении числа мономерных звеньев в микросателлитном кластере. Графики изменения средней свободной энергии в зависимости от длины рассматриваемого участка молекулы ДНК для мо.чоморфных локусов представлены на рисунках 5 и 6.

Существует несколько моделей, объясняющих изменчивость микросателлитных локусов [Schlutíerer et al., 1992; Di Rienzo et al., 1993; Kruglyak et al. 1998], ко взаимовлияние изменений биохимических и физико-химических характеристик этих участков молекулы ДНК на их генетические свойства

D. raddei —Г

D. valentini —Г" .

остаются все еще малоизученными При этом большинство из указанных моделей укладывается в так называемую «шаг за шагом» модель ("Stepwise mutation model", SMM), согласно которой изменения в длине микросателлитных кластеров происходят последовательно за счёт увеличения или уменьшения длины повтора на одну мономеркую единицу в результате репликационных ошибок.

Мы предполагаем, что молекулу ДНК следует рассматривать как систему, устойчивость которой определяется свободной энергией и от нее зависит, в каком направлении будет происходить изменение длины микросателлита. Ею же определяется конформация - перегибы и сочленения - больших молекул ДНК, РНК и белков [Симан, 2007]. Любая система всегда стремится к состоянию с наименьшей свободной энергией. Свободная энергия двух взаимно дополняющих цепей нуклеотидов минимальна, когда они образуют двойную спираль, в свою очередь свободная энергия однонитевой молекулы ДНК минимальна, когда она образует ДНК/ДНК-дуплекс - «шпильку» или комплементарную структуру, удерживающую выпетливание участка микросателлитного кластера. Возможность микросателлитных последовательностей образовывать «шпильки» и петли тем больше, чем больше отрицательное значение ДО при образовании удерживающего данную структуру дуплекса и именно образование «шпильки» и петли, а в дальнейшем и «проскальзывание» цепей ДНК при репликации является ключевым моментом в так называемой «шаг за шагом» мутационной модели [Valdes et al., 1993].

у.Дж^моль

• -- v.: -• --■: - V •■- г-.- -. - :■.--•-.■- Т.

.■' ■ л ■ .

.....

] — -Р• '-'-..............-f-—--—'

ч.-'.'"ч

.й ■. .1.. .■V .-iJi-.i...... ..Л. L -

^ -VY^^'С'^'лГ^ -'.лЧ.■ '. Чм^-v,

...................-.....«г-}.,-..;

-Газмер пос-тн, hi.

SO. 100: ISO-". 230 / >0:/.

35? , .403. 450 ' 500.': .550. '600. '.650

Рисунок 5 - Средняя свободная энергия образования ДНК/ДНК-дуплекса для локуса Ои255. Вертикальными линиями, параллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера на график.

А

Рисунок 6 - Средняя свободная энергия образования ДНК/ДНК-дуплекса для локуса 13и231 - А и Ви365 - Б. Вертикальными линиями, параллельными оси ординат, показана проекция микросагеллигного кластера на график.

На основании этого можно сказать, что изменения в микросателлитных кластерах, изучаемых в данной работе, локусов будут происходить в сторону такого числа микросателлитных звеньев, которое обеспечит всему яокусу наименьшее значение ДОор. Таким образом, можно ожидать, что изменения локусов Ви183, Би365 и Би214, исходя из термодинамических расчетов, будут направлены в сторону увеличения микросателлитных кластеров, а изменения локусов Ви215, Би255, Би323 и Ви281 - в сторону уменьшения микросгтеллитного кластера.

Таблица 4 - Сравнительные биохимические и физико-химические характеристики полиморфных микросателлитных

локусов и их аллельных вариа нтов

Локус* / аллельный вариант* * Микросателлитный кластер Размер ДНК, (нукл.) G + С, % Суммарная AG образования ДНК/ДНК дуплекса, Д ж/моль. Средняя AG образования ДНК/ДНК дуплекса, Дж/моль

Du 183 (TG),o(AG)7(G)7(AGG),o 368 48,8 -2576670 -7002

2 (TG)7(AG)7(G)7(AGG)9 192 47,7 -1334864 -6952

3 (TG)7(AG)7(G)7(AGG)10 195 48,9 -1359869 -6974

1 (TG)io(AG)7(G)7(AGG)io 201 50 -1411458 -7022

Du214 GTAA(GT)21 558 40,9 -3807123 -6823

2 GTAA(GT)m 219 40,8 -1488140 -6795

4 GTAA(GT)2, 221 40,8 -1502598 -6799

6 GTAA(GT)24 223 41 -1519754 -6815

1 (GTb 225 41,5 -1534213 -6819

3 (GT)26 227 41,5 -1548672 -6822

5 (GT)29 233 41,7 -1592048 -6833

Du281 (GATA), 0TAG ATA 566 40,7 -3778210 -6795

4 (GATA)joTAGATA 197 36,2 -1304142 -6620

1 (GATA)9GATGATATAGATA 200 34,6 -1311608 -6558

6 (GATA) 11 TAG ATA 201 36 -1329092. -6612

3 (GATA ) i oG ATG A TA TA GA TA 204 34,3 -1336557 -6552

5 (GATA) ) i G ATG ATAT AG A TA 208 34,3 -1361507 -6546

2 (GATA) i -jGATG ATATAG ATA 212 34 -1386456 -6540

Du215 GAT(GATA),, 453 40,6 -3087897 -6817

1 GAT(GATA)4GAT(GATA)7 145 31,2 -955411 -6589

2 GAT(GATA)i0 138 32 -917576 -6649

3 GAT(GATA), 134 32,3 -892627 -6661

* - полная вставка рекомбинантного клона; ** - ПЦР-амллификант на ДНК рекомбинантного клон

Таблица 5 - Качественная оценка влияния увеличения микросателлитпого кластера на физико-химические параметры молекулы ДНК______________________________________

Название локуса Уровень полиморфизма* Классификационный признак микросателлита Параметр

Процентная доля нуклеотида Модуль разности молекулярных масс 5'-3' и 3'-5' последовательностей Средняя АС образования ДНК/ДНК дуплекса

А с С т

Ои214 высокополиморфный совершенный / простой 1 1 ■'ЧЧ 1 1

Би281 несовершенный / простой - Т:' X 1 Т

ЕМ 83 слабополиморфный совершенный / сложный 1 Т 1

Би215 совершенный / простой -т; 1 1 Г

Ои255 мономорфный совершенный / сложный , 4' : Т т

Ви231 совершенный / простой 1 1 1 . 1 I

Би365 несовершенный / простой 1 Г т 1

Би323 несовершенный / простой } 4 1 - т т

- увеличение характеризуемого параметра уменьшение характеризуемого параметра | - характеризуемый параметр не изменяется

Серым цветом показаны преобладающие нуклеотиды в микросателлитном звене

* - уровень полиморфизма определялся относительно числа аллельных вариантов характерных для микросателлитных локусов геномов партеногенетических видов рода Багел^Ш.

Данное теоретически рассчитанное предсказание подтверждается результатами семенного анализа партеногенетнческих потомков О.итзехиаНз по локусу Ви281. Было показано, что в 4-х исследованных семьях из 24 потомков 9 имели мпкросателлитный кластер равный по размеру кластеру в геноме матери, 4 потомка имели больший по размеру кластер и 11 потомков имели меньший, чем у материнского организма микросателлитный кластер [ВасЗаеуа е! а!., 2008]. Таким образом, оказалось, что при случайном характере микросателлитных мутаций с течение'М времени в популяциях В. итвехиаШ будет происходить преимущественное накопление аллельных вариантов локуса Би281 с меньшим по размеру микросателлитным кластером и с наименьшем значением ДОср.

Микросателлитные последовательности в целом и микросателлиты СТ-типа в частности способны образовывать большое количество неканонических структур ДНК. К таким структурам относятся й-квадруплексы, параллельные дуплексы, триплексы [Калюжный с соавт., 2008]. Компьютерное моделирование вторичных структур исследуемых в данной работе локусов показывает, что способность образовывать неканонические вторичные структуры зависит от числа мономеркых звеньев в микросателлитном кластере, от типа микросателлитного кластера и единичных нуклеотидных замен в микросателлитных звеньях. Так, на примере локуса Ьи183 (см. табл. 4) отчетливо наблюдается влияние каждого отдельного микросателлитного кластера и совокупное влияние всего микросателлкта на возможность локуса образовывать различные вторичные структуры. Вне зависимости от протяженности динуклеотидных и мононуклеотидных кластеров, тринуклеотидный кластер локуса Би183 образует вторичную структуру, показанную на рисунке 7.А. Однако, если бы данный локус вообще не содержал микросателлита, то образуемая им вторичная структура имела бы совсем другой вид (см. рисунок 7.Б). Подобные эффекты характерны также для локусов Ви214, Би255 и Би281.

Рисунок 7 - Компьютерное моделирование вторичных структур однонитевой последовательности ДНК локуса Ои183. А - нуклеотидная последовательность Ви183, содержащая 4 микросателлитных кластера, Б - нуклеотидная последовательность 13ц 183 без микросателлитых кластеров. Цифрами показаны порядковые номера некоторых нуклеотидов в последовательности.

■а—с—о-а—а—с—а—а—с—т~а—■

А

V

■ Т-Т-С-С-А-О-Т-А-Т-О-Т-Л-Т-Т

Математическое моделирование и анализ закономерностей распределения частот аллелей вариабельных локусов в популяциях Р. утзехиаНз. Разработка математической модели для характеристики генофонда однополых видов.

В настоящее время в арсенале математической биологии доя описания генетического разнообразия существует ряд математических показателей [Ризниченко, 2002], которые позволяют оценить уровень меж- и виутрипопуляционного разнообразия, предложенных в рамках математических моделей разных типов. К таким показателям, - например, относятся: Я-гетерозиготность, или внутрипопуляционное разнообразие, и Т^-межпопуляционное разнообразие генофонда. Подобные параметры наиболее часто применяются в генетико-популяционных исследованиях и в том числе в исследованиях ящериц рода ВагечьЫа. Однако, в работе [Петросян с соавт., 2003] показано, что оценка генетического разнообразия по классической формуле Нея:

п - количество особей, А - количество аллелей на локус, -частота ]-го аллеля конкретного локуса, некорректна в условиях исследования партеногенетических видов животных, т.к. она, как и все остальные перечисленные показатели, применимые в математических моделях биологии и построенные на основе учета аллельного разнообразия, основываются на математических следствиях из закона Харди-Вайнберга. В основе данного закона лежат такие определяющие допущения (ограничения) как: наличие случайно скрещивающихся особей и большое генетическое разнообразие популяций, образующее пул (общий фонд) генов -которые, однозначно, не имеют место в популяциях партеновидов в принципе [Хедрик, 2003].

Для обработки данных представленных в таблице 3 нами была разработана и реализована математическая модель, которая позволила выявить частоту встречаемости каждого аллельного варианта (БО локуса Би214 в генофонде партеновида Д. итзехиаИв (рис.8.А) и на основе анализа частоты встречаемости аллельных вариантов представить генетико-популяциокную структуру вида, демонстрирующую совокупный генетический вклад каждой популяции (БД учитывающую популяционный вклад по каждому аллельному варианту^) (рис.8.Б):

у тМ-

$'и=--------:-,где:

/77,.,

* I т, 3 м к ,

И-- I т.. Е

=1 /=1 п} /=1 7=1 п: X ти

V

Шу - число особей популяции! содержащих аллель ¡; п, - число особей в популяцпи ]; к - число аллельных вариантов;

/ - число популяций вида; - весовой коэффициент для каждого аллельного варианта ¡.

Рисунок 8 - Частота встречаемости аллельных вариантов локуса Du214 партеновида D.unisexualis - А и генетико-популяционная структура партеновяда unisexualis - Б.

вариант 2 43%

Нсратус 21,5%

У D.

Эта математическая модель, допускает одновременный расчет данных по нескольким полиморфным локусам. Кроме того, результаты подсчета частот различных аллельных вариантов локуса Du214 в каждой популяции партеновида D. unisexualis показывают, что сумма частот различных аллельных вариантов для каждой популяции D. unisexualis в генофонде вида (SFj) является постоянной и равной во всех популяциях:

S^ Кутчак = S~ Лчап — ^^Загачу — S' Нсратус = S' Такярлу = 0,2.

В ходе ряда элементарных математических преобразований удается доказать это утверждение в общем виде в рамках предложенной нами математической модели для любого фиксированно-гетерозиготного партеновида: SFj = const |V/eZ>0J =1,2,3 .J,

предварительно указав, что под фиксированной гетерозиготностью понимается то. что все особи вида являются одновременно только либо гаплоидными, либо диплоидными, либо тетраплоидными и т.д. по данном)' локусу, т.е.: С = const I С е Z > 0 > где: с - плоидность особей.

Следует отметить, что данное утверждение теряет свою силу, если условие фиксированной гетерозиготности в отношении какого-либо локуса не соблюдается. Константность сумм частот различных аллелей локусов в популяциях партеновкдов позволяет предположить, что существует некоторый генетико-популяционный механизм, приводящий генофонд партеновида относительно частот аллелей в равновесное состояние, выход из которого происходит, если в результате мутационных событий или актов межвидовой и внутривидовой гибридизации (что является достаточно распространенным явлением у ящериц рода Darevskia [Даревский, 1993]) нарушается условие фиксированной гетерозиготности особей партеновида.

Выводы

1. Впервые определена молекулярная структура пяти микросателлитных динуклеотидных локусов (Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365) генома паргеногенетической ящерицы D. unisexualis и гомологичных локусов в геномах родительских видов D. raddei и D. valentini.

2. Проведена оценка внутривидового полиморфизма этих локусов у партеновида D.unisexualis.

3. Установлено, что аллельные варианты локусов Dul83, Du214, Du231, Du255, Du365 и гомологичные локусы родительских видов отличаются числом повторов мономерного звена .в микросателлитных кластерах и единичными нуклеотидными заменами в прилежащих к микросателлиту областях ДНК.

4. Показано, что интенсивность и направление изменений микросателлитных последовательностей Dal83, Du214, Du231, Du255 и Du365 может объясняться изменением средней свободной энергии (AG) образования ДНК/ДНК-дуплекса на данных участках молекулы ДНК.

5. Разработана и реализована математическая модель генетико-популяционной структуры партеновидов, на основе которой установлен генетический вклад каждой из пяти исследованных популяций (21,5%, 18,4%, 21,5%, 17,1% и 21,5%) в генофонд партеновида D. unisexualis.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Омельченко A.B., Корчагин В.И., Севастьянова Г.А., Токарская О.Н. Полиморфизм микросателлитных динуклеотидных локусов у партекогенетических ящериц Darevskia unisexualis. // Доклады академии наук, 2009, том 424, №1, с. 122-124. (0,3 п.л., доля авторского участия - 80%);

2. Омельченко A.B., Корчагин В.И., Севастьянова Г.А., Рысков А.П., Токарская О.Н. Молекулярно-генетическая характеристика микросателлитных динуклеотидных локусов у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis. // Генетика, 2009, том 45, №2, с. 230-238. (1,1 пл., доля авторского участия - 80%);

3. Корчагин В.И., Мартиросян И.А., Омельченко A.B., Даревский U.C., Рысков А.П., Токарская О.Н. Изучение аллелыюго полиморфизма (GATA)n-содержащих локусов партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis (сем. Laseriidae). // Генетика, 2004, том 40, №10, с. 1336-1342. (0,8 п.л., доля авторского участия - 25%);

4. Омельченко A.B., Корчагин В.И., Бадаева Т.Н., Малышева Д.Н., Мартиросян И.А., Рысков А.П. Геномная нестабильность и генетическое разнообразие у клонально размножающихся ящериц рода Darevskia. Н Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии. - Т.1 - Киев: Логос, 2007. - С. 256-260. (0,3 п.л., доля авторского участия - 10%);

5. Омельченко A.B., Корчагин В.И., Севастьянова Г.А. Термодинамические аспекты нестабильности микросателлитных да-, три- и тетрануклеотидных последовательностей ДИК у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis. // Тезисы XXI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления

физико-химической биологии», 9-11 февраля 2009, Москва.С. 15. (0,07 пл., доля авторского участия - 90%);

6. Омельченко A.B., Токарская О.Н., Севастьянова Г.А. Популяционная структура партеновида Darevskia unisexualis, определенная с помощью микросателлитных динуклеотидных маркеров ДНК. // Тезисы XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии», 11-15 февраля 2008, Москва. С. 36. (0,07 пл., доля авторского участия -85%);

7. Омельченко A.B., Токарская О.Н., Севастьянова Г.А. Проблема изменчивости генома на примере микросателлитных локусов однополого вида Darevskia unisexualis //' Тезисы XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии», 7-9 февраля 2007, Москва. С. 43. (0,07 пл., доля авторского участия - 80%);

8. Омельченко A.B., Корчагин В.И., Севастьянова Г.А. Изучение динуклеотидных (TG)n последовательностей ДНК геномов однополого и двуполого видов ящериц рода Darevskia// Тезисы XVm зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии», 7-10 февраля 2006, Москва. С. 61. (0,07 пл., доля авторского участия - 80%);

9. Омельченко A.B., Корчагин В.И.,, Токарская О.Н., Севастьянова Г.А. Изучение микросателлитных динуклеотидных последовательностей генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualisll Тезисы XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии», 7-10 февраля 2005, Москва. С. 60. (0,07 пл., доля авторского участия -

10.Омельченко A.B., Корчагин В.И., Низамутдинова Ю.Х., Севастьянова Г.А., Токарская O.K. Клонирование (TG)„' микросателлитных последовательностей генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis (,Lacertidae).// Тезисы XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии», 9-12 февраля 2004, Москва. С. 51. (0,07 п.л., доля авторского участия - 70%);

11.Омельченко A.B., Корчагин В.И., Низамутдинова Ю.Х., Севастьянова Г.А., Токарская О.Н. Молекулярно-генетический анализ вариабельного (GATA)n микросателлитного локуса генома партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis (Lacertidae).// Тезисы XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии», 9-12 февраля 2004, Москва. С. 25-26. (0,07 пл., доля авторского участия - 30%).

75%);

Подп. к печ. 01.04.2009 Объем 1 п.л. Заказ №.63 Тир 100 экз. Типография МПГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Омельченко, Андрей Владимирович

Принятые сокращения и аббревиатуры.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.g

1.1 Геном эукариот. Структура и характеристика генома эукариот.

1.1.1 Уникальные последовательности генома эукариот.

1.1.2 Умерено повторяющиеся последовательности генома эукариот.

1.1.3 Часто повторяющиеся последовательности генома эукакриот.

1.2 Микросателлитные последовательности ДНК.

1.2.1 Определение и классификация микросателлитов.

1.2.2 Роль и функции микросателлитов.

1.2.3 Механизмы нестабильности микросателлитов.

1.3 Термодинамический аепект структурной организации генома эукариот. Изохоры. CpG-островки.

1.4 Вариабельность генома и генетико-популяционные исследования.

1.4.1 Маркеры в генетических исследованиях: роль, свойства и классификация.

1.4.1.1 Биохимические маркеры.

1.4.1.2 ДНК-маркеры.

1.4.1.2.1 Маркеры на основе ПДРФ.

1.4.1.2.2 Маркеры, основанные на ПЦР.

1.4.1.2.2.1 Мономорфные ДНК-маркеры.

1.4.1.2.2.2 Полиморфные ДНК-маркеры.

1.4.2 Математическое моделирование генетико-популяционных процессов.

1.4.2.1 Классификация математических моделей в биологии, классы задач и математический аппарат.

1.4.2.2 Математическое моделирование генетических процессов на популяционном и видовом уровнях.

1.5 Однополые виды позвоночных животных и их популяции.

1.5.1 Общая характеристика вида Darevskia unisexualis.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Выделение ДНК из крови.

2.2 Анализ нативности ДНК.

2.3 Анализ ДНК на спектрофотометре.

2.4. Анализ геномной клонотеки D. unisexualis.

2.4.1 Скрининг геномной библиотеки на наличие (TG)n последовательностей.

2.4.1.1 «Колони» - гибридизация.

2.4.1.2 Приготовление (TG)9-зонда.

2.4.1.3 Гибридизация.

2.5 Выделение плазмидной ДНК.

2.6 Рестрикция плазмидной ДНК, электрофорез рестрикционных фрагментов в агарозном геле, блоттинг, блот-гибридизация.

2.7 Секвенирование рекомбинантной ДНК, содержащей (TG)n -последовательности. Постановка вычислительного эксперимента.

2.8 Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.8.1 Подбор праймеров.

2.8.2 Подбор условий для ПЦР.

2.9 ПЦР-анализ.-.

2.9.1 Подготовка стекол.

2.9.2 Приготовление 8 % полиакриламидного геля (ПААГ) для нативной ДНК и 6% геля ПААГ для денатурированной ДНК.

2.9.3 Заливка ПААГ «накатом».

2.9.4 Электрофорез нативной ДНК и денатурированной ДНК в ПААГ.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (ТО)п-микросателлиты, из геномной клонотеки D. unisexualis.

3.2 Анализ изменчивости микросателлитных локусов у партеновида D.unisexualis.

3.3 ПЦР-анализ локусов, гомологичных Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365, у двуполых родительских видов Darevskia raddei и Darevskia valentini.

3.4 Сравнительный анализ биохимических и физико-химических характеристик микросателлитных локусов генома D.unisexualis.

3.5 Математическое моделирование и анализ закономерностей распределения частот аллелей вариабельных локусов в популяциях D.unisexualis. Разработка математической модели для характеристики генофонда однополых видов.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Полиморфизм микросателлитсодержащих локусов генома у различных однополых и двуполых видов рода Darevskia.

4.2 Интерпретация результатов биохимического и физико-химического анализа в приложении к исследованиям вариабельных участков генома.

4.3 Сравнительный анализ, практика и перспективы применения предложенной математической модели.

5 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis"

Молекулярные механизмы и характеристика процессов нестабильности генома являются наиболее актуальными вопросами молекулярной биологии и биохимии нуклеиновых кислот. Микросателлитные последовательности ДНК выступают как один из факторов подобной нестабильности. Микросателлиты представляют собой тандемные повторы ДНК с размером мономерного звена от 2 до 6 нуклеотидов. Микросателлитный кластер занимает в среднем от 20 до 60 пар нуклеотидов (за исключением экспансии триплетных повторов, наблюдаемой при некоторых наследственных болезнях человека О

Гайцхоки с соавт., 2000]). Микросателлиты имеют высокие скорости мутирования от 10" до 10 5 в зависимости от типа микросателлита [Ellcgren, 2004], что приводит к накоплению популяционно-специфических мутаций и позволяет использовать информацию об изменчивости микросателлитных локусов для анализа структуры популяций [Rosenberg et al., 2002]. Тамдемпые повторы в целом и микросателлитные последовательности ДНК в частности наделяются рядом исследователей важной ролью в функционировании генома на биохимическом, молекулярном и субклеточном уровнях [Зимпицкий с соавт., 2005]. В настоящее время к наиболее изученным относятся микросагеллиты человека, ряда животных и растений [Neff et al., 2001; Животовский, 2006]. В то же время, однополые виды животных с клональным типом размножения остаются все еще малоизученными как с точки зрения молекулярной биологии и биохимии ДНК, так и с точки зрения генетической изменчивости [Tokarskaya et al., 2001]. Уникальной природной моделью для проведения исследований по характеристике и анализу микросателлитных последовательностей ДНК является облигатно-партеногенетический вид кавказских скальных ящериц Darevskia unisexualis [Arribas, 1999], который имеет гибридное происхождение от родоначальных двуполых видов D. raddei и D. valentini. Среди всего спектра микросателлитных последовательностей особое значение имеют динуклеотидные микросателлиты, которые не только наиболее широко представлены в геноме эукариот [Sharma et al., 2007], но и являются наиболее эволюционно-консервативными генетическими маркерами ДНК.

Важным представляется характеристика полиморфных динуклеотидных микросателлитных участков генома на уровне первичной структуры молекулы ДНК. Подобные исследования становятся все более актуальными для геномов многих позвоночных животных, однако проводятся лишь в очень незначительной степени для геномов партеногенетических видов в целом и ящерицы D. unisexualis в частности. Мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных кластеров и число микросателлитных звеньев, изменяют такие важные молекулярно-биологические и биохимические характеристики как нуклеотидный состав, GC-содержание локусов, энергия Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5'-3' и 3'-5' последовательностей. Количественная оценка подобных параметров характеризующих и объясняющих направление и интенсивность биохимических реакций и взаимодействий при формировании вторичной структуры, репликации и репарации молекулы ДНК поможет в дальнейшем раскрытию глубинных биологических закономерностей на различных уровнях организации живого.

Практическая ценность исследования микросателлитных участков ДНК заключается в том, что на основе анализа вариабельности и распространенности аллельных вариантов данных локусов в популяциях выделяются последовательности применимые в качестве генетических маркеров. Однако, распространенные математические модели в большинстве своем адаптированы для исследований популяций двуполых видов и не приспособлены для популяций партеновидов [Петросян с соавт., 2003]. В связи с этим, актуальной представляется разработка и реализация математической модели, количественно определяющей вклад популяций в генофонд партеногенетических видов и раскрывающая генетико-популяционную структуру партеновида. Данные количественные оценки могут быть широко применимы в работе по охране редких» видов позвоночных животных в целом и партеновида/). unisexualis в частности.

В связи с этим, цель данной pa6oiM - получение и молекулярная характеристика локусов, содержащих микросателлитные динуклеотидные последовательности генома партеногенетической ящерицы D. unisexualis, для оценки их изменчивости и вклада в генетическое разнообразие партеновидов.

Для достижения указанной цели в данной работе решались следующие задачи:

1) поиск вариабельных динуклеотидных микросателлитных последовательностей ДНК генома D. unisexualis;

2) определение молекулярной природы микросателлитных локусов в популяциях D. unisexualis;

3) исследование биохимических и молекулярно-биологических параметров микросателлитных последовательностей ДНК и их аллельных вариантов для характеристики и формализации процессов изменчивости молекулы ДНК;

4) разработка и применение системы количественной оценки вариабельности микросателлитных последовательностей ДНК как генетических маркеров для оценки внутри- и межпопуляционных закономерностей у партеновида/).unisexualis.

1 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Омельченко, Андрей Владимирович

5 Выводы

1. Впервые определена молекулярная структура пяти микросателлитных динуклеотидных локусов (Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365) генома партеногенетической ящерицы D. unisexualis и гомологичных локусов в геномах родительских видов D. raddei и D. valentini.

2. Проведена оценка внутривидового полиморфизма этих локусов у партеновида D.unisexualis.

3. Установлено, что аллельные варианты локусов Dul83, Du214, Du231, Du255, Du365, и гомологичные локусы родительских видов отличаются числом повторов мономерного звена в микросателлитных кластерах и единичными нуклеотидными заменами в прилежащих к микросателлиту областях ДНК.

4. Показано, что интенсивность и направление изменений микросателлитных последовательностей Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365 может объясняться изменением средней свободной энергии (AG) образования ДНК/ДНК-дуплекса на данных участках молекулы ДНК.

5. Разработана и реализована математическая модель генетико-популяционной структуры партеновидов, на основе которой установлен генетический вклад каждой из пяти исследованных популяций (21,5%, 18,4%, 21,5%, 17,1% и 21,5%) в генофонд партеновида D. unisexualis.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Омельченко, Андрей Владимирович, Москва

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 98. № 9. С. 11-73.

2. Апонин Ю.М., Апонина Е.А. Иерархия моделей математической биологии и численно-аналитические методы их исследования // Математическая биология и биоинформатика, 2007. Т. 2. №2. С.347-360.

3. Базыкин А.Д. Нелинейная динамика взаимодействующих популяций. М. Иж.: ИКИ. 2003. 368 с.

4. Бакланов Г.И. Некоторые вопросы индексного метода. М.: Статистика, 1972. 72 с.

5. Банников А.Г., Даревский И.С., Денисова М.Н., Дроздов Н.Н., Иорданский Н.Н. Жизнь животных. М.: "Просвещение". 1969. Т. 6. С. 282 284.

6. Брусиловский П.М. Становление теоретической биологии и математическое оделирование // Проблемы анализа биологических систем: Сборник Под. Ред. В.Н.Максимова. Изд-во МГУ, 1983. - 132 с.

7. Даревский И.С. Эволюция и экология партеногеиетического размножения у пресмыкающихся / В сб.: Современные проблемы теории эволюции. М.: "Наука". 1993. С. 89-109.

8. Елисеева И.И., Юзбашев М.М. Общая теория статистики. М.: Финансы и Статистика, 2008. 655 с.

9. Животовский JI.A. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы её изучения // Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. № 1. С. 74-96.

10. Забаровский Е.Р. Альтернативные подходы к секвенированию и картированию генома// Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 2. С. 224.

11. Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., Уразбаев В.Н. Тамдемные повторы ДНК и концепция матричного синтеза протеогликанов. М.: Лабиринт, 2005. - 103 с.

12. Калюжный Д. Н., Бондарев Ф. С., Щелкина А. К., Лившиц М. А., Борисова О.Ф. Внутримолекулярные G-квадруплексы, образованные микросателлитной последовательностью d(GT)i2 в присутствии ионов К+ // Молекулярная биология, 2008. Т.42. №1. С.693-700.

13. Костюченко М.В., Удина И.Г., Зайцев A.M., Храброва Л.А., Сулимова Г.Е. Изучение генетического разнообразия пород лошадей отечественной селекции на основе RAPD-PCR и микросателлитных маркеров //Сельскохоз. биология. 2001. №6. С.29-34.

14. Куприянова Л.А. Некоторые цитогенетические закономерности сетчатого видообразования однополых видов ящериц (Reptilia, Lacerddae) и других групп позвоночных животных. // Цитология. 1997. Т.39. № 2. С. 1089 1108.

15. Левич А.П. Энтропия как мера структурированности сложных систем // Труды семинара "Время, хаос и математические проблемы". Вып.2. М.: Книжный дом "Университет". 2001. С. 163 - 176.

16. Левич А.П., Фурсова П.В. Задачи и теоремы вариационного моделирования в экологии сообществ // Фундаментальная и прикладная математика, 2002, том 8, вып. 4, с. 1035-1045.

17. Малышева Д.Н., Вергун А.А., Токарская О.Н. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов микросателлитного локуса Du215 (arm) у партеновида Darevskia armeniaca (Lacertidae). II Генетика, 2007. Т. 43. № 2. С. 170-175.

18. Малышева Д.Н., Токарская О.Н., Даниелян Ф.Д., чл-корр. Даревский И.С., чл-корр. Рысков А.П. Обнаружение микросателлитных мутаций у партеногенетических ящериц Darevskia armeniaca. // Доклады Академии Наук.2005. Т. 400(2). С. 265-268.

19. Мартиросян И.А., Кан Н.Г., Петросян В.Г. и др. Фингерпринтный анализ вариабельности мини- и микросателлитных повторов ДНК упартеногенетических ящериц Darevskia armeniaca. II Генетика. 2003. Т. 39(2). С. 215-222.

20. Патрушев JT. И., Минкевич И. Г. Проблема размеров генома эукариот // Успехи биологической химии, 2007. Т.47. С. 293-370.

21. Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. // М-Ижевск, Изд. РХД, 2002, 236 с.

22. Ризниченко Г.Ю. Математические модели в биофизике и экологии. М. — Иж.: ИКИ. 2003. 184 с.

23. Ризниченко Г.Ю. Математическое моделирование // 1999. http://www.library.biophys.msu.ru/MathMod/

24. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию: от клеток к атомам: Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 142с.

25. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекуляр. биология, 1999. Т. 33. №6. С. 997-1011.

26. Симан Н. Нанотехнология и двойная спираль // В мире науки, 2007. №9. С.23-31.

27. Сингер М, Берг П. Гены и Геномы. М.: "Мир". 1998. Т. 2. С. 201 204.

28. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Электронный журнал лаб. Сравнительной генетики животных ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН, 2004. №1. (http://lab-cga.ru/articles/Jornal01/Statial.htm).

29. Токарская О.Н., Даревский И.С., Мартиросян И.А. Генетическая нестабильность (GATA)n микросателлитных повторов ДНК и соматический мозаицизм у однополых ящериц Darevskia unisexualis II Доклады Академии Наук. 2003. Т. 388. №6. С. 825-828.

30. Токарская О.Н., Кан Н.Г., Петросян В.Г., и др. Вариабельность GATA-микросателлитных ДНК в популяциях партеногенетического вида ящериц Lacerta unisexualis Darevsky.ll Генетика. 2000. Т.36. № 5. С. 693 698.

31. Фомин С. В., Беркинблит М.Б. Математические проблемы в биологии. М.: 1973. 200 с.

32. Хедрик Ф. Генетика популяций. М.: Техносфера, 2003,- 592с.

33. Шноль С.Э. Физико-химические факторы эволюции. М.: Наука, 1979. 201с.

34. Aharoni A., Baran N., Manor Н. Characterization of a multi-subunit human protein which selectively binds single stranded d(GA) n and d(GT)n sequence repeats in DNA. // Nucleic Acid Research, 1993. V. 21. P.5221 -5228.

35. Anselmi C., Bocchinfuso G., De Santis P., Savino M., Scipioni A. A Theoretical Model for the Prediction of Sequence-Dependent Nucleosome Thermodynamic Stability//Biophysical Journal, 2000. V. 79. P. 601-613.

36. Arcot S.S., Wang Z., Weber J.L., Deininger P.L. and Batzer M.A. Alu repeats: a source for the genesis of primate microsatellites. // Genomics, 1995. V.29. P. 136 -144.

37. Arribas О J. Phylogeny and relationships of the mountain lizards of Europe and Near

38. East (Archaeolacerta Merttens, 1921, Sensu Lato) and their relationships among the i Eurasian Lacertid lizards. // Russian J. Herpetology, 1999. V. 6(1). P. 1-22.

39. Badaeva T.N., Malysheva D.N., Korchagin V.I., Ryskov A.P. Genetic variation and de novo mutations in the parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia unisexualis. // PloS One, 2008. V.3(7): e2730. (http://www.plosone.org/home.action).

40. Berger S.L. Histone modifications in transcriptional regulation // Curr. Opin. Genet. Devel., 2002. V. 12. P.142-148.

41. Bernardi G. Isochores and the evolutionary genomics of vertebrates.// Gene, 2000. V. 241. P. 3-17.

42. Bernardi G. The neoselectionist theory of genome evolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, V.104. P. 8385-8390.

43. Bertoni F., Codegoni A.M., Furlan D., Tibiletti M.G., Capella C., Broggini M. CHK1 frameshift mutations in genetically unstable colorectal and endometrial cancers. // Genes Chromosomes Cancer, 1999. V. 26. P. 176-180.

44. Biemont C., Vieira C. Genetics: Junk DNA as an evolutionary force // Nature, 2006. V. 443. P. 521-524.50