Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов у партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика
Автореферат диссертации по теме "Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов у партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis"
На правах рукописи УДК 577.21:598.112
□□344 7331
Бадаева Татьяна Николаевна
Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов у партеногенетической ящерицы
Оагеуз/с/а ип1эехиаИз.
Специальность 03 00 26 - «молекулярная генетика»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
о 2 0 ИТ 2008
Москва 2008
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории организации генома
Научный руководитель
Доктор биологических наук, профессор,
член-корреспондент РАН Рысков А П.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Крамеров Д А
Доктор биологических наук, профессор Сулимова Г Е.
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН
Защита диссертации состоится "22" октября 2008 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037 01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу. 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В А Энгельгардта РАН по адресу. 119991, Москва В-334, ул Вавилова 32
Автореферат разослан "22" сентября 2008 года
Ученый секретарь Диссертационного совета канд фарм. наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Партеногенетические позвоночные благодаря особенностям системы размножения образуют линии генетически идентичных животных и поэтому являются уникальными модельными организмами для экологических, эволюционных и молекулярно-генетических исследований. В частности, они могут быть использованы для изучения генетической нестабильности гипервариабельных ДНК, причин и механизмов, приводящих к ее появлению. Для большинства однополых позвоночных установлено, что они возникают в результате межвидовой гибридизации, изменяющей цитологические механизмы репродукции [Dawley, 1989, Vrigenhoek, 1994]. Их популяции состоят из самок, размножающихся кпонально Даули [Dawley, 1989] сформулировал две наиболее важные проблемы в исследовании клональных видов позвоночных: (1) выяснение цитологических механизмов клонального размножения и (2) определение причин внутри и межпопуляционного клонального разнообразия.
Кавказские скальные ящерицы рода Darevskia представлены в Закавказье и соседних районах Турции 18 бисексуальными и 7 партеногенетическими видами Все партеногенетические виды этого рода имеют гибридное происхождение, характеризуются диплоидным набором хромосом, невысоким уровнем гетерозиготности аллозимных локусов [Fu et al., 1998] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [Moritz et al., 1992] Проведенные ранее ДНК-фингерпринтные исследования ящериц рода Darevskia выявили значительный уровень популяционной неоднородности особей по отдельным микросателлитным маркерам ДНК [Кан и др., 1998; Токарская и др, 2000]
Популяционной разнообразие однополых видов принято объяснять мутациями, множественным гибридным происхождением и возможной незаконной рекомбинацией [Parker and Seiander, 1976, Parker, 1979; Cole et al, 1988; Moritz et а/, 1989, Fu et al, 2000] Однако степень влияния каждого из этих факторов на уровень генетической вариабельности остается неясным Более того, практически нет данных о природе мутаций и их вкладе в геномное и кпональное разнообразие однополых позвоночных Наиболее простой путь для выявления мутационной составляющей - это прямое изучение мутационных событий в родословных, например при сравнении геномов матери и потомков ДНК-фингерпринтный анализ семей партеногенетических ящериц показал, что в геноме D unisexualis и D агтетаса существуют нестабильные локусы,
изменчивость в которых приводит к разнообразию ДНК-фингерпринтных фенотипов у потомков и в популяциях [Токарская и др, 2003, Malysheva et al, 2007]. Однако что лежит в основе наблюдаемых изменений - мутации в сайтах рестрикции, изменение длины микросателлитного кластера или мутации в участках ДНК, прилежащих к микросателлитному кластеру, остается неясным Поэтому необходимо проведение молекулярно-генетических исследований индивидуальных микросателлитсодержащих локусов в популяционных и семейных образцах ДНК, что позволит определить структуру аллельных вариантов локусов, молекулярную природу и механизмы возникновения микросателлитных мутаций у клонально размножающихся животных
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов генома, поиск и характеристика мутаций по этим локусам у партеногенетических ящериц Darevskia unisexua/is и D. armeniaca, а также у ряда двуполых видов рода Darevskia. Для выполнения этой работы были поставлены следующие задачи: 1. Выделение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (GATA)n,
(ТСС)п и (ТСТ)п микросателлиты, из геномной библиотеки D unisexuahs 2 Молекулярно-генетический анализ микросателлитсодержащих локусов у
D unisexualis и двуполых родительских видов D. (raddei) nairensis и D.valentini. 3. Поиск и характеристика de-novo мутаций полиморфных локусов на больших
выборках семейных образцов D unisexualis и D. armeniaca. 4 Молекулярно-генетическая характеристика и сравнительный анализ вариабельных микросателлитсодержащих локусов у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
Научная новизна работы. Впервые показано существование супернестабильного микросателлитного локуса, содержащего (GATA)n, в геноме клонально размножающихся ящериц D. unisexuahs Впервые выявлена и определена молекулярная структура мутантных аллелей супернестабильного локуса у партеногенетических потомков первого поколения D. untsexualis. Тем самым получены прямые свидетельства о вкладе и характере мутационных событий в геномное и клональное разнообразие однополых популяций позвоночных. Впервые на молекулярном уровне получены данные о межвидовой изменчивости ряда микросателлитных локусов у однополых и двуполых ящериц рода Darevskia
Практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания факторов, определяющих геномное и клональное разнообразие однополых популяций Работа вносит важный вклад в современные представления о геномной нестабильности и характере мутационной изменчивости микросателлитных локусов у клональных видов позвоночных. В практическом отношении важны данные о молекулярной структуре индивидуальных локусов в исследованных геномах однополых и двуполых ящериц, которые могут быть использованы для целей геномного маркирования, определения филогенетических связей, реконструкции эволюционных событий у представителей рода Darevskia Кроме того, эти данные могут быть использованы в курсах лекций по молекулярной генетике и эволюционной биологии для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях International conference «The Biology of Genomes» (Cold Spring Harbor USA, 2007), 14th European Congress of Herpetology (Porto Portugal, 2007), XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), International conference «Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution» (Yerevan Armenia, 2005), 9th evolutionary meeting at Marseilles (Marseille France, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ из них 6 статей и 8 тезисов докладов и материалов конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (218 источников) и раздела благодарностей Работа включает 3 таблицы и 47 рисунков.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлит-содержащих локусов у D. unisexualis и двуполых родительских видов £>. (raddei) nairensis и D. valentini.
1.1 Получение и молекулярная характеристика рекомбинантных клонов лартеновида D. unisexualis, содержащих микросателлитные кластеры.
В работе была использована ранее созданная геномная клонотека партеновида D unisexualis [Корчагин и др., 2004а,Ь] Из нее были отобрано 3
клона, содержащие (САТА)-последовательность, 1 клон - (ТСТ) и 1 клон - (ТСС)-последовательность. Клоны были секвенированы, к ним подобраны специфичные пары праймеров для выявления аллельных вариантов с помощью ПЦР.
и (...< („» к»
„„„ Mi..... 3 5 7 9 11 13
ML щ
1.2 Анализ популяций D. unisexualis по локусам Du47, Du418, Du161, Du222 и Du334.
*' пУшЬ-—.i— ть* ■ - , Всего было изучено 68
.....' особей из различных популяций.
' ' ПЦР анализ показал, что (GATA)
содержащие локусы представлены электрофоретически (ЭФ) различающимися аллелями (рисунок 1). Локусы, содержащие ТСТ и
ТСС, представлены только одним Рисунок 1. Электрофорез в ПААГ ПЦР -
продуктов локусов Du418 (a) Du47 (b) и Du 161 (с) ПЦР продуктом (рисунок 2).
особей D. unisexualis из разных популяций. Практически все исследованные Стрелками обозначены аплельные варианты. к
Маркеры молекулярного веса 100 bp+ Ladder особи Не вариабельны, только по "Fermentas" с 100 п. н.
локусу Du 161 найдена одна
а пи
отличная от других особь. Таким
»машмм >'«•миф)» ' образом, все исследованные
локусы оказались мономорфны в
исследованных популяционных
выборках, а три из них (Du47,
Рисунок 2. Электрофорез в 8%-ном ПААГ ПЦР- ри418 и Du161) представлены ЭФ-продуктов локусов Du334 (а) и Du222 (b)
различных популяций D. unisexualis. Маркеры различающимися аллелями. Затем
молекулярного веса 50 bp Ladder "Fermentas" с шагом ,
50пн был изучен аллельныи полимор-
физм этих локусов в популяциях двуполых родительских видов.
1.3 Анализ внутри- и межпопуляционного полиморфизма локусов Du47, Du418 и Du161 у двуполых родительских видов D. (raddei) nairensis и D.valentirii.
В связи с тем, что D. unisexualis (как и другие партеновиды рода Darevskia) имеет гибридное происхождение, нами были исследованы локусы, ортологичные Du47, Du418 и Du161, у родительских видов D. valentini и D. (raddei) nairensis. Следует отметить, что ПЦР-продукты ортологичных локусов имеют примерно те же электрофоретические подвижности, что и у D.unisexualis, однако, они
5 7 9
Ф *ям? fc s.. - fe bçj,
обнаруживают разную степень полиморфизма. Высокий уровень полиморфизма у родительских видов выявлен по локусам Ои418 и йи161 во всех исследованных популяциях (рисунок 3).
м р 1 И»
Ч **
►ni
III
По локусу,
ортологичному йи47,
двуполые родительские
виды показали разную
степень полиморфизма.
Рисунок 3. Электрофорез в ПААГ ПЦР-продуктов локуса Особи О. (габбе/) Эй418 (а) и йи161 (Ь) особей родительских видов: О.
(ласИе/) па/гепз/э (3-7) и 0.уа!епШ (8 - щ.Р- продукт ПЦР па1гепв15 были мономо-
м 1 3 $ 7 9 !1 13 15
щ WywrtH
НЙЙИи^м^нИИ*»^ Ми
250 200
рфны и гомозиготны по
плазмидной ДНК, ПЦР продукты особей D.unisexualis были использованы для сравнения(1 - 3). Маркер молекулярного веса 50 bp+ Ladder "Fermentas" с шагом 50 п.н. изучаемому локусу, а
особи D.valentini - гетерозиготны и на исследованной выборке представлены как минимум шестью аллельными вариантами.
1.4 Первичная структура ДНК аллельных вариантов локусов Du47, Du418 и Du161 у D.unisexualis.
Для получения информации о строении аллелей локусов Du47, Du418 и Du161 было предпринято клонирование и секвенирование различающихся по ЭФ
подвижности ПЦР-продуктов
т ат а 7 caa' с с- С дат а ас ал с дат а* 7&tgac at с а - oa т a oa т а о а т а 0
л 4
1) ™¡„,v„,,/;J аллель jía т лШс л ас с ос а ат а ас а а с а а т а аллель 2тлта?с а ас с ос дат а ас аас дат д" Часть клона Du47¡oA7a- ; а а: сосаатаасаас дата totoacatc acoatagat а6ата0 т от о ac at с а : oat a gat a&ac ао тотоасатсacgatagatagajag
а г agata с-а с а о ас ас-a с ао а с ас- а' аоатьдтдс-ат ас аоао&тттата
£ "i.
/) tmiwrMet/iv аллель 1 а : ЛоЛтао а : аол:аоа:айас ас-а ;аллель 2атаоата................од Часть клона Du47ataoatac-acagacagacaga;aga- аоат 0а7 ас-а 7 а т аоа с'этт tata agatoat aoa* ataoaosat tata ag at gat ac-at at agagght t a t a
тгслтоа;та&сатттаттгао- тос t с t о с t с лот t с а с: т с т at т с а •
:Ь
■ аллель 1т ífcutoaífruocatttatttag®7о /). wnsexuoii.s; аллель 2: т?т д т о а с да ¿: а г т т а г :: а >-: с-Часть клона Du47: г о а ;£|а с- : а : г: а т т т a g - & т с т с- с т ; а с- т т с a cíob с т а т - с а -тст&с7саоттсас|£|г стагтса-
т aggtgaü7 сйтт í с ат с x
•fe 1т аоот оас-тсс-ттсс атс а ;алпепь 2таоотоаотсот: с с дт Часть клона Du47t д got о а о т -с от т с: а т с с
Рисунок 4. Сравнение НуКЯеОТИДНЫХ
для каждого локуса с последующим компьютерным анализом данных. Нуклеотидные последовательности двух аллелей локуса йи47 представлены на Рис. 4. Аллели отличаются размером и составом микросателлитного класте-также однонуклео-тидными заменами во
последовательностей двух аллелей локуса Ои47 между Ра. а собой и с нуклеотидной последовательностью части клона 01/47. Микросателлитный кластер выделен рамкой. Мутации во фланкирующих последовательностях фланкирующих последова-выделены прямоугольниками. Верхняя строка консенснусная последовательность.
тельностях ДНК. Анализ нуклеотидных последовательностей микросателлитных кластеров показал, что они имеют сложное строение.
Все три аллельных варианта локуса Du418 содержат микросателлитную последовательность. Отличия в ЭФ подвижности аллелей связаны с различиями в количестве повторяющихся звеньев в микросателлитном кластере, а также крупными делециями или инсерциями во фланкирующих последовательностях. Мономорфность этого локуса в популяциях объясняется тем, что особи содержат одновременно все три аллеля. Аллели локуса Du161oтличаются друг от друга по длине микросателлитного кластера: вариант # 3, найденный у особи из популяции Загалу, идентичен нуклеотидной последовательности клона Du161; аллель # 2 отличается количеством повторяющихся звеньев в микросателлитном кластере; а аллель # 1 характеризуется несколькими точковыми заменами во фланкирующих последовательностях ДНК и отсутствием несовершенного повтора GAT в конце микросателлитного кластера.
1.5 Первичная структура ДНК локуса Du47 у двуполых родительских видов D. (raddei) nairensis и D.valentini.
Нуклеотидные последовательности шести аллельных вариантов локуса Du47 у особей двуполого родительского вида D. valentini приведены на рис. 5.
ТАГА" •о: A AT А А ААТ AT "GTGA GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAG
к, ■к 3*0 Jr. & ffb
D. ип1:с\ш:!и 1 ТАТАТ 2 ГАТАТ А АС А А: CGC : с* A AT А А ААТАА' ААС А А ААТ AT ААТ AT ОТО АС G7C-A- ATCAC GATAGATAGATAGATAGATAGACAGACAGACA- •-...............- • • GATAGATAGAC AGAT AC-ATAGAT A....................-........
Г S2 5 ТАТАТ 1 ТАТАТ АА. А АС CGC аатаасаас ААТААСАА аат at аат at GTGACATCAC GTGACATCAC gatagatagatagatagatagat - gatagatagatagataoatagatagatag gatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatag
! ™ 6 ТАТАТ : ГАТАТ ■i ТАТАТ У ТАТАТ А АС а ас ААС ААС С С-С с о С С GC сс-с ААТАА аатаа аатаа аатаа аа аач ААТ AT ААТАТ ААТ AT ААТАТ gtga-С-Г OA С отоач g7ga- ATCAC ATCAC ATCAC ATCAC C-AT AGAT AGAT AGATAGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGATAC-AT AOATAGATAG C-ATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAG SAT AGAT AGAT AGATAC-AT AGAT AGAC AGAT AC-AT AGAT AC-ATAGAT A..... &A7ACATAGATAOATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA.........
ЩШ
тг
С AGAT AGAT С-А AT А! ТТ АТС-АС? А
_______:к ih-Ш Ш-5-Ш
а 1 '••--••-••..................6ЛС АОЛТ А О А ТС-AT А С-А ТАГ AjG AGC-TT 7 AT AT Т С AT GA : Т АО С AT Г Т AT Т Г АС-С-Т GC Т Т С-С Т
а.2...................................GAT GAT AGAT А ? At-АООАТ Т AT AT Т Т AT GA С ААС-С AT Т Т AT Т Т АО- TGCTCTGCT
AT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGA С AGATAGATC-ATAGATATAfcrAC-GrT ТА TAT 77ATGAC ? AGC AT TT AT TT AC GT GC TCTGCT
ATAGATAGATAGATA............OA:AOATAGATGATAGATATApAGGTTTATАТТТАТ&АГTAG:ATTTATTTAG-TGCTCTGCT
u.6 ATAC-ATA....................GAC AC-ATAGATGA7 AGA7AT AjC-AGGTT7A7A77TA7GAC TAG С A 7 TT AT 7 TAG- 7GCTCTGCT
a? ATA........................GAC AGATAGAT GAT AGAT AT ACAGGTTTATATTT AT t-ACTAGC AT TT ATT TAGGTGCT CTGC T
...........................ОА;АОАТАС-АТОА~АОАТАГЛЬАС-С-ТГ:.ЛТАГ:ТА:С-А:ГАС-:А:ТГА:ТТА&- re-::::с-:r
тъ )...........................GAC AGATAGAT GAT AGAT AT AjSAGGIT T AT ATT TAT GACTAGC AT TT ATT T AG- TGCTCTGCT
тшш
С ТС А
п. J С A SI ТС АС £Т CTATTCAGTAO&TGAGTCGTTC САТСА №' СAG7TCACGTCTAT7CA- ТАООТбМТСйТТССАТ a¡ САСГТС ACÍTC 7AT ТСА. ТА&&ТGA6TCGTTÍ-
са&ттсасстст at тс а. tagc-tc-agtcgttc :атса аб cagttcacctctattca. тлс-с-тоаьт с gt тс с at с а аЗ САС-ТТС АССТСТАТТСА. tagc-TC-AO: :GTTCCATCA ii гас'ттсасстстаттса. taggtgagtc с-гтссатса
Рисунок 5. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локуса Du47 у D. unisexualis в сравнении с двуполым родительским видом D. valentini. Однонуклеотидные замены во фланкирующих последовательностях ДНК у двух аллелей О.unisexualis выделены серым цветом. Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой. Верхняя строка - консенснусная последовательность.
Во всех аллельных вариантах ближе к концу микросателлитного кластера присутствовал микросателлит GACA, в конце микросателлитного кластера также обнаружена характерная последовательность GATGATAGATATA. Аплельные
варианты О. уа1епйт отличаются от двух аллелей О. ип1зехиаНз длиной и составом микросателлитного кластера, а также транзициями и делециями во фланкирующих областях.
:: о: ал г а ас ал; аат атт от оас а: : ас с-ат лоатара : лоат ас-ат ас-атл................с-а гол т.гол г лт
1 ' 5 i I í I í i
_________________7atatcaa::g:aataa:aa:aatattütgacat:a
•"п гатл::*д-.-.5:а«»4-.лл:ллт»ттотолса-!'-1
D тЛЫптнпзиюж*] г ат а т : лас с ос аа т аа с аас а ат а7 т oiga-с а т с а :
о 11 тататсаат тосаатаасаа:аататтьтоасат :
ata олт аса: а олт а о а г аса - л олт aúa : ас. л: л олт лс-лтолт ас-агат л
a? agata&acaga?aflat agata................gatgataüatata
олтлолтаслтлоатлс-лтлолтл...............о ат о ат ао ат ат а
с-атайлтаоасаоатайлтлс-лта................с-лтолтаоататд
оаооаттататттатоасааотатттаттгло- т с-:т гтс-: г : аотг:а:ст; таттс а т аоотс-аот сотт с: атс
¡35 ilj ГГ: ГП Т.
i c-a>ttatattíatc-attac-cattta7T7aügt&ctctgctcaüttca:ctctat
! оаос-аттататттатоат ааосатттатттао- tgctct&ctcaottcacütctat | gaggattatatttatgacaagcatt татттл&- tgc7ctgc тсаьт? сасотстат
i с-аооаттататттатоа-:аас-:атттатттао-то:тстост:аотт:а:4т:тат
TAÜTAGGTGAGTCGTTCCATTA :я Т АООТ ОАО";ОТ Т С С АТ СА- TAGC-TGAGTCGTTTTATCA ТА-Т АООТОАОТ С ОТТ Т:АТС А
Рисунок 6. Нукпеотидные последовательности аллельных вариантов локуса Du47 D. unisexuaHs в сравнении с двуполыми видами D. raddei и D. (raddei) nairensis. Однонуклеотидные замены во фланкирующих последовательностях ДНК у двух аллелей D. unisexuaHs отмечены серым цветом. Микросателлитный кластер выделен рамкой. Верхняя строка - консенснусная последовательность
Секвенирование ПЦР-продуктов подтвердило существование только одного аллельного варианта локуса Du47 в D. (raddei) nairensis (Рис. 6). Аллельные варианты особей D. raddei и D. (raddei) nairensis идентичны между собой и по последовательности соответствуют второму аллельному варианту локуса Du47 у D. unisexuaHs.
2. Выявление и молекулярная характеристика de-novo мутаций в (GATA)n содержащих локусах партеногенетических потомков D.unisexuaHs.
Известно, что наиболее прямой и адекватный способ выявления мутаций -это сравнительный анализ генома или индивидуальных локусов у родителей и потомков в семейном анализе. Мы использовали две выборки семейных образцов партеновидов D. unisexuaHs (49 семей, 168 потомков F-i) и D. armeniaca (50 семей, 147 потомков F-i). Среди всех изученных в нашей лаборатории микросателлитных локусов D. unisexuaHs большинство (в т.ч. охарактеризованные в этой работе) были мономорфными. Только два (ОАТА)п-содержащих локуса - Du281 и Du215, оказались полиморфными [Корчагин 2004а,б; Korchagin et al., 2007]. В настоящей работе проводился поиск мутаций по этим локусам у потомков семей D. unisexuaHs и D. armeniaca.
2.1 Монолокусный PCR-анализ анализ локусов Du281 и Du215 на
панели семейных образцов D. armeniaca.
Первая серия экспериментов была выполнена совместно с к.б.н. Малышевой Д.Н. Ни в одной из 50 семей D. armeniaса не было обнаружено мутаций по исследуемым локусам.
2.2 Монолокусный РСИ-анализ локусов йи281 и Ои215 на панели семейных образцов 0.ип1эехиаП5.
Аналогичный анализ семейных образцов
а ™—( 1) -(--[
, , »» ) > ,, £>. итвехиаЬэ по Ои215 также не выявил
I 5 . , 4 ,; ," , *
внутрисемейных вариаций в подвижности ПЦР-с «о—|—^ <1 „, | ; | ] амплификантов В то же время по локусу Ои281 ||М!? Мм К§М МГ у потомков четырех семей были обнаружены
Рисунок 7. Внутрисемейная ЭФ мУтации' На Рис" 7 представлены результаты
вариабельность ПЦР продуктов ПЦР анализа этих семей. Таким образом, локуса Ои281 а-сI - семьи 1-4
Материнские ДНК обозначены М1- частота мутаций по локусу йи281 у О.итзехиЫт М4 соответственно, ДНК потомков , .„.1 _
по/сазаны стрелками и пронуме- Равна 1.42а х 10 событии на зародышевую рованы е каждой семье тканЬ1 чт0 на несколько порядков превышает
среднюю частоту мутаций микросателлитных локусов Прямое подтверждение мутантной природы аллелей, а также определение характера мутаций может быть получено с помощью их клонирования и секвенирования
2.3 Молекулярная характеристика мутантных аллелей у потомков О. итзехиаНэ.
Сравнение нуклеотидных последовательностей локуса йи281 в материнских особях и их потомках выявило мутации только в микросателлитном кластере, мутации во фланкирующих районах обнаружены не были (Рис. 8-9). Материнские аллели и соответствующие им аллели потомков определялись по гаплотипам Т-А-Т и С-в-С, образованным фиксированными мутациями в прилежащих к микросателлиту областях каждого аллеля локуса йи281 [КогсЬад'т в( а/ 2007]
В семье 1. состоящей из материнской особи и одного потомка, была обнаружена делеция одного вАТА-мономера в обеих аллелях потомка (Рис. 8А) В семье 2. состоящей из материнской особи и пяти потомков, только в одной аллели, несущей гаплотип С-в-С, у всех потомков произошла одинаковая мутация - делеция САТАТА в микросателлитном кластере (Рис. 8В), а вторая аллель осталась неизменной В семье 3, состоящей из матери и двух потомков, произошла инсерция одного вАТА-мономера в микросателлитном кластере обеих аллей потомков (Рис. 8С)
В четвертой семье, состоящей из матери и четырех потомков, несколько различных мутаций обнаружены в аллели, несущей гаплотип С-в-С (Рис. 9)
г ; сто; tc-agaaaoa; : лет : gaaaa: : л о о: л: ас-: о: ; аатт:та:таааат : сagat tgttgagaagagaatт т ; л; -ъ-^ i ^ у ^ ^ ^
^.,ntcctgctoagaaaoaccaot|t^AAAACCAOGCACAGTGTCAATTCTACTAAAATCCAGATTOTreAGAAGAÛAATTTCAC ew.IIJTCCTGC tgagaaagaccagtftigaaaaccaogcac agtgtc aattctactaaaatccagattgttgagaagagaatttc ас ck,ii,îT сçtgttgagaaagac с agt cgaaaac сaggcас agtgtcаатт с tactaaaat с сagattgttgagaagagaatttc ас i.icn.;tcctgctgagaaagacсagtcgaaaac с aggcас agtgtcaattc tactaaaat: сagat tgt tgagaagagaattt с ac
TC^GGлоТл???^???!^^ олУЛУЛ^У-?!?1
S ГП ÎÎ5 ÏÏÔ Ж
«ti» itctacsa'aqc acagc agaaagcatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatgatatagatattt m».itctagaagc acagc agaaagc at agat agat agatagat agat agat agata gat agat a- - ■ gatgat at agat attt » ;t ct aggíagc acagc agaaagc at agat agat agat agat agat agat agat a g at agat agat a- • gat at ag at at t t u.m.:t ct agsfiagc aс agc agaaagc atagatagatagatagatagat agat agatagat agata.......gat at agat at г t
сctttataaagtaatc с a
vccttt at a a agi* ja at с с a u- icc'ttt ataaagtaatcc a », : с с t t t at a a a tícu at с : a
»•-cctttataaag;aat::a
tcctgctgagaaaoac сagttgaaaa: :agc< a:agtgt :aatt: ta:taaaat: сagattgttgagaagagaattt : a: ^ t I 1 i i * F
iTc:tg:tgagaaagac:agttgaaaac:agg:a:agtgt:aattcta:taaaat::agattgttgagaagagaatttcac «a ;t: с tg:tgagaaaga::agttgaaaa: :acgcacagtgt:aat t:t a:taaaat: :agattgtt gagaagagaattt: a : «к:*: :tg:tgagaaaga::agtcgaaaa::agg:a:agtgtсaattctactaaaat::agattgttgagaagagaattt: a:
w.'t: с tc-: tgagaaagac : agtkgaaaac с aggc a с agt gt с aat тс t act aaaat : :agattgttgagaagagaattt:ac
T С T A G G A G С A A G С A G A A A G С A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T G A T A T A С- A T A T T T : : T T
-î-ш-ffi-Ш-Ш-ГЕ--Ш
■ >T С TAGÎÀUGC ACAGC AGAAAGC AT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGATAGATGAT ATAGAT ATTT* CTT inTCT AO|AUGC ACAGC AGAAAGC AT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT A GAT AGAT GAT AT AGAT ATTT С CTT и. :TC T AGGÍAGC АС AGC AGAAAGC AT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGATAGATAGATAGAT A- • • GAT AT AGAT ATT T С CT T «.:TCTAG&AGC ACAGC AGAAAGC AT AGAT AGAT AGAT AGATAGATAGATAGAT AGAT AGAT A.........GAT ATTT С С T T
. iTATAAAGTAATC : A .TATAAAGTAATCCA AT A A AG CÍA A" С С A «<i • Wu:T ATAAAGCAATC С A
т'"с ■ T C-"; 7 О A G A A Л G A С G г" 7 G A A A A 1 I A G G I A С A G T G T С A A T T 1 7 A С T A A Л
$ $ i i i 35 ï I
6«.<М%*яас»> (T CCTGC TGAGAAAGAC С AGT|T'£AAA АС С AGGC АС AGTGT С ААТТ С TAC TAAAATC * AGAT TGTTGAGAAGAGAATT T С AС им. ?i»»i7 С С TGC T GAGA A AG АС С AGTiT|GAAAA С С AGGC A: AGT GTC ААТТ С TACT AAAAT С С AGAT TGT T GAGAAGAGAAT T Т С АС Я (M» * г««.. T С С T G С T G A G A A A G A С С A G T С fe A A A A С '.AGGC AC AGTGT CAATT С TAC T AAAAT : С AGATTGT T GAGAAGAGAATT T С АС ««п. 2UWÍ,».T С С TGC TGAGAAAGAC С AGTSSJGAAAA : С AGGC АС AGT GTC AATTC TA: T AAAAT : С AGATTGT T GAGAAGAGAAT T ТС AC
-£-35--Ш-Ш-TE-ÏS-Я
Л.(М.!>лгчи» ITCT AG-VAGC АС AGCAGAAAGC AT Д GAT AGAT AGATAGATAGATAGAT AGAT AGAT AGATA • - • GATGATATAGAT АГТ T «<t 2>««:*.iT CTAGAAG С ACAGC AGAAAGC AT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT GAT AT AGAT ATTT xxw.il. T : T A GsG A G С A С A G С A G A A A G С A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A G A T A.......G A T A T A G A T A T T T
я»*» :î с t a gfea g с a с a g с agaaagc at '.: 41*usàlà t t
ataaac-taatcta
.lcctttat »licîîtat * ;c с t tt at ала .,'CCTTTAT
Рисунок 8. Нуклеотидные последовательности аллелей покуса Du281 в семейных образцах ДНК D. unisexualis (А - семья 1,6- семья 2, С- семья 3). Мутации выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы обведены прямоугольником. Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой.
Так, у трех потомков мутантный аллель отличался от материнского депецией одного GATA- мономера, а у другого (# 2) произошла делеция GATA ТА последовательности в микросателлитном кластере.
ж -5 - зс 5 5 I ^
1ГССТеСТОАСЛААОДССАб??Г^АЛААССАоеСАСАйГ07СЛАГТСГАСГЛААЛТССАОАТТОТТбАОААеАОААТТТСАС 1Т ССТОСТОАС-АААОАС С А07Т\0ААА АССАООС АСАОТ ОТСААТТСТАСТААААТССАОАТТОТТОАСААОАОААТТТС АС ¡ТССТбСТОАйААЛС-АССАС-тМоАДААССАООСлеАОТйТСЛАТТСТДСТАЛААГССЛОАТХСТТОАеААОАОААТТТСАС :ТССТОСТОАОАААОАССАОТЙОААААССАООСАСАОТСТСААТТСТАСТААААТССАОАТТОТТОАйААОАОААТТТСАС ;Т СС ТО С ТО А ОЛААОАССАОТСС-ДАААС С АООС АС АОТ б ТС ДАТГСТАСГДАААГССАС-АТГОТТйДОДДОД&ААТТТС АС :ТСС1<гСТ«АСАААОАССА6Т!аС-ААААССАООСДСАвТОТСААТ1СГАСТААДАТССА6АТТ511йАСДАОА6АД1Г1САС
ТС?!5«!5?!ЯбЯЯ • ■ ■ йМЫгАТл&Ш??
£-Ж--ТЕ-ПЗ-Ш-5Б-Ш-аз
ОС АС АОС АС-АААОС АТ АОАТАС-АТ АС-АТ АОАТАОАТ АОАТ АОАТ АОАТ АОАТ А----6А10АТАТАС-АТА!ТТ1
ОС АСАОСАОАААОС АТ АОАТ АОАТАОАТ АС-АТ АОАТАОАТ АС-АТ АОАТ АС-АТ А- - - -ОАТОЛТЛТАОАТАТТТ ОС АСАОС АОАААОС АТАОАТАОАТАОАТАОАТАОАТАОАТАОАТ АОАТАОАТА- - - - ОАТОАТАТАОАТАТТТ ■ ОС АС АвС АОАААОСАТДОАТАОА Г АОАТ АОАТ АОАТ АОАТ АОАТАОА Т АС-АТ АОАТ А- - - С-А~ Л 7 АС-АТЛ7 Т 7
ОСАС АОС А О АЛ АОС А Т АОАТ АС-АТ АОАТ АО А Т АОАТ АОАТ АОАТ АОАТ АОАТ А.......ОАТАТАОАТАТТТ
.07 А С АОС АОАААОС АТ АС-АТ АОАТ АОАТ АС-АТ АОАТАОАТ АОАТ АОАТАОАТ Ач-Д ТА- -.......ОДТДТТТ
! ССТТТ АТАААО:ТААТС С А . |СС ТТТ АТАААОТААТССА . |С 7 Т ТТ АТ АААОТААТ СС Д 'ССТТТАТА ЛАОСААТС:А тССТТТ ».'ССТТТ
ОС'ААТ С С Л
Рисунок 9. Нуклеотидные последовательности аллелей локуса йи281 в семейных образцах ДНК О. ш/зехиа/к (семья 4). Мутации выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаппотипы, обведены прямоугольником. Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой.
В семьях доминировали изменения на одно повторяющееся звено. В двух семьях (все потомки семьи 2 и потомок #2, семьи 4) материнский аллель и аллель потомка отличались друг от друга делецией ОАТАТА-последовательности. Мутации могут происходить в двух или только в одной аллели. В двух семьях мутации были одинаковыми у всех потомков одной семьи, а в четвертой паттерны мутаций у потомков отличались.
3. Сравнительный анализ (САТА)„- содержащих локусов йи281 и Эи47 у различных двуполых видов рода Оаге^Я/а.
Мутационную изменчивость у микросателлитов можно изучать, сравнивая аллели ортологичных микросателлитных локусов у родственных видов. Этот подход дает возможность оценить исторически накопленные мутаци. С помощью локус-специфического ПЦР-анализа с парами праймеров, подобранные для локусов Ои287 и Ои47, проводилось изучение аллельного полиморфизма ортологичных локусов у различных двуполых видов рода Оагеувк/а. Были выявлены аллельные варианты этих локусов и определены их различия на уровне первичной структуры ДНК. Разделы 3.5 и 3.6 были выполнены совместно с к.б.н. Васецким Н.С.
3.1. Полиморфизм двуполых видов рода йагеУБк/а по локусу Ои281.
Локус йи281 высоко полиморфен, среди исследованных особей О. гасМе/он представлен как минимум шестью аллельными вариантами, различающимися по
злектрофоретической подвижности продуктов амплификации в пределах 50 нуклеотидных пар. У представителей D. portschinski portschmski локус представлен четырьмя аллельными вариантами Среди исследованных особей D portschinski nigrita было выявлено три аллельных варианта. У D. caucasica и D dríada он представлен двумя аллелями, a D dagestanica и D сhlorogaster одной
3.2. Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du47.
Исследованные особи D. raddei были гомозиготны по локусу Du47, и в исследованных выборках он представлен одним аллельным вариантом У представителей D. portschinski portschmski, наоборот, он оказался высоко полиморфным. Большинство исследованных особей гетерозиготны, а локус представлен пятью аллельными вариантами. В выборке D. portschinski также выявлено пять аллельных вариантов, причем ПЦР-продукты локуса Du47 у особей обоих подвидов значительно отличались D. dagestanica, D. caucasica и D dríada были гомозиготами по изучаемому локусу, a D chlorogaster гетерозиготой.
3.3. Секвенирование аллельных вариантов локуса Du281 у ряда
представителей двуполых видов рода Darevskia.
Было проведено секвенирование ПЦР-продукгов представителей нескольких видов с последующим компьютерным анализом данных Ранее были исследованы аллельные варианты ортологов Du281 двуполых родительских видов [Korchagin et al, 2007] и было показано, что аллельные варианты с гаплотипом - Т-А-Т перешли от D (raddeí) nairensis, а с гаплотипом C-G-C - от D valentini Как и у D. unisexualis, у родительских видов аллельные варианты различались по длине и структуре микросателлитного кластера При рассмотрении структуры самих микросателлитных кластеров у всех изученных видов была обнаружена короткая последовательность из несовершенных мономеров (GATATA или GATGATATA), четко фиксированная около 3'- конца кластера Причем оказалось, что последовательность GATATA ассоциирована с гаплотипом C-G-C, а последовательность GATGATATA - с гаплотипом Т-А-Т.
В работе проводили изучение аллельного полиморфизма ортологичного локуса Du281 у особей D. raddeí Нуклеотидные последовательности аллелей представлены на рис. 10 Видно, что D raddei также как и D (raddeí) nairensis, несут гаплотип Т-А-Т, однако аллельные варианты отличаются наличием делеций и транзиций во фланкирующих последовательностях Обнаружены также мутации в микросателлитных кластерах
t gagaaagaccас-ttg aaaac с agocас agtgtс aat тс ta£"aaaa
'с с ac-at" -
• tc c'tc-c't gagaaagacc
• tcctgctgagaaagaccagt|t ttct7gctgagaaagaccagt tt сttgctgagaaagacсagt tic с tgctgagaaagac с agi ttcttgctgagaaagac cagt: tt с tt gctgagaaagac с agt]! tt с с tgc tgagaaagac с agtji
гтсгтсстблcaaАОл:с.
ttcttgctgagaaagacc.
iaaaacc aggc acagtgt c'a .aaacс aggcасagtg . а а а с:aggcacagtgtca гaaaac сaggcacagtgt с j .•aaaa с с aggc а- - c-tc-tcj •aaaaccagc-cacagtgtc, .•aaaac с aggc ac agtgt с a •aaaac с aggc a- gtgtc, faaaa : : agc-c a . act&t с.1 гaaaacсaggcасagtgtсa
с tactaaaatcс agat t gtt gagaagagaattt с act ctac-g agc t тс t ас t aaaa"с с agattgtt gagaagagaat ttcactctagaagc tictac raaaatccagattc-ttcagaagagaatttí actctaca agc ttct act aaaatc'cagattgct gagaagagaattt t actctag a agc t t с t а с t a a a at с с ас- at t gt т g ag a ag a g a at t t с ас t с t ас- а а g с t7ctactaaaa7ccagat tgt tgagaaoagaatttc actctaga agc 7 t с t ас t aaaat cc agat t gt 7 gaga agagaat it c'ac tct ag a agc
7 7;:л;7 аааатссagattgttgagaagagaatttcactctagaa&;
ттс тас taaaatсс agattох 7 gagaagagaatt т с ас t с т ао аagc ттс tac 7 аааатс с ac-at TGT Т gagaagagaattt с аст С tac-a agc
САОС AGAAAGC АТАС- АТАОАТ АО АТАС-А7 AGAT AGAT АО А7 AGAT AGAT AGAT.
с agaaagcat jjgatac-at а сagaaag с agaaag с agaaag'
a?. АС AGCAGAAAGCАТдСАТ
AGAAAGC СAGAAAGC СAGAAAGC СAGAAAGC СAGAAAG:
at .jjgat agat.
_jE_
ac-at agat agat agat agat agatagat a ac-at ac-at agat agat agat agat agat agata ac-a- • gat- gatagat agat agat agat agat agat agat agat agat agat ac-a" agat agat agat - ga" agat agat agatagatagatagatagatagatagatagatagatao. agatagatagatagatagatagatagatagatag.
ac-at ag at ■ ga t AGAT A6A7AGA7 a ga t a.....
agatagatagatagatagatagatagata......
ac-a " agat ac-a i agat agat agat agat a.....
agatagatagatagatagatagata.........
7AGATAGATAGA'
■ - gatatagata- - •
• • c-atatagata- • -
- • gat gat at ac-at a- - -
- -gatgatatagata- - -
..... gatatagata--•
..... gata!agatagat
- - gatgatatagata- - -
..... gatatagata--•
• • gatgatatagata- • •
zfe
TTTCt'TT TATAAAOlC ТТТССТГТАТАААСГ TTTCCTT7A7AAAG TTTCCTT7AT AAAC-T
TTTCCTT TAIAAAG Г TTTCCTTTAT AAAC- Г ТТТСС TTTATAAAC7 TTTCCTTTATAAAC T TTTCCTTTATAAAGT
Рисунок 10. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса йи281 й. ип1$ехиаН8 в сравнении с двуполым видом О. гас!с1е1'. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы, обведены прямоугольником. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
На рис. 11. приведены результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Эи281 у особей О. ро^всЫпзк! ро^сЬтзк!' и О. ро^всЫпвМ т'дгИа.
тсc7gctgagaaagacс ао'
gaaaас с aggc ас agtg7
Т АС 7 ААААТ С С A G А Т Т С- Т Т С- А О А А О А О А А Т "
.ul ТССТ
С Т GAGAAAGACC АС-CTGAOAAAGACC АС-7 СTGAGAAAGAC С АО С ТGAGAAAGACCАО CTGAGAAAGACCAG С TGAGAAAGAC С АС-CTGAGAAAGAC С АС-СTGAGAAAGACС АО
аааассaggcacagtgtсааттстастаааатс сagattgtтgagaagagaat 1 aaaa с '.aggc а с agt gt с aatt ct act aaaat с с agat t gt t gagaagagaat 1 aaaac с aggcасagtgtсaattctactаааатссagattgttgagaagagaat' гаааас с agc-: ас agtgt сааттст act aaaatccagattgt7gac-a agagaat; aaaac с aggcа с agtgtсааттстactaaaatс сagattgttgagaagagaat! aaaa с caggc acagtgt с aattc tac taaaatccagattc-tt gagaagagaat • •aaaac с aggcacagtgtcaattctactaaaatcíagattgttgagaagagaat' cjc-aaaa: caggc acagtgt с aat tct act aaaat с с agattgttgagaagagaa71
I AGAAAGCAT/
-IS-
.AGAAAGCAT ; AGAAAGCAT : AGAAAGCAT AGAAAGCAT : AGAAAGCAT ; AGAAAGCAT AGAAAGCAT. AGAAAGCAT
gatagatagat.
TAGA7 —
tagatagat
-ПЗ—
m,} CAC-fD>1 С A C-ть2 CAC-:
: agatagatagatagatagatgata"aga гagatagatagatagata- - - gatataga "agatagatagatagat; :agatagatagata- • - •
: agata..............
agata ga t agatagat- c-<
:ac-atagatagatagata- -
Рисунок 11. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса йи281 О. итзехиаНв в сравнении с двуполыми видами О. ро^сЫпвМ ро/1зсЬ1пзк1 и й. рог1$с111пзк'1 тдгйа. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы выделены прямоугольником. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
Видно, что аллельные варианты D. portschinski portschinski и D. portschinski nigrita несут гаплотип C-G-C. Аллели отличаются только длиной микросателлитного кластера, мутаций во фланкирующих последовательностях ДНК не обнаружено. Число мономерных звеньев у D. portschinski portschinski варьирует от 7 до 11, а у О. portschinski nigrita, от 10 до 16. У D. portschinski portschinski микросателлитный кластер состоит только из совершенных повторов. У D. portschinski nigrita в одном аллельном варианте произошли две однонуклеотидные делеции. Характерных для локуса Du281 D. unisexualis последовательностей GATGATATA и GATATA в конце микросателлитного кластера не обнаружено.
Результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du281 у особей D. dagestanica, D. caucasica, D. dríada, D. chlorogaster представлены на рис. 12
tcctgctgagaaagac cagt
actaaaat с сaga77c-7
D dagtiunriea uaesbl '.
D cbrogas ter млель 1
с ctc-ctgagaaagac cagt
cctgctgagaaaga:cagt cctgctgagaaagaccagi с ctc-ctgagaaagac с agc с ctc-ctgagaaagac с ac-' с с t gc tgagaa ас-ас с agc cctgctgagaaaga:cagc cctgctgagaaagaccac-t
jaaaac
jaaaaс
:-aaaa: ja KA Í :
'•aaa а с 3aaaac ïaaaac
:-aaaa:
tgtcaat tgt с aat ' tgtcaat tgtcaat'
tgagaagagaat t gaga a t ac-aat tgagaagagaat tgagaagagaat tgagaagagaat tgagaagagaat 70agaac-ac-aa7 tgagaagagaat
7 : ac t
i cacagcagaaagcat^gatagatacatagatagata- • gatac-ata- • gatagatagat
*.ткль2 с ac agc agaaagc at л&ат ac-at ac-at aga t
i catagcagaaac-cat^gatagatagatagatagata-
D dríada «л Д dnadaп
tbj.i с ас ао с ag аа ag : л"
cacagcagaaag: at.
a 3.1 cacagcagaaagcat. ib5.2 cacagcagaaagcat; ir®,! cacagcagaaagc-
taoa7 a- • g a t а с- a t a g a t a g a t a g a t a t a g a t a g a t • c-at ag at agat a
'atagatagatagatagata- • c-at- c-ata- • c-atagatagatagatagata- • gatagat- gatagatagata atagatagatagata&ata-•gatagata--gatagat-gatagatagata -gatagatagatagata&ata
at agat agat agat agat a- • gat ac-at at agat agat agat • gatac-ata......................
•at agatagatagat agat at ac-at agat a- - c-at- gatac-ata......................-.......
igatagatagatagat agata- • gatac-ata- - с- at ac-at ag at ag at • gata - gat agatagatagat agata
tataaagta
i gatagatagata--
а^влаллмъ«.............................гттсстттатааас-
D clorogasrtrxnt.-* 1 c-at ac-at agat ac-at agatgat at ac-at а|гттс с тттатлаас
Рисунок 12. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса Du281 D. unisexualis в сравнении с двуполыми видами D. dagestanica, D. caucasica, D. driada, D. chlorogaster. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы, обведены прямоугольником. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
У D. caucasica выявлен гаплотип CGC, а у D. clorogaster - гаплотип Т-А-Т. У видов D. dagestanica и D. driada найдены другие гаплотипы - C-G-T и T-G-T, соответственно. Число звеньев в микросателлитном кластере у этих видов варьирует от 10 до 24, в них выявлены инсерции динуклеотида ТА и делеции последнего нуклеотида «А» в GATA. Во фланкирующих последовательностях обеих аллелей D. driada найдена одна транзиция, а у D. dagestanica - одна транзиция и одна инсерция. У представителей D. dagestanica, D. driada, D.
chlorogaster присутствует консервативный элемент GATATA в составе микросателлитного кластера.
3.4 Секвенирование аллельных вариантов лонуса Du47 у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
На рис. 13 представлены результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du47 у особей D. portschinskiportschinski и D. portschinski nigrita.
ТА АС а АС A AT AT ТОТ С-АС AT С ACGATAÖATAGAT
"Ж
.gatagatagatagata-
............... -Ь ....... .
lgacagacagacagata-
caataacaaiaatattgtoa:atlacpatagatagatagatagatagatagatagaragaragatagatagat : аатаасaacaatattgtgacat сaibataga;agatagatagatagatagatagatagatagatagacа • • •
: а атлас aa: aatattgtga : at: ack-atagatagatagatagatagatagatagatagacc...........
: aataac aacaatattgtgacat с acjgatagatagat agatagat agatagatagacc...............
С AATAAC AACAATATTGTGACATC ACj&ATAGATAGATAGATAGA!AGA!AGATAGATAGATAGATAGA!AöAT СAATAACAACAATATTGTGACATСACjGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAOATAGA"AGATAGAT
: AATAAC AAC AAT AT TOT GAC атс афат AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT а.......
с aataa с аагаа tattgtgacатс aíbatagatagatagatagataoatagataoatagata...........
gacac-atagatgatac-atatagaggtttatatttatgactagcatttatttao- tgctctgctcagttcacctctattca--ж-^-гт:-7Б-rjr-ш-ш-^-
aggtg -ifo
3
c-gtg ggtg c-gtg ggtg c-gtg
. AGTCGTTCCATCAT |_«я»аь5 AGTCGTTСCATСА P«.*iw.™i AGTÍGTTCCATCA DpírtjífHiBKl Еисд.2 AC-T С GTT С С AT T А ! пяь» 5 АС-Т С GTT С С AT С А Lrasa-i AGTCGTTCCATCA
Рисунок 13. Сравнение нукяеотидных последовательностей двух аллельных вариантов локуса Du47 D. unisexualis с нуклеотидными последовательностями аллельных вариантов локуса Du 47 у двуполых видов D .portschinski portschinski и D .portschinski nigrita. Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом.
У D. portschinski portschinski и D. portschinski nigrita ближе к началу
микросателлитного кластера обнаружен микросателлит другого типа - GACA, и в
конце микросателлитного кластера - консервативная последовательность
GATAGATATA.
Результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du47 у особей D. dagestanica, D. caucasica, D. dríada, D. chlorogaster представлены на рис. 14. Между видами обнаружены значительные различия по длине и составу микросателлитного кластера. У D. dríada выявлена инсерция последовательности ААТАААТА, у D. dagestanica и D. caucasica встречаются мотивы GAGA, и у всех видов в начале микросателлитного кластера встречается микросателлит GACA. Как и в аллелях D. unisexualis, у этих видов в конце микросателлитного кластера
находится последовательность САТСАТАОАТАТА. Во фланкирующих последовательностях найдены мутации типа транзиций и инсерций.
СААССОСАА
-I-
' ААСА АС АА7АТТ6ТС-А С АГ -^-1-
О.штткЛЬI ^^ ' О <<ау«(яя(ш аллель! Т Й фюОаал
ОАТ АС-АТАО АТАОАТАОАТАОАТА-
• С-А- АС-АС А........
* -ЭЕ
• б А С АС АС АО АС АОАТ А
• ОАТОАТАОАТАТАС-АЬйТТТАТАТТТАТОАСААОС АТТТАТТТАО- ТОСТСТОСТС АСмТ С АС О-
ж
- - • - ОАТОАТАОАТАТА
• • • • С-АТС-АТАОАТАТА
• - • • ОАТОАТАОАТА С-АТАС-АТОАТАОАТА
■ ■ - ОАТОАТАОАТА
ТГо--лг
¡АООТТТАТАТТСАТОАСТАОС АТТТАТТТАООТ ■А00АТ ТАТ АТТ ГАТйАС ЛАОС АТ ТТАТТТАО- Т С-АОС-ТТТ АТ АТТ" АТОАС ААС-С АТТТ АТТТАО- Т С-АООТТ Т АТ АТТ Т АТ О А С А АС- С АТ Т Т А Т Т Т АС-- Т С-АОС-ТТ ТАТ АТТТАТОАС ЛАОС АТ ТТ АТТТ АС' - Т
АОС-ТОАвТ С ОТ
С АОТТСАС С - ТСТАТТСАОТАООТС-АОТСС-Т САОТТСАСО-ТСТАТТСА-Т АООТ О АОТ С ОТ С АОТТ С АСОАТС Т АТ Т С А-Т АООТОАО"С ОТ САОТТСАСО- ТСТАТТСА. ТАООТОАОТС ОТ САОТТСАТО-ТСТАТТСА- "АООТОАОТС ОТ
О ¿аривн'са млел»! Т С С А Т С А Х>. еансепсамлель 1 Т С С АТ С А О. ЖихЬ юякл \ ТСС АТС А
Рисунок 14. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса Ои47 О. ип/вехиаЧа в сравнении с различными двуполыми видами рода Оаге^Я/а. Микросателлитный кластер обведен рамкой. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом.
3.5. Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Ои281 у разных видов рода Оагеузк/а.
Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Ои281 у разных видов представлены в виде Байесовских деревьев на рис. 15. Данные деревья отражают
существующий на сегодняшний день взгляд на эволюционные отношения в пределах рода Оа^вк/а [Даревский, 1993].
Рисунок 15. Байесовское аллелей локуса Ои281 для представителей рода Darevskia.
учета микросателлитов, б - с
3.6. Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса йи47 у разных видов рода 0агеузк1а.
Структурные взаимоотношения аллельных вариантов разных видов ящериц по локусу йи47 представлены в виде Байесовских деревьев на рисунке 16.
микросателлитов. 1-8 О. лас/сУе/, 9-12 О. (гаМе1) па '1гепв15, 13-18 О. ипяехиаНз, 19-20 О. \zalentini, 21-22 О. роПвсЫпвки (ШдгНа), 23-25 О. роЯвс/мгаМ, 26-27 О. саисажа, 28 - О. йаде$1атка, 29-30 О. йпаба, 31 - О. сЫогода$1ег.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Однополые позвоночные - это уникальные модельные организмы для изучения генетической изменчивости, поскольку мутации можно легко обнаружить в клональных популяциях, семьях и последующих поколениях. Уровень их генетической вариабель-
Рисунок 16. Байесовское древо аллелей локуса Н0СТИ невысокий ПО сравнению с
Du47 для ряда представителей рода Darevskia. а - родственными двуполыми видами без учета микросателлитов, б - с учетом
микросателлитов 1-5 D portschmskii (nignta), 6-7 О [Dawley, 1989; Гребельный 2005]
unisexuahs, 8-11 D portschmskii^2^7 D valentim, 18 -
D raddei, 19 - D (raddei) nairensis, 20 - D caucasica, 21 Клональное разнообразие ОДНО- D dríada, 22 - O dagestanica
полых видов принято объяснять мутациями, гибридным происхождением и незаконной рекомбинацией [Parker and Selander, 1976; Parker, 1979, Cole et al., 1988; Moritz etal, 1989, Fu etal, 2000].
Ранее с помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга было показано, что на фоне видоспецифических спектров партеновидов рода Darevskia выявляется генетическая неоднородность особей по некоторым микросателлитным маркерам [Кан и др , 1998, Tokarskaya et al, 2001; Мартиросян и dp 2002, 2003]. Анализ семей D. unisexuahs и D агтетаса выявил мутантные ДНК-фингепринтные паттерны у потомков нескольких семей, которые отличались от материнских несколькими фрагментами [Tokarskaya et al., 2004; Malysheva et al., 2007]. Эти результаты показывают, что в геноме партеногенетических ящериц существуют нестабильные локусы, которые можно выявить с помощью микросателлитных проб Но причины такой вариабельности, механизмы ее возникновения не ясны. Очевидно, что для решения этих вопросов требуются новые подходы, в том числе анализ индивидуальных локусов.
Опубликовано мало работ по клонированию и характеристике индивидуальных микросателлитсодержащих локусов у однополых позвоночных Так, Wilmhoff et al [2003] клонировал и секвенировал 16 вариабельных динукпеотидных микросателлитных локусов партеногенетического геккона Lepidodactylus lugubns Генетическая вариабельность этих локусов, выявленная с помощью локус-специфического ПЦР анализа, оказалось неожиданно высокой. Gardner et al [2004] изолировали и секвенировали шесть полиморфных локусов,
содержащих (AAC)n и (AAAG)n микросателлиты, из триллоидной партеногенетической формы австралийской ящерицы Menetia greyii и предложили использовать их для анализа непартеногенетических линий комплекса M greyii Однако молекулярную характеристику аллельных вариантов полиморфных локусов они не проводили.
Ранее в нашей лаборатории была создана геномная клонотека партеновида D. unisexualis, из которой были отобраны клоны, содержащие разные микросателлиты Два - Du281 и Du215, оказались полиморфными [Korchagin at al., 2007] В настоящем исследовании выделены и охарактеризованы три новых (GATA)„ содержащих локуса и два локуса, содержащих (ТСТ)„ и (ТСС)П микросателлиты Мы определили строение всех аллельных вариантов этих локусов, а для одного из них - аллели ортологов двуполых родительских видов. На популяционной выборке D unisexualis (N=68) эти локусы оказались мономорфными, причем содержащие (GATA)n были гетерозиготами, а (ТСТ/ТСС)П - гомозиготами.
По классификации [Weber and Wong, 1993] микросателлитные последовательности подразделяются на три категории: совершенные, несовершенные и сложные Согласно этой классификации, локусы Du418 и Du161 содержат несовершенные микросателлитные звенья, a Du47 включает как сложные, так и несовершенные микросателлитные мономеры. Несовершенные звенья типа GAT или ТА могли возникнуть в результате мутации «сдвига рамки считывания» на неполное мономерное звено В локусах Du418 и Du161 в составе микросателлитных кластеров были найдены последовательности ТАТАТТТА и GGCTC соответственно; они могли появиться или в результате рекомбинационных событий, или мутации микросателлитного звена типа транзиций и трансверсий
По локусам Du418 и Du47 не было обнаружено вариации по ЭФ подвижности ПЦР продуктов, а по локусу Du161 была выявлена только одна отличающаяся особь Интересно, что локус Du418 у D. unisexualis амплифицировался в виде трех аллелей, тогда как у родительских видов он представлен двумя или одной алпелью Наиболее вероятно, что третья аллель возникла в результате дупликации этого локуса у партеновида. Известно, что локусы, содержащие несовершенные повторы или вставки других по составу повторов, гораздо более стабильны, чем содержащие идеальные повторы [Bichara et al., 1995; Heale and Petes, 1995] Этим может объяснить мономорфность изученных (САТА)п-содержащих локусов. Причины стабильности
локусов Du222 и Du334 остаются неясными. Возможно, это связано с их относительно небольшими размерами или особенностями строения окружающих участков генома
В каждом из (GATA)n содержащих локусов аллели также отличались несколькими делециями/инсерциями или транзициями и трансверсиями одного и более нуклеотидов во фланкирующих последовательностях ДНК. Возможно, что подобные нукпеотидные замены встречаются с определенной периодичностью в геноме различных видов ящериц рода Darevskia. Например, наличие точковых замен во фланкирующих областях было показано для локусов Du215 и Du281 у D. unisexuahs [Корчагин, 2004а,Ь] Они могут соответствовать горячим точкам мутаций, которые возникают вблизи повторяющихся элементов генома
Механизмы нестабильности микросателлитных локусов в полной мере не известны, однако существует ряд гипотез по этому вопросу [Strand et а/, 1993; Pearson et al., 1996]. Нестабильность зависит от целого ряда факторов, главными из которых являются нукпеотидный состав и характеристики геномного окружения [Weissenbach et al., 1992, Weber, Wong, 1993, Jin et а!, 1996, Goldstein, Pollok, 1997]. Изменения числа повторов коротких последовательностей обычно связывают с явлением "проскальзывания" нити ДНК во время репликации или репарации. Известны и другие механизмы, обуславливающие высокую частоту инсерций и делеций, а также многочисленные точковые мутации во фланкирующих микросателлит областях ДНК [Ellegren, 2000].
На панелях семейных образцов D. unisexuahs и D armeniaca нами были исследованы два полиморфных локуса - Du281 и Du215 Сравнение аллелей у материнских особей и потомков проводилось по обоим локусам, однако только по Du281 у потомков были выявлены de novo мутации Подсчитанная частота мутаций равнялась 1,428 х 10"1 событий на зародышевую ткань Это хорошо соотносится с более высоким уровнем популяционного полиморфизма у D. unisexuahs по локусу Du281 в сравнении с Du215 [Korchagin et al, 2007] В то же время, обнаруженная нами частота мутаций на порядок превышает значения, полученные для индивидуальных микросателлитсодержащих локусов у бисексуальных видов Например, в родословных человека частота мутаций микросателлитных локусов варьировала от 3x10"3 до 6x10"4 [Ellegren, 2000b], в других работах приводится значение 10'4 [Dib et al., 1996, Weissbach et al, 1992]. Для (AAAG)n-noKyca частота мутаций составляла 5 7x10"3 для деревенской ласточки - касатки [Brohede et al., 2002], а для австралийской двуполой ящерицы
Egernia stokesii она равнялась 4 2x10"2 [Gardner et al, 2000] Гипервариабельный микросателлит (ТАТС)П с частотой мутаций 1 7x10"2 был найден в X хромосоме человека [Mahtanl and Willard, 1993] У локуса, содержащего (GGCAGG)n повторяющийся мотив, частота мутаций в клетках зародышевой линии грызунов была 8 8х10"2 на гамету [Mitani et al, 1990]. Следовательно, микросателлитный локус Du281 у D. uriisexuahs является гипермутабельным, и это первый пример такого локуса у однополых позвоночных.
Наличие в семье нескольких потомков с одинаковым мутантным фенотипом свидетельствует о том, что изменения произошли в терминальных клетках родителей Фенотипически нормальные индивидуумы могут нести несколько гамет, произошедших клонально от одной предковой клетки, мутация в которой возникла у родителей на ранних стадиях развития [Youssoufian and Pyeritz, 2002] В трех из четырех семей D. uriisexuahs паттерны мутаций были одинаковыми у всех потомков. Вероятно, они возникли в клетках зародышевой линии. В четвертой семье у одного из потомков паттерн мутации отличался от остальных Эта особь могла мутировать дважды - сначала вместе с другими потомками, и затем на более поздней стадии дифференциации, или же мутация произошла однажды на поздней стадии дифференциации клеток зародышевой линии
Для объяснения мутационного поведения микросателлитов предложено несколько основных моделей и ряд их модификаций Согласно модели пошаговых мутаций (Stepwise mutation model) [Ohta and Kimura, 1973] мутации в микросателлитах происходят путем последовательного добавления или утраты одного повторяющегося звена. Основным фактором, приводящим к изменению длины аллеля, считается эффект "проскальзывания" ДНК-полимеразы в процессе репликации. Эта модель получипа прямые и косвенные экспериментальные подтверждения [Schlotterer and Tautz, 1992, Weber and Wong, 1993], однако многочисленные наблюдения показали, что поведение микросателлитов далеко не всегда согласуется с обобщенным вариантом модели Ее модифицированный вариант, "two-phase mutation model" [Di Rienzo et al, 1994], предполагает, что в некоторых микросателлитных локусах мутации могут происходить либо последовательно, "шаг за шагом", либо скачкообразно, приводя к огромному единовременному увеличению длины повтора (экспансии) [Wells, 1996, Djian, 1998] Анализ индивидуальных микросателлитных локусов в различных организмах показывает, что от 5% до 75% мутаций носят характер мультиповторных мутаций [Ellegren, 2004] Мутации, затрагивающие один
микросателлитный повтор, у человека происходят гораздо чаще, чем «многошаговые» мутации [Weber and Wong, 1993] У рыб Danio rerío 68% мутаций в микросателлитных локусах мультиповторны (или имеют мультиступенчатый характер) [Shimoda et al, 1999]
Описаны и более сложные процессы, происходящие в микросателлит содержащих локусах, такие как асимметрия в распределении мутаций вдоль кластера, инсерции и делеции, а также многочисленные точковые мутации, нуклеотидные замены во фланкирующих последовательностях ДНК [Rubinsztein et al, 1995; Ellegren et al, 1997; Colson, Goldstein, 1999]. Так, например, у краба Limutus polyphemus был обнаружен (СА)п-содержащий микросателлитный локус размером 570 п н. с 34 аллельными вариантами Основные различия между аллелями были обусловлены полиморфизмом фланкирующих зон, содержащих нуклеотидные замены в 22-х сайтах [Orti et al, 1997]. Скорость мутационных изменений в самих микросателлитах может быть ниже, чем скорость замен во фланкирующих областях ДНК [Ellegren et al, 1997] Так, у некоторых видов дрозофилы различия фланкирующих областей были выше, чем в самих микросателлитных повторах Отличия аллельных вариантов могут ограничиваться только прилежащими участками ДНК [Colson and Goldstein, 1999].
Мы обнаружили de-novo мутации, затрагивающие несовершенный микросателлитный повтор (GATATA), т.е. более одного мономера. Наиболее вероятными механизмами подобной мутации могут быть двухфазная модель [Di Rienzo et а/, 1994] В других семьях изменения ЭФ подвижности были вызваны делецией или инсерцией одного повтора GATA, что можно объяснить пошаговой моделью мутационных изменений [Kimura and Ohta, 1978]. Однако ни в одной семье не было найдено мутаций, затрагивающих фланкирующие последовательности ДНК
Данные, полученные при изучении двуполых видов животных [Primmer et al., 1998], а также человека [Amos et al, 1996, Ellegren, 2000a] показали, что количество инсерций превосходит количество делеций. В нашем исследовании в 10 из 12 случаев мутация вела к уменьшению размера аллеля Возможно, это связано со строением Du281 локуса или с особенностями организации гибридного генома D unisexualis
Для оценки исторически накопленных мутаций по локусам был изучен аллельный полиморфизм локусов, ортологичных Du47 и Du281, у разных двуполых видов рода Darevskia. Поскольку они двуполые, аллельный
полиморфизм может быть следствием как мутационных, так и рекомбинационных явлений Особи О. (гасМе/) па/гепзя и О. гаоУе/ характеризуются высокой степенью генетического сходства по данным ВДРО анализа [Рябинина и др, 1998], таксонопринтного анализа [Гречко и др., 1998], а также по данным исследования мтДНК [МопЬ е( а/, 1992]. Результаты настоящей работы показали, что особи О (гасМе/) па/гете/в и О гасМе/ идентичны и мономорфны по локусу йи47, но сильно отличаются по локусу Ои281, причем различия затрагивают как структуру микросателлитсодержащего кластера, так и фланкирующие последовательности ДНК. Различия могут быть связаны с разной геномной локализацией Ои47 и Ои281. Локус Ои281 может находиться в участке генома, более подверженным мутациям, чем Оц47 Этим так же можно объяснить стабильность локуса Ои47 в популяциях О. итзехиа/я
Ранее по данным ЯДРО анализа [Рябинина и др, 1998], таксонопринтного анализа [Гречко и др, 1998], рестрикционного картирования мтДНК [МопЬ а/, 1992], мультилокусного аллозимного анализа [МасСиНосИ е^ а/, 1995] и анализа первичной структуры двух генов мтДНК [Ри е* а/, 1997] было показано высокое генетическое сходство видов О. роЛзсЬтзк! и О уа/елЬп/ Мы установили, что по локусу йи47 О portschlnskl (включая подвид О. ро^сЛ/лв/с/ тдгЛа) и О valentlnl имеют идентичную структуру микросателлитного кластера, а у О роПзсЫпзк! роЛзс1ипзМ и О. valвntlnt идентичные фланкирующие последовательности, отличающиесяся от О. рог^сЛ/пя/а тдгЛа одной трансверсией. По локусу йи281 О ро^сЛ/лй/с/ и О. valentlni идентичны по фланкирующим последовательностям, но отличаются по строению микросателлитного кластера. У О ро^зсЬтзк! рси!зсЫпзк1 он состоит из совершенных микросателлитных повторов, а аллели отличаются между собой числом мономерных звеньев У О. ройзсЬтзк! п1дп(а встречаются несовершенные микросателлитные повторы, и локус менее вариабелен. Поскольку аллели, содержащие несовершенные повторы, гораздо более стабильны, можно предположить, что высокая вариабельность локуса Ои281 у О. рси^эсЬтзк! ро^зсЬтзк связана с особенностями строения микросателлитного кластера Подвиды О ро/^гсЛ/лвЛ/ (ро^зсЫпзк/ и тдгиа) также вариабельны по Ои47 локусу. Как у О. итзехиа//э, в состав микросателлитного кластера входят сложные и несовершенные микросателлитные звенья У О. рог1зМпзк1 ро/1зсЬт5к1 встречается САСС микросателлит, который мог возникнуть в результате мутации САСА последовательности
Аллели локусов Du281 и Du47 у представителей видов D dagestanica, D. caucasica, D. dríada, D chlorogaster различаются мутациями типа транзиций, трансверсий и инсерций во фланкирующих последовательностях Наиболее вероятно, что эти участки являются горячими точками мутаций. У всех исследованных нами видов количество транзиций превышает количество трансверсий Известно, что транзиции GC—>АТ - одни из наиболее часто встречаемых спонтанных нуклеотидных замен, происходящих вследствии дезаминирования цитозина [Чобану и др , 2003] Выявлены значительные отличия и по строению микросателлитного кластера, чаще всего - это мутации типа сдвига рамки считывания, приводящее к появлению несовершенных микросателлитных повторов, иногда это другие типы мутации, приводящие к появлению микросателлита другого типа Структурные взаимоотношения аллельных вариантов изученных локусов у разных видов рода в виде Байесовских деревьев отражают существующий на сегодняшний день взгляд на эволюционные отношения в пределах рода Darevskia [Даревский, 1993] Деревья, построенные с учетом и без учета изменчивости микросателлитов, имеют сходную топографию, что, возможно, связано с нахождением в составе микросателлитов исследованных видов эволюционно консервативных нуклеотидных группировок
Таким образом, с помощью клонирования и секвенирования ДНК установлена молекулярная структура ряда микросателлитных локусов и их аллельных вариантов у партеновида D. unisexualis В исследованной популяционной выборке эти локусы оказались мономорфными, что, возможно, связано с особенностями строения микросателлитных кластеров данных локусов, или со специфическими характеристиками прилежащих ДНК
На двух больших выборках семейных образцов партеновидов D. unisexualis и D. агтетаса изучена стабильность (GATA)n- содержащих локусов Du281 и Du215. Полученные данные свидетельствуют о супернестабильности Du281 у D.unisexualis частота мутаций этого локуса достигает 1,428x10"1 событий на зародышевую ткань, что на несколько порядков превышает среднюю частоту мутаций микросателлитов и сравнимо с наиболее нестабильными локусами, описанными у двуполых видов. Выявлено и установлена структура 15 мутантных аллелей; показано, что большинство мутаций - это делеции одиночных микросателлитных мономеров Показано, что de novo мутации у партеногенетических потомков возникают, вероятно, в результате ошибок при репликации ДНК и происходят в клетках зародышевой линии. Полученные
результаты являются первым прямым доказательством того, что мутации вносят существенный вклад в геномное разнообразие популяций клонально размножающихся позвоночных.
Генетико-инженерное изучение аллельных вариантов ряда микросателлитных локусов партеновидов D unisexualis и их ортологов у двуполых видов позволило выявить особенности их мутационной изменчивости в группе ящериц рода Darevskia, которые связаны как с вариациями числа повторяющихся единиц микросателлитных кластеров, делециями и инсерциями в микросателлитах и в прилегающих областях ДНК.
ВЫВОДЫ
1. В работе впервые клонированы и охарактеризованы пять новых микросателлитсодержащих локусов у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis Сходство спектров амплификации для каждого из локусов у 68 особей свидетельствует о том, что изученные популяции мономорфны по этим маркерам Анализ их молекулярной структуры на популяционной выборке D unisexualis показал, что исследованные особи гетерозиготны по локусам, содержащим (GATA)n последовательности, и гомозиготны по локусам, содержащим (ТСС)П и (ТСТ)п
2. Частота мутаций, равная 1,428 х 10"1, подсчитанная для локуса Du281 на 49 семьях (168 потомков) D. unisexualis, свидетельствует о супернестабильности данного локуса. В связи с тем, что у D. агтетаса мутаций по этому локусу не было обнаружено, можно предположить, что супернестабильность локуса Du281 проявляется не у всех партеногенетических видов этого рода
3. Определена молекулярная структура 15 мутантных аллелей по локусу Du281 у партеногенетических потомков первого поколения Показано, что большинство мутаций происходит в клетках зародышевого пути и выражаются в делециях мономерного звена в микросателлитном кластере
4 Сравнительный анализ первичной структуры аллельных вариантов локусов Du281 и Du47 у представителей двуполых видов рода Darevskia позволил установить особенности межвидовой изменчивости, связанной с вариациями числа мономеров в микросателлитных кластерах, делециями и инсерциями в микросателлитах и точковых нукпеотидных заменах в прилежащих к ним областях ДНК.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1 Badaeva TN. Malysheva D N, Korchagin VI, Ryskov A P. Genetic variation and de novo mutations in the parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia umsexuahs. // Plos ONE, 2008, 3(7), e2730
2 Korchagin VI, Badaeva T.N. Tokarskaya ON, Martirosyan I A., Ryskov A P Molecular characterization of allelic variants of (GATA)„ microsatellite loci in parthenogenetic lizards Darevskia umsexuahs (Lacertidae) // Gene, 2007, 392(1-2) 126-133.
3. Бадаева T H. Корчагин В И, Токарская О Н, Рысков А П. Выявление и молекулярная характеристика мутантных аллелей локуса Du281 у партеногенетических потомков Darevskia umsexuahs // Докл Аккад Наук, 2006, 409(1) 120-122
4 Tokarskaya ON, Martirosyan I A, Badaeva T N. Malysheva DN, Korchagin VI, Darevsky I S, Damelyan F D, Ryskov A P Instability of (GATA)n microsatellite loci in the parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia umsexuahs (Lacertidae). II Mol. Gen. Genomics, 2004, 270 509-513
5 Токарская ОН, Даревский И.С, Мартиросян И А, Бадаева Т.Н.. Корочкин ЛИ, Даниелян ФД, Петросян В Г, Рысков АП Генетическая нестабильность (GATA)„ микросателлитных повторов ДНК и соматический мозаицизм у однополых ящериц Darevskia umsexuahs // Докл Акад Наук, 2003, 388(6) 825-828
6 Рысков А П, Мартиросян И А , Бадаева Т Н. Корчагин В И, Даниелян Ф Д, Петросян В Г, Даревский И С, Токарская ОН Супернестабильность (ТСТ/ТСС)П микросателлитных днк у партеногенетических ящериц Darevskia umsexuahs (сем Lacertidae) II Генетика, 2003, 39(9)' 1172-1179
7. Badaeva TN. Malysheva DN, Korchagin V.I., Martirosyan I A. Mutations as a major source of population genomic variation in clonally reproduced parthenogenetic lizards of genus Darevskia. The Biology of Genomes, 8-12 May 2007, Cold Spring Harbor, USA, p 28
8 Badaeva. V I Korchagin, О N. Tokarskaya, Ryskov A P "Microsatellite instability in parthenogenetic rock lizard Darevskia umsexuahs". 14th European Congress of Herpetology, Porto, Portugal, 19-23 September 2007, p 174.
9 Бадаева TH Токарская О H Рысков А П "Изучение вариабельности (ТСТ/ТСС)П микросателлитных ДНК партеногенетической ящерицы Darevskia umsexuahs (Darevskia)" XVII зимняя молодежная научная школа « перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, 7-10 февраля 2005, Тезисы докладов и стендовых сообщений стр. 53.
10 Martirosyan IA, Korchagin V.I., Malysheva D.N., Badaeva T N, Tokarskaya ON, Damelyan FD., Darevsky IS, Ryskov AP "Clonal diversity and genome Instability in parthenogenetic lizards of genus Darevskia" The second international conference Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution. Yerevan, 8-11 September 2005, p 78
11 Martirosyan I A, Korchagin V.I, Malysheva DN, Badaeva TN. Tokarskaya ON, Damelyan F D , Darevsky I S, Ryskov A P "Study of clonal diversity, genome instability and genetically instable loci in parthenogenetic rock lizards genus Darevskia." 9th evolutionary meeting at Marseilles. 21-23 September Marseille, 2005 p 23
12. Korchagin VI, Martirosyan IA , Malysheva D N, Badaeva TN. Tokarskaya О N, Ryskov A P "Study of genomic diversity, genetically unstable loci and somatic mosaicism in clonally reproduced (parthenogenetic) lizards, genus Darevskia" Advanced in molecular cell biology" devoted to the 10th anniversary of the center for Medical Studies (1993-2003). Moscow, June 17-18 2004, p 73-82
13 Martirosyan IA , Badaeva T N. Malysheva D N, Korchagin V I., Petrosyan V.G., Damelyan F D , Darevsky IS, Tokarskaya О N "Variation multilocus DNA markers in parthenogenetic rock lizards Darevskia umsexuahs" 12th ordinary General Meeting of Societas Europaea Herpetologica St Petersburg, 12-16 August 2003, Programme & Abstracts p 106.
14 Korchagin VI, Martirosyan IA, Malysheva D N., Badaeva T N. Tokarskaya ON Highly instable (GATA)n-containmg sequences in parthenogenetic lizards Darevskia umsexuahs (Lacertidae) International conference "Molecular genetics of Eucariotes". Moscow, 4-7
February 2003, Institute of Gene Biology RAS p.26 ^
Заказ № 154/09/08 Подписано в печать 17 09 2008 Тираж 150 экз Уел пл 1,5
ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бадаева, Татьяна Николаевна
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Однополые виды позвоночных.
1.1. Общая характеристика однополых позвоночных.
1.2 Способы размножения.
1.3. Цитогенетические механизмы однополого размножения.
2. Партеногенез у рептилий.
2.1. Происхождение и эволюция партеногенеза у рептилий.
2.2. Сетчатое видообразование у кавказских скальных ящериц рода Darevskia.
2.3. Клональное разнообразие у однополых видов рептилий. 17 2.4 Характеристика вида Darevskia unisexualis.
3. Молекулярно-генетические маркеры ДНК.
3.1. Типы молекулярных маркеров. 21 3.1.1 Маркеры индивидуальных локусов. 22 3.1.2.Маркеры множественных локусов.
3.2. Основные критерии отбора маркеров для генетических исследований.
4. Повторяющиеся последовательности генома эукариот.
4.1. Классификация тандемно повторяющихся последовательностей.
4.2. Микросателлитные последовательности.
4.2.1. Распространение микросателлитов.
4.2.2. Структура микросателлитов.
4.2.3. Неканонические структуры ДНК, образуемые микросателлитами.
4.2.4. Возникновение и эволюция микросателлитов.
4.2.5. Возможные функции микросателлитов. 32 4.2.6 Микросателлиты как генетические и геномные маркеры.
5. Генетическая нестабильность микросателлитных локусов.
5.1. Молекулярные механизмы нестабильности микросателлитных 36 последовательностей.
5.2. Модели мутационного процесса микросателлитов.
5.3. Частота микросателлитных мутаций.
5.4. Факторы, влияющие на частоту микросателлитных мутаций.
5.5. Подходы к изучению микросателлитных мутаций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Биологический материал.
2. Выделение геномной ДНК.
2.1. Выделение ДНК из крови.
2.2. Выделение ДНК из эмбрионов и тканей.
3. Анализ геномной клонотеки D. unisexualis.
3.1. Скрининг геномной библиотеки на наличие микросателлитных 51 последовательностей.
3.2. Приготовление меченых зондов.
3.3. Гибридизация.
3.4. Получение радиоавтографов.
3.5 Выделение плазмидной ДНК.
3.6 Обработка плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
3.7 Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК.
3.8 Перенос ДНК на мембрану. 55 3.9. Секвенирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей 55 микросатсллитные последовательности.
4.Постановка локус-специфической полимеразной цепной реакции.
4.1 Подбор праймеров.
4.2 Подбор условий для амплификации. 56 4.2.1 Электрофоретическое фракционирование PCR-фрагментов ДНК. 56 4.2.2. Перенос PCR-фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану "Hybond N+".
4.3 Полимеразная цепная реакция.
5. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).
5.1 Приготовление 8% ПААГ.
5.2 Подготовка стекол.
5.3 Вертикальный электрофорез.
6. Элюция и секвенирование ДНК. 58 6.1 Элюция ДНК из агарозного геля на DEAE ватман. 58 6.2. Элюция ДНК из полиакриламидного геля. 59 6.3 Переклонирование продукта ПЦР в плазмиду. 59 6.3.1 рК реакция. 59 6.3.2. Лигирование.
6.3.3 Трансформация.
6.3.4 Выделение трансформированных клеток.
6.4 Секвенирование и анализ PCR-продуктов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлит 62 содержащих локусов у D.unisexualis и двуполых родительских видов D. raddei nairensis) и D.valentinL
1.1 Получение и молекулярная характеристика рекомбинантных клонов партеновида 62 D. unisexualis содержащих микросателлитные кластеры.
1.2 Анализ популяций D. unisexualis по локусам Du47, Du418, Dul61, Du222 и 62 Du334.
1.3 Анализ внутри- и межпопуляционного полиморфизма локусов Du4 7, Du418 и 64 Dul61 у двуполых родительских видов D. raddei (nairensis) и D.valentini.
1.4 Первичная структура ДНК аллельных вариантов локусов Dn47, Du418 и Dul61 у 65 D.unisexualis.
1.5 Первичная структура ДНК локуса Du47 у двуполых родительских видов D. 68 raddei (nairensis) и D.valentini.
2. Выявление и молекулярная характеристика de-novo мутаций в (GATA),, 70 содержащих локусов у партеногенетических потомков D.unisexualis.
2.1 Монолокусный PCR-анализ анализ локусов Du281 и Du215 на панели семейных 71 образцов D. armeniaca.
2.2 Монолокусный PCR-анализ локусов Du281 и Du215 на панели семейных 71 образцов D.unisexualis.
2.3 Молекулярная характеристика мутантных аллелей у потомков D.unisexualis.
3. Сравнительный анализ (GATA)n- содержащих локусов Du281 и Du47 у 75 различных двуполых видов рода Darevskia.
3.1. Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du281.
3.2. Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du47.
3.3 Секвенирование аллельных вариантов локуса Du281 у ряда представителей 78 двуполых видов рода Darevskia.
3.4 Секвенирование аллельных вариантов локуса Du47 у ряда представителей 81 двуполых видов рода Darevskia.
3.5. Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Du281 у разных 83 видов рода Darevskia
3.6. Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Du47 у разных 84 видов рода Darevskia
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ выводы
БЛАГОДАРНОСТИ
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
DEAE - ионообменная нитроцеллюлозная мембрана с диэтиламиновой функциональной группой dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) - дезоксинуклеотидтрифосфат GF/C-фильтр - стеклянный фильтр Ватман (градуировка С) LINE (Long Interspersed Repeats) - длинные диспергированные повторы LTR (Long Terminal Repeats) — длинные концевые повторы
NET-буфер — солевой буфер для элюции, в состав которого входят NaCl, ЭДТА, Трис
PCR (Polymerase Chain Reaction) - Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР)
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - Додецил сульфат натрия
SINE (Short Interspersed Repeats) - короткие диспергированные повторы
SMM (Stepwise Mutation Model) - одноступенчатая модель микросателлитных мутаций
SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм
SSC (Sodium Saline Citrate) -натрий- цитратный буферный раствор '*»
ТХУ - Трихлоруксусная кислота
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) - вариабельные тандемные повторы ПААГ - полиакриламидный гель
ТВЕ-буфер - Трис-ЭДТА-боратный буфер (ТБЭ-буфер) ТЕ-буфер - Трис-ЭДТА буфер (ТЭ-буфер) ТЕМЕД - Ы^^'^'-тетраметилэтилендиамин
ЭДТА (EDTA) - Динатриевая соль этиледиаминтетрауксусной кислоты (Disodium Salt: Dihydrate)
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов у партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis"
Партеногенетические позвоночные благодаря особенностям системы размножения образуют линии генетически идентичных животных и поэтому являются уникальными модельными организмами для различных биологических, экологических, эволюционных и молекулярно-генетических исследований. В частности, они могут быть использованы для изучения генетической нестабильности гипервариабельных ДНК, причин и механизмов, приводящих к ее появлению. Для большинства однополых позвоночных установлено, что они возникают в результате межвидовой гибридизации изменяющей цитологические механизмы их репродукции [Dawley, 1989; Vrigenhoek, 1994]. Их популяции состоят из самок, размножающихся клонально. Даули [Dawley, 1989] сформулировал две наиболее важные проблемы в исследовании клональных видов позвоночных: выяснение цитологических механизмов клонального размножения и определение причин внутри и межпопуляциопного клонального разнообразия.
Кавказские скальные ящерицы рода Darevskia (ранее принадлежащие к роду Lacerta [Arribas, 1999]) представлены в Закавказье и соседних районах Турции восемнадцатью бисексуальными и семью партеногенетическими видами. Все партеногенетические виды рода Darevskia имеют гибридное происхождение, характеризуется диплоидным набором хромосом, невысоким уровнем гетерозиготности аллозимных локусов [Fu et al., 1998] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [Moritz et al., 1992]. Ранее проведенные ДНК-фингерпринтные исследования Кавказских скальных ящериц рода Darevskia выявили значительный уровень популяционной неоднородности особей по отдельным микросателлитным маркерам ДНК [Кан и др., 1998; То карская и др., 2000]. Популяционной разнообразие однополых видов принято объяснять мутациями, множественным гибридным происхождением и возможной незаконной рекомбинацией [Parker and Selander, 1976; Parker, 1979; Cole et al., 1988; Moritz et al., 1989; Fu et al., 2000].
Однако степень влияния каждого из этих факторов на уровень генетической вариабельности остается неясным. Более того, практически нет данных о природе мутаций и их вкладе и в геномное и клональное разнообразие однополых позвоночных. Наиболее простой путь для выявления мутационной составляющей это прямое изучение мутационных событий в родословных, например при сравнении геномов матери и потомков. ДНК-фингерпринтный анализ семей партеногенетических ящериц показал, что в геноме D. unisexualis и D. armeniaca существуют нестабильные локусы, изменчивость в которых приводит к разнообразию ДНК-фингерпринтных фенотипов у потомков и в популяциях [Токарская и др., 2003, Malysheva et al., 2007]. Однако что лежит в основе наблюдаемых изменений - мутации в сайтах рестрикции, изменение длины микросателлитного кластера или мутации в участках ДНК, прилежащих к микросателлитному кластеру остается неясным. Поэтому необходимо проведение молекулярно-генетических исследований индивидуальных микросателлитсодержащих локусов в популяционных и семейных образцах ДНК, что позволит определить структуру аллельных вариантов локусов, молекулярную природу и механизмы возникновения микросателлитных мутаций у клонально размножающихся животных.
Целью настоящей работы является изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов генома, поиск и характеристика мутаций по этим локусам у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis и Darevskia armeniaca, а также у ряда двуполых видов рода Darevskia. Для выполнения этой работы были поставлены следующие задачи:
1. Выделение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (GATA) п, (ТСС)П и (ТСТ)п микросателлиты из геномной библиотеки D. unisexualis.
2. Молекулярно-генетический анализ микросателлитсодержащих локусов у D.unisexualis и двуполых родительских видов D. raddei (nairensis) и D.valentini.
3. Поиск и характеристика de-novo мутаций полиморфных локусов на больших выборках семейных образцов D.unisexualis и D. armeniaca.
4. Молекулярно-генетическая характеристика и сравнительный анализ вариабельных микросателлитсодержащих локусов у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Бадаева, Татьяна Николаевна
выводы
1. В работе впервые клонированы и охарактеризованы пять новых микроеателлитеодержащих локусов у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis. Сходство спектров амплификации для каждого из локусов у 68 особей свидетельствует о том, что изученные популяции мономорфны по этим маркерам. Анализ их молекулярной структуры на популяционной выборке D. unisexualis показал, что исследованные особи гетерозиготны по локусам, содержащим (GATA)n последовательности, и гомозиготны по локусам, содержащим (ТСС)П и (ТСТ)П.
2. Частота мутаций, равная 1,428 х 10"1, подсчитанная для локуса Du281 на 49 семьях (168 потомков) D. unisexualis, свидетельствует о супернестабильности данного локуса. В связи с тем, что у D. armeniaca мутаций по этому локусу не было обнаружено, можно предположить, что су пер нестабильность локуса Du281 проявляется не у всех партеногенетических видов этого рода.
3. Определена молекулярная структура 15 мутантных аллелей по локусу Du281 у партеногенетических потомков первого поколения. Показано, что большинство мутаций происходит в клетках зародышевого пути и выражаются в делециях мономерного звена в микросателлитном кластере.
4. Сравнительный анализ первичной структуры аллельных вариантов локусов Du281 и Du47 у представителей двуполых видов рода Darevskia позволил установить особенности межвидовой изменчивости, связанной с вариациями числа мономеров в микросателлитных кластерах, делециями и инсерциями в микросателлитах и точковых нуклеотидных заменах в прилежащих к ним областях ДНК.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бадаева, Татьяна Николаевна, Москва
1. Aharoni A., Baran N., Manor H. Characterization of a multi-subunit human protein which selectively binds single stranded d (GA) n and d (GT) n sequence repeats in DNA. //Nucleic Acids Research. 1993. V. 21. P. 5221-5228.
2. Albaneze V., Biguet N.F., Kiefer H., Bayard E., Mallet J., Meloni R. Quantitative effects on gene silencing by allelic variation in a tetranucleotide micosatellite. // Human Molecular Genetics. 2001. V. 10. P. 1785 1792.
3. Amos, W., Sawcer S.J., Feakes R.W., and. Rubinsztein D.C. Microsatellites show mutational bias and heterozygote instability. // Nature Genetics. 1996. V. 13. P. 390 -391.
4. Andreassen R., Egeland Т., Olaisen B. Mutation rate in the hypervariable VNTR g3 (D7S22) is affected by allelic length and a flenking DNA sequence polymorphism near the repeat array. // American Journal of Human Genetics. 1996. V. 59. P. 360 387.
5. Arcot S.S., Wang Z., Weber J.L., Deininger P.L. and Batzer M.A. Alu repeats: a source for the genesis of primate microsatellites. // Genomics. 1995. V. 29. P. 136 144.
6. Arribas O.J. Phylogeny and relationships of the mountain lizards of Europe and Near East (Archaeolacerta Merttens, 1921, Sensu Lato) and their relationships among the Eurasian Lacertid lizards. // Russian Journal of Herpetology. 1999. V. 6(1). P. 1 22.
7. Bachtrog D., Wegs S., Zangerl В., Brem C., Schlotter C. Distribution of dinucleotide microsatellites in the Drosophila melanogaster genome. // Molecular Biology Evolution. 1999. V. 16. P. 602-610.
8. Barton S.C., Surani M.A., Norris M.L. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. //Nature. 1984. V. 311(5984). P. 374-376.
9. Bertoni F., Codegoni A.M., Furlan D. Tibiletti M.G., Capella C., Broggini M. CHK1 frameshift mutations in genetically unstable colorectal and endometrial cancers. // Genes Chromosomes Cancer. 1999. V. 26. P. 176 180.
10. Bichara M., Schumacher S., Fuchs R. Genetic instability within monotonous runs of CpG sequences in Escherichia coli. // Genetics. 1995. V. 140. P. 997 907.
11. Biet E., Sun J., Dutreix. M. Conserved sequence preference in DNA binding among recombination proteins: an effect of ssDNA secondary structure. // Nucleic Acids Research. 1999. V. 27. P. 596-600.
12. Bogart J.P. Elinson R.P., and Licht L.E. Temperature and sperm incorporation in polyploid salamanders. // Science. 1989. V. 496(4933). P. 1032 1034.
13. Bois P., Willianson J., Brown J. Dubrov Y.E., Jeffreys A.J. A novel unstable mouse VNTR family expanded from SINE B1 elements. // Genomics. 1998. V. 49. P. 122 128.
14. Botstein D., White R.J., Scolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. // American Journal of Human Genetics. 1980. V. 32. P. 314-331.
15. Bowcock A.M., Linares A.R., Tomfhorde J., Minch E., Kidd J.P., Cavalli-Sforza L.L. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites. // Nature. 1994. V. 368. P. 455-457.
16. Brinkmann В., Klintschar M., Neuhuber F., Hiihne J, Rolf B. Mutation rate at human microsatellites: influence of the structure and and length of the tandem repeat. // American Journal of Human Genetics. 1998. V. 62. P. 1408 1415.
17. Britten R.J. and Kohne D.E. Repeated sequences in DNA. // Science. 1968. V. 161. P. 529 540.
18. Brohede J., Primmer C.R., Moller A, Ellegren H. Heterogeneity in the rate and pattern of germline mutation at individual microsatellite loci. // Nucleic Acids Research. 2002. V. 30. 1997-2003.
19. Brookfield J.E.Y. Genome sequencing: the ripping yarn of the frozen genome. // Current Biology. 2003. V. 13. P. 552 553.
20. Chacraborty R., Kimmel M., Stivers D.N. et al. Relative mutation rates at di-, tri- and tetranucleotide microsatellite loci. // Proceedings of National Academy of Sciences USA. 1997. V. 94. P. 1041-1046.
21. Chambers G.K. and MacAvoy E.S. Microsatellites: consensus and controversy. // Comparative Biochemical Physiology. 2000. V. 126. P. 455 476. A
22. Chapman D., Shivji M., Louis E., Sommer J., Fletche H., Prodo P. Virgin birth in a hammerhead shark. // Biology Letters doi:10.1098/rsbl.2007.0189 Published online.
23. Charlesworth В., Sniegowski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. // Nature. 1994. V. 371. P. 215 220.
24. Cimino M.C., Egg production, polyploidization and evolution in a diploid all-female fish of the genus Poeciliopsis. II Evolution. 1972. V. 26. P. 294 306.
25. Cole C.J., Townsend C.R. Parthenogenetic lizards as vertebrate systems. // Journal of Experimental Zoology Supplement. 1990 V. 4. P. 174- 176.
26. Colson I., Goldstein D.B. Evidence for complex mutations at microsatellite loci in Drosophila. // Genetics. 1999. V. 152. P. 617 627.
27. Csink A.K., Henikoff S. Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats. // Trends in Genetics. 1998. V. 14. P. 200 204.
28. Darevsky I.S., Kupriyanova L.A., Uzzel T. Parthenogenesis in Reptiels. / Biology of the Reptilia. 1985. V. 15.
29. Dawley R.M. An introduction to unisexual vertebrates. // In: Evolution and ecology of unisexual vertebrates. Eds: Dawley R.M., Bogart J.P. // Bull New York State Museum (Albany. N.Y.). 1989. V. 466. P.l 18
30. De Vienne. Molecular markers in plant genetics and biotechnology. // Enfield, NH, USA: Science Publ. Inc., 2003. P239.
31. Di Rienzo A., Donnely P., Toomajian C., et al. Heterogenity of microsatellite mutation within and between loci, and implications for human demographic histories. // Genetics. 1998. V. 148. P. 1269-1284.
32. Di Rienzo A., Peterson A.C., Garza J.C., Valdes A.M., Slatkin M. Mutational processes of simple sequence repeat loci in human populations. // Proceedings of National Academy of Sciences USA. 1994. V. 91. P. 3166 3170.
33. Djian P. Evolution of simple repeats in DNA and their relation to human disease. // Cell. 1998. V. 94. P. 155- 160.
34. Elder, J.F. and I.J. Sehlosser. Extreme clonal uniformity of Phoxinus eos / neogaeus gynogens among variable habitats in northern Minnesota beaver ponds. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1995. V. 92. P. 5001 5005.
35. Ellegren H. Microsatellite mutations in the germline: implication for evolutionary inference. // Trends in gcnetics. 2000. V. 16(12). P. 551 558.
36. Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. // Genetics. 2004. V. 5. P. 435-445.
37. Ellegren H., Lindgren G., Primmer C.R. and Moller A.P. Fitness loss and germline mutations in barn swallows breeding in Chernobyl. // Nature. 1997. V. 389. P. 593 596.
38. Engeler B, & Reyer HU. Choosy females and indiscriminative males: mate choice in mixed populations of sexual and hybridogenetic water frogs (Rana lessonae, Rana esculenta). И Behavioral Ecology. 2001. V. 12. P. 600 606.
39. Field D., Wills C. Long, polymorphic microsatellite in simple organisms. // Proceedings of Royal Society of London Biological Sciences. 1996. V. 263. P. 209 215.
40. Fowler C. Macro Mini Micro Satellite VNTR Polymorphism: Theory and Application. // DNA and criminal justice. 1988. P. 110 119.
41. Fu J. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth, hitchhiking and backgrownd selection. // Genetics. 1997. V. 147. P. 915 925.
42. Fu J., MacCulloch R.D, Murphy R.W. The parthenogenetic Rock Lizard Lacerta unisexualis: An Example of Limited Genetic Polymorphism. // Journal of Molecular Evolution. 1998. V. 46. P. 127 130.
43. Fu J., MacCulloch, R.D., Murphy, R.W., Darevsky, I.S., Divergence of the cytohrome b gene in the Lacerta raddei complex and its parthenogenetic daughter species: Evidence for recent multiple origins. // Copeia. 2000. P. 432 440.
44. Fukuoka S., Inoue Т., Miyao A., Monna L., Zhong H.S., Sasaki Т., Minobe Y. Mapping of sequence-tagged sites in rice by single-strand conformation polymorphism.// DNA research. 1994. V. 1. P. 271 -277.
45. Gardner M.G., Bull C.M., Cooper S.J.B., Duffield G.A. Microsatellite mutations in litters of the Australian lizard Egernia stokesii. II Journal of Evolutionary Biology. 2000. V. 13. P. 551-560.
46. Gardner M.G., Otewell K., Adams M. Isolation of microsatellites in parthenogenetic lizard Menetia greyii (Scintidae) and their utility in sexual species of the Menetia greyii complex. // Molecular Ecology Notes. 2004. V. 4(2). P. 219 221.
47. Godfrey S., Bull C.M., Gardner M.G. Associations between blood parasite infection and a microsatellite DNA allele in an Australian scincid lizard (Egernia stokesii). II Parasitology research. 2006. V. 100(1). P.107 109.
48. Goldstein D.B., Pollock D.D. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic inference // Journal of Heredity. 1997. V. 88. P. 335 342.
49. Gondo Y., Okada Т., Noriko M., et al. Human megasatellite DNA RS447; copy number polymorphism and interspecies conservation. // Genomics. 1998. V. 54. P. 39 49.
50. Gordenin D.A., Kunkel T.A., Resnick M.A. Repeat expansion all in a flap? // Nature Genetics. 1997. V. 16. P. 24-33.
51. Graf J-D and Muller W.P. Experimental gynogenesis provides evidence of hybridogenetic reproduction in the liana esculenta complex. // Experimentia. 1979. V. 35. P. 1574- 1576.
52. Groot T.V.M., Bruins E., Breeuwer, J.A.J. Molecular genetic evidence for parthenogenesis in the Burmese python, Python molurus bivittatus. // Heredity. 2003. V. 90(2). P. 130- 135.
53. Gupta P.K., Varshney R.K., Sharma P.C., Ramesh B. Molecular markers and their application in plant breeding. // Plant Breedeng. 1999. V. 118. P. 369 407.
54. Hancock J.M. Simple sequences in a minimal genome // Nature genetics. 1996. V. 14. P. 14- 15.
55. Hartmann, A., J. Wantia, Heinze J. Facultative sexual reproduction in the parthenogenetic ant Platythyrea punctata. // Insectes Sociaux. 2005. V. 52(2). P. 155 -162.
56. Hastbacha J., de la Chapelle A., Kaitila I. Sistonen P., Weaver A., Lander E. Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastophic dysplasia in Finland. // Nature Genetics. 1992. V. 2(3). P. 204 211.
57. Heale S.M. and Petes T.D. The stabilization of repetitive tracks of DNA by variant repeats requires a functional DNA mismatch repair system. // Cell. 1995. V. 83. P. 539 -545.
58. Heslop-Harrison J. S. Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes. // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 617 635
59. Himmelreich R. Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B.C., Herrmann R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. II Nucleic Acids Research. 1996. V. 24. P. 4420 4449.
60. Hoffman E.K., Trusko S.P., Murphy M., George D.L. An SI nuclease-sensitive homopurine/homopyrimidine domain in the c-KI-ras promoter interacts with a nuclearfactor. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1990. V. 87. P. 2705 -2709.
61. Holtkemper U., Rolf В., Honoff C., Forster P., Brinkmann B. Mutatiom rates at two human Y-chromosomal microsatellite loci using small pool PCR techniques. // Human Molecular Genetics. 2001. V. 10. P. 629 633.
62. Ни X., Peng M., Feng Z. The detection of microsatellite mutations is dependant upon allele length. //Nature Genetics. 2000. V. 24. P. 396 399.
63. Huang Q.Y. ,Xu F.H. Shen H., Deng H.Y., Liu Y.J., Liu Y.Z., Li J.L., Rccker R.R., Deng H.W. Mutation pattern at dinucleotide microsatellite loci in humans. // American Journal of Human Genetics. 2002. V. 70. P. 625 634.
64. Hubbs C., Drcwry G. Warburton B. Occurrence and Morphology of a Phenotypic Male of a Gynogenetic Fish. // Science. 1959. V. 129 (3357). P. 1227 1229.
65. Hubbs C.L. Hybridization between fish species in nature. // Systema Zoology. 1955. V. 4. P. 1—20.
66. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analyses of human genome. // Nature. 2001. V. 409. P. 860 921.
67. Jackson A.L., Loeb L.A. The mutation rate and cancer. // Genetics. 1998. V. 148. P. 1483 1490.
68. Jeffreys A.J., Allen M.J., Armour J.A., Collick A., Dubrov Y., Fretwell N., Guram Т., Jobling M., May C.A., Neil D.L., Neumann R. Mutation processes at human minisatellites. //Electrophoresis. 1995. V. 16. P. 1577 1585.
69. Jin L., Macaubas C., Hallmayer J., Kimura A., Mignot E. Mutation rate varies among alleles at a microsatellite locus: Phylogenetic evidence. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1996. V. 93. P. 15285 15288.
70. Katti M.V., Ranjekar P.K., Gupta V.S. Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences. // Molecular Biology Evolution. 2001. V. 18. P. 1161 1167
71. Kelly R.G. Similar origins of two mouse minisatellites within transposon-like LTRs. // Genomics. 1994. V. 24. P. 509 515.
72. Kimura M., Ohta T. Stepwise mutational model and distribution of allelic frequencies in a finite population. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1978 V. 75. P. 2868-2872.
73. Klesert T.R., Otten A.D., Bird T.D., Tapscott S.J. Trinucleotide repeat expansion at the myotonic dystrophy locus reduces expression of DMAHP // Nature Genetics. 1997. V. 16. P. 402-406.
74. Konitcznym A., Ausubel F.M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using codominant ecotype-specific PCR based markers. //Plant Journal. 1993. V. 4. P. 403 -410.
75. Kono T. Genomic imprinting is a barrier to parthenogenesis in mammals. // Cytogenetical Genome Research. 2006. V. 113(1-4). P. 31 35.
76. Kono Т., Obata Y., Wu Q., Niwa K., Ono Y., Yamamoto Y., Park E.S., Seo J.S. and Ogawa H. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood. // Nature. 2004. V. 428. P. 860-864).
77. Koreth J., O'leary J. J., McGee J.O.D. Microsatellites and PCR genomic analysis // Jornal of Pathology. 1996. V. 178. P. 239 248.
78. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief Bioinformatics. 2004. V. 5(2). P. 150 163.
79. La Rota. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice wheat and barley. // BMC Genomics. 2005. V. 6. P. 23 -35.
80. Lafyatis R., Denhez F., Williams T. Sporn M., Roberts A. Sequence specific protein binding to and activation of the TGF-beta3 promoter through a repeated TCCC motif. // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 6419-6425.
81. Lalioti M.D., Scott H.S., Buresi C. Rossier C, Bottani A., Morris M.A., Malafosse A., Antonarakis S.E. Dodecamer repeat expansion in cystatin В gene in progressive myoclonus epilepsy. //Nature. 1997. V. 386. P. 847 851.
82. Laughlin T.F., Lubinski B.A., Park E.H., Taylor D.S., Turner B.J. // Clonal stability and mutation in the self-fertilizing hermaphroditic fish, Rivulus marmoratus. II Journal of Heredity. 1995. V. 86(5). P. 399 402. •
83. Lee J.S., Hanford M.G., Genova J.L., Farber R.A. Relative stabilities of dinucleotide and tetranucleotide repeats in cultured mammalian cells. // Human Molecular Genetics. 1999. V. 8. P. 2567-2572.
84. Levinson G., Gutman G.A. Slipped strand mispairing: a major mechanism for DNA sequcncc evolution. // Molecular Biology Evolution. 1987. V. 4. P. 203 221.
85. Lewin, B. // Genes. 1994. // Oxford University Press.
86. Li Q., Hisatsune Т., Kijima A. Induction of haploid androgenesis in Pacific oyster by UV irradiation. // Marine Biotechnology (NY). 2004. V. 6(3). P. 291 297.
87. Li W.H., Gu Z., Wang H., Nekrutenko A. Evolutionary analysis of the human genome. // Nature. 2001. V. 409. P. 847 849.
88. Lima, N.R.W., Koback C.J. and Vrijenhoek R.C., Evolution of sexual mimicry in sperm-dependent clonal forms of Poeciliopsis (Pisces: Poeciliidae). // Journal of Evolutionary Biology. 1996. V. 9. P. 185-203.
89. Liu L., Dybvig K., Panangala V.S., van Santen V. L., French С. T. GAA trinucleotide repeat region regulates M9/pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum. II Infection and Immunity. 2000. V. 68. P. 871 876.
90. MacCulloch R.D., Murphy R.W., Kupriyanova L.A., Darevsky I.S. The Caucasian rock lizard Lacerta rostombekovi: a monoclonal parthenogenetic vertebrate. // Biochemical Systematics and Ecology. 1997. V. 25(1). P. 33 37.
91. MacCulloch R.D., Murphy R.W., Kupriyanova L.A., Darevsky I.S. Clonal variation in the parthenogenetic rock lizard Lacerta armeniaca.il Genome. 1995. V. 38. P. 1057 -1060.
92. Macgregor H.C. and Uzzell T.M. Gynogenesis in salamanders related to Ambystoma jeffersonianum. // Science. 1964. V. 143(3). P. 1043 1045.
93. Mahtani, M.M., and Willard, H.F., A polymorphic X-linked tctranucleotide repeat locus displaying a high rate of new mutation: implications for mechanisms of mutation at short tandem repeat loci. // Human Molecular Genetics. 1993. V. 2. P. 431 437.
94. Malysheva D.N., Tokarskaya O.N., Petrosyan V.G., Danielyan F.D., Darevsky I.S., Ryskov A.P. Genomic variation in parthenogenetic lizard Darevskia armeniaca: evidence from DNA fingerprinting data. // Journal of Heredity. 2007. V. 98 (2). P. 173 178,
95. Mandel J.L. Braking the rule of three. // Nature. 1997. V. 386. P. 767 769.
96. Marescalchi O., Scali V. Automictic parthenogenesis in the diploid-triploid stick insect Bacillus atticus and its flexibility leading to heterospecific diploid hybrids. // Invertebrate Reproduction and Development. 2003. V. 43. P. 163 172.
97. Martin P., Kohlmann K., Scholtz G. The parthenogenetic Marmorkrebs (marbled crayfish) produces genetically uniform offspring. // Naturwissenschaften. 2007. V. 94(10). P. 843-846.
98. Mathew C.G.P. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA. // In: Methods in Molecular Biology. Eds.Walker J.M. // Humana press. N.Y. 1984. V. 2. P. 31 34.
99. McGrath J., Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. // Cell. 1984. V. 37(1) P. 179 183.
100. McMurray C.T. Mechanisms of DNA expansion. // Chromosoma. 1995. V. 104. P. 2 -13.
101. Melody S. Zoogeography of Parthenogenetic Whiptail Lizards (Cnemidophorus lemniscatus) in the Guianas: Evidence from Skin Grafts, Karyotypes, and Erythrocyte Areas. // Journal of Biogeography. 1985. V. 12 (1) P. 49 56.
102. Mitani K., Takahashi Y., Kominami R. A GGCAGG motif in minisatellites affecting their germline instability. // Journal of Biological Chemistry. 1990. V. 265. P. 15203 -15210.
103. Money T.A., Liu C.J., Gale M.D. Convertion of RFLP markers for downy mildew resistance in pearl millet to sequence tagged sites. // In: Use of Molecular Markers in Sorgnum and Pearl Millet Breeding for Developing Countries. Proceedings of an ODA
104. Plant Sciences Research Programme Conference. March 29lh-Aprillsl 1993. Norwich. UK. P. 65 68.
105. Moore W.S. Evolutionary ecology of unisexual fishes. // In: evolutionary Genetics of fishes. Ed. Turner B.J. // Plenum press New York. 1984. P. 329 398.
106. Morgante M., Olivieri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. //The plant journal. 1993. V. 3(1). P.175- 182.
107. Moritz C., Donnelan S., Adams M., Baverstock P.R. The origin and evolution of parthenogenesis in Heteronotia binoei (Gekkonidae): extensive genotypic diversity among parthenogens. //Evolution. 1989. V. 43. P. 994 1003.
108. Moritz C., Uzzel Т., Spolsky C., Hotz II. Darevsky I.S., Kupriyanova L.A., Danielyan F. The maternal ancestry and approximate age of parthenogenetic species of Caucasian rock lizards (Lacerla: Lacertidae). II Genelica. 1992. V. 87. P. 53 62.
109. Murphy R.W., Darevsky I.S., MacCulloch R.D. Old age, multiple formations or genetic plasticity? Clonal diversity in the unipaiental Caucasian rock lizard Lacerta dahli. II Genetica. 1997. V. 101. P. 125 130.
110. Murphy, R.W., Fu, J., MacCulloch, R.D., Darevsky, I.S., Kupriyanova, L.A. A fine line between sex and unisexuality: the phylogenetic constraints on parthenogenesis in lacertid lizards. // Zoological Journal of Linnean Society. 2000. V 130. P.527 549.
111. Mybre Dupuy В., Stenersen M., Egeland Т., Olaisen B. // Y-chromosomal microsatellite mutation rates: differences in mutation rate between and within loci // Human Mutation. 2004. V. 23. P. 117-124.
112. Nadir E., Hargalit H., Gallily Т., Ben-Sasson S.A. Microsatellite spreading in the human genome: Evolutionary mechanisms and structural implications. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1996. V. 93. P. 6470 6475.
113. Nur U. Mitotically unstable supernumerary chromosomes with an accumulation mechanism in a grasshopper. // Chromosoma. 1963. V. 14. P. 407 422.
114. Ohta Т., Kimura M. The model of mutation appropriate to calculate the number of electrophoretically detectable alleles in a genetic population // Genetics Research. 1973. V. 22. P. 201 -204.
115. Oliver J.H. Introduction to the Symposium on Parthenogenesis. // American Zoologist. 1971. V. 11(2). P. 241-243.
116. Olsen M. W. Performance record of a parthenogenetic turkey male. //Science. 1960. V. 132(3440). P. 1661.
117. Orti G., Pearse D.E., AviseJLC. Phylogenetic assessment of length variation at microsatellite locus. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1997. V. 94. P. 10745-10749.
118. Palsboll P.J., Berube M., Jorgensen H. Multiple levels of single-strand slippage of cetacean tri- and tetranucleotide repeat microsatellite loci // Genetics. 1999. V. 161. P. 529-540.
119. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce.// Theoretical and applied genetics. 1993. V. 85. P. 765 -771
120. Parker E.D. Phenotypic consequences of parthenogenesis in Cnemidophorus lizards. Invariability in parthenogenetic and sexual populations. // Evolution. 1979. V.33. P.l 150 1166.
121. Parker, E.D. and Selander, R.K., The organization of genetic diversity in the parthenogenetic lizard Cnemidophorus tesselatus. Genetics. 1976. V.84. P. 791 805.
122. Pearson C.E., Sinden R.R. Alternative structures in duplex DNA formed within the trinucleotide repeats of the myotonic dystrophy and fragile X loci. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 5041 -5053.
123. Porter K. R. Androgenetic development of the egg of Rana pipiens. II Biological Bulletin. 1939. V. 77. P. 233-257.
124. Primmer C.R., Saino N., Moller A.P., Ellegren H. Unraveling the process of microsatellite evolution through analyses of germline mutations in barn swallows Hirundo rustica. II Molecular Biology Evolution. 1998. V. 45. P. 1047 1054.
125. Purdom C.E. Genetics and fish breeding. // In: Fish and Fisheries Series (United Kingdom). // Chapman and Hall. London. 1993. № 8. P. 291.
126. Reik W., Collick A., Norris L., Surani. Genomic imprinting determines methylation of a female mule and jack donkey. // Journal of Heredity. 1987. V. 76. P. 248 251.
127. Ronquist, F., Huelsenbeck, J.P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. // Bioinformatics. 2003. V. 19. P. 1572 1574.
128. Royle N. J., Clarkson R.E., Wong Z., Jeffreys A.F. Clustering of hypervariable minisatellites in the preterminal regions of human autosomes. // Genomics. 1988. V. 3. P. 352-360.
129. Santibanez-Koref M.F., Gangeswaran R., Hancock J.M. A reletionship between length of microsatellite and nearby substitution rates in mammalian genome. // Molecular Biology Evolution. 2001. V. 18. P. 2119-2123.
130. Schultz J. R. Gynogenesis and Triploidy in the Viviparous Fish Poeciliopsis. II Science. 1967. V. 157(3796). P. 1564- 1567.
131. Shimoda N. Knapik E.W., Ziniti J., Sim C., Yamada E., Kaplan S., Jackson D., de Sauvage F., Jacob H., Fishman M.C. Zebrafish genetic map with 2000 microsatellite , markers. // Genomics. 1999. V. 58. P. 219 232.к
132. Soller M., Beckmann J.S. Genetic polymorphism in varietal identification and genetic1 чч ^improvement. // Theoretical and Applied Genetics. 1989. V. 67. P. 25-33. )
133. Solter D. Differential imprinting and expression of maternal and paternal genomes. // Annual Review of Genetics. 1988. V. 22. P. 127 146.
134. Spandidos D.A., Koumantakis E., Sifakis S., Sourvinos G. Microsatellite mutations in spontaneously aborted embryos. // Fertility and Sterility. 1998. V. 5. P. 892 895.
135. Spruell P. and Thorgaard G.H. Sine sequeriees detect DNA fingerprints in salmonid fishes. // Heredity. 1996. V. 17. P. 317 324.
136. Strand M., Prolla T.A., Liskay R.M., Petes T.D. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. // Nature. 1993. V. 365. P. 274-276.
137. Subramanian S. Mishra R.K., Singh L. Genome-wide analysis of microsatellite repeats in humans: their abundance and density in specific genomic regions. // Genome Biology.2003. V. 4(2). P. 13.1. V I
138. Suomalainen, E, Saura, A, and Lokki, J. Polyploidy in association with parthenogenesis.
139. In: Cytology and Evolution in Parthenogenesis. Eds: Suomalainen, E., Saura, A. and Lokki, J. // CRC Press, Boca Raton. Florida. 1987. P. 71 112.
140. Surani M.A.N., Barton S.C., Norris L.M. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome in gametogenesis. // Nature. 1984. V. 308. P. 548 -550.
141. Tautz D. Notes on definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences. // In: DNA fingerprinting: state of the science. Eds: Pena D.J., Chakrabortyb R., Epplen J.T., Jeffreys A.J. // Basel: Birkhauser Verlag. 1993. P. 21 28.
142. Tautz D., Trick M., Dover G.A. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation. // Nucleic Acids Research. 1989. V. 17(16). P. 6463 6471.
143. Templeton A.R., Clark A.G., Weiss K.M. Nickerson. Bocrwinkle E., Sing C.F. Recombinational and mutational hot spots within the human lipoprotein lipase gene. // American Journal of Human Genetics. 2000. V. 66. P. 69-83.
144. Thein S.L., Hesketh C., Wallace R.B. Human genetic disease—a practical approach. // In: Human Gcnetic Disease: A Practical Approach. Eds: Davies K.E. // IRL Press, Oxford. 1986. P.33 50.
145. Toth G., Gaspan Z., Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes survey and analysis. // Genome Research. 2000. V. 10. P. 967 981.
146. Townscnd, D. S., Stewart M. M., Pough F. H. and Brussard P. F. Internal fertilization in an oviparous frog (Eleutherodactylus coqui). II Science. 1981. V. 212. P. 469 471.
147. Treco D., Arnheim N. The evolutionary conserved repetitive sequence d(TG/AC)n promotes reciprocal exchange and generates unusual recombinant tetrads during yeast meiosis. // Molecular and Cellular Biology. 1986. V. 6. P. 3934 3947.
148. Turner B.J. Does Matrotrophy Promote Chromosomal Evolution in Viviparous Fishes? // The American Naturalist. 1983. V. 122(1). P. 152- 154
149. Turner B.J., Elder J.F., Laughlin T.F. et al. Extreme clonal diversity and divergence in populations of a selfing hermaphroditic fish. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1992. V. 89. P. 10643 10647.
150. Turner B.J., Elder J.F., Laughlin Т.Н., and Davis W.P. Genetic variation in clonal vertebrates detected by simple sequence DNA fingcrprintingio // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1990. V. 87. P. 5653 5657.
151. Urquhart A., Kimpton C.P., Downes T.J., Gill P. Variation in short tandem repeat sequences — a survey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers // International Journal of Legal Medecine. 1994. V. 107. P. 13 20.
152. Uzzell T.M. Meiosis mechanisms of naturally occurring unisexual vertebrates. // American Nature. 1970. V. 104. P. 433 445.
153. Vorlickova M., Kejenovska I., Kovanda J., Kyrp J. Dimerization of the guanine-adenine repeat strands of DNA. // Nucleic Acids Research. 1999. V. 27. P. 581 586.
154. Vos P., Hogers R., Reijans M., Van de Lee Т., Homes M., Friters I., Pot J., Peleman J., Kupier M., Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.// Nucleic Acids Research. 1995. V. 23. P.791 798.
155. Vrijenhoek R.C., Dawley R.M., Cole C.J., Bogart J.P. A list of the known unisexual vertebrates. // In: Evolution and ecology of unisexual vertebrates. Eds: Dawley R.M., Bogart J.P. // Bull New York State Museum (Albany. N.Y.). 1989. V. 466. P. 19 23.
156. Vrijenhoek R.C., Schultz R.J., Evolution of a trihybrid unisexual fish (Poeciliopsis, Poecilidae). II Evolution. 1974. V. 28. P. 306 319.
157. Vrijenhoek, R. C. Unisexual fish: Models for studying ecology and evolution. // Annual Review of Ecology and Systematics. 1994. V. 25. P. 71 96.
158. Vrijenhoek, R. C., Homozygosity and interstrain variation in the self-fertilizing fish Rivulus marmoratus. II Journal of Heredity. 1985. V. 576. P. 82 84. '
159. Wahls W.P., Moore P.D. Homologous recombination enhancement conferred by the Z-DNA motif d(TG)3o is abrogated by simian virus 40 T antigen binding to adjacent DNA sequences. // Molecular and Cellular Biology. 1990. V. 10. P. 794 800.
160. Wang D.G., Fan J.B., Siao J.C. et al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. // Science. 1998. V. 280. P. 1077- 1082
161. Wang Y.H. and Griffin J. Expanded CTG repeats triplet blocks from myotonic dystrophy gene create the strongest known natural nucleosome positioning elements // Genomics. 1995. V. 25. P. 570-573.
162. Watts P.C., Buley K.R., Sanderson S., Boardman W., Ciofi C., Gibson R. Parthenogenesis in Comodo dragons. //Nature. 2006. V. 444. P. 1021 1022.
163. Weber J.L. and Wong C. Mutation of human short tandem repeats. // Human Molecular Genetic. 1993. V. 2. P. 1123 1128.
164. Weissbach, J., Gyapay, G., Dib, C., Vignal, A., Morissette, J., et al, A second-generation linkage map of the human genome. // Nature. 1992. V. 359. P. 794 801.
165. Weissenbach J., Gyapay G., Dib C. Vignal A., Morissette J. Second-generation linkage map of the human genom. // Nature. 1992. V. 359. P. 794 801.
166. Wells R.D. Molecular basis of genetic instability of triplet repeats. // Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271 (6). P. 2875 2878.
167. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitary primers are useful as genetic markers. // Nucleic Acids research. 1990. V. 18. P. 6531 -6532
168. Wilmhoff, C.D., Csepeggi, C.E., Petren, K. Characterization of dinucleotide microsatellite markers in parthenogenetic mourning gecko (.Lepidodactylus lugubris). // Molecular Ecology. 2003. V. 3. P. 400 402.
169. Wolfgang S., Cho S., Possible role of natural selection in the formation of Tanden -Repetitive noncoding DNA. // Genetics. 1994. V.136. P. 333 341.
170. Wyman A., White R. A highly polymorphic locus in human DNA. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1980. V. 77. P. 6474.
171. Xu X., Peng M., Fang Z. The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length. // Nature Genetics. 2000. V. 24. P. 396 399.
172. Youssoufian H. and Pyeritt R.E. Mechanisms and consequences of somatic mosaicism in humans. // Nature Publishing Group. 2002. V. 3. P. 748 758.
173. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple-equence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification. // Genomics. 1994. V.20. P. 44 -61.
174. Астауров Б.Л., Демин Ю.С. Партеногенез у птиц. // Онтогенез. 1972. Т. 3(2). С. 123 -141.
175. Гайцхоки B.C., Пагкин E.J1. Сателлитные ДНК и болезни возможные механизмы тринуклеотидные повторы. // Генетика. 2000. Т. 36(7). С. 869 - 886.
176. Горбунова И.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и гентерапию наследственных заболеваний. // Спб.: "Специальная литература", 1997.
177. Гребельный С.Д. Много ли на свете клональных видов. // Зоология беспозвоночных. 2005. Т. 2(1). С. 79 102.
178. Даревекий И.С. Эволюция и экология партеногенетического размножения у пресмыкающихся / В сб.: Современные проблемы теории эволюцию. // Москва, из-во Наука. 1993. С. 89- 109.
179. Конюхов Б.В., Платонов Е.С. Геномный импринтинг у млекопитающих. // Генетика. 2001. Т. 37(1). С. 5 17.
180. Корчагин В.И., Мартиросян И.А., Омельченко А.В., Даревский И.С., Рысков А.П., Токарская О.Н. Изучение аллельного полиморфизма (GATA)n- содержащих локусов партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis (сем. Lacertidae). //
181. Генетика. 2004а. Т. 40(10). С. 1 7.
182. Куприянова JI.A. Генетическое разнообразие гибридных однополых видов, и форм рода Lacerta (Lacertidae, Reptilia): его возможные цитогенетические механизмы, цитогенетика мейоза природных полиш/оидных форм. // Цитология. 1999. Т.41(12). С. 1038- 1047.
183. Лебедева Е. Б., Васильев В. П., Рысков А: П. // Моноклональность гиногенетической формы рыб рода Cobitis (Cobitidae) в одном из районов ее ареала (по данным ДНК-фингерпринтинга). // Доклады Академии Наук. 2005. Т. 401(1). С. 136- 138.
184. Лобашев М.Е. Генетика. // Изд-во Ленинградского университета. Ленинград. 1967.
185. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. // Изд-во «Мир». Москва. 1984.
186. Мартиросян И.А.; Кан Н.Г., Петросян В.Г., Малышева Д.Н., Трофимова А.А., Даниелян Ф.Д., Даревский И.С., Корочкин Л.И., Рысков А.П., Токарская О.Н. Фингерпринтный анализ вариабельности мини- и микросателлитных повторов
187. ДНК у партеногенетических ящериц Darevskia armeniaca. II Генетика. 2003. Т. 39(2). С. 215-222.
188. Никитина Т.В., Назаренко С.А. Микросателлитные последовательности ДНК человека: мутационный процесс и эволюция. // Генетика. 2004. Т. 40(10). С. 1301 — 1318.
189. Никитина Т.В., Назаренко С.А. Мугации в микросателлитных повторах ДНК и эмбриональная гибель у человека. // Генетика. 2000. Т. 36(7). С.965 971.
190. Патрушев JI. И. Экспрессия генов. // Изд-во. "Наука". Москва. 2000.
191. Ротт Н.Н., Терская Е.Р. Диплоидный андрогенез. / В сб.: Методы биологии развития. Москва. 1974.
192. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-поиуляционных исследованиях биоразнообразия. // Молекулярная биология. 1999. Т.33(6). С. 997 -1011.
193. Рябинина I-I.JL, Гречко В.В., Даревский И.С. Полиморфизм ДНК популяций ящериц семейства Lacertidae, определяемые методом RAPD. // Генетика. 1998. Т.34(11). С. 1661 1667.
194. Сингер М, Берг П. Гены и Геномы. // Изд-во. "Мир". Москва. 1998. Т. 2. С. 201 -204.
195. Сиянова Е.Ю., Миркин С.М. Экспансия тринуклеотидных повторов. // Молекулярная биология. 2001. Т. 35(2). С. 208 223.
196. Сулимова Г.Е., Зинченко В.В. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции. // Изд-во "Диалог МГУ". Москва. 1999.
197. Токарская О.Н., Кан Н.Г., Петросян В.Г., и др. Вариабельность GATA-микросателлитных ДНК в популяциях партеногенетического вида ящериц Lacerta unisexualis Darevsky.// Генетика. 2000. Т. 36(5). С. 693 698.
198. Чобану Д.Г., Гречко В.В., Даревский И.С. Молекулярная эволюция сателлитногй ДНК Clbat ящерий рода Darevskia (Sauria: Lacertidae): корреляция с видовым разнообразием. // Генетика. 2003. Т.39(11). С. 1527 1541.1. БЛАГОДАРНОСТИ
199. Я выражаю искреннюю благодарность своему руководителю д.б.н., профессору, чл.-корр. РАН Рыскову Алексею Петровичу (Институт биологии гена РАН) за повседневное руководство, интерес, участие в обсуждении результатов экспериментов и всестороннюю поддержку.
200. Я особенно признательна Васецкому Никите Сергеевичу (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) за личное участие в статистической обработке данных.
201. Я благодарна руководству Института биологии гена РАН за предоставленную возможность обучения в очной основной аспирантуре и возможность выполнить Диссертационную работу.
-
Бадаева, Татьяна Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.26
- Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis
- Молекулярная структура и полиморфизм микросателлитных локусов у однополых и двуполых видов рептилий рода Darevskia
- Скелетохронологическое исследование скальных ящериц Армении и некоторые вопросы их экологии
- Геномный полиморфизм и нестабильность локусов, содержащих мини- и микросателлитные повторы ДНК у однополых видов ящериц рода Darevskia
- Изучение изменчивости мини- и микросателлитных ДНК у партеногенетических видов ящериц рода Lacerta
