Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение изменчивости мини- и микросателлитных ДНК у партеногенетических видов ящериц рода Lacerta

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кан, Наталья Геннадьевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи УДК 575.17.174.015.3

КАН НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИНИ- И МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДНК У ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВИДОВ ЯЩЕРИЦ

РОДА LACERTA

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН А. П. Рысков кандидат биологических наук О. Н. Токарская

МОСКВА 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1. Партеногенетическое размножение 7

1.1. Общая характеристика партеногенеза как типа полового размножения 7

1.2. Способы клонального размножения у позвоночных 8

1.3. Партеногенетические виды рода Lacerta 11

1.4. Гибридогенное происхождение однополых видов ящериц

рода Lacerta 12

1.5. Мейотический партеногенез у однополых видов ящериц 14 1.5. Биологические, биохимические и молекулярно-генетические

исследования партеногенетических видов рода Lacerta 16

1.6.1. Клональное разнообразие партеногенетических видов

рода Lacerta Морфологическая изменчивость клонов 16

1.6.2. Генетическая изменчивость 17

2. Молекулярно-генетические методы

изучения изменчивости на уровне ядерной ДНК 21

2.1. Система универсальных генетических маркеров. Явление полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

ядерной ДНК 21

2.2. Открытие мини- и микросателлитов 23

2.3. Особенности строения минисателлитных

последовательностей Джеффриса 24

2.4. М13 -гипервариабельные минисателлиты 25

2.5. Микросателлитные маркеры ДНК 26

2.6. Моно- и мультилокусные зонды. Метод ДНК-фингерпринтинга 28

3. Геномная нестабильность локусов, содержащих тандемные повторы ДНК 31

3.1. Гетерогенная структура минисателлитов и полярность мутационных изменений в мини- и микросателлитных локусах 32

3.2. Механизмы возникновения мутаций в локусах, содержащих минисателлитные тандемные повторы 34

3.3. Механизмы нестабильности микросателлитных локусов 37

3.4. Скорость мутационных процессов в минисателлитах 41

3.5. Эмбриональные и соматические мутации 42

3.6. Изучение мутационных процессов на модели

трансгенных животных 43

4. Применение полиморфной системы мини- и

микросателлитных маркеров для анализа изменчивости в природных популяциях, оценки

генетического разнообразия организмов 44

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48

РЕЗУЛЬТАТЫ 56

1. Оптимизация условий ДНК-фингерпринтного анализа

ящериц рода Lacerta 56

2. Сравнительный анализ изменчивости мини- и микросателлитной

ДНК у партеногенетических видов ящериц L. dahli и L. armeniaca 58

3. Изменчивость в природных популяциях двуполых видов

ящериц рода Lacerta 67

4. Анализ вариабельности мини- и микросателлитной ДНК в природных популяциях партеногенетического вида L. unisexualis 70

5. Изменчивость мини- и микросателлитных локусов в партеногенетических семьях L. armeniaca и L. unisexualis 74

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 78

ВЫВОДЫ 88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время биологическое разнообразие сформировалось как междисциплинарное научное направление, актуальность которого определяется тем, что решение многих глобальных и региональных практических и экологических задач общества невозможно без фундаментальных знаний о разнообразии организмов. Одной из составных частей биологического разнообразия является генетическое разнообразие, то есть внутривидовое разнообразие организмов на уровне ДНК и генов. В этой связи чрезвычайно важными являются новые эффективные методы анализа ДНК для оценки генетического разнообразия и генетической изменчивости.

В последнее время для изучения генетического разнообразия у видов с различной популяционной структурой широко используется технология ДНК-фингерпринтинга, поскольку выявляемые при этом гипервариабельные мини-и микросателлиты являются наиболее чувствительными индикаторами геномного полиморфизма. В современной литературе активно обсуждается проблема геномной нестабильности этих локусов, содержащих тандемно-организованные повторы ДНК, их структуры и мутационных процессов, приводящих к появлению множественных аллельных вариантов, отличающихся числом тандемно повторяющихся копий (Jeffreys and Репа, 1993). В то время как нестабильность мини- и микросателлитных локусов интенсивно изучается на человеке (Jeffreys et al., 1991; Jeffreys et al., 1994; Jeffreys et al., 1995) и линейных мышах (Jeffreys et al., 1987; Dubrova et al., 1993) как модельных объектах исследования, структура и свойства гипервариабельных локусов практически не исследовались у других эукариот. Особый интерес представляет изучение изменчивости мини- и

микросателлитов в популяциях животных с отсутствием полового размножения, например, партеногенетически размножающихся видов позвоночных. Молекулярные основы клональной изменчивости и генетической нестабильности при однополом типе размножения остаются практически неизученными. Роль мутационной изменчивости в возникновении клонального разнообразия была ранее продемонстрирована при исследования мини- и микросателлитных ДНК у однополых видов рыб Poecilia formosa и Rivulus marmoratus (Turner et al., 1990).

Изучение партеногенетических видов кавказских скальных ящериц рода Lacerta представляет особый интерес в связи с особенностями системы размножения этих видов. При клональном типе воспроизводства идентичных генотипов и отсутствии рекомбинации между клонами могут быть прослежены мутационные изменения в гипервариабельных мини- и микросателлитных локусах в ряду поколений, что позволит получить новую информацию о мутационной изменчивости и генетической нестабильности у этих организмов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Партеногенетическое размножение

1.1. Общая характеристика партеногенеза как типа полового размножения.

У животных и растений наряду с обычным половым размножением встречаются и нерегулярные типы полового размножения. Это прежде всего апомиксис, то есть половое размножение без оплодотворения. Синоним апомиксиса - партеногенез. Естественный партеногенез - девственное размножение, при котором развитие организма из яйцеклетки происходит без оплодотворения и участия в этом процессе сперматозоидов. Этот вид однополого размножения встречается главным образом у беспозвоночных, некоторых позвоночных животных и многих видов семенных и споровых растений. Партеногенез без редукции хромосом во время созревания яйцеклетки называют амейотическим или соматическим, а партеногенез яиц, претерпевших оба деления - редукционное и эквационное - мейотическим или генеративным. Партеногенез может быть облигатным (постоянным), или факультативным (циклическим), когда партеногенетические поколения чередуются с половыми. При этом смена поколений обычно зависит от условий окружающей среды (Инге-Вечтомов, 1989). Популяции партеногенетических видов представляют собой клоны, то есть группы генетически идентичных особей, происходящих от одного предка. При таком способе размножения отсутствует комбинаторная изменчивость, поэтому все изменения носят случайный характер и, вероятно, отражают мутационные или рекомбинационные процессы, происходящие в геноме партеногенетических особей (Cole et al., 1988).

Партеногенетические виды являются удобным объектом для широкого круга биологических и молекулярно-генетических исследований, а именно, ддя изучения самого феномена однополого размножения, полиплоидии у высших организмов, механизмов мейоза, оогенеза, эмбриогенеза и ряда других проблем биологии развития. Явление партеногенеза представляет широкий интерес не только как тип размножения, но и как удобная модель для изучения проблемы изменчивости и видообразования (Cole, 1990).

1.2. Способы клонального размножения у позвоночных

Способы размножения однополых видов не ограничены лишь партеногенезом. Так, например, гиногенез - особый вид однополого размножения, при котором развитие яйцеклетки индуцируется проникновением неспособных к кариогамии сперматозоидов. В случае андрогенеза размножение организма происходит при участии ооплазмы и мужского ядерного материала, женский пронуклеус при этом погибает. Андрогенез у животных встречается очень редко. Развитие андрогенных особей до взрослого состояния наблюдалось лишь у аксолотлей (Ротт, Терская, 1974) и тутового шелкопряда (Струнников и др., 1983).

В настоящее время известно около 50 видов позвоночных, рыб, амфибий и рептилий, для которых характерен клональный способ размножения. Все однополые позвоночные имеют гибридное происхождение (см.: Боркин, Даревский, 1980).

Впервые однополое размножение среди позвоночных было обнаружено у Poecilia formosa (семейство Poeciliidae) (Hubbs, Hubbs, 1932). При анализе ряда морфологических признаков оказалось, что этот вид рыб

занимает промежуточное место между двумя другими видами - Р. mexicana и P. latipinna, что послужило основанием для гипотезы о его гибридном происхождении (Abramoff et al., 1968). Диплоидная P. formosa (2n=46) в отличие от своих двуполых родителей является гиногенетическим видом, состоящим только из самок (Rasch et al., 1982). Наследование у Р. formosa имеет строго материнский тип, между особями нет обмена генами, и все потомки представляют клоны от их матери. В некоторых популяциях обнаружены однополые триплоидные самки (Зп=69). Биохимические и генетические данные также указывают на их гибридное происхождение (Monaco et al., 1982; Turner et al., 1983).

Другой интересный пример описан в группе живородящих рыбок рода Poeciliopsis из этого же семейства. Эта группа включает 5 бисексуальных диплоидных (2п=48) видов, а также по крайней мере 7 морфологически и генетически обособленных однополых форм, состоящих только из самок (Miller, Schultz, 1959; Moore et al., 1970; Vrijenhoek, Schultz, 1974). Среди семи однополых форм представлены 3 триплоидных и 4 диплоидных. Триплоидные формы размножаются гиногенетически (Cimino, 1972). Для диплоидных форм был открыт уникальный для позвоночных тип размножения, названный гибридогенезом (Schultz, 1969). Как и в случае гиногенеза для гибридогенетического размножения необходимо участие самцов чужого вида. Однако если в первом случае сперматозоид лишь активирует яйцеклетку, то при гибридогенезе геномы яйцеклетки и сперматозоида сливаются, образуя гибридную зиготу, из которой развивается особь с признаками обоих родительских форм. Благодаря особенностям определения пола все гибридные особи являются исключительно самками

(Schultz, 1973). У этих гибридов во время оогенеза отцовские хромосомы избирательно элиминируются и к моменту спаривания в зрелой яйцеклетке остается только гаплоидный материнский геном. При последующем оплодотворении образуется гибридная зигота, из которой развивается особь с признаками обоих родителей и все повторяется снова. Отцовский геном как бы "одалживается" на одно поколение и "выкидывается" из яйцеклетки в оогенезе. Таким образом, каждое поколение диплоидной формы является гибридным, кроме зрелых яйцеклеток (Schultz, 1969,).

Клональный способ размножения в каждом случае имеет свои особенности. Так, Rivulus marmoratus семейства Cyprinodontidae является единственным среди позвоночных видом, для которого характерен гермафродитизм (Harrington, 1961). Природные популяции этого вида состоят из гомозиготных клонов. Генетическая рекомбинация между клонами неизвестна (Kallman, Harrington, 1964; Harrington, Kallman, 1968). В семействе Ambystomatidae (саламандры) имеется группа из 4 видов, из которых два диплоидны и бисексуальны (A. jeffersonianum и A. laterale), а другие два (А. platineum и A. tremblayi) триплоидны и состоят только из самок (Uzzell, 1964). Триплоидные формы размножаются путем гиногенеза, что было подтверждено цитогенетически (Macgregor, Uzzell, 1964), в некоторых популяциях их возможен и партеногенез (Uzzell, 1970). Исследования показали, что все однополые формы абмистом также имеют гибридное происхождение (Downs, 1978).

Позвоночные, для которых характерен истинный партеногенез, представлены примерно 40 видами однополых ящериц, относящихся к 14 родам 7 из 17 современных семейств пресмыкающихся, а также 3 или 4

видами, принадлежащих к двум семействам мелких роющих змей (Даревский, 1993).

1.3. Партеногенетические виды рода Lacerta

Изучая ящериц рода Lacerta в Армянской ССР И. С. Даревский обнаружил, что некоторые их популяции состоят исключительно из самок, и предположил, что такие ящерицы способны откладывать неоплодотворенные, но вполне жизнеспособные яйца (Даревский, 1958). В настоящее время имеются прямые доказательства партеногенетического типа размножения у ящериц. Это - фактическое отсутствие самцов в природных популяциях партеногенетических ящериц (встречается 1 самец на 1000 особей самок), отсутствие сперматозоидов в половых путях половозрелых партеногенетических самок (в отличие от двуполых) и, наконец, размножение и получение полноценного потомства, состоящего исключительно из самок, при отсутствии спаривания и оплодотворения (Darevsky, 1985). Партеногенетическое размножение ящериц и получение потомства нескольких генераций, состоящее только из самок, было воспроизведено в лабораторных условиях (Cole, 1977). Кроме того, генетическая однородность, фиксированная гетерозиготность, выявленная методом электрофоретического анализа белков, кариологические исследования (плоидность) и гистосовместимость (отсутствие отторжения кожных трансплантантов) также свидетельствуют о существовании клонального типа размножения у ящериц (Даревский, 1993).

На юго-западе США и на севере Мексики были обнаружены популяции ящериц-бегунов из рода Cnemidophorus, также состоящие из одних

самок (см.: Cole, 1975). Многочисленные исследования показали, что и эти животные размножаются партеногенетически (Коул, 1984).

Среди комплекса кавказских скальных ящериц рода Lacerta известно семь партеногенетических видов, распространенных в Закавказье и соседних районах Турции: L. armeniaca, L. unisexualis, L. dahli, L. rostombekovi, L. uzzelli, L. saphpirina, L. bendimachiensis. Все партеногенетические виды имеют диплоидный набор хромосом (2п = 38) (Darevsky et al., 1985). Однополые виды ящериц рода Cnemidophorus представлены примерно 12 из 40 видов этого рода (Cole, 1975).

1.4. Гибридогенное происхождение однополых видов ящериц рода Lacerta

Многочисленные исследования филогении и систематики однополых видов пресмыкающихся вообще, и рода Lacerta в частности, указывают на то, что их происхождение не укладывается в рамки классической схемы видообразования Ч. Дарвина, согласно которой новые виды образуются в ходе дивергентной эволюции. В настоящее время доказано, что они возникли принципиально иным путем, в результате естественной гибридизации между близкими родительскими формами, то есть в результате так называемой сетчатой эволюции (Боркин, Даревский, 1980).

Партеногенетический вид, однажды возникнув в результате гибридизации, не требует для своего поддержания повторных актов гибридизации. Об этом свидетельствует существование в течение десятков сотен генераций островных партеногенетических популяций. В этом отношении интересен также факт существования с 1964 г.

интродуцированной популяции L. armeniaca на Украине, оторванной на 1500 км от границы естественного ареала этого вида, живущего в горах Северной Армении (Даревский, Щербак, 1968).

Сравнительный анализ изменчивости сайтов рестрикции митохондриальной ДНК 5 бисексуальных и 5 однополых видов рода Lacerta, аллозимный анализ, а также к а ри о л оги че ск и е исследования показали, что пять диплоидных партеногенетичских видов исходно образовались при гибридизации между пятью бисексуальными видами, причем гибридизация в разных сочетаниях одних и тех же родительских форм привела к возникновению различных партеногенетических гибридогенных видов (табл. 1) (Moritz et al-, 1992).

Таблица 1. Гнбридогенное образование и а ртено генетических видов ящериц рода Lacerta.

«Материнский» Щ вид , щшт. у <<о~й>> ,

L. mixta i i ; ■ " Ü L valentini ■ i. i,« i

% mixta ж L. portschinskii I мам

I miremMsás, L. ип1$ёШаШ ||||^ 9W, , дшЗр ¡¡ L ШепНЫ ■■Kfe^; ' :;■ JLH

L. raddei i ■ js L. rostombekovi ■ L. portschinskii

L, valentini, ili; L. uzzm Iii ill- Ш L. nairensis

Все однополые виды ящериц рода Lacerta на большей части ареала аллопатричны со своими родительскими формами. Однако местами между ними сохраняются зоны сим па три и, в которых возникают гибриды обоих полов, получающие два генома от партеногенетической матери и один геном от отца — самца родительского бисексуального вида. У ящериц рода Lacerta

подобные гибриды обычно стерильны. Однако у американских однополых ящериц рода Cnemidophorus такие триплоидные гибридные особи в большинстве случаев плодовиты и склонны к партеногенетическому размножению, что обеспечило становление самостоятельных триплоидных партеногенетических видов (Коул, 1984).

Помимо гибридов описаны случаи спонтанного возникновения мужских диплоидных особей в популяциях однополых видов ящериц (Darevsky, Kupriyanova, 1982; Darevsky et al., 1978; Taylor et al., 1967). Было показано, что такие самцы развиваются в яйцах партеногенетических самок, но обычно оказываются нежизнеспособными и погибают на разных стадиях эмбриогенеза. Только в редких случаях они нормально развиваются и достигают половозрелого состояния. Ф�