Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика доменного уровня организации эукариотического генома

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика доменного уровня организации эукариотического генома"

На правах рукописи УДК 576.315.42

РГ6 Ой

1 О ЯИП

ЯРОВАЯ ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ДОМЕННОГО УРОВНЯ ОРГАНИЗАЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА

Специальность 03.00.03~"молекулярная биология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН Научный консультант:

чл. — корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор Разин С.В.

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор биологических наук,

профессор Збарский И.Б.

чл. — корр. РАН, доктор медицинских наук,

профессор Корочкин Л.И.

доктор биологических наук, профессор Карпов В.Л. Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и ЮА-Овчинникова РАН

Защита состоится "30" января 1998 года в " // » часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова д. 32

Автореферат разослан '' декабря 1997 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ.

В настоящее время считается общепризнанным, что эукаряотическая ДНК организована в петли размером от 10 до 200 т.п.н., фиксированные своими основаниями на скелетных структурах ядра (ядерном матриксе). Известно также, что геном высших организмов подразделяется на независимые функциональные единицы — репликоны и транскриптоны. Вопрос о возможном соответствии петель хромосомной ДНК функциональным единицам генома широко обсуждается в литературе.

Для решения этого вопроса необходимо проанализировать, насколько специфично происходит образование петель ДНК, т.е. выяснить, имеют ли границы петель какое —то определенное положение в геноме и существует ли специфический класс последовательностей, обеспечивающих закрепление петель ДНК на ядерном матриксе. Результаты, полученные разными авторами к настоящему времени, во многом противоречивы. Это объясняется прежде всего отсутствием адекватной процедуры изоляции последовательностей, расположенных в основаниях петель. Все разработанные к настоящему моменту экспериментальные процедуры позволяют идентифицировать и выделить последовательности ДНК, обладающие способностью связываться со скелетными структурами ядра. Первая группа методов картирования границ петель базируется на выделении так называемой ДНК ядерного матрикса. Для этого проводят нуклеазную обработку ядер с последующей солюбилизацией отщепившихся дистальных частей петель ДНК. Для солюбилизации организованной в хроматин ДНК часто пользуются экстракцией 2 М раствором №С1, хотя существуют и другие протоколы.

Вторая группа методов позволяет идентифицировать последовательности ДНК, преимущественно связываемые белками скелетных структур ядра in vitro (т.наз. MAR— и SAR—элементы). В обоих случаях в результате выделяется широкий спектр последовательностей ДНК, имеющих некоторые общие черты. Вероятнее всего, основания петель представляют собой лишь небольшую фракцию внутри этого множества. Это объясняется тем, что большая часть взаимодействий ДНК со скелетными структурами ядра обусловлена процессами транскрипции и репликации, имеет временный характер и не связана с организацией генома в петли.

Разработанная нами процедура картирования участков прикрепления петель ДНК к ядерному матршссу концептуально отличается от описанных подходов. Мы отказались от анализа свойств весьма гетерогенной фракции прикрепленной к ядерному матриксу ДНК. Наш подход основан на выщеплении петель по участкам их прикрепления к скелетным структурам и последующем изучении целых петель ДНК.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью данной работы является разработка надежной процедуры картирования границ петель хромосомной ДНК и изучение с использованием данной процедуры структурно — функциональной организации эукариотического генома. Конкретные задачи исследования сводились к следующему:

1. разработать экспериментальную процедуру, позволяющую расщепить геном на отдельные петли по участкам их прикрепления к скелетным структурам ядра

2. картировать основания петель в границах протяженных уникальных и повторяющихся областей различных эукариотических геномоь с

использованием разработанной экспериментальной процедуры

3. изучить специфичность крупномасштабной фрагментации генома различными эндогенными и экзогенными нуклеазами, в том числе в ходе индуцированного апоптоза

4. исследовать зависимость доменной организации генома эукариот от функционального состояния клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые предложена принципиально новая процедура, позволяющая специфически расщепить геном по участкам прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу. В результате специфического ингибирования топоизомеразы II ядерного матрикса противоопухолевым препаратом 4' — диметилэпиподофилотоксинтенилиден —(3—Б —глюкозидом (ВМ —26) в последовательности ДНК, расположенные в участках прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу, вносятся двухцепочечные разрывы, в результате чего происходит расщепление генома на отдельные петли ДНК. Это открывает возможность создания крупномасштабных карт генома эукариот, отражающих характер укладки ДНК в петли. Были построены карты организации в петли кластера рибосомных генов млекопитающих, а также визуализированы домены, содержащие некоторые уникальные гены высших эукариот. Были картированы основания петель в протяженной области локуса 14В —15В X—хромосомы ВтозорЫ1а те\аподаз1ег. Впервые показано, что участок прикрепления петли представляет собой не точку, а достаточно протяженную зону, внутри которой осуществляются комплексные взаимодействия ДНК с белками ядерного матрикса.

Исследовала специфичность крупномасштабной фрагментации ДНК на начальных стадиях апоптотической гибели клеток. Впервые продемонстрировано, что при индукции апоптоза происходит специфическое выщепление петель ДНК и их олигомеров по участкам прикрепления к ядерному матриксу. Показано, что участки прикрепления петель ДНК являются предпочтительно доступными для экзогенных нуклеаз в пермеабилизированных клетках.

Впервые продемонстрирована зависимость организации участка прикрепления петли ДНК от репликативного статуса клеток. Показано, что при стимулировании клеток к пролиферации происходит реорганизация участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу.

На основании полученных данных предложена модель трехмерной структурно — функциональной организации эукариотического ядра, разрешающая многие противоречия, накопившиеся в этой области исследований.

Полученные результаты имеют большое практическое и теоретическое значение. Подробно изучен механизм действия ингибитора топоизомеразы ВМ —26, широко использующегося при химиотерапии многих форм рака. Знание механизма действия ВМ —26 позволяет предсказать отдаленные последствия и возможные побочные действия этого препарата.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные результаты работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях и семинарах, в том числе на юбилейной конференции—симпозиуме по проблемам количественной биологии в Колд Спринг Харборе (США,

1993), на Гордоновских конференция« "Ядерные белки, структура хроматина и экспрессия гена" (США 1994, 1996), на Международной конференции, организованной Институтом Казузо "Структура и функция хромосомы", (Япония, 1994), на Кейстоуяском симпозиуме "Ядерный матрикс и эпигенная наследственность" (США, 1995), на школе "Структура хроматина", организованной НАТО (Греция, 1995), на Международных курсах по молекулярной биологии, организованных Центром генетической инженерии и биотехнологии (1ССЕВ) (Италия, 1995), на Международной конференции Е1*.В.А."Структура и функции генома" (Италия, 1996), на конференции по программе "Геном человека" (Германия, 1996), на 3 —ей Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Россия, 1997), на Юбилейном Симпозиуме, посвященном 10—летию 1ССЕВ (Италия, 1997), на II съезде Российского Биохимического Общества (Россия, 1997) и на лекциях в ведущих российских и зарубежных научно—исследовательских учреждениях.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на 223 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, экспериментальная часть (материалы и методы и результаты), обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя 412 источников. Работа проиллюстрирована 34 рисунками и 1 таблицей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

Как уже отмечалось, вопрос о специфичности организации геномной ДНК в петли не был решен до сих пор из —за противоречивости экспериментальных данных относительно свойств прикрепленных к скелетным структурам ядра последовательностей ДНК. В данной работе для изучения организации генома в петли был использован принципиально новый подход. Нами была предложена экспериментальная процедура, позволяющая охарактеризовать индивидуальные петли ДНК после их специфического выщепления по участкам прикрепления к скелетным структурам ядра. В качестве инструмента для вырезания петель ДНК была использована эндогенная ДНК—топоизомераза II. Топоизомераза II является неотъемлемой частью ядерного матрикса. В то же время фермент присутствует и в кариоплазме. Растворенную форму фермента удается легко экстрагировать из ядра растворами с физиологической и высокой ионной силой. При этом фермент, остающийся в составе скелетных структур ядра, не теряет своей активности. В норме топоизомераза И катализирует реакции релаксации, декатенации и расплетания ДНК. Во всех этих реакциях топоизомераза II осуществляет расщепление и последующее религирование обеих цепей ДНК, ковалентно связываясь по концам молекулы в месте разрыва. Промежуточные ДНК —белковые комплексы в реакции расщепления — религирования могут быть накоплены под воздействием ряда противоопухолевых агентов (ВМ — 26, ВП —16, амсакрин), т.к. эти вещества ингибируют реакцию религирования. Дальнейшая депротеинизация ДНК—белковых комплексов ведет к появлению

двухцепочечных разрывов в молекуле ДНК (рис. 1).

Рис. 1. Механизм топоизомеразного расщепления ДНК под действием ВМ —26.

ВМ-26, зээ

5'

На базе этого была разработана экспериментальная процедура, позволяющая расщеплять эукариотический геном на индивидуальные петли посредством внесения разрывов участки их прикрепления к скелетным структурам ядра (рис. 2В).

Рис, 2. Схема, иллюстрирующая выщепление петель ДНК по участкам их прикрепления к ядерному матриксу топоизомеразой скелетных структур.

В

растворимая топоизомераза II

Ф ф • «

ВМ-26

ВМ-26 10 мкг/мл

ВМ-26 50 мкг/мл

депротешшзация

Клетки пермеабилизировали с помощью неионных детергентов и экстрагировали раствором, содержащим 2 М NaCl, В результате получали остаточные скелетные структуры с прикрепленными петлями ДНК, содержащие в своем составе сохраняющую ферментативную активность топоизомеразу II. После экстракции и отмывания нуклеоиды инкубировали в буфере для топоизомеразы II в присутствии различных концентраций ВМ —26. На этом этапе происходило накопление двухцепочечных разрывов в участках закрепления ДНК на ядерном матриксе. После депротеинизации в присутствии SDS и протеиназы К результирующие фрагменты ДНК, представляющие собой вырезанные индивидуальные петли и их олигомеры, разделяли электрофорезом в пульсирующем поле. Далее иммобилизированные на нейлоновых фильтрах препараты ДНК использовали для гибридизационного анализа.

2. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ И РЯДА УНИКАЛЬНЫХ ГЕНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Предложенный нами протокол был использован для характеристики доменной организации кластера рибосомных генов культуры клеток китайского хомячка (СНО) (Яровая с соавт. 1993, Razin et al., 1993, Яровая с соавт., 1994, Hancock et al., 1993, Яровая и Разин, 1998). Клетки запаивали в блочки с 1% легкоплавкой агарозой, пермеабилизировали при помощи неионного детергента NP —40, экстрагировали 2 М раствором NaCl и обрабатывали ВМ —26 в различных концентрациях в буфере для топоизомеразы II. После депротеинизации выгцеплеяные фрагменты ДНК разделяли посредством электрофореза в пульсирующем поле, переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали со специфическими пробами. Техника проведения электрофореза в пульсирующем поле и работа с

крупными [более 50 т.п.н.) фрагментами ДНК требует, чтобы любые манипуляции с ДНК в растворе были исключены из —за возможности гидродинамической деградации длинных молекул. Поэтому живые клетки фиксировали в агарозных блочках и все процедуры экстракции, обработки антибиотиками, ферментами и депротеинизацию проводили с ДНК, фиксированной в геле. Эта процедура является достаточно мягкой и не влияет на жизнеспособность клеток — с одной стороны, и исключает возможность гидродинамической деградации ДНК — с другой стороны. На рис. ЗА показано характерное молекулярно — весовое распределение фрагментов ДНК после их разделения в пульсирующем поле и окраски бромистым этидием. Можно видеть, что материал распределяется в диапазоне от 30 до 300 т.п.н. при максимальной концентрации ВМ—26. По мере увеличения концентрации ВМ —26 происходит постепенное снижение среднего молекулярного веса выщепляемых фрагментов. В контроле (т.е. б отсутствии ВМ—26) расщепления ДНК почти не происходит и большая часть материала остается на старте и в области верхней компрессии. Для исследования специфичности организации в петли кластера рибосомных генов фильтры гибридизовали с последовательностью, кодирующей 18Б РНК (рис. ЗВ) Известно, что в клетках китайского хомячка содержится около 500 копий тандемно повторенного мономера рибосомного гена размером около 34 т.п.н. После гибридизации на радиоавтографах можно наблюдать набор полос, соответствующих мономеру (34 т.п.н.) и олигомерам рибосомального повтора. Можно заключить, что в результате топоизомеразного расщепления происходит вырезание мономера и олигомеров петель

рибосомного гена, при этом размер мономера одиночной петли

соответствует единице повтора. В качестве

Рис. 3. Результаты электрофоретического разделения в пульсирующем поле (А) и гибридизации с рибосомной пробой (В) в присутствии и в отсутствии хромомицина (С) фрагментов ДНК, выщепляемых топоизомеразой II ядерного матрикса при обработке ВМ—26 пермеабилизированных и экстрагированных 2 М раствором NaCl клеток СНО .

A. 1-0, 2-5, 3-10, 4-20, 5-40, 6-60 мкг/мл ВМ-26. 7-маркер -конкатемеры ДНК фага X.

B. 1—5, 2 — 20, 3 — 40, 4 — 60 мкг/мл ВМ —26. Стрелками указаны позиции маркера: 50, 100, 150, 200 т.п.н.

C. обработка ВМ-26 в присутствии хромомицина (Х.р + ) и в отсутствии хромомицина (Хр —).

дополнительного доказательства того, что ДНК расщепляется под действием топоизомеразы II, мы проводили обработку ВМ—26 в присутствии хромомицина — ингибитора топоимзомеразы II. На рис. ЗС представлены результаты этого эксперимента. Можно видеть, что эффективность расщепления ДНК в присутствии хромомицина существенно снижена, т.к. хромомицин связывает и экранирует последовательности, атакуемые топоизомеразой. Необходимо отметить, что при обработке чистой ДНК экзогенной топоизомеразой II характерный специфический паттерн расщепления отсутствовал и деградация происходила случайным образом. Таким образом можно утверждать, что выявленный в наших экспериментах специфический характер разрезания рибосомных генов никак не связан с ограниченной специфичностью топоизомеразы II в отношении атакуемых последовательностей ДНК.

Полученные результаты позволяют однозначно утверждать, что расщепление ДНК происходит специфически по основаниям петель, результатом чего является выщепление мономера и олигомеров рибосомного повтора. Однако на основании полученных результатов нельзя ничего сказать о локализации точки разрыва внутри гена. Участки разрыва внутри рибосомного гена были картированы с использованием стратегии непрямого мечения концов выщепляемых фрагментов. Если имеется некий рестрикционный фрагмент и гибридизационная проба, близко расположенная к одному из его концов, то при наличии специфических разрывов в части молекул после гибридизации можно видеть целый фрагмент, а также набор субфрагментов меньшего молекулярного веса (рис. 4). Для картирования разрыва внутри

рибосомного гена использовали расщепление рестриктазами Eco RI или Hind III и три пробы, расположенные в области, кодирующей 18 S РНК и соответствующие концам рестрикционных фрагментов (рис. 5). Проба 1

Рис. 4. Стратегия процедуры непрямого мечения концов вьпцепляемых нуклеазами фрагментов ДНК.

А и В — пробы, расположенные на противоположных концах исходного фрагмента.

Крестиками помечены места нуклеазных разрывов.

1 — набор субфрагментов, выявляемых пробой А при частичном нуклеазном гидролизе.

2 — набор субфрагментов, выявляемых пробой В при частичном нуклеазном гидролизе.

А

-X-M—н-

1

-».

-^

-^

■<-

ч-

представляет собой Eco RI—Xba I фрагмент, проба 2 — Hind III —Xba I фрагмент и проба 3 — EcoR I—Xba I — фрагмент. Как видно из приведенных автографов, только в первом случае выявляются дополнительные субфрагменты размером около 7 т.п.н. в опыте по сравнению с контролем, тогда как пробы 2 и 3 дополнительных субфрагментов не выявляли. Это делает возможным картировать место

разрыва, при этом наличие нескольких субфрагментов позволяет утверждать, что расщепление топоизомеразой происходит не в точке, а в зоне, расположенной на расстоянии 4.8 — 5.5 т.п.н. перед началом кодирующей 18 Б РНК последовательности.

Рис. 5. Картирование топоизомеразного разрыва в мономере рибосомного

А — рестрикционная карта, расположение кодирующих областей и использованных для гибридизации проб.

В — результаты гибридизационного анализа фрагментов ДНК, выщепляемых топоизомеразой II ядерного матрикса и дополнительно переваренных рестриктазами Eco RI (для проб 1 и 2) Hind III (для пробы

1,2,3 — номера использованных проб. " —" — контрольные клетки

"+" — клетки, обработанные 10 мкг/мл ВМ — 26 в течение 1 часа. Левая дорожка " + " — живые клетки, правая дорожка " + " — пермеабилизированные и экстрагированные 2 М раствором ЫаС1 клетки.

повтора.

3}

Д Проба 1

Проба 2 Проба 3

ВМ-26 о +■ +

о + + о + +

436.6-

Щ'4** "W

в

П

1т п о

Проба 2

Проба I

Проба 3

Предваряя возможную критику об артефактном происхождении полученных специфических разрывов, аналогичные эксперименты были

проведены in vivo. Для обработки ВМ —26 мы использовали не экстрагированные ядра, а живые клетки, запаянные в блочки или находящиеся в среде. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 6А и С.

Рис. 6. Результаты электрофоретического разделения в пульсирующем поле (А и В) и гибридизации с рибосомной пробой (С и D) фрагментов ДНК, выщепляемых топоизомеразой II ядерного матрикса при обработке живых клеток СНО ВМ — 26 в отсутствии (А и С) и в присутствии (В и D) дистамицина.

1 -5, 2-10, 3 - 20, 4- 40, 5- 60 мкг/мл ВМ-26. X - маркер, разделение конкатемеров ДНК фага h.

Мы получили принципиально такую же картину, однако интенсивность гибридизации между дискретными полосами была значительно выше для живых клеток, чем для экстрагированных ядер. На основании полученных данных можно заключить, что участки прикрепления петель являются предпочтительными сайтами для атаки топоизомеразой не только в экстрагированных ядрах, но и в живых клетках. Высокий гибридизационный сигнал между полосами в экспериментах с живыми клетками может быть легко объяснен внесением разрывов по всему протяжению петли ДНК растворимой формой топоизомеразы II, которая присутствует в неэкстрагированных клетках (рис 2А). Для повышения специфичности расщепления ДНК топоизомеразой II in vivo мы использовали дистамицин. Этот антибиотик связывает AT —богатые последовательности, в несколько раз повышая специфичность и эффективность расщепления по SAR—элементам. На рис. 6 А,В можно видеть, что в присутствии дистамицина разброс молекулярных весов результирующих фрагментов ДНК уменьшается по сравнению с теми же кинетическими точками в контроле (в отсутствии дистамицина). Интенсивность сигнала между дискретными полосами при этом уменьшается.

Принципиальная схожесть характера крупномасштабной фрагментации ДНК in vivo и в экстрагированных ядрах позволяет сделать вывод об адекватности предложенной экспериментальной процедуры. Экстракция ядер 2 М раствором NaCl не ведет ни созданию de novo или дезинтеграции чувствительных к топоизомеразе последовательностей, ни к их перераспределению относительно скелетных структур ядра. Картирование области топоизомеразного разрыва в рибосомальном

кластере также показало совпадение участков прикрепления петли в экстрагированных ядрах и в живых клетках (рис. 5).

Подводя итог, можно заключить, что использованный нами экспериментальный протокол полностью подтверждает ту базовую теоретическую модель, на основе которой он был разработан. Это свидетельствует не только об адекватности экспериментального подхода, но и о справедливости исходной модели. Предложенная методология не зависит ни от конкретной роли топоизомеразы II, как части комплекса участка прикрепления, ни от тех сложных ДНК —белковых взаимодействий, которые происходят в зоне фиксации петли. Разработанный нами подход делает возможным использование созданной природой сложной системы в качестве простого экспериментального инструмента.

Известно, что ядрышко представляет собой весьма специфический компартмент зукариотического ядра. Поэтому закономерности, выявленные на рибосомных генах, могут совершенно не отражать ситуацию в целом. Пространственная организация неядрышковых генов может сильно отличаться от таковой для рибосомных генов и вообще быть построенной на иных принципах. Нашей ближайшей целью было распространение разработанной нами экспериментальной процедуры на другие области генома китайского хомячка. Мы сделали попытку по гибридизации с уникальными последовательностями визуализировать домены (петли), содержащие эти уникальные последовательности. Экспериментальная процедура в данном случае ничем не отличалась от описанной выше. Экстрагированные ядра обрабатывали различными концентрациями ВМ — 26, депротеинизировали, результирующие

фрагменты ДНК разделяли в пульсирующем поле и гибридизовали с различными уникальными пробами, в т.ч. последовательностями гена белка теплового шока НБР27, генов дегидрофолатредуктазы и родопсина хомяка. Результаты гибридизаций приведены на рис. 7.

Рис. 7. Результаты гибридизации ряда уникальных генов китайского хомячка с фрагментами, выщепляемыми топоизомеразой II ядерного матрикса, при обработке ВМ —26 пермеабилизированных и экстрагированных 2 М раствором ИаС1 клеток СНО. На верхней панели показана концентрация ВМ—26. На крайней левой дорожке — конкатемеры ДНК фага }.. А — гибридизация с уникальной последовательностью гена белка дегидрофолатредуктазы (ДГФР) А и В — гибридизация с уникальной последовательностью гена белка теплового шока (БТШ)

С — гибридизация с уникальной последовательностью гена родопсина. А ВС

X БТШ ДГФР БТШ родопсин

ВМ-26 - 30 30 5 10 20 30 10 20

Можно видеть, что гибридизующиеся последовательности выявляются в виде дискретных полос. Обычно видно более одной полосы, хотя никакого регулярного паттерна (как в случае рибосомных генов) не обнаруживается. Это объсняется тем, что соседствующие домены могут значительно различаться по размеру. По молекулярному весу

гибридизующейся полосы легко определить размер петли, содержащий соответствующий ген. Для гена белка теплового шока это около 40 т.п.н., 50 т.п.н. для гена дегидрофолатредуктазы и 75 т.п.н. для родопсинового гена. Полученные величины соответствуют сложившимся представлениям о топологической организации генома эукариот.

Таким образом, предложенную нами экспериментальную процедуру можно использовать для изучения доменной организации как уникальных, так и повторяющихся ядрышковых генов.

3. КАРТИРОВАНИЕ ГРАНИЦ ДОМЕНОВ В ЛОКУСЕ 14В- 15В X-ХРОМОСОМЫ DROSOPHILA MELANOGASTER.

С нашей точки зрения представлялось весьма перспективным использовать новый подход для картирования положения оснований петель внутри достаточно хорошо охарактеризованной области генома. Применение редкощепящих рестриктаз в сочетании с процедурой непрямого мечения концов выщепляемых крупных фрагментов ДНК делает возможным картировать топоизомеразные разрывы на уровне разрешения электрофореза в пульсирующем поле для протяженных участков генома. Для решения этой задачи была выбрана область 14В — 15В X—хромосомы D. melanogaster с известной рестрикционной картой, картироваными транскриптами, SAR— и ARS—элементами и доступными уникальными пробами (Яровая с соавт., 1994, Iarovaia et al., 1996, Яровая с соавт., 1996). Полученные после топоизомеразного гидролиза препараты ДНК далее обрабатывали редкощепящими рестриктазами Sfi I и Not I и результирующие фрагменты разделяли в пульсирующем поле. Общая стратегия выбора проб для гибридизаций с соответствующими рестрикционными фрагментами представлена на рис. 8. Позиции

рестрикционных сайтов для Not 1 и Sli 1 были определены ранее на рекомбинантных клонах. Важно отметить, что во всех случаях места расщепления по Not I и Sfi I не совпадают, что позволяет подтвердить топоизомеразные разрывы, картированные с использованием

Рис. 8. Общая стратегия выбора проб для картирования топоизомеразных разрывов в локусе 14В—15В X —хромосомы Drosophila melanogaster. На верхней панели представлены положения участков расщепления рестриктазами Not I и Sfi I. Внизу — результирующие фрагменты и концевые пробы, выявляющие эти фрагменты. Номер пробы совпадает с ее положением на карте.

Not!

..LL

«оо

т т ,т т_т

600 70С

тгпгт

i Sdl

Пр 550 -Пр Ево -

- Пр 543

.Пр. 705

Пр 360 -

Пр. 635 -

Пр 715 -

Not I

-Пр. 410

Пр 555 .

Пр. 5S0

_Ир 658

[1р. 705 -

Sfi I

Sfi I, соответствующими гибридизационными экспериментами с ДНК, переваренной Not I (и наоборот).

На рис. 9 представлены результаты гибридизационных экспериментов. Гибридизация пробы 543 с фрагментами ДНК, вырезанными из генома тоиоизомеразой по участкам прикрепления

петель и дополнительно переваренных Not 1, выявляет 6 субфрагментов { 15, 40, 75, 105 и 175 т.п.н.) помимо основного рестрикционного фрагмента размером 187 т.п.п. (рис. 9а). В контрольной дорожке дополнительные фрагменты отсутствуют. Из этого можно сделать вывод о том, что топоизомераза II ядерного матрикса расщепляет ДНК преимущественно в участках, расположенных на расстоянии 15, 40, 75, 105, 140 и 175 т.п.н. ниже Not I сайта, расположенного в точке 545 т.п.н. На карте эти позиции имеют координаты соответственно 370, 405, 440, 470, 505 и 530 т.п.н. Аналогичные рассуждения приводят к заключению о том, что появление дополнительного фрагмента размером 20 т.п.н, идентифицируемого пробой 580, указывает на наличие топоизомеразного разрыва в области, соответствующей на карте позиции 657. Фрагменты размером 35 и 55 т.п.н., выявляемые пробой 715, указывают на наличие разрывов в областях 748 и 770 т.п.н. Суммируя, можно заключить, что гибридизационный анализ выщепляемых эндогенной топоизомеразой и переваренных Not I фрагментов выявляет 10 участков предпочтительного расщепления. Положения 7 из этих 10 участков были подтверждены в гибридизациях с пробами к противоположному концу рестрикционных фрагментов.

Аналогичным образом было подтверждено наличие 7 из 10 участков расщепления в гибридизационных экспериментах с использованием другой рестриктазы — Sfi I. В этой серии экспериментов был обнаружен еще один участок прикрепления петли (620—625 т.п.н. по карте). Этот участок расщепления не мог быть выявлен в предыдущей серии экспериментов, т.к. соответствующий Not I фрагмент 608 — 623 т.п.н. не анализировали.

Рис. 9. Картирование топоизомеразных разрывов с использованием процедуры непрямого мечения концов выщепляемых топоизомеразой II фрагментов (относительно участков расщепления ДНК рестриктазой Not 1). Слева и справа приведены радиоавтографы, показывающие результаты гибридизации с пробами 543 (а), 550 (Ь), 580 (с) , 705 (d), 715 (е). f—результаты разделения конкатемеров ДНК фага л и рестрикта >.-Hind III. Стрелками обозначены позиции рестрикционных фрагментов и субфрагментов и их молекулярный вес. В центре представлена карта расположения рестрикционных фрагментов и идентифицированных участков расщепления (крестики).

к ВМ-26

к ВМ-26

а

4P ф «I 187

?-* 170 я* -Щ 140

» -л» 100

^ 75

Ч| г* -Щ 40

-Ч 15

к ВМ-26

30

mf -«•

33 30

300

400

500

600

700

800

:сь

i

к ВМ-26

к ВМ-26

86 Ф

55 35

X WHind III

300

200 J"**^-

100

50 в»*- т 23.1*"

9.4

Важным контролем к такого рода экспериментам является переваривание чистой ДНК экзогенной топоизомеразой II. Такой контроль был поставлен. Препараты ДНК дрозофилы были обработаны очищенной топоизомеразой в присутствии ВМ —26. На рис. ЮА можно видеть распределение результирующих фрагментов после электрофореза в пульсирующем поле. После топоизомеразной обработки ДНК была дополнительно переварена Not I, фрагменты разделены в пульсирующем поле и прогибридизованы с пробой 543. На рис. 10В представлены

Рис. 10. Анализ специфичности крупномасштабной фрагментации ДНК дрозофилы экзогенной очищенной топоизомеразой II. А—результаты электрофоретичесхого разделения в пульсирующем поле продуктов переваривания ДНК дрозофилы экзогенной топоизомеразой II. Блочки с ДНК инкубировали 45 мин. при 25 ° С с 8, 2, 0 мкг (1—3 дорожки, соответственно) очищенной топоизомеразы II дрозофилы в присутствии ВМ —26. Слева показано распределение конкатемеров ДНК фага X.

В —после дополнительной обработки Not I продукты переваривания ДНК 0, 2, 8 мкг (дорожки 1—3, соответственно) топоизомеразы II разделяли в пульсирующем поле, переносили на нейлоновый фильтр и гибридизовали с пробой 543. Стрелкой указано положение полноразмерного рестрикционного фрагмента, идентифицируемого пробой 543.

A JB

X 1 2 3 12 3

результаты этой гибридизации. На радиоавтографе можно видеть основной рестрикционный фрагмент длиной около 187 т.п.н. и случайное распределение гибридизационного сигнала ниже. Никаких дискретных дополнительных фрагментов, подобных тем, что мы наблюдали в экспериментах с эндогенной топоизомеразой, обнаружено не было. Т. обр., при обработке чистой ДНК экзогенной топоизомеразой предпочтительных участков атаки не выявляется. Из этого следует, что участки предпочтительного гидролиза эндогенной топоизомеразой II, выявляемые в экспериментах по обработке нуклеоидов ВМ —26, обязаны своим существованием взаимодействию ДНК с белками скелетных структур. Надо отметить, что случайное распределение участков расщепления, наблюдаемое при переваривании чистой ДНК топоизомеразой II, никак не противоречит тому общепризнанному факту, что топоизомераза обладает некоторой специфичностью в отношении узнаваемых последовательностей. Дело в том, что участки предпочтительного узнавания расположены на чистой ДНК достаточно часто и при том разрешении, которое обеспечивает электрофорез в пульсирующем поле, результирующие фрагменты не могут быть выявлены в виде дискретных полос.

Таким образом, в исследуемом локусе нами было прокартировано 11 участков прикрепления петель ДНК, которые ограничивают 10 петель длиной от 20 до 90 т.п.н. На схеме (рис. 11) суммированы результаты экспериментов по картированию участков прикрепления. Имея в виду низкое разрешение метода электрофореза в пульсирующем поле, мы оцениваем возможную ошибку в определении позиции участка расщепления в 5 т.п.н.

Рис. 11. Суммарная карта, показывающая позиции картированных топоизомеразных разрывов (темные квадраты), автономно реплицирующихся последовательностей (темные овалы), и MAR/SAR — элементов (нижняя часть ломаной линии под картой). Верхняя часть ломаной линии соответствует участкам, не содержащим MAR/SAR— элементов. Участки, обозначенные толстой линией, соответствуют MAR/SAR — элементам максимальной аффинности.

350 400 450

650 700 750

_L_e_^ ^ о I_1_

—Ш-;-Ш-Ш-

Ulli

Как мы уже отмечали, выбранный нами локус достаточно хорошо охарактеризован. В частности, с использованием экстракции дииодосалицилатом лития для этого локуса прокартированы SAR— элементы. Их позиции показаны на схеме на нижней линии диаграммы, в частности, SAR—элементы, имеющие максимальную аффинность к белкам скелетных структур, отмечены жирной линией. Можно видеть,

что за единственным исключением (позиция участка разрыва — 470 т.п.н.) участки прикрепления совпадают, или хотя бы частично перекрывают SAR—элементы. Однако, существует большое количество SAR—элементов, расположенных в дисталыгых частях петель ДНК. Это говорит о том, что афинность ДНК к белкам скелетных структур сама по себе еще не достаточное основание для того, чтобы был образован участок прикрепления петли. Важно и то, что не обнаружено никакой зависимости между степенью аффинности SAR — элементов и вероятностью вовлечения этих элементов в организацию участка прикрепления. Действительно, только один из картированных "сильных" SAR — элементов совпадает с участком прикрепления петли. Надо подчеркнуть, что в экспериментах по перевариванию клонированных последовательностей этого локуса топоизомеразой II in vitro большая часть картированных SAR —элементов совпадала с участками гиперчуЕствительности к топоизомеразе. Интересно отметить, что существует некоторая корреляция в распределении участков прикрепления петель ДНК и последовательностей, способных поддерживать автономную репликацию в дрожжах (ARS — элеменов). Функциональный смысл такого совпадения пока неясен.

В границах исследованного локуса ранее были картированы два гена, расположенных в районах с 413 по 427 т.п.н. и с 507 по 542 т.п.н. на карте. Один из участков прикрепления (530 т.п.н.) таким образом оказывается расположенным внутри гена PS 2. Этот ген экспрессируется в большинстве культур клеток дрозофилы. Из этого следует, что участок прикрепления петли не является препятствием для транскрипции. Предложенный нами метод был использован для картирования участков

прикрепления петель в амплифицированном локусе с—туе человека. Авторами были обнаружены множественные точки прикрепления, расположенные внутри фрагмента длиной 5 т.п.н., перекрывающем два первых экзона. В этом случае также приходится говорить не о точке, а о зоне прикрепления петли. Этими же авторами было подтверждено наше заключение о том, что зоны прикрепления совпадают в живых клетках и в экстрагированных ядрах.

Т.обр. нами была разработана процедура, позволяющая расщепить геном на отдельные петли по участкам их прикрепления к скелетным структурам ядра. Предложенный метод картирования не приводит к перераспределению, утрате или созданию de novo участков прикрепления. Основанная на теоретической модели топологической организации генома, наша экспериментальная процедура сама по себе эту модель подтверждает.

Наш метод может быть использован для картирования петель внутри протяженных областей генома и целых хромосом. Причем такие карты будут отражать не только физическое, но и функциональное устройство генома и являться важным инструментом изучения структурно — функциональной организации эукариотической ДНК.

4. АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧНОСТИ КРУПНОМАСШТАБНОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК ПРИ АПОПТОЗЕ.

Не так давно было показано, что в процессе апоптоза деградация ДНК начинается с вырезания крупных фрагментов ДНК (размером 50 — 300 т.п.н.), которые впоследствии расщепляются до олигонуклеосомных фрагментов. Было предположено, что характер крупномасштабной фрагментации ДНК при апоптозе отражает периодичность укладки 30 —

нм фибриллы хроматина, возникающую за счет фиксации оснований петель на элементах скелетных структур ядра. Однако единственным основанием для такого предположения являлось совпадение приблизительных размеров выхцепляемых при апоптозе фрагментов и петель ДНК в геноме эухариот. Данные о специфичности деградации отсутствовали. Соответственно, не представлялось возможным сравнение характера деградации ДНК при апоптозе с распределением участков прикрепления внутри изученных областей. Разработанная нами процедура картирования участков прикрепления позволила провести такое сопоставление. В качестве экспериментальной модели был выбран кластер рибосомных генов мыши и неамплнфицированный ген с~пгус человека. Нашей экспериментальной задачей было сравнение характера крупномасштабной фрагментации генома, происходящей под действием топоизомеразы II ядерного- матрикса и при апоптозе, индуцированном фактором некроза опухолей (а —TNF) и содержанием клеток в среде без сыворотки (Lagarkova et al., 1995а).

На рис. 12А показано характерное электрофоротическое распределение фрагментов ДНК, вьпцепляемых из генома клеток человека и мыши под действием различных концентраций а —TNF в течение 12 — 48 часов. Надо отметить, что а —TNF вызывает апоптоз в самых разных клеточных линиях. В некоторых случаях для индукция апоптоза необходима дополнительная обработка клеток актиномицином D. В наших экспериментах человеческие клетки RPMI —6410t обрабатывали а—TNF в присутствии актиномицина D, мышиные клетки L—929 инкубации с актиномицином D не требовали. Можно видеть, что в обоих типах клеток на начальных этапах апоптоза значительная часть

Рис. 12. Анализ специфичности крупномасштабной фрагментации ДНК в ходе апоптоза, вызванного обработкой клеток а—TNF. А—результаты электрофоретического разделения в пульсирующем поле выщепляемых в ходе апоптоза фрагментов ДНК В—гибридизация разделенных фрагментов с рибосомальной пробой. 1 — фрагментация ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса по участкам прикрепления петель к скелетным структурам. 2 — 4 — фрагментация ДНК в клетках RPMI —6410t, обработанных актиномицином D (1 мкг/мл) и культивированных в течении 48 часов в отсутствии (2) или в присутствии 5 ед/мл а —TNF (3) и 10 ед/мл а—TNF (4). 5—7 — фрагментация ДНК в клетках L929, культивированных 0 час. (5), 12 час. (6) и 18 час. (7) в среде, содержащей 5 ед/мл а —TNF. Все дорожки содержат ДНК, выделенную из одинакового количества клеток. Стрелками указаны позиции маркеров — 50, 100, 150 т.п.и.

Ф

клетки RPMI 6410t L929

aKT.D 1 мкг/мл нет

a-TNF 0 5 10ед/мл 5 ед/мл

время 48 ч. 0 12 18 ч.

ДНК расщеплялась до фрагментов с размерами от 50 до 300 т.п.н. (рис. 12А). На основании окрашивания трипановым голубым делали вывод о количестве мертвых клеток в культуре. Более 50% клеток RPMI — 6410t, обработанных а—TNF в присутствии актиномицина D, окрашивались трипановым голубым после 48 часовой инкубации. Аналогичный цитотоксический эффект наблюдали через 12 часов культивации клеток L —929 после обработки а —TNF. В обоих случаях большая часть клеток в популяции имела типичную апоптотическую морфологию.

Следующим этапом нашей работы был анализ специфичности крупномасштабной фрагментации ДНК при апоптозе. Результаты габридизационного анализа приведены на рис. 12В. Наличие дискретных полос, гибридизующихся с рибосомной пробой, свидетельствует о том, что в обоих случаях расщепление происходит специфически. Важно, что идентичный характер фрагментации кластера рибосомных генов наблюдается и под действием эндогенной топоизомеразы II ядерного матрикса. Как было показано в предыдущем разделе, характер деградации ДНК под действием ВМ—26 прямо отражает распределение участков прикрепления петель в исследуемом локусе. Таким образом, на примере деградации кластера рибосомных генов в ходе апоптоза под действием а —TNF в присутствии или в отсутствии актиномицина D можно заключить, что гидролиз ДНК при апоптозе начинается с выгцепления индивидуальных петель и их олигомеров по участкам, их. прикрепления к скелетным структурам ядра. Аналогичные результаты были получены на другой системе с использованием той же гибридизациопной пробы. Было показано, что в процессе апоптотической деградации ДНК при бессывороточном содержании клеток происходит выщепление крупных

фрагментов ДНК, сопоставимых по молекулярному весу с размерами петель. Мы исследовали специфичность подобной деградации ДНК в клетках эритролейкемии человека К —562 при апоптозе, вызванном инкубацией клеток в среде без сыворотки (рис. 13). Через 68 часов культивации в отсутствии сыворотки более 50% клеток в популяции были трипан — позитивными, а через 168 часов практически все клетки были мертвы.

Рис. 13. Анализ специфичности крупномасштабной фрагментации кластера рибосомных генов в клетках К562 в ходе апоптоза, вызванного бессывороточным культивированием.

А — результаты электрофоретического разделение в пульсирующем поле крупных фрагментов ДНК, вьпцепляемых в ходе апоптоза В — гибридизация разделенных фрагментов с рибосомной пробой. 1—3 дорожки—ДНК, выделенная из одинакового количества клеток, культивированных в отсутствии сыворотки в течении 24, 96 и 168 час., соответственно. Справа — разделение конкатемеров ДНК фага X.

А В

1 2 3 X 12 3

Анализ молекулярно—весового распределения выщепляемых фрагментов (через 68 часов инкубации) позволяет выявить наличие ДНК в области от 50 до 600 т.п.н. (рис. 13А). Через 168 часов инкубации эти фрагменты все еще видны, однако их средний молекулярный вес существенно ниже. Гибридизационный анализ с рибосомной пробой (рис. 13В) выявляет такой же регулярный паттерн, как и в предыдущем случае. Т. обр. можно сделать вывод, что и для этой клеточной линии в ходе

У

апоптоза, вызванного бессывороточным содержанием, происходит преимущественное расщепление ДНК по участкам прикрепления петель.

Для проверки того, справедливы ли сделанные выводы для неядрышковых генов, мы провели аналогичную серию экспериментов с использованием в качестве гибридязационной пробы фрагмента гена с— туе человека (рис. 14). Эксперименты с бессывороточным содержанием культуры клеток эритролейкемии человека К—562 проводили, как было описано выше. На рис. 14А представлено электрофоретическое распределение выщепляемых крупных фрагментов ДНК в зависимости от времени инкубации. На отдельной дорожке представлено разделение фрагментов ДНК, выщепляемых топоизомеразой II ядерного матрнкса под действием ВМ—26. Для гябридизационного анализа использовали пробу, содержащую фрагмент гена с—туе человека. Можно видеть (рис. 14В), что по мере деградации ДНК происходит накопление фрагмента длиной около 80 т.п.н. Такой же фрагмент выщепляется при обработке ВМ —26 клеток, пермеабилизированных и экстрагированных 2 М раствором ЫаС1. Домен гена с—туе удается идентифицировать в виде отдельной полосы на радиоавтографе, соответствующей мономеру петли. Минорные высокомолекулярные полосы, хорошо различимые на автографе,

Рис. 14. Анализ специфичности крупномасштабной фрагментации локуса с—туе в клетках К562 в ходе алоптоза, вызванного бессывороточным культивированием.

А—результаты электрофоретического разделение в пульсирующем поле выщепляемых в ходе апоптоза фрагментов

В—гибридизация разделенных фрагментов с фрагментом гена с-тус. Слева представлено разделение конкатемеров ДНК фага к.

А Л

X 1 2 3 4 5 6 X. 1 2 3 4 5 6

ВМ-26 120 96 48 24 0 ч ВМ-26 120 96 48 24 0 ч

соответствуют олигомерам петель. Можно заключить, что в процессе апоптотической деградации ДНК при бессывороточном содержании клеток К-562 происходит специфическое выщепление петель ДНК по их основаниям. Это заключение справедливо как для рибосомных, так и для неядрышковых генов.

Полученные результаты можно объяснить двояко. С одной стороны, можно предположить, что в скелетных структурах ядра содержатся в норме неактивные нуклеады. Активация эти нуклеаз является важным этапом в цепи событий, приводящих к клеточной смерти. В пользу этого свидетельствует тот факт, что действующий при вырезании петель фермент отличается от обычной Ca/Mg - зависимой нуклеазы. Ионы

Zn++ являются мощным ингибитором Ca/Mg — зависимой нуклеазы, но практически не влияют на крупномасштабную фрагментацию ДНК при апоптозе. Несмотря на то, что ряд ингибиторов топоизомеразы II вызывают апоптоз, маловероятно, что топоизомераза II напрямую задействована в деградации ДНК во время клеточной смерти. Показано, что характер расщепления ДНК тимоцитов не отличается на начальных этапах апоптоза, индуцированного как метазоном, так и ингибиторами топоизомеразы II. Далее в обоих случаях фрагментация ДНК достаточно эффективно подавлялась актиномицином D, что свидетельствует о том, что в механизме апоптоза важную роль играет экспрессия специфических генов.

Вьицепление петель ДНК на начальных стадиях апоптоза может быть объяснена предпочтительной чувствительностью к нуклеазам ДНК участков прикрепления. В этом случае последовательности, лежащие в основаниях петель будут предпочтительно атаковаться цитоплазматическим нуклеазами, которые получают доступ к ядру при инициации апоптоза. Эти соображения подтолкнули нас к проведению новой серии экспериментов, направленных на изучение крупномасштабной фрагментации ДНК различными нуклеазами.

5. КРУПНОМАСШТАБНАЯ ФРАГМЕНТАЦИЯ ГЕНОМА ПОД ДЕЙСТВИЕМ НУКЛЕАЗ.

Основной целью этого цикла экспериментов было выяснение вопроса о том, являются ли основания петель предпочтительными сайтами при действии эндогенных и экзогенных нуклеаз. Иными словами, мы намеревались сопоставить характер крупномасштабной фрагментации ДНК, вызванной эндогенными и экзогенными нуклеазами и

тодоизомеразой И ядерного матрикса. Основания для постановки этой экспериментальной задачи были следующие: Кларком с соавт. было показано, что при обработке метафазных хромосом нуклеазой Bal 31 происходит деградация ДНК с образованием фрагментов, сопоставимых по молекулярному весу с размерами петель. С другой стороны, нами было продемонстрировано, что на начальных стадиях апогггоза происходит независимая от топоизомеразы II деградация ДНК под действием специфических эндогенных нуклеаз.

Мы сравнивали характер крупномасштабной фрагментации рибосомных генов эндогенной топоизомеразой, и фрагментации, происходящей под действием нуклеазы Bal 31 (Lagar k.ova et al,, 1995, Лагарькова с соавт., 1995). Для этого запаянные в блочки клетки К —562 пермеабилизировали неионными детергентами, обрабатывали различными концентрациями нуклеазы Bal 31, и после депротеинизации результирующие фрагменты: разделяли в пульсирующем поле. Одновременно на том же геле разделяли фрагменты, выщепляемые под действием ВМ —26 топоизомеразой скелетных структур. Результаты этого эксперимента приведены на рис 15 (слева). Можно видеть, что обработка Bal 31 приводит к появлению популяции длинных фрагментов ДНК размером от 50 до 600 т.п.н. По мере увеличения количества нуклеазы происходит прогрессивное снижение среднего молекулярного веса ДНК. Некоторое количество деградированной ДНК в контроле может быть объяснено наличием в популяции небольшого процента мертвых клеток, ДНК которых деградирована. Молекулярно — весовое распределение фрагментов ДНК, выщепляемых под действием Bal 31, совпадает с таковым при топоизомеразной эксцизии петель. Для анализа

Рнс. 15. Результаты электрофоретического разделения в пульсирующем поле и гибридизации с рибосомной пробой фрагментов ДНК, вьпцепляемых при обработке нуклеазой Bal 31 пермеабилизированных клеток К —562 и при обработке ВМ —26 пермеабилизированных и экстрагированных 2 М раствором NaCl клеток К — 5S2. Сверху указаны концентрации ВМ—26 и Bal 31. Стрелками указано положение маркера — 50 и 100 т.п.н.

ВМ-26, мкг/мл Bal 31, ед./мл ВМ-26, мкг/мл Bal 31, ед./мл 15 50 0 200 100 50 15 50 0 200 100 50

специфичности расщепления результирующие фрагменты переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с фрагментом кодирующей части рибосомного гена. На результирующем автографе (рис. 15, справа) можно видеть, что в обоих случаях расщепление происходит специфически. Рибосомальная проба выявляет идентичный дискретный набор полос, причем размер самого легкого фрагмента составляет 44 т.п.н., что соответствует длине мономера кластера рибосомальных генов человека. Размер высокомолекулярных полос кратен этому числу. Несмотря на идентичность полученных паттернов нельзя утверждать, что внутри вырезаемого мономера длиной 44 т.п.н. оба фермента узнают одну и ту же последовательность. Действительно, идентичный набор полос

может быть получен при расщеплении по любому уникальному сайту, регулярно повторяемому на протяжении всего кластера. Картирование разрывов, вносимых обоими ферментами с использованием процедуры непрямого мечения концов въццепляемых фрагментов ДНК показало, что нуклеаза Bal 31 и топоизомераза ядерного матрикса атакуют одну и ту же последовательность, расположенную внутри нетранскрибируемого спейсера сразу вслед за точкой старта транскрипции! Это хорошо согласуется с результатами, полученными ранее на клетках китайского хомячка. Совпадение участков расщепления нерастворимой топоизомеразы и нуклеазы Bal 31 показывает, что предпочтительным участком, атакуемым обоими ферментами, являются основания петель ДНК. Соответственно, гибридизующиеся со специфической пробой дискретные фрагменты ДНК представляют собой мономер и олигомеры петель, содержащих рибосомные гены. Причины, по которым Bal 31 атакует основания петель, неясны. Этот фермент сочетает в себе как экзонуклеазную, так и эндонуклеазную активности. В случае отсутствия доступных концевых последовательностей Bal 31 предпочтительно расщепляет частично денатурированные участки или фрагменты с неканонической сируктурой. Как уже обсуждалось, среди возможных кандидатов на роль последовательностей, фиксирующих основание петли на скелетных структурах, наиболее вероятными являются SAR/ MAR— элементы, или часть их популяции, Одно из важных свойств этих геномных элементов — относительная легкоплавкость и способность к образованию неканонических структур. Следует отметить, что специфический гибридизационный паттерн не может быть получен при обработке препаратов чистой ДНК нуклеазой Bal 31. Кроме того, после

разрушения хроматина в результате обработки ядер концентрированными солевыми растворами последующий перевар Bal 31 также происходит неспецифически. Наши результаты находятся в хорошем соответствии с результатами других авторов. Картирование нуклеазных разрывов в амплифицироваяном локусе с—туе человека позволяет констатировать совпадение участков прикрепления петель ДНК и последовательностей, гиперчувствительных к ДНКазе I, S1 — нуклеазе, нуклеазе из проростков фасоли и ряду эндогенных нуклеаз.

С функциональной точки зрения интересным представляется рассмотреть наши данные в связи с рекомбинационными процессами, происходящими в ядре. Давно известно, что наиболее часто хромосомные перестройки происходят в специфических местах, т.наз. "горячих точках" хромосомы. Как показывает изучение распределения "горячих точек", участки, вовлеченные в рекомбинационные процессы, разделены длинными (20—100 т.п.н.) фрагментами ДНК, в которых перестройки происходят редко. Корреляция со средним размером петли в данном случае очевидна. Анализ свойств последовательностей ДНК, наиболее часто подверженных рекомбинационным процессам, часто выявляет в их составе MAR—элементы и последовательности, предпочтительно узнаваемый нуклеазами. Это также свидетельствует в пользу возможного вовлечения оснований петель в рекомбинационные процессы.

Интеграция ретровирусов в геном хозяина, что также является частным случаем рекомбинации, происходит почти исключительно по MAR — элементам.

Гейлом с соавторами на модельной системе было продемонстрировано, что эукариотическая топоизомераза II обладает

межмолекулярной лигирующей активностью и способна осуществлять неспецифическую рекомбинацию in vitro. Известно, что обработка клеток млекопитающих ингибиторами топоизомеразы II ведет к накоплению делеций, транслокаций и инсерций в хромосомах.

Накоплены факты, свидетельствующие о том, что химиотерапия с применением таких ингибиторов топоизомеразы II, как ВП —16 или амсакрин, часто через некоторое время вызывают вторичную лейкемию, обусловленную хромосомными перестройками. При этом происходящие перестройки расположены в геноме не случайно, а кластеризовано. Например, внутри гена миелоидно—лимфоидной лейкемии все перестройки после химиотерапии находились внутри участка длиной 8.3 т.п.н. Так как мишенью использованных противораковых средств в описанных случаях является топоизомераза II, то представляется вероятным, что основания петель являются предпочтительными сайтами незаконной рекомбинации, в результате которой теряются или транслоцируются фрагменты ДНК, сопоставимые по своей длине с размером петель.

С другой стороны, обнаруженная нами предпочтительная чувствительность участков прикрепления петель к нуклеазам также может являться причиной незаконных перестроек. Известно, что двухцепочечные разрывы ДНК могут индуцировать делеции и транслокации. Что касается ферментативного обеспечения рекомбинационных процессов, то было показано, что в препаратах ядерного матрикса присутствует рекомбиназная активность. Таким образом, участки прикрепления петель, являющиеся предпочтительными мишенями для топоизомеразы II и нуклеаз, представляют собой "слабые

точки" хромосом. С нашей точки зрения разработанная нами процедура картирования оснований петель ДНК имеет важное значение для изучения рекомбинационных процессов в эукариотическом геноме.

6. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА ЗАВИСИТ ОТ РЕПЛИКАТИВНОГО СТАТУСА

КЛЕТОК.

Разработка экспериментального подхода, позволяющего расщепить геном на отдельные петли по участкам их прикрепления, открывает широкие перспективы для дальнейших исследований. Например, оказалось возможным выяснить, происходит ли реорганизация доменной структуры при изменении функционального статуса клеток, в частности, при активации пролиферации. В качестве модели был выбран хорошо изученный с точки зрения доменной организации кластер рибосомных генов человека. Мы сравнивали характер крупномасштабной фрагментаци этих генов топоизомеразой Н ядерного матрикса и нуклеазой Bal 31 в нормальных и активированных к пролиферации обработкой фитогемагглютинином лимфоцитах человека (larovaía et al, 1995, Яровая с соавт., 1995). Лимфоциты донорской крови суспендировали в культуральной среде в присутствии ЭН —тимидина и активировали к пролиферации посредством обработки ФГА. Максимум включения 3Н тимидина наблюдали через 72 часа. При этом большая часть популяции лимфоцитов вступала в митоз. На четвертые сутки инкубации лимфоциты собирали центрифугированием, заплавлялн в агарозные блочки и обрабатывали ВМ —26. Аналошчной обработке подвергали неактивированные лимфоциты донорской крови. Полученные после депротеинизации препараты ДНК анализировали посредством

электрофореза в пульсирующем поле. На рис. 16 представлено элекгрофоретическое распределение фрагментов ДНК, выщепляемых топоизомеразой II из генома нормальных (рис. 16А) и активированных к пролиферации (рис. 16С) лимфоцитов. Можно видеть, что эффективность расщепления ДНК в присутствии ВМ—26 в активированных лимфоцитах существенно выше, чем в неактивированных. После переноса на нейлоновые фильтры полученные препараты ДНК гибридизовали с рибосомной пробой. При гибридизации этой пробы с ДНК активированных к пролиферации лимфоцитов выявляется регулярный паттерн фрагментов с размерами, кратными размерам повтора ДНК рибосомальных генов (рис. 16D), тогда как гибридизация с ДНК нормальных лимфоцитов такой специфичности не выявляет (рис. 16В).

В качестве альтернативного инструмента изучения зависимости топологической организации ДНК от решшкативного статуса клеток мы использовали анализ крупномасштабного распределения участков чувствительности к нуклеазам в геноме нормальных и активированных к пролиферации лимфоцитах. Отсутствие расщепления ДНК по основаниям петель под действием ВМ —26 в покоящихся лимфоцитах может иметь разные объяснения. Причиной этого может быть как фундаментальная перестройка участка прикрепления, так и более низкий уровень содержания топоизомеразы II в покоящихся клетках. Для того, чтобы различить эти две возможности, была изучена специфичность крупномасштабной фрагментации хроматина нуклеазой Bal 31 в покоящихся и делящихся клетках. Результаты проведенного анализа (рис. 17) позволяют заключить, что при стимуляции пролиферации лимфоцитов при одинаковой эффективности нуклеазного гидролиза (рис. 17 А и С)

Рис. 16. Анализ характера крупномасштабной фрагментации ДНК под действием топоизомеразы II ядерного матрикса при обработке нормальных (слева) и активированных к пролиферации (справа) лимфоцитов ВМ — 26.

А и С —результаты электрофоретического разделения в пульсирующем поле выщепляемых под действием ВМ — 26 фрагментов. В и Э—результаты гибридизации выщепляемых фрагментов с рибосомальной пробой.

Над дорожками указана концентрация ВМ-26 (0, 10, 20, 40, 60 мкг/мл, дорожки 1 —5 соответственно). Стрелками указаны положения маркеров.

НОРМАЛЬНЫЕ ЛИМФОЦИТЫ

В

1 2 3 4 5

250 * ♦

150 * -»

АКТИВИРОВАННЫЕ ЛИМФОЦИТЫ

1 2 3 4 5

»«ж С® иж»

Рис. 17. Анализ характера крупномасштабной фрагментации ДНК под действием нуклеазы Bal 31 при обработке нормальных (вверху) и активированных к пролиферации (внизу) пермеабилизированных лимфоцитов.

А и С —результаты электрофоретического разделения в пульсирующем поле фрагментов ДНК, выщепляемых под действием Bal 31. В и D — результаты гибридизации выщепляемых фрагментов с рибосомэлыюй пробой.

1— ДНК контрольных клеток, не инкубированных в буфере для Bal 31,

2— ДНК пермеабилизированных клеток, инкубированных в буфере для Bal 313 часа в отсутствии фермента, 3 — 5 — ДНК пермеабилизированных клеток, обработанных 75 ед. нуклеазы Bal 31 в течении 1,2,3 часов, соответственно, 6— конкатемеры ДНК фага X. Стрелками указаны положения маркеров.

НОРМАЛЬНЫЕ ЛИМФОЦИТЫ

характер фрагментации существенно изменяется. Тогда как в делящихся лимфоцитах обнаруживается характерный набор дискретных полос, соответствующих мономерам и олигомерам петель (рис. 17 В), в нормальных лимфоцитах дискретные полосы не выявляются и расщепление происходит случайно (рис. 17 В). Важно отметить, что в использованных нами условиях деградации хроматина под действием эндогенных нуклеаз практически не происходит.

Полученные результаты позволяют утверждать, что при изменении пролиферативного статуса клеток происходит реорганизация участка прикрепления. Это проявляется в виде появления 1гуклеазиой гиперчувствительности в участке прикрепления петли к скелетным структурам ядра при стимуляции клеток к размножению. Полученные результаты не означают, что участок прикрепления разрушается в покоящихся клетках. Независимые данные свидетельствуют в пользу того, что ДНК продолжает быть организованной в петли в неактивных эритроцитах и сперматозоидах кур. Следовательно, фундаментально изменяется характер ДНК —белковых взаимодействий в участке прикрепления после стимуляции клеток к размножению. Эти перестройки могут быть связаны с активацией участков начала репликации, сосредоточенными на скелетных, структурах ядра.

7. ЯДЕРНЫЙ МАТРИКС КАК СИСТЕМА КАНАЛОВ.

С точки зрения традиционных представлений об организации скелетных структур ядра обнаруженная нами предпочтительная чувствительность к нуклеазам оснований петель и локализация на ядерном матриксе участков топоизомеразного расщепления противоречат друг другу. Так же неясно, как можно соотнести данные о

предпочтительной чувствительности активных генов с их расположением на скелетных структурах ядра. Действительно, последнее предполагает, что при обработке ядер нуклеазами вначале должны отщепляться неактивные последовательности, расположенные в дистальных частях петли, и только потом — активные гены, локализующиеся на скелетных структурах. В действительности, все происходит наоборот. Для объяснения этого противоречия была предложена следующая модель (Капп е1 а1., 1995, Яровая и Разин, 1998). Наше основное предположение состоит в том, что элементы ядерного скелета, взаимодействующие с ДНК, представляют собой не филамешы, а микроканальцы, связанные с ядерными порами. Петли ДНК аранжированы вокруг этих канальцев так же, как в современной архитектуре вокруг башни с лифтом располагаются отдельные модули здания (рис. 18). Внутренний матрикс представляет собой сеть канальцев, обеспечивающих возможность транспорта различных веществ: ферментов, предшественников ДНК и РНК, регуляторных белков, а также РНК — из ядра в цитоплазму. Канальцы могут местами расширяться и ветвиться, образуя каверны, вокруг которых собраны кластеры репликонов и транскрипционные фокусы. Принятая в настоящее время модель строения ядерного матрикса рассматривает его как сеть филаментов, предоставляющую поверхность для организации мультиферментных комплексов. Наша модель объясняет предпочтительную доступность прикрепленных последовательностей для цитоплазматических факторов, эндогенных и экзогенных нуклеаз, транс — регуляторных элементов. В рамках этой модели легко объяснить деградацию генома по участкам прикрепления петель на начальных этапах апоптоза. Мишенью поступающих из цитоплазмы через поры по

Рис. 18. Модель организации интерфазной хромосомы, основанная на предположении о том, что ядерный матрикс представляет собой систему канальцев.

канальцам эндогенных нуклеаз в первую очередь становятся кластеризованные участки прикрепления петель. Точно так же объясняется доступность этих участков для экзогенных нуклеаз. Экстракция концентрированными солевыми растворами, возможно, вызывает коллапс канальцев. Тогда в результате такой обработки хроматин будет доступен только со стороны нуклеоплазмы, а участки прикрепления петель будут частично защищены от действия нуклеаз. Таким образом, предложенная модель с одной стороны не противоречит общепринятым представлениям о структуре ядра, с другой стороны, позволяет логично разрешить накопившиеся противоречия, не выходя за рамки традиционных представлений. Модель позволяет объяснить

группа петель, представляющая собой кластер репликонов

активные гены> фиксированные на внутренней поверхности канальцев

рНП-частицы,

транспортируемые

в цитоплазму

ядерные поры

обращенный паттерн нуклеазной чувствительности в пермеабилизированных клетках и экстрагированных ядрах, В рамках этой модели легко объясняется механизм внутриядерного транспорта. Регуляция сложных процессов, происходящих в ядре, может осуществляться простым выбором "правильного" канальца для транспорта регуляторных элементов.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые предложена принципиально новая процедура, позволяющая создавать физические карты генома эукариот, отражающие способ его организации в хромосомные петли.

2. Построены карты организации в петли кластера рибосомных генов млекопитающих и протяженной области локуса 14В—15В X—хромосомы ОтоБорЫ1а те1аподаз1ег.

3. Впервые показано, что участок прикрепления петли представляет собой не точку, а достаточно протяженную зону, внутри которой осуществляются комплексные взаимодействия ДНК с белками ядерного матрикса.

4. Продемонстрировано, что крупномасштабная фрагментация генома, протекающая на начальных этапах апоптоза, происходит специфически по участкам прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу.

5. Показано, что участки прикрепления петель ДНК являются предпочтительно доступными для нуклеаз в пермеабилизированных клетках.

6. Впервые продемонстрирована зависимость организации участка прикрепления петли ДНК от репликативяого статуса клеток.

7. На основании полученных данных предложена модель трехмерной структурно — функциональной организации эукариотического ядра, разрешающая многие противоречия, накопившиеся в этой области исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Hancock. R., larovaia O.V., Razin S.V. 1993. Excision of loops or domains of chromosomal DNA and separation of domains containing different genes. Proc. of the 13"1 Eur. Workshop on the Cell Nucleus (Balatonaliga, Hungary, June 21-25), p.92.

2. Razin S.V., Hancock R., larovaia O., Westergaard O., Gromova I. and Georgiev G.P. 1993. Structural — functional organization of chromosomal DNA domains. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., v. 58, p. 25 — 35.

3. Яровая O.B., Хенкок P., Разин С.В. 1993. Доменная организация кластера рибосомных генов млекопитающий. Докл. РАН, т. 330, стр. 120 — 122.

4. Яровая О.В., Хенкок Р., Разин С.В. 1994. Анализ характера крупномасштабной фрагментации геномной ДНК Drosophila melanogaster топоизомеразой II in vivo. Докл. РАН, т. 335, стр. 653 — 655.

5. Яровая О.В., Хенкок Р., Разин С.В. 1994. Расщепление геномной ДНК по границам топологических доменов топоизомеразой II ядерного матрикса. Генетика, т. 30, стр. 25-32.

6. larovaia O.V., Lagaikova MA., Razin S.V. 1995. The specificity of human lymphocyte nucleolar long—range fragmentation by endogenous topoisomerase II and exogenous Bal 31 nuclease depends on cell proliferation status. Biochemistry, v. 34, p. 4133-4138.

7. Lagarkova M.A., larovaia O.V., Razin S.V. 1995. Large —scale fragmentation

of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chromosomal DNA loops and their oligomers. J. of Biol. Chem., v. 270, p. 20239 - 20241.

8. Lagarkova M.A., Iarovaia O.V. and Razin S.V. 1995. Excision of chromosomal DNA loops by pretreatment of permeabilised cells with nuclease Bal 31. Mol. Gen. Genet., v. 245, p. 253-256.

9. Razin S.V., Gromova I.I. and Iarovaia O.V. 1995. Specificity and functional significance of DNA interaction -with the nuclear matrix'. New approaches to clarify the old questions. Int Rev Cytol., v. 162B, p. 405-448.

10. Razin S.V., Iarovaia O.V., Gromova I.I., Lagarkova M.A., Hancock R. 1995. Functional architecture of chromosomal DNA domains. J. Cell. Biochem., Suppl. 21B, p. 120.

11. Лагарьхова M.A., Яровая O.B., Гнучев H.B., Разин С.В. 1995. Обработка пермеабилизированных клеток нуклеазой Bal 31 ведет к вырезанию петель ДНК из генома. Докл. РАН, т. 345, стр. 690—693.

12. Яровая О.В., Лагарькова М.А., Разин С.В. 1995. Пространственная организация кластера рибосомных генов человека зависит от репликативного статуса клеток. Докл. РАН, т. 340, стр. 276 — 278.

13. Iarovaia O.V., Hancock R., Lagarkova M.A., Miassod R. and Razin S.V. 1996. Mapping of genomic DNA loop organization in a 500—kilobase region of the Drosophila X chromosome using the topoisomerase II—mediated DNA loop excision protocol. Mol. Cell. Biol., v. 16, p. 302-308.

14. Яровая O.B., Разин C.B. 1996. Сопоставление позиций участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу, MAR—элементов и автономно—реплицирующихся последовательностей в протяженной области X—хромосомы Drosophila melanogaster. Молекулярная биология,

т. 30, стр. 1184-1192.

15. Яровая О.В., Разин C.B. 1998. Новые подходы к изучению структурно — функциональной организации эукариотического генома. Молекулярная биология, т. 32, стр. 47—56. г

Отпечатано АОЗТ "sKAßXA" 18.12.97 Тираж 100 экз. Заказ № 1784