Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация домена альфа-глобиновых генов кур

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация домена альфа-глобиновых генов кур"

На правах рукописи УДК 577,21 163Э4У

ЮДИНКОВА ЕЛЕНА СТАНИСЛАВОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА

2007

003163947

Работа выполнена в лаборатории сгруктурно-ф>нкциональной организации хромосом Института биологии гена РАН

Научный консультант

доктор биотогических наук, профессор, чл -корр РАН Разин С В Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор, чл -корр РАН Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

доктор биологических наук, профессор Лимборская Светлана Андреевна

Ведущая организация

Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН

Защита диссертации состоится 2- &2007 года часов на заседании Диссертационного совета Д 002 37 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан

2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета канд фарм наук

Грабовская Л С

ОБЩ\Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

После успешною завершения программы секвенирования генома человека с юно очевидным что усилиями всего мирового сообщества создан лишь инструмеш, который может быть использован для реализации различных программ, направленных на изучение механизмов функционирования 1енома Общеизвестно, что в эукариотическом геноме наряду с кодирующими последовательностями присутствует большое число некодирующих последовательностей Некоторые из них транскрибируются, некоторые представлены одной копией (как, например шпроны большинства генов), другие повторены шсячи и десягки тысяч раз Для того, чтобы разобраться в механизмах функционирования генома необходимо построить некую разумную модезь и попробовать ее проверить

В течение многих лет такой модезыо была гак называемая доменная гипо1еза ор1анизации генома Согласно этой гипотезе геном состоит из функциональных единиц которые устроены и функционирует сходным образом Эта гипотеза получила убедительные подтверждения при изучении домена бета-глобиновых генов человека и ряда других геномных доменов (точенов бета-глобиновых генов других позвоночных, домена гена лизоцима кур, домена гена аполипопротеина В человека) В то же время в последние годы накопилось достаточно экспериментальных данных, не укладывающихся в «классическую» доменную гипотезу Среди этих экспериментальных данных следует в первую очередь упомянуть обнаружение большого числа перекрывающихся генов и обнаружение богатых генами областей, в которых тканеспецифичные гены и гены «домашнего хозяйства» соседствуют на молекуле ДНК Стало ясно, что функциональная организация генома высших эукариот намного сложнее чем это предполагалось «классической» доменной моделью Соответственно, модель быта модифицирована посредством допущения о том, что существуют функциональные домены разных типов Домены, содержащие перекрывающиеся и близко расположенные неродственные гены было предложено называть доменами открытого типа

В настоящее время существуют основания полагать, что домены открытого типа составляют значительную, а возможно, и ботьшую часть генома Между тем принципы функционирования регуляторных элементов в доменах такого типа, в том числе принципы направленного действия энхансеров на определенный тип промоторов и механизмы инактивации генов, находящихся в доменах с открытой (чувствительной к ДНКазе) хроматиновой конфигурацией, практически не изучены Это означает, что мы мало

представляем себе, как функционирует значительная часть генома высших эукариот Именно это определяет актуальность темы настоящей диссертационной работы, которая посвящена изучению домена альфа-глобиновых генов кур, являющегося типичным примером доменов открытого типа

Цель и задачи исследования

Основной целью работы было изучение структурных особенностей и механизмов, контролирующих транскрипционную активность домена альфа-глобиновых генов кур В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи

1) определение границ домена методом картирования эритроидспецифичных у частков гиперчувствительности к ДНКазе I,

2) клонирование и характеристика 5'-фланкирующей области домена альфа-глобиновых генов кур,

3) изучение пространственной организации домена с использованием олигонуклеотидных матриц,

4) идентификация неэрнтроидспецифичного гена, расположенного в домене альфа-глобиновых генов кур,

5) идентификация и характеристика длинных транскриптов в домене альфа-глобиновых генов кур,

6) характеристика регуляторных элементов, контролирующих работу домена альфа-I лобиновых генов кур

Научная новизна и практическая ценность работы

Настоящая работа вносит существенный вклад в современные представления о доменах открытого типа и методы изучения этих доменов Предложен простой и эффективный метод картирования доменов открытого типа посредством характеристики распределения тканеспецифичных участков гиперчувствителыюсти к ДНКазе I в протяженных геномных областях Раскрыты базовые принципы поэтапной активации тканеспецифичных генов, расположенных в доменах открытого типа, постоянно находящихся в декомпактизованнои (чувствительной к ДНКазе) хроматиновой конфигурации В частности, продемонстрировано, что дня таких доменов характерно наличие негативных регуляторных элементов доменного уровня В случае домена альфа-глобиновых генов кур это - группа инсуляторов, расположенных на расстоянии 11 т п п перед генным кластером и расположенный на

расстоянии 3-4,5 т п н перед генным кластером CpG-островок, который метилируется в неоритроидных клепсах Получены косвенные доказательства того, что активация домена альфа-глобнновых генов к транскрипции в предшественниках эритробластов осуществляв 1ся по механизму процессивного переноса факторов ремоделирования хроматина и гистонацетилаз РНК полимеразой 11, осуществляющей транскрипцию всею домена (как постулируется в гипотезе Траверса [Travers, 1999]) Продемонарировано в частности, что главный позитивный регуляторный элемент домена альфа-глобиновых генов колокапизуется с точкой начала синтеза попнодоменнот транскринга, который синтезируется только в эритроидных клетках Показано, что упомянутый полнодоменныи транскрипт не транспортируется в цитоплазму и участвует в поддержании структуры ядерного матрикса, возможно, адаптируя ее для последующих стадии дифференцировки эритроидных клеток Идентифицирован новый повсеместно экспресснрующиися юн (предположительно ген «домашнего хозяйства»), промотор которого находится в границах СрС-островка, расположенною перед мастером альфа-глобиновых генов Эги и другие результаты рабо!ы (например, характерно шка особенносюи «неклопируемых последовательностей ДНК») являются оригинальными и не имеют мировых аналогов, о чем свидетельствует, в частности, факт публикации их в рецензируемых международных журналах, в том чисче в J of Molecular Biology

Хотя работа имеет четко выраженный фундаментальный характер, полученные резутьтаты имеют и определенное практическое значение В последние годы все чаще стала возникать необходимость создавать клеточные линии и организмы, в геноме которых экспрессируются чужеродные гены (в частности в биотехнологических целях и целях ieimoii терапии) Осуществление этих задач невозможно без достаточно четкого представления о том, как организованы геномные домены, каким образом осуществляется контроль над транскрипцией генов посредством координированной работы регуляторных систем разных уровней Результаты настоящей диссертационной работы существенно расширяют существующие представления о геномных доменах открытого типа и, соответственно, расширяют возможности конструирования векторов, адашированных для обеспечения работы трансгенов в таких доменах

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на след>ющих симпозиумах и конференциях Symposium "Current problems of molecular genetics and cell biology" (Moscow, 2000), conference "Advances in molecular cell biology" (Moscow, 2004), Третий Съезд Российских Биохимиков (Ст Петербург, 2002), Gliwice Scientific Meeting (Gliwice, Poland, 2002), VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005), German-Russian Bilateral Symposium (Titisee Black Forest, Germany, 2006), ESF-1SPS Workshop on Functional Genomics (Kanagawa, Japan, 2006)

Публикации

По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа, в том числе 25 статей в российских и международных журналах и 6 тезисов докладов и материалов конференции

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 181 странице и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы Диссертация содержит 39 рис>нков Библиография включает 229 ссылок

СОДЕРЖА ПНЕ РА БОТЫ.

I. СТРУКТУРА ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

1. Определение границ домена альфа-глобиновых генов методом картирования участков гиперчувствительностн к ДНКазе I.

В случае домена альфа-глобиновых генов кур тест на предпочтительную чувствительность к ДНКазе 1 не может быть использован для определения границ домена. В этой связи мы предложили другой экспериментальный подход - анализ распределения эритроидспецифичных участков гиперчувствительности к ДНКазе I. Участки гиперчувствительности к ДНКазе 1, как правило, маркируют позиции различного рода регуляторных элементов, включая LCR. Поэтому представляется логичным считать, что домен того или иного тканеспецифичного гена (группы генов) примерно соответствует той области, в пределах которой могут быть обнаружены соответствующие тканеспецифичные участки гиперчувствительности к ДНКазе I.

Для картирования позиций участков гиперчувствительности к ДНКазе I мы использовали метод непрямого концевого мечения |Nedospasov et. al., 19801. Для того чтобы различить эритроидспецифичные и конститутивные участки гиперчувствительности к ДНКазе I. мы сравнивали распределение гиперчувствительных участков в ядрах культивируемых эритробластов (линия HD3) в зрелых эритроцитах и культивируемых лимфоцитах (линия НР50).

20 40 во

Ц Ш I Hill И

п а° аА

5'-■ ■ ■-3-

Полученные данные позволили картировать 5 - границу и определить размер домена альфа-глобиновых генов кур. Этот домен имеет размер около 40 т.п.н., начинается примерно 20 т.п.н. перед первым геном домена - п и заканчивается на расстоянии около 10 т.п.н. после гена аА (Рис. 1). Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными позднее при анализе сайт-специфичного ацетилирования гистонов в хроматиновом домене, включающем кластер альфа-глобиновых генов [Anguita et. al., 2001; Flint et. al., 2001].

Рис. 1. Определение границ домена альфа-глобиновых генов кур посредством анализа распределения участков гиперчувствительности к ДНКазе 1. Черными вертикальными стрелками показаны эритроидспецифичные, белыми -конститутивные участки гиперчувствительностн к ДНКазе I.

2. Особенности организации домена альфа-глобиновых генов кур. Идентификации CpG-островка перед кластером альфа-глобиновых генов кур.

К началу наших исследований в базе данных GeneBank имелась информация о части нуклеотидноп последовательности З'-области домена, полученная другими исследовательскими группами. Мы провели клонирование и ссквепировапие остальных регионов домена (за исключением небольшой области между я и aD-генами, которая будет описана в следующем разделе) и. используя эту информацию, проанализировали распределение CpG-динуклеотидов в кластере альфа-глобиновых генов и прилегающей 5'-флапкирующей области. Результаты анализа представлены па Рис.2. Видно, что композиционная организация домена весьма неоднородна (Рис.2Г): «взрослые)» гены аА и aD, подобно адьфа-глобиновым генам человека [Bird et. al., 1987]. находятся GC-богатой области, с некоторыми локальными максимумами (рис.2 Д. Е).

Эмбриональный ген л и прилегающий к нему 5'-фланкирующий регион, напротив, располагается в GC-бедной области. На расстоянии 3,5-5 т.п.н. перед первым геном домена (тг-ген) расположен классический СрО-островок, т.е. GC-богатая последовательность ДНК, характеризующаяся примерно равным соотношением CpG и GpC-динуклеотидов (CpG/GpC = -0.8) (Рис.2 Д-а, Е-а).

, JC06S6 X5S9SS Х0802г

♦♦ j , » ♦ + Т7 g ? Ь V 1

Рис. 2. Анализ нуклеотидной композиции домена альфа-глобиновых генов кур. А -Номера использованных для анализа нуклеотидных последовательностей в базе данных ''СепеВапк". Б - Рестрикционная карта домена альфа-глобиновых генов кур (положение сайтов рестрикции .тля НтсЛП и ВатШ показаны черными и белыми стрелками соответственно). В -Положение глобиновых генов. I" •■■ Анализ нуклеотиднои композиции. Каждый столбец соответствует фрагменту ДНК размером 500 п.н. Д- Анализ относительного содержания СрС/СрС, выделенные штриховой линией

участки с большим разрешением (100 п.н. - один столбец) показаны ниже - Е.

Напомним что для ДНК высших эукариот характерен пониженный уровень CpG-динуклеошдов, являющихся мишенями для меппирования В среднем по геному отношение CpG/GpC составляет ~ 0,2 В границах обнаруженною нами CpG-островка, расположенною перед кластером альфа-глобиновых генов, ранее был картирован участок инициации репликации и место прикрепления петли ДНК к ядерному матриксу [Razin et al, 1986, 1991, Recillas-Targa et al, 1994, Verbovaia et al 1995] Следует отметить, что сами по себе гтобиновые гены не имеют выраженных CpG-островков в промоторных областях, что является обычным для генов с тканеспецифичнои экспрессией

3 Характеристика «иеклонирусмои» последовательности ДНК, локализованной в интергенном спенсере между я и (iD глобнновыми генами курицы

Последовательности альфа-глобиновых генов цыпленка и межгенных спейсеров были клонированы Энгелем и Додсоном [Engel et al , 1980] При последующей pa6oie с полученными этими авторами рекомбинатными фагами, выяснилось, что инсерция одною ni них (XCaG5) содержит нестабильный участок, который быстро делетирует при размножении фага в клегках Е coli Попытки получить плазмидные клоны, содержащие данный фрагмент ДНК, также закончились неудачей Было установлено, что делетируюшии из различных рекомбинантных клонов участок включает часть кодирующих последовательностей я- и aD-генов и весь ннтергеиный спейсер, расположенный между этими генами В последующие годы была определена нуклеотидная последовательность практически всего домена альфа-глобиновых генов за исключением упомянутого выше «неклоннруемого» фрагмента Анализ н>клеотидных последовательностей домена, приведенный в предыдущем разделе, позволил заключить, что «неклонируемый» фрагмент ДНК расположен на стыке GC-бедной и GC-6oiaToFi изохор (Рис 2А Г), в силу чею попытка его охарактеризовать представлялась особенно актуальной

Нам удалось получить рекомбинантный клон (Рис 3), инсерция которого охватывает весь спейсерный участок между л- и aD-глобиновыми генами курицы Представляющий интерес фрагмент ДНК размером 1587 пн был амплифицирован из геномной ДНК кур с помощью техники PCR Для размножения рекомбинантной ДНК был использован специальный штамм Е coll (SURE) не имеющий ферментов рекомбинации Следует отмегшь, что при размножении даже в этом штамме, специально созданном для клонирования последовательностей ДНК, предрасположенных к делетированию и перестройкам, инсерция со временем утрачивалась

Мы определили нуклеотидную последовательность инсерции полученного рекомбинантного клона (AF250873) и сравнили с нуклеотидной последовательностью части инсерции делециопного варианта рекомбинантного фага A.CaG5del [Farache ct. al., 1990]. Сравнительный анализ этих последовательностей позволил установить точные границы делегированного фрагмента и продемонстрировал, что делегирующий из рекомбинантных фагов фрагмент ДНК размером 3,1 т.п.и. окружен несовершенными прямыми повторами длиной 76 п.н.. включающими три блока полной гомологии Границы делетирующего участка находились точно перед 14 н.н. блоками полностью гомологичных последовательностей. Окруженный прямыми повторами фрагмент ДНК длиной 3,1 т.п.н. имеет определенные черты сходства с бактериальными траиспозонами [Berg, 1985; ReznikolTet. al.. 1999]. Мы полагаем, что именно по этой причине данный фрагмент часто утрачивается при амплификации рекомбинантной ДНК в прокариотических системах. Интересной особенностью делетирующего фрагмента ДНК (спейсерной области между л- и aD- генами) является частая встречаемость динуклеотидных пар TG/CA. Геометрия этих динуклеотидных пар такова, что при наличии определенных напряжений в молекуле ДНК (которые могут возникать, в частности, в ходе репликации) они «скручиваются», в силу чего возникают локальные песпаренпые районы.

н?н | н

Делетированный участок

ь rrrrm-ei 2.5 т.п.н.

В

J00856 Х59989

AF250873

Л

cacceccagaagttcatgctgcgtg ggaceagttcctgtceagcatttcc tctcrttctgactg&gaaatacagat

аа

с*сссссимотаая«лосстг CmCAAOTÍPCCTSrereXGTQTCT остдааякюстогаьжлзшю&т

н

CÄiaxx^agaÄgtt^tgctgc^tggOACAAarrrcCT^TrcTi^XT^rcr «яшотоажшйАСТюиатА

Рис. 3. Позиция «неклонируемого» фрагмента ДНК в домене альфа-глобиновых генов кур и характеристика несовершенных повторов, фланкирующих данный фрагмент. А -Рестрикшая карга фрагмента домена альфа-глобиновых генов кур. Б - Позиция делетирующего фрагмента ДНК. В ~ Позиции глобиновых генов. Г - Регистрационные номера депонированных в базе данных «ОепеВапк» последовательностей ДНК, которые использовались для анализа. Последовательность АР250873 была определена в настоящей работе. Д -несовершенные повторы, локализованные на левой (строчные буквы) и правой (прописные буквы) границах делетирующего фрагмента ДНК. Жирным шрифтом показаны нуклеотиды, идентичные в обеих последовательностях. Е Участок сочленения несовершенных повторяющихся элементов, возникающий после делеции нестабильного фрагмента ДНК из инсерции рекомбинантного фага 1Са05. Сохранившиеся части левого и правого повторяющихся элементов показаны строчными и прописными буквами соответственно.

Этот эффект может быть особенно сильным в том случае, когда позиции TG/CA динуклеотидных пар ротационно коррелированны [McNamara et. al., 1990; Jurca ct. al., 1998],

то есть когда эти дииуклеотидные пары находятся на расстояниях, кратных 1/2 нормального витка двойной спирали (около 5,25 пар основании)

Анализ нуклеоищнои последовательное!!! спенсера между л- и аЭ-генами показал, чю в данной области прослеживается определенная ротационная корреляция позиций ТС/СА дннуклеотидных пар (Рис 4) Это может быть дополнительной причиной нестабильности данной последовательности ДНК Следует также упомянуть, что ранее область «неклонируемой» последовательности была определена как легкоплавкая [Могсаи й а1, 1982], хотя она не относшся к АТ-богатым последовательностям ни в целом (55% в С), ни локально

Рис 4

Аутокорреляцнонный анализ распрелеления ТО дннуклеотидных пар в пределах 1 6 т п н «нсклонируемого» фрагмента ДНК (АР250873) Ротационно-коррелированные позиции показаны стрелками

Таким образом, мы обнаружили, по крайней мере, две особенности исследуемой последовательности, которые могут быть причиной ее «нестабильности» И если первая -сходство с бактериальным транспозоном — может являться причиной нестабильности лишь при размножении в бактериях, то вторая - наличие «скручивающихся» элементов - может проявлять себя как в прокариотических, так и в эукарнотических клетках То есть данная последовательность может быть нестабильной и в эукариотической хромосоме Для проверки этого предположения мы проанализировали вопрос о лом, является ли п - аБ иитергениыи спейсер полиморфным регионом в различных клеточных линиях и тканях цыпленка Мы провели блот-гибридизацига четырех образцов ДНК (из печени, крови, клеточных линий [ЮЗ и НР50), с радиоактивной пробой, представляющей собой левый конец 3 т п и «неклонируемого» фрагмента Во всех четырех случаях были обнаружены дополнительные полосы меньшего размера, что указывает на нестабильность исследуемой последовательности в эукарнотических клетках (Рис 5) Уровень полиморфизма исследуемой области в эукарнотических клетках оказался значительно ниже, чем можно было ожидать, основываясь на результатах, полученных в прокариотических клетках Очевидно, эукариотические клетки имеют некие защитные системы для несыбильлых последова1елыгостей, как, например, взаимодействие с гистоновыми и негистоповыми белками Свидетельством в пользу такого

Количество ТО пар %

5 10 17 яг

Расстояние между ТО парами пн

предположения может служить тот факт, что исследуемый фрагмент проявил in vitro свойства слабого MAR-элемента.

А

проба "а* проба "б"

■ ■

7 ®i У \7 U V

1 1 т.п.н.

0 5 10

—т— -ш-ив—

я «о »А

проба "а" проба "а"

проба "б'

единиц фермента на 1 мкг ДНК 5 25 25

® ai ьс го

йт.п.н*-4ТП.Н:*-Зт.п.м*. 2Т.П.НЛ-

1Т.П Н->-

» т Щ

# чт ш

* * т J и ** « ф 1»

* * J ш

■л %

1 т т

Рис. 5. Полиморфизм геномной ДНК, наблюдающийся в л-аА интергенном спейсере. А - Карта домена альфа-глобиновых генов кур, черные квадраты над рестрикционной картой показывают позиции проб для гибридизации. Позиции участков узнавания для эндонуклеаз рестрикции ЕсоЮ и ВатН1 показаны соответственно черными и белыми стрелками. Б - Результаты гибридизационного анализа.

Кроме того, он имеет в своем составе пять консенсусных последовательностей (ООТОТО) для связывания белка ядерного матрикса АЯВР [Ви11гте51ег е1. а1., 1995]. Следует отметить, что сама консенсусная последовательность содержит две «скручивающихся» СГ/СА динуклеотидных пары. Таким образом, можно предположить, что взаимодействие с ядерным матриксом может защищать такие нестабильные последовательности ДНК.

И. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

Достижения в секвенировании различных геномов сделали доступным огромное количество нуклеотидных последовательностей, что позволило нам усовершенствовать традиционную технику картирования петель ДНК/хроматина, основанную на гибридизации фрагментов клонированной ДНК с пробами ДНК. прилежащей к ядерному матриксу, (полученными в результате обработки изолированных ядер неионным детергентом, удаления гистонов 2М ЫаС1 и обработки ДНКазой I). Пробу прилежащей к ядерному матриксу ДНК мы гибридизовали с олигонуклеотидной матрицей, состоящей из упорядоченно организованных фрагментов ДНК, представляющих протяженную область геномной ДНК. При изготовлении олигонуклеотидной матрицы олигонуклеотиды выбирали таким образом, чтобы они не содержали повторяющихся последовательностей, решая тем самым проблему интерпретации результатов, присущую традиционному методу. С использованием описанного выше методического подхода мы картировали участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу в 100 т.п.м. фрагменте куриной хромосомы 16. включающем кластер альфа-глобиновых генов и

фланкирующие последовательности ДНК. Олигонуклеотидная матрица представляла собой нейлоновый фильтр с нанесенными на него 60-ти членными олигонуклеотидами, покрывающими интересующую нас область с ш'агом в 2 т.п.н.

Рис. 6. Результаты гибридизации олигонуклеотидиой матрицы с тотальной ДНК и ДНК, прилежащей к ядерному матриксу (сверху). Сравнительная оценка интенсивности полученных сигналов (снизу)

В параллельных экспериментах с олигонуклеотидиой матрицей гибридизовали прилежащую к ядерному матриксу и тотальную ДИК. При гибридизации с тотальной ДНК гибридизация происходит почти равномерно со всеми олигонуклеотидами. Результаты гибридизации той же олигонуклеотидиой матрицы с препаратом прилежащей к ядерному матриксу ДНК из культивируемых куриных эритробластов существенно отличаются от результатов гибридизации с тотальной ДНК (Рис.6). Предпочтительная гибридизация наблюдалась с олигонуклеотидами, расположенными в позициях 34 и 78 т.п.н., где, по-видимому. и находятся участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Полученные результаты подтверждают установленный ранее факт, что домен альфа-глобиновых генов организован в одну петлю хроматина [Farache et. al., 1990; Razin et. al., 1991].

Данные, полученные нами в предыдущем эксперименте, были подтверждены методом FISH с препаратами ядерных гало. После экстракции из ядер или метафазных хромосом гистонов и ряда негистоновых белков хроматина прикрепленные к ядерному/хромосомному остову петли ДНК образуют своеобразную корону (ядерное/хромосомное гало), которую легко видеть после окраски Д1IK флуоресцентным красителем (DAP1). Флуоресцентная in situ гибридизация индивидуальных (в том числе и достаточно протяженных фрагментов) ДИК позволяет увидеть индивидуальные петли ДИК и выяснить вопрос о том, локализуются ли изучаемые последовательности ДНК на ядерном матриксе или в петлях ДНК [Iarovaia et. al., 2004; Bickmore et. al., 1996]. Ядерные гало были приготовлены посредством солевой экстракции ядер, иммобилизованных на стекле. На препаратах можно видеть корону (гало) петель ДНК, прикрепленных к более ярко окрашенному ядерному матриксу (Рис.7А).

Рис. 7. Результаты флуоресцентной гибридизации in situ препаратов ядерных гало линии клеток HD3. А - окрашивание по DAP1, Iii - результаты гибридизации с фрагментами ДНК из области 76 - 80 т.п.н., В - результаты гибридизации с фрагментами ДНК из области 4-8 т.п.н., 1" обобщение результатов, приведенных на рисунках А, Б и В, путем наложения.

В качестве зондов для гибридизации in situ использовали фрагменты ДНК, картирующиеся в области петель - 4-8 т.п.н. (Рис.7В) и участка прикрепления к ядерному матриксу - 76-80 т.п.н. (Рис.7Б). Предпочтительная гибридизация в границах ядерного матрикса пробы, которая происходит из участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу, определенного с использованием техники олигонуклеотидных матриц, подтверждает корректность предложенного нами метода картирования.

III. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕЭРИТРОИДСПЕЦИФИЧНОГО ГЕНА,

РАСПОЛОЖЕННОГО В ДОМЕНЕ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР, АНАЛОГА

ГЕНА «-14» ЧЕЛОВЕКА.

Анализ нуклеотидной последовательности 5'-фланкирующей области домена альфа-глобиновых генов кур позволил выявить ряд участков высокой гомологии с экзонами гена «14», найденного ранее в домене альфа-глобиновых генов человека [Vias et. al., 1995] (Рис. 8). Чтобы получить ответ на вопрос, есть ли аналогичный ген в домене альфа-глобиновых генов кур, мы, прежде всего, проанализировали вопрос о том, транскрибируется ли 5'-концевая область домена альфа-глобиновых генов кур в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов. С этой целью был приготовлен ряд рибонуклеотидных проб, способных узнавать РНК, транскрибирующуюся в направлении, противоположном направлению синтеза глобиновых генов. Эти пробы гибридизовали с иммобилизованными на фильтрах препаратами ядерных РНК из куриных эритробластов.

Результаты, представленные на рисунке 9. показывают, что все фрагменты домена, начиная от первой области гомологии с геном «-14» и далее вплоть до конца исследуемой области (см. карту на Рнс.9), активно транскрибируются в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов.

гльидогкхгкттт »МП к .«и

1111 и i! п 1111 и miiuiimiuii н iimi п imiimtl

шееттооегде чл

Рис. 8. Три области гомологии между геном «-14» человека и доменом альфа-глобиновых генов кур.

А | В., | И, |№|ц |1« нч в,, нх •И 1 Nil

-5 0 5 10 IS 20

i« L 1 II I

i D Д А г, и а

В i Н0 a 1 H, H,)

• pi «* m *

# m w

* ** «* 1

m «i Ш

i 1

i 1 4 -¡i

Рис. 9. Анализ уровня

транскрипции 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур в направлении, противоположном направлению синтеза

глобиновых РНК. А-карта домена. В - результаты гибридизации.

Для того чтобы охарактеризовать клеточное распределение транскриптов, синтезирующихся в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов, было проведено два типа экспериментов. Была проведена «ЫоПЬегп» гибридизация препаратов полиА -РНК из цитоплазмы с олигонуклеотидной пробой, узнающей достаточно протяженную (80 п.н.) область гомологии с экзопом IV гена «-14». При этом в параллельных экспериментах сравнивали препараты РНК из эритроидных и лимфоидных культивируемых куриных клеток (Рис.10).

Рис.10.

Гибридизация пробы из области гомологии с экзоном IV гена «-14»(В-1 на Рис. 14) с поли(А)+-РНК из эритроидных (1103) клеток (Э) и лимфоидных (НР50) клеток (Л).

ilJHBHBHHBHBKLl

ШШшИгШИшкЛ Рис. 11. Результаты

гибридизации in

situ куриных

эритробластов

(линия HD3) с

пробой,

гомологичной

первому экзону

гена «-14»

человека.

Л-Окраска DAP1.

Б - Гибридизация

in situ.

Полученные данные показали, что в обоих типах клеток присутствуют два класса поли(А)+ РНК (1.7 и 2.5 т.н.). гомологичных мРНК гена «-14» человека. Этот результат позволяет заключить, что в 5'-фланкирующей области домена альфа-глобиновых генов кур расположен консервативный ген, гомологичный гену «-14» человека [Ууаэ еГ а!., 1995]. Два класса мРПК

этого гена, по-видимому, возникают в результате альтернативного сплайсинга, подобно тому, как эго имеет место в случае транскрипции гена «-14» Следует отметить, что экзон I этого гена каршруется в области участка начала репликации и CpG-островка

Дополнительно была выполнена гибридизация in situ с пробой, гомологичной экзону 1 гена «-14» Результаты, представленные на рисунке 11, четко показывают наличие соответствующего транскрипта в цитоплазме Таким образом, было показано, что макроорганизация домена альфа-глобиновых генов позвоночных достаточно консервативна Идентифицированный ген был назван ggPRX

IV ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЯЖЕННЫХ 1РАНСКРИШОВ В ДОМЕНЕ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР, СИНТЕЗИРУЮЩИХСЯ В НАПРАВЛЕНИИ ТРАНСКРИПЦИИ ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ

1 Определение протяженности и непрерывности транскрипционной единицы

О существовании протяженного транскрипта, начинающегося в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов и включающего собственно кластер глобиновых генов сообщалось давно - первая публикация появилась в 1973 году [Imaizumi et al, 1973]

Однако, не были известны ни точные границы, ни функции этой транскрипционной единицы Единственное предположение, которое дискутировалось в течение ряда лет, заключалась в том, что этот транскрипт может быть предшественником полицистронной мРНК, но никаких экспериментальных данных, подтверждающих эту точку зрения, получено не было Напротив, было продемонстрировано, что каждый из глобиновых генов имеет свой собственный промотор Интерес к проблеме доменных транскриптов возрос после обнаружения так называемых «межгенных» транскриптов в домене бета-глобиновых генов, функции которых связывали с поддержанием активного статуса домена Мы предположили, что и в домене альфа-глобиновых генов кур протяженные транскрипты доменного уровня могут играть аналогичную роль

Чтобы картировать всю область, транскрибирующуюся в направлении транскрипции глобиновых генов в эритроидных клетках, мы провели гибридизацию ядерной РНК из куриных эритробластов с однонитевыми РНК-пробами (у знающими транскрипт глобинового направления), взятыми из разных областей домена Результаты гибридизации представлены на рис 12 Сильный сигнал в высокомолекулярной области (от 20 т н ) наблюдался только в ядерной РНК и отсутствовал в цитоплазматической РНК Значительно более слабые полосы с

меньшим молекулярным весом видны как в ядерной, так и в цитоплазматической РНК, и, скорее всего, представляют собой результат неспецифической сорбции пробы на рибосомные РНК. В цитоплазматической РНК полосы, соответствующие мРНК гена аА (0.6 т.п.н.) и относительно стабильному продукту неполного процессинга этой мРНК (0.7 т.п.н.) четко видны при гибридизации с пробой В18 (аА-ген). Присутствие глобиновой мРНК является результатом спонтанной дифференцировки 1-5% клеток HD3 в неиндуцированных культурах.

Рис. 12. Нозерн-блот анализ транскрибирующейся области домена а-глобиновых генов а клетках 111)3 Вверху - карта домена. Результаты гибридизации показаны в нижней части рисунка. Каждая проба гибридизовалась с препаратами

цитоплазматической (Ц) и ядерной (Я) РНК. Гель, окрашенный бромистым этидием, использованный для переноса РНК на нейлоновый фильтр, показан слева от двух групп радиоавтографов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в клетках HD3 весь домен альфа-глобиновых генов (включая 5'-концевую область), транскрибируется, давая начало протяженной ядерной РНК. В то же время оставалось неясным, является ли эта транскрипционная единица единой и непрерывной, или это несколько траскриптов, начинающихся в разных точках и перекрывающих всю исследуемую область.

Для решения этого вопроса мы воспользовались методом обратной транскрипции со специфических праймеров с последующей амплификацией посредством полимеразной цепной реакции тест-фрагментов, расположенных на большом расстоянии от праймеров. Необходимость использования специфических праймеров для обратной транскрипции определялась тем обстоятельством, что изучаемая область генома транскрибируется и в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов.

Было подобрано несколько наборов праймеров (по 3 праймера в каждом), чтобы инициировать синтез кДНК с различных участков домена (117, Н12/л:-ген, В16/ай-ген, В18/ад-ген, В20. В21). Эти праймеры были использованы для обратной транскрипции на ядерной РНК. Для последующей амплификации тест-фрагментов на матрице кДНК были использованы два набора праймеров для PCR, подобранных с целью выявить возможное присутствие в последовательности кДНК фрагментов В-1 и ИЗ.

Присутствие обоих фрагментов в одном ЯТ-продукте свидетельствует о том, что транскрипт, с которого он был синтезирован, является непрерывным.

Inf* Hj^M"? jVlft» i

Гло&ютокх штраилс»

ццяяццяя.

Рис. 13. RT-PCR картирование протяженной транскрипционной единицы домена а-глобиновых генов кур. В верхней части рисунка показана карта домена с позициями праймеров, использованных для PCR-амплификации периферической части продуктов RT. Внизу показаны результаты RT-PCR и их интерпретация. Слева представлены блоты с продуктами PCR-амплификации с двумя группами праймеров В1 и НЗ. В правой части рисунка находится схематическое изображение позиций использованных праймеров для обратной транскрипции и интерпретация результатов PCR. Наличие или отсутствие обратной транскриптазы в реакциях обозначено (+) и (-) соответственно.

Результаты анализа показывают, что к ДНК, синтез которых инициирован на участках с Н7 по В18, содержат последовательности фрагментов В-1 и НЗ (Рис. 13), следовательно, изучаемая нами транскрипционная единица является непрерывной. Конец полнодоменной транскрипционной единицы располагается на границе фрагментов В20 и В21, т.е. на расстоянии около 1,5 т.п.и. к 3'-концу от аА-гена.

£gPRX

10000

20G00

40QQ0

Рис. 14. Картирование 5'-концевого участка полноразмерного транскрипта кластера а-глобиновых генов. В верхней части - схема домена. Глобиновые гены показаны черными прямоугольниками. Тест-фрагменты 1-VI показаны белыми верти кал ы i ы м и прямоу гольниками. Результаты PCR-анализа - под картой. На дорожки «Б», «В» наносились продукты амплификации на кДНК, разведенной в 5 и 25 раз по сравнению с количеством кДНК, использованной для PCR-реакции, продукты которой наносились на дорожки «А». На дорожки, обозначенные «ДНК» наносились продукты PCR-реакции с теми же парами праймеров на геномной ДНК.

Для картирования начала полнодоменного транскрипта также был использован метод ЯТ-РСЯ. Результаты, представленные на рисунке 14, показывают, что транскрипционная единица доменного уровня, охватывающая протяженную 5'-концевую область домена альфа-

глобиновых генов кур, начинается между тест-фрагментами II и 111. т. е. на расстоянии 21-24 т.п.н. перед эмбриональным глобиновым геном л. Интересно, что именно в этой области находится LCR-подобнып регуляторный элемент домена альфа-глобиновых генов кур и заканчивается эритроидспецифичный домен предпочтительного ацетилирования гистонов, который включает всю картированную транскрибирующуюся область и собственно кластер глобиновых генов. С учетом данных, полученных в предыдущем эксперименте, длина полнодоменной транскрипционной единицы составляет 33 т.п.н.

2. Протяженные траискринты присутствуют в эритробластах, но не в фибробластах.

Следующий эксперимент позволил продемонстрировать, что протяженные транскрипты присутствуют в эритробластах, но не в фибробластах. Для этого в качестве матрицы для обратной транскрипции п последующей PCR-амплифнкации тест-фрагментов IV, VI и VII использовали РНК из первичных куриных фибробластов. Полученные результаты представлены на рисунке 15.

--—I

30000 40000

ЭРИТРОБЛАСТЫ

я а" о"

50000

ФИБРОБЛАСТЫ

Рис. 15. Сравнительный анализ транскрипционного статуса 5'-концевой области домена а-глобиновых генов в эритобластах и фибробластах. «-ЯТ» обозначает контрольные препараты, в которых РСЯ-амплификация проводилась без предварительной обратной транскрипции. «Анти IV» - для амплификации использована кДНК синтезированная с транскрипта, противоположного глобиновому. Белыми стрелками показаны позиции ожидаемых поодуктов амплисЬикаиии.

Можно видеть, что в фибробластах не выявлены транскрипты глобшювого направления. Как и следовало ожидать, ген ggPRX одинаково интенсивно транскрибируется в эритроидных и неэритроидных клетках (дорожки «анти IV» на Рис. 15). Таким образом, транскрипция протяженной области домена альфа-глобиновых генов кур в направлении синтеза глобиновых генов характерна только для эритроидных клеток.

3. Полнодоменные грапскрнптм являются составной частью ядерного матрикса.

Важность синтеза полнодоменного транскрипта для активации домена альфа-глобиновых генов не исключает того, что этот транскрипт может выполнять и другие функции. Одна из возможностей заключается в том, что полнодоменный транскрипт, равно как и ряд других ядерных РНК, играет определенную роль в пространственной организации клеточного ядра, участвуя в образовании ядерного матрикса. [Razin et. al., 1995; Cremer et. al., 2000]. Для проверки этого предположения мы провели гибридизацию in situ РНК проб к фрагментам Н7 и Н12 (л- ген) с клетками HD3 (линия трансформированных эритроидных клеток курицы) и ядерными матриксами, изолированными из этих клеток. Фрагменты Н7 и Н12 представляют собой некодирующую и кодирующую последовательности ДНК соответственно. Результаты гибридизации показаны на рисунке 16.

Рис. 16. Визуализация т уЦи глобиновых транскриптовв интактных клетках и препаратах ядерных матриксов (линия НОЗ). Слева показаны результаты гибридизации т .чПи РНК-пробы к фрагменту Н7 (некодирующая последовательность) и к Н12 (кодирующая последовательность) - справа.

Рис. 17. Результаты RT-PCR анализа РНК из ядерных матриксов культивируемых эритробластов (линия HD3). Сверху показаны позиции тестируемых фрагментов. Внизу - результаты PCR анализа.

U-H.1 650 л н |1?9»

0" " •---. Н4 ..-'") 931

- " " * н12

1 в, ( но !|„з

Нз Л

PCR Пробы НЗ Н4

Н4 НЗ PCR праймеры

- - обратная

— + — +

■=? ■ _ 740 п.н.

т -650 п.н.

При гибридизации интактных клеток с пробой Н7 окрашиваются только ядра, в то время как проба III2 окрашивает как ядра, так и цитоплазму в некоторых клетках. Это отражает факт абортивной экспрессии тг- гена, по крайней мере, на уровне мРНК. При гибридизации с ядерными матриксами обе пробы дают достаточно сильный сигнал в границах всего ядерного матрикса, исключая область остаточных ядрышек. Этот результат ясно свидетельствует о том. что оба транскрипта представлены в РНК ядерного матрикса.

Для подтверждения этого вывода мы выполнили серию экспериментов по обратной транскрипции РНК, выделенной из ядерных мафиксов, с последующей PCR-амплификацией тест-фрагменюв Так как получение недет радированного полнодоменного транскриша из ядерных матриксов представлялось маловероятным, мы не предпринимали попыток синтезировать достаточно протяженную кДНК Вместо этого проверили, перекрывают ли предсшвленные в ядерном MaipiiKce последовательное!и полнодоменного транскриша область, свободную от экзонов глобиновых генов (Н7 - фрагмент) На рисунке 17 показаны позиции праймеров для синтеза кДНК (на границе Н7и НЮ фрагментов) и положение праимеров для амплификации тес [-фрагментов (НЗ и Н4) Можно видеть, что обе пары праймеров дают положительный сигнал при PCR-амплификации кДНК, синтез которой инициирован на границе фрагментов Н7н НЮ Таким образом, присутствие полнодоменного транскрипта в ядерном матрнксе эритроидных куриных клеток можно считать доказанным

V ХАРАКТЕРИСТИКА НЕГАТИВНЫХ РЕГУЛЯ ГОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ РАБОТУ ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИПОВЫХ ГЕНОВ КУР

Домен альфа-глобнновых генов находится в открытой хроматиновой конфигурации во всех типах клеток, и представляется весьма маловероятным что транскрипционным статус домена альфа-глобиновых тенов регулируется посредством сворачивания-разворачивания 30 нч хроматиновой фибриллы Тем не менее, альфа-глобиновые гены экспрессируются только в эритроидных клетках Определенные изменения в характере модификаций гнстонов, связанные с синтезом доменных транскриптов, могут влиять па статус домена альфа-глобнновых генов в дифференцирующихся эритроидных клетках Тем ire менее, и в клетках, дифференцированных по другим путям промоторы альфа-глобиновых генов, скорее всего, являются доступными для факторов стимулирующих сборку транскрипционных комплексов Это делает актуальным поиски негативных регуляторных элементов, подавляющих экспрессию альфа-глобиновых генов в неэритроидных клетках

Известно, что позиции различных регуляторных последовательностей в ДНК могут быть предсказаны на основании анализа распределения участков гиперчувствителыюсти к ДНКазе I Результаты проведенного нами анализа показали, что изучаемая область содержит значительное число т иперчувствительпых к ДНКазе 1 участков (Рис 18 19)

.«ш Рис. 18. Идентификация участков

* «ШШ «ДНВШМ| гиперчувствительности к ДНКазе I

1 посредством непрямого мечения концов

рестриктлых фрагментов. ДНК из ядер

* 9 9 ♦ у#| кул ьти ви ру емо й л ин и и л и м фои дн ы х к лето к

(НР50), нормальных эритроцитов и * культивируемой линии эритроидных клеток

(НОЗ) курицы, обработанных возрастающими количествами ДНКазы I, дополнительно переваривали рестриктазами ВатН1 - >г— ' 4 (гибридизация с пробами 1-3), либо Крп1

т •"•"'•¡|||М (гибридизация с пробой 4), разделяли в

„ « • *** ___ а га розном геле, переносили на фильтр и

# , гибридизовали с пробами 1-4. как указано над

? I ... | — * фотографиями радиоавтографов.

"1 *

КрпI КрпI

х:

и ш!

! 1 и! г 1 V

1 1 ■ 1

Рис. 19. Картирование сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I в 5'-фланкирующей области домена. А - Карга 5'-фланкируюшей области домена с указанием позиций проб, использованных в гибридизационных экспериментах. Над картой показаны полноразмерные рестриктные фрагменты, идентифицируемые каждой из проб. Б - Распределение участков, гиперчувствительных к ДНКазе I в 5'-фланкирующей области домена, выявленных в культивируемой линии лимфоидных клеток (НР50), нормальных эритроцитах и культивируемой линии эритроидных клеток (НОЗ) курицы. Пунктиром выделены два кластера участков гиперчувствительности к ДНКазе 1

Все идентифицированные участки, за одним исключением, сконцентрированы в пределах двух кластеров, расположенных от -14,5 до -11 т.п.н. и от -4,5 до -3 т.п.н. перед первым геном домена (эмбриональным геном я). Обе группы содержали как эритроид-специфичные, так и конститутивные участки гиперчувствительности к ДНКазе I. Мы исследовали функциональную активность последовательностей ДНК, колокализующихся с двумя блоками участков гиперчувствительности к ДНКазе I (Рис.19).

1. Анализ функциональной активности фрагментов из кластера участков гниерчувствптелыгости к ДНКазе 1, локализованного на расстоянии 11-14,5 т.п.и. перед л-г сном.

Для анализа Энхансерной/сайленсерной активности последовательностей ДНК, локализованных в пределах идентифицированных нами кластеров участков гиперчувствительности к ДНКазе. 1 был сконструирован вектор, содержащий репортерный ген бактериальной хлорамфениколацетилгрансферазы (сокращенно «СА Г»), поставленный под кон троль промотора одного из альфа-глобиновых генов aD. Полученный вектор а°рСАТЗ использовали во всех последующих опытах.

Полноразмерную инсерцию (6,6 т.п.н. BamHl - BamHI - фрагмент), содержащую кластер участков гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенный на расстоянии 11-14.5 т.п.н. перед я-геном, и ее субфрагменты клонировали в BamHl сайт вектора а°рСАТЗ, т.е. после репортерного гена. Затем проводили трансфекцию культивируемых куриных эритробластов (линия HD3) эквимолярными количествами различных конструкций. Через 72 часа определяли активность хлорамфениколацетилгрансферазы в клеточных экстрактах. Полученные результаты представлены на рисунке 20.

Ham HI !_

_^xHLLJ_1_J_i—

\Kpn\ \Крп\ -10

pCATJ b»»ic,'enh»nc« «i»Top

п э

_L—L-

Д

Коисгрушив

CAT-tmuttocrv %

оОрСАТЗ е«тШ Sum

аВрСЛТЗ iumlO - ватЮ 6 6 т.н. оЛртшч» 74

айрСКП ВцШ - SemViJ 2.1 rn « пр.но«

аОрСАТЗ till - Aomlll t-oj. обрсткы* TO

oDpCA-nijnt-Jo»JA I JTII« пр.»»* W

оОрСАТЗ - ia»jA l.S гя к. oOfti-niM* il

uCvCAT3iJ.)A0.; run "i

9 aßpCAT}Ji«>AO?T.n.nBj>«wc* »

аОрСАТЗ t>M« 100

аОрСАТЭ - J V-K1 жиже p I JO

Рис. 20. Анализ функциональной активности последовательностей ДНК из 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур. А Карта 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур. Б -Позиции рестриктных сайтов, использованных для получения субклонов. Жирными стрелками показано положение эритроидспецифичных (Э) и постоянного (II) участков гиперчувствительности к ДНКазе!. В Схема вектора аОрСАТЗ. Г - Схема ориентации исследуемых субфрагментов ДИК в векторе аОрСАТЗ, слева направо - ориентация в направлении транскрипции глобиновых генов. Д-Активность CAT - гена в исследуемых конструкциях.

Можно видеть, что ни один из тестируемых фрагментов не активирует экспрессию репортерного гена. Более того, при использовании полноразмерного фрагмента и ряда субфрагментов из его правой части (если ориентировать фрагмент в направлении транскрипции глобиновых генов) наблюдается существенное снижение уровня хлорамфениколацетилтрансферазы в клеточных экстрактах. Наибольшее подавление

активности репортерного гена вызывает фрагмент 0,9 т.п.н.. локализованный на правом конце исследуемой области (Рис. 20).

В другой серии опытов различные фрагменты исследуемой области клонировали между промотором и репортерным геном. В этом случае вышеупомянутый фрагмент ДНК 0.9 т.п.н. полностью подавлял экспрессию САТ-гена. Таким образом, этот фрагмент обладает активностью сайленсера. В контрольном эксперименте было продемонстрировано, что в клетках отсутствует мРНК хлорамфениколацетилтрансферазы. Таким образом, отсутствие в цитоплазме функционально активной хлорамфениколацетилтрансферазы не может быть связано с подавлением трансляции посредством удлинения 5'-концевой некодирующей области мРНК.

Для получения более полной информации о роли изучаемой геномной области в структурно-функциональной организации домена были проведены эксперименты по связыванию in vitro фрагментов клонированной ДНК с изолированными ядерными матриксами.

А п »gm eg/it Kj,„t

«»»in ^ А

T 3

0.67 И 0-6'JI 2.75

с мi m

'III*

(1.69 0.67

Д

с MI m

BcK tP|> Ф-

MAR ф *

Рис. 21. Картирование МАЯ - элементов в 5'-вш,,т концевой области домена альфа- гл оби новых генов кур. А - Карта инсерции клона ЯРаОО. Б - Схема продуктов расщепления инсерции рестриктазой II. Блоки, представляющие удерживаемые ядерным матриксом фрагменты ДНК, показаны штриховкой. На схеме В показаны фрагменты, использованные во втором эксперименте по связыванию с матриксом Г и Д -Радиоавтографы, представляющие результаты по связыванию с ядерным матриксом смесей фрагментов клонированной ДНК, показанных на схемах Б и В. С - исходная смесь фрагментов. М1 и М2 - фрагменты, удержанные в составе ядерного матрикса в присутствии 0.2 мг/мл (М1) и 0.4 мг/мл (М2) конкурентной ДНК.

Карта участков расщепления изучаемого фрагмента ДНК из рекомбинантного клона ХРсЮО эндонуклеазами рестрикции и результаты анализа представлены на рисунке 21. Полученные результаты показывают, что на расстоянии 2,75-4,05 т.п.н. от правого конца изучаемого фрагмента ДНК расположен МАЯ-элемент протяженностью 1,3 т.п.н. В пределах этого МАЯ-элемента картируется один из обнаруженных ранее эритроидспецифичиых участков гиперчувствительности к ДНКазе 1.

Согласно литературным данным МАИ-элементы часто располагаются на границах геномных доменов, выполняя функцию инсуляторов. Действительно, в последующей

совместной работе нашей лаборатории и лаборатории проф. Рессилас-Тарга было продемонстрировано, что обнаруженный нами МАИ-элемент колокализуется с группой энхансер-блокирующих элементов

2. Кластер участков гиперчувствителыюсти ДПК'азе I, локализованный на расстоянии 3-4,5 т.п.и. перед я-1 сном, колокализуется с СрС-островком, часть которого избирательно метилирована в неэрнт роидных клетках.

Как упоминалось ранее, на расстоянии 3-4.5 т.п.н. перед тг-геном расположен СрО-островок. Известно, что в клетках большинства высших эукариот СрО-динуклеотиды служат мишенями для метилирования. I? то же время СрС-островки, как правило, не метилируются. Чтобы проанализировать характер метилирования изучаемого фрагмента ДИК мы сравнили характер расщепления данного фрагмента рестриктазами чувствительными (НраП и Бита!) и нечувствительными (Мзр!) к метилированию.

Б проба I проба г

Ш Ш "г I н

г г г I 2 г г г г г ' ' £

2 Р1!1Р|

* * ..... ► * 9

1

05..--^ 0 V« V • *

Рис. 22. Анализ характера метилирования СрО-богатого фрагмента ДНК из домена альфа-глобиновых генов кур. А - Карга, иллюстрирующая распределение сайтов узнавания для рестриктаз Мяр1/Нра11 в изучаемой области. Под картой показаны позиции проб, использованных в эксперименте. Единичный сайт узнавания МярШ 1ра11, метилированный по всем остаткам цитозина, показан звездочкой. Б-Результаты гибридизации с пробами 1 и 2,

При этом в параллельных опытах анализировали характер расщепления этими ферментами геномной ДНК эритроидпых (1ГОЗ) и лимфоидных (НР50) клеток. Стратегия исследования и результаты показаны на рисунке 22. Анализ характера расщепления позволяет заключить, что часть С'рС-островка, обращенная в сторону кластера альфа-глобиновых генов, избирательно метилирована в неэритроидных клетках.

3. Анализ функциональной активности эр-СрС-фрагмента.

Корреляция между метилированием эр-СрС-фрагмента в неэритроидных клетках и подавлением экспрессии глобиновых генов в этих клетках позволила предположить, что мелилирование ap-CpG—фрагмента может играть определенную роль в регуляции транскрипционного статуса апьфа-глобиновых генов. Чтобы проверить это предположение, мы проанализировали, оказывает ли эр-СрО-фрагмент (в метилированном и неметилированном состоянии) какое-либо влияние на активность промотора aD-гена. Для этого на основе того же вектора (а°рСАТЗ) мы сделали конструкцию эр-СрО-а°рСАТЗ. В последующем эр-СрС-фрагмент вырезали из конструкции и метилировали in vitro по всем CpG-динуклеотидам с использованием метилазы Sssl. В параллельных (контрольных) опытах фрагмент инкубировали с Sssl-метилазой в реакционном буфере, не содержащем S-аденозилметионина. После этого оба фрагмента (метилированный и контрольный) лит провали обратно в исходную конструкцию.

Рис. 23. Анализ функциональной активности эр-CpG-фрагмента (метилированного и неметилированного) из 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур. А - Схема конструкции aupCAT3 вектора. Б - Активность CAT - гена в исследованных конструкциях.

Кольцевую ДНК очищали посредством препаративного электрофореза и использовали для трансфекции клеток НРЗ. В параллельных опытах проводили трансфекцию эквимолярными количествами следующих конструктов: «°рСАТЗ (т. е. исходный вектор без эр-СрО-фрагмента), эр-СрС-а°рСАТЗ (контрольная конструкция, полученная посредством вырезания и лигирования на прежнее место неметилированного эр-СрО-фрагмента), мет-эр-СрО-а°рСАТЗ (конструкция, содержащая метилированный эр-СрО-фрагмент и неметилированный или метилированный промотор).

После культивирования клеток в течение 72 часов их лидировали и определяли активность хлорамфениколацетштрансферазы. Полученные результаты показаны на рисунке 23. Можно видеть, что метилирование эр-СрО-фрагмента, поставленного перед

неметшшрованным промотором а°-гена, снижает активность промотора в пять раз Таким образом, наше предположение о том, что метилирование ор-СрО-фра!меша можег способствовать подавлению акшвносш гчобнновых генов в неэритроидных кле!ках, получило косвенное подтверждение

VI МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ, АКТИВИРУЮЩИЕ РАБОТУ ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ В ЭРИ ГРОИДНЫХ КЛЕ1КАХ

На основе полученных нами резулыаюв и данных литературы можно предложить вариант модели, объясняющей каким образом происходит активация работы глобиновых генов в зритроидных клетках

Мы уже упоминали, чю домен альфамлобиновых генов относится к числу доменов открытого типа Такие домены располагаются в богатых генами областях генома, не имеют четко выраженных ipainm н часто перекрываю 1Ся с доменами других 1епов Более roto, домены открытого типа, содержащие тканеспецифичные гены, характеризуются повышенной чувствительностью к ДНКазе I во всех типах клеток (в том числе и в тех клетках, где данные гены не экспрессируются)

g энхамспр?! CR

ggPRX ¡CGTHBA) * MARh инсупяторы г> д ТМЕЫ6

. У_r-i,orí __ — "энхзмсер

■1 .........—гт

4»9 «Д511 |07^88' «74! 72107

с с 49а"

6 ♦ t it ♦ It t t tt t DHS

-1-r-1-1-i-H-p

• 15 -10 5 0 +5 +10 тп н

В ^тяШЯШШШШШМтт^^

домен тпврацвтипиромния гистонов

Рис 24 Организация домена а-глобиновы\ генов кур (а) - Схема домена, показывающая расположение генов энханссров и инсулягоров Г оризонтальная черная стрелка под схемой показывет полнодоменный транскрипт Ген ТМЕМ6 представляет собой открытую рамку считывания которая предположительно кодирует трансмембранныи домен белка (б) - Распределение участков гиперчувствителыюсти к ДНКазе I (ОНв) Короткими стрежачи обозначены зригроидсненифичные участки гиперчувствительности Длинными стрелками с буквой «С» обозначены перманентные учаыки 1 иперчу вствитсльности (в) - Позиция домена гиперлцетичировапня гистонов, возникающего в преэритробластах

На рисунке 24 представлена схема организации домена альфа-глобиновых генов кур Можно видеть, что собственно ктастер альфа-глобиновых генов имеет протяженность ~ 10 т п н Непосредственно перед этим клас1ером располагаем ген «домашнего хозяйства» ggPRX Главный регуляторный элемент, контролирующий работу домена альфа-глобиновых

генов, располагается в 5 интроне этого гена Между этим регуляторным элементом и собственно глобиновыми генами находится МАЯ-элемент. обладающий активностью инсулягора

Мы говорим о домене, а не о кластере альфа-глобиновых генов, так как существует группа экспериментальных данных, позволяющих говорить о том, что функциональный домен альфа-глобиновых генов существенно больше, чем собственно генный кластер В эритроидных клетках тот же самый геномный домен, который мы идентифицировали посредством анализа распредетения эритроидспецифичных участков гиперчувствителыгости к ДНКазе I (Рис 246), можно идентифицировать и посредством анализа сайт-специфического ацетилирования гистонов(Рис 24в)

Оба экспериментальных подхода позволяют говорить о том что домен альфа-глобиновых генов кур начинав!ся на расстоянии 21 тп и перед эмбриональным глобиновым геном альфа-типа - п (те примерно там, где располагается главный регуляторный элемегп кластера альфа-глобиновых генов) и заканчивается через несколько т п н после гена аА, последнего из генов альфа-глобинового кластера

Довольно давно было известно, что в эритроидных клетках транскрибируются не только собственно глобиновые гены но и достаточно протяженная 5'-концевая область домена Ситуация представляется достаточно сложной для анализа, так как в этой области располагается ген домашнего хозяйства, который транскрибируется в направлении, противоположном направлению транскрипции альфа-глобиновых генов Тем не менее в сотрудничестве с К Шеррером нам удалось продемонстрировать, что эта область транскрибируется и в направлении транскрипции глобиновых генов Ботее того, было показано что

(1) транскрипт, синтезирующийся в направлении транскрипции альфа-глобиновых генов является эритроидспецифичным,

(и) границы транскрипционной единицы практически совпадают с границами домена альфа-глобиновых генов, причем транскрипт является непрерывным, в силу чего было предложено называть его полнодоменным транскриптом

(ш) начало полнодоменного транскрипта фактически совпадает с местом расположения главного регуляторного элемента домена альфа-глобиновых генов

(IV) синтез полнодоменного транскрипта начинается в преэритробластах и продукт транскрипции (потнодоменный транскрипт) остается в клеточном ядре

Все эти наблюдения позво тягот предполагать что активация домена альфа-глобиновых !енов в преэритробластах осуществляется в соответствии с гипотезой Траверса Согласно этой [ипотезе элоширующий комплекс РНК полимеразы II может выполнять роль

своеобразного транспортного средства, которое, перемещаясь вдоль геномного домена, способно «перевозить» вместе с собой гистонацетилазы комплексы ремоделирования хроматина и другие фермешы, необходимые для активации хроматиновою домена Главный регуляторньш элемент домена альфа-глобиновых генов кур (и доменов альфа-глобиновых генов дружх позвоночных) включает в себя мощный эрироидспецифнчныи энхансер, работающий при участии белковою факюра ЫГПИ и малых белков труппы МаГ Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что, наряду с энхансером, данный регуляторный элемент домена альфа-глобиновых генов включает и промотор полнодоменного транскрипта По-видимому, энхансер активируется уже в незрелых эритробластах в силу повышения концентрации эритроидспецифичных транскрипционных факторов Неактивное состояние энхансера в неэритроидныч клетках может поддерживаться при участии сайленсера, идентифицированною в нашей работе Результатом активации энхансера является начало синтеза полнодоменного транскрипта и сопряженное с этим процессом изменение хроматниовои конфигурации домена альфа-глобиновых генов, свидетельством чего является, в частности, изменение харакюра ацегилирования гистонов в рамках всего домена Следует отметить, что аналогичный механизм работает и при активации «взрослого» субдомена домена бета-глобиновых генов человека Гам также был идентифицирован протяженный транскрип г, включающий глобиновые 1ены, работающие в эритробластах взрослого организма (5 и Р), и интергенные участки Деления промотора данного транскрипта приводила к инактивации субдомена, включающего гены 5 и Р, хотя промоторы данных генов и область контроля локуса оставались неповрежденными

Возвращаясь к домену альфа-глобиновых генов кур, мы хотели бы обратить внимание на два обстоятельства Прежде всего уже в незрелых эритробластах отсутствует метилирование части Срв-островка, прилежащей к кластеру альфа-глобиновых генов Мы показали, что метилирование данного фрагмента генома (в модельном эксперименте) подавляет активность промотора гена аЭ Устранение метилирования Срв-островка, которое можно наблюдать уже в преэритробластах, по-видимому, является одним из ранних этапов активации домена альфа-глобиновых генов Второе обскшельство, на которое мы хотели бы обратить внимание, заключается в том, что в преэритробластах удаленный энхансер не может взаимодействовать с промоторами глобиновых генов в силу того, что между ним и промоторами находится группа СТСГ-зависимых инсуляторов, котокализующихся с МАИ-элементом В зрелых эритробластах эти инсуляюры инактивируются, о чем свидетельствует отсутствие связанного с инсуляторами СТСГ Как именно происходит инактивация инсуляторов не вполне ясно До сих пор был описан лишь один класс СТСГ-зависимых кондиционных инсуляторов, активность которых регулируется посредством метилирования

участка связывания СТСР В случае инсуляторов, расположенных в 5'-концевой области домена альфа-гтобиновых генов такой механизм работать не может в силу того, что участки узнавания СТСР не содержат СрО-динуклеотидов Наиболее вероятным представляется то, что в зрелых эритробластах СТСР вытесняется конкурирующими за перекрывающиеся участки связывания эршроид-специфичными транскрипционными факторами Это предположение косвенно подтверждается тем фактом, что обсуждаемые инсуляторы располагаются в границах эритроидспецифичных участков гиперчувствительности к ДНКазе I Гак или иначе в зрелых эрифобластах инсутяторы, разделяющие удаленный энхансер и кластер глобиновых генов инактивируются, и появляется возможность прямою взаимодействия этого энхансера с промоторами глобиновых генов

Для домена альфа-глобиновых генов кур, также как и для доменов альфа- и бета-глобиновых генов других позвоночных характерно переключение экспрессии генов в ходе развития На эмбриональной стадии развития кур предпочтительно экспрессируется ген я, который расположен в начале кластера альфа-глобиновых генов Предпочтительную экспрессию этого гена можно объяснить уже тем, что этот ген расположен ближе всего к удаленному энхансерному элементу и, следовательно, стерически образование комплекса между удаленным энхансером и промотором этого гена является наиболее вероятным В этом смысле ситуация вполне аналогична той, которая реализуется в домене бета-глобиновых генов человека, где наиболее близко к области контроля локуса расположен эмбриональный ген в По окончании эмбриональной стадии развития промотор 71-гена инактивируется посредством метилирования, что приводит к прекращению экспрессии этого гена В зрелых эритробластах кур экспрессируются два альфа-глобиновых гена (аА и осв) Экспрессия этих генов контролируется как удаленным энхансером, расположенным в 5'-концевой области домена, так и мощным эритроидспецифичным энхансером, расположенным на расстоянии ~ I т п н после I ена аА Активность этого энхансера критическим образом зависит от наличия эритоидспецифичного транскрипционного фактора САТА-1 Соответственно она может регулироваться посредством изменения уровня экспрессии данного транскрипционного фактора Кроме того, непосредственно рядом с энхансером расположен сайленсер Каким образом регулируются соотносительные активности энхансера и сайленсера в ходе дифференцировки эритроидных клеток, остается неясным Можно лишь предполагать, что в зрелых эритробластах сайленсер тем или иным образом инактивируется, обеспечивая возможность максимальной активации экспрессии генов ад и а°

выводы

1 Разработан новый способ картирования геномных доменов открытого типа, основанный на характеристике распределения тканеспецифических участков гиперчувствительности к ДНКазе I

2 Показано, что доме» альфа-1 лобииовых ¡снов кур находи 1ся на границе двух изохор, между которыми располагается нестабильная последовательность ДНК

3 Продемонстрировано, что одной из важных характеристик нестабильных последовательностей ДНК в эукариотическом геноме является присутствие в их составе фазированных динуклеотидов ГС/СА, приводящих к скручиванию двойной спирали ДНК

4 Обнаружен новый ген который расположен в 5'-концевои области домена альфа-глобиновых генов и транскрибируется в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов

5 Продемонстрировано, что в эршроидных клетках весь кластер альфа-глобиповых генов и протяженная 5'-концевая область транскрибируются в составе полнодоменного транскрипта в направлении транскрипции глобиновых генов Показано, что полнодоменная транскрипционная единица начинается в облает расположения 1ХГ1-подобного позитивною эригроидспецифичнот регуляторною элемента

6 Продемонстрировано, что в регуляции экспрессии домена альфа глобиновых 1енов кур участвуют две группы негативных регуляториых элементов, расположенных в 5'-концевой области домена

7 Продемонстрировано, что будучи помещенной перед промоюроч гена а0, метилированная последовательность ДИК Срв-островка из домена альфа-глобиновых генов кур существенно подавляет активность этою промотора даже в том случае когда сам промотор не метилирован

8 Разработан новый метод изучения пространственной организации геномных доменов, основанный на гибридизации прилежащей к ядерному матриксу ДНК с олигонуклеотпдиыми матрицами

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Юдинкова Е С , Лагарькова M Л , Разин С В 1997 Клонирование и характеристика 5'-концевои обтасги включающей потенциальный регуля горный элемент доменного уровня Докл АН 356(3), 407-408

2 Шварц Ю Б , Юдинкова Е С , Демаков С Л , Разин С В , Жимулев И Ф 1999 Фрагменты ДНК из районов междисков политенных хромосом Diosophila melanogaster связываются с ядерным матриксом m vitro Mon Биол , 33(2), 268-272

3 Юдинкова Е С , Разин С В 1999 Участок связывания ДНК с ядерным матриксом (MAR -элемент) локализован в кластере сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I в 5' -концевой области домена альфа-глобиновых генов кур Мол Биол, 33(4), 603-604

4 Юдинкова Е С, Разин С В 2001 Изучение регуляторных последовательностей ДНК, локализованных в участках гиперчувствшельносги к ДНКазе I в 5'- концевой области домена альфа-глобиновых генов кур Mon Биоч, 34(5) 821-827

5 Яровая О В Юдинкова Е С , Разин С В 2001 CpG-меппирование не влияет на характер взаимодеисшия MAR - элементов с ядерным матриксом Докл АН, 377(2), 277-278

6 Юдинкова ЕС, Трифонов ЬН, Шеррер К, Разин С В 2001 Характеристика «неклонируемои» последовательности ДНК, локализованной в ингергенном спенсере между я и <xD глобиновыми 1енами курицы Докл АН, 378(1), 118-120

7 Юдинкова Е С , Разин С В 2002 Перед кластером альфа-глобиновых генов кур находится блок CpG-динуклеотидов, которые по-разному метилированы в эритроидных и неэритроидных клетках Докл АН 384(5), 692-694

8 Съяксте H, Яровая О В , Съяксте Т, Разин С В , Юдинкова Е С 2003 Перед кластером альфа-глобиновых генов кур расположен неэритроидспецифичный ген, начало которого колокализуется с участком начала репликации Докл АН 388(2) 272-274

9 Борунова В В, Юдинкова Е С, Разин С В 2003 Картирование границы эритроидспецифичнои транскрипционной единицы в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур Докл АН, 393(1), 112-115

10 Клочков ДБ, Юдинкова ЕС, Разин С В 2004 Характеристика сайленсера, расположенного в CpG-богатой области перед кластером альфа-глобиновых генов кур Докл АН,Докл АН, 398(5), 699-701

11 Юдинкова ЕС, Кадулин С Г Гольдман ИЛ, Разин С В, Вербовая Л В 2004 CpG-островок из домена альфа-глобиновых генов кур не содержит сигналов, достаточных для поддержания его неметилированного статуса в геноме трансгенных мышей Докл АН, 396(1), 126-128

12 Юдинкова ЕС, Петров А В, Васецкий ЕС, Разин С В 2005 Пространственная организация домена альфа-глобиновых генов кур в клетках различною происхождения Мол Биоч 39(6), 971-977

13 loudinkova Е S , Bystritsky А, Razin S V 1998 Does the apoptotic fragmentation of DNA starts by excision of chiomosomal DNA loop domains9 Cellulm and Molecular Biology Letters 3(2), 103-109

14 Razin S V , Shen K., loudinkova E S , Scherrer К 1999 Functional analysis of DNA sequences located within a cluster of DNase I hypersensitive sites «¡localizing with a MAR element at the upstream border ol the chicken alpha-globm gene domain J Cell Biochem 74,38-49

15 Schwartz Yu В loudinkova E S , Demakov S A , Razin S V , Zhimulev 1 E 1999 Interbands of Drosophila melanogaster polythene chromosomes contain matrix association regions J Cell Biochem 72,368-372

16 Razin SV, loudinkova ES, Scherrer К 2000 Extensive methylation of a part of the CpG island located 3 0-4 0 Kb upstream to the chicken alpha-globm gene cluster may contribute to silencing the globm genes in noncrythroid cells J Mo! Biol 209,845-852

17 Razin S V , loudinkova E S , frifonov E N , Scherrer К 2001 Non-clonability correlates with genomic instability a case study of a unique DNA region J Mol Biol 307,481-486

18 loudinkova ES, larovaia OV Scherrer K, Razin SV 2001 Regulation of globin genes expression new findings made with the chicken domain of alpha globm genes Gene Ther Mol Biol 6, 149-157

19 loudinkova E, Verbovaia L, Kadulin S, Goldman 1, Razin SV 2004 Heterologous CpG island becomes extensively methylated in the genome of transgenic mice J Cell Biochem 92, 99-103

20 Razin S V, Rynditch A , Borunova V , loudinkova E S , Smalko V , Scherrer К 2004 The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix J Cell Biochem 92,445-457

21 loudinkova E S , Razin S V , Borunova V V , De Conto F , Rynditch A , Scherrer К 2005 The RNA-dependent nuclear matrix contains a 33 kb globin full domain transcript as well as prosomes but no 26S proteasomes J Cell Biochem 94, 529-539

22 loudinkova E S , Petrov A , RazinS V Vassetzky Y S 2005 Mapping long-range chromatin organization within the chicken alpha-globm gene domain using oligonucleotide DNA arrays Genomics, 85(1), 143-151

Об юры

23 Юдинкова E С , Разни С В 2002 Геномные домены и регуляторные злемешы доменкою уровня Моч Биол ,36(6), 947-955

24 Юдинкова Е С , Разин С В 2003 Регуляторные системы геномных доменов с размытыми 1раницами Генетика, 39(2), 182-186

25 Разин С В Юдинкова Е С 2007 Механизмы, контролирующие активацию домена альфа-глобиновыч генов в эритроидных клетках кур Биохимия, 72(5), 581 — 585

26 Ioudinkova Е , Scherrer К , Ra/in S The chicken domain of alpha-globin genes search for the "domain level" negative regulatory elements Symposium "Current problems of molecular genetics and cell biology", Moscow, 19-21 October, 2000, 46-56

27 Borunova V , Youdinkova E The whole domain of chicken alpha-globin gene including a 20kb-long upstream area is transcribed m the globin direction in premature chicken erythroblasts Conference "Advances in molecular cell biology", Moscow, 17-18 June, 2004, 5-12

28 Яровая О В , Юдинкова Е С , Разин С В 2002 «Регуляция экспрессии глобиновых генов» Третий Съезд Российских Биохимиков, Ст Петербург, июнь 2002

29 Ra7in S V larovaia О, Ioudinkova Е 2002 Chicken domain of alpha-globin genes organization and regulation of globin genes expression "Gliwice Scientific Meeting" Gliwice, Poland November 22-23. 2002, 23

30 Klochkov D В , Ioudinkova E S , Recillas-Targa F, Razm S V New CTCF-dependent regulatory element within the area ol overlapping gene loci of chicken ggPRX gene and alpha-globin gene cluster EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics La Grande Motte, France, 24-28 September, 2005, 82

31 Klochkov D В , Rinkon-Arano H , Ioudinkova E S , Recillas-Targa F , Razm S V Structural-functional characterization of differently methylated region in the extended upstream area of chicken alpha-globin gene domain ESF-JSPS Workshop on Functional Genomics, Kanagawa, Japan, March 6-11 2006, 50

Тезисы конференций

Заказ № 169/03/07 Подписано в печать 02 03 2007 Тираж 120 экз Уел пл 2,0

^ ^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \v\vw с/г ги , е тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Юдинкова, Елена Станиславовна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. ДОМЕННАЯ ГИПОТЕЗА ОРГАНИЗАЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА.

И. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОМЕННОЙ ГИПОТЕЗЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ

ПО ИЗУЧЕНИЮ ДОМЕНА БЕТА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ.

III. ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМНЫХ ДОМЕНОВ.

1. Области контроля локуса различных геномных доменов.

2. Ипсуляторы.

IV. ГЕНОМНЫЕ ДОМЕНЫ С РАЗМЫТЫМИ ГРАНИЦАМИ.

1. Что такое геномные домены с размытыми границами?.

2. Можно ли картировать домен, если тест на предпочтительную чувствительность к ДНКазе I не работает?.

3. Регуляция экспрессии генов в доменах с невыраженными границами.

V. ХРОМАТИНОВЫЕ ДОМЕНЫ.

VI. ДОМЕНЫ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ ПОЗВОНОЧНЫХ.

1. Хромосомная локализация.

2. Структура домена.

3. Пространственная организация домена.

4. Ген «домашнего хозяйства».

5. Организация хроматина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Работа с культурами клеток.

2. Работа с ДНК и РНК.

3. Гибридизация in situ.

4. Приготовление олигонуклеотидных матриц.

5. Связывание in vitro фрагментов ДНК с препаратами ядерного матрикса.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. СТРУКТУРА ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

1. Определение границ домена альфа-глобиновых генов кур методом картирования участков гиперчувствительности к ДНКазе 1.

2. Клонирование и характеристика 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур.

3. Идентификация CpG-островка перед кластером альфа-глобиновых генов кур.

4. Характеристика «неклонируемой» последовательности ДНК, локализованной в интергенном спейсере между я- и aD-глобиновыми генами курицы.

II. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

1. Крупномасштабная организация хроматина в домене альфа-глобиновых генов кур, выявленная с использованием олигонуклеотидных матриц.

2. Подтверждение позиций участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу с использованием метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с препаратами ядерных гало.

3. Гибридизация прилежащей к ядерному матриксу фракции ДНК с олигонуклеотидными ДНК-чипами позволяет картировать позиции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу в протяженных областях генома.

4. Пространственная организация домена альфа-глобиновых генов кур в различных типах дифференцированных клеток.

III. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕЭРИТРОИДСПЕЦИФИЧНОГО ГЕНА, РАСПОЛОЖЕННОГО В ДОМЕНЕ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР, АНАЛОГА ГЕНА «-14» ЧЕЛОВЕКА.

1. 5'-фланкирующая область домена альфа-глобиновых генов кур содержит участки гомологии с геном «-14» человека.

2. Характер транскрипции 5'-фланкирующей области домена альфа-глобиновых генов кур.

IV. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДЛИННЫХ ТРАНСКРИПТОВ

В ДОМЕНЕ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

1. Определение протяженности и непрерывности транскрипта.

2. Транскрипционная единица доменного уровня начинается в области LCR-подобного регуляториого элемента домена альфа-глобиновых генов кур.

3. Протяженные транскрипты присутствуют в эритробластах, но не в фибробластах.

4. Полнодоменные транскрипты являются составной частью ядерного матрикса.!.

V. ХАРАКТЕРИСТИКА НЕГАТИВНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ РАБОТУ ДОМЕНА

АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

1. Анализ функциональной активности фрагментов из кластера участков гиперчувствительности к ДНКазе I, локализованного на расстоянии 11-14.5 т.п.н. перед я-геном.

2. Кластер участков гиперчувствительности к ДНКазе I, локализованный на расстоянии 3-4.5 т.п.н. перед л-геном, колокализуется с CpG-островком, часть которого избирательно метилирована в неэритроидных клетках.

3. Анализ функциональной активности эр-CpG - фрагмента.

4. CpG-островок из домена альфа-глобиновых генов кур не содержит сигналов, достаточных для поддержания его неметилированного статуса в геноме трансгенных мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Геномные домены открытого типа.

2. Новый метод изучения пространственной организации протяженных геномных доменов.

3. Молекулярные механизмы, активирующие работу глобииовых генов в эритроидных клетках.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация домена альфа-глобиновых генов кур"

Транскрипционная активность эукариотических генов регулируется на нескольких уровнях, в том числе на уровне индивидуальных промоторов и на уровне так называемых геномных доменов, которые правильнее было бы называть хроматиновыми доменами. Принципиальным отличием пространственной организации эукариотического генома является упаковка его в хроматин, которая позволяет значительно сократить линейные размеры ДНК, обеспечивая возможность размещения ее в относительно небольшом (~ 10 мкм в большинстве случаев) клеточном ядре. Было бы, однако, неправильным утверждать, что упаковка ДНК в хроматин обеспечивает лишь сокращение линейных размеров ДНК. На этом уровне работают и специальные регуляторные механизмы, контролирующие транскрипционный статус протяженных областей генома. Более 30 лет назад было продемонстрировано, что транскрипционная активность большинства генов коррелирует с уровнем доступности этих генов для переваривания ДНКазой I и другими нуклеазами. Позднее было продемонстрировано, что предпочтительной чувствительностью к нуклеазам обладают не только собственно транскрибирующиеся гены, но и фланкирующие геномные области, которые могут быть достаточно длинными и включать как транскрибирующиеся, так и нетранскрибирующиеся гены. Такие области и получили название геномных доменов. Мы говорим о том, что более правильно было бы называть эти области хроматиновыми доменами в связи с тем, что транскрипционный статус таких областей-доменов регулируется на уровне изменения характера упаковки ДНК в наднуклеосомные хроматиновые структуры. Имеется в виду, прежде всего 30 нм. хроматиновая фибрилла, которая может разворачиваться в так называемую нуклеосомную нить (структуру типа «бусинок на нити», описание и фотографии которой можно найти во всех современных учебниках по молекулярной биологии). Динамика конформационных изменений 30 нм хроматиновой фибриллы регулируется ацетилированием гистонов.

Четкая связь между геномными доменами (как функциональными единицами генома, находящимися под контролем определенных регуляторных механизмов) и хроматиновыми доменами впервые была продемонстрирована в экспериментах Грудина и соавторов [Forrester et. al., 1990]. Этими авторами было показано, что не затрагивающая собственно глобиновых генов делеция 5'-концевой области кластера бета-глобиновых генов человека приводит к одновременному прекращению транскрипции бета-глобиновых генов и переходу в компактную (устойчивую к ДНКазе I) конфигурацию протяженного хроматинового домена, включающего весь кластер бета-глобиновых генов и фланкирующие последовательности ДНК. Одновременно изменялось и время репликации (тайминг репликации) соответствующей геномной области. Подобно большинству геномных областей, не содержащих активных генов, репликация этой области происходила в конце S-фазы, в то время как активно работающий домен бета-глобиновых генов реплицируется в начале S-фазы. Последующие эксперименты позволили идентифицировать ключевой регуляторный элемент, контролирующий транскрипционный статус домена бета-глобиновых генов [Grosveld et. al., 1987]. С этого времени домен бета-глобиновых генов человека стал классической моделью для изучения механизмов, контролирующих транскрипционный статус протяженных геномных областей на доменном уровне. Со временем к этой модели добавились домены бета-глобиновых генов других позвоночных, домен овальбуминовых генов и гена лизоцима кур, домен гена аполипопротеина В человека. Анализируя все эти исследования в ретроспективе, невольно удивляешься тому, что целый ряд принципиальных заключений, касающихся доменной организации генома был сделан на основе анализа столь малого числа экспериментальных моделей. О каких, собственно, заключениях идет речь? Прежде всего, о том, что домены тканеспецифичных генов могут находиться в активном, либо неактивном состоянии, что четко коррелирует с чувствительностью (соответственно высокой иди низкой) этих доменов к ДНКазе I. Вторым важным заключением являлось то, что геномные домены являются изолированными и в определенном смысле самодостаточными единицами генома, что обеспечивается наличием в их составе регуляторных элементов доменного уровня получивших название Областей Контроля Локуса (Locus Control Region, LCR). Ключевым аргументом, подтверждающем это второе утверждение явилась демонстрация того, что полноценные домены либо мини-домены, сконструированные из области контроля локуса и одного или нескольких генов, были способны нормально работать в эктопических геномных позициях, в том числе и в геноме трансгенных животных других видов.

Было бы очень заманчивым представить, что весь геном состоит из более или менее единообразно построенных структурно-функциональных единиц (доменов), работа которых регулируется сходными механизмами. Это, несомненно, могло бы существенно облегчить познание общих принципов работы генома, однако в природе даже для решения сходных задач часто используются совершенно различные пути. Это в полной мере относится и к геномным доменам. Известно, что гемоглобин построен из цепей альфа- и бета- типов. Альфа-глобиновые цепи кодируются альфа-глобиновыми генами, которые организованы в кластер. Этот кластер находится в хроматиповом домене, который резко отличается от тех доменов, которые обсуждались выше. Основной особенностью этого домена является то, что он одинаково чувствителен к ДНКазе в эритроидных и неэритроидных клетках. Иными словами нарушается казавшийся классическим принцип корреляции между транскрипционным статусом гена (генного кластера) и чувствительностью к ДНКазе, а, следовательно, и способом упаковки хроматинового домена. Неясным становится и вопрос о том, что собственно следует считать в данном случае геномным доменом. Ведь при рассмотрении всех упоминавшихся выше модельных систем границы домена определялись по чувствительности к ДНКазе. Тем не менее, существуют веские основания считать, что альфа-глобиновые гены также являются частью протяженного хроматинового домена, транскрипционный статус которого регулируется особыми механизмами. Мы назвали такие домены доменами открытого типа или доменами с размытыми границами. В настоящей работе будут рассмотрены основные принципы организации и регуляции работы доменов открытого типа на примере домена альфа-глобиновых генов кур. Актуальность работы определяется тем, что домены открытого типа встречаются в геноме достаточно часто, а возможно, составляют большую его часть. Именно по этой причине столь узок был круг экспериментальных моделей, использовавшихся при изучении «классических» доменов, подобных домену бета-глобиновых генов кур. Раскрытие базовых принципов работы доменов открытого типа существенно расширяет наши представления об организации и работе эукариотического генома в целом. Очевидно, что эта информация является принципиально важной и для решения практических задач в области биотехнологии и генной терапии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ДОМЕННАЯ ГИПОТЕЗА ОРГАНИЗАЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА.

Хотя о доменах эукариотического генома написано немало экспериментальных и обзорных статей [Goldman, 1988; Razin et. al., 1993; Razin, 1996; Geyer et. al., 1997; Dillon et. al., 2000], термин этот остается неоднозначным. Можно говорить, по меньшей мере, о двух типах доменов: функциональных и структурных. Классическими функциональными доменами являются единицы транскрипции (транскриптоны) и единицы репликации (репликоны). Наиболее четко определенными структурными доменами являются предпочтительно чувствительные к нуклеазам области. Предпочтительная чувствительность к ДНКазе I активных генов была впервые продемонстрирована в работах Вайнтрауба и Грудина [Weintraub et. al., 1976]. Они показали, что в процессе обработки ДНКазой I изолированных ядер клеток из разных тканей, ДНК, кодирующая глобины, преимущественно переваривается в красных кровяных клетках, но не в фибробластах или клетках мозга. В то же время, не транскрибирующиеся в этих типах клеток гены овальбумина были относительно устойчивы к действию ДНКазы. Результаты этих экспериментов позволили предположить, что транскипционпо активные и неактивные гены по-разному упакованы в хроматине. В последующих экспериментах других авторов эта точка зрения получила дополнительные подтверждения. Кроме того, было показано, что предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I обладают потенциально активные гены. Фактический уровень транскрипции тех или иных генов не коррелировал с чувствительностью к ДНКазе кодирующих последовательностей ДНК. Изучая домен овальбуминовых генов, Гаррел с соавторами показали, что предпочтительная чувствительность к ДНКазе I характерна для протяженного геномного домена, включающего как активные гены, так и нетранскрибирующиеся псевдогены

Garel et. al., 1976; Garel et. al., 1977]. Мультигенное семейство овальбуминовых генов -классический пример ДНКаза-чувствительного домена, который включает как активные, так и неактивные гены, а именно: два псевдогена (X,Y) и собственно ген овальбумина.

Рисунок 1. Относительная чувствительность ДНК к расщеплению ДНКазой I в клетках яйцеводов курицы. Домен овальбуминовых генов кур. Положение овальбуминовых генов показано прямоугольниками.

Транскрипция генов происходит под воздействием эстрогена в яйцеводе курицы в пропорции C>V:X:Y=100.i0:l [Knoll et. al., 1981]. Лоусон и соавт. [Lawson et. al., 1982] показали, что область, включающая овальбуминовый ген, упомянутые выше псевдогены, спейсерные и фланкирующие последовательности, находится в ДНКаза-чувствительной конфигурации в клетках яйцеводов (Рис.1). ДНКаза-чувствительная область распространяется и далее в 5'-направлении от псевдогена X приблизительно на 20 т.п.и., и на такое же расстояние в З'-сторону после овальбуминового гена. На границах домена переход к закрытой (нечувствительной к ДНКазе I) области происходит достаточно быстро - на отрезке в 10 т.п.н. Таким образом, полный размер ДНКаза-чувствительного домена составляет около 100 т.п.н. Надо сказать, что организация ДНКаза-чувствительного домена связана с клеточной дифферецировкой, а не с транскрипцией овальбуминового гена. При прекращении гормональной стимуляции транскрипция овальбумина останавливается, но конфигурация домена остается открытой -чувствительной к ДНКазе I. В других тканях (печени, селезенке) весь домен характеризуется относительной устойчивостью к ДНКазе I. Авторы цитированной выше работы предложили модель, связывающую феномен предпочтительной чувствительности к ДНКазе тканеспецифичных генов и клеточную дифференцировку (Рис.2). Они предположили, что в процессе дифференцировки эмбриональных стволовых клеток тканеспецифичные гены в разных типах клеток включаются в состав предпочтительно чувствительных к нуклеазам доменов. В отсутствие дополнительных модуляторов транскрипции эти декомпактизованные домены не транскрибируются. Под воздействием индукторов, таких как гормоны для овальбуминового семейства в клетках яйцевода, гены в домене становятся транскрипциоппо активными, а домен продолжает оставаться ДНКаза-чувствительпым. В настоящее время схема поэтапной активации генов (сначала на уровне хроматинового домена, а потом на уровне индивидуальных промоторов) является общепризнанной.

Изменение чувствительности к ДНКазе I в зависимости от типа клеточной дифференцировки характерно и для доменов ряда других тканеспецифичных генов. Так, домен гена лизоцима кур характеризуется повышенной чувствительностью к ДНКазе I в клетках макрофагов и относительной резистентностью к ДНКазе в других типах клеток. [Janzen et. al., 1986]. ДНКаза-чувствителыгая область включает в себя транскрипционную единицу размером 4 т.п.н. и распространяется на 14 т.п.н. в 5'- и на 6 т.п.н. в 3'-направлении. Переход к ДНКаза-устойчивой конфигурации хроматина достаточно постепенный с 5'-стороны и резкий в З'-области, как и в случае доменов генов овальбумина [Lawson et. al., 1982] и GAPDH [Alevy et al., 1984]. эмбриональные , стволовые клетки.

IDUJIUDDIC М1С1ЯЛ> дифференцировка \ » (гормоны?) ^ Е

Шл Ш, клеточный тип 1 клеточный тмп 2 индукция |

I | (гормоны) | | транскрипционно неактивный ген ■ транскрипционно активный ген

ДНКаза I устойчивая структура

ДНКаза I чувствительные домены

Рисунок 2. Модель образования чувствительных к ДНКазе I доменов во время клеточной дифференцировки (комментарий в тексте) [Lawson et. al., 1982].

Феномен повышенной чувствительности к ДНКазе I обычно объясняют переходом 30 нм хроматиновой фибриллы в так называемую развернутую структуру типа «бусинок на нити». Постепенное изменение чувствительности на границе может быть связано с тем, что в популяции клеток изменение копформации хроматиновой фибриллы начинается в разных точках в пределах некоторой зоны на молекуле ДНК. Помимо общей повышенной чувствительности к ДНКазе I существуют так называемые участки гиперчувствительности к этому ферменту. Как правило, это свободные от нуклеосом участки, в которых расположены разные регуляторные последовательности. В домене гена лизоцима цыпленка участки гиперчувствительности к ДНКазе I расположены кластерами перед и после транскрипционной единицы, за одним исключением, и все в границах домена. Наличие гиперчувствительных сайтов на достаточном расстоянии от гена, но внутри домена указывает на возможность контроля экспрессии из отдаленных районов. Эта точка зрения нашла прямое подтверждение в работах Тейсена [Theisen et. al., 1986] и Гревала [Grewal et. al., 1992]: выяснилось, что гиперчувствительный сайт -6.1 т.п.н. проявляет энхансерную активность и является мишенью для связывания ядерного фактора NF1 и некоторых других регуляторных белков.

Домен бета-глобиновых генов кур необычен с точки зрения расположения генов и компактности (Рис.3).

HSA

FR ген v

Инсулятор CTCF 5'HS4

LCR ш p|3H(3Ae

Ш II I I

16 т.п.н. конденсированный хроматин

CTCF 3'HS

V7

3/8 0RreH энхансер

Рисунок 3. Схематическое изображение домена бета-глобиновых генов кур.

Гены расположены в следующем порядке 5'-р-р"-рд-б-3'; расположенные в центре гены взрослых животных (Рн и (3А) окружены эмбриональным геном р и фетальным геном е [Villeponteau et. al,, 1982]. Согласно гипотезе К. Шеррера о том, что АТ-богатые области являются естественными границами геномных доменов, считалось, что домен имеет размер порядка 20 т.п.н. [Moreau et al., 1982], однако более поздние эксперименты Хеббса и соавт. расширили его границы до 33 т.п.н. Также в работе Хеббса было продемонстрировано, что область чувствительности хроматина к ДНКазе I совпадает с областью гиперацетилирования коровых гистонов [Hebbes et al., 1994]. Индивидуальные промоторы регулируют экспрессию каждого бета-глобинового гена при участии эритроидных и общих транскрипционных факторов: GATA-1, EKLF, NF-E2, Spl и других. Кроме того, в состав домена входит эритроидспецифичный энхансер (fiA/e), который расположен между взрослым 13Л и эмбриональным е генами [Choi et al., 1986; Hesse et al., 1986]. Энхансер BA/e является общим для двух генов и содержит сайты связывания различных транс-действующих факторов, специфичных для каждой стадии развития. Конкуренция между этими регуляторными факторами и определяет предпочтительную мишень для действия энхансера [Foley et al., 1992]. Энхансер BA/s может направлять экспрессию, зависящую от количества копий, репортерного гена у трансгенных мышей [Reitman et al., 1990], но этот энхансер сам по себе не может «открывать» хроматин. В 5'-некодирующей области домепа идентифицировано четыре сайта гиперчувствительности к ДНКазе I [Reitman et al., 1993] В домене бета-глобиновых генов три эритроидспецифичных гиперчувствительных сайта расположены относительно близко к генам. С 5'-стороны домен отделен от прилегающего хроматина четвертым сайтом гиперчувствительности, который содержит CTCF-зависимый инсулятор и определяет границы домена [Reitman et al., 1990; Chung et al., 1993; Bell et al., 1999]. Еще один участок гиперчувствительности к ДНказе I колокализуется с ВА/е энхансером. В З'-концевой области домена бета-глобиновых генов не обнаружено никаких регуляторных элементов. З'-граница домена отмечена, по-видимому, сайтом гиперчувствительности, расположенным на расстоянии 3 т.п.н. после эмбрионального гена. В этом участке гиперчувствительности к ДНКазе I располагается CTCF-зависимый инсулятор. Любопытно, что этот инсулятор обладает способностью блокировать активность энхансеров, но не защищает трансгены от позиционных эффектов [Saiton et al., 2000]. Таким образом, весь домен бета-глобиновых генов кур расположен между двумя инсуляторами. Перед доменом располагается область конденсированного хроматина, протяженность которой (на молекуле ДНК) составляет 16 т.п.н. [Prioleau et al., 1999; Litt et al., 2001]. Далее следует ген фолатного рецептора. С З'-стороны к домену бета-глобиновых генов примыкает кластер генов обонятельных рецепторов.

Можно привести и другие примеры доменов тканеспецифичных генов, обладающих повышенной чувствительностью к ДНКазе в тех типах клеток, где соответствующие гены экспрессируются. Это домены гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) [Alevy et al., 1984], аполипопротеина В человека [Levy-Wilson et al., 1989], вителлогенина [Tata et al., 1980], протамина [Levy-Wilson et al., 1980 ], инсулина [Wu et al., 1981], домены бета-глобиновых генов млекопитающих [Stalder et. al., 1980; Tuan et. al., 1985; Forrester et. al., 1986]. Все перечисленные домены являются достаточно протяженными (более 100 т.п.и. в случае домена овапьбуминовых генов кур) и характеризуются предпочтительной чувствительностью к ДНКазе только в определенных типах клеток. Они могут включать один или несколько (часто функционально сцепленных) генов и межгенные пространства. Границы ДНКаза-чувствительных доменов являются достаточно четкими. Переход от ДНКаза-чувствительной области к области, характеризующейся относительной устойчивостью к ДНКазе, происходит в пределах фрагмента ДНК протяженностью в несколько т.п.н. Это позволяет предположить, что существуют некие специальные элементы генома и соответствующие им структуры хроматина, которые являются границами ДНКаза-чувствительных доменов. Разумеется, ДНКаза-чувствительные домены не являются единственным типом структурных доменов хроматина. Существуют еще закрепленные на ядерном матриксе петли ДНК, имеющие размеры, сопоставимые со средними размерами ДНКаза-чувствительных доменов [Razin et. al., 1996] и существенно более протяженные домены - "изохоры", характеризующиеся относительным постоянством нуклеотидпого состава ДНК [Bernardi, 2000].

ДНКаза-чувствительные домены генома привлекли особое внимание исследователей, прежде всего потому, что очевидна была определенная зависимость между статусом этих доменов и транскрипционной активностью соответствующих генов.

Механизм этой зависимости долгое время оставался неясным. Серия недавно проведенных исследований позволяет предложить, что переход геномного домена в открытую (чувствительную к ДНКазе) конфигурацию связан с ацетилированием гистонов [Davie, 1996].

Можно говорить о том, что чувствительные к ДНКазе I домены хроматина являются некими структурно-функциональными блоками генома, которые могут находиться в активном либо неактивном состоянии в зависимости от типа клеток, или, иными словами, в зависимости от неких дополнительных сигналов. Это положение составляет основу так называемой доменной гипотезы структурно-функциональной организации эукариотического генома [Bodnar, 1988; Goldman, 1988]. Данная гипотеза приобрела особую привлекательность после того, как были обнаружены так называемые области контроля локуса (LCRs), которые, как следовало из результатов первоначальных экспериментов, осуществляют контроль над всеми параметрами (характер ацетилирования гистонов, транскрипционный статус и время репликации) протяженных доменов генома [Grosveld et. al., 1987; Forrester et. al, 1990].

II. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОМЕННОЙ ГИПОТЕЗЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДОМЕНА БЕТА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ.

Домен бета-глобиновых генов человека расположен в GC-бедной области (изохоре) 11-й хромосомы. Для подобных бедных генами и поздно реплицирующихся областей характерны высокая степень упаковки хроматина и множественность контактов с ядерным матриксом [Hardison et al., 1998; Craddock et al., 1995]. Домен бета-глобиновых генов, размером около 100 т.п.н., включает эмбриональный ген - е, два фетальных гена -Gy и Ау и два взрослых гена - 8 и р (Рис.4). Все эти гены транскрибируются в одном направлении. Порядок генов в домене соответствует времени их активации в процессе развития. В эритроидных клетках взрослого человека экспрессируются только 5 и |3 гены. При изучении домена бета-глобииовых генов человека была обнаружена первая, и в известном смысле «классическая» область контроля локуса (рис.4). Областью контроля локуса - LCR (locus control region) принято называть регуляторный элемент, контролирующий транскрипционный статус одного или группы генов на уровне геномного домена. В экспериментах для идентификации области контроля локуса часто используют тест на обеспечение независимого от позиции интеграции уровня экспрессии трансгенов (смотри ниже). Первые свидетельства существования области контроля локуса домена бета-глобиновых генов человека были получены при изучении делеций, приводящих к талассемиям (заболеваниям, связанным с нарушением экспрессии глобиновых генов). Анализ характера геномных нарушений при разных формах талассемии показал, что участки ДНК, расположенные на расстоянии более 5 т.п.н. перед кластером бета-глобиновых генов человека, необходимы для нормальной экспрессии этих генов [Kiossis et. al., 1983; Curtin et. al., 1985]. А

HSS -6.1 - -21.5 10 т.п.н. I-1 5 р П П

5 4 3 2 1 та п Gy Ay П П

11 эмбриональный L | фетальные '— | взрослые

Ранореплицирующийся. ДНКазочувствнтельный. транскрнпционно активный 1

Испанская делеция G;/ g ^ п □ □□ □

I—I II II эмбриональный фетальные взрослые

Позднореплицирующийся. ДНКазоустойчивый. транскрипцнонно неактивный

HSS-6.1- -21.5

10 т.п.н., шшшш

Строение мини-домена

Опыты на трансгенных мышах чшшш

Рисунок 4. А - Идентификация области контроля локуса домена бета-глобиновых генов человека. Схема нормального бета-глобинового локуса человека и локуса. поврежденного Испанской делецией. Гены обозначены белыми прямоугольниками. Стрелками показаны позиции ДНКаза I гиперчувствительных сайтов (HSS)l-5. Пунктиром обозначена область распространения Испанской делении [Grosveld et. al., 1987; Forrester et. al., 1990]. Б. Демонстрация активности области контроля локуса из домена бета-глобиновых генов человека.в экспериментах с трансгенными мышами [Grosveld et. al., 1987]: схема конструирования мини-домена (слева); анализ экспрессии трансгена - зависимость уровня синтеза [3-глобиновой мРНК от количества копий интегрированного конструкта (справа).

В независимых экспериментах было установлено, что на расстоянии 6-22 т.п.н. перед кластером бета-глобиновых генов человека находится блок участков гиперчувствительности к ДНКазе I, включающий четыре эритроидспецифичных и один перманентный участок [Forrester et. al., 1986; Tuan et. al., 1985]. Как уже говорилось, участки гиперчувствительности к ДНКазе I в хроматине, как правило, обозначают положение различных регуляторных последовательностей в ДНК. Были обнаружены делеции 5'-концевой области домена, не затрагивающие собственно глобиновые гены и их промоторы, но приводящие, тем не менее, к развитию талассемий. В данном случае делеции и другие геномные перестройки, приводящие к талассемиям, всегда затрагивали блок участков гиперчувствительности к ДНКазе I. Наиболее короткая из известных делеций такого типа, так называемая Испанская делеция (приводящая к у5р-талассемии), содержит четыре участка гиперчувствительности и 25 т.п.н. перед ними (рис.5А). В эритроидных клетках, с Испанской делецией, домен бета-глобиновых генов находится в транскрипционно неактивном состоянии, является устойчивым к действию ДНКазы и позднореплицирующимся, в то время как в нормальных эритроидных клетках он активно транскрибируется и реплицируется в начале S-фазы [Forrester et. al., 1990].

Это позволило предположить, что блок участков гиперчувствительности к ДНКазе I, находящийся на расстоянии 6-22 т.п.н. перед кластером бета-глобиновых генов человека, является особым регуляторным элементом, который контролирует транскрипционный статус протяженного геномного домена на уровне упаковки этого домена в хроматин. Этот регуляторный элемент был назван областью контроля локуса (LCR).

Ключевые опыты, подтверждающие эту точку зрения, были сделаны на трансгенных мышах. В лаборатории Гросвельда было продемонстрировано, что фрагмент ДНК домена бета-глобиновых генов человека, содержащий четыре гиперчувствительных сайта (5'HSS 2-5, рис.5Б), будучи помещен перед всем кластером бета-глобиновых генов или перед одним из генов, обеспечивает высокий и не зависящий от места интеграции уровень экспрессии этих генов в эритроидных клетках трансгенных мышей [Grossveld et. al., 1987; Dillon et. al., 1993]. Практически сразу после этого было показано, что LCR домена бета-глобиновых генов человека работает аналогичным образом и в отношении других трансгенов, поставленных под его контроль [van Assendelft et. al., 1989; Talbot et. al., 1989].

В течение многих лет изучение организации и функциональной активности LCR было возможно лишь в модельных опытах на трансгенных мышах. Однако любая модельная система позволяет лишь частично воспроизвести реальную ситуацию. Существенным недостатком первых опытов по интеграции полного или частично делетированного локуса бета-глоби новых генов в геном трансгенных мышей была множественная интеграция конструкций. При микроинъекции конструкций в пронуклеус яйцеклетки, как правило, наблюдается тандемная интеграция значительного числа копий конструкции в одно и то же место генома [Henikoff, 1998]. Понятно, что в таком искусственно возникшем «ампликоне» возможно взаимное влияние регуляторных элементов, расположенных в повторяющихся блоках. Использование фаговых [Ramires-Solis et. al., 1995] и дрожжевых [Schlake et. al., 1994] систем сайт-специфической рекомбинации позволило получать трансгенных животных, геном которых содержит только одну копию генной конструкции [Tanimoto et. al., 1999]. Хотя такая модель более совершенна, однако и она не полностью отражает условия работы LCR в нормальной геномной позиции. Сейчас все более очевидно, что макроокружение и пространственная организация тех или иных геномных элементов в ядре эукариотической клетки заметно влияют на их работу [Francastel et. al., 2000]. В связи с этим чрезвычайно важен детальный анализ функциональной активности LCR и его отдельных блоков в нормальной геномной позиции.

Первый опыт такого рода поставила, в сущности, сама природа. В данном случае имеется в виду Испанская делеция и различные талассемии. Развитие техники направленных делеций (knock-out) позволило охарактеризовать результаты удаления отдельных блоков либо всего LCR из хромосомы. Понятно, что в случае с LCR человека опыты такого рода возможны лишь на культурах клеток. Результаты экспериментов по направленным делециям различных элементов LCR оказались довольно неожиданными. Как и предполагалось, делеции протяженных участков бета-глобинового LCR на человеческой хромосоме приводили к подавлению экспрессии глобиновых генов. Но в противоположность предположениям, базирующимся на изучении клеток с Испанской делецией, домен оставался чувствительным к ДНКазе и ранореплицирующимся. После удаления LCR сохранялось гиперацетилирование гистонов, характерное для активного хроматинового домена.

На основе этих экспериментов были сделаны выводы о том, что LCR не является необходимым для поддержания активной конфигурации бета-глобинового домена. Поскольку данные эксперименты были выполнены на культурах клеток, существовала вероятность того, что функция LCR является существенной на некоторых стадиях эмбрионального развития. Однако, вероятность подобного факта была исключена при изучении мышей, содержащих делеции в эндогенном бета-глобиновом LCR. Направленные делеции некоторых внутренних элементов мышиного бета-глобинового LCR практически не сказывались экспрессии бета-глобиновых генов, а делеции некоторых из 5'-гиперчувствительпых сайтов приводили к снижению уровня транскрипции не более чем на 20%. Делеция большей части мышиного LCR приводила к резкому снижению уровня транскрипции бета-глобиновых генов, как в культурах клеток, так и у трансгенных мышей. Однако, в отличие от сходной делеции у человека, транскрипция не была полностью подавлена в отсутствие LCR. Домен оставался ДНКаза-чувствительным и обнаруживал гиперацетилирование гистонов ИЗ и Н4 на всем своем протяжении. Кроме того, был сохранен правильный порядок включения бета-глобиновых генов в процессе развития. В соответствии с результатами этих исследований, делеция 5' HSS 1-4 у мышей также вызывала бета-талассемический фенотип с низким уровнем экспрессии взрослых бета-глобиновых генов в мутантной аллели гетерозиготных мышиных особей. При низком уровне экспрессии в мутантной аллели нормальный уровень экспрессии наблюдался только в 1-3% эритроидных клеток, так как аллель была инактивирована в большей части клеток. Однако хроматиновая структура локуса еще не была подвержена изменениям в результате этой мутации.

Исходя из этих данных, было сделано заключение о том, что у мыши LCR не является необходимым ни для поддержания активной конформации домена бета-глобиновых генов, ни для обеспечения правильного порядка экспрессии этих генов в ходе развития [Bender et. al., 2000].

Все модели, предложенные для объяснения действия областей контроля локуса, фактически были разработаны для того, чтобы объяснить механизмы действия «классических» бета-глобиновых областей контроля локуса доменов млекопитающих и птиц. Гросвельд предположил, что для активации экспрессии какого-либо гена в домене бета-глобиновых генов, LCR должен непосредственно взаимодействовать с промотором соответствующего гена [Dillon et. al., 1997; Wijgerd et. al., 1995]. Это взаимодействие могло быть реализовано посредством выпетливания фрагмента ДНК, разделяющего LCR и промотор данного гена [Bulger et. al., 1999]. Со статистической точки зрения, возможность подобного взаимодействия возрастает при уменьшении расстояния между LCR и промотором. Следовательно, гены, расположенные ближе к LCR должны были иметь преимущество перед генами, расположенными дальше. В этом смысле может оказаться важным то обстоятельство, что бета-глобиновые гены млекопитающих расположены в порядке их активации в процессе развития [Peterson et. al., 1993].

У трансгенных мышей, несущих единственную копию кластера бета-глобиновых генов человека, эмбриональный ген е, расположенный ближе всего к LCR, наиболее сильно экспрессируется в желточном мешке, тогда как взрослый глобиновый ген (3 на этой стадии не экспрессируется. Противоположный характер экспрессии (активная экспрессия взрослого гена Р в желточном мешке и отсутствие экспрессии гена е) наблюдался в результате экспериментально индуцированной инверсии кластера бета-глобиновых генов, при которой ген Р был перемещен на ближнюю позицию к LCR, а ген s на наиболее отдаленную позицию [Tanimoto et. al., 1999]. Другие эксперименты также подтвердили предпочтительную экспрессию гена, наиболее близко расположенного к LCR [Dillon et. al., 1997]. Вторым важным аргументом в пользу «конкурентной» модели действия LCR является то, что только один из пяти бета-глобиновых генов может экспрессироваться на одной хромосоме в данный момент времени. Действительно, если LCR, находящийся на хромосоме, взаимодействует с промотором для инициации транскрипции, то одновременная инициация транскрипции на нескольких LCR-зависимых промоторах невозможна, что и было продемонстрировано экспериментально. Прямое взаимодействие промотора и LCR было названо «flip-flop» механизмом [Gribnau et. al., 1998; Trimborn et. al., 1999].

Хотя «конкурентная» модель и объясняет, почему эмбриональный глобиновый ген е начинает экспрессироваться первым в ходе развития, она не может объяснить механизм переключения экспрессии глобиновых генов, равно как и полное отсутствие экспрессии «взрослых» глобиновых генов человека на эмбриональной стадии развития. Действительно, домен бета-глобиновых генов находится в открытой конфигурации на протяжении эритроидного развития, а экспрессия гена е, который занимает наиболее близкую позицию по отношению к LCR, ограничена эмбриональной стадией. Следовательно, должен существовать особый механизм, предотвращающий экспрессию этого гена в эритроидных клетках взрослого организма. Более того, у человека взрослые бета-глобиновые гены не экспрессируются в желточном мешке даже па низком уровне, хотя «конкурентная» модель подразумевает, что все гены должны экспрессироваться, хотя и на разных уровнях. По-видимому, это имеет место у мышей, включение генов которых происходит в относительно небольшой промежуток времени, вследствие того, что у них короткие эмбриональная и фетальная стадии.

У человека экспрессия взрослых бета-глобиновых генов вероятно, сильно подавляется на эмбриональной стадии посредством механизма, отличного от простой конкуренции промоторов за LCR. Этот механизм может функционировать на уровне разделения кластера бета-глобиновых генов человека на «эмбрионально-фетальный» и «взрослый» субдомены [Gribnau et. al., 2000], о чем будет сказано ниже.

Стоит обратить особое внимание на то, что в «конкурентной» модели работы LCR промоторы индивидуальных генов рассматриваются как часть регуляторной системы доменного уровня. Для эффективного взаимодействия с LCR или, возможно, с белковым «холокомплексом», связанным с ним, белковые комплексы, связанные с промотором, должны иметь определенный уровень пространственной комплементарное™ с LCR-связывающим «холокомплексом» [Amrolia et. al., 1998; Bulger et. al., 2002; Langdon et. al., 1998; Sawado et. al., 2001]. В соответствии с вышеизложенным, можно сказать, что взаимодействие между LCR и эритроидспецифичиыми промоторами бета-глобиновых генов является существенным для функционирования регуляторных систем домена бета-глобиновых генов.

Вторая группа моделей, объясняющая механизм действия LCR постулирует, что LCR является местом сборки некоего активаторного комплекса, сигнал от которого потом распространяется в сторону промоторов. В этой связи важным представляется то, что для всех областей контроля локуса характерна высокая концентрация сайтов связывания транскрипционных факторов [Goodwin et. al., 2001; Hardison et. al., 1997].

Связавшись с LCR, транскрипционные факторы могут привлекать комплексы ремоделирования хроматина и ацетилирования гистонов. Действительно, было показано, что эритроидный Krueppel-like фактор (EKLF), который может связываться с G-T последовательностью в HSS 3 LCR и САССС-последовательностью в промоторе

Р-глобинового гена [Tewari et. al., 1998; Wijgerde et. al., 1996], формирует комплексы с факторами ремоделирования хроматина SWI/SNF [Armstrong et. al., 1998]. Кроме того, было показано, что GATA-1, EKLF и NF-E2 взаимодействуют с гистонацетилтрансферазами [Zhang et. al., 1998]. Можно предположить, что гистонацетилтрансферазы и комплексы ремоделирования хроматина, имеющие сродство к LCR, в конечном итоге активируют соседние хроматиновые участки [Bresnick et. al., 1997; Elefant et. al., 2000; Forsberg et. al., 1999]. Однако это предположение не может объяснить активации удаленных промоторов, т.е. прогрессивного распространения активирующего сигнала. Поэтому было выдвинуто предположение о том, что транскрипция инициируется в LCR. Продолжаясь в направлении глобиновых генов, она обеспечивает активацию домена [Ashe et. al., 1997; Jonson et. al., 2003]. Известно, что элонгирующая PHK-полимераза, продвигаясь вдоль организованной в хроматин молекулы ДНК, перемещает вместе с собой сложный комплекс ферментов, обеспечивающий возможность так называемой «транскрипции через нуклеосомы». К числу этих ферментов относятся гистонацетилазы и факторы ремоделирования хроматина [Cho et. al., 1998; Wilson et. al., 1996; Wittschieben et. al., 1999]. Таким образом, низкоуровневая транскрипция может быть необходима для активации хроматинового домена [Travers, 1999]. В случае доменов бета-глобиновых генов эта гипотеза подтверждается рядом экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что как сам LCR, так и межгенные области домена бета-глобиновых генов транскрибируются в эритроидных клетках [Kong et. al., 1997; Plant et. al., 2001]. Интересно, что полнодоменные транскрипты были обнаружены и в домене альфа-глобиновых генов кур [Broders et. al., 1990].

Строго говоря, упомянутая выше гипотеза Траверса может рассматриваться как развитие «сканирующей модели» работы LCR [Herendeen et. al., 1992; Tuan et. al., 1992]. Эта модель предполагает, что LCR служит местом сборки активаторного комплекса, сигнал от которого неким образом распространяется в сторону промоторов глобиновых генов. Траверс предложил конкретный механизм распространения активирующего сигнала. Подобно «flip-flop» модели сканирующая модель может объяснить важность порядка расположения в домене генов, работа которых находится под контролем LCR. Предпочтительно транскрибируется первый ген, с которым сталкивается на своем пути от LCR РНК-полимераза II. Но и эта модель не объясняет, каким образом осуществляется переключение работы глобиновых генов в ходе развития. Для инактивации эмбриональных генов в клетках взрослого организма должен существовать дополнительный механизм. Следовательно, «сканирующая» модель не полностью соответствует экспериментальным данным, по крайней мере, не в случае домена бета-глобиновых генов. Однако активация хроматиновых доменов посредством LCR в эктопических сайтах может происходить с помощью вышеописанного механизма. Смысл заключается в том, что функцией LCR является доставка транскрипционных факторов к нужному сайту. Это становится возможным вследствие высокой концентрации сайтов связывания для большого количества факторов (в пределах LCR). Важное значение высокой концентрации участков узнавания транскрипционных факторов в области LCR подтверждается двумя группами экспериментальных данных. Во-первых, было показано, что функция частично поврежденного LCR в эктопической прецентромерной позиции может быть компенсирована посредством суперэкспрессии таких транскрипционных факторов как EKLF или Spl [Grosveld, 1999; McMorrow et. al., 2000]. Во-вторых, конструкции, содержащие единственный участок гиперчувствительности (HSS 2), примыкающий к репортерному гену, обеспечивает позиционно-независимую экспрессию этого гена в эктопических сайтах, но только в случае множественной интеграции, то есть когда имеет место высокая локальная концентрация сайтов связывания транскрипционных факторов. Косвенно эта гипотеза подтверждается и тем фактом, что не было обнаружено ни одного особого транскрипционного фактора, связывающегося исключительно с LCR. Таким образом, нет оснований предполагать, что механизм работы этого регуляторного элемента должен принципиально отличаться от механизма работы обычного энхансера или тканеспецифичного энхансерно-промоторного блока.

Как уже было сказано ранее, бета-глобиновый локус млекопитающих может быть разделен на субдомены, регулируемые в процессе развития. На основе чувствительности к ДНКазе I в бета-глобиновом локусе человека можно выделить минимум три субдомена: LCR-субдомен, эмбрионально-фетальный и взрослый субдомены. LCR-субдомен находится в чувствительной к ДНКазе I хроматиновой конфигурации на протяжении всех эритроидных стадий развития, в то время как эмбрионально-фетальный и взрослый субдомены обнаруживают повышенную чувствительность к ДНКазе I только на эмбриональной, фетальной и взрослой стадиях соответственно. Примечательно то, что повышенная чувствительность к ДНКазе этих субдоменов коррелирует с появлением межгенных транскриптов, которые могут быть необходимы для активации субдоменов в соответствии с гипотезой Траверса. Лучшим подтверждением этого предположения является то, что делеция, которая включает сайт начала транскрипции межгенного транскрипта взрослого субдомена, приводит к исчезновению межгенной транскрипции и повышенной чувствительности к ДНКазе всего субдомена, равно как и к прекращению транскрипции находящихся внутри этого субдомена глобиновых генов [Gribnau et. al., 2000]. Таким образом, есть веские основания полагать, что «межгенная» транскрипция действительно нужна для «открывания» хроматинового домена [Engel et. al., 2000]. В соответствии с обсуждаемой моделью, транскрипция и открытая конформация LCR необходимы на всех стадиях развития для взаимодействия между LCR и эмбрионально-фетальным или взрослым субдоменами в течение определенной стадии, когда этот субдомен транскрибируется.

В дополнение к хроматиновым субдоменам, выделенным на основе чувствительности к ДНКазе, в бета-глобиновых локусах можно обнаружить различия в уровнях ацетилирования гистонов [Forsberg et. al., 2000; Forsberg et. al., 2001]. При этом области гиперацетилирования фактически колокализуются с областями предпочтительной чувствительности к ДНКазе I. При Испанской делеции уровень ацетилирования гистонов в домене бета-глобиновых генов резко снижается. Напротив, повышается уровень метилирования гистонов по ряду специфических позиций (например, К9 в гистоне НЗ), что приводит к переходу домена в более компактную конфигурацию.

III. ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМНЫХ ДОМЕНОВ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Юдинкова, Елена Станиславовна

выводы

1. Разработан новый способ картирования геномных доменов открытого типа, основанный на характеристике распределения тканеспецифических участков гиперчувствительности к ДНКазе I.

2. Показано, что домен альфа-глобиновых генов кур находится на границе двух изохор, между которыми располагается нестабильная последовательность ДНК.

3. Продемонстрировано, что одной из важных характеристик нестабильных последовательностей ДНК в эукариотическом геноме является присутствие в их составе фазированных дипуклеотидов TG/CA, приводящих к скручиванию двойной спирали ДНК.

4. Обнаружен новый ген, который расположен в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов и транскрибируется в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов.

5. Продемонстрировано, что в эритроидных клетках весь кластер альфа-глобиновых генов и протяженная 5'-концевая область транскрибируются в составе полнодоменного транскрипта в направлении транскрипции глобиновых генов. Показано, что полнодоменная транскрипционная единица начинается в области расположения LCR-подобного позитивного эритроидспецифичпого регуляторного элемента.

6. Продемонстрировано, что в регуляции экспрессии домена альфа-глобиновых генов кур участвуют две группы негативных регуляторных элементов, расположенных в 5'-концевой области домена.

7. Продемонстрировано, что будучи помещенной перед промотором aD-reHa, метилированная последовательность ДНК CpG-островка из домена альфа-глобиновых генов кур, существенно подавляет активность этого промотора даже в том случае, когда сам промотор не метилирован.

8. Разработан новый метод изучения пространственной организации геномных доменов, основанный на гибридизации прилежащей к ядерному матриксу ДНК с олигонуклеотидными матрицами. С использованием этого метода изучена пространственная организация домена альфа-глобиновых генов кур.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Юдинкова, Елена Станиславовна, Москва

1. Abbott, D., Ivanova, V., Wang, X., Bonner, W., Ausio, J. (2001) Characterization of the stability and folding of H2A.Z chromatin particles: implications for transcriptional activation. J Biol Chem 276,41945-41949.

2. Adolph K. (2001) Relationship of transcription of Drosophila melanogaster gene CGI 1327 and the gene for a thrombospondin homologue (DTSP). DNA seq 12, 273-279.

3. Aelen, J., Opstelsten, R., Wanka, F. (1983) Organization of DNA replication in Physarum polycephalum. Attachment of origins of replication and replication forks to the nuclear matrix. Nucl Acids Res 11,1181-1195.

4. Alevy, M., Tsai, M., O'Malley, B. (1984) DNase I sensitive domain of the gene coding for the glycolitic enzyme GAPDH. Diochem 23,2309-14.

5. Anguita, E., Johnson, C., Wood, W., Turner, В., Higgs, D. (2001) Identification of a conserved erythroid specific domain of histone acetylation across the alpha-globin gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA 98, 12114-12119.

6. Antequera, F., Bird, A. (1999) CpG islands as genomic footprints of promoters that are associated with replication origins. Curr Biol 9, 661-667.

7. Aota, S.-I., Ikemura, T. (1986) Diversity in G+C content at the third position of codons in vertebrate genes and its cause. Nucleic Acids Res 14, 6345-6355.

8. Ariel, M., McCarrey, J., Cedar, H. (1991) Methylation patterns of testis specific genes. Proc Natl Acad Sci USA 88, 2317-2321.

9. Ashe, H., Monks, J., Wijgerde, M., Fraser, P., Proudfoot, N. (1997) Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev 11, 24942509.

10. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R., Moore, D. (1989) Current protocols on molecular biology.

11. Bazett-Jones, D., Mendez, E., Czarnota, G., Ottensmeyer, F., Allfrey, V. (1996) Visualization and analysis of unfolded nucleosomes associated with transcribing chromatin. Nucleic Acids Res 24,321-329.

12. Basler, J., Hastie, N., Pietras, D., Matsui, S., Sandgerg, A., Berezney, R. (1981) Hybridization of nuclear matrix attached deoxyribonucleic acid fragments. Biochemistry 20, 6921-6929.

13. Bell, A., West, A., Felsenfeld, G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer-blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98, 387-96.

14. Bell, A., Felsenfeld, G. (2000) Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 405,482-485.

15. Bell, A., Felsenfeld, G. (1999) Stopped at the border: boundaries and insulators. Curr OpinGen Dev 9,191-198.

16. Berg, D. (1985) Mechanisms of transposition in bacteria. Basic Life Sci 30, 33-44.

17. Bernardi, G., Olofsson, В., Filipski, J., Zerial, M„ Salinas, J., Cuny, G., Meunier-Rotival, M., Rodier, F. (1985) The mosaic genome of warm-blooded vertebrates. Science 228, 953-958.

18. Bernardi, G., Mouchiroud, D., Gautier, C., Bernardi, G. (1988) Compositional patterns in vertebrate genomes: Conservation and change in evolution. JMol Evol 28, 7-18.

19. Bernardi, G. (2000) Isochores and the evolutionary genomics of vertebrate. Gene 241, 3-17.

20. Beug, H., Doederlein, G., Freudenstrein, C., Craf, T. (1979) Erythroblast cell lines transformed by a temperature sensitive mutant of avian erythroblastosis virus. A model system to study erythroid differentiation in vitro. J Cell Physiol 1,195-207.

21. Beug, H., Palmieri, S., Freudenstein, C., Zentgraf, H., Graf, T. (1982) Hormone-dependent terminal differentiation in vitro of chicken erythroleukemia cells transformed by ts mutants of avian erythroblastosis virus. Cell 28, 907-919.

22. Bickmore, W., Oghene, K. (1996) Visualizing the spatial relationships between defined DNA sequences and the axial region of extracted metaphase chromosomes. Cell 84, 95104.

23. Bird, A. (1986) CpG-rich island and the function of DNA methylation. Nature 321,209213

24. Bird, A., Taggard, M., Nicholls, R., Higgs, D. (1987) Non-methylated CpG-rich island at the human alpha-globin locus: implication for evolution of the alpha-globin pseudogene. EMBO J 6, 999-1004.

25. Bode, J., Schlake, Т., Rios-Ramirez, M., Mielke, C., Stengert, M., Kay, V., Klehr-Wirth, D. (1995) Scaffold/matrix-attached regions: Structural properties creating transcriptionally active loci. Int Rev Cytol 162A, 389-454.

26. Bodnar, J. (1988) A domain model for eukaryotic DNA organization: a molecular basis for the cell differentiation and chromosome evolution. J Theor Biol 132,479-507

27. Bonifer, C., Huber, M., Faust, N., Sippel, A. (1996) Regulation of the chicken lysozyme locus in transgenic mice. Crit Rev Eukar Gene Expr 6, 285-297.

28. Borunova, V., Iarovaia, O., Vassetzky, Y., Razin, S. (2005). The upstream area of the chicken alpha-globin gene domain is transcribed in both directions in the same cells. FEBS Lett 579,4746-4750.

29. Bowen, N., Fujita, N., Kajita, M., Wade, P. (2004). Mi-2/NuRD: multiple complexes for many purposes. Biochim Biophys Acta 1677, 52-57.

30. Brandeis, M., Frank, D., Keshet, I., Siegfied, Z., Mendelsohn, M., Nemes, A., Temper, V., Razin, A., Cedar, H. (1994) Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature 371, 435-438.

31. Brickner, H., Zhu, X., Atweh, G. (1991) A novel regulatory element of the human a-globin gene responcible for its constitutive expression. J Biol Chem 55, 15363-15368.

32. Broders, F., Scherrer, K. (1987) Transcription of the a-globin gene domain in normal and AEV-transformed chicken erythroblasts: mapping of giant globin-specific RNA including embryonic and adult gene. Mol Gen Genet 209,210-220.

33. Broders, F., Zahraoui, A., Scherrer, K. (1990) The chicken a-globin gene domain is transcribed into a 17-kilobase polycistronic RNA. Proc Natl Acad Sci USA 87, 503-507.

34. Buhrmester, H., von Kries, J., Stratling, W. (1995) Nuclear matrix protein ARBP recognizes a novel DNA sequence motif with high affinity. Biochemistry 34,4108-4117.

35. Buongiorno-Nardelli, M., Gioacchino, M., Carri, M., МагШеу, M. (1982) A relationship between replicon size and supercoiled loop domains in the eukaryotic genome. Nature 298,100-102.

36. Burch, J., Davis, D., Haas, N. (1993) Chicken repeat 1 element contain a pol-like open reading frame and belong to the non-long terminal repeat class of retrotraspozons. Proc Natl Acad Sci USA 90 , 8199-8203.

37. Burgess-Beusse, В., Farrel, C., Gasziner, M., Litt, M., Mutskov, V., Recillas-Targa, F. (2002) The insulation of of genes from external enchancer and silencing chromatin. Proc Natl Acad Sci USA 99 , 16433-16437.

38. Chakravarthy, S., Bao, Y., Roberts, V., Tremethick, D„ Luger, K. (2004) Structural characterization of histone H2A variants. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 69, 227234.

39. Chen, S., Corces, V. (2001) The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner. Genetics 159, 1649-1658.

40. Choi, О., Engel, J. (1986) A 3' enhancer is required for temporal and tissue-specific transcriptional activation of the chicken adult P-globin gene. Nature 323, 731-734.

41. Chong, S., Riggs, A., Bonifer, C. (2002) The chicken lysozyme chromatin domain contains a second, widely expressed gene. Nucl Acids Res 30, 463-467.

42. Chung, J., Whiteley, M., Felsenfeld, G. (1993) A 5'-element of the chicken p-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effects in Drosophila. Cell 74,505-14.

43. Chung, J., Bell, A., Felsenfeld, G. (1997) Characterization of the chicken P-globin insulator. Proc Natl Acad Sci USA 94, 575-580.

44. Ciejek, E., Tsai, M., O'Malley, B. (1983) Actively transcribed genes are associated with the nuclear matrix. Nature 306, 607-609.

45. Cockerill, P., Garrard, W. (1986) Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the nenhancer in a region containing topoisomerase II sites. Cell 44,273-282.

46. Cockerill, P., Yuen, M., Garrard, W. (1987) The enhancer of the immunoglobulin heavy chain locus is flanked by presumptive chromosomal loop anchorage elements. J Biol Chem 262, 5394-5397.

47. Cook, P., Brazell, I. (1980) Mapping sequences in loops of nuclear DNA by their progressive detachment from the nuclear cage. Nucl Acids Res 8,2895-2907.

48. Cosgrove, M., Wolberger, C. (2005) How does the histone code work? Biochem Cell Biol 83,468-476.

49. Craddock, C., Vyas, P., Sharpe, J., Ayyub, H., Wood, W., Higgs, D. (1995) Contrasting effects of alpha and beta globin regulatory elements on chromatin structure may be related to their different chromosomal environments. EMBOJ14, 1718-1726.

50. Craig, J., Bickmore, W. (1993) Chromosome bands flavours to savours. Bioessays 15, 349-354.

51. Cremer, Т., Cremer, С. (2001) Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet 2, 292-301.

52. Cross, S., Brid, A. (1995) CpG islands and genes. Curr Opin Genet Dev 5, 309-314.

53. Curtin, P., Pirastu, M., Kan, Y., Gorbert-Jones, J., Stephens, A., Lehmann, H. (1985) A distant gene deletion affects beta-globin gene function in an atypical gamma delta beta-thalassemia J. Clin Invest 76, 1554-1558.

54. Czarnota, G., Bazett-Jones, D., Mendez, E., Allfrey, V., Ottensmeyer, F. (1997) High resolution microanalysis and three-dimensional nucleosome structure associated with transcribing chromatin. Micron 28,419-431.

55. Davie, J. (1996) Histon modification, chromatin structure and the nuclear matrix. J Cell Biochem 62, 149-157.

56. Davie, J., Moniwa, M. (2000). Control of chromatin remodeling. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 10, 303-325.58. de la Cruz, X., Lois, S., Sanchez-Molina, S., Martinez-Balbas, M. (2005) Do protein motifs read the histone code? Bioessays 27,164-175.

57. Dillon, N. Grossveld, F. (1993) Transcriptional regulation of multigene loci: multilevel control. Trends Genet 9,134-137.

58. Dillon, N., Sabbatini, P. (2000) Functional gene expression domains: defining the functional units of eukaryotic gene regulation. BioEssays 22, 657-665.

59. Dodgson, J., McCune, K., Rusling, D., Krust, A., Engel, J. (1981) Adult chicken alpha-globin genes aA and aD: no anemic shock a-globin exist in domestic chickens. Proc Natl Acad Sci USA 78, 5998-6002.

60. Druin, R., Holmfquist, J., Richer, C. (1994) High-resolution replication bands compared to morphologic G- and R-bands. Adv Hum Genet 22,47-115.

61. Eberharter, A., Becker, P. (2004). ATP-dependent nucleosome remodelling: factors and functions. J Cell Sci 117, 3707-3711.

62. Engel, J., Dodgson, J. (1980) Analysis of the closely linked adult chicken alpha-globin genes in recombinant DNAs. Proc Natl AcadSci USA 77,2596-2600.

63. Engel, N., West, A., Felsenfeld, G., Bartolomei, M. (2004) Antagonism between DNA hypermethylation and enchancer-blocking activity at the HI9 DMD is uncovered by CpG mutation. Nat Genet 36, 883-888.

64. Evans, Т., Reitman, M., Felsenfeld, G. (1988) An erythrosyte-specific DNA-binding factor recognized sequence common to all chicken globin genes. Proc Natl Acad Sci USA 85, 5976-5980.

65. Farrell, C., West, A., Felsenfeld, G. (2002) Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human P-globin loci. Mol Cell Biol 22, 3820-3831.

66. Farache, G., Razin, S., Recillas-Targa, F., Scherrer, K. (1990) Organization of the 3'-boundary of the chicken a-globin gene domain and characterization of a CR1 specific protein binding site. Nucl Acids Res 18,401-409.

67. Faurholm, В., Millar, R., Katz, A. (2001) The genes encoding the type II gonadotropin-releasing hormone receptor and the ribonucleoprotein RBM8A in humans overlap in two genomic loci. Genomics 78,15-18.

68. Filippova, G., Thienes, C., Penn, В., Cho, D., Hu, Y., Moore, J., Klesert, Т., Lobanenkov, V., Tapscott, S. (2001) CTCF-binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation-sensitive insulator at the DM1 locus. Nat Genet 28, 335-343.

69. Foley, K., Engel, J. (1992) Individual stage selector element mutations lead to reciprocal changes in (3- vs s-globin gene transcription: genetic conformation of promoter competition during globin gene switching. Genes Dev 25, 730-44.

70. Forrester, W., Thompson, C., Elder, J., Groudine, M. (1986) A developmental^ stable chromatin structure in the |3-globin gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA 83,1359-1363.

71. Forsberg, E., Bresnick, E. (2001) Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world. Bioessays 23, 820-30.

72. Fuks, F. (2005). DNA methylation and histone modifications: teaming up to silence genes. Curr Opin Genet Dev 15, 490-495.

73. Gardiner, K. (1995) Human genome organization. Curr Opin Genet Dev 5, 315-322.

74. Gardiner, K. (1996) Base composition and gene distribution: critical patterns in mammalian genome organization. Trends Genet 12, 519-524.

75. Garel, A., Axel, R. (1976) Selective digestion of transcriptionally active ovalbumin genes from oviduct nuclei. Proc Natl Acad Sci USA 73 (11), 3966-70.

76. Garel, A., Zolan, M., Axel, R. (1977) Genes transcribed at diverse rates have a similar conformation in chromatin. Proc Natl Acad Sci USA 74 (11), 4867-71.

77. Gerasimova, Т., Byrd, K., Corses, V. (2000) A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol Cell 6,1025-1035.

78. Geyer, P., Corces, V. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 6, 1865-1873.

79. Geyer, P. (1997) The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr Opin genet Dev 7, 242-248.

80. Gourdon, G., Sharp, J., Higgs, D., Wood, W. (1995) The mouse alpha-globin locus regulatory element. Blood 86, 766-775.

81. Goldman, M. (1988) The chromatin domain as a unit of gene regulation. BioEssays 9, 5055.

82. Grewal, Т., Theisen, M., Borgmeyer, U., Sippel, A. (1992) The 6.1-kilobase chicken lysozyme enhancer is a multifactorial complex containing several cell-type-specific elements. Mol Cell Biol 12, 2339-50.

83. Gribnau, G., Diderich, K., Pruzina, S., Calzolari, R., Frazcr, P. (2000) Intergenic transcription and developmental remodelling of chromatin subdomains in the human (3 -globin locus. Mol Cell Biol 5, 377-386.

84. Grossveld, F., van Assandelt, G., Greaves, D., Kollias, B. (1987) Position-independent high level expression of human p-globin gene in transgenic mice. Cell 51,975-985.

85. Grunstein, M. (1997) Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389, 349-352.

86. Haigh, L., Owens, В., Hellewel, O., Ingram, V. (1982) DNA methylation in chicken alpha-globin gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 79, 5332-5336.

87. Hardison, R., Slightom, J., Grimicio, D., Goodman, M., Stojanovich, N., Miller, W. (1997) Locus control regions of mammalian P-globin gene clusters: combiningphylogenetic analyses and experimental result to gain functional insights. Gene 205,7394.

88. Harendza, S., Pollock, A., Mertens, P., Lovett, H. (1995) Tissue-specific enhancer-promoter interactions regulate high level constitutive expression of matrix metalloproteinase 2 by glomerular mesangial cells. J Biol Chem 270, 18786-18796.

89. Havas, K., Whitehouse, I., Owen-Hughes, T. (2001). ATP-dependent chromatin remodeling activities. Cell Mol Life Sci 58, 673-682.

90. Hebbes, Т., Clayton, A., Thorne, A., Crane-Robinson, C. (1994) Core histon hyperacetilation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBOJ 13,1823-30.

91. Henikoff, S., McKittrick, E., Ahmad, K. (2004) Epigenetics, histone H3 variants, and the inheritance of chromatin states. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 69,235-243.

92. Hesse, J. (1986) Regulated gene expression in transfected primary chicken erythrocytes. Proc Natl Acad Sci US A 83,4312-6.

93. Higgs D. R., Wood W. G., Jarman A. P., Sharpe J., Lida J., Pretorius I.-M., and Ayyub H. (1990). A major positive regulatory region located far upstream of the human a-globin gene locus. Genes Dev. 4, 1588-1601.

94. Holmgren, C., Kanduri, C., Dell, G., Ward, A., Mukhopadhya, R., Kanduri, M.,1.banenkov, V., Ohlsson, R. (2001) CpG methylation regulates the Igf2/H19 insulator. Curr Biol 11,1128-1130.

95. Holmquist, G. (1989) Evkolution of chromosome bands: molecular ecology of noncoding DNA. J Mol Evol 28,469-486.

96. Holmquist, G. (1992) Chromosome bands, their chromatin flavors, and their functional features. Am J Hum Genet 51, 17-37.

97. Iarovaia, O., Razin, S., Scherrer, K. (2001) In chicken leukemia cells globin genes are fully transcribed but their mas are retained in the perinucleolar area Exp Cell Res 270, 159-65.

98. Iarovaia, O., Shkumatov, P., Razin, S. (2004a) Breakpoint cluster regions of the AML-1 and ETO genes contain MAR elements and are preferentially associated with the nuclear matrix in proliferating HEL cells. J Cell Sci 117, 4583-4590.

99. Iarovaia, O., Bystritskiy, A., Ravcheev, D., Hancock, R., Razin, S. (2004b) Visualization of individual DNA loops and a map of loop-domains in the human dystrophin gene. Nucl Acids Res 32, 2079-2086.

100. Igarashi, K., Kataoka, K., Itoh, K., Hayashi, N., Nishizawa, M., Yamamoto, M. (1994) Regulation of transcription by dimerization of erythroid factor NF-E2 p45 with small Maf proteins. Nature 367, 568-572.

101. Igarashi, K., Kataoka, K., Itoh, K., Motobashi, II., Hayashi, N., Matuzaki, Y., Nakauchi, H., Nishizawa, M., Yamamoto, M. (1995) Activity and expression of murine small maf family protein mafK. J Biol Chem 270, 7615-7624.

102. Imaizumi, M.-T., Diggelmann, H., Scherrer, K. (1973) Demonstration of Globin Messenger Sequences in Giant Nuclear Precursors of Messenger RNA of Avian Erythroblasts. Proc Natl Acad Sci USA1Q, 1122-1126.

103. Imhof, A. (2003) Histone modifications: an assembly line for active chromatin? Curr Biol 13, 22-24.

104. Ioudinkova, E., Iarovaia, O., Scherrer, K., Razin, S. (2001) Regulation of globin genes expression: New findings made with the chicken domain of alpha globin genes. Gene Ther Mol Biol 6,149-157.

105. Ioudinkova, E, Petrov, A., Razin, S., Vassetzky, Y. (2005) Mapping long-range chromatin organization within the chicken alpha-globin gene domain using oligonucleotide DNA arrays. Genomics 85,143-151.

106. Ioudinkova, E., Razin, S., Borunova, V., de Conto, F., Rynditch, A., Scherrer, K. (2005) RNA-dependent nuclear matrix contains 33 kb globin full domain transcript as well as prosomes but no 26S proteasomes. J Cell Biochem 94, 529-539.

107. Jackson, D., McCready, S., Cook, P. (1981) RNA is synthesized at the nuclear cage. Nature 292, 552-555.

108. Jackson, D., Dickinson, P., Cook, P. (1990) The size of chromatin loops in HeLa cells. EMBOJ 9, 567-571.

109. James-Pederson, M., Yost, M., Shewchuk, Т., Miller, R., Ilardison, R. (1995) Flanking and intragenic sequences regulating the expression of the rabit alpha-globin gene. J Biol Chem 270, 3965-3973.

110. Jantzen, K., Fritton, H., Igo-Klemenes, T. (1986) The DNase I sensitive domain of the chicken lysozyme gene spans 24kb. Nucl Acids Res 14, 6085-99.

111. Jarman, A., Wood, W., Sharpe, J., Gourdon, G., Ayyub, H., Higgs, D. (1991) Characterization of the major regulatory element upstream of the human alpha-globin gene cluster. Mol Cell Biol 11,4679-4689.

112. Jonson, K., Grass, J., Park, C., Im, H., Ghoi, K., Bresnick, E. (2003) Higly restricted localization of RNA polymerase II within a LCR of a tissue-specific chromatin domain. Mol Cell Biol 23,6484-6493.

113. Jurka, J., Klonowski, P., Trifonov, E. (1998) Mammalian retroposons integrate at kinkable DNA sites. J Biomol Struct Dynam 15, 717-721.

114. Kajikawa, M., Tanaka, N., Okada, N. (2004) Isolation and characterization of active LINEs and SINEs from Eel. Mol Biol and Evolution 22, 673-682.

115. Kellum, R., Schedl, P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64,941-950.

116. Kellum, R., Schedl, P. (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in an enchancer-blocking assay. Mol Cel Biol 12,2424-2431.

117. Keplinger, В., Guo, X., Quine, J., Feng, Y., Cavener, D. (2001) Complex organization of promoter and enhancer elements regulate the tissue-and developmental stage-specific expression of the Drosophila melanogaster Gld gene. Genetics 157, 699-716.

118. Kielman, M., Smits, R., Devi, Т., Fodde, R., Bernini, L. (1993) Homology of a 130-kb region enclosing the a -globin gene cluster, the a-locus controling region, the two non-globin genes in human and mouse. Mammalian Genome 4, 314-323.

119. Kielman, M., Smits, R., Bernini, L. (1994) Localisation and characterization of the mouse a -globin gene locus control region. Genomics 21, 431-433.

120. Kioussis, D., Vanin, E., de Lange, Т., Flavell, R., Grossveld, F. (1983) p-globin gene inactivation by DNA translocation in yP thalassemia Nature 306, 662-666.

121. Knezetic, J., Felsenfeld, G. (1989) Identification and characterization of a chicken a-globin enhancer. Mol Cell Biol 9, 893-901.

122. Knezetic, J., Felsenfeld, G. (1993) Mechanism of developmental regulation of a", the chicken embryonic a-globin gene. Mol Cell Biol 13,4632-4639.

123. Knoll, В., Woo, S., Beattie, W., O'Malley, B. (1981) Identification and sequence analisis of 5' domain of the X and Y pseudo-ovalbumin genes. J Biol Chem 256, 7949-53.

124. Krajewski, W., Becker, P. (1998) Reconstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterized by high conformational flexibility of nucleosomal DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95, 1540-1545.

125. Labrador, M., Corces V. (2002) Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization. Cell 111, 151-154.

126. Latt, S. (1976) Optical studies of metaphase chromosome organization. Annu Rev Biophys Bioeng 5, 1 -37.

127. Lawson, G., Knoll, В., March, C., Woo, S., Tsai, M„ O'Malley, B. (1982) Definition of 5' and 3' structural boundaries of the chromatin domain containing the ovalbumin multigene family. J Biol Chem 257, 1501-7.

128. Levy-Wilson, В., Kuehl, L., Dixon, G. (1980) The release of high mobility group protein H6 and protamin gene sequences upon selective DNase I degradation of trout testis chromatin. Nucleic Acids Res 8, 2859-69.

129. Lewis, W., Lee, J., Dodgson, B. (1991) Adult chicken alpha-globin gene expression in transfected QT6 quail cells: evidence for a negative regulatory element in the aD gene region. Nucleic Acids Res 19, 5321-5329

130. Li, X., Noll, M. (1994) Compatibility between enhancers and promoters determines the transcriptional specificity of gooseberry and gooseberry neuro in the Drosophila embryo. EMBOJl3, 400-406.

131. Litt, M., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau M., Felsenfeld, G. (2001) Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBOJ 20, 2224-2235.

132. Litt, M., Simpson, M., Gaszner, M., Allis, C., Felsenfeld, G. (2001) Correlation between histon lysine methylation and developmental changes at the chicken P-globin locus. Science 293,2453-55.

133. Lois, R., Freeman, L., Villeponteau, В., Martinson, H. (1990) Active beta-globin gene transcription occurs in methylated, DNase I-resistant chromatin of nonerythroid chicken cells. Mol Cell Biol 10,16-27.

134. Maniatis, Т., Fritsch, E., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

135. Majumder, P., Cai, H. (2003) The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. Proc Natl Acad Sci USA 100, 5223-5228.

136. Margueron, R., Trojer, P., Reinberg, D. (2005) The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev 15, 163-176.

137. McNamara, P., Bolshoy, A., Trifonov, E., Harrington, R. (1990) Sequence-dependent kinks induced in curved DNA. J Biomol Struct Dynam 8, 529-538.

138. Merli, C., Bergstrom, D., Cygan, J., Blackman, R. (1996) Promoter specificity mediates the independent regulation of neighbouring genes. Genes Dev 10, 1260-1270.

139. Mito, Y., Henikoff, J., Henikoff, S. (2005) Genome-scale profiling of histone H3.3 replacement patterns. Nat Genet 37, 1090-1097.

140. Modin, C., Pedersen, F., Duch, M. (2000) Lack of shielding of primer binding site silencer-mediated repression of an internal promoter in a retrovirus vector by the putative insulators ses, BEAD-1, and HS4. J. Virol 74, 11697-11707.

141. Moreau, J., Marcaud, L., Maschat, F., Lepesant, J., Scherrer, K. (1982) A+T-rich lincers define functional domain in eukaryotic DNA. Nature 295, 260-62.

142. Moss, В., Tompson, E. (1969) Adult fowl haemoglobin and its acetylation. Biochem Biophis Acta 188, 348-350.

143. Motohashi, H., Shavit, A., Igarashi, K., Yamamoto, M., Engel, D. (1997) The world according to Maf. Nucl Acids Res 25,2953-2959.

144. Muller, M., Gerster, Т., Schaffner, W. (1988) Enhancer sequences and the regulation of gene transcription. Eur J Biochem 176,485-495.

145. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E Parshikov, A., Belenkaya, Т., Pirotta, V. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291, 495-498.

146. Nedospasov, S., Georgiev, G. (1980) Non-random cleavage of SV-40 DNA in the compact minichromosome and free in solution by micrococcal nuclease. Biochem Biophis Res Commun 92, 132-139.

147. Ohlsson, R., Renkawitz, R., Lobanenkov, V. (2001) CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet 17, 520-527.

148. Plant, K., Routledge, S., Proudfoot, N. (2001) Intergenic transcription in the human beta-globin cluster. Mol Cell Biol 21,6507-6514.

149. Prioleau, M., Nony, D., Simpson, M., Felsenfeld, G. (1999) An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken P-globin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene. EMBOJ 18,4035-48.

150. Pusarla, R., Bhargava, P. (2005) Histones in functional diversification. Core histone variants. Febs Jill, 5149-5168.

151. Raisner, R., Hartley, P., Meneghini, M., Bao, M., Liu, C., Schreiber, S., Rando, O., Madhani, H. (2005). Histone variant H2A.Z marks the 5' ends of both active and inactive genes in euchromatin. Cell 123, 233-248.

152. Raisner, R., Madhani, H. (2006) Patterning chromatin: form and function for H2A.Z variant nucleosomes. Curr Opin Genet Dev 16, 119-124.

153. Ratsch, A., Joos, S., Kioschis, P., Lichter, P. (2002) Topological organization of the MYC/IGK locus in Burkitt's lymphoma cells assessed by nuclear halo preparations. Exp Cell Res 273,12-20.

154. Razin, S., Mantieva, V., Georgiev, G. (1979) The similarity of DNA sequences remaining bound to scaffold upon nuclease treatment of interphase nuclei and metaphase chromosomes. Nucl Acids Res 7, 1713-1735.

155. Razin, S., Kekelidze, M., Lukanidin, E., Scherrer, K., Georgiev, G. (1986) Replication origin are attached to the nuclear skeleton. Nucl Acids Res 14, 8189-8207.

156. Razin, S. (1987) DNA interaction with the nuclear matrix and spatial organization of replication and transcription. BioEssays 6,19-23.

157. Razin, S., Vassetsky, J., Kvartskhava, A., Grinenko, N., Georgiev, G. (1991) Transcriptional enhancer in the vicinity of replication origin within 5' region of the chicken alpha-globin gene domain. JMol Biol 217, 595-598.

158. Razin, S., Hancock, R., Iarovaia O., Westergaard, O., Gromova, I., Georgiev, G. (1993) Structural-functional organization of chromosomal DNA domain. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58, 25-35.

159. Razin, S., De Moura Gallo, C., Scherrer, K. (1994) Characterization of the chromatin structure in the upstream area of the chicken a-globin gene domain. Mol Gen Genet 242, 649-652.

160. Razin, S. (1996) Functional architecture of chromosomal DNA domain. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 6, 247-269.

161. Razin, S., Farrell, C., Recillas-Targa, F. (2003) Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. Int. Rev. Cytol 226, 63-125.

162. Razin, S., Rynditch, A., Borunova, V., Ioudinkova, E., Smalko, V., Scherrer, K. (2004) The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix. J Cell Biochem 92, 445-57.

163. Recillas-Targa F., De Moura Gallo С. V., Huesca M., Scherrer K., and Marcaud L. (1993). Silencer and enhancer elements located at the З'-side of the chicken and duck a-globin-encoding gene domain. Gene 129, 229-237.

164. Recillas-Targa, F., Bell, A., Felsenfeld, G. (1999) Positional enchancer blocking activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. Proc Natl Acad Sci USA 96,14354-14359.

165. Recillas-Targa, F. (2000) The chicken a- and p- globin gene domains and their chromatin organization. Cell Mol Biol Lett 5,451 -467.

166. Recillas-Targa, F., Razin, S. (2001) Chromatin domains and regulation of gene expression: familiar and enigmatic clusters of chicken globin genes. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 11,227-242.

167. Rein, Т., Zorbas, H., De Pamphilis, M. (1997) Active mammalian replication origins are associated with a high density of mCpG dinucleotides. Mol Cell Biol 17,416-426.

168. Reitman, M., Lee, E., Westphal, H., Felsenfeld, G. (1990) Site-independent expression of the chicken pA-globin gene in transgenic mice. Nature 348, 749-52.

169. Reitman, M., Felsenfeld, G. (1993) Developmental regulation of topo II sites and DNase I hypersensitive sites in the chicken P-globin locus. Mol Cell Biol 10, 2774-86.

170. Reznikoff, W., Bhasin, A., Davies, D., Twining, S. (1999) Tn5: a molecular window on transposition. Biochem Biophys Res Commun 266, 729-734.

171. Rouleau, M., Aubin, R., Poirier, G. (2004) Poly(ADP-ribosyl)ated chromatin domains: access granted. J Cell Sci 117, 815-825.

172. Russel, G., Walker, P., Elton, R., Sharpe, J. (1976) Doublet frequence analysis of fractionated vertebrate nuclear DNA .J Mol Biol 108, 1-23.

173. Rzeszowska-Wolny, J., Razin, S., Puvion, E., Moreau, J., Scherrer, K. (1988) Isolation and characterization of stable nuclear matrix preparations and associated DNA from avian erythroblasts. Biol Cell 64,13-22.

174. Saiton, N., Bell, A., Recillas-Targa, F., West, A., Felsenfeld, G. (2000) Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken P-globin domain. EMBO J 19, 2315-22.

175. Sarma, K., Reinberg, D. (2005) Histone variants meet their match. Nat Rev Mol Cell Biol 6, 139-149.

176. Schultz, S., Shields, G., Steitz, T. (1991) Crystal structure of a CAP-DNA complex: the DNA is bent by 90 degrees. Science 253, 1001-1007.

177. Sharpe, J., Chan-Thomas, P., Lida, J., Ayyub, H., Wood ,W., Higgs, D. (1992) Analysis of the human alpha globin upstream regulatory element (HS-40) in transgenic mice. EMBOJ11,4565-4572.

178. Sharpe, J., Summerhill, R., Vyas, P., Gourdon, G., Higgs, D., Wood, W. (1993) Role of upstream DNase I hypersensitive sites in the regulation of human alpha globin gene expression. Blood 82,1666-1671.

179. Shewchuk, В., Hardison, R. (1997) CpG islands from the alpha-globin gene cluster increase gene expression in an integration-dependent manner. Mol Cell Biol 17, 58565866.

180. Shiio, Y., Eisenman, R. (2003) Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc Natl Acad Sci USA 100,13225-13230.

181. Singal, R., van Wert, J., Ferdinand, L. (2002) Methylation of alpha-type embryonic globin gene alpha pi represses transcription in primary erythroid cells. Blood 100, 4217 — 4222.

182. Sjakste, N., Iarovaia, O., Razin, S., Sjakste, Т., Le Gac, V., Zhao, Z., Scherrer, K. (2000) A novel gene is transcribed in the chicken a-globin gene domain in the direction opposite to the globin genes. Mol Gen Genet 262, 1012-1021.

183. Stalder, J., Larsen, A., Engel, J., Dolan, M., Groudine, M., Weintraub, H. (1980) Tissue-specific DNA cleavages in the globin chromatin domain introduced by DNAase I. Cell 20,451-460.

184. Stumph, E., Kristo, P., Tsai, M., O'Malley, B. (1981) A chicken middle-repetitive DNA sequence which shares homology with mammalian ubiquitous repeats. Nucl Acids Res 9, 5383-5397.

185. Suto, R., Clarkson, M., Tremethick, D., Luger, K. (2000) Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nat Struct Biol 7, 11211124.

186. Tata, G., Baker, В., Deeley, J. (1980) Vitellogenin as a multigene family. Not all Xenopus vitellogenin genes may be in an "expressible" configuration. J Biol Chem 255, 6721-27.

187. Targa, F., de Moura Gallo, C., Huesca, M., Scherrer, K., Marcaud, L. (1993) Silencer and enhanser element located at the 3'- side of chicken and duck alpha-globin-encoding gene domain. Gene 129, 229-237.

188. Theisen, M., Stief, A., Sippel, A. (1986) The lysozyme enhancer: cell-specific activation of the chicken lysozyme gene by a far-upstream DNA element. EMBOJ 5, 719-24.

189. Titus, D. (1991) Promega Protocols and Applications Guide", second edition.

190. Travers, A. (1999) Chromatin modification by DNA tracking. Proc Natl Acad Sci USA 96,13634-13637.

191. Tuan, D., Solomon, W., Li, Q., London, T. (1985) The "(3-like-globin" gene domain in human erythroid cells. Proc Natl Acad Sci USA 82, 6384-6388.

192. Turner, B. (1998) Histone acetylation as an epigenetic determinant of long-term transcriptional competence. Cell Mol Life Sci 54, 21-31.

193. Valadez-Graham, V., Razin, S., Recillas-Targa, F. (2004) CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken alpha-globin gene domain. Nucl Acids Res 32,1354-1362.

194. Verbovaia, L., Razin, S. (1995) Analisis of the replication direction through the domain of alpha-globin encoding genes. Gene 166,255-259.

195. Villeponteau, В., Landes, G., Pankratz, M., Martinson, H. (1982) The chicken beta-globin gene region. Delineation of transcription units and developmental regulation of interspersed DNA repeats. J Biol Chem 257, 11015-23.

196. Vyas, P., Vickers, M., Simmons, D., Ayyub, H., Craddock, C., Higgs, D. (1992) Cis-acting sequences regulating expression of the human a-globin cluster lie within constitutively open chromatin. Cell 69, 781-793.

197. Vyas, P., Vickers, M., Picketts, D., Higgs, D. (1995) Conservation of position and sequence of a novel, widely expressed gene containing the major human alpha-globin regulatory element. Genomics 29, 679-689.

198. Wagener, R., Aszodi, A, Aeschlimann, D, Paulsson, M. (2001) Characterization of the mouse matrilin-4 gene: a 5' antiparallel overlap with the gene encoding the transcription factor RBP-1. Genomics 76, 89-98.

199. Wasylyk, B. (1988) Enhancers and transcription factors in the control of gene expression. Biochim Biophys Acta 951, 17-35

200. Weiner, A. (2000) Do all SINEs lead to LINEs? Nat Genet 24, 332-333.

201. Weintraub, H., Groudine, M. (1976) Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation. Science 193(4256), 848-56

202. West, A., Gaszner, M., Felsenfeld, G. (2002) Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev 16, 271-88.

203. Whitelaw, E., Hogben P., Hanscombe, O., Proudfoot, N. (1989) Transcriptional promiscuity of the human alpha-globin gene. Mol Cell Biol 9,241-251.

204. Wong, G., Passey, D., Yu, J. (2001) Most of the human genome is transcribed. Genome Res 11, 1975-1977.

205. Wu, C., Gilbert, W. (1981) Tissue specific exposure of chromatin structure of the 5'terminus of the rat preproinsulin II gene. Proc Natl Acad Sci USA 78, 1577-1580.

206. Wu, J., Grunstein, M. (2000) 25 years after the nucleosome model: chromatin modifications. Trends Biochem Sci 25, 619-623.

207. Yang, Y., Hu, J., Ulaner, G., Li, Т., Yao, X., Vu, Т., Hoffman, A. (2003) Epigenetic regulation of Igf2/H19 imprinting at CTCF insulator binding sites. J Cell Biochem 90, 1038-1055.

208. Yusufzai, Т., Tagami, H., Nakatani, Y., Felsenfeld, G. (2004) CTCF tethers an insulator to sunuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol Cell 30, 291-298.

209. Yusufzai, Т., Felsenfeld, G. (2004) The 5' HS4 chicken beta - globin insulator is a CTCF - dependent nuclear matrix-accociated element. Proc Natl Acad Sci USA 101, 8620-8624.

210. Zeng, L., Zhou, M. (2002) Bromodomain: an acetyl-lysine binding domain. FEBS Lett 513,124-128.

211. Zhang, Y., Reinberg, D. (2001) Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev 15,2343-2360.

212. Zutter, M., Painter, A., Staatz, W., Tsung, Y. (1995) Regulation of alpha 2 integrin gene expression in cells with megakaryocyte features: a common theme of three necessary elements. Blood 86, 3006-3014.

213. Клочков Д. Б., Юдинкова Е. С. и Разин С. В. (2004). Характеристика сайленсера, расположенного в CpG-богатой области перед кластером а-глобиновых генов кур. Доклады Академии Наук 398, 699-701.

214. Разин, С. (2006) Крупномасштабная организация эукариотического генома и действие эпигенетических механизмов. Генетика 42, 1605-1614.1. БЛАГОДАРНОСТИ

215. Отдельно хочется поблагодарить дирекцию и администрацию Института биологии гена РАН за обеспечение благоприятных условий для научных исследований.