Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение репликационной структуры больших областей генома высших эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение репликационной структуры больших областей генома высших эукариот"

На правах рукописи УДК 576.315.42

РГВ Щ]

2 7 ПН0 ш?

ВЕРБОВАЯ Лиля Витальевна

ИЗУЧЕНИЕ РЕПЛИКАЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ БОЛЬШИХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА ВЫСШИХ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Института биологии гена РАН

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Разин C.B.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Карпов B.J1. кандидат биологических наук Георгиева С.Г.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится " ..." 1997

года в " .___." часов на заседании Диссертационного совета

Д.2 00.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельтардта РАН

Автореферат разослан

»!

п

декабря 1996 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета

канд.фарм.наук

Грабовская Л.С,

Актуальность темы

Познание механизмов, контролирующих инициацию репликации ДНК в клетках высших эукариот, составляет одну из центральных задач современной молекулярной биологии. Быстрый прогресс в изучении участков начала репликации низших эукариот был предопределен установлением того факта, что определенный класс последовательностей ДНК способен поддерживать автономную репликацию плазмид в этих клетках. Эти последовательности (АКЭ-элементы) во многих случаях работают в качестве участков начала репликации и в хромосомах низших эукариот. К сожалению, данный экспериментальный подход не удалось применить для изучения участков начала репликации высших эукариот. Несмотря на многочисленные попытки идентифицировать последовательности ДНК способные поддерживать стабильную автономную репликацию ДНК в клетках млекопитающих и других высших эукариот, таких последовательностей обнаружено не было (за исключением последовательностей ДНК гомологичных участкам начала репликации ряда вирусов). В этой связи наиболее перспективным подходом для изучения участков начала репликации высших эукариот является картирование их позиций в охарактеризованных областях генома и последующее изучение функциональных элементов ДНК, локализованных в области инициации репликации. Изучение репликационной структуры тех или иных областей генома (т.е. картирование границ репликонов и участков начала репликации) представляется важным и для анализа ряда проблем, связанных с зависимостью времени

/

*

репликации геномных доменов от их транскрипционного статуса.

В настоящее время разработано несколько методов картирования участков начала репликации в охарактеризованных областях генома высших эукариот, таких, например, как анализ полярности синтеза лидирующих и отстающих цепей ДНК, анализ относительной представленности различных проб в препаратах коротких цепей новосинтезированной ДНК, и анализ направления движения репликативных вилок посредством различных элекрофоретических методов. Большинство из перечисленных выше процедур требуют предварительной синхронизации клеточной культуры. Кроме того они, как правило, позволяют проанализировать достаточно небольшую область генома. Исключением является лишь метод определения полярности синтеза лидирующих цепей ДНК. Этот метод в принципе может быть применен для анализа больших областей генома, не требует предварительной синхронизации клеточной культуры, и позволяет установить позиции как участков начала, так и участков терминации репликации, т. е. картировать организацию репликонов. в больших областях генома. Широкое применение данной процедуры для анализа репликационной структуры больших областей генома осложнялось однако необходимостью приготовления посредством трудоемких генно-инженерных манипуляций большого числа специальных проб, специфичных в отношении комплементарных цепей ДНК. В этой связи несомненной представляется актуальность темы настоящей

а

диссертационной работы, в которой предложена модификация метода анализа полярности синтеза лидирующих цепей ДНК, значительно упростившая этот метод и впервые позволившая проанализировать репликационную структуру неамплифицированной области генома человека, имеющей протяженность более 2000000 п.н. и содержащей самый длинный из охарактеризованных генов - ген мышечной дистрофии Дюшенна. Сравнительный анализ репликационной структуры гена мышечной дистрофии в различных клеточных линиях, в том числе в клеточных линиях, содержащих перестроенные варианты этого гена позволит проанализировать взаимосвязь между репликационной структурой этого гена и топографией хромосомных перестроек, часто происходящих внутри данного гена.

Цели и задачи работы

Целью данной работы явились разработка модифиикации метода определения направления синтеза лидирующих цепей ДНК, которая позволила бы использовать данный метод для анализа репликационной структуры больших областей генома, и картирование с помощью данной процедуры топографии репликонов в протяженной (2000 т.п.н.) области генома человека, включающей ген мышечной дистрофии Дюшенна. Для -достижения данной цели нами были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:

1. Подобрать условия, обеспечивающие возможность использования коротких синтетических олигонуклеотидов в качестве специфичных в отношении цепей ДНК проб для

а

\

количественного анализа соотносительной представленности различных уникальных последовательностей в препаратах новосинтезированной ДНК.

2. Проверить возможность использования олигонуклеотидных проб для анализа полярности синтеза лидирующих цепей ДНК посредством картирования участка начала репликации в участке генома, репликационная структура которого была изучена ранее с помощью иных эксперементальных подходов.

3. Охарактеризовать топографию репликонов в границах гена мышечной дистрофии с использованием олигонуклеотидных проб, синтезированных на основании известной нуклеотидной последовательности экзонов этого гена.

Научная новизна и практическое значение работы.

Разработана модификация метода определения полярности синтеза лидирующих цепей ДНК, позволяющая использовать данный метод для изучения репликационной структуры частично охарактеризованных больших областей генома без их предварительного клонирования и субклонирования. Данная процедура может найти широкое применение при изучении комплекса проблем, связанных со структурно-функциональной организацией эукариотического генома, взаимозависимостью транскрипционного и репликационного статуса доменов эукариотического генома и механизмами хромосомных перестроек.

/у

Охарактеризована топография репликонов в наиболее протяженном из известных человеческих генов - гене мышечной дистрофии Дюшенна. Впервые продемонстрировано, что один ген может быть организован в несколько репликонов. Впервые продемонстрировано, что в клетках высших эукариот репликоны могут быть ассиметричными. Картирование топографии репликонов в гене мышечной дистрофии Дюшенна представляется весьма важным для изучения механизмов хромосомных перестроек, часто происходящих в границах этого гена и приводящих к тяжелым наследственным заболеваниям человека.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы представлялись на Гордоновской конференции, посвященной ядерным белкам, структуре хроматина и регуляции транскрипции (США, 1996), а также на научных семинарах в Институте им. Ж. Моно (Франция, 1996), Университете г. Гамбург (Германия, 1996), Университете г. Сан-Луис (США, 1996) и Национальном Институте Здоровья (США, 1996).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 научные статьи.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 2>Ь страницах

машинописного текста и состоит из следующих частей:

■Г

"Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Библиография включает источников. Работа проиллюстрирована /срисунками и Я, таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Картирование участков начала репликации в домене а-глобиновых генов кур посредством анализа асимметричности синтеза лидирующих цепей ДНК.

В настоящий момент наиболее изученным из участков начала репликации ДНК высших эукариот является участок начала репликации, расположенный на расстоянии нескольких тысяч нуклеотидных пар после гена дегидрофолатредуктазы китайского хомячка. Позиция этого участка начала репликации была картирована с использованием практически

1

'всех известных в настоящий момент методических подходов. Универсальность выводов, сделанных с использованием одной, либо ограниченного числа моделей, может, однако, вызывать определенные сомнения. В этой связи важным Представляется картирования позиций других участков начала репликации. Ранее с использованием метода

вытеснения двуспиральных молекул новосинтезированной ДНК

I

из коротких репликационных петель в нашей лаборатории был картирован участок начала репликации домена а-глобиновых ренов кур. В настоящей работе мы представляем результаты картирования позиции того же участка начала репликации,

е

осуществленного посредством анализа полярности синтеза лидирующих цепей новореплицированной ДНК. Метод был первоначально предложен Седером и соавторами. В настоящее время используется модификация первоначальной процедуры, разработанная в лаборатории ДеПамфилиса. В этой лаборатории было продемонстрировано, что в условиях ингибирования синтеза белков эметином избирательно подавляется синтез фрагментов Оказаки, в то время как лидирующие цепи ДНК продолжают синтезироваться. После включения в эти цепи плотностной метки (бромодезоксиуридина) они могут быть очищены с использованием того или иного экспериментального подхода, и полярность синтеза лидирующих цепей может быть установлена посредством гибридизации таких препаратов с парами высокомеченных проб, представляющих последовательности комплементарных цепей ДНК.

В наших экспериментах были использованы перевиваемые эритробласты кур (клеточная линия LSCC, клон Аб). Для внесения метки в суммарную ДНК клетки культивировали в течение 24 часов в среде, содержащей ^С-тимидин. После этого среду меняли на свежую и вносили в нее эметин. После 15 минут инкубации клеток при 37°С в ту же среду вносили бромодезоксиуридин и 3Н -дезоксицитидин. Клетки культивировали в этой среде в течение 16 часов, после чего их осаждали, лизировали и выделяли ДНК. Новосинтезированные цепи выделяли посредством равновесного центрифугирования (Вескшап L70, 40000 об/мин, в течение 12 часов при 18°С) в щелочном градиенте

плотности сульфата цезия (начальная плотность 1,479 г/мл). Профиль разделения новосинтезированной и родительской ДНК показан на рисунке 1.

ФРАКЦИИ ГРАДИЕНТА

Содержание меченой Н3 и С14 ДНК

Рисунок 1. Профиль разделения новосинтезированных и родительских целей ДНК в щелочном градиенте сульфата цезия. Заштрихованная область показывает фракции, использованные в дальнейшей работе.

&

Фракции, содержащие тяжелую ДНК, собирали, как показано на рисунке 1, и дополнительно очищали посредством повторного центрифугирования в тех же условиях. Полученные препараты ДНК использовали для иммобилизации на найлоновых фильтрах. В качестве контроля наряду с образцом тяжелой ДНК на те же фильтры наносили и обрразец тотальной ДНК. Каждый образец содержал 2 мкг анализируемого препарата ДНК.

В качестве гибридизационных зондов использовали два различных фрагмента 5'- концевой области домена а-глобиновых генов кур, клонированных в двух разных ориентация* в векторах тр18 и тр19, являющихся производными фага М13. Позиции проб на карте домена показаны на рисунке 2.

Рисунок 2. Позиции проб "А" и "В" на карте домена а-глобиновых генов кур. Заштрихованные прямоугольники показывают позиции глобиновых генов. Цифрами обозначены

расстояния в тысячах пар оснований. Вертикальными стрелками обозначены только те рестриктные сайты, которые были использовании при клонировании фрагментов А и В (гибридизационных проб). Горизонтальнее стрелки обозначают направление синтеза лидирующих цепей ДНК.

Направления синтеза лидирующих цепей новосинтезированной ДНК, установленные по результатам гибридизации, показаны в нижней части рисунка 2. Участок смены полярности синтеза новосинтезированной ДНК между пробами А и В очевидно является зоной инициации репликации, так как лидирующие цепи ДНК синтезируются в противоположных направлениях, начиная от этого участка. Следует отметить, что именно в этой области участок начала репликации был картирован ранее с использованием метода вытеснения двуспиральных молекул

новосинтезированной ДНК (Razin et al., 1986, Nucl. Acids. Res. т.14, с. 8189). Таким образом, позиция участка начала репликации в этой области подтверждена в настоящее время с помощью двух различных экспериментальных процедур.

Демонстрация возможности использования синтетических олигонуклеотидов в качестве проб, специфичных в отношении комплементарных цепей ДНК при определении направления синтеза лидир/ющихцепей ДНК.

В связи с тем, что клонирование и субклонирование различных фрагментов ДНК из интересующей области генома представляет отдельную эксперименальную задачу и значительно замедляет процедуру картирования участков начала репликации в больших областях генома, мы решили проверить возможность использования синтетических олигонуклеотидов в качестве специфичных в отношении комплементарных цепей ДНК гибридизационных проб для анализа полярности синтеза лидирующих цепей ДНК. В первой серии экспериментов были взяты синтетические двадцатичленные олигонуклеотиды, соответствующие пробам, клонированным в фаге М13. Результаты гибридизаций показали полное соответствие сигналов, регистрируемых при использовании в качестве гибридизационных проб двадцатичленных олигонуклеотидов и достаточно протяженных (300 п.н.) фрагментов ДНК, клонированных в фарах тр18 и тр19. С тем, чтобы исключить возможность неспецифической гибридизации коротких олигонуклеотидов с частично гомологичными последовательностями в исследуемых образцах ДНК нами была проведена серия экспериментов по подбору' условий гибридизации и дополнительных отмывок фильтров. Полученные данные позволили существенно улучшить качество гибридизационных экспериментов и повысить надежность получаемых результатов.

В следующей серии экспериментов была охарактеризована репликационная структура всего домена а-глобиновых генов кур. Для этого было синтезировано восемь пар олигонуклеотидных проб, представляющих

//

последовательности ДНК из позиций достаточно равномерно распределенных вдоль всего домена, включая и его 5'-концевую область (общая длина 25 т.п.н.). Нуклеотидные последовательность проб указаны в таблице I. Карта исследуемого района, позиции проб на данной карте и результаты определения направления синтеза лидирующих цепей ДНК показаны на рисунке 3.

1

0

1

1Л

I_I- и''

п «о «А

■ я я а ■ ■ ■ ■

1 2 3 4 5 6 7 8

-м- --►

10 I

20 _1_

т.п.н. 30 .

Рисунок 3. Стратегия и результаты анализа репликационной структуры домена а-глобиновых генов кур. В верхней части рисунка показана физическая карта домена с позициями участков расщепления ДНК рестриктазой Ват Н1 (вертикальные стрелки). Позиции глобиновых генов показаны белыми прямоугольниками с указанием названий ■ соответствующих генов. Черные квадраты, обозначенные цифрами 1-8 показывают позиции гибридизационных проб. Горизонтальные стрелки показывают направление репликации (направление синтеза ведущей цепи ДНК, определенное

посредством гибридизационных экспериментов). Шкала расстояний приведена в нижней части рисунка.

ТАБЛИЦА I

Олигонуклеотидные пробы, использованные для анализа репликационной структуры домена а-глобиновых генов кур

N нуклеотидная поел. нуклеотидная поел,

(позиция олигонуклеотида из олигонуклеотида из

на карте) верхней цепи нижней цепи

1 ТСТСАССАССТСТСТСГТСС ССААСАСАСАССТССТСАСА

2 ССТСААСАССААСТССАССС СССТССАСГТССТСТТСАСС

3 СССАТТТССАССТСТСССАС СТСССАСАССТСЗАААТССС

4 ССТСССАСТСССАСТАССАС СТССТАСТСССАСГСССАСС

5 СТССССАТСССААСААССТС САССТТСТТСССАТССССАС

6 СТСТССйСТССТСАСААСАА ТТСТТСГСАССАССССАСАС

7 СТСССАССТССТСАСТААСТ АОТТАСТСАбСАССТСССАС

8 ССАССТСАСАТССАТСАТСТ АСАТСАТССАТСТСАССТС

Результаты проведенных экспериментов, схематически представленные на рисунке 3, позволяют утверждать, что направление репликации меняется трижды в пределах домена а-глобиновых генов кур. В позиции 2 обе цепи представлены эквивалентно в препарате новосинтезированной ДНК. В позиции 1 в препарате новосинтезированной ДНК

представлена преимущественно нижняя цепь (т. е. та цепь, которая служит матрицей для синтеза глобиновых м-РНК), а в позиции 2 новосинтезированная ДНК представлена преимущественно верхней цепью. Как уже обсуждалось в предыдущем разделе, эти результаты свидетельствуют о наличии участка начала репликации в позиции 2. Участок домена, включающий собственно глобиновые гены, реплицируется в направлении транскрипции. В позиции 7 направление синтеза снова меняется. В данном случае направления движения репликационных вилок сходятся, что свидетельствует о наличии участка терминации репликации в 1 т.п.н. фрагменте ДНК, расположенным за последним геном домена (и включающем эритроид-специфичный энхансер транскрипции (Knezetic and Felsenfeld, 1989. Mol. Cell. Biol. т. 96 с. 893.))

Картирование участков качала репликации и сайтов терминации гена мышечной дистрофии Дюшенна

С целью получения дополнительной информации о топографии репликационных единиц в ДНК высших эукариот мы охарактеризовали репликационную структуру человеческого гена мышечной дистрофии Дюшенна. Выбор объекта исследования был связан с тем, что этот протяженный (2000 т.п.н.) ген активно изучается и в настоящее время достаточно хорошо охарактеризован. Ген мышечной дистрофии Дюшенна дистрофина находится в коротком плече Х-хромосомы. В настоящее время построены физическая карта сегмента генома, включающего ген

/V

мышечной дистрофии Дюшенна и карта экзон-интронной организации этого гена. Определена первичная последовательность мРНК, кодируемой геном мышечной дистрофии Дющенна. Для нас последовательность этой мРНК представляла хороший источник информации для выбора олигонуклеотидных проб. С целью картирования репликационной структуры гена мышечной дистрофии Дюшенна мы синтезировали 36 пар 20-членных олигонуклеотидных зондов (таблица II). Зонды были синтезированы на основании известных последовательностей экзонов гена мышечной дистрофии с учетом установленных ранее позиций экзонов на карте гена. Приблизительные позиции проб на физической карте гена и результаты определения направления движения репликационных вилок представлены на рисунке 4.

Таблица II

Олигонуклеотидные пробы, использованные для анализа репликационной структуры гена мышечной дистрофии Дюшенна

N нуклеотидная поел,

(позиция олигонуклеотида из на карте) верхней цепи

нуклеотидная поел, олигонуклеотида из нижней цепи

И24 СТТТСАССААСАТбАСАСААТС САТТСТСТСАТСТТССТСАААС

И22(Е1) СТТТСССССТАСАСЗАСТСАС СТСАСГССТСТАСССССАААС

Й12(Е2) САААСАСААСАТСТТСААААС СТТТТСААСАТСТТСТСТТТС

/Г

RI3(ЕЗ) GGCAAGCAGCATATTGAGAAC R7(E7) CTATTTGACTGGAATAGTGTG R2(E8) CCTATCCAGATAAGAAGTCC R14(Ell)GTACATGATGGATTTGACAGC 87-1 CTATCATGCCTTTGACATTCCA 87-15 ATAATTCTGAATAGTCACA R21(E25)CAATTCAGCCCAGTCTAAAC R25(E27)GCTAAAGAAGAGGCCCAAC E28 GTTTGGGCATGTTGGCATGAG E29 TGCGACATTCAGAGGATAACC

E31 GGCTGCCCAAAGAGTCCTGTC

R16(E33)GTCTGAGTGAAGTGAAGTCTG E35 GAAGGAGACGTTGGTGGAAGA R31(E39)CAACTTACAACAAAGAATCACA R 8 ( E 4 0) GGTAT CAGTACAAGAGGCAG E43 GTCTACAACAAAGCTCAGGTCG E4 4 GACAGATCTGTTGAGAATTGC

R18(E45)CTCCAGGATGGCATTGGCAG R4 (E46) ATTTGTTTTATGGTTGGAGG E4 8 GTTTCCAGAGCTTTACCTGA

E4 9 ACTGAAATAGCAGTTCAAGC E50 GAAGT TAGAAGAT CTGAGCTC E53 CAGAATCAGTGGGATGAAGTA E54 CCAGTGGCAGACAAATGTAG E55 TGAGCGAGAGGCTGCTTTGG R20(E56)GGTGAAATTGAAGCTCACAC E60 ACTTCGAGGAGAAATTGCGC E61 GCCGTCGAGGACCGAGTCAG

GTTCTCAATATGCTGCTTGCC CACACTATTCCAGTCAAATAG GGACTTCTTATCTGGATAGG GCTGTCAAATCCATCATGTAC

TGGAATGTCAAAGGCATGATAG TGTGACTATTCAGAATTAT GTTTAGACTGGGCTGAATTG GTTGGGCCTCTTCTTTAGC CTCATGCCAACATGCCCAAAC GGTTATCCTCTGAATGTCGCA GACAGGACTCTTTGGGCAGCC CAGACT T CACT T CACT С AG AC TCTTCCACCAACGTCTCCTTC TGTGATTCTTTGTTGTAAGTTG CTGCCTCTTGTACTGATACC CGACCTGAGCTTTGTTGTAGAC GCATTTCTCAACAGATCTGTC CTGCCAATGCCATCCTGGAG CCTCCAACCATAAAACAAAT TCAGGTAAAGCTCTGGAAAC GCTTGAACTGCTATTTCAGT GAGCTCAGATCTTCTAACTTC TACTTCATCCC&CTGATTCTG CTACATTTGTCTGCCACTGG CCAAAGCAGCCTCTCGCTCA GTGTGAGCTTCAATTTCACC GCGCAATTTCTCCTCGAAGT CTGACTCGGTCCTCGACGGC

Е64

ACTCCGAAGACTGCAGAAGG

CCTTCTGCAGTCTTCGGAGT

E68

TAAGCCAGAGATTGAAGCGG

CCGCTTCGATCTCTGGCTTA

E70

ACATCAGGAGAAGATGTTCG

CGAACATCTTCTCCTGñTGT

E7 5

CTGCAAGCAGAATATGACCG

CGGTCATATTCTGCTTGCAG

R5 (E7 9) CAGAGTGAGTAATCGGTTGG

CCAACCGATTACTCACTCTG

Рисунок 4. (на следующей странице) Стратегия и результаты анализа репликационной структуры гена мышечной дистрофии Дюшенна. Секции "А" и "Б" показывают первую и вторую половины гена. В верхней части секций "А" и "Б" показана карта экзон-интронной организации гена мышечной дистрофии Дюшенна. Экзоны показаны вертикальными линиями. Каждый десятый экзон обозначен соответствующим номером. Расстояния (в тысячах нуклеотидных пар) и позиции мышечного и мозгового промоторов (стрелки) показаны над картой экзон-интронной структуры. Под картой экзон-интронной организации показаны позиции проб (вертикальные линии с указанием названий соответствующих проб; пробы синтезированные на основании нуклеотидной

последовательности экзоно гена мышечной дистрофии Дюшенна обозначены номерами соответствующих экзонов (Е) Остальные пробы обозначены в соответствии с номенклатурой, использованной в работе Коффи и соавторов (Coffey et al. 1992. Genomics т. 12, с. 474)) и результаты определения направления движения репдикативных вилок (горизонтальные стрелки). Примерные позиции участков начала и терминации репликации обозначены соответственно символами orí и term.

Р. МОЗГ, о Р- МЫШ. I

500 т.п.н.

1000 т.п.н.

I

||Щ ч II ...... .............1ИППГТ

10

20

ог/

о г/

30 40

I

±_|_I_III IIII III II I

И24

Е1

Е2

ЕЗ Е7

Е8 Е11 87-1 87-15 Е25 Е28 Е31 Е35 Е40Е43 Е27 Е29 ЕЗЗ ЕЗЭ

1500 Т.П.Н. 2000 Т.П.Н.

I I

♦I I НИ II ' И "НИМ I шн II т-ГЦ

50 60 70

ог] t ОГ7 I ОТ/ Г

Т Г 17 Г ТГ 17 7 ТГ_7 7 Т Т_1_

Е43 Е44 Е45 Е48 Е49Е50Е53Е54 Е55 Е56 Е60 Е61 Е64 Е68 Е70 Е75 Е79

Е46

Рисунок 4

Как показано на рисунке 4, в пределах изучаемого участка Х-хромосомы, включающего ген мышечной"дистрофии Дюшенна происходит 11 изменений направления синтеза лидирующей цепи. Учитывая направления движения репликативных вилок, можно утверждать, что в исследуемой области находится 5 участков инициации и 6 участков терминации репликации. Первый участок терминации репликации локализован между мозговым и мышечным промоторами гена, причем мозговой промотр реплицируется в направлении транскрипции гена (проба Я24), а мышечный промотр (проба К22(Е1}) и экзоны 2 -7 (пробы К12(Е2), Я13(ЕЗ), Ю(Е1)) реплицируются в направлении, противоположном направлению транскрипции. Следующий участок изменения направления синтеза лидирующей цепи ДНК находится между экзонами Е7 и Е8. В этом случае репликативные вилки расходятся. Иными словами, между экзонами Е7 и Е8 находится участок инициации репликации. Рассуждая аналогичным образом, можно прийти к заключению о том, что участки инициации репликации находятся также между парами экзонов Е29 и Е29, Е43 и Е44, Е46 и Е48, и Е64 и Е68. Участки терминации репликации локализованы между экзонами Е41 и Е43, Е44 и Е45, Е48 и Е49, и Е70 и Е75 .

Подводя итог, можно сделать вывод, что ген мышечной дистрофии организован в несколько репликонов. Любопытным представляется то обстоятельство, что не все репликоны, идентифицированные в пределах этого гена, являются симметричными. Протяженные участки гена мышечной

дистрофии Дющенна (экзоны Е1-Е7 и экзоны Е48-Е64) реплицируются в одном направлении. Противоположные плечи соответсвующих репликонов являются существенно более короткими. Заслуживающим внимания является и то обстоятельство, что один из участков терминации репликации находится в интроне 44, т. е. в той же области, где располагается главная "горячая точка" хромосомных перестроек. В литературе неоднократно высказывались предположения о том, что участки терминации репликации могут быть предпочтительными местами хромосомных перестроек. Результаты нашей работы косвенно подтверждают такую точку зрения. Хотелось бы также отметить, что центральная часть гена мышечной дистрофии Дюшенна организована в несколько относительно небольших симметричных репликонов, тогда как концевые домены этого гена реплицируются преимущественно однонаправленно, и длина репликонов в этих областях существенно превышает длину репликона в центральной части гена. Соответственно, можно утверждать, что центральная часть гена должна реплицироваться существенно быстрее, чем концевые области (так как скорость движения репликативных вилок является постоянной во всех областях). В этой связи при репликации гена мышечной дистрофии Дюшенна могут возникать определенные топологические стрессы, что, опять таки, может способствовать возникновению хромосомных перестроек, часто происходящих в границах данного гена.

Выводы

ЛО

1. Разработана модификация метода анализа направления движения репликативных вилок, позволяющая использовать этот метод для анализа топографии репликонов в частично-охарактеризованных протяженных областях генома без их предварительноко клонирования и субклонирования.

2. Охарактеризована репликационная структура домена а-глобиновых генов кур. Подтверждена установленная ранее позиция участка начала репликации и картирован участок терминации репликации.

3. Охарактеризована репликационная структура гена мышечной дистрофии человека. Впервые продемонстрировано, что один ген может быть организован в несколько репликонов. Установлены примерные позиции 5 участков начала репликации и б участков терминации репликации.

и

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вербовая Л.В., Суржик В.В., Светлова Ё.Ю., Разин С.В. Картирование участка начала репликации в домене а-глобиновых генов кур посредством анализа асимметричности синтеза лидирующих цепей ДНК. ДАН, 1994, Т 336, № 3, с. 403-405

2. L.Verbovaia and S.Razin. Analysis of replication derection through the domain of a-globin-encoding chicken genes. Gene, 1995,V 166, p. 255-259

3. Вербовая Л.В., Разин С.В.Ген мышечной дистрофии Дюшенна организован в несколько репликонов. Молекулярная биология, 1996, Т 30, №6, с. 1334-1338