Изучение процессов ремоделирования хроматина и репликации на инсуляторах D. melanogaster

Мазина, Марина Юсуповна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение процессов ремоделирования хроматина и репликации на инсуляторах D. melanogaster
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение процессов ремоделирования хроматина и репликации на инсуляторах D. melanogaster"

На правах рукописи / Ь

Мазина Марина Юсуповна

Изучение процессов ремоделирования хроматина и репликации на инсулягорах О. те1апо£аМег

Специальность 03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 мпО ¿015

Москва 2014

005557859

Работа выполнена в группе по изучению связи транскрипции и транспорта мРНК Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель: Краснов Алексей Николаевич, доктор биологических

наук

Официальные оппоненты: Колесников Александр Александрович, доктор

биологических наук, профессор кафедры молекулярной биологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова; Гарбуз Давид Григорьевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится 10 февраля 2015 года на утреннем заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

http://www.eenebiologv.n^/dissertation/clis^^/M azina-dissertation.pdf Автореферат разослан: » 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета л

кандидат фармацевтических ¿ъЛЛюбовь Сергеевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В последние годы благодаря успехам в развитии технологий секвенирования были получены последовательности геномов многих организмов, картированы гены, определены последовательности белков. На сегодняшний день остаются неразрешенными ряд вопросов: какие механизмы лежат в основе реализации этой первичной генетической информации, как организм регулирует транскрипцию генов, какие регуляторные факторы при этом оказываются задействованными.

Экспрессия белок-кодирующих генов эукариот контролируется на нескольких уровнях: инициация и элонгация транскрипции, процессинг мРНК, трансляция. Однако принято считать, что основной мишенью действия регуляторных факторов является стадия инициации транскрипции (Maston et al., 2006). Значительную роль в регуляции инициации транскрипции играют уис-действующие элементы: промоторы и дистальные регуляторные элементы - энхансеры, сайленсеры, инсуляторы. Исследование этих участков важно как для понимания механизмов, определяющих активность отдельных генов, так и регуляции на уровне всего генома.

Геном эукариот организован в домены, содержащие гены или кластеры генов с различными профилями экспрессии. Функциональные исследования показали, что промоторы генов изолированы от действия негативных или позитивных регуляторных элементов в соседних доменах. Инсуляторы это специфические последовательности ДНК, которые способны защищать гены от влияния регуляторных элементов в соседних локусах (Valenzuela and Kamakaka, 2006).

Белок Su(Hw) является белком с доменом "цинковых пальцев". Он обеспечивает активность ряда хорошо изученных инсуляторов D. melanogaster. 5и(Н\у)-зависимые инсуляторы способны блокировать энхансер-промоторные взаимодействия, а также могут препятствовать распространению неактивной, конденсированной формы хроматина, выполняя барьерную функцию (Georgiev and Kozycina, 1996; Golovnin et al„ 2003; Pai et al., 2004). Ранее в Лаборатории регуляции экспрессии генов ИБГ РАН было показано, что белок ENY2 привлекается белком Su(Hw) в состав инсуляторного комплекса и является необходимым для барьерной активности Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов (Kurshakova, Maksimenko et al., 2007). ENY2 это небольшой белок, который является субъединицей гистонацетилтрансферазного комплекса SAGA D. melanogaster и играет важную роль в регуляции транскрипции (Kurshakova, Krasnov et al., 2007). Комплекс SAGA в свою очередь участвует в модификации гистонов и совместно с комплексами ремоделирования хроматина SWI/SNF принимает участие в формировании открытой структуры хроматина

на промоторах активно-транскрибирующихся генов (Krebs et al., 2011). Была высказана гипотеза, что роль SAGA и SWI/SNF комплексов в поддержании открытой структуры хроматина не ограничена промоторами генов, но и распространяется на Su(Hw)-зависимые инсуляторы дрозофилы.

Также, в Лаборатории регуляции экспрессии генов ИБГ РАН белок ENY2 был соосажден вместе с белками узнающими участки начала репликации ORC (origin recognition complex) (неопубликованные данные). Белковый комплекс ORC связывается с точками начала репликации, или ориджинами репликации, и играет определяющую роль в формировании платформы для сборки пре-репликативного комплекса и последующего запуска репликации. Места локализации ORC в геноме часто совпадают с различными регуляторными областями, такими как промоторы и инсуляторы (MacAlpine et al., 2004), что предполагает существование четкого механизма, обеспечивающего позиционирование точек начала репликации. Данный механизм, по-видимому, служит для синхронизации транскрипции и репликации в ходе клеточного цикла, что крайне важно для стабильности генома. Однако, несмотря на множество исследований, посвященных изучению ориджинов репликации, до сих пор остается не понятным, какие ключевые факторы определяют сайты связывания ORC. Известно лишь, что субъединицы ORC комплекса не способны выполнять эту функцию, так как обладают неспецифической ДНК-связывающей активностью (MacAlpine et al., 2004; Balasov et al., 2007).

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось в разных модельных системах - линиях клеток S2 и различных линиях D. melanogaster - исследовать то, какие белковые комплексы привлекаются на Su(Hw)-3aencnMbie инсуляторы, а также то, какие белок-белковые взаимодействия определяют рекрутирование данных комплексов.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить какие комплексы, изменяющие структуру хроматина, привлекаются на Su(Hw)-3aBHCHMbie инсуляторы

2. Проверить, зависит ли привлечение комплексов, изменяющих структуру хроматина, на Su(Hw)-3aBHCHMbie инсуляторы от белка Su(Hw)

3. Определить, происходит ли рекрутирование на 5и(Н\у)-зависимые инсуляторы комплекса ORC; если комплекс ORC привлекается на инсуляторы, проверить, зависит ли рекрутирование комплекса от белка Su(Hw)

Научная новизна

В рамках данной работы была высказана гипотеза, что роль SAGA и SWI/SNF комплексов в поддержании открытой структуры хроматина не ограничена промоторами генов, но и распространяется на 5и(Нш)-зависимые инсуляторы дрозофилы. Данное предположение было полностью подтверждено в настоящей работе. Было обнаружено, что Su(Hw) привлекает комплексы ацетилирования гистонов SAGA и ремоделирования хроматина dSWI/SNF на 5и(Н\у)-зависимые инсуляторы, что приводит к созданию областей с низкой плотностью нуклеосом и создает условия для связывания комплекса белков, узнающих участки начала репликации (ORC). По результатам работы высказано предположение о глобальном участии ДНК-связывающих белков в формировании сайтов пре-репликативных комплексов. В соответствии с предложенной моделью именно ДНК-связывающие белки являются ключевыми детерминантами позиционирования пре-репликативных комплексов в геноме. Они привлекают на инсуляторы, промоторы и энхансеры комплексы, ковалентно модифицирующие гистоны и ремодслирующие хроматин, способствуя формированию областей активного хроматина. Таким образом, ДНК-связывающие белки позволяют создать платформу для посадки комплекса ORC и связать регуляцию транскрипции и репликации.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты данной работы расширяют представление о функциях таких регуляторных элементов генома, как инсуляторы, и являются примером объединения данными элементами регуляции процессов репликации и транскрипции. Кроме того, на основании результатов работы можно предполагать, что именно ДНК-связывающие белки являются ключевыми детерминантами позиционирования пре-репликативных комплексов в геноме.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа основана на собственных данных, полученных соискателем в период с 2011 по 2013 гг.

Методология и методы работы

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и биохимии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Su(Hw) привлекает комплекс ацетплирования гистонов SAGA и комплекс ремоделирования хроматина ВАР семейства dSWI/SNF на сайты связывания Su(Hw).

2. Su(Hw)-3aBHCHMoe связывание комплексов SAGA и ВАР приводит к формированию областей с низкой плотностью нуклеосом на сайтах Su(Hw) и создает условия для связывания комплекса белков ORC, узнающих участки начала репликации.

3. Комплекс CDC45 рекрутируется на некоторые из исследованных сайтов Su(Hw) и Su(Hw) является необходимым для рекрутинга.

4. Свойства ДНК-связывающсго белка Su(Hw) не зависят от типа хроматина, окружающего его сайт.

5. Инсуляторные белки dCTCF, GAF и BEAF32 являются белками-кандидатами на участие в позиционировании ORC и формировании пре-репликативных сайтов по механизму, сходному с описанным для белка Su(Hw).

Степень достоверности и апробация результатов

Цели, поставленные в работе достигнуты, достоверность полученных результатов не вызывает сомнений. Результаты работы были представлены автором на следующих конференциях: Конференция молодых ученых "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты" (Москва, 2012), Международная конференция "Биология - наука XXI века" (Москва, 2012), Международная конференция "Хромосома 2012" (Новосибирск, 2012), Offspring-Meeting of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded) (Moscow, Russia, 2013), Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies (Egmond aan Zee, The Netherlands, 2013), Workshop "Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology " of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded) (Sankt Petersburg, Russia, 2013)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 7.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 99 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Диссертация содержит 32 рисунка и 2 таблицы. Библиография включает 219 источников.

Результаты исследований

1. Su(Hw) привлекает комплекс SAGA на сайты связывания Su(Hw)

Ранее было показано, что белок Su(Hw) взаимодействует с белком ENY2 (Kurshakova, Maksimenko et al.. 2007), который является компонентом комплекса SAGA (Kurshakova, Krasnov et al.. 2007). Решено было проверить присутствует ли комплекс SAGA на сайтах белка Su(Hw).

GCN5 ab / линия клеток S2

9,0

а 8,0

S 7,0

1 « 6,0 О X

2 I5'0

г ¡ 4,0

Ч о.

8 " з,о

ь 2,0 о

* 1,0 0,0

j В Контроль Т 1 nSulHwJRNAi

ÍÍ) а 1

Gypsy 1А2 50А 62D Б6Е 87Е 1А1 1А6 Мер

ADA2bab/линия клеток S2

В Контроль □ Su(Hw) RNAi

Gypsy 1A2 50A S2D 66E 87E 1A1 1AS Мер

Рисунок 1. Связывание GCN5 и ADA2b с 5и(Нш)-зависимыми инсуляторами. Черные столбцы - результаты СЫР до РНК-интерференции белка Su(Hw); белые столбцы - результаты ChlP после РНК-интерференции Su(Hw). Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

Для этого была проведена иммунопреципитация хроматина (ChlP) из S2 клеток дрозофилы антителами к субъединицам GCN5 и ADA2b комплекса SAGA. GCN5 является каталитической субъединицей GNAT-семейства гистонацетилтрансфераз. к которому принадлежит SAGA, и необходим для ацетилирования гистонов. в то время, как белок ADA2b является специфической субъединицей SAGA и не входит в состав других GCN5-

содержащих комплексов (Rodríguez-Navarro et al., 2009). Были исследованы известные Su(Hw)-3aBHCMMbie инсуляторы: gypsy, 1А2, 50А, 62D, 66Е и 87Е. В качестве негативного контроля использовались последовательности 1А1 и 1А6, на которых Su(Hw) отсутствует (Kurshakova, Maksimenko et al., 2007). Также в качестве 5и(Н\у)-независимого контроля был использован CTCF-зависимый инсулятор Мер. Результаты, представленные на Рисунке 1, показали, что субъединицы GCN5 и ADA2b действительно привлекаются на Su(Hw)-3aBHCHMbie инсуляторы gypsy, IA2, 50А, 62D, 66Е, 87Е, в то время как на контрольных участках 1А1 и 1А6 данные субъединицы отсутствуют. Связывание субъединиц комплекса SAGA с инсулятором Мер согласуется с ранее описанными исследованиями о том, что CTCF-зависимые инсуляторы обогащены комплексами ацетилирования гистонов (Huang et al., 2007).

Контроль 1 0.5 0.1

RNAi Su(Hw)

1 0.5 0.1

Su(Hw) —— губулин -- -

Контроль RNAi Su(Hw)

Su(Hw)ab /линия клеток S2

45,0

В Контроль □ Su(Hw) RNAi

Gypsy 1A2 50A S2D 66E S7E 1A1 1A6 Мер

Рисунок 2. (a) - результат Western-blot анализа количества белка Su(Hw) в контрольных клетках и в клетках после РНК-интерференции Su(Hw). Для проверки тотального количества белка мембрану гибридизовали с антителами к тубулину. Над дорожками указано относительное количество лизата клеток, взятого для Westem-blot анализа, (б) - уровень транскрипции гена Su(Hw) (кДНК) до и после РНК-интерференции Su(Hw). Общее количество кДНК, взятой на ПЦР, выравнивали относительно кДНК гена ras (праймеры Su(Hw) и Ras, соответственно); (в) - Результаты осаждения хроматина из 52-клеток антителами к Su(Hw). Черные столбцы - результаты ChIP до РНК-интерференции белка Su(Hw); белые столбцы - результаты ChIP после РНК-интерференции Su(Hw). Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

Для того, чтобы проверить, зависит ли привлечение комплекса SAGA на инсуляторы от Su(Hw), было решено понизить количество Su(Hw) в клетке методом РНК-интерференции. Снижение количества белка в S2 клетках после РНК-интерференции определяли методами Western-блот анализа и измерением количества мРНК гена Su(Hw) до и после РНК-интерференции (Рисунок 2а, б). Предварительно, из данных литературы было известно, что 8и(Нш)-зависимые инсуляторы связывают Su(Hw) с разной эффективностью (Kuhn-Parnell et al., 2008). Результаты осаждения хроматина антителами к Su(Hw) до и после РНК-интерференции Su(Hw) представлены на Рисунке 2. Очевидно, что количество связанного Su(Hw) при РНК-интерференции этого белка значительно снижается лишь на части Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов (gypsy, 1А2, 66Е, 87Е). Результаты осаждения хроматина из S2-icneTOK антителами к субъединицам комплексов GCN5 и ADA2B до и после РНК-интерференции Su(Hw) представлены на Рисунке 1. Видно, что уменьшение количества комплекса SAGA происходит на всех инсуляторах кроме 50А и 62D. На инсуляторе Мер уровни связывания GCN5 и ADA2B также остаются неизменными.

в 60-° х

I 50,0

0 8-

j 40,0

1 зо,о *

О 20,0

0 г

1 10'°

6 0,0

* </ Ф & & л* # * ^ ^ f

Рисунок 3. Результаты осаждения хроматина из куколок мух D. melcmogaster, мутантных по гену белка Su(Hw) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к Su(Hw). Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

В целом, после РНК-интерференции Su(Hw) в линии клеток S2 остается около 5% данного белка (Рисунок 2). При этом Su(Hw) остается связан с инсуляторами 50А и 62D. Для того, чтобы полностью исключить связывание Su(Hw) со своими сайтами была выбрана линия D. melanogaster su(Hw)v/su(Hw)E>í, мутантная по гену su(Hw). Мухи данной линии несут один аллель гена Su(Hw) с точечной мутацией в области, кодирующей

Su(Hw) ab / куколки

цинковые пальцы белка (аллель su(Hw) ); второй аллель содержит ген Su(Hw) с делецией промотора и первого экзона (аллель su(Hwf), с которого не происходит экспрессии белка. Таким образом, белок Su(Hw) данной линии мух не связывает ДНК, что было подтверждено в предварительном эксперименте (Рисунок 3). В качестве контрольной линии была использована линия, экспрессирующая белок Su(Hw) дикого типа. Кроме того, в дополнение к уже известным 5и(Н\у)-зависимым инсуляторам были проанализированы несколько новых сайтов связывания Su(Hw) (54В, 73А, 16С. 8D. 89В и 50С), выбранных при скрининге данных экспериментов ChIP-chip проекта modENCODE (Celniker et al., 2009). Полученные результаты (Рисунок 4а) показали, что все сайты связывания Su(Hw) связывают GCN5 в линии мух дикого типа, в то время как в мутантной линии уровень связывания GCN5 значительно снижен. В то же время мутация Su(Hw) не повлияла на связывание SAGA с CTCF-зависимьтм инсулятором Мер. Таким образом, было показано, что Su(Hw) необходим для привлечения комплекса SAGA на сайты связывания Su(Hw) в линии клеток S2 и в куколках D. melanogaster.

2 s,o

i 6,0

4 о

0 £ СЕ

1 2<°

о »0

GCNSab/ куколки

ü wt

Dv/еЗ

/ f # ¿f» # & <? # 4- # # 4- # # ^

¡n Su(Hw) IgG Su(Hw) —

in GCN5 IgG

« •

Рисунок 4. (а) - Результаты осаждения хроматина из куколок мух О. ше/йпо^шгег, мутантных по гену белка 5и(Н«<) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к ОС№. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. (б) - результаты 'й'евСегп-ЫоС анализа экспериментов по ко-иммунопреципитации ядерного экстракта из эмбрионов О. те1апо$а$1ег антителами к

Su(Hw) и GCN5. В качестве отрицательного контроля для иммунопреципитации использовали антитела IgG. in - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация.

Чтобы проверить, происходит ли физическое взаимодействие белков Su(Hw) и GCN5 in vivo была проведена ко-иммунопреципитация ядерного экстракта из эмбрионов D. melanogasler антителами к обоим белкам. Антитела к Su(Hw) преципитировали Su(Hw) и ко-преципитировали 20% GCN5 из экстракта; аналогично, антитела к GCN5 преципитировали GCN5 и ко-преципитировали Su(Hw) (Рисунок 46). Данные результаты свидетельствуют о том, что белки Su(Hw) и GCN5 взаимодействуют in vivo.

2. Su(Hw) привлекает комплекс dSWI/SNF на сайты связывания Su(Hw)

Известно, что комплекс SAGA в участвует в модификации гистонов и совместно с комплексами ремоделирования хроматина dSWI/SNF принимает участие в формировании открытой структуры хроматина на промоторах активно-транскрибирующихся генов (Mitra et al., 2006). После того, как комплекс SAGA был обнаружен на сайтах связывания Su(Hw), интересно было проверить, привлекается ли на данные сайты комплекс dSWI/SNF. Семейство dSWI/SNF у дрозофилы представлено подсемействами ВАР и РВАР. В составе комплексов ВАР и РВАР можно выделить субъединицы, общие дня этих комплексов, такие как MOIRA, SNR1, ВАР60, BAPU1, и комплекс-специфические субъединицы: OSA для комплекса ВАР и PB, ВАР170 и SAYP для комплекса РВАР (Mohrmann and Verrijzer, 2005; Vorobyeva et al., 2009) Для того, чтобы определить, какие именно комплексы ремоделирования присутствуют на Su(Hw)-3aßitciiMLix инсуляторах были проведены эксперименты по осаждению хроматина, выделенного из S2 клеток, антителами против белков ВАР170 и OSA, а также против их общей субъединицы ВАР111. Оказалось, что последовательности Su(Hw)-3aBncnMbix инсуляторов в значительной степени осаждаются антителами к белкам ВАР111 и OSA, но не осаждаются антителами к белку ВАР170 (Рисунок 5). Связывание субъединиц OSA, ВАР111 и ВАР170 с инсулятором Мер также согласуется с ранее полученными данными о том, что CTCF-зависимые инсуляторы обогащены комплексами ремоделирования хроматина семейства dSWI/SNF (Euskirchen et al., 2011).

Для определения роли белка Su(Hw) в привлечении комплекса ВАР была проведена иммунопреципитация хроматина из S2-iaieTOK после РНК-интерференции Su(Hw). Было показано, что на инсуляторах, за исключением 62D и 50А, уровень связывания субъединиц ВАР значительно падает (Рисунок 5). Чтобы проверить результаты полученные в экспериментах по РНК-интерференции Su(Hw), была проведена

иммунопреципитация хроматина из куколок линии su(Hw)y/su(Hw)a и дикого типа

антителами к белку OSA. Результаты ChIP (Рисунок 6а) показали, что мутация Su(Hw) вызывает значительное снижение уровня связывания OSA на всех исследуемых сайтах Su(Hw), но не влияет на привлечение комплекса ВАР на инсулятор Мер. Таким образом, было показано, что комплекс ремоделирования хроматина ВАР, аналогично комплексу ацетилирования гистонов SAGA, привлекается на сайты связывания Su(Hw) зависимым от Su(Hw) образом.

ВАР170аЬ/линия клеток S2

OSA ab / линия клеток S2

BAPlli аЬ/линия клетокS2

Рисунок 5. Результаты осаждения хроматина из 52-клеток антителами к ВАР170, ВАР) 11 и OSA. Черные столбцы - результаты ChIP до РНК-интерференции белка Su(Hw);

белые столбцы - результаты СЫР после РНК-интерференции 5и(Нш). Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

OSA аЬ/ куколки

in Su(Hw) IgG in OSA IgG OSA H _ fc

Рисунок 6. (a) - Результаты осаждения хроматина из куколок мух D. melanogaster, мутантных по гену белка Su(Hw) (белые столбцы), и мух. экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к OSA. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. (б) - результаты Westem-blot анализа экспериментов по ко-иммунопреципитации ядерного экстракта из эмбрионов D. melanogaster антителами к Su(Hw) и OSA. В качестве отрицательного контроля для иммунопреципитации использовали антитела IgG. in - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация.

Далее было проверено, ассоциированы ли Su(Hw) и OSA in vivo. Для этого была проведена ко-иммунопреципитация ядерного экстракта из эмбрионов D. melanogaster. Антитела к белку Su(Hw) преципитировали из экстракта Su(Hw), а также ко-преципитировали около 0,5% OSA, и наоборот (Рисунок 66). Полученные данные подтверждают взаимодействие Su(Hw) и OSA in vivo, которое однако является достаточно слабым, что может означать непрямое взаимодействие данных белков на инсуляторах, опосредованное еще неизвестными мсдиаторными белками или комплексами.

3. Su(Hw) необходим для формирования областей с низкой плотностью нуклеосом

После того, как комплексы SAGA и ВАР были обнаружены на сайтах связывания Su(Hw), оказался существенным вопрос о том, происходит ли на данных сайтах ремоделирование хроматина. Чтобы оценить структуру хроматина и плотность расположения нуклеосом на Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторах, мы провели эксперименты по осаждению хроматина из линии клеток S2 антителами против гистона НЗ и

обнаружили, что уровень гистона НЗ на инсуляторах заметно ниже, чем на контрольных сайтах 1А1 и 1А6 (Рисунок 20а). Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными о том, что сайты связывания белков, ассоциированных с инсуляторами, являются областями с пониженной плотностью нуклеосом относительно среднегеномного значения (Negre е1 а1., 2010). Чтобы определить роль 5и(Н1л<) в формировании областей с пониженной плотностью нуклеосом была проведена иммунопреципитация хроматина из клеток линии 52 после РНК-интерференции белка 5и(Н\у). Данный эксперимент показал заметное увеличение уровня связывания гистона НЗ с 5и(Н\у)-зависимыми инсуляторами, в то время как на инсуляторе Мер изменений практически не наблюдалось (Рисунок 7а). Аналогично, анализ связывания гистона НЗ в куколках линии хи<Нш)уЛи(Нп')Е8 показал заметное возрастание уровня связывания НЗ в мутантной линии по сравнению с линией дикого типа (Рисунок 76).

40,0

5 35,0 с

| 30,0

о г 25,0

§ \ 20,0

5- 0

о '

= 10,0 К 5,0

0,0

« 45,0

I 40,0

1 35,0

О.

а 30'°

Б 25,0

I 20,0

I 15,0

0 10,0

1 5<°

2 0,0

I У & 4- & * ^ # ^ ^ ^

Рисунок 7. (а) - Результаты осаждения хроматина из 52-клеток антителами к НЗ. Черные столбцы - результаты СЫР до РНК-интерференции белка 5и(Н\у); белые столбцы - результаты СЫР после РНК-интерференции 8и(Н\у). Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. (б) - Результаты осаждения хроматина из куколок мух £>. текто^сшег, мутантных по гену белка 8и(Н\у) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к НЗ. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. .

НЗ аЬ / линия клеток52

¡л1к

Л|

йур5у 1А2 50А 620 66Е 37Е 1А1 1А6 Мер

НВ аЬ / куколки

4. Комплекс узнавания ориджинов репликации (ORC) привлекается на сайты связывания Su(Hw)

Полученные нами данные позволяют заключить, что существуют некоторые общие свойства между промоторами активно транскрибируемых генов и сайтами связывания Su(Hw). Так, сайты Su(Hw), как и промоторы, связывают комплекс ацетилирования гистонов SAGA и комплекс ремоделирования хроматина dSWI/SNF и являются областями с низкой плотностью нуклеосом. Поэтому можно предположить, что сайты связывания Su(Hw) могут иметь и другие общие свойства с промоторами активных генов. Для проверки данного предположения биоинформатическими методами был проведен анализ геномного распределения различных белковых факторов, включенных в базу данных modENCODE. Выло обнаружено, что с сайтами связывания Su(Hw) в геноме тесно связанны белок ORC2 и хеликазный комплекс МСМ2-7; но, в отличии от промоторов, сайты связывания Su(Hw) не колокализуются с РНК-полимеразой II (Pol II) (Рисунок 8а -в). Известно, что комплекс узнавания ориджинов репликации (ORC) и хеликаза МСМ2-7 часто локализуются поблизости от промоторов активных генов (MacAlpine et al.. 2004) и играют важную роль в формировании и запуске ориджинов репликации (Masai et al., 2010). Сайты в геноме D. melanogaster, обогащенные белком ORC, характеризуются сниженным количеством нуклеосом (MacASpme et al., 2010) и подвержены активному обмену гистонов, о чем свидетельствуют результаты экспериментов CATCH-IT (Deal et al., 2010). В данных экспериментах используется ко-трансляционное мечение белков азидогомоаланином, замещающим метионин, в течение различных промежутков времени (20, 40 и 60 минут) с последующей пришивкой к метке модифицированного биотина. Затем проводится расщепление хроматина на мононуклеосомы микрококковой нуклеазой и биотинилированные белки подвергаются аффинной очистке на стрептавидин-агарозе и жесткой отмывке, удаляющей все негистоновые белки. Анализ результатов экспериментов CATCH-IT показал, что на сайтах связывания Su(Hw) также происходит активный обмен гистонов, следовательно для данных сайтов характерно активное состояние хроматина (Рисунок 8г - е).

Сайты связывания ORC в геноме часто располагаются поблизости от сайтов начала транскрипции активно транскрибируемых генов в областях, обогащенных АТ-последовательностями. (MacAlpine et al., 2004; Balasov et al., 2007). В то же время, имеются данные (Cayrou et al., 2011; Cayrou, Coulombe et al., 2012) о том, что сайты начала репликации ассоциированы с GC-обогащенными последовательностями, что следует из результатов анализа новосинтезированной ДНК (Cayrou, Gregoire et al., 2012). Решено

было проверить, последовательностями какого состава обогащены сайты связывания 8и(Ниг). В первую очередь, были проанализированы все (ЖС-связывающие сайты в геноме дрозофилы и было обнаружено, что сайты связывания СЖС одновременно являются обогащенными вС- и АТ-последовательностями (Рисунок 8ж): вС-богатая область располагается в центре среднестатистического сайта связывания и с двух сторон окружена АТ-богатыми областями. Таким образом, оказалось возможным объединить раннее существовавшие данные о АТ/вС составе сайтов связывания СЖС. Профиль АТЛЗС состава на всех сайтах связывания 5и(Нш) в геноме дрозофилы оказался сходным профилем, полученным для сайтов связывания (ЖС (Рисунок 8з).

Ж ORC 3 Su(Hw)

59% 54% 59% 54%

44% 5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 44% >-4-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Рисунок 8. Полногеномный анализ связывания сайтов Su(Hw) с различными факторами, (а - е) Log2 профили распределения для обозначенных факторов в положении от -5 до +5 т. п. о. от сайтов связывания Su(Hw); (а - в) профили распределения ORC2, МСМ2-7, Polll в S2 клетках; (г - е) профили обмена гистонов (CATCH-IT) (20-, 40- и 60-минутное мечение азидогомоаланином); (ж - з) профили АТ-состава сайтов связывания ORC (ж) и Su(Hw) (з) в геноме дрозофилы.

Для того, чтобы проверить данные, полученные биоинформатическим методом, были проведены эксперименты СЫР антителами к компонентам комплекса ORC; ORC2,

0RC3, 0RC6. Результаты подтвердили рекрутирование данных субъединиц комплекса ORC на Su(Hw)-3aBHCHMbie инсуляторы (Рисунок 9; 10а). Чтобы оценить роль белка Su(Hw) в привлечении комплекса ORC на инсуляторы, была проведена иммунопреципитация хроматина из клеток линии S2 после РНК-интерференции белка Su(Hw). Было показано, что уровень связывания субъединицы ORC3 упал на всех тестируемых инсуляторах, за исключением 50А и 62D (Рисунок 10а). Анализ связывания субъединицы ORC3 в куколках линии su(Hw)v/su(Hwfs подтвердил, что Su(Hw) необходим для рекрутирования комплекса ORC на сайты связывания Su(Hw) (Рисунок 106). Чтобы проверить, происходит ли белок-белковое взаимодействие между комплексом ORC и Su(Hw) in vivo была проведена ко-иммунопреципитация ядерного экстракта из эмбрионов D. melanogaster соответствующими антителами. Было обнаружено, что антитела к белку Su(Hw) осаждают Su(Hw) и около 2% белка ORC3 (Рисунок 11). Относительно слабое взаимодействие данных белков можно объяснить опосредованными белок-белковыми взаимодействиями.

ORC2 аЬ/ линия клетокS2

^ # # ^ ^ ORC6 аЬ/линия клетокS2

Рисунок 9. Результаты осаждения хроматина из 52-клеток антителами к ORC2 и ORC6. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

0RC3 аЬ/линия клетокS2

в?

# # 4- & # ^

Рисунок 10. (а) - Результаты осаждения хроматина из 82-клеток антителами к СЖСЗ. Черные столбцы - результаты СЫР до РНК-интерференции белка 8и(Нш); белые столбцы - результаты СЫР после РНК-интерференции 8и(Н\у). Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. (б) - Результаты осаждения хроматина из куколок мух И. те1апо$а51ег, мутантных по гену белка 8и(Нш) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к СЖСЗ. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

ИП ИП

in Su(Hw) igS in ORC3 IgG Su(Hw) <— _ «KM

Рисунок 11. Результаты Western-blot анализа экспериментов по ко-иммунопреципитации ядерного экстракта из эмбрионов D. melanogaster антителами к Su(Hw) и ORC3. В качестве отрицательного контроля для иммунопреципитации использовали антитела IgG. in - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация.

Cdc45 привлекается на пре-репликативный комплекс на сайтах связывания Su(Hw)

Чтобы обеспечить правильный временной паттерн репликации генома в течении S-фазы, в клетках эукариот существуют множественные ориджины репликации, определенная часть из которых срабатывает в зависимости от стадии развития организма и условий роста (Masai et al., 2010). Поэтому было необходимо определить, все ли сайты связывания Su(Hw) являются действующими ориджинами репликации. Известно, что белок CDC45 привлекается на пре-реплиационные сайты непосредственно перед загрузкой на них ДНК-полимеразы (Mimura et al., 2000; Takisawa et al., 2000). поэтому данный белок решено было использовать для маркирования ориджинов репликации, готовых к запуску. Результаты экспериментов ChIP в куколках линии su(Hw) /su(Hwf8 показали, что CDC45 действительно привлекается на Su(Hw)-caii™ 5и(Н\у)-зависимым образом, однако количество CDC45 на разных сайтах сильно варьирует (Рисунок 12). В частности, уровень связывания CDC45 близок к фоновому на сайтах 16С, 89В, 50С, в то время, как на 8D наблюдается значительное обогащение уровня связывания CDC45. С другой стороны, уровень связывания ORC3 на данных сайтах заметно превышал фоновый уровень (Рисунок 10). Выше были изложены данные, полученные биоинформатическими методами, которые показали, что хеликазный комплекс МСМ2-7 ассоциирован с сайтами связывания Su(Hw) в геноме дрозофилы (Рисунок 86). Таким образом, можно сделать вывод, что на сайты связывания Su(Hw) привлекаются комплексы ORC и МСМ2-7, после чего на часть из этих сайтов происходит посадка CDC45 и формирование пре-репликационных сайтов, готовых к старту репликации.

. 2-5 Г

I 2,0

0 о.

I1'5

о 1,0 г о о

S 0.0

* f 4? О? & & <? * **

Рисунок 12. Результаты осаждения хроматина из куколок мух D. melanogaster, мутантных по гену белка Su(Hw) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к CDC45. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

CDC45 ab /куколки

5. Su(Hw)-cBH3biBaiomne сайты составляют значительную часть сайтов ORC в "синем" и "черном" типах хроматина

В недавних исследованиях весь хроматин генома дрозофилы был разделен на несколько типов в зависимости от ассоциированных с хроматином белков и ковалентных модификаций гистонов (Filion et al., 2010). Оказалось, что белки комплекса ORC ассоциированы в основном с активными типами хроматина, в то время, как Su(Hw) преимущественно располагается в синем и черном типе (Filion et al., 2010). Было определено, что около 80% ORC-связывающих сайтов локализовано в "красном" и "желтом" типах хроматина, и лишь около 12 и 5% соответственно расположено в "синем" и "черном" хроматине (Рисунок 13а). В отличие от ORC, 86% Su(Hw)-cafiroB расположены в "синем" и "черном" хроматине (Рисунок 13а). Таким образом, большая часть ориджинов репликации не содержит Su(Hw). Чтобы оценить количество ORC-связывающих сайтов из "синего" и "черного" хроматина, содержащих Su(Hw), был построен профиль распределения Su(Hw) на сайтах ORC (Рисунок 136). Из представленного профиля видно, что значительная часть ORC-связывающих сайтов из "синего" и "черного" хроматина содержит Su(Hw). В пересчете на общее количество ORC-связывающих сайтов оказалось, что Su(Hw) присутствует на 6% сайтов ORC в геноме D. melanogaster.

Э Сайты связывания ORC

Сайты связывания Su(Hw)

желтый

сайты ORC в "синем" и "черном" хроматине

■■■ все сайты ORC

Рисунок 13. (а) - Распределение сайтов связывания ORC и Su(Hw) в различных типах хроматина, (б) - Log2 профили распределения Su(Hw) в положении от -5 до +5 т. п. о. от сайтов связывания ORC.

6. Рекрутирование комплексов SAGA, ВАР и ORC на сайты связывания Su(Hw) не зависит от типа окружающего хроматина

Как было отмечено выше, белок Su(Hw) по-разному представлен в разных типах хроматина в геноме дрозофилы. Решено было проверить, зависят ли свойства Su(Hw) от типа хроматина, в котором расположен сайт связывания, и является ли состояние хроматина первичным сигналом для связывания комплексов SAGA, ВАР и ORC. Для этого были выбраны сайты связывания белка Su(Hw), расположенные в "черном" (BLACK 1, BLACK2, BLACK3), "синем" (BLUEl, BLUE2, BLUE3), "красном" (REDI, RED2, RED3) и "желтом" (YELLOW1, YELLOW2, YELLOW3) типах хроматина. В качестве негативных контролей были использованы последовательности 1А1 и 1А6, где, как ранее было показано, Su(Hw) отсутствует, а также CTCF-зависимый инсулятор Мер, который не связывает белок Su(Hw). В качестве объекта исследований были использованы линия D. melanogaster su(Hw)y/su(Hwf8, мутантная по гену su(Hw), и линия, экспрессирующая белок Su(Hw) дикого типа. В экспериментах по иммунопреципитации хроматина (ChIP) из куколок линии дикого типа все отобранные сайты Su(Hw) и инсулятор Мер продемонстрировали значительное обогащение белками GCN5, OSA и ORC3, являющимися субъединицами комплексов SAGA, ВАР и ORC, соответственно, а также заметное снижение уровня связывания гистона НЗ по сравнению с контрольными сайтами (Рисунок 14; 15). В то же время, ChIP из куколок линии показал, что в отсутствии Su(Hw) рекрутирование всех вышеописанных субъединиц на Su(Hw)-caflTbi нарушается, а уровень гистона НЗ на сайтах связывания Su(Hw) возрастает (Рисунок 14; 15). На основании полученных данных можно предположить, что свойства ДНК-связываюшего белка Su(Hw) не зависят от типа хроматина, окружающего его сайт. Первичным сигналом для формирования сайта начала репликации скорее служит ДНК-связывающий белок, примером которого в данном случае является Su(Hw).

OSA ab/ куколки

¿W ЛЛ* ,-VV

GCN5 ab/ куколки

Рисунок 14. Результаты осаждения хроматина из куколок мух D. melanogasier, мутантных по гену белка Su(Hw) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к OSA и GCN5. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

0RC3 ab/куколки

НЗ аЬ/ куколки

Рисунок 15. Результаты осаждения хроматина из куколок мух D. melanogaster, мутантных по гену белка Su(Hw) (белые столбцы), и мух, экспрессирующих белок дикого типа (черные столбцы), антителами к НЗ и ORC3. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК.

7. Искусственное привлечение Su(Hw) является достаточным для последующего рекрутирования комплексов SAGA, ВАР и ORC

Для дальнейшей проверки роли Su(Hw) в позиционировании ориджинов репликации необходимо было определить, является ли Su(Hw) достаточным фактором для привлечения комплексов SAGA, ВАР и ORC на инсуляторы. В ходе работы над данным вопросом была получена линия клеток S2, стабильно экспрессирующая 3xFLAG GAL4-ДНК-связывающий домен, слитый с N-концом белка Su(Hw), и содержащая в геноме тандем из 10 сайтов связывания домена GAL4 (IOxUAS) (Рисунок 16в). В качестве

40,0G

10,00

0,00

X,"- ///

^^^ *«»

отрицательного контроля к данной клеточной линии, была получена линия, содержащая в геноме lOxUAS и экспрессирующая 3xFLAG САЬ4-ДНК-связывающий домен (Рисунок 16в). Эксперименты СЫР из полученных линий за анти-FLAG антитела показали, что 3xFLAG GAL4 привлекается на lOxUAS заметно эффективнее 3xFLAG GAL4, слитого с Su(Hw). Тем не менее, субъединицы GCN5, OSA и ORC3 намного эффективнее рекрутируются на lOxUAS в линии клеток 3xFLAG GAL4-Su(Hw), чем в линии 3xFLAG GAL4 (Рисунок 166). Следовательно, Su(Hw) необходим и достаточен для привлечения комплексов SAGA, ВАР и ORC на свои сайты связывания.

Astfi ?iometef t!a píeme lar püC Orí Awp

3XFLAG GAW

Рисунок 16. (a) - Привлечение 3xFLAG GAL4 (светлый столбец) и 3xFLAG GAL4-Su(Hw) (темный столбец) на сайты связывания САЬ4-домена lOxUAS; (6) - привлечение OSA, GCN5 и ORC3 на lOxUAS в клеточных линиях, стабильно экспрессирующих 3xFLAG GAL4-Su(Hw) (темные столбцы) и 3xFLAG GAL4 (светлые столбцы). . Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК; (в) - карты конструкций, использованных для получения стабильных линий 3xFLAG GAL4 и 3xFLAG GAL4-Su(Hw).

8. Сайт связывания Su(Hw) определяет привлечение комплексов SAGA, ВАР и ORC

Подтверждение данных клеточной системы с рекрутированием за GAW-домен было получено и для трансгенных мух. В качестве модельной была использована регуляторная система гена yellow, который ответственен за темную пигментацию тела и щетинок мух. Активацию гена в кутикуле и щетинках обеспечивают два энхансера,

расположенные выше промотора (Geyer and Corees, 1987). В работе была использована линия мух, трансгенная по конструкции, в которой четырехкратно повторенный сайт связывания Su(Hw) из инсулятора gypsy (4xSBS) был расположен в 900 п.о. от промотора гена yellow и отделял промотор от энхансеров (Рисунок 176), Для мух данной линии характерны светлые тело и щетинки, что означает функциональную активность инсулятора 4xSBS и блокирование им функций энхансеров. Эксперименты по иммунопреципитации хроматина из мух данной линии за антитела к GCN5, OSA и ORC3 показали, что на сайт 4xSBS происходит привлечение комплексов SAGA, ВАР и ORC (Рисунок 17а). Следовательно, именно позиция сайта связывания Su(Hw) определяет позиционирование данных комплексов.

a OSA ab/куколки 4xSBS GCN5 ab/куколки 4xSBS

14,0

ORC3 ab/куколки 4xSBS

4.5

BRcn

Yellow

Рисунок 17. (а) - Привлечение комплексов OSA, GCN5 и ORC3 на сайт 4xSBS в трансгенных куколках. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. (б) - карта конструкции, использованной для получения трансгенной линии мух. Wen - энхансер крыльев; Ben - энхансер тела; BRen - энхансер щетинок.

9. Su(Hw), CTCF, GAF и BEAF32 обладают сходными свойствами ремоделирования хроматина и рекрутирования ORC

После обнаружения того, что Su(Hw) присутствует на 6% сайтов ORC в геноме D. melanogaster, было выдвинуто предположение, что оставшиеся 94% сайтов ORC колокализуются с другими ДНК-связывающими белками, связывающимися с различными регуляторными элементами, включая промоторы и инсуляторы. Для проверки данного предположения были проанализированы профили распределения в геноме инсуляторных белков дрозофилы Класса I таких, как dCTCF, GAF и BEAF32. В качестве отрицательного контроля была использована выборка случайных сайтов из генома дрозофилы. Для проверки используемого программного обеспечения было проанализировано

распределение в геноме РНК-полимеразы II и был подтвержден ранее известный факт о том. что Su(Hw) относится к Классу II инсуляторных белков, которые не ассоциированы в геноме с РНК-полимеразой II (Рисунок 18а): В то же время, dCTCF, GAF и BEAF32, как инсуляторные белки Класса I, колокализуются в геноме с сайтами обогащения РНК-полимеразой II (Рисунок 18а). Дальнейший полногеномный анализ показал, что ORC2 и МСМ2-7 колокализуются с сайтами связывания всех тестируемых инсуляторных белков, в то время, как анализ случайных сайтов не показал обогащения белками ORC2 и МСМ2-7 (Рисунок 18а). Уровень обогащения ORC2 на сайтах связывания Su(Hw) оказался меньше, чем на сайтах других инсуляторных белков. Также на сайтах связывания Su(Hw), dCTCF, BEAF-32, GAF и случайных сайтах были проанализированы плотности распределения гистонов (HI, НЗ, Н4) и профили обмена гистонов (CATCH-IT).

■5-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Su(Hw)

случайные сайты

Рисунок 18. Полногеномный анализ связывания сайтов 5и(Н\¥), с!СТСР, йАР и ВЕАР32 с различными факторами, (а - в) 1x^2 профили распределения для обозначенных факторов в положении от -5 до +5 т. п. о. от сайтов связывания 5и(Н\у), с1СТСР, САР и ВЕАР32; (а, б) профили распределения РоШ, СЖС2, МСМ2-7, Н1, НЗ, Н4 в 52 клетках: (в) профили обмена гистонов (САТСН-ГГ) (20-, 40- и 60-минутное мечение азидогомоаланином).

Оказалось, что все исследуемые белки характеризуются сходными профилями распределения и обмена гистонов на своих сайтах (Рисунок 186 - в). Таким образом, можно сделать вывод, что dCTCF, GAF и BEAF32 являются белками-кандидатами на участие в позиционировании ORC и формировании пре-репликативных сайтов по механизму, сходному с описанным для белка Su(Hw). Более высокая активность инсуляторных белков Класса I по сравнению с Su(Hw) может объясняться тем, что сайты связывания белков данного класса часто колокализуются с промоторами активных генов и, таким образом, профили распределения, вычисленные для белков Класса I, представляют результат совместного действия белков Класса I и коактиваторов транскрипции. В этом отношении, сайты связывания Su(Hw) представляют уникальную модель для исследования молекулярных механизмов позиционирования комплекса ORC, которая не усложнена специфическими для транскрипции событиями и факторами.

Обсуждение

На основании полученных данных можно сделать следующие выводы. Su(Hw) привлекает комплекс ацетилирования гистонов SAGA и комплекс ремоделирования хроматина ВАР на сайты связывания Su(Hw). Это приводит к формированию областей с низкой плотностью нуклеосом и создает условия для связывания комплекса белков, узнающих участки начала репликации (ORC). Отсутствие Su(Hw), способного связывать сайты на ДНК при нокауте данного белка в линии клеток S2, либо в мутантной линии su(Hw)v/su(Hwf, приводит к значительному снижению количества белковых комплексов SAGA, ВАР и ORC, и, в то же время, к увеличению плотности нуклеосом на сайтах связывания Su(Hw) (Рисунки 1,4- 10, 14, 15). Таким образом, Su(Hw) создает условия для связывания комплекса ORC и формирования пре-репликативных комплексов (Рисунок 19). Биоинформатические методы показали, что хеликазный комплекс МСМ2-7 ассоциирован с сайтами связывания Su(Hw) (Рисунок 86). Результаты ChlP экспериментов показали, что комплекс CDC45 рекрутируется на некоторые из исследованных сайтов Su(Hw) и Su(Hw) является необходимым для рекрутинга (Рисунок 12). Таким образом, можно предположить следующую последовательность привлечения белков на Su(Hw)-инсуляторы: Su(Hw) создает условия для комплекса ORC, хеликазный комплекс МСМ2-7 связывается с платформой ORC, после чего белок CDC45 загружается на сформировавшийся пре-репликационный комплекс. Разные сайты связывания Su(Hw) привлекают различные количества CDC45, в то время, как уровень связывания ORC3 на всех сайтах более или менее сходный (Рисунок 9, 10). Вероятно, Su(Hw) создает платформу для формирования пре-репликационных комплексов на всех исследованных в

работе сайтах связывания 5и(Нш), после чего происходит активация репликации на некоторых из данных сайтов.

Рисунок 19. Предполагаемая схема функционирования сайта связывания Su(Hw)

Свойства ДНК-связывающего белка Su(Hw) не зависят от типа хроматина, окружающего его сайг. На основании этого можно предположить, что состояние хроматина не является первичным сигналом для формирования сайта начала репликации. Скорее таким первичным сигналом служит некий ДНК-связывающий белок, примером которого в данном случае является Su(Hw). В пользу данной идеи говорит распределение белков ORC и Su(Hw) в геноме по типу хроматина. Не смотря на то, что в основном в геноме белки комплекса ORC обнаружены в районах активного хроматина, они были обнаружены на сайтах связывания Su(Hw). Su(Hw), который в основном образует сайты в «синем» и «черном» хроматине, оказался ведущим детерминантом в позиционировании ориджинов.

Su(Hw) является первым примером белка, участвующего в позиционировании 6% ORC-связывающих сайтов в "черном" и "синем" хроматине генома дрозофилы. Так как большинство сайтов ORC в геноме располагаются в "красном" и "желтом" хроматине, возможными кандидатами на роль позиционирования ориджинов репликации являются ДНК-связывающие транскрипционные активаторы. Данное предположение подтверждает тот факт, что для многих факторов транскрипции было показано взаимодействие с компонентами пре-репликационного комплекса (Beall et al., 2002: Hubner and Phi-van, 2012; Bosco and Orr-Weaver, 2001). Результаты биоинформатических исследований, описанных в данной работе, показали, что Su(Hw) и инсуляторные белки дрозофилы Класса I также обладают сходными свойствами по ремоделированию хроматина и колокализуются с компонентами пре-репликационного комплекса (Рисунок 18). Таким образом, dCTCF, GAF и BEAF32 являются белками-кандидатами на участие в

позиционировании ORC и формировании пре-репликативных сайтов по механизму, сходному с описанным для белка Su(Hw).

Ранее было показано, что комплекс ORC связывается преимущественно с АТ-богатыми областями хроматина (MacAlpine et al., 2004). Более того, субъединица ORC6 дрозофилы необходима для связывания комплекса ORC с ДНК и предпочтительно связывает поли-А последовательности (Balasov et al., 2007). Согласно этим данным необходимость ORC6 для связывания комплекса ORC с хроматином объясняется неспецифической связывающей активностью данной субъединицы по отношению к АТ-богатым последовательностям ДНК в областях открытого хроматина, образованных с помощью различных ДНК-связывающих белков включая Su(Hw). В соответствии с этим выводом было показано заметное обогащение сайтов связывания Su(Hw) АТ-богатыми последовательностями (Рисунок 8ж - з). Белок-белковые взаимодействия могут дополнительно стабилизировать связывания ORC, что следует из сильного взаимодействия между Su(Hw) и компонентами комплексов SAGA, ВАР и ORC (Рисунок 4, 6, И). Считается, что комплекс ORC не обладает заметной специфичностью по отношению к последовательностям ДНК (MacAlpine et al., 2010) и среди сайтов связывания ORC у высших эукариот отсутствует консенсус. В поддержку данного мнения, было показано, что сайт связывания Su(Hw) может направлять позиционирование сайта ORC in vivo (Рисунок 16).

Su(Hw) относится к классу II инсуляторных белков и в отличии от класса I не ассоциирован с промоторами генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II (Negre et al., 2010; Smith et al., 2009). Более того, Su(Hw) имеет тенденцию локализоваться в областях транскрипционно не активного хроматина, согласно классификации (Filion et al., 2010) относящихся к "черному" и "синему" хроматину. Тем не менее, описанный в работе механизм формирования открытого хроматина на сайтах связывания Su(Hw) имеет много общего с формированием открытого хроматина на промоторах активных генов. Известно, что активаторы транскрипции привлекают на промоторы этих генов комплексы ремоделирования и ацетилирования хроматина. Аналогично, комплекс ORC привлекается на промоторы активных генов и на сайты связывания Su(Hw). Также анализ структуры хроматина методом САТСН-ГГ обеспечивает подтверждение того, что на Su(Hw) связывающих сайтах происходит активный обмен гистонов (Рисунок 8г - е), что является характерной чертой ориджинов репликации (Deal et al., 2010). Сходные свойства таких различных геномных элементов как сайты связывания Su(Hw) и промоторы позволяют нам предположить, что в клетке реализуются универсальные механизмы

позиционирования ориджинов репликации. Эти механизмы позволяют клетке создать множество ориджинов репликации, позиционируемых ДНК-связывающими белками, которые организуют необходимую для связывания комплекса ORC структуру хроматина. В ряде исследований показано, что основные известные классы регуляторных элементов ДНК, включая промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, области контроля локусов, являются областями открытого хроматина (Cockerill, 2011; Gross and Garrard, 1988). Таким образом, универсальный механизм позиционирования ориджинов репликации мог бы позволить связать процессы транскрипции и репликации на разнообразных регуляторных элементах генома.

Выводы

1. Su(Hw) привлекает комплекс ацетилирования гистонов SAGA и комплекс ремоделирования хроматина ВАР семейства dSWI/SNF на сайты связывания Su(Hw).

3. Комплекс CDC45 рекрутируется на некоторые из исследованных Su(Hw)-caÜTon и Su(Hw) является необходимым для рекрутинга. Таким образом, Su(Hw) создает платформу для формирования пре-репликационных комплексов на своих сайтах связывания, после чего происходит активация репликации на некоторых из данных сайтов.

4. Свойства ДНК-связывающего белка Su(Hw) не зависят от типа хроматина, окружающего его сайт.

Список публикаций

Статьи:

1. Vorobyeva, N. Е. and Mazina. М. U.. Golovnin, А. К., Kopytova, D. V., Gurskiy, D. Y., Nabirochkina, E. N., Georgieva, S. G., Georgiev, P. G., Krasnov, A. N. (2013) Insulator protein Su(Hw) recruits SAGA and Brahma complexes and constitutes part of Origin Recognition Complex-binding sites in the Drosophila genome. Nucleic acids res, 41 (11): 5717-30.

2. Мазина. M. Ю.. Воробьева, H. E., Краснов, A. H. (2013) Способность Su(Hw) создавать платформу для формирования ориджинов репликации не зависит от типа окружающего хроматина. Цитология, 55 (4): 218-24.

Материалы конференций:

1. Магадова М. Su(Hw)-3aBiicnMbie инсуляторы, как перспективная модель для создания высокоэффективных векторов в биотехнологии. Конференция молодых ученых "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты", Москва, 13.03.2012.

2. Магадова М.Ю.. Воробьева Н.Е., Краснов А.Н. Инсуляторный белок D. melanogaster Su(Hw) рекрутирует комплексы SAGA и Brahma и создает условия для связывания белков, узнающих участки начала репликации (ORC). Международная конференция "Биология - наука XXI века", Москва, 24.05.2012.

3. Краснов А.Н., Мазина М.Ю.. Воробьева Н.Е. Роль белка Su(Hw) в позиционировании ориджинов репликации. Международная конференция "Хромосома 2012", Новосибирск, 2-7.09.2012.

4. Мазина М.Ю.. Воробьева Н.Е., Краснов А.Н. Инсуляторный белок D. melanogaster Su(Hw) рекрутирует комплексы SAGA и Brahma и создает условия для связывания белков, узнающих участки начала репликации (ORC). Международная конференция "Хромосома 2012", Новосибирск, 2-7.09.2012.

5. Marina Yu. Mazina. Methods of study of replication on the model of Drosophila follicular cells. Offspring-Meeting of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, Moscow, Russia, 26-29.06.2013.

6. Marina Mazina. Nadezhda Vorobyeva, Alexey Krasnov. Insulator protein Su(Hw) is indispensable to DAFC re-replication during Drosophila oogenesis. Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies, Egmond aan Zee, The Netherlands, 2-4.09.2013.

7. Marina Mazina. Nadezhda Vorobyeva, Alexey Krasnov. Insulator protein Su(Hw) is indispensable to DAFC re-replication during Drosophila oogenesis. Workshop "Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology " of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, Sankt Petersburg, Russia, 17-20.09.2013.

Подписано в печать 10.12.2014г. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Заказ № 174. Тираж 100 экз. Типография «КОПИЦЕНТР» 119234, г. Москва, Ломоносовский пр-т, д.20 Тел. 8(495)213-88-17

Информация о работе

Мазина, Марина Юсуповна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.03

Автореферат

Похожие работы