Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы

Федосеева, Дарья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы"

На правах рукописи

Федосеева Дарья Михайловна

Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки

дрозофилы

03.01.03 - «Молекулярная биология»

7 НОЯ 2013

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005537366

Москва-2013

005537366

Работа выполнена в Лаборатории организации генома Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Чуриков Николай Андреевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, заведующая лабораторией

факторов транскрипции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Георгнева София Георгиевна

доктор биологических наук, заведующая лабораторией исследования геномных повторов эукариот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Калмыкова Алла Ивановна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Института биологии развития им Н.К. Кольцова Российской академии наук.

Защита состоится « »{¿ОлЬрА 2013г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу 119991, Москва, ул. Вавилова д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан « А 201 Зг

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат химических наук и

дтолтГиМихайлович Крицын

Актуальность проблемы

Изучение регуляции экспрессии генов является одной из наиболее актуальных проблем в современной молекулярной биологии. Многоклеточные организмы образуют различные типы клеток, отличающиеся по строению и выполняемым функциям. При этом клеточная идентичность и потенциал развития связаны с пространственно-временной регуляцией организации генома и его экспрессии.

Изучение энхансеров и инсуляторов является актуальной темой исследований. Энхансеры - это регуляторные элементы, способные усиливать транскрипцию отдельных генов или генных кластеров. Энхансеры могут активировать транскрипцию, располагаясь даже на значительном удалении от регулируемого промотора. В разное время было предложено множество различных моделей, объясняющих механизм работы энхансеров (Moreau et al., 1981; Blackwood and Kadonaga, 1998; Dorsett, 1999; de Laat et al., 2008). Большинство из предложенных моделей предполагают, что эти регуляторные элементы могут пространственно сближаться путем образования петли ДНК между энхансером и промотором. В результате факторы транскрипции, связывающиеся с энхансером и промотором, могут напрямую взаимодействовать друг с другом, или же привлекать (рекрутировать) дополнительные белковые факторы, инициирующие петлеобразование. В данном случае энхансеры выступают как места сборки пре-инициационного комплекса, а процесс образования петли необходим для доставки этого комплекса на промотор. Тем не менее, непонятно, каким образом происходит доставка этих комплексов, как обеспечивается специфичность взаимодействия между энхансером и промотором, а также какие процессы являются сигналом для начала активации (Spitz and Furlong, ¿012).

В последнее время становится ясно, что регуляция экспрессии генов в клетке осуществляется с помощью различных эпигенетических механизмов. Ключевым событием в активации транскрипции является появление открытой структуры хроматина, которая обеспечивается различными транскрипционными факторами. Поскольку энхансеры выступают в качестве платформы для связывания транскрипционных факторов, их эпигенетические метки также активно изучаются. Так, принято считать, что характерными эпигенетическими метками энхансеров являются H3K4mel и НЗК27ас (Heintzman et al., 2007; Kharchenko et al., 2010). Однако картирование по этим меткам выявило большое количество последовательностей ДНК, которые не обладают свойствами энхансеров (Spicuglia and Vanhille, 2012). Более того, существует мнение, что сами по себе модификации хроматина неспецифичны и являются следствием связывания определенных активаторных белков с определенными последовательностями ДНК (Ptashne., 2013). Поэтому вопрос об эпигенетических маркерах энхансеров остается актуальным и требует дальнейшего изучения.

Еще одним важным аспектом работы энхансеров является синтез некодирующих, энхансерных РНК (эРНК). Синтез эРНК происходит с обеих сторон от энхансера, при этом уровень этого синтеза сравним с уровнем транскрипции регулируемого гена (Tchurikov et al, 2009; Kim et al., 2010). Корреляция уровня экспрессии этих некодирующих РЖ с экспрессией соседних генов указывает на их возможную функциональную роль в активации транскрипции на промоторе, однако механизм этого процесса до конца неясен. Более того, пока не ясно, как организован синтез эРНК. В настоящее время в литературе существуют противоречивые данные об их размере, а также о наличии или отсутствии у них сигналов полиаденилирования (Kim et al., 2010; Koch et al., 2011). Недавние исследования показали, что эти параметры широко варьируют у различных эРНК (ENCODE Project Consortium., 2012). Использованная данной работе система генетических конструкций, исключающая регуляторное влияние геномного окружения, позволяет подробнее изучить механизм работы энхансеров, исследовать характерные для энхансеров метки хроматина, а также проанализировать индуцируемые энхансером РНК.

and Dean, 2012). Было обнаружено, что нокдаун CTCF в клетках человека нарушает образование инсуляторами обособленных петлевых доменов, что косвенным образом негативно влияет на взаимодействие между энхансером и промотором гена АРО (Mishiro et al., 2009). Однако какие механизмы лежат в основе функционирования энхансеров и инсуляторов пока неизвестно. Регуляция дистантных взаимодействий между энхансером и промотором может обеспечиваться через управление внутриядерной локализацией отдельных хромосомных доменов за счет взаимодействия с некоторыми ядерными белками, например с когезином и ламинами. Было показано, что сайты связывания инсуляторных белков ограничивают области хроматина, взаимодействующие с ламиной (Herold et al., 2012; van Bemmel et al., 2010). При этом эти области, как правило, характеризуются низкой транскрипционной активностью, а также обогащены инактивирующими эпигенетическими метками (Pickersgill et al., 2006, Guelen et al., 2008). Кроме того, известно, что образуемые инсуляторами макромолекулярные комплексы, так называемые инсуляторные тельца, локализуются на периферии ядра и представляют собой комплексы инсуляторных белков и ДНК (Gerasimova et al., 2000). Связанные с инсуляторными белками области ДНК образуют отдельные петли - независимые экспрессионные домены, а ламина в данном случае выступает в качестве стабилизатора этих доменов (Gerasimova et al., 2000).Также, показано, что убиквитин-лигаза dTopors, входящая в состав инсулятора gypsy, может взаимодействовать с ламиной, и, возможно, участвует в заякоривании инсуляторных телец на ламине (Capelson and Corees, 2005). Однако согласно другим данным, инсуляторные тельца являются всего лишь белковыми агрегатами и не содержат ДНК (Golovnin et al., 2007). Таким образом, вопрос о строении и функции инсуляторных телец нуждается в дальнейшем изучении.

Цели и задачи исследования

Целями данной работы было:

1. Определить в трансфецированных генетических конструкциях, содержащих энхансер мобильного элемента copia, старт-сайты транскрипции (transcription start sites, TSS) энхансерных РНК (эРНК) и их размеры;

2. Изучить возможное влияние инсулятор(ов) мобильного элемента gypsy на синтез эРНК;

3. Выявить некоторые модификации гистона НЗ, вызываемые энхансером и инсулятором в разных областях генетических конструкций, содержащих энхансер мобильного элемента copia и инсулятор(ы) мобильного элемента gypsy,

4. Изучить связывание инсуляторных белков Su(Hw), dCTCF и mod(mdg4)2.2 в разных частях генетических конструкций, содержащих энхансер и инсулятор(ы);

5. Изучить возможность связывания геномных копий инсулятора мобильного элемента gypsy, а также ряда инсуляторов Su(Hw) и dCTCF в составе ВХ-С с ядерной ламиной в культуральных клетках S2 Drosophila melanogaster.

Для достижения поставленных целей нами были определены следующие задачи:

в трансфецированных генетических конструкциях, содержащих энхансер мобильного элемента copia и инсулятор мобильного элемента gypsy

• Определить TSS эРНК с помощью 5'RACE;

• Определить TSS эРНК с помощью primer-extension;

• Провести анализ эРНК с помощью Норзерн-блот-гибридизаций;

• Изучить влияние энхансера и инсулятора на модификации гистона НЗ с помощью иммунопреципитации хроматина;

• Провести анализ связывания инсуляторных белков дрозофилы Su(Hw), dCTCF и mod(mdg4)2.2 в различных районах генетических конструкций с помощью иммунопреципитации хроматина;

• Кроме того, исследовать взаимодействие геномных копий gypsy и шести инсуляторов в составе ВХ-С с ламиной в культуральных клетках S2 Drosophila melanogaster.

Научная новизна результатов исследования

В данной работе, используя трансфецированные генетические конструкции, мы выявили эпигенетические механизмы, с помощью которых работают энхансеры и инсуляторы. В системе, исключающей цис-регуляторное влияние геномного окружения, нами впервые обнаружено, что основная часть TSS эРНК находится на расстоянии 265 п.н. от энхансера copia. Определены размеры данных эРНК. В ходе исследования структурно-функционального состояния хроматина в трансфецированных генетических конструкциях показано, что именно в местах максимального синтеза эРНК энхансерами индуцируются и модификации хроматина НЗК4шеЗ и НЗК18ас, которые видимо и вызывают синтез эРНК. Впервые обнаружено, что введение инсулятора в конструкции снижает уровень данных модификаций и одновременно стимулирует образование других модификаций - НЗК4ше1 и НЗК27ас. Все это приводит к резкому уменьшению уровня синтеза эРНК. Кроме того, выявлено, что инсуляторные белки дрозофилы могут взаимодействовать не только с инсулятором, но и с энхансером, и что при этом инсулятор конкурирует с энхансером за связывание инсуляторных белков. Также впервые показано, что белок dCTCF может связываться с инсулятором мобильного элемента gypsy. Кроме того, подтверждено связывание геномных инсуляторов с ядерной ламиной, что указывает на ее роль в функционировании этих регуляторных элементов.

Научно-практическая ценность

Полученные в настоящей работе данные раскрывают некоторые аспекты работы цис-регуляторных элементов и могут быть полезны в дальнейших исследованиях молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов в геноме. Результаты исследования механизмов работы энхансеров и инсуляторов в клетках модельного организма Drosophila melanogaster могут помочь в изучении данных механизмов в клетках человека и в дальнейшем могут быть использованы в биомедицинских исследованиях.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на международном симпозиуме Cell Symposia «Regulatory RNAs» (Чикаго, США, 2011), на X чтениях памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2011), на 16 международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012), а также на международной конференции EMBL 10th Transcription and Chromatin (Гейдельберг, Германия, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 4 тезиса докладов и сообщений на научных конференциях.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, изложение полученных результатов и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 130 листах машинописного текста и содержит 25 рисунков. Список литературы включает 388 источников.

Результаты

Анализ распределения TSS в конструкции e-h с помощью метода 5' RACE (Rapid Amplification of 5' Complementary DNA Ends)

Ранее было показано, что в трансфецированной генетической конструкции e-h энхансером, в прилежащих к нему областях индуцируется синтез специфических, энхансерных РНК (эРНК), причем введение инсулятора ингибирует эту транскрипцию (Tchurikov et al., 2009). В данной работе нами было изучено распределение стартов транскрипции эРНК, синтезирующихся в направлении промотора. Исследование этого распределения нами проводилось с использованием метода 5'RACE. Данный метод основан на амплификации 5'-

областей транскриптов. Сначала на тотальной РНК нарабатывали кДНК с помощью праймера prl-cw(-), комплементарного области R3 конструкции e-h. На 3'-концы полученных молекул кДНК добавляли олиго(с!С)-тракт с помощью терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы (TdT). Далее, кДНК последовательно амплифицировали с помощью неспецифических праймеров ААР и AUAP (5'RACE System, Promega, США) и специфического праймера pr-cw-2

Г Г Г ГГ 27111

4 4 IT pr-^cw-2

252 6

CAAAAGGCCAGGAACCGTGAWiAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCC TGACNAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAAAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTT

259 9 — четыре клона

ACAAAAATCGACGCCCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCG TTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTT

2645

ATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGC CGC

2656 — четыре клона

AGGCGTTTCCCCCTGGAGGCTCCCTCGCGCGCTCTCCTGTTCCGACCCrGCCGCTT 2665

TTTCTCCCCTGGAAGCTCCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCCTGCCGCTT

,2250

Рис. 1 Старт-сайты и последовательности одиннадцати случайных клонов, содержащих 5' концевые области эРНК. enh(copia) - энхансер, вставленный в область 2250 исходного вектора pGL-3-Enhancer. Праймер pr-cw-2 использовался для амплификации на последнем этапе 5' RACE. Его 5* конец соответствует позиции 2711 в исходном векторе. В последовательностях клонов жирным шрифтом показаны старты транскрипции (с указанием номера нуклеотида по последовательности исходного вектора, АС # U47297) и область праймера pr-cw-2. Стрелки на схеме указывают старт-сайты.

Анализ одиннадцати случайных клонов показал, что все найденные TSS приходятся на последовательность ДНК, следующей за энхансером. Кроме того, в двух случаях нами было обнаружено по четыре одинаковых TSS, что указывает на то, что эти старт-сайты являются горячими точками транскрипции. При этом большая часть TSS эРНК приходится на область генетической конструкции, удаленную от энхансера на 265 п.н. (Рис. 1).

PCR-продукты после 5' RACE также анализировались с помощью мультиплексного однонаправленного глубокого секвенирования на платформе 454. Предварительно, проба для проведения глубокого секвенирования нарабатывалась на PCR-продукте после 5' RACE с помощью праймера, содержащего также MIDI последовательность AGGAGTGCGT, необходимую для компьютерного распознавания данных сиквенсов при обработке результатов мультиплексного секвенирования.

В результате нами были получены 2895 "правильных" чтений. Как и в случае капиллярного секвенирования, большинство TSS обнаруживалось в области, удаленной от энхансера на 265 п.н. (Рис.2). Также нами были отмечены горячие точки TSS. Так, например для TSS 2613 (координаты по исходному вектору pGL3-Enhancer, АС # U47297) было прочитано 58 чтений, для TSS 2634 - 26, а для TSS 2642 - 62 чтения. Таким образом, все найденные TSS приходятся на последовательность ДНК, следующую за энхансером. При этом большая часть TSS эРНК приходится на область генетической конструкции, удаленную от энхансера на 265 п.н.

30-20-

2600

start-site position

enh(copia)

hsp

Pr-cw-2

Рис. 2 Распределение стартов транскрипции, полученное в результате мультиплексного однонаправленного глубокого секвенирования на платформе

454 а) Распределение старт-сайтов. По оси X указаны координаты по исходному вектору рОЬЗ-епЬапсег (Ргопг^а, США). По оси У- количество чтений. Ь) Схема конструкции е-Ь. Стрелкой указан праймер рг-с\у-2, использованный для наработки РСЯ-продукта при 5'-ЯАСЕ.

Анализ распределения TSS в конструкции e-h с помощью primer extension

Для того, чтобы наглядно показать распределение Твв, использовали еще один подход -удлинение праймера на амплифицированной кДНК. Препарат кДНК, полученный на тотальной РНК, выделенной из клеток, трансфецированных конструкцией е-Ь, амплифицировапи праймерами АЦАР (1пуйго§еп) и рг-сш-2, как это делали для получения клонов с использованием Тс1Т. Затем, полученный препарат кДНК использовали для удлинения [з3-Р]-меченых праймеров с\у-3 и епЬ(-). Кроме того, параллельно было проведено "ручное" секвенирование конструкции е-Ь с используемых праймеров (Рис.3,4).

32-P-pr-cw-3

Рис. 3 Эксперименты по удлинению [32-Р|-меченного праймера cw-3(-). а) Фракционирование продуктов после реакции удлинения праймера cw-3. Рядом представлен сиквенс ДНК конструкции e-h с данного праймера. Стрелки внизу указывают на позицию исходного меченного праймера cw-3. Цифры указывают области согласно нумерации исходного вектора pGL-3-Enhancer. Справа от области фракционирования фрагментов ДНК в секвенирующем геле представлен профиль сканирования дорожки, содержащей продукты реакции удлинения праймера. б) Сравнение паттернов распределения полос при удлинении меченого праймера cw-3(-) на кДНК после 5'RACE и на конструкции e-h, разрезанной в области 2250 (рестрикция BamHI). Квадратными скобками обозначены области с максимальным количеством материала при удлинении праймера cw-3 на кДНК (primer extension) и на конструкции e-h, разрезанной в области 2250 (e-h/BamHI).

Полученное распределение полос на геле отражает распределение стартов транскрипции эРНК и не связано со случайной остановкой синтеза фрагментом Кленова, поскольку при удлинения праймера [33P]-cw-3 на конструкции e-h, разрезанной в области 2250 п.н. (рестрикция BamHI) наблюдался другой паттерн распределения полос, преимущественно в области геля, расположенной выше координаты 2546 п.н., в то время как основная часть TSS расположена за этой областью (Рис. 36). Кроме того, последовательность сиквенса дорожек A,G,C, Т (РисЗ а,б) также указывает на отсутствие стронг-стопов в данном фрагменте ДНК.

В результате пами было получено распределение TSS эРНК как в области между энхансером и промотором, так и в самом энхансере (Рис.З а,б). Однако, следует учесть, что амплифицированная ДНК содержит добавленную последовательность праймера AUAP и олиго-(С) тракта, равная примерно 30 нуклеотидам. В итоге, в ходе эксперимента по удлинению меченого праймера cw-З, мы наблюдали в геле заметное количество меченой ДНК перед областью 2515 п.н. (координаты по исходному вектору pGL-3-Enhancer). Также видны области хорошо выраженных "горячих точек", соответствующих 5'-концам эРНК. Таким образом, как и в случае анализа продуктов 5'RACE с помощью капиллярного и глубокого и секвенирования, нами было обнаружено, что основная часть TSS располагается примерно на удалении от энхансера на 250 - 300 п.н. (Рис. 3 а,б).

75/Ю5-. —

80/1 Ю -* = _

87/117 -- ~ — _

— •- 93

-- Ю5

-- 1 Ю

32-P-pr-enh(-)

Рис. 4 Фракционирование продуктов после реакции удлинения праймера епЬ(-). Рядом представлен сиквенс ДНК конструкции е-И с данного праймера. Стрелки внизу указывают на позицию исходного меченного праймера епЬ(-). Цифры слева (в числителе) указывают на номер нуклеотида в последовательности энхансера. Истинное положение старт-сайта в пределах энхансера приведено в знаменателе дроби (см. текст) или справа от сиквенса.

При удлинении праймера enh(-) нами также было замечено небольшое количество TSS в последовательности самого энхансера (Рис. 4). Так, нами были выявлены TSS в положении 93, 105 и 110 (нумерация по последовательности enh(copia), АС # Ml 1240).

Таким образом, в пределах энхансера находится минорная часть стартов транскрипции эРНК (Рис.4). Не удивительно, что мы не выявили их при изучении небольшого количества клонов кДНК на первом этапе работы.

Размеры энхансерных РНК варьируют от 300 до 1050 н.

Следующим этапом работы было определение размеров эРНК. Для этого нами был проведен Нозерн-блот анализ препаратов тотальной РНК, выделенной из клеток S2, трансфецированных конструкциями e-h и e-g-h. Равные количества препаратов тотальной РНК фракционировали в денатурирующем 5%-ном ПААГ и проводили электро-блоттинг на мембрану Hybond N+. В качестве зонда в Нозерн-гибридизациях использовали [32-Р]-меченый фрагмент R-3 (Рис. 5), который содержит основную массу стартов транскрипции эРНК (Федосеева и др., 2010).

(а) 2250

(copia) 1 г г г гг

5' HI 3'

! R3

2550 2 889

(S) п.н. i i s

1000-

500- щ

200- -

5.8S- -»0ЛЧ*

Рис. 5. Определение размеров эРНК с помощью Нозерн-блот гибридизации, а). Схема, показывающая исследуемую область в конструкциях e-h и e-g-h. Основная масса ранее обнаруженных TSS эРНК в районе R3 указана стрелками. Нумерация приведена по исходному вектору pGL-3-Enhancer (Promega, США), (б) Результат Норзерн-гибридизации с препаратами РНК, выделенными из клеток S2, трансфецированных конструкицями e-h и e-g-h, а также с препаратом из исходных не трансфецированных клеток. Указаны длины в РНК-маркере в п.н. Зонд - область R3.

Видно, что в конструкции e-h этой области соответствуют эРНК длиной от 300 до 1050 н. В основном они расположены в полосе длиной около 400 н. Добавление инсулятора между энхансером и промотором (конструкция e-g-h), приводит к заметному подавлению синтеза всех наблюдаемых эРНК. При этом в тотальной РНК исходных клеток S2, использованных для трансфекции, данные РНК не определялись. Это свидетельствует о том, что гибридизация происходит именно с энхансерными РНК, индуцируемыми энхансером copia, входящим в состав конструкции e-h (Рис. 5).

Анализ распределения модификаций хроматина в генетических конструкциях e-h, e-g-h

" g/g

Энхансерные РНК составляют значительную часть от всех некодирующих транскриптов в геноме (van Bakel et al., 2010). Однако механизм инициации транскрипции эРНК пока еще не ясен. Обнаруженная нами транскрипция эРНК (Федосеева и др., 2010) косвенно свидетельствует о том, что хроматин в исследуемых районах становится активным. Для проверки этой гипотезы мы изучили модификации хроматина H3K4mel и НЗК27ас, которые обычно связывают с

активными энхансерами (Heintzman et al., 2009), и модификации H3K4me3 и НЗК18ас, ассоциированные с активной транскрипцией (Bernstein et al., 2005) в различных районах генетических конструкций. Используемая нами система генетических конструкций позволяет выявить модификации хроматина, вызываемые энхансером и инсулятором, избегая влияния геномного окружения на это распределение. Для изучения модификаций хроматина генетические конструкции h, e-h и e-g-h были трансфецированы в клетки S2 Drosophila melanogaster, после чего клетки обрабатывались 3% раствором формальдегида для сшивки ДНК с белками. После обработки формальдегидом хроматин дробился ультразвуком до размеров 100-300 п.н.

д/д

e-h-g

H3K4me3 НЗК18ас НЗК4те1 ЬНЗК27ас НЗК4теЗ НЗК18ас НЗК4те1 ННЗК27ас НЗК4теЗ НЗК18ас НЗК4те1 НЗК27ас ТТэК4теЗ НЗК18ЭС НЗК4те1 НЗК27ас

Рис. 6 Эксперименты по иммунопреципитации хроматина с помощью антител к модификациям гнстона НЗ (НЗК4шеЗ, H3K4mel, НЗК18ас и НЗК27ае) в исследуемых областях конструкций. Цветная шкала показывает log2 значения интенсивности специфических модификаций гистонов в указанных районах конструкций.

На полученном после дробления хроматине проводилась иммунопреципитация с антителами к выбранным модифицированным гистонам. Фрагменты ДНК после иммунопреципитации анализировались посредством количественной PCR (Tchurikov et al., 2013) с праймерами к трем районам генетических конструкций - области энхансера (R1), области с минимальным количеством TSS эРНК (R2) и области с максимумом TSS эРНК (R3). При анализе района R1, который соответствует самому энхансеру, использовали минус-праймер, соответствующий последовательности вектора. Таким образом, мы следили за областью энхансера только в конструкциях, а не в его геномных копиях.

Для наглядного представления результатов иммунопреципитации использовали цветную шкалу (heatmap). Для этого вычислялся log2 от значений интенсивности уровня специфических модификаций гистонов (Рис. 6).

Оказалось, что все изучаемые четыре варианта модификаций гистона НЗ присутствуют в энхансере. Добавление одной или двух копий инсулятора немного увеличивает доли НЗК4шеЗ, H3K4mel и НЗК27ас в области энхансера. В конструкции e-h, в районе, непосредственно прилежащем к энхансеру, R2, также содержащем мало стартов транскрипции эРНК, количество НЗК4теЗ немного возрастает, a H3K4mel заметно уменьшается (Рис. 6). В ответ на введение одного или пары инсуляторов, содержание НЗК18ас в данном районе падает. Интересно, что только в районе R3, где расположена основная часть стартов транскрипции эРНК, введение энхансера приводит к заметному возрастанию модификаций НЗК4теЗ и НЗК18ас (Рис. 6). Полученные данные согласуются с недавними исследованиями, в которых было показано, что модификация НЗК4теЗ является эпигенетической меткой активных энхансеров (Pekowska et al., 2011; Wang et al ., 2008). Кроме того, ацетилирование H3K18ac также обнаруживается на

активных энхансерах (Ernst et al., 2011; Zentner et al., 2011) Инсулятор же в этом районе действует как антагонист энхансера, уменьшая содержание данных модификаций и вызывая появления больших количеств модификаций H3K.4mel и, особенно, НЗК27ас. Интересно, что в данном районе, R3, энхансер не влияет на содержание последних двух модификаций.

Анализ связывания инсуляторных белков Su(Hw), |mod(mdg4)l2.2 и dCTCF с различными районами конструкций e-h, e-g-h и g/g

Одной из основных функций инсуляторов является блокирование взаимодействия между энхансером и промотором. Однако в ходе недавних исследований стало ясно, что инсуляторы скорее управляют этим процессом, а не ингибируют его (Krivega et al., 2012). Тем не менее, до сих пор не ясен механизм обеспечения специфичности и стабильности этого процесса (Bortle and Corees, 2013).

Для выяснения механизмов работы инсуляторов мы исследовали связывание в разных частях используемых конструкций трех инсуляторных белков: Su(Hw) и mod2.2, входящих в состав инсулятора gypsy (Dorsett 1990; Ghosh et al., 2001) а также белка dCTCF, гомологичного основному инсуляторному белку млекопитающих CTCF. Для этого мы провели иммунопреципитацию хроматина с антителами к этим инсуляторным белкам. Исследуемые районы содержали энхансер (R1), 5' и 3' области инсуляторов gypsy в конструкциях e-g-h и g/g (3'Gl, 5'G!, 3'G2, 5'G2), промотор hsp70 (HSP), а также районы с минимальным (R2) и максимальным (R3) количеством TSS эРНК. При этом "минус" праймер для наработки 3' области инсуляторов Gl и G2 (3'Gl и 3'G2) расположен в последовательности вектора, что позволяет амплифицировать только копии инсулятора в конструкциях. Аналогично, для наработки 5' области инсуляторов Gl и G2 (5'G1 и 5'G2) использовали "плюс" праймер, расположенный в векторе, а для амплификации hsp70 - "минус" праймер, расположенный в области гена lue.

Инсуляторные белки связываются с энхансером copia.

При анализе связывания инсуляторных белков Su(Hw), mod2.2 и dCTCF в районе энхансера нами было обнаружено, что все эти белки с разной интенсивностью связываются с энхансером в отсутствие инсулятора gypsy (конструкция e-h). Особенно заметно связывание mod2.2 (Рис. 7). Связывание mod2.2 также обнаруживается и в районе R2, прилежащем к энхансеру. Это не означает, что антитела к Su(Hw) или к dCTCF были менее активными, т.к. хорошие сигналы при ChIP-PCR обнаруживали и в экспериментах с этими антителами (Рис. 8).

Рис. 7. Связывание инсуляторных белков в районах RI, R2 и R3 в конструкциях e-h, e-g-h и g/g. а)

Схема, показывающая область, включающую энхансер и два района, следующие за ним в направлении промотора hsp70. Четыре части в энхансере показывают тандемные повторы enh(copia). Стрелки указывают расположение "плюс" и "минус" праймеров. (в) Интенсивность связывания энхансерных белков с исследуемыми районами. Цветная шкала показывает log2 значения интенсивности специфического связывания белка с районами конструкций.

Связывание белков mod2.2 и dCTCF с энхансером резко подавляется введением одной копии инсулятора в конструкцию, но сохраняется при введении пары инсуляторов (Рис.7). То есть, один инсулятор успешно конкурирует за связывание инсуляторных белков с энхансером, тогда как пара инсуляторов это сделать не способна.

В настоящее время, отсутствуют данные, подтверждающие возможность взаимодействия инсуляторных белков Drosophila melanogaster с энхансерами. Однако было показано, что у млекопитающих инсуляторный белок CTCF способен взаимодействовать с энхансер-связывающим белком рЗОО, облегчая активацию промоторов регулируемых энхансером генов (Handoko et al., 2011).В данном случае, не ясно, связывается ли dCTCF непосредственно с последовательностью энхансера copia, или же просто взаимодействует с другими белками в составе белковых комплексов.

С инсулятором gypsy в генетических конструкциях связывается не только Su(Hw), но иdCTCF

При изучении области первого инсулятора (районы 5'G1 и 3'G1), нами были получены данные о связывания инсуляторных белков.

(а)

5' З1

hsp70 lue

—

5G1 3d hsp70

(б) ш en

«HJ CTCF

1 4

m log2

Шя Г" mod2.2

Рис. 8 Связывание инсуляторных белков в области первого инсулятора gypsy (G1) в конструкциях e-g-

li и g/g и в промоторе hsp70 в конструкциях e-h, e-g-h и g/g. (а) Схема исследуемых районов G1 и hsp70. Желтые прямоугольники указывают сайты связывания Su(Hw). Стрелки указывают расположение "плюс" и "минус" праймеров, использованных для PCR (б) Интенсивность связывания энхансерных белков с областями 5'G1 и 3'G1 (инсулятор) и с hsp70. Цветная шкала показывает log2 значения интенсивности специфического связывания белка с указанными районами конструкций.

Как и ожидалось, нами было выявлено связывание инсуляторных белков Su(Hw) и mod2.2 с инсулятором gypsy. Это согласуется с литературными данными о свойствах этого инсулятора, поскольку данные белки являются его структурными компонентами (Ghosh et al., 2001). Однако, согласно полученным результатам, оказалось, что dCTCF также связывается с инсулятором gypsy в последовательностях LTR данного элемента (Рис 8).

dCTCF не входит в состав инсулятора gypsy, однако недавно посредством полногеномного анализа было определено, что сайты связывания белка dCTCF перекрываются с сайтами связывания других инсуляторных белков, в том числе и Su(Hw) (van Bortle., 2012).

Mod2.2 связывается с промотором в конструкции e-h

В ходе анализа связывания инсуляторных белков в области hsp70 промотора, регулирующего активность репортерного гена люциферазы (lue), нами было обнаружено, что с промотором в конструкции e-h, в которой отсутствует инсулятор, активно связывается белок Mod2.2. При этом при добавлении одного инсулятора (область G1 в конструкции g), а также при

добавлении пары инсуляторов (области G1 и G2 в конструкции g/g) это связывание заметно ослабляется (Рис. 8). Полученные данные согласуются с полногеномным исследованием распределения сайтов связывания инсуляторных белков, в котором было показано, что Mod2.2 преимущественно обнаруживается в области промотора (Negre et al., 2010).

Инсуляторные белки связываются преимущественно с 5' областью инсулятора Glue З'областью инсулятора G2 в конструкциях e-g-h и g/g

Интересные данные получены при анализе связывания в 5' и 3' половинах второго инсулятора gypsy в конструкции g/g (5'G2 и 3'G2 на Рис. 9 а,б). Ясно видно, что только в 3' половине G2 активно связываются белки dCTCF и Mod2.2. В первой копии инсулятора (см. Рис. 8), напротив, 5' половина активно связывает все изучаемые белки (Рис. 9).

Подобное неравномерное распределение связывания белков dCTCF и Mod2.2 позволяет предположить, что копии инсулятора взаимодействуют между собой в конструкции g/g, располагаясь антипараллельно.

— —

5G2 (6) П ■ CTCF

Su(Hw)

■ mod2.2

1 4 loq2

Рис. 9. Связывание инсуляторных белков в области второго инсулятора gypsy (G2) в конструкции g/g.

(а) Схема, показывающая область инсулятора G2. Стрелки указывают положение "плюс" и "минус" праймеров, использованных для PCR. (б) Интенсивность связывания энхансерных белков с областями 5'G2 и 3'G2. Цветная шкала показывает log2 значения интенсивности специфического связывания белка с указанными районами конструкций.

Возможность взаимодействия между отдельными инсуляторами была многократно подтверждена в ходе экспериментов по изучению влияния инсуляторов на активацию энхансером репортерного гена в генетических конструкциях (Cai and Shen, 2001; Muravyova et al., 2001; Comet et al., 2006). Кроме того, было показано, что белок млекопитающих CTCF, аналог белка dCTCF Drosophila melanogaster, способен к олигомеризации, образуя отдельные петлевые домены за счет обьединения связанных с CTCF участков хроматина (Williams and Flavell, 2008; Zlatanova and Caiafa, 2009).

Анализ взаимодействия геномных копий инсуляторов evpsv, а также инсуляторов комплекса ВХ-С с ламиной

Ранее было показано, что различные комплексы инсуляторных белков, связанные с ДНК, могут взаимодействовать друг с другом, образуя инсуляторные тельца. Эти инсуляторные тельца заякориваются на ядерной ламине для стабилизации независимых экспрессионных доменов в отдельных петлях хроматина (Gerasimova et al., 2000). Однако также были получены данные, согласно которым инсуляторные тельца лишены ДНК, а представляют собой лишь депо для хранения инсуляторных белков (Golovnin et al., 2008).

(а)

н-Ат Lamin

(б)

dCTCF Su(Hw)

C+S-1 C+S-2

N-1

I i Sj3

CG 42342 ¿

Г Г 1 N"2 C-2 N-3 C-3

* i Fas1

Fas1 1 i I

* i IHII '-tt-» III » *

1 4« III_11 in »

Ubx bxd

(B)

11 IJ

Lamin

Рис. 10 Связывание иисуляторов Su(Hw) и dCTCF из района ВХ-С, а также геномных копий инсулятора gypsy с ядерной ламиной (на следующей странице). Схема, указывающая расположение праймеров, использованных для наработки геномных копий инсулятора gypsy. Приведены данные связывания с ламиной (% input). н-Ат - результат, полученный с антителом к неспецифическим IgG. (г) Карта района ВХ-С в геномной браузере IGB. Показаны координаты версии генома дрозофилы - апрель-2006 (dm3/BDGP R5). Стрелки указывают инсуляторы Su(Hw) и dCTCF, обозначенные как S или С. Выбраны и - N-1, N-2 и N-3 - три не-инсуляторных сайта. Ниже приведены данные связывания с ламиной (% input). н-Ат - результат, полученный с антителом к неспецифическим IgG. Нумерация сайтов соответствует указанной на геномной карте.

Для того, чтобы выяснить, могут ли инсуляторы взаимодействовать с ламиной, мы использовали подход с использованием количественной PCR после иммунопреципитации хроматина с антителами к ламину DmO Drosophila melanogaster. Для анализа мы выбрали шесть инсуляторов из области ВХ-С, картированных ранее с помощью ChlP-chip в линии Кс (Bushey et

al., 2009). Один инсулятор из шести содержал сайт связывания только Su(Hw) (S), три - только dCTCF (С). В двух случаях были выбраны инсуляторы, связывающие как Su(Hw), так и dCTCF (C+S-1 и C+S-2). В качестве контролей нами были выбраны три неинсуляторные области (N) (Рис.10 б). Все выбранные области входят в 5' концевую область большого форум-домена, содержащего ВХ-С (Tchurikov et al., 2011).

Также мы изучили связывание с ламиной геномных копий gypsy. Для изучения геномных копий gypsy мы использовали праймеры, расположенные внутри LTR данного элемента (Рис. 10а). Данные представлены в процентах от взятой на иммунопреципитацию ДНК (% input). В результате мы получили данные, свидетельствующие о том, что геномные копии LTR gypsy активно связываются с ламиной (Рис. 10а).

При изучении инсуляторов ВХ-С также были получены данные о взаимодействии с ламиной. Так оказалось, что с ламиной взаимодействуют все шесть изученных нами инсуляторов (Рис. 1 Ов). Кроме того, один из неинсуляторных фрагментов (N-3), расположенный в интроне гена Ubx также обнаружил связывание. Этот факт подтверждает клеточную специфичность активности инсуляторов (Matzat et al., 2012), а также ранее описанную локализацию области ВХ-С, связанную с инсуляторными белками на ламине (Gerasimova et al., 2000).

Обсуждение

Роль энхансеров и инсуляторов в изменении структурно-функционального состояния хроматина

эРНК и малые петли хроматина

Адекватная регуляция работы генома, необходимая для своевременного ответа на стимулы как внутренней, так и внешней среды, обеспечивается различными цис-регуляторными элементами, такими как энхансеры, промоторы, инсуляторы и сайленсеры, которые способны взаимодействовать между собой. Так, энхансеры дистантно активируют транскрипцию регулируемых ими генов через взаимодействие с промоторными областями, в то время как инсуляторы могут влиять на это взаимодействие либо ограничивая, либо наоборот облегчая его (van Bortle and Corees, 2013, Krivega and Dean, 2012). В настоящее время становится очевидным, что действие как энхансеров, так и инсуляторов связано с изменениями структурно-функционального состояния хроматина.

В результате данного исследования нами впервые изучены старты транскрипции эРНК с помощью 5'RACE и primer extension. Оба использованных нами подхода свидетельствуют о том, что лишь небольшая часть эРНК начинает синтезироваться с разных старт-сайтов в самом энхансере copia, а также сразу за ним, в пределах ближайших 260 п.н.. Основная же часть старт-сайтов рассеяна в области, находящейся на расстоянии более 260 п.н. от последовательности ДНК энхансера. Мы предполагали, что транскрипция данных эРНК может инициироваться в самом энхансере, однако то, что основная часть TSS эРНК находится за пределами энхансера, оказалось для нас неожиданным. Мы предполагаем, что синтез эРНК как в самом энхансере, так и на расстоянии 265 п.н. от него, скорее всего, инициируется комплексами РНК полимеразы II. Возможно, что связанные с энхансером белки и белковые комплексы, в том числе комплексы, содержащие РНК полимеразу II, вызывают образование небольших петель ДНК с обеих сторон от энхансера. Причем, скорее всего, процесс образования данных петель является энергозависимым и требует участия АТФ. Комплексы РНК полимеразы II, при продвижении по направлению к промотору, могут рекрутировать другие белки и белковые комплексы, модифицирующие хроматин. Специфические модификации гистоновых белков могут служить сигналом для синтеза эРНК в областях, удаленных от энхансера примерно на 265 п.н. Области петель при этом не модифицируются (Рис.11). Образование петель именно такого размера может быть обусловлено ригидностью структуры ДНК, поскольку минимальный размер фрагмента двуспиральной ДНК, способного образовывать кольцо составляет 250-300 п.н. (Shore et al., 1981). Таким образом, комплексы, связанные с энхансером, физически не могут контактировать с последовательностью ДНК в области петель.

петля - мало модификаций

энхансерные

^ enh шии

белки

■+ т + т + t t * + + +

enh

Л_±_

белки

J-J.J-4.J.J.XV-

модификации H3K4me3 и H3K18ac

промотор

Рис. 11 Схема, иллюстрирующая предполагаемый механизм образования петель хроматина в генетических конструкциях, содержащих энхансер. Большими стрелками указано направление "протягивания" хроматина (Федосеева и др., 2012).

Предложенный нами механизм согласуется с литературными данными. Так, например, было показано, что РНК полимераза II , обнаруживается на многих энхансерах (Louie et al., 2003; Shang et al 2002). Более того, белковый комплекс Mediator, коактиватор транскрипции эукариот, способен не только связываться с энхансерами (Kuras et al., 2003), но и запускать образование петель ДНК, через взаимодействие с когезином (Kagey et al., 2010).

Участие петлеобразования в регуляции транскрипции генов также недавно было определено в ходе изучения промоторов дрожжей. Оказалось, что образуемые петли между промотором и сайтом полиаденилирования необходимы для поддержания направления транскрипции на промоторах, при этом потеря возможности образовывать петли приводит к ослаблению транскрипции и увеличению количества РНК, ассоциированных с промотором (PASR) (Tan-Wong et al., 2012), что косвенным образом подтверждает важность процесса петлеобразования в регуляции экспрессии генов.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о синтезе эРНК на расстоянии 265 п.н. от энхансера. Кроме того нами предложен механизм, объясняющий инициацию синтеза этих РНК с обеих сторон от энхансера, однако причинно-следственные связи между запуском транскрипциии эРНК и образованием петли между энхансером и промотором пока еще не выяснены. Не ясно также, какие белки участвуют в этих процессах.

В литературе стали появляться данные о функциональной значимости эРНК. Так было показано, что энхансер гена MYOD1 в клетках человека запускает синтез эРНК, которые в свою очередь увеличивают количество РНК-полимеразы II на промоторе. Также, оказалось, что эРНК регулируют доступ транскрипционного комплекса к определенным геномным областям, таким образом, обеспечивая специфическую транскрипцию через изменение структуры хроматина. (Mousavietal., 2013).

эРНК и модификации хроматина.

Обнаруженная нами активная транскрипция с обеих сторон вокруг энхансера дрозофилы косвенно свидетельствует о том, что хроматин в этих районах становится активным (Tchurikov et al., 2009). Мы предполагаем, что связанные с энхансером белковые комплексы вызывают появление открытой структуры хроматина в областях, удаленных от энхансера на 265 п.н. Это подтверждается ранее полученными данными в нашей лаборатории с применением тех же генетических конструкций. Так, наличие открытой структуры хроматина в области удаленной от энхансера на 265 п.н. было обнаружено в экспериментах с ДНКазой. Кроме того, именно район с

максимальным количеством TSS эРНК содержит сайты связывания ТВР и РНК-полимеразы II. (Моисеева и др., 2011). Открытая структура хроматина, в свою очередь, может обеспечиваться посредством модификаций гистоновых белков. Эти модификации могут служить сигналами для синтеза эРНК. Поэтому, мы исследовали специфические модификации гистона НЗ в различных районах генетических конструкций, в том числе и в области с максимальным количеством TSS эРНК.

Согласно литературным данным, принято считать, что эпигенетическими метками активных энхансеров дрозофилы являются модификации гистонов H3K4mel, НЗК27ас и НЗК18ас, а также связывание белка СВР/рЗОО (ModENCODE Consortium et al., 2010). В геноме человека энхансеры также связывают рЗОО, а вокруг них находится хроматин, меченный H3K4mel и НЗК27ас (Rada-Iglesias et al., 2011). При этом модификация НЗК4шеЗ характерна только для активных промоторов и на энхансерах этой модификации нет (Heintzman et al., 2007).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что сами энхансеры приобретают характерные метки хроматина (H3K4mel, H3K4me3, НЗК27ас, и НЗК18ас). Кроме того, они вызывают модификации в последовательностях ДНК, расположенных вокруг них -непосредственно рядом, в пределах 265 п.н. (небольшое увеличение НЗК4шеЗ, уменьшение H3K4mel и НЗК27ас), а также на удалении 265 п.н. (резкое увеличение меток НЗК4шеЗ и НЗК18ас). Мы считаем, что именно модификации НЗК4шеЗ и НЗК18ас связаны непосредственно с воздействием энхансера enh(copia), тогда как модификации НЗК4ше1 и НЗК27ас - с эффектом инсулятора gypsy. Однако следует также иметь в виду, что разные энхансеры в разных клетках могут обладать разными свойствами.

Подобное противоречие между полученными в данной работе результатами и литературными данными может быть связано с тем, что в нашей системе было исключено возможное цис-влияние геномного окружения на распределение модификаций хроматина. Описанные эпигенетические маркеры энхансеров изучали с помощью полногеномного секвенирования осажденной с антителами ДНК (Chip-seq) (ModENCODE Consortium, 2010). При этом подходе нельзя исключить цис-влияние окружающих регуляторных элементов, расположенных на разном расстоянии от выявленных энхансеров и инсуляторов. В данной работе мы использовали аналитическую систему, специально предназначенную для изучения влияния отдельных регуляторных элементов дрозофилы, которая предполагает использование трансфецированных генетических конструкций, содержащих определенные регуляторные элементы и репортерный ген люциферазы (Tchurikov et al., 2009). Преимуществом этой системы является то, что она позволяет исключить влияние других возможных регуляторов генома на наблюдаемые эффекты в генетических конструкциях (Федосеева и др., 2010; Федосеева и др., 2011; Федосеева и др., 2013). С другой стороны, в последнее время ставится под сомнение четкая корреляция между модификацией H3K4mel и активными энхансерами. Так было показано, что некоторые известные активные энхансеры лишены модификации НЗК4ше1, и при этом обогащены модификацией H3K4me3 (Barski et al., 2007; Pekowska et al., 2011). Кроме того, существует мнение, что ключевым событием в регуляции экспрессии генов является связывание активаторных или репрессорных белков, которые впоследствии модифицируют хроматин вокруг сайта связывания либо самостоятельно, либо через привлечение модифицирующих хроматин ферментов. Модификации хроматина же сами по себе неспецифичны, не несут никаких функций в активации или репрессии генов, а всего лишь являются следствием активности связывающихся с хроматином белков (Ptashne., 2013).

Таким образом, обнаруженное нами распределение стартов транскрипции эРНК, а также выявленные модификации хроматина свидетельствуют о том, что энхансеры могут действовать не только непосредственно, генетически, но также и опосредованно, эпигенетически, причем последний путь является основным. Надежным независимым доказательством этого вывода служит тот факт, что, после удаления энхансера активная транскрипция может сохраняться, поскольку сохраняются модификации хроматина в месте расположения энхансера - так называемая транскрипционная память (Chong et al., 2010; Sen et al., 2010).

Размеры эРНК.

В данной работе мы проанализировали размеры эРНК. Оказалось, что они варьируют от 300 до 1050 н. В настоящее время выделяют два класса эРНК. В первый класс входят транскрипты длинной более 4000 н. Эти транскрипты являются однонаправленными, а также несут сигналы полиаденилирования. Данный тип эРНК был обнаружен в ходе анализа энхансеров, расположенных внутри интронов кодирующих генов. Энхансер в данном случае выступает как альтернативный промотор для синтеза некодирующих транскриптов (Kowalczyk et al., 2012). Второй класс эРНК представляет собой транскрипты меньшей длины, от 500 до 2000 н. Эти эРНК не полиаденилированы и синтезируются в обоих направлениях от энхансера (Kim et al., 2010; Koch et al., 2011). В данной работе мы использовали препараты тотальной РНК. Поэтому не ясно, являются ли эти эРНК ядерными, или же они могут полиаденилироваться и транспортироваться в цитоплазму. Кроме того, не ясен механизм созревания этих эРНК, не ясно существуют ли у исследуемых эРНК более длинные предшественники. Для того чтобы ответить на эти вопросы, мы планируем в дальнейшем изучить только ядерную фракцию эРНК.

Согласно данным, полученным в ходе Нозерн-блот анализа, введение в конструкцию инсулятора gypsy ингибирует синтез всех наблюдаемых эРНК. Механизм этого ингибирования не ясен. Мы предполагаем, что инсулятор может непосредственно контактировать с энхансером (модель ловушки), тем самым препятствуя связыванию с ним транскрипционных факторов, вызывающих образование малых петель ДНК и инициирующих синтез некодирующих транскриптов. Эта гипотеза также подтверждается данными, полученными в ходе анализа связывания инсуляторных белков Su(Hw), CTCF и mod2.2 в генетических конструкциях (см. Рис. 1)

Роль инсуляторных белков в регуляции дистантных взаимодействий

Инсуляторы представляют собой комплексы инсуляторных белков с ДНК, которые способны облегчать дистантные внутрихромосомные и межхромосомные взаимодействия. Как правило, взаимодействия, обеспечиваемые инсуляторными белками, предполагают прямые функциональные контакты между регуляторными элементами, такими как энхансеры, промоторы, а также между независимыми хромосомными доменами, связанными с кооперативной регуляцией транскрипции генов в домене (van Bortle et al., 2013). Связывание инсуляторных белков Su(Hw), mod2.2 и dCTCF с не только с инсулятором, но и с энхансером copia, обнаруженное нами в ходе иммунопреципитации хроматина трансфецированных генетических конструкций, свидетельствует об их участии в функционировании данного энхансера. При этом особенно заметно связывание mod2.2 (Рис. 12а). Кроме того, mod2.2 обнаруживается также в областях R2 и R3 прилежащих к энхансеру и на промоторе hsp70. Данный белок не способен напрямую связываться с ДНК, но, как было показано (Georgiev and Gerasimova, 1989), взаимодействует через BTB/POZ-домен со многими ДНК-связывающими инсуляторными белками дрозофилы, в том числе и с Su(Hw) и dCTCF. Кроме того mod2.2 взаимодействует с белком CP 190, который, в свою очередь, также взаимодействует с Su(Hw) и dCTCF. Таким образом, высокий уровень mod2.2 может обеспечиваться за счет того, что этот белок участвует во многих белковых комплексах и, соответственно, чаще осаждается в ходе иммунопреципитации. Кроме того, не исключено, что mod2.2 может взаимодействовать и с другими BTB/POZ-связывающими белками, которые могут также взаимодействовать с энхансером. В настоящее время в литературе отсутствуют данные, подтверждающие участие инсуляторных белков дрозофилы в обеспечении функционирования энхансеров. Так, при полногеномном картировании сайтов связывания dCTCF в геноме дрозофилы не было выявлено ассоциации данного белка с энхансерами. Более того, сайты связывания dCTCF преимущественно располагаются между энхансером и ближайшим неспецифическим промотором, что подтверждает энхансер-блокирующую функцию этого белка (Negre et al., 2010). Тем не менее, было показано, что белок CTCF позвоночных, чьим аналогом является белок dCTCF дрозофилы, способен обеспечивать взаимодействие между энхансер-связывающим белком рЗОО и промотором активируемого гена (Handoko et al., 2011). При этом присутствие CTCF не нарушает взаимодействие между промоторами и энхансерами (Sanyal et al., 2012). CTCF способен образовывать олигомеры через взаимодействие между отдельными молекулами белка, тем самым

сближая связанные с ними участки хроматина (Williams and Flavell, 2008; Zlatanova and Caiafa, 2009). Кроме того, существуют данные о взаимодействии CTCF с когезином (Parelho et al.,2008; Rubio et al., 2008), белком, способным стабилизировать хроматиновые нити и управлять взаимодействием между различными сайтами в геноме (Nativio et al., 2011).

Рис. 12 Модели, иллюстрирующие связывание инсуляторных белков в консрукциях е h. e-g-h и g/g (Федосеева и др, 2013). (а) Связывание инсуляторных белков в конструкции e-h. (б) Связывание инсуляторных белков в конструкции e-g-h. Предполагается, что первый инсулятор (Gl) "отбирает" инсуляторные белки от энхансера и связывает их на своей 5' половине. При этом инсулятор взаимодействуют с энхансером. (в) Связывание инсуляторных белков в конструкции g/g. Два инсулятора взаимодействуют с энхансером, а также между собой, при этом располагаясь антипараллельно.

На возможную роль инсуляторных белков в работе энхансера copia также указывает то, что, согласно полученным нами данным, при добавлении инсулятора в конструкции e-g-h связывание инсуляторных белков с энхансером ослабляется, а при введении еще одного инсулятора в конструкции g/g снова усиливается. То есть, инсулятор конкурирует с энхансером за связывание инсуляторных белков, в то время как пара инсуляторов конкурировать с энхансером не способна. Связывание в промоторе также подавляется одной копией инсулятора. Эти данные позволяют предполагать, что в конструкции e-g-h инсулятор может контактировать с энхансером, забирая инсуляторные белки на свою 5'половину (Рис.126). Эти данные согласуются с гипотезой, предполагающей, что инсуляторы могут выступать в качестве «ловушки» для энхансеров, обладая сродством к связанным с ним белкам и соревнуясь с промотором за энхансер (Geyer, 1997). При добавлении второго инсулятора (G2) белки dCTCF и Mod2.2 активнее связываются с 5'областью инсулятора Gl, в то время как в районе инсулятора G2 наблюдается активное связывание в 3'области.

Возможно, что подобное распределение инсуляторных белков указывает на то, что районы 5'G1 и 3'G2, в которых инсуляторные белки связываются менее активно, вовлечены в другие пространственные контакты и недоступны или малодоступны для связывания. Это согласуется с литературными данными, согласно которым, инсуляторы могут взаимодействовать между собой, как в составе генетических конструкций, так и в геноме (Cai and Shen, 2001;

Muravyova et al., 2001; Comet et al., 2006). Более того, возможность взаимодействия между инсуляторами в геноме может обеспечивать формирование в геноме независимых транскрипционных доменов (Corees et al., 2013).

Учитывая данные о взаимодействии инсуляторных белков с энхансером в конструкции е-h, мы предполагаем, что образуется комплекс, включающий энхансер и пару антипараллельно расположенных инсуляторов, которые связывают инсуляторные белки 5' половиной G1 и 3' половиной G2 (см. Рис.12в).

Таким образом, согласно полученным данным, инсуляторные белки могут участвовать в обеспечении взаимодействия между энхансером и промотором, между энхансером и инсулятором, а также между несколькими инсуляторами. Однако более точный механизм этого процесса у дрозофилы неясен и требует дальнейшего изучения.

Участие dCTCF в работе инсулятора gypsy

Классическими компонентами инсулятора gypsy считаются ДНК-связывающий белок Su(Hw), а также взаимодействующие с ним белки mod2.2 и CP 190 (Capelson and Corees., 2004). В ходе проведенного анализа связывания инсуляторных белков в конструкции e-g-h мы обнаружили, что dCTCF также связывается с инсулятором gypsy (Федосеева и др, 2013). Это согласуется с данными исследования, в котором было показано, что сайты связывания dCTCF обнаруживаются по всему геному, и во многих случаях перекрываются с сайтами связывания Su(Hw) (van Bortle et al., 2012).

Исходя из полученных нами данных, сложно сказать, связывается ли dCTCF непосредственно с последовательностью ДНК, или же просто со-осаждается в составе более крупных белковых комплексов. Так, например, известно, что dCTCF может взаимодействовать с белком СР190, который является одним из компонентов инсулятора gypsy. Кроме того, СР190 играет важную роль в образовании так называемых инсуляторных телец, объединяя в отдельных компартментах клетки различные инсуляторные белки, в том числе Su(Hw) и dCTCF (Gerasimova et al., 2007).

С другой стороны, связывание dCTCF с инсулятором gypsy может иметь функциональное значение, однако для определения роли dCTCF в функционировании инсулятора gypsy требуются дальнейшие исследования.

Значение ламины в формировании инсуляторных телец и функционировании инсуляторов

Ламина представляет собой фиброзный слой, расположенный между внутренней ядерной мембраной и периферическим хроматином. Специфические взаимодействия генома с ядерной ламиной необходимы для трехмерной укладки хромосом в ядре, а также для регуляции генной экспрессии. Заякоривание на ламине вызывает инактивацию отдельных хромосомных доменов и сопряжено со значительными эпигенетическими изменениями (Shumaker et al., 2006). Основной функцией инсуляторов является создание хроматиновых доменов за счет взаимодействия между отдельными инсуляторными белками. Взаимодействие с ламиной обеспечивает стабилизацию формируемых инсуляторами хромосомных доменов, а также образование специфических, инактивированных участков хроматина, ассоциированных с ламиной (LADs) (Shevelyov et al, 2009). Так, например, было показано, что сайты связывания инсуляторного белка Su(Hw) фланкируют LADs в геноме дрозофилы. Более того, данный белок непосредственно управляет взаимодействием хроматина с ламиной, регулируя транскрипционную активность всего генома (van Bemmel et al., 2010). Формирование независимых хромосомных доменов происходит за счет взаимодействия между инсуляторными белками и связанным с этими белками хроматином. Так при исследовании инсуляторов комплекса ВХ-С оказалось, что в результате взаимодействия между отдельными инсуляторами образуются специфические структуры (Рис.13, 14), так называемые инсуляторные тельца, определяемые как скопления инсуляторных белков и хроматина, локализующихся на ядерной ламине (Gerasimova and Corees, 1998; Gerasimova et al., 2000).

Рис. 13 Ядерная локализация ДНК-последовательностей из комплекса Bithorax содержащих инсерцию инсулятора gypsy в имагинальных дисках Drosophila melanogaster. А- окрашивание имагинальных дисков DAPI. В- FISH-гибридизация с ДНК-пробой из локуса Bithorax, содержащих инсерцию инсулятора gypsy (линия bx349). С-Иммуноокрашивание антителами к белку mod2.2. D-Совмещение изображений В и С. Желтыми стрелками указано расположение гибридизационного сигнала FISH, совпадающего с иммуноокрашиванием антителами к mod2.2. Белыми стрелками указано расположение гибридизационного сигнала FISH, не совпадающего с иммуноокрашиванием антителами к mod2.2. (Fig.5 из статьи Gerasimova et al., 2000).

Исходно, данные, обосновывающие гипотезу о строении и ядерной локализации инсуляторных телец, были получены в ходе экспериментов, совмещающих FISH-гибридизацию и иммуноокрашивание. Так оказалось, что в линии Ьх349 , содержащей инсерцию gypsy в Bithorax-локусе, сигнал гибридизации FISH-пробы соответствующей локусу Bithorax большинстве случаев совпадают с агрегатами инсуляторных белков gypsy, визуализированных с помощью иммуноокрашивания антителами к белку mod2.2 в. При этом оказалось, что эти агрегаты расположены преимущественно на периферии ядра (Рис. 13).

Рис. 14. Возможная модель строения инсуляторных телец. Желтым цветом обозначены петли хроматина, синим цветом обозначен белок Su(Hw), зеленым обозначен белок mod2.2, способный к олигомеризации, красным цветом обозначена ламина. (Gerasimova et al., 2000).

В настоящей работе мы также исследовали инсуляторы, входящие в состав ВХ-С. Полученные нами данные о взаимодействии шести инсуляторов из области ВХ-С с ламиной согласуются с данными о локализации на ламине инсуляторных белков и связанного с ними хроматина. Кроме того, согласно нашим данным геномные копии инсулятора gypsy также взаимодействует с ламиной. Тем не менее, согласно другой гипотезе, инсуляторные тельца представляют собой депо для хранения инсуляторных белков, лишены ДНК и не участвуют в функционировании инсуляторов (Golovnin et al., 2008). Таким образом, взаимодействие с ламиной и образование инсуляторных телец, согласно данной гипотезе, являются отдельными, не связанными между собой, событиями.

На основании проведенного нами исследования сложно сказать, организуются ли изученные инсуляторы в инсуляторные тельца. В литературе существуют противоречивые данные о влиянии взаимодействия с ламиной на работу отдельных инсуляторов. Так, оказалось, что мутации генов, кодирующих ламины у дрозофилы, также приводят к нарушению функционирования инсуляторов. Также было показано, что белок dTopors стабилизирует хроматиновые домены, образуемые в инсуляторных тельцах, за счет закрепления их на ламине. Более того, гиперэкспрессия данного белка у мутантов по гену mod(mdg4) приводит к восстановлению нормального фенотипа (Capelson and Corees., 2005). Однако в другом исследовании, в условиях теплового шока, диссоциация инсуляторных белков Su(Hw) и mod2.2 с ядерной периферии не влияла на энхансер-блокирующую активность инсуляторов (Xu et al., 2004). Вероятно, что локализация на ядерной ламине может быть лишь одним из механизмов функционирования инсуляторов, и различные инсуляторы могут действовать посредством различных механизмов. Таким образом, к настоящему времени понятно, что ламина играет важную роль в обеспечении функционирования инсуляторов и регуляции экспрессии генов в целом. Однако строение инсуляторных телец, механизм их формирования и участие ламины в этом процессе до конца не определен, и требует дальнейшего изучения. В целом, наши данные о связывании с ламиной всех исследуемых в данной работе инсуляторов - как геномных, так и в составе генетических конструкций - согласуются с моделью, представленной на Рис.14 (Gerasimova et al., 2000)

Выводы

1) Изучены старты транскрипции и размеры эРНК. Определено, что инициация транскрипции эРНК может происходить непосредственно в самой последовательности ДНК энхансера copia. Однако, в районе, удаленном от энхансера copia на 265 п.н., расположено большинство TSS эРНК, которые имеют длину от 300 до 1000 н..

2)Энхансер copia индуцирует образование модификаций НЗК4теЗ and НЗК18ас, в районах удаленных от энхансера на 265 п.н.. Инсулятор gypsy действует как антагонист энхансера, ингибируя синтез эРНК, а также понижая количество модификаций H3K4me3 and НЗК18ас, вызываемых энхансером copia, и увеличивая количество модификаций H3K4mel and НЗК27ас.

3) Инсуляторные белки Su(Hw), dCTCF и mod(mdg4)2.2 связываются с энхансером copia. При этом один инсулятор gypsy успешно конкурирует за связывание инсуляторных белков с энхансером copia, тогда как пара инсуляторов gypsy это сделать не способна.

4)Выявлено связывание инсуляторного белка dCTCF с инсулятором gypsy.

5) Установлено, что геномные копии инсулятора gypsy а также все шесть изученных инсуляторов из области ВХ-С взаимодействуют с ламиной.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

Статьи в научных журналах:

1. Федосеева Д.М., Кретова О.В., Чуриков Н.А.(2010) Молекулярный анализ РНК, индуцированных энхансером в клетках дрозофилы, содержащих репортерные генетические конструкции. Доклады Академии Наук, 435(6), 831-836.

2. Федосеева Д.М., Кретова О.В., Чуриков Н.А.(2011) Анализ энхансерных РНК и модификаций хроматина в районах их синтеза в репортерных генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы. Доклады Академии Наук, 442(1), 127-132.

3. Федосеева Д. М.,. Чуриков Н. А. (2013) Анализ связывания инсуляторных белков в репортерных генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы. Доклады Академии Наук, 451 (i), 339-343.

4. Tchurikov NA, Kretova OV, Fedoseeva DM, Sosin DV, Grachev SA, Serebraykova MV, Romanenko SA, Vorobieva NV, Kravatsky YV. (2013) DNA double-strand breaks coupled with PARP1 and HNRNPA2B1 binding sites flank coordinately expressed domains in human chromosomes. PLoS Genet., 9(4), el 003429.

Тезисы конференций:

1. Федосеева Д.М., Кретова О.В. Чуриков Н.А. Анализ энхансерных РНК и

модификаций хроматина в трансфецированных клетках S2 Drosophila melanogaster, содержащих репортерные генетические конструкции// 16 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых: Биология - наука XXI века, 16-21 апреля 2012г., Сборник тезисов, 152-153.

2. Fedoseeva D.M., Tchurikov N.A., and Kretova O.V., Molecular analysis of RNA induced by enhancer in genetic constructs after transfection into Drosophila cells in culture. // Abstract book of the 10th EMBL Conference Transcription and Chromatin, 25 - 28 August 2012, EMBL Heidelberg, Germany, p 196;

3. Федосеева Д.М., Кретова O.B., Чуриков H.A. Анализ энхансерных РНК и модификаций хроматина в трансфецированных клетках S2 Drosophila melanogaster, содержащих репортерные генетические конструкции // Сборник тезисов научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчиникова" 14-17 ноября 2011 г. Том 2., стр 72.

4. Tchurikov N.A., Fedoseeva D.M. and Kretova O.V., Molecular analysis of RNA induced by enhancer in genetic constructs after transfection into Drosophila cells in culture.// Cell Symposia: Regulatory RNA's, October 10th-12th, 2011, Chicago, PI.16

Заказ № 76-Р/10/2013 Подписано в печать 22.10.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федосеева, Дарья Михайловна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

0420136395

ФЕДОСЕЕВА ДАРЬЯ МИХАЙЛОВНА

АНАЛИЗ ЭНХАНСЕРНЫХ РНК, ИНСУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ И МОДИФИКАЦИЙ ХРОМАТИНА В ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЯХ, ТРАНСФЕЦИРОВАННЫХ В КЛЕТКИ

ДРОЗОФИЛЫ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(03.01.03 - молекулярная биология)

Научный руководитель: д.б.н. проф. Н.А. Чуриков

МОСКВА-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ............................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................5

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..........................................................................7

1.1 Актуальность проблемы................................................................................................7

1.2 Цели и задачи исследования..........................................................................................9

1.3 Научная новизна результатов исследования.............................................................10

1.4 Научно-практическая ценность...................................................................................10

1.5 Апробация работы........................................................................................................11

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................11

Введение..............................................................................................................................11

2.1 Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов. Модификации хроматина............................................................................................................................12

2.2 Энхансеры- ДНК элементы, вовлеченные в эпигенетическую регуляцию экспрессии генов.................................................................................................................18

2.2.1 Свойства энхансеров. Модели действия энхансеров.....................................18

2.2.2 Белки, связанные с работой энхансеров..........................................................21

2.2.3 Свойства энхансера copia Drosophilla melanogaster........................................24

2.3 Инсуляторы и их роль в регуляции экспрессии генов..............................................24

2.3.1 Свойства инсуляторов. Модели действия инсуляторов.................................24

2.3.2 Типы инсуляторов Drosophilla melanogaster...................................................28

2.3.3 Регуляция активности инсуляторов.................................................................31

2.4 Некодирующие РНК и их роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов.....................................................................................................................................35

2.4.1 Классификация некодирующих РНК. Энхансерные РНК.............................35

2.4.2 Некодирующие РНК как регуляторы транскрипции. Длинные некодирующие РНК....................................................................................................38

2.4.3 Механизмы активации транскрипции генов длинными некодирующими РНК. Энхансерные РНК.............................................................................................40

2.5 Ламииа и ее роль в регуляции экспрессии генов.....................................................45

2.5.1 Структурная организация ламины. Ламина у Drosophilla melanogaster......45

2.5.2 Типы ядерных ламинов Drosophilla melanogaster..........................................46

2.5.3 Ламина и хроматин. Ламина как регулятор экспрессии генов......................48

Заключение..........................................................................................................................50

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................50

3.1 Культура клеток Drosophila melanogaster...................................................................50

3.2 Штаммы E.coli и векторы............................................................................................51

3.3 Используемые праймеры.............................................................................................51

3.4 Генетические конструкции, использованные в работе.............................................53

3.5 Антитела, использованные в работе...........................................................................55

3.6 Стандартные молекулярно-биологические методы..................................................55

3.7 Трансфекция ДНК-конструкций в культуру клеток Schneider 2 дрозофилы.........60

3.8 5'RACE (5'-Rapid Amplification of Complementary Ends).........................................61

3.9. Primer-extention............................................................................................................62

3.10 Выделение тотальной РНК из культуральных клеток Schneider 2 Drosophila melanogaster.........................................................................................................................63

3.11 Нозерн-блот анализ....................................................................................................64

3.12 Иммунопреципитация хроматина.............................................................................65

3.13 Полуколичественная PCR..........................................................................................66

3.14 Подготовка проб для мультиплексного однонаправленного глубокого секвенирования на платформе 454 ...................................................................................66

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.......................................................................................................................67

4.1 Анализ распределения TSS в конструкции e-h с помощью 5' RACE (Rapid Amplification of 5' Complementary DNA Ends)................................................................67

4.2 Анализ распределения TSS в конструкции e-h с помощью primer extension.........72

4.2 Размеры энхансерных РНК варьируют от 300 до 1050 п.и......................................77

4.3 Анализ распределения модификаций хроматина в генетических конструкциях e-h, e-g-h и g/g.....................................................................................................................78

4.4 Анализ связывания инсулягорных белков Su(Hw), [mod(mdg4)]2.2 и dCTCF с различными районами конструкций e-h, e-g-h и g/g.......................................................82

4.4.1 Инсуляторные белки связываются с энхансером copia.................................82

4.4.2 С инсулятором gypsy в генетических конструкциях связывается не только Su(Hw), но и dCTCF....................................................................................................84

4.4.3 Mod2.2 связывается с промотором в конструкции e-h...................................85

4.4.4 Инсуляторные белки связываются преимущественно с 5' областью инсулятора Gl и с З'областью инсулятора G2 в конструкциях e-g-h и g/g..........85

4.5 Анализ взаимодействия геномных копий инсуляторов gypsy, а также инсуляторов комплекса ВХ-С с ламиной.........................................................................86

5. ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................................88

5.1 Роль энхансеров и инсуляторов в изменении структурно-функционального

состояния хроматина..........................................................................................................88

5.1.1 эРНК и малые петли хроматина.......................................................................88

5.1.2 эРНК и модификации хроматина.....................................................................91

5.2 Размеры эРНК...............................................................................................................93

5.3 Роль инсуляторных белков в регуляции дистантных взаимодействий...................93

5.4 Участие dCTCF в работе инсулятора gypsy...............................................................97

5.5 Значение ламины в формировании инсуляторных телец и функционировании

инсуляторов.........................................................................................................................97

Выводы..............................................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................102

Список сокращений

п.н. - пар нуклеотидов.

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов.

н. - нуклеотидов.

т.н. - тысяч нуклеотидов.

rpm - оборотов в минуту (route per minute)

эРНК - Энхансерные РНК (eRNAs)

TSS - старт-сайты транскрипции (transcription start site)

Mod(mdg4)2.2 - mod2.2

3C - определение конформации хромосом (Chromosomal Conformation Capture) DamID - идентификация с помощью аденин-метилтрансферазы ДНК (DNA adenine methyltransferase identification)

5'RACE - амплификация комплиментарных 5'концов (5'-Rapid Amplification of Complementary Ends)

BX-C - комплекс Биторакс (Bithorax complex)

ANT-C - комплекс Антеннапедиа (Antennapedia complex)

H3K4me3 - триметилирование no 4 лизину гистона НЗ

H3K18ac - ацетилирование 18 лизина гистона НЗ

H3K4mel - монометилирование 4 лизина гистона НЗ

НЗК27ас - ацетилирование 27 лизина гистона НЗ

НЗК16ас - ацетилирование 16 лизина гистона НЗ

НЗК56ас - ацетилирование 56 лизина гистона НЗ

H3K36 - 36 лизин гистона НЗ

НЗК79 - 79 лизин гистона НЗ

НЗК9те - метилирование 9 лизина гистона НЗ

НЗК27теЗ - триметилирование 27 лизина гистона НЗ

НЗК9 - 9 лизин гистона НЗ

НЗК27 - 27 лизин гистона ИЗ

Н4К20 - 20 лизин гистона НЗ

piRNAs - РНК, взаимодействующие с PIWI (PlWI-interacted RNAs)

TF - факторы транскрипции (transcription factors)

MBD - метил-связывающий домен (methyl-binding domain)

ORF - открытая рамка считывания (open reading frames)

RTKs - рецепторные тирозинкиназы (Receptor tyrosinkinases)

СВР - ССААТ-энхансерсвязывающий белок (CCAAT/enhancer binding protein)

CBF-1 - фактор, связывающийся с энхансером copia-\(copia binding factor-1) TCR-P - локус p Т-клеточного рецептора (T-cell receptor-P) PREs - Polycomb response elements

LAD - домены, ассоциированные с ламиной (Lamin associated domain)

PTS - промоторнацеливающие последовательности (Promoter Targeting Sequences)

tRNAs - транспортные PI IK (transfer RNAs)

rRNAs - рибосомальные PI IK (ribosomal RNAs)

snRNAs - сплайсеосомные PHK(spliceosomal RNAs)

siRNAs - малые интерферирующие PHK(small interfering RNAs)

miRNAs - микроРНК (micro RNAs))

PASR - ассоциированные с промотором некодирующие РНК (Promoter-associated RNAs) TASR - ассоциированные с терминатором иекодирующие РНК (terminator-associated RNAs)

priRNA - первичные малые РНК (primal RNAs))

IncRNA - длинные некодирующие РНК (long noncoding RNAs)

circRNAs - кольцевые РНК (circular RNAs)

ceRNAs - эндогенные конкурирующие РНК (competing endogenous RNAs) RISC - РНК-зависимый комплекс репрессии (RNA Induced Silencing Complex) HSR1 - РНК теплового шока-l (heat-shock RNA-1)

1. Общая характеристика работы

1.1 Актуальность проблемы

Изучение энхансеров и инсуляторов является актуальной темой исследований. Энхансеры - это ре1уляторные элементы, способные усиливать транскрипцию отдельных генов или генных кластеров. Энхансеры могут активировать транскрипцию, располагаясь даже на значительном удалении от регулируемого промотора. В разное время было предложено множество различных моделей, объясняющих механизм работы энхансеров (Morcau et al., 1981; Blackwood and Kadonaga, 1998; Dorsctt, 1999; de Laat et al., 2008). Большинство из предложенных моделей предполагают, что эти регуляюрные элементы могут пространственно сближаться путем образования петли ДНК между энхансером и промотором. В результате факторы транскрипции, связывающиеся с энхансером и промотором, могут напрямую взаимодействовать друг с другом, или же привлекать (рекрутировать) дополнительные белковые факторы, инициирующие петлеобразование. В данном случае энхансеры выступают как места сборки пре-инициационного комплекса, а процесс образования петли необходим для доставки этого комплекса на промотор. Тем не менее, непонятно, каким образом происходит доставка этих комплексов, как обеспечивается специфичность взаимодействия между энхансером и промотором, а также какие процессы являются сигналом для начала активации (Spitz and Furlong, 2012).

В последнее время становится ясно, что регуляция экспрессии генов в клетке осуществляется с помощью различных эпигенетических механизмов. Ключевым событием в активации транскрипции является появление открытой структуры хроматина, которая обеспечивается различными транскрипционными факторами. Поскольку энхансеры выступают в качестве платформы для связывания транскрипционных факторов, их эпигенетические метки также активно изучаются. Так, принято считать, что характерными эпигенетическими метками энхансеров являются II3K4mel и НЗК27ас (Ilcintzman et al., 2007; Kharchcnko et al., 2010). Однако картирование по этим меткам выявило большое количество последовательностей ДНК, которые не обладают свойствами энхансеров (Spicuglia and Vanhillc, 2012). Более того, существует мнение, что сами по себе модификации хроматина неспецифичны и являются следствием связывания определенных активаторных белков с определенными последовательностями ДНК

(Ptashne., 2013). Поэтому вопрос об эпигенетических маркерах энхансеров остается актуальным и требует дальнейшего изучения.

Еще одним важным аспектом работы энхансеров является синтез некодирующих, энхансерных РНК (эРПК). Синтез эРПК происходит с обеих сторон от энхансера, при этом уровень этого синтеза сравним с уровнем транскрипции регулируемого гена (Tchurikov et al, 2009; Kim et al., 2010). Корреляция уровня экспрессии этих некодирующих РНК с экспрессией соседних генов указывает на их возможную функциональную роль в активации транскрипции на промоторе, однако механизм этого процесса до конца неясен. Более того, пока не ясно, как организован синтез эРПК. В настоящее время в литературе существуют противоречивые данные об их размере, а также о наличии или отсутствии у них сигналов полиаденилирования (Kim et al., 2010; Koch et al., 2011). Недавние исследования показали, что эти параметры широко варьируют у различных эРНК (ENCODE Project Consortium., 2012). Использованная данной работе система генетических конструкций, исключающая регуляторное влияние геномного окружения, позволяет подробнее изучить механизм работы энхансеров, исследовать характерные для энхансеров метки хроматина, а также проанализировать индуцируемые энхансером Р11К.

Возможность взаимодействия энхансеров с промоторами регулируется другими элементами генома - инсуляторами, которые представляют собой специфические последовательности ДНК, связывающиеся с комплексом инсулягорных белков. IIa данный момент понятно, что действие инсулягоров, как правило, связано с обеспечением функциональных контактов между регуляторными элементами. Так, было показано, что инсулягоры способны облегчать взаимодействие между энхансером и промотором (van Bortie and Corees, 2013, Krivcga and Dean, 2012). Было обнаружено, что нокдаун CTCF в клетках человека нарушает образование инсуляторами обособленных петлевых доменов, что косвенным образом негативно влияет на взаимодействие между энхансером и промотором гена АРО (Mishiro et al., 2009). Однако какие механизмы лежат в основе функционирования энхансеров и инсуляторов пока неизвестно. Регуляция дистантных взаимодействий между энхансером и промотором может обеспечиваться через управление внутриядерной локализацией отдельных хромосомных доменов за счет взаимодействия с некоторыми ядерными белками, например с когезином и ламинами. Было показано, что сайты связывания инсуляторных белков ограничивают области хроматина, взаимодействующие с ламиной (Herold et al., 2012; van Bcmmcl et al., 2010). При этом эти области, как правило, характеризуются низкой транскрипционной активностью, а также обогащены инактивирующими эпигенетическими метками (Pickersgill et al., 2006,

Guclcn et al., 2008). Кроме того, известно, что образуемые инсуляторами макромолекулярные комплексы, так называемые инсуляторные тельца, локализуются на периферии ядра и представляют собой комплексы инсуляторных белков и ДНК (Gerasimova et al., 2000). Связанные с инсулягорными белками области ДИК образуют отдельные петли - независимые экспрессионные домены, а ламина в данном случае выступает в качестве стабилизатора этих доменов (Gerasimova et al., 2000).Также, показано, что убиквитин-лигаза dTopors, входящая в состав инсулятора gypsy, может взаимодействовать с ламиной, и, возможно, участвует в заякоривании инсуляторных телец на ламине (Capelson and Corees, 2005). Однако согласно другим данным, инсуляторные тельца являются всего лишь белковыми агрегатами и не содержат ДНК (Golovnin et al., 2007). Таким образом, вопрос о строении и функции инсуляторных телец нуждается в дальнейшем изучении.

1.2 Цели и задачи исследования

Целями данной работы было:

2. Изучить возможное влияние инсулягор(ов) мобильного элемента gypsy на синтез эРНК;

3. Выявить некоторые модификации гистона ИЗ, вызываемые энхансером и инсулятором в разных областях генетических конструкций, содержащих энхансер мобильного элемента copia и инсулятор(ы) мобильного элемента gypsy,

4. Изучить связывание инсуляторных белков Su(Hvv), dCTCF и Mod(mdg4)2.2 в разных частях генетических конструкций, содержащих энхансер и инсулятор(ы);

Для достижения поставленных целей нами были определены следующие задачи:

• Определить TSS эРНК с помощью 5'RACE ;

• Определить TSS эРНК с помощью primer-extension;

• Провести анализ эРНК с помощью Норзерн-блот-гибридизаций;

• Изучить влияние энхансера и инсулятора на модификации гистона ИЗ с помощью иммупопреципитации хроматина;

• Провести анализ связывания инсуляторных белков дрозофилы Su(Hw), dCTCF и Mod(mdg4)2.2 в различных районах генетических конструкций с помощью иммунопреципитации хроматина;

• Кроме того, исследовать взаимодействие геномных копий gypsy и шести инсуляторов в составе ВХ-С с ламиной в культуральных клетках S2 Drosophila melanogcister.

1.3 Научная новизна результатов исследования

В данной работе, используя грансфецированные генетические конструкции, мы выявили эпигенетические механизмы, с помощью которых работают энхансеры и инсуляторы. В системе, исключающей цис-регулягорное влияние геномного окружения, нами впервые обнаружено, что основная часть TSS эРНК находится на расстоянии 265 п.н

Информация о работе

Федосеева, Дарья Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы