Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ нового семейства регуляторных генов у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Головнина, Елена Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи УДК 577.21:595.773.4

БЕЗБОРОДОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НОВОГО СЕМЕЙСТВА РЕГУЛЯТОРНЫХ ГЕНОВ У ВКОЗОРШЬА МЕЬАтвАЗТЕК

Специальность 03.00.26 - Молекулярная генетика

Научный руководитель: д.б.н., профессор П.Г. Георгиев.

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................4.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................6.

1.1. Механизмы репрессии...........................................................................................................6.

1.1.1. Репрессия транскрипции в гетерохроматине..............................................................6.

1.1.2 Репрессия транскрипции в эухроматине.....................................................................14.

1.2. Организация транскрипционных комплексов в эухроматине.........................................23.

1.2.1. Характеристика инсуляторов дрозофилы..................................................................25.

1.2.1.1 Характеристика ses/ses' элементов................................................................28.

1.2.1.2. Характеристика зи(Н\\г)-связывающего домена...........................................30.

1.2.2. Возможные механизмы действия инсуляторов.........................................................37.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................40.

2.1. Генетические методы........................-..................................................................................40.

2.1.1. Мутации Drosophila melanogaster, использованные в работе..................................40.

2.1.2. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе......................................42.

2.1.3. Способы получения Su(mg) мутаций...........................................................................44.

2.1.4.Определение хромосомы, на которой находится Su(mg) мутация.............................46.

2.1.5. Локализация Su(mg) мутаций с помощью метода рекомбинационого картирования.................................................................................................................................47.

2.1.6. Локализация Su(mg) мутаций с помощью цитологического анализа политенных хромосом........................................................................................................................................49.

2.1.7. Очистка линий с Su(mg) мутациями от лишних копий Р элемента...........................49.

2.1.8. Получение ревертантов Su(mg) мутаций под действием Р элемента........................49.

2.1.9. Создание комбинаций мутаций и их анализ.................................................................50.

2.1.10. Фенотипический анализ проявления комбинаций мутаций......................................52.

2.2 Биохимические методы.............................................................................................................54.

2.2.1. Выделение ДНК дрозофилы.............................................................................................54.

2.2.2. Выделение фрагментов ДНК из геля при помощи Gene-Clean.....................................54.

2.2.3. Блот-гибридизация по Саузерну......................................................................................55.

2.2.4. Гибридизация на фильтрах..............................................................................................55.

2.2.5. Молекулярное клонирование..........................................................................................56.

2.2.5.1. Получение геномных библиотек........................................................................56.

2.2.5.2. Выделение рекомбинантных клонов из геномной библиотеки......................57.

2.2.5.3. Выделение ДНК рекомбинантного фага............................................................57.

2.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами....................................................58.

2.2.7. Выделение ДНК плазмид методов щелочного лизиса.................................................59.

2.2.8. Метод PCR (ПЦР)...........................................................................................................60.

2.2.9. Секвенирование плазмид и PCR продуктов...................................................................60.

2.2.10. In situ гибридизация ДНК с политенными хромосомами...........................................60.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................................................62.

3.1. Способы получения Su(mg) мутаций.....................................................................................62.

3.1.1. Получение Su(mg) мутаций в Р-М гибридном дисгенезе.............................................62.

3.1.2. Получение Su(mg) мутаций с помощью конструкций на основе Р элемента.............65.

3.2. Локализация Su(mg) мутаций..................................................................................................66.

3.2.1. Рекомбинационное картирование Su(mg) мутаций.......................................................66.

3.2.2. Анализ Su(mg) мутаций с помощью блот гибридизации по Саузерну........................71.

3.3. Влияние Su(mg) мутаций на взаимодействие mod(mdg4)luI с мутациями, индуцированными МДГ4..............................................................................................................72.

3.4. Анализ зависимости эффекта Su(mg) мутаций от окружающих последовательностей.....75.

3.5. Анализ влияния Su(mg) мутаций на транскрипцию генов yellow и cut..............................77.

3.6. Мутации Su(mg) не являются модификаторами эффекта положения и не относятся к генам группы Polycomb...................................................................................................................79.

3.7. Влияние мутаций Su(mg) на трансвекцию между аллелями в локусеyellow......................80.

3.8. Анализ взаимодействия мутаций в локусах Su(mg), su(Hw) и mod(mdg4)..........................81.

3.9. Мутации Su(mg)!'7, Su(mg)3'3 и Su(mg)3~4 индуцированы инсерцией Р элемента................83.

3.9.1, Анализ мутаций Su(mg) " и Su(mg)3'4.............................................................................83.

3.9.2. Анализ мутации Su(mg)1'7................................................................................................86.

3.10. Большинство Su(mg) мутаций индуцировано hobo элементом..........................................88.

3 3

3.11. Клонирование и молекулярный анализ мутацииSu(mg) '................................................90.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................................................95.

4.1. Функции Su(mg) генов в регуляции транскрипции...............................................................95.

4.2. Роль мобильных элементов в индукции Su(mg) мутаций...................................................100.

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................102.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................103.

ВВЕДЕНИЕ

Гены эукариот имеют сложно устроенные регуляторные области, содержащие большое количество регуляторных элементов. Одним из регуляторных элементов, обеспечивающих правильное взаимодействие между энхансером и промотором, является инсулятор.

Инсулятор - это цис-регуляторный элемент, который блокирует взаимодействие между энхансером и промотором, если он расположен между ними. При этом ни энхансер, ни промотор сами по себе не теряют своей функциональной активности. В настоящее время наиболее изученным инсулятором является зи(Нш)-связьшающий район, который входит в состав ретротранспозона МДГ4 Drosophila melanogaster. зи(Н\у)-связывающий район состоит из 12 октамерных сайтов связывания для белка su(Hw); уменьшение числа сайтов связывания приводит к ослаблению инсуляторной функции. Было показано, что введение мутации su(Hw) приводит к супрессии мутантного фенотипа, из чего следует, что белок su(Hw) ответствен за мутантный фенотип, возникающий вследствие внедрения инсулятора. Другим белком, участвующим в работе инсулятора, является modifier of mdg4,

lui

mod(mdg4). Мутация в этом гене, mod(mdg4) , в случае одних генов ослабляет инсуляцию вызванную зи(Н\у)-инсулятором, а в случае других генов приводит к полному ингибированию транскрипции. Предполагается, что белок mod(mdg4) связывается с

lui

белком su(Hw) и участвует в инсуляции. В мутации mod(mdg4) белок mod(mdg4) теряет способность взаимодействовать с белком su(Hw). В результате этого белок su(Hw) начинает в некоторых случаях напрямую ингибировать некоторые промоторы. Остается открытым вопрос какие другие белки участвуют в данном процессе. Целью данной работы является получение мутаций в генах, которые могут либо взаимодействовать с su(Hw)/mod(mdg4) белковым комплексом, либо определять характер взаимодействия белка su(Hw) с промотором теки yellow, который прямо ингибируется su(Hw) инсулятором

в присутствии мутации mod(mdg4) . Для решения этой проблемы была использована чувствительная генетическая система: линия дрозофилы содержащая три мутации индуцированные инсерцией МДГ4 в локусах yellow, scute и cut. В результате мобилизации транспозиций мобильных элементов были получены мутации в генах Suppressor of modifier of mdg4 (Su(mg)), которые супрессируют частично или полностью действие lui

мутации mod(mdg4) . Мутации в генах Su(mg) имеют доминантный эффект, и в большинстве не влияют на жизнеспособность и не имеют самостоятельного фенотипического проявления. В данной работе был проведен анализ генетических характеристик Su(mg) мутаций, выяснение локализации и природы Su(mg) мутаций для клонирования в дальнейшем соответствующих генов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Увеличение размеров и сложности генома, сопровождающее эволюцию высших эукариот, ставит ряд серьезных проблем, в том числе: каким образом достигается высокая упорядоченность и компактность структуры гигантских молекул ДНК внутри клеточного ядра, и при этом осуществляется точная временная и пространственная регуляция экспрессии гена. Очень важно, чтобы экспрессия генов, отвечающих за правильную закладку тканей, находилась под строгим контролем, - иначе могут произойти необратимые нарушения в развитии организма. Ниже будут рассмотрены механизмы, обеспечивающие репрессию как отдельных генов, так и целых генных комплексов, а также механизмы независимого функционирования генов, расположенных в непосредственной близости друг от друга.

1.1. Механизмы репрессии.

1.1.1. Репрессия транскрипции в гетерохроматине.

На основании цитологических наблюдений был сделан вывод о существовании в клеточном ядре эукариот 2-х основных видов хроматина: эу- и гетерохроматина (Heitz, 1928; Pardue and Hennig, 1990). Эухроматин в интерфазном ядре декондесирован, в то время как гетерохроматин конденсирован в течение почти всего клеточного цикла. Эухроматиновые районы, которые содержат большую часть уникальных геномных последовательностей и структурных генов, реплицируются в ранней и средней iS-фазе. ДНК гетерохроматина в основном представлена так называемыми сателлитами -тандемными повторами определенной длины (от двух до нескольких сот пар нуклеотидов). Другой класс повторов, ассоциированных с гетерохроматином, - умеренные повторы, и, прежде всего, большой их подкласс, представленный мобильными генетическими элементами (МЭ). Гетерохроматин в отличие от эухроматина реплицируется в поздней iS-фазе (Lima-de-Faria and Jaworska 1968).

Исследования, проведенные на дрозофиле и дрожжах, показали, что гетерохроматин может репрессировать транскрипцию генов, находящихся в соседних эухроматиновых районах (Reuter et al., 1982). Впервые это явление наблюдали как результат хромосомных перестроек, инверсий или транслокаций, в результате которых эухроматиновые гены оказывались в непосредственной близости от ДНК гетерохроматина. У Drosophila melanogaster наиболее подробно изучена инверсия In(I)wm4, которая приближает ген white, отвечающий за пигментацию глаз, к гетерохроматину (Reuter and Spierer 1992; Reuter et ah, 1983). В результате инверсии наблюдается мозаичная окраска глаза: отдельные группы фасеток имеют различную интенсивность окраски, от нормальной до полного ее отсутствия. Это говорит о том, что экспрессия гена white в одних клетках репрессирована, а в других нет, что прямо коррелирует со степенью распространения гетерохроматизации. Статистическая гетерохроматизация близлежащих эухроматиновых районов, при которой стабильно наследуется репрессированное состояние генов в определенной суб-популяции клеток, получила название эффекта положения мозаичного типа (ЭПМ) (перевод термина: position-effect variegation (PEV) (Spofford, 1976;Eissenberg, 1989; Henikoff, 1990).

Приобретенное конденсированное состояние хроматина может приводить к полной репрессии транскрипции потенциально активных "эухроматиновых" генов. Было показано, что в случае ЭПМ инактивация гена в каждой данной клетке происходит статистически, на ранних стадиях развития, а затем приобретенное репрессированное состояние поддерживается в потомстве каждой конкретной клетки. ЭПМ чувствителен к различным воздействиям, включая температуру и разные генетические факторы: присутствие дополнительной 7-хромосомы, отцовский эффект, наличие генов-модификаторов (Spradling and Karpen 1990; Henikoff, 1990; Grigliatti, 1991). Мутации в генах, кодирующих структурные и регуляторные компоненты хроматина (как

эухроматиновые, так и гетерохроматиновые), а также в генах, контролирующих сборку хроматина и его конденсацию, также влияют на фенотипическое проявление ЭПМ.

В настоящее время охарактеризовано более 120 локусов, мутации в которых оказывают влияние на ЭПМ. Эти локусы классифицированы следующим образом (Reuter and Spierer 1992):

1. Десять локусов Su(var), suppressor of variegation, супрессируют действие ЭПМ, находясь в количестве одной копии на геном ( гапло-супрессорный эффект) и усиливают действие ЭПМ, находясь в количестве трех копий на геном (трипло-энхансерный эффект).

2. Около 75 локусов Su(var) имеют только гапло-супрессорный эффект.

3. Десять локусов E(var), enhancer of variegation, усиливают действие ЭПМ, находясь в количестве одной копии на геном (гапло-энхансерный эффект) и супрессируют ЭПМ, находясь в количестве трех копий на геном (трипло-супрессорный эффект).

4. Около 25 локусов E(var) имеют только гапло-энхансерный эффект.

Для объяснения существования столь большого числа генов, мутации в которых оказывают доминантный эффект на гетерохроматизацию, к модели сборки хроматина был применен закон действующих масс. Как известно, хроматин представляет собой ДНК-белковый комплекс, в который входят как гистоновые, так и негистоновые белки. Собственно место начала образования хроматина может специфично зависеть от последовательности ДНК или от ее структуры, но после инициации белковый комплекс может кооперативно распространяться вдоль хромосомы вне зависимости от первичной последовательности ДНК (Tartof et. al., 1984). Степень и стабильность экспрессии определенного гена зависит от стабильности ДНК-белкового комплекса. Таким образом, концентрация структурных белков гетерохроматина будет влиять на степень супрессии генов в ЭПМ (Zuckerkandl 1974). Если предположить, что каждый белок гетерохроматина присутствует в клеточном ядре либо в связанном с гетерохроматином состоянии, либо в

свободной форме, то соотношение между этими двумя состояниями белка будет влиять на скорость сборки и распространения гетерохроматина (Locke et. ah, 1988). Различия в концентрации белков между клетками могут объяснить мозаичную природу ЭПМ, т.е. различную степень гетерохроматизации и, как следствие, - мозаичную экспрессию гена (один и тот же ген работает в одних клетках и одновременно репрессирован в соседних, в которых гетерохроматизация выше).

Мутации, негативно влияющие на синтез любого из белков гетерохроматина, будут снижать степень гетерохроматизации и, таким образом, супрессировать ЭПМ. С другой стороны, мутации, приводящие к снижению уровня синтеза основных эухроматиновых белков, ответственных за поддержание генов в активном состоянии, будут усиливать вероятность гетерохроматизации и, следовательно, усиливать ЭПМ. С генетической точки зрения первый класс белков будет выступать в роли супрессоров ЭПМ, в то время как второй - в роли энхансеров ЭПМ.

Идентификация и характеристика модификаторов мозаичной репрессии (ЭПМ) у Drosophila стали важным шагом в ходе исследования состава и свойств гетерохроматина. Для структурных компонентов гетерохроматина закон действующих масс проявляется в том, что увеличение количества копий гена (а, следовательно, и количества белкового продукта) приводит к усилению ЭПМ, в то время как их удаление - супрессирует ЭПМ. В настоящее время известно всего лишь несколько белков, являющихся структурными компонентами гетерохроматина.

Белок НР1 (белок, ассоциированный с гетерохроматином), кодируемый геном Su(var)2-5, считается на данный момент времени основным структурным белком гетерохроматина (Eissenberg et ah, 1990). Мутации в гене Su(var)2-5 являются сильными супрессорами ЭПМ. При этом наличие одной копии Su(var)2-5 ведет к увеличению экспрессии гена white в линии, несущей In(l)wm4, т.е. к супрессии ЭПМ; тогда как наличие

трех копий приводит, напротив, к снижению экспрессии гена white, т.е. к усилению ЭПМ (Eissenberg et al., 1992). Было показано, что белок НР1 ассоциирован с прицентромерным гетерохроматином и гетерохроматиновыми районами 4 хромосомы (James et al., 1989). НР1 является небольшим ( 167 аминокислот) и крайне консервативным белком - его гомологи были найдены у мыши и человека (Wreggett et al., 1994; Lorentz et al., 1994). Ha концах белка находятся хромодомены, которые необходимы для взаимодействия между белками. Было показано, что НР1 не связывается непосредственно с ДНК, а хромодомен на С-конце является определяющим в ассоциации белка с гетерохроматином. Вероятно, однако, что оба домена НР1 участвуют в двух независимых типах белок-белковых взаимодействий и необходимы для связывания белка с гетерохроматином (Platero et al., 1995). Предполагается, что белок НР1 входит в состав мультипротеидного комплекса, осуществляющего поддержание компактной структуры гетерохроматина. В этом комплексе НР1 белок может присутствовать в форме либо мономера, либо димера, который образуется за счет взаимодействия N-концевых доменов мономеров белка.

Белковый продукт другого гена, Su(var)3-7, также является структурным компонентом гетерохроматина; при этом он непосредств�