Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование "инсуляторных телец" в ядрах клеток Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование "инсуляторных телец" в ядрах клеток Drosophila melanogaster"
На правах рукописи УДК 577 21 577 218
003448736
ВОЛКОВ ИЛЬЯ АЛЕКСЕЕВИЧ
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ДОМЕНОВ БЕЛК4 МОР(МПС4) НА ОКРАЧОВАНИЕ «ИНСУЛЯТОРНЫХ ТЕЛЕЦ» В ЯДРАХ КЛЕТОК ОЯОБОРШЬА ^1ЕЬА N0С/1.4ТЕ/?
03 00 03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2008
1 6 О ИТ 2008
003448796
Работа выполнена в лаборатории Факторов транскрипции в Учреждении Российской академии наук Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН и в группе «Молекулярной генетики дрозофилы» в Учреждении Российской академии наук Институт биологии гена РАН
Научный руководитель
кандидат биологических наук Головнин Антон Клеменсович Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор Глазков Михаил Васильевич, кандидат биологических наук Копытова Дарья Владимировна
Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН
Защита диссертации состоится _"30"_октября_ 2008 года, в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002 037 01 при Учреждении Российской академии наук Институт биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32
Автореферат разослан _"30"_сентября_ 2008 года
Ученый секретарь Диссертационного совета
канд фарм наук
Общая характеристика работы Актуальность проблемы Геном эукариот имеет доменную структуру Внутри доменов могут находиться либо индивидуальные гены, либо группы генов с отдельными паттернами экспрессии Специфические элементы молекулы ДНК, функционально изолирующие гены от влияния соседних доменов, были названы инсуляторами Инсуляторы ограничивают действие регуляторных элементов, работающих на больших расстояниях, и обладают способностью снимать эффект положения гена, то есть препятствуют инактивирующему влиянию гетерохроматина на транскрипцию Инсуляторы способствуют формированию и поддержанию работы транскрипционных программ и играют существенную роль в регуляции генов
Наиболее полно у Ого5орЬ,!а с\аргтер"ЗОЕаи 5и(Н"/)-зависимыч
инсулятор Впервые ЗиЩ»1) инсулятор был обнаружен в 5'-нетранслируемой области ретротранспозона МДГ4 Этот инсулятор обладает энхансер-блокирующей активностью Он способен блокировать более тридцати известных энхансеров в разных тканях и на разных стадиях развития ОгозорЫя melanogaster 5и(Н\¥)-зависимый инсулятор способен блокировать различные репрессионные эффекты, включая гетерохроматин и белки группы Ро1усошЬ
Около десяти лет назад было показано, что инсуляторные белки 8и(Н\у) и Мос1(пк^4) колокализуются в дискретных скоплениях в ядрах интерфазных клеток Огозор1п1а Основываясь на том, что исчезновение этих иммунофлюоресцирующих скоплений при мутации белка Мос1(т(3§4) соответствовало ослаблению 8и(Н\у) инсулятора, такие ядерные образования были названы «инсуляторными тельцами»
Предполагается, что эти тельца представляют собой зафиксированные на ядерном матриксе скопления многих разнесенных по геному связанных с ДНК белковых комплексов Su(Hw) инсулятора По какой-то причине инсуляторы объединяются друг с другом и держатся вместе, благодаря взаимодействию между белками Мос!(шс1§4) и СР190, таким образом, образуя «отдельные хроматиновые петли-домены» и контролируя высокоупорядоченную организацию и функционирование генома Основываясь на этом предположении, была выдвинута структурная модель работы инсулятора, постулирующая, что энхансер, находящийся в одном функциональном домене, не может активировать промотор, находящийся в другом домене
К сожалению, предполагаемое сосредоточение удаленных последовательностей ДНК инсуляторов внутри «инсуляторных телец» не было подтверждено в течение многих лет
Цель и задачи исследования*
Основной целью данной работы является изучение связи так называемых «инсуляторных телец» и инсуляции
В работе были поставлены следующие задачи
1 Проанализировать связь функционирования Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов и образования внутриядерных «инсуляторных телец»
2 Изучить роль сумолирования в образовании «инсуляторных телец»
3 Понять роль отдельных белков инсуляторного комплекса в образовании «инсуляторных телец»
Научная новизна и практическая ценность работы. В представленной работе впервые было доказано отсутствие прямой взаимосвязи между образованием внутриядерных «инсуляторных телец» и активностью 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster
Впервые было показано, что вовлечение инсуляторного белка Mod(mdg4) в состав «инсуляторных телец» полностью зависит от процесса его сумолирования
Также было продемонстрировано, что инсуляторный белок СР190 играет ключевую роль в образовании «инсуляторных телец»
Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о роли «инсуляторных телец» как «фабрике» по быстрой сборке инсуляторного комплекса и хранения его компонентов
Полученные в данной работе результаты позволяют лучше понять роль отдельных белков в организации работы инсуляторов, расширить знания о новом механизме посттрансляционной модификации - сумолировании, и по-новому взглянуть на структурную организацию генома Drosophila в определенные периоды развития клетки
Практически полученные данные можно применить при конструировании генно-инженерных векторов, учитывая продемонстрированную нами роль отдельных доменов белков, участвующих в инсуляции
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции "Nuclear Structure & Dynamics" (Монпелье, Франция, 2008), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на школе-конференции «Биология традиции и инновации в 21 веке» в рамках I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов
2
«Симбиоз - Россия - 2008» (Казань, 2008) и на I Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликованы две научные статьи и тезисы, представленные на пяти конференциях.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах, включает 2 таблицы и 37 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 209 источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Мутантные варианты белка Mod(mdg4), используемые в работе
Белок Mod(mdg4) является одним из необходимых основных компонентов инсуляторного комплекса. Нарушение его связи с белком Su(Hw) приводит к потере инсуляции и, как было показано в прежних исследованиях (Gerasimova and Corees, 1998; Gerasimova et al., 2000), к исчезновению «инсуляторных телец». Поэтому основное внимание в наших экспериментах мы уделили этому важному компоненту инсуляторного комплекса.
Были созданы две производные белка Mod(mdg4): в MotlAQ делеция аминокислотных остатков с 145 по 276 удаляла глютамин(С))-богатый домен и один сигнал ядерной локализации NLS; в ModAC делеция 43-х С-концевых аминокислотных остатков удаляла основную часть домена, необходимого для связывания с белком Su(Hw) (Рис. 1).
Q NLS-1
NLS-2 FLYWCH SID
Ш ИМ— ■■
NLS-2 FLYWCH SID
NLS-2 FLYWCH ~~ SID
Рис.1. Схематическое изображение вариантов белка Мо(1(пк^4).
Сверху вниз: Мос^Т (дикого типа), Мос!ДС> и Мос1ДС.
В экспериментах с двугибридной дрожжевой системой белки ModWT (дикого типа) и ModAQ продемонстрировали сильное взаимодействие с Su(Hw)MID, в то время как производная ModAC оказалась неспособной взаимодействовать с белком Su(Hw) (Таб. 1). Как и ожидалось, ModAC, также как производная ModAQ, имеет способность как к гомологичной, так и к гетерологичной олигомеризации (с белком Mod дикого типа).
В экспериментах по коиммунопреципитации белок Su(Hw) полностью копреципитировался с производной ModAQ и только частично с ModAC (Рис.2). Это свидетельствовало о том, что обе производные находятся в одном комплексе с белком Su(Hw), однако в случае ModAC производной взаимодействие с Su(Hw) опосредованно.
Взаимодействующие белки Сила взаимодействия
GAL4BD GAL4AD
ModWT Su(Hw)MiD +++
Su(Hw)Mll) ModWT ++Ч-
Su(Hwfu ModAC -
ModAC Su(Hw)M,b -
Su(Hw)M,u ModAQ +++
ModAQ Su(Hw)M11> +++
ModAC ModWT +++
ModWT ModAC ++
ModAC ModAC +++
ModAQ ModWT +++
ModWT ModAQ ++
ModAQ ModAQ +++
Input IP Output ModWT *.................
ModAC
PS PS Output
Рис.2. Коиммунопреципитации белка Su(Hw) и ModWT, ModAQ и ModAC, несущих последовательность FLAG, в трансформированных S2 клетках.
Иммунопреципитированные комплексы промывали 500 тМ и 100 тМ KCI-содержащими буферами перед нанесением на ДСН-ПААГ. Анализировали методом Western-гибридизации при помощи антител к белку Su(Hw). Input, общее нанесение; IP Output, надосадочная жидкость после иммунопреципитации с антителами против Su(Hw); IP, иммунопреципитат; PS, первичная сыворотка; PS Output, надосадочная жидкость после иммунопреципитации с первичной сывороткой.
Таблица 1. Анализ взаимодействия производных белка Mod(mdg4) в двугибридной дрожжевой системе. Относительная сила взаимодействия обозначается символом "+", отсутствие взаимодействия - В этих экспериментах мы использовали укороченную форму белка Su(Hw) - Su(Hw)MID - которая содержала только участок белка, необходимый для взаимодействия с Mod(mdg4).
2. Локализация Mod(mdg4) производных в S2-Kлетках
Ядра 82-клеток, полученных из эмбрионов Drosophila, при окрашивании антителами к белкам Mod и Su(Hw) четко демонстрировали дискретные скопления белков (Рис.3). По размерам, количеству и расположению эти скопления совпадают с ранее описанными скоплениями, называемыми «инсуляторными тельцами».
Суперэкспрессия химерного белка дикого типа Mod(mdg4)-FLAG не изменила «нормального» окрашивания: окрашивание антителами к FLAG эпитопу показывало
исключительно ядерное распределение в виде «инсуляторных телец», согласующееся с распределением белка Su(Hw). Ввиду большего количества белка при суперэкспресии рекомбинантных генов скопления белков Mod(mdg4) и Su(Hw) были более насыщены, чем в контроле.
С другой стороны, интенсивная экспрессия ModAQ-FLAG давала обильное диффузное распределение этого белка в цитоплазме, но не в ядре. Несколько ядерных скоплений, детектируемых антителами к белкам Su(Hw) и Mod(mdg4), скорее всего, существовали до трансфекции, поскольку ни один из них не окрашивался против FLAG.
Anti-Flag
Рис.3. Распределение вариантов Motl(mdg4) в 52-клетках.
На левой части рисунка представлены результаты специфического иммунного окрашивания на фоне суперэкспрессии исследуемых вариантов белка Mod (ModWT - белок дикого типа; Мое! ДО и Mod АС -мутантные варианты белка Mod). Справа показаны результаты окрашивания нетрансфецированых клеток.
При экспрессии белка ModAC-FLAG наблюдалось ядерное распределение в виде «инсуляторных телец» и колокализация с белком Su(Hw). Количество ModAC-FLAG «инсуляторных телец» было несколько меньше, но они были больше в размерах, чем в контроле Mod(mdg4)-FLAG или в диком типе Mod(mdg4). Все белковые скопления, которые окрашивались антителами к FLAG эпитопу, колокализовались со скоплениями, окрашивавшимися антителами к Su(Hw) белку. В то же время небольшая часть скоплений (наиболее вероятно, уже существовавших до трансфекции) содержала белки Mod(mdg4) и Su(Hw), но не ModAC-FLAG.
3. Распределение мутантных вариантов белка Mod в цитоплазматической и ядерной белковых фракциях S2 клеток. X-ChIP анализ.
Полученное в предыдущих экспериментах распределение химерных белков предполагает, что Mod(mdg4)-FLAG и ModAC-FLAG, в отличие от ModAQ-FLAG, присутствуют в ядре и находятся в составе инсуляторного комплекса. Для подтверждения иммунохимических наблюдений в ядрах клеток, нами были проведены дополнительные молекулярные анализы in vitro и in vivo. В первом эксперименте мы анализировали распределение химерных белков в различных клеточных фракциях («ядро» - «цитоплазма»), В результате эксперимента мы показали, что химерный белок ModAQ-FLAG присутствует в ядерной фракции трансфецированных клеток приблизительно в той же мере, как и химерные белки Mod(mdg4)-FLAG и ModAC-FLAG. Отсюда можно сделать вывод, что, несмотря на отсутствие «инсуляторных телец» в ядре клеток трансфецированых ModAQ-FLAG, этот белок там присутствует, не образуя скоплений (Рис.4).
цитоплазма
ядро
^ ^ ^ -О" О клеток.
Рис.4. Распределение хнмерных белков Mod(mdg4)-FLAG, ModAC'-FLAG и ModAQ-FLAG в цитоплазматической и ядерной белковых фракциях S2
# # ^
a FLAG а lamin а tubulin i а Su(Hw) i
После фракционирования трансфецированных клеток, фракции анализировались с помощью Western-блот анализа. Детекция проводилась антителами к FLAG эпитопу, распознающему химерные белки, ламину (белку специфичному для ядерной фракции) и тубулину (белку специфичному для цитоплазматической фракции). В качестве контроля количества нанесенного материала использовались антитела к белку Su(Hw).
Цель следующего эксперимента заключалась в анализе наличия химерных белков в составе инсуляторного комплекса in vivo. Для этого был использован метод хроматин-иммуноприципитации (X-ChIP анализ). Для данного эксперимента использовались праймеры к уже известным эндогенным инсуляторам и инсулятору Su(Hw) в составе МДГ4 ретротранспозона. В качестве отрицательного контроля использовались праймеры к кодирующим последовательностям генов ras и actin (Рис.5). Значительное обогащение PCR-продуктов на сайтах связывания 8и(Н\¥)-зависимого инсуляторного комплекса наблюдалось в случае экспрессии Mod(mdg4)-FLAG и ModAQ-FLAG белков. Однако при экспрессии белка ModAC-FLAG обогащения на инсуляторных сайтах не наблюдалось. Результаты этого эксперимента привели нас к неожиданному выводу. Несмотря на наличие в ядре «инсуляторных телец», белок ModAC-FLAG не способен in vivo связываться с
инсуляторнымн сайтами, в то время как белок Мос1Д(}-РЬАО, не образующий «инсуляторных телец», участвует в формировании инсуляторов.
Рис.5. Х-СЫР анализ. Пары наибольших пиков для каждой инсуляторной последовательности соответствуют
экспрессии белков Мос1(тс1ё4)-Р1.АС1 и Моси\(,)-Р'1.ЛС] В контролях (крайний слева и крайний справа) обогащения не происходит. При экспрессии белка Мос1ДС-Е;1_ АО обогащения также не наблюдается.
j
4. Тестирование мутантных форм белка Mod in vivo
Следующим нашим шагом было сравнение функциональной эффективности производных ModAQ и ModAC в Drosophila melanogaster. Для этого были созданы трансгенные линии, экспрессирующие ModAQ и Mod(mdg4)-67.2 под промотором, содержащим UAS-последовательность. Последующее скрещивание такой линии с GAL-драйвером позволяет индуцировать экспрессию конструкции в любых тканях на любой стадии развития мухи. Все эксперименты с трансгенными конструкциями проводились на фоне мутации mod(mdg4)"'. Эта мутация позволяет исследовать эффект экспрессии Mod(mdg4) производных без влияния эндогенного белка. Мутация mod(mdg4)"' не позволяет эндогенному белку связываться с инсуляторными комплексами. Для анализа производной ModAC была использована ранее описанная мутация mod(mdg4)lf'. В этой мутации, за счет образовавшегося стоп-кодона в аминокислотной позиции 570, транслируется белок, также как и в случае с ModAC, лишеный 43 С-концевых аминокислот.
Анализ инсуляторной активности производных Mod(mdg4) был проведен на самцах Drosophila в аллелях локуса ct и yellow, вызванных инсерцией мобильного элемента МДГ4, в составе которого находился Su(Hw) инсулятор (Рис.бА). Экспрессия белка Mod(mdg4) дикого типа, как и ModAQ, полностью преодолевает эффект мутации mod(mdg4)' . Экспрессия белка ModAQ влияет на обе характерные черты mod(mdg4)"' мутации: полностью снимается эффект репрессии и восстанавливаются инсуляторные свойства. Данный результат свидетельствует, что белок ModAQ проявляет те же свойства, что и белок дикого типа. При этом, мутация mod(mdg4) 6, при которой экспрессируется белок аналогичный ModAC, проявляет совершенно такой же фенотип, как мутация mod(mdg4)"', демонстрируя, что белок ModAC в инсуляции нефункционален.
ModWT-FLÁG ModiQ-FLAG ModiC-FLAG
неспецифические IgG
В аллелях с/й и с/*1 ретротранспозон МДГ4 находится между энхансером, отвечающим за развитие крыловой пластины, и промотором. В аллеле с/6 инсулятор полностью блокирует этот энхансер, образуя фенотип с «обрезанными» крыльями (Рис.бБ). Мутация mod(mdg4)", и мутация mod(mdg4)"' очевидно супрессируют мутантный фенотип с!6, демонстрируя таким образом, что белок Мос1(1т^4)-67.2 существенен для блокирования энхансера крыльев, и что МойДС не способен компенсировать его потерю. С другой стороны, экспрессия белка МосЗДСЗ полностью восстанавливает функцию 8и(Н\у)-инсулятора на фоне mod(mdg4)"l, по эффекту воспроизводя белок Мос)(тс^4) дикого типа.
Инсулятор 8и(Н\у) в аллеле с1к слабее, чем в с{\ поскольку он имеет только 7, а не 12 сайтов связывания для белка 8и(Н\у). Проявление этого аллеля выражается в промежуточном фенотипе: многочисленные сливающиеся вырезки по краям крыловой пластины (Рис.бБ). Поэтому аллель ак более чувствителен к уровню белка Мос1(тс^4)-67.2 и почти полностью супрессируется одной копией мутации mod(mdg4)",. Производная Мос1ДО восстанавливала активность инсулятора на фоне mod(mdg4)"l/mod(mdg4)"l мутации, полностью воспроизводя эффект, наблюдаемый в случае экспрессии белка дикого типа (Рис.6). Этот эксперимент показал, что в ядре клетки присутствует достаточное количество функционального белка
Рис.6. Модельные системы для исследовании in vivo.
А. Схематическое изображение аллеля у2 Б. Схематическое изображение аллелей с/6 и ак
Овалами обозначены энхансеры (En) крыльев (w, wing), тела (b, body), щетинок (br, bristle) и wing margin (win). Треугольником обозначена инсерция ретротранспозона МДГ4 (другое название - gypsy), фланкированная длинными концевыми повторами. Инсулятор Su(Hw) обозначен темным кружком. На фотографиях слева представлены фенотип кутикулы брюшка и пигментация щетинок (5 - для дикого типа, 1 - при отсутствии работы инсулятора). На фотографиях слева показаны фенотипы крыльев.
ModAQ, для того чтобы связаться с сайтами инсулятора Производная ModAC и в этой чувствительной модельной системе не смогла восстановить инсуляторные свойства фенотипы крыльев у mod(mdg4)16 и mod(mdg4)"' мутаций были идентичными
Для того чтобы определить эффект полученных нами производных белка Mod(mdg4) и на других модельных системах, мы использовали различные аллели Achaete-Scute Complex (AS-C), находящегося в непосредственной близости от гена yellow (Modolell and Campuzano, 1998)
Все описанные аллели были протестированы с помощью производных белка Mod(mdg4) И снова нами было обнаружено, что мутация mod(mdg4)n (производная ModAC) проявляла себя точно так же, как mod(mdg4)"' мутация, подтверждая наши предыдущие данные об инсуляторной нефункциональности производной 'vludAC В то же врстя экспрессия производной ModAQ на фоне мутации mod(mdg4)"' полностью восстанавливало энхансер-блокирующую способность как 1А2 инсулятора, так и инсулятора в составе ретротранспозона МДГ4, а также снимала гетерохроматиновую репрессию в аллеле In(I)scV2 Эти эксперименты еще раз подтверждают функциональность ModAQ производной и не способность производной ModAC восстанавливать инсуляцию
5 Локализация призводных белка Mod(mdg4) в личинках
Как было показано ранее (Gerasimova & Corees, 1998) при помощи иммунного окрашивания на политенных хромосомах, сайты связывания для белка Su(Hw) полностью колокализуются с сайтами связывания белка Mod(mdg4) Два хорошо видимых места локализации 8и(Н\у)-инсуляторов это инсерции МДГ4 в локусах у2 и scD: на конце X-хромосомы
Связывание производных белка Mod(mdg4) с сайтами инсуляторов было проанализировано на политенных хромосомах Как и ожидалось, ModAQ связывался с политенными хромосомами точно так же, как белок дикого типа, в частности, на бэндах, соответствующих Su(Hw) инсулятору в составе мобильного элемента МДГ4, в у2 и se1" (цветные фотографии представлены в тексте диссертации) И, наоборот, в форме ModAC (мутация mod(mdg4)16) практически терял способность связываться на политенных хромосомах, а имеющиеся редкие сайты не колоколизовались с белком Su(Hw) Эти данные подтверждают, что производная ModAQ, так же как Mod(mdg4) дикого типа, но не ModAC производная, взаимодействует с наблюдаемыми при иммунном окрашивании Su(Hw)-инсуляторами
И, наконец, мы проанализировали иммунное окрашивание в клетках имагинальных
дисков Drosophila В соответствии с опубликованными ранее данными и нашими
9
экспериментами в S2 клетках, ядра дикого типа содержали множественные колокализующиеся скопления белков Mod(mdg4) и Su(Hw) С другой стороны, в клетках с мутацией mod(mdg4)"' был смутно виден только неясный фон белка Su(Hw), не способного образовывать четких скоплений Как и ожидалось, трансгенная экспрессия белка Mod(mdg4) дикого типа на фоне мутации mod(mdg4)ul восстанавливала распределение белков по дикому типу
Как уже было продемонстрировано в наших экспериментах, белок ModAQ восстанавливает все протестированные функции 8и(Н\у)-инсулятора и связывается со всеми инсуляторными сайтами на политенных хромосомах Однако ModAQ на фоне мутации mod(mdg4)"' не формировал «инсуляторные тельца» и не входил в какие-либо ядерные скопления, хотя мы видели четко выраженное цитоплазматическое распределение белков Mod(mdg4) и Su(Hw) Интересно, что при экспрессии белка ModAQ на фоне mod(mdg4)+ ядерные скопления восстанавливались как для белка Mod(mdg4), так и для Su(Hw) При этом цитоплазматическое распределение также сохранялось, хотя и в меньшей интенсивности Эти данные хорошо согласуются с результатами полученными на S2 клетках Drosophila
Белок ModAC не может функционально поддерживать 8и(Н\у)-инсуляторы и связываться с соответствующими сайтами на хроматине Однако, в клетках mod(mdg4)T6 (экспрессирующих вариант ModAC) была отмечена его колокализация с белком Su(Hw) в ядерных «инсуляторных тельцах», которых было меньше, чем в диком типе, но сопоставимо с ModAQ на фоне mod(mdg4)
6 Нефункциональный белок Su(Hw) способен образовывать спеклы
На следующем этапе мы решили проверить, каким образом связаны способность основного инсуляторного белка Su(Hw) взаимодействовать с консенсусной ДНК, образование «инсуляторных телец» и функционирование инсулятора Для этого мы использовали трансгетерозиготную линию Drosophila с двумя мутациями по гену su(Hw) (Рис 7) Одна мутация - su(Hw)r - несла делецию промотора гена и части первого его экзона Поэтому данный аллель не способен давать какой-либо продукт и являлся нуль-мутацией Другая мутация - su(Hwf - была вызвана точечной заменой аминокислоты цестеина на тирозин в позиции 525, что приводило к нарушению правильного сворачивания домена «цинковый палец №10» и, как следствие, к неспособности такого белка связываться с молекулой ДНК Однако аллель su(Hwf производит полноразмерный белок, который можно детектировать антителами Сочетание этих мутаций приводит к потере инсуляции, что было подтверждено на нашей модельной системе аллелях у2 и et6, вызванных инсерцией мобильного элемента МДГ4
Л'и(//и/
(>> Т>г
1
:ЧЗ- ЧНННН ННКННЬ
делеция \ч(11п)
Рис 7 Схематичное изображение мутации
Мутация несет делецию промотора гена и части первого его экзона Другая мутация $и(Нм/ вызвана
точечной заменой аминокислоты цестеина на тирозин в позиции 525, что ведет к нарушению правильного сворачивания домена «цинковый палец №10» и как следствие, к неспособности такого белка связываться с молекулой ДНК
Окрашивание имагинальных дисков линии $и(Ны) антителами к белку
8и(Н\у) выявило нормально сформированные «инсуляторные тельца», образующиеся в ядрах клеток (цветные фотографии представлены в тексте диссертации) К тому же эти «инсуляторные тельца» полностью колокализовались с белками СР190 и Мос!(тс1§4), против которых проводилось также иммунное окрашивание
Таким образом, белок 8и(Н\у), неспособный связываться с ДНК и поэтому не подцеживающий инсуляцию, тем не менее, был способен к формированию полноценных «инсуляторных телец»
ЧАСТЬ II
1. Удаление сигналов ядерной локализации белка Мо(1(пм^4) влияет на распределение белка в клетке и не влияет на его инсуляторные свойства.
Для анализа роли сайтов ядерной локализации в распределении «инсуляторных телец» в клетке нами была сделана серия химерных конструкций с делецией первого и второго сайтов ядерной локализации Обе конструкции содержали трехкратный РЬАО-эпитоп на С-конце (Рис 1)
При иммунохимическом окрашивании против РЬАО-эпитопа в трансфецированных Э2 клетках во всех вариантах наблюдалось равномерное цитоплазматическое распределение белка Белок был невидим в ядре и показывал диффузное распределение в цитоплазме Таким образом, при удалении любого из сигналов N1^ белок показывал цитоплазматическое распределение без образования «инсуляторных телец» (цветные фотографии представлены в тексте диссертации)
Функциональный анализ в мухах Drosophila проводился по той же схеме, что для ModAQ и ModAC производных (см. выше). В линиях с аллелями у и с(' на фоне mod(mdg4)"'/mod(mdg4)"' мутации, конструкции экспрессировали белки Mod-ANLSl и Mod-ANLS2, которые полностью восстанавливали работу инсулятора. Во всех анализируемых конструкциях наблюдалось нарушение развития крыловой пластины (аллель ct6) и снижение экспрессии гена yellow в абдоминальной части брюшка Drosophila.
Полученные неожиданные результаты показывают, что, несмотря на отсутствие сайтов ядерной локализации и цитоплазматическое распределении белка, наблюдаемом при иммунноокрашивании, Mod-ANLSl и Mod-ANLS2 производные способны проникать в ядро клетки и функционировать в составе инсуляторных комплексов.
2. Процесс сумолирования играет ключевую роль в образовании спеклов белка Mod(mdg4)
Совсем недавно в лаборатории В.Корцеса была показана возможность сумолирования различных компонентов инсуляторного комплекса. В том числе было показано, что белок Mod(mdg4) сумолируется in vitro и in vivo. К тому же недавно в работе П.11. Пондолфи была показана важная роль процесса сумолирования в образовании PML телец, которые сильно похожи на исследуемые нами «инсуляторные тельца». Поэтому мы решили проанализировать связь сумолирования и образования «инсуляторных телец».
Методами биоинформатики нами были выявлены два мотива ТКХЕ, являющихся консенсусом для связывания с белком SUMO. Один из них располагается за 62 аминокислоты от первого сайта ядерной локализации в позиции 160, а другой в позиции 423 непосредственно около второго NLS (Рис.8).
ВТВ K16QR Q NLS-1 NLS-2 K423R FLYWCH S1D
Рис.8. Схематическое изображение доменов белка Mod(mdg4). Вертикальными прямоугольниками отмечены аминокислотные замены в сайтах прикрепления белка SUMO (K160R и K423R).
Основываясь на этих данных, нами было сделано несколько конструкций. Производная Mod K160R имела точечную замену остатка лизина на аргинин в одном из сайтов прикрепления SUMO, таким образом, нарушалась консенсусная последовательность Ч'КХЕ. Производная Mod K.423R имела такую же точечную замену во втором сайте прикрепления SUMO. Производная Mod K160R/K423R имела такие же точечные замены в
обоих сайтах связывания для белка SUMO. В клетках S2, экспрессирующих мутантные варианты Mod K.160R и ModK423R, при окрашивании антителами к эпитопу FLAG, белок распределялся как в клетках «дикого типа»: он находился в ядре и образовывал «инсуляторные тельца». Точно также распределялись и другие белки-компоненты инсуляторного комплекса (Su(Hw) и CP 190), демонстрируя полную колокализацию с производными формами Mod(mdg4). Следовательно, изменение любого одного из сайтов сумолирования не влияло на способность белка Mod(mdg4) участвовать в формировании «инсуляторных телец» (цветные фотографии представлены в тексте диссертации).
Однако, при изменении обоих сайтов связывания SUMO, картина распределения белка Mod K160R/K423R коренным образом менялась (Рис.9). Белок по-прежнему находился в ядре, ни не образовывал «инсуляторных телец», а распределялся равномерно внутри ядра. При этом наблюдалось изменение в распределении других белков инсуляторного комплекса. Распределение белка CP! 90 не менялось по сравнению с распределением в клетках дикого типа. Однако белок Su(Hw) имел более диспергированное по сравнению с контролем распределение: он с одной стороны частично колокализовался с белком CP 190 в составе «инсуляторных телец», но с другой стороны частично локализовался с диффузным распределением Mod K160R/K.423R производной. Следовательно, можно утверждать, что несумолированная форма белка Mod(mdg4) не в состоянии формировать или вступать в «инсуляторные тельца». При этом экспрессия такой производной белка Mod(mdg4) частично нарушает распределение связанного с ним Su(Hw) белка. Это указывает на то, что белок Mod(mdg4) может не только вовлекаться в «инсуляторные тельца», но и участвовать в их формировании (цветные фотографии представлены в тексте диссертации).
Рис.9 Распределение белка Mod с мутированными сайтами прикрепления белка SUMO в ядрах клеток S2.
Представлены результаты специфического иммунного окрашивания ядер 52-клеток Drosuphila (aFLAG - экспрессируемьш рекомбинантный белок; aSu - белок Su(Hw}; ctCP 190 - белок СР190; aLamin - белок ядерной оболочки).
Один из компонентов процесса сумолирования, белок Ubc9, выполняет роль фермента конъюгации (Е2 лигаза), ковалентно пришивая белок SUMO к субстрату С помощью метода двугибридной дрожжевой системы, мы обнаружили, что белок Ubc9 непосредственно взаимодействует с ВТВ доменом белка Mod(mdg4) (см диссертацию) Для дальнейшего анализа связи сумолирования и образования «инсуляторных телец» мы использовали полученные нами ранее мутации в ВТВ домене белка Mod(mdg4)-67 2, которые нарушали его способность к димеризации Анализ мутаций Mod R47Q, Mod D33N/H46D и Mod D33N/R47Q показал их способность формировать разные по форме и размеру «инсуляторные тельца» в ядрах клеток Однако в двугибридной системе белок Ubc9 очень хорошо взаимодействует с белком Mod R47Q, но совсем не взаимодействует с Mod D33N/H46D и Mod D33N/R47Q производными Таким образом, мы показали, что нарушение связывания белка Ubc9 не коррелирует с разрушением «инсуляторных телец» в ядре несмотря на то, что белок Ubc9 не может связаться с производными Mod(mdg4), «инсуляторные тельца» способны образовываться в ядре По-видимому, существует дополнительный белок способный привносить Ubc9 и осуществлять сумолирование Mod(mdg4)-67 2 И действительно, мы показали, что CP 190 также способен взаимодействовать с Ubc9 (см диссертацию) К тому же, белок CP 190 входит в состав инсуляторного комплекса, взаимодействует с Mod(mdg4)-67 2 и сумолируется Таким образом, белком способным привносить фермент конъюгации Ubc9, который ковалентно пришивает SUMO к субстрату -может являться CP 190
Каким же образом мутации в белке Mod(mdg4), нарушающие сайты сумолирования и, как следствие, образование «инсуляторных телец» будут влиять на инсуляцию в DrosophiW Для ответа на этот вопрос были получены трансгенные линии мух, экспрессирующие под промотором, содержащим UAS-последовательность, мутантные производные «Mod K160R», «Mod K423R» и «Mod K160R K423R» Последующее скрещивание таких линий с GAL-драйвером позволяло индуцировать экспрессию конструкции в любых тканях на любой стадии развития мухи Все эксперименты с трансгенными конструкциями проводились на фоне мутации mod(mdg4)"' Эта мутация позволяет исследовать эффект экспрессии Mod(mdg4) производных без влияния эндогенного белка, поскольку она не позволяет белку связываться с инсуляторными комплексами
Анализ инсуляторной активности производных Mod(mdg4) проводился на самцах Drosophda в аллелях локуса ct и yellow, вызванных инсерцией мобильного элемента МДГ4 (см Результаты I часть, описание модельной системы)
Выяснилось, что все исследуемые варианты Mod восстанавливали активность инсулятора Su(Hw) на фоне mod(mdg4)"'/mod(mdg4')"' мутации, полностью воспроизводя
14
эффект, наблюдаемый в случае экспрессии белка дикого типа. Таким образом, in vivo ни одна из этих мутаций не оказывала влияние на инсуляторную функцию белка Mod(mdg4).
3. Уникальные С-концевые домены белка Mod(mdg4) не нужны для образования «инсуляторных телец»
Локус mod(mdg4) является сложным и состоит как минимум из 26 сплайс-вариантов, каждый из которых имеет общий N- и различные С-концы. Один из сплайс-вариантов кодирует белок Mod(mdg4) с молекулярной массой 67.2 кДа (Mod(mdg4)-67.2), который является одним из необходимых основных компонентов Su(Hw) инсуляторного комплекса. Уникальная С-концевая часть этого белка включает в себя домен, ответственный за инсуляцию, домен «цинковый палец» FLYWCH типа и второй сигнал ядерной локализации. Нарушение связи белка Mod(mdg4)-67.2 с белком Sn(Hw) приводит к потере инсуляции и, как было показано в прежних исследованиях (Gerasimova and Corees, 1998; Gerasimova et al., 2000), к исчезновению «инсуляторных телец».
ModWT
ModT6 ModXI Mod72I ModEII ModAZn
Рис. 10. Схематическое изображение мутантных вариантов белка Mod(mdg4).
Сверху вниз: ModWT (дикий тип); ModT6 (аналог ModAC); Mod XI; Mod 721; Mod Ell; Mod AZn.
Для того чтобы понять роль уникальных доменов белка Mod(mdg4)-67.2 в формировании «инсуляторных телец», нами были созданы ряд производных (Рис.10).
В конструкции ModAZn был удален домен «цинковый палец» FLYWCH типа. Была создана производная ModEII идентичная мутации mod"'/mod'1, где от уникальной части белка оставался лишь второй сайт ядерной локализации с консенсусом для сумолирования. Мутация, при которой белок целиком лишался уникального для Mod(mdg4)-67.2 С-концевого района, получила название ModXI. При мутации Mod72I целиком удалялся район, ответственный за взаимодействие с белком Su(Hw). Все описанные выше конструкции имели на С-конце экспрессирующийся «в рамке» FLAG эпитоп. Анализ экспрессии полученных
15
втв
Q NLS-1
BTB Q NLS-1
яШШШ^ШШШвШЛ 1 'К
втв Q NLS-1
1 ■:.....yw- jjj^l
BTB Q NLS-1
' шШЯ '' ШШ
BTB Q NLS-1
нявннннявн Н -
ВТВ
NLS-2 FLYWCH
■ яшшят
NLS-2 FLYWCH
SID
SID
NLS-2 FLYWCH NLS-2 FLYWCH NLS-2 FLYWCH
SID
производных в 82-клетках дал неожиданный результат. Все анализируемые белки имели ядерное распределение и образовывали полноценные «инсуляторные тельца» (цветные фотографии представлены в тексте диссертации). Причем, наблюдалась полная колокализация с другими белками инсуляторного комплекса - Su(Hw) и CP 190. Однако генетический анализ тех же производных показал, что, по своей способности восстанавливать работу инсулятора, их можно разделить активные и не активные. Так тансген ModAZn полностью восстанавливал инсуляторную способность, в то время как конструкции экспрессирующие в мухах белки ModXI, Mod72I, а также мутации mod"'/mod"' (аналог производной ModEII) и mod76/modT6 (аналог производной ModAC) были не способны восстановить работу инсулятора. Эти эксперименты показали, что ни один из уникальных доменов белка Mod(mdg4)-67.2 не является необходимым для формирования «инсуляторных телец». Однако для нормальной работы инсулятора абсолютно необходим домен ответственный за взаимодействие с белком Su(Hw), так как при его отсутствии производные формы Mod(mdg4)-67.2 были не способны восстанавливать инсуляцию.
7. Выявление спеклообразующего компонента инсуляторных телец
Эксперименты с применением РНК-интерференции позволили нам выяснить, какой из белков, входящих в состав Su(Hw) инсулятора, является спеклообразующим. В трансфецированных 82-клетках спеклы полностью пропадали при снижении экспрессии белка CP 190. И практически не исчезали при инактивации продукта гена su(Hw). Western-блот анализ наглядно демонстрирует существенное снижение белка в ядерном экстракте, полученном из трансфецированных 82-клеток (Рис.10).
При снижении экспрессии белка Mod(mdg4), некоторое количество белка Su(Hw) не входит в ядерные спеклы, а распределено диффузно внутри ядра. Сформированные белком Su(Hw) спеклы менее интенсивно окрашены по сравнению с диким типом. В спеклах белок Su(Hw) колокализуется с белком CP 190 (цветные фотографии представлены в тексте диссертации).
Рис. 10. Результаты И^егл-блот анализа.
Заметно существенное снижение белка, полученного из клеток, обработанных методом НЛ'Лк В качестве контроля использовались нетрансфецированные клетки. Сравнение интенсивности экспрессии белков в трансфецированных и нетрансфецированных клетках проводили по уровню экспрессии белка тубулина. На рисунке отмечены размеры белков (в кДа): 190 кДа - белок СР190, 130 кДа - белок Зи(Н'й'), 100 кДа - белок ГуМ(тс1§4), 55 кДа - белок тубулин.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Большой интерес к вопросу о механизме действия инсуляторов вызван постепенным переносом центра тяжести в современных исследованиях с изучения простого взаимодействия между регуляторными элементами генов на выяснение влияния на экспрессию дальних и сверхдальних взаимодействий в геноме, а также влияние организации хроматина в ядре на экспрессию генов Инсуляторы представляют один из ключевых механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов и поддержания доменной структуры хроматина Наконец, понимание механизма работы инсуляторов вносит большой вклад в выяснение основ работы энхансеров, сайленсеров и организации генома в целом
Ранее была предложена модель мелампЗма действ..". ..псуляторов, 0С"0ЕЬ'вающяяся нз способности белков, входящих в состав инсуляторного комплекса, образовывать внутри ядра скопления, названные «инсуляторными тельцами» По этой модели, предполагается, что инсуляторные комплексы, связанные с ДНК, взаимодействуют друг с другом, образуя видимые в ядре скопления Образовавшиеся «инсуляторные тельца» выпетливают хроматин, расположенный между ними, и формируют таким образом «домены независимой транскрипции» Предполагается, что регуляторные элементы, находящиеся в одном таком домене, не способны влиять на активность генов, расположенных в другом домене Эта модель работы инсуляторов подкреплялась лишь тем, что в «инсуляторных тельцах» наблюдалась колокализация компонентов инсуляторного комплекса, а при введении мутации тод^т)^)"1 наблюдалось ослабление инсуляторной активности и размывание «инсуляторных телец»
Изучая роль отдельных доменов белка Мос1(тс^4), нам удалось разделить проявление инсуляторной активности и способность белков инсуляторного комплекса образовывать «инсуляторные тельца»
Используя производную белка Мос1(тс1£4) с делецией глютамин-богатого района -Мос1ДС> - мы показали, что этот белок аккумулируется в цитоплазме и не формирует каких-либо видимых образований в ядре При этом в 52 клетках другие компоненты инсуляторного комплекса - белки 5и(Н\у) и СР190 - формировали нормально колокализующиеся «инсуляторные тельца», а в имагинальных дисках, на фоне мутации mod(mdg4)"l/ mod(mdg4)"' , происходило частичное или полное перераспределение белка 8и(Н\у) в цитоплазму, где он колокализовался с Мос1ДС> Очевидно, что белок Мос1Д(2 сохраняет способность взаимодействовать с белками, но не в ядре его накопление и олигомеризация в цитоплазме может уменьшать количество доставляемых в ядро уже синтезированных белков Мо(](т(]з4) и Зи(Ни') В то же время, в Б2 клетках уже существует эндогенный белок
17
Mod(mdg4), способный участвовать в формировании и «закреплении» уже имеющихся на момент трансфекции «инсуляторных телец» Это подтверждается данными, полученными при экспрессии белка ModAQ на фоне mod(mdg4)'l mod(mdg4)*, когда «инсуляторные тельца» восстанавливались как для белка Mod(mdg4), так и для Su(Hw) При этом цитоплазматическое распределение также сохранялось, хотя и в меньшей интенсивности
Другая производная, ModAC, несла делецию части домена, отвечающего за взаимодействие с белком Su(Hw) Несмотря на это, ModAC был способен образовывать «инсуляторные тельца» как в S2 клетках, так и в имагинальных дисках При этом, образовывающиеся «инсуляторные тельца» очень хорошо колокализовались с белками Su(Hw) и CP 190
Для функционального анализа полученных производных мы использовали хорошо отработанные модельные системы аллели у2 и с/5, вызванные инсерцией мобильного элемента МДГ4, в составе которого находился Su(Hw) инеулятор В этих модельных системах нами были получены неожиданные результаты производная ModAQ оказалась полностью функциональной, в то время как ModAC (ее полный аналог мутация mod(mdg4)TÍ) - нет Абсолютно такая же ситуация наблюдалась в других модельных системах, которые позволяли тестировать функциональность производных белка Mod(mdg4) с обоими инсуляторами-gypsy и эндогенным Эи(Н\у)-зависимым (1А2) инсулятором
В эксперименте по коиммунопреципетации белок Su(Hw) выявлялся в одном комплексе с ModAC, но гораздо хуже, чем в случае белка ModAQ Анализ в двугибридной дрожжевой системе показал, что производная ModAC, в отличие от ModAQ, не способна взаимодействовать с белком Su(Hw) напрямую Вероятно, взаимодействие между ModAC и Su(Hw) опосредуется белком CP 190, про которого известно, что он взаимодействует с белком Su(Hw) и Mod(mdg4) in vitro и in vivo
Важно отметить, что исчезновение в ядрах окрашивания против ModAQ не означает отсутствие самого белка Это только значит, что внутриядерный белок ModAQ не агрегирует сам или не примыкает к уже существующим спеклам Стандартное субклеточное фракционирование и и^ега-гибридизация четко демонстрировали наличие ModAQ и Su(Hw) в ядре Иммуноокрашивание политенных хромосом четко показало наличие белка ModAQ на хроматине и его полную колокализацию, в отличие от производной ModAC, с белком Su(Hw)
Однако более уместными в данном случае являются данные, полученные при иммунопреципитации хроматина (X-ChIP), которые показывали, что с районами хроматина, про которые было известно, что они содержат 8ц(Н\у)-зависимые инсуляторы и похожие
мотивы, повсеместно были связаны одинаковые количества белка дикого типа Mod(mdg4) и ModAQ Уровень же белка ModAC был неотличим от фона
Обобщая, можно сказать, что белок ModAQ сохраняет все существенные для инсулятора свойства В ядра клеток Drosophüa он доставляется, возможно, по причине наличия одно сигнала ядерной локализации (NLS) С сайтами 5и(Н\у)-инсулятора на хроматине связывается не менее эффективно, чем белок дикого типа Но белок ModAQ не формирует ядерные спеклы и не вступает в уже существующие И наоборот, белок ModAC, невзаимодействующий с белком Su(Hw), совершенно неспособен связываться с инсуляторными сайтами на хроматине При этом он полностью колокализуется (возможно, присоединенный другими белками) с белком Su(Hw) в ядерных «инсуляторных тельцах»
Эти данные подтсрждают, что в соответствии со свойства"", продемонстрированными т vitro, белок ModAQ является функциональным эквивалентом белку дикого типа Mod(mdg4) на инсуляторах Drosophda, тогда как ModAC таковым не является
Однако остается вопрос что же такое «инсуляторные тельца», как они формируются и какова их роль В ядре клетки можно наблюдать множество различных образований на подобии «инсуляторных телец» К примеру, хорошо известные PML-NB, включающие в свой состав многие, не обязательно функционально связанные, белки Недавно было показано, что в их образовании важную роль играет процесс сумолирования (Bernardi and Pandolfi, 2007) Также совсем недавно была показана возможность сумолирования различных компонентов инсуляторного комплекса В том числе было показано, что белки Mod(mdg4) и CP 190 сумолируются т vitro и in vivo, а белок Su(Hw) - нет (Corees et al, 2006) В нашей работе мы продемонстрировали, что ранее показанное сумолирование белка Mod(mdg4) необходимо для привлечения его в образующиеся «инсуляторные тельца», поскольку мутирование найденных нами сайтов сумолирования нарушает образование «инсуляторных телец» белка Mod(mdg4) При этом мутирование сайтов сумолирования Mod(mdg4) частично дестабилизирует вхождение в них белка Su(Hw) и никак не сказывается на способности белка СР190 формировать «инсуляторные тельца» По-видимому, сумолированный белок Mod(mdg4) стабилизирует вхождение Su(Hw) в «инсуляторные тельца»
Однако, такие изменения в структуре «инсуляторных телец» никак не повлияли на функциональную активность инсулятора При экспрессии белка Mod(mdg4) с мутированными сайтами сумолирования, в нашей модельной системе (аллели у2 и ct6) инсулятор продолжал блокировать энхансеры, что было видно по измененной пластине крыла и снижение экспрессии гена yellow в кутикуле Более того, все производные с различными делециями уникального района белка Mod(mdg4) были способны образовывать
19
полноценные «инсуляторные тельца» в ядре клетки. Однако, только те из них, которые имели домен отвечающий за связывание с белком 8и(Н\у), были способны участвовать в инсуляции. Все остальные производные в этом отношении были не функциональны.
Исходя из полученных данных, мы сделали вывод о том, что нет прямой связи между образованием «инсуляторных телец» в ядре клеток и функционированием инсулятора. Основываясь на этом, мы выдвигаем гипотезу, что «инсуляторные тельца» являются своеобразными «депо» различных, в том числе и инсуляторных, белков (Рис. 11). Клетка, сумолируя неиспользуемые в данный момент в каких-либо процессах белки, накапливает их в таких «депо». При необходимости, за счет процесса десумолирования, белки могут быстро собраться в необходимый комплекс. Таким образом, «инсуляторные тельца» могут являться аккумуляторами белков, участвующих в одних процессах, и могут способствовать быстрой сборке необходимых комплексов.
Проведенные нами исследования ставят под сомнение идею о «инсуляторных тельцах», как организаторах структуры и функции генома, поддерживающих высокоорганизованный хроматин и формирующих функциональные домены. Особенно это становится очевидно в свете давно и хорошо известных фактов о том, что сильные мутации по белку Эи(Н\у) нарушают только фертильность самок, а мутация mod(mdg4)",, являющаяся нуль-мутацией для инсуляции, не нарушает никаких процессов развития Огоьорк'йа.
Рис. И. Предлагаемая модель, по которой «инсуляторные тельца» являются «депо», в которых хранится запас белков. Сборка инсуляторных комплексов, по-видимому, контролируется
процессами сумолирования-
десомулирования. Схематически изображено ядро клетки с нитями хроматина, сближенными в сайтах связывания белка 5и(Н\у). Скопления белков (известные ранее как «инсуляторные тельца») напрямую не связаны с функционированием инсулятора.
SUMO
Белки
формирующие инсулятор
выводы
1 Доказано отсутствие прямой взаимосвязи между образованием внутриядерных «инсуляторных телец» и активностью Su(Hw)-3aBnciiMbix инсуляторов у Drosophtla melanogaster
2 Впервые показано, что вовлечение инсуляторного белка Mod(mdg4) в состав «инсуляторных телец» полностью зависит от процесса его сумолирования
3 Продемонстрировано, что инсуляторный белок CP 190 играет ключевую роль в образовании «инсуляторных телец»
4 Выдвинута гипотеза о роли «инсуляторных телец» как «фабрике»
по ubiLipun сборке инсуляторпого лОтПЛСлСа .. хранение его ,со"*"оие,,то!;
СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах
1 Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Galkm A & Georgiev P «'Insulator bodies' are aggregates of proteins but not of insulators» EMBO reports, 2008, V 9 P 440445
2 Костюченко M В , Савицкая H E , Волков И А , Головнин А К , Георгиев П Г (2008) «Изучение функционального взаимодействия между тремя копиями инсулятора из мобильного элемента МДГ4 на примере модельной системы гена miniwhite Drosophila melanogaster» Доклады Академии Наук, 2008, Том 421, №6, Стр 830-835
Тезисы конференций
1 Волков И А . Головнин А К
Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии»
Томский государственный университет (г Томск) 10-12 мая 2007 г «Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование «инсуляторных телец» в ядрах клеток Drosophila melanogaster»
2 A Golovnin, L Melnikova, I Krivega, M Kostuchenko, I Volkov. P Georgiev The nucleoskeletal proteins EAST and CP60 modulate activity of the gypsy insulator in
Drosophila melanogaster "Nuclear Structure & Dynamics", Montpellier, France, 1-5 September, 2007
3 Мельникова JI С, Головины А К, Кривега И В , Костюченко M В , Волков И А IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск 11-15 мая 2008 г
«Белки ядерного матрикса EAST и СР60 влияют на активность gypsy инсулятора у Drosophila melanogaster»
4 Головнин А К , Волков И А
IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск 11-15 мая 2008 г
«Исследование распределения инсуляторных белков в соматических клетках дрозофилы»
5 Волков И А . Головнин А К
Школа-конференция «Биология традиции и инновации в 21 веке» в рамках I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия -2008» Казанский государственный университет (г Казань) 6-10 июля 2008 г «Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование «инсуляторных телец» в ядрах клеток Drosophila melanogaster»
6 Волков И А , Головнин А К
I Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике биологии»
Харьковский государственный университет (г Харьков) 15-20 сентября 2008 г «Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование «инсуляторных телец» в ядрах клеток Drosophila melanogaster» / __
Заказ № 226/09/08 Подписано в печать 30 09 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5
^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 у жим с/г ги , е-тт1 ¡п/о@с/г ги
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волков, Илья Алексеевич
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ. ИНСУЛЯТОРЫ
1.1. Геном эукариот организован в домены
1.2. «Молчащие» домены
1.3. Активные домены
1.4. Границы доменов
1.5. Инсуляторы
1.5.1. Инсулятор Su(Hw)
1.5.2. Эндогенные инсуляторы Su(Hw) и инсуляторные тельца
1.5.3. Нейтрализация инсуляторов
1.5.4. Модели действия инсулятора Su(Hw)
1.5.5. Модификация белков Su(Hw) инсулятора белком SUMO
2. SUMO: НОВЫЙ УЧАСТНИК ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОЙ МОДИФИКАЦИИ
2.1. Путь конъюгации белка SUMO
2.2. Строение белка SUMO и ферментов-участников пути сумолирования
2.2.1. Фермент El
2.2.2. Фермент Е
2.2.3. Фермент ЕЗ
2.3. Десомулирование
2.4. Сумолирование регуляторов транскрипции
2.5. Сумолирование белков, ассоциированных с репарацией ДНК
2.6. Инсуляторные белки сумолируются in vitro и in vivo
2.7. Протеолитический убиквитин-зависимый контроль конъюгации SUMO
2.8. Формирование ядерных телец PML
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Штаммы бактерий, дрожжей и линия культуты клеток
Drosophila melanogaster
2.1.2. Среды для выращивания бактерий, дрожжей и культуры клеток Drosophila melanogaster
2.1.3. Ферменты и реактивы
2.1.4. Олигонулеотидные праймеры
2.2. МЕТОДЫ 57 2.2.1. Биохимические методы
2.2.1.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК
2.2.1.2. Трансформация компетентных клеток плазмидами
2.2.1.3. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.1.4. Полимеразная цепная реакция
2.2.1.5. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.1.6. Агарозный гель-электрофорез
2.2.1.7. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
2.2.1.8. Определение нуклеотидной последовательности
2.2.1.9. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.2.1.10. Культивирование дрожжей
2.2.1.11. Трансформация дрожжевых клеток
2.2.1.12. Анализ взаимодействий в двугибридной системе
2.2.1.13. Трансфекция S2 клеток
2.2.1.14. Получение клеточного лизата из S2 клеток
2.2.1.15. Получение ядерного лизата из S2 клеток
2.2.1.16. Иммунопреципитация
2.2.1.17. Иммунопреципитация хроматина
2.2.1.18. Western-гибридизация
2.2.1.18. Окрашивание клеточных препаратов
2.2.1.19. РНК-интерфереция
2.2.1.20. Детекция белков на политенных хромосомах дрозофилы.
2.2.1.21. Детекция белков в клетках имагинальных дисков дрозофилы.
2.2.1.22. Получение конструкций, экспрсссирющих белки CP 190, Mod(mdg4)-67.2 и его варианты в 82-клетках Drosophila.
2.2.1.23. Получение конструкций для дрожжевой двугибридной системы.
2.2.1.24. Получение конструкций для трансформации в личинки мух 72 2.2.1. Генетические методы
2.2.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
2.2.2 Фенотипический анализ экспрессии генов
2.2.3 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 76 ЧАСТЬ I. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ОБРАЗОВАНИЕМ
ИНСУЛЯТОРНЫХ ТЕЛЕЦ» И ИНСУЛЯЦИЕЙ
1. Мутантные варианты белка Mod(mdg4), используемые в работе
2. Локализация Mod(mdg4) производных в 82-клстках
3. Распределение мутантных вариантов белка Mod в цитоплазматической и ядерной белковых фракциях S2 клеток.
X-ChIP анализ
4. Тестирование мутантных форм белка Mod in vivo
5. Локализация призводных белка Mod(mdg4) в личинках 86 ЧАСТЬ II. ВЫЯВЛЕНИЕ ФАКТОРА, ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА ОБРАЗОВАНИЕ «ИНСУЛЯТОРНЫХ ТЕЛЕЦ» БЕЛКА MOD(MDG4)
1. Удаление сигналов ядерной локализации белка Mod(mdg4) влияет на распределение белка в клетке и не влияет на его инсуляторные свойства.
2. Процесс сумолирования играет ключевую роль в образовании спеклов белка Mod(mdg4)
3. Уникальные С-концевые домены белка Mod(mdg4) не нужны для образования «инсуляторных телец»
4. Нефункциональный белок Su(Hw) способен образовывать спеклы
5. Выявление спеклообразующего компонента инсуляторных телец
Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102 ВЫВОДЫ 108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование "инсуляторных телец" в ядрах клеток Drosophila melanogaster"
Около десяти лет назад было показано, что белки Su(Hw) и Mod(mdg4) колокализуются в дискретных скоплениях в ядрах интерфазиых клеток Drosophila. Основываясь на том, что исчезновение этих иммунофлюоресцирующих скоплений при мутации белка Mod(mdg4) соответствовало ослаблению Su(Hw) инсулятора, такие ядерные образования были названы «инсуляторными тельцами».
Предполагается, что эти тельца представляют собой зафиксированные на ядерном матриксе скопления многих разнесенных по геному комплексов ДНК инсулятора Su(Hw). По какой-то причине инсуляторы объединяются друг с другом и держатся вместе благодаря взаимодействию между белками Mod(mdg4) и CP 190, таким образом образуя «отдельные хроматиновые петли-домены» и контролируя высокоупорядоченную организацию и функционирование генома. Основываясь на этом предположении, была выдвинута структурная модель работы инсулятора, постулирующая, что энхансер, находящийся в одном функциональном домене, не может активировать промотор, находящийся в другом домене.
К сожалению, предполагаемое сосредоточение удаленных последовательностей ДНК инсуляторов внутри «инсуляторных телец» не было подтверждено в течение многих лет. Поэтому в работе были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать связь функционирования 8и(Нш)-зависимых инсуляторов и образования внутриядерных «инсуляторных телец».
2. Изучить роль сумолирования в образовании «инсуляторных телец».
3. Понять роль отдельных белков инсуляторного комплекса в образовании «инсуляторных телец».
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Волков, Илья Алексеевич
выводы
Доказано отсутствие прямой взаимосвязи между образованием внутриядерных «инсуляторных телец» и активностью 8и(Нлу)-зависимых инсуляторов у Ого.чорИНа те1апо%а$Хег
Впервые показано, что вовлечение инсуляторного белка Мос1(тс^4) в состав «инсуляторных телец» полностью зависит от процесса его сумолирования Продемонстрировано, что инсуляторный белок СР190 играет ключевую роль в образовании «инсуляторных телец»
Выдвинута гипотеза о роли «инсуляторных телец» как «фабрики» по быстрой сборке инсуляторного комплекса и хранения его компонентов
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волков, Илья Алексеевич, Москва
1. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сиб.унив.изд-во, 2006г. стр 254
2. Жимулёв И.Ф., Беляева Е.С., Колесникова Т.Д., Волкова Е.И. Интеркалярный гетерохроматин и проблема сайленсинга. Вестник ВОГиС. 2004, Т. 8, № 2
3. Жимулёв И.Ф. Молекулярная и генетическая организация гетерохроматина в хромосомах дрозофилы. Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6 №2
4. Жимулёв И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск, Наука, 1993
5. Патрушев Л.И., Экспрессия генов. М.: Наука, 2000.Стр. 289
6. Сингер М., Берг П., Гены и геномы: в 2-х т. М.: Мир, 1998.- 391 с.
7. Страйер Л., Биохимия: в 3-х т. Т.З М.: Мир, 1985.Стр.128
8. Apionishev S, Malhotra D, Raghavachari S, Tanda S, Rasooly RS. The Drosophila UBC9 homologuc lesswright mediates the disjunction of homologues in meiosis I. // Genes Cells 2001. V.6.P.215-224.
9. Azuma Y, Tan SH, Cavenagh MM, Ainsztein AM, Saitoh H, Dasso M. Expression and regulation of the mammalian SUMO-1 El enzyme. // FASEB J. 2001. V.15. P.1825-1827.
10. Bayer P, Arndt A, Metzger S, Mahajan R, Melchior F, et a). Structure determination of the small ubiquitin-related modifier SUMO-1. // J. Mol. Biol. 1998. V.280. P.275-286.
11. Bencsath KP, Podgorski MS, Pagala VR, Slaughter CA, Schulman BA. Identification of a multifunctional binding site on Ubc9p required for Smt3p conjugation. // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.47938—47945.
12. Bernier-Villamor V, Sampson DA, Matunis MJ, Lima CD. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAPl. // Cell. 2002. V.108. P.345-356.
13. Blackwood E, Kadonaga J. Going the distance: a current view of enhancer action. // Science. 1998. V.281 P.60-63.
14. Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the distance: a current view of enhancer action. // Science. 1998. V.281. P.60-63.
15. Boddy MN, Howe K, Etkin LD, Solomon E, Freemont PS. PIC 1, a novel ubiquitin-like protein which interacts with the PML component of a multiprotein complex that is disrupted in acute promyelocytic leukaemia. // Oncogene 1996. V.13. P.971-982.
16. Bondarenko VA, Liu YV, Jiang YI, Studitsky VM. Communication over a large distance: enhancers and insulators. // Biochem. Cell Biol. 2003 Vol.81. P.241-251.
17. Breathnach R, Chambon P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. // Annu Rev Biochem. 1981. V.50. P.349-383.
18. Buchner K, Roth P, Schotta G, Krauss V, Saumweber H, Reuter G, Dorn R. Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. //Genctics. 2000. V.155. P. 141-157.
19. Bulger M, Groudine M. Looping versus linking: toward a model for long-distance gene activation. // Genes Dev. 1999. V.13. P.2465-2477.
20. Bulger M, Groudine M. Looping versus linking: toward a model for long-distance
21. Burke T, Kadonaga J. Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. // Genes Dev. 1996. V.10.P.711-724.
22. Burley S, Roeder G. Biochemistry and structural biology of transcription factor IID (TFIID). // Annu Rev Biochem. 1996. V.65. P.769-799.
23. Bylebyl GR, Belichenko I, Johnson ES. The SUMO isopeptidase Ulp2 prevents accumulation of SUMO chains in yeast. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.44113-44120.
24. Cai HN, Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. // Science. 2001. V.291. P.493^95.
25. Cai HN, Zhang Z, Adams JR, Shen P.Genomic context modulates insulator activity through promoter competition. // Development. 2001. V.128. P.4339-4347.
26. Cajiao I, Zhang A, Yoo EJ, Cooke NE, Liebhaber SA. Bystander gene activation by a locus control region. // EMBO J. 2004 V.23(19). P.3854-3863.
27. Campuzano S, Carramolino L, Cabrera CV, Ruiz-Gomez M, Villares R, Boronat A, Modolell J. Molecular genetics of the achaete-scute gene complex of D. melanogaster. // Cell. 1985. V.40(2) P.327-338.
28. Capelson M, Corces VG. Boundary elements and nuclear organization. // Biol. Cell 2004. V.96. P.617-629.
29. Capelson M, Corces VG. The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. // Mol. Cell. 2005. V.20. P.105-116.
30. Capelson M. and Corces VG. SUMO conjugation attenuates the activity of the gypsy chromatin insulator // The EMBO Journal. 2006.
31. Carey M. Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. // Mol. Cell. 1998. V.10. P.227-236.
32. Carey M. The enhanceosome and transcriptional synergy. // Cell. 1998. V.92. P.5-8.
33. Carter D, Chakalova L, Osborne CS, Dai YF, Fraser P.Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. //Nat. Genet. 2002. V.32. P.623-626.
34. Chakalova L, Carter D, Debrand E, Goyenechea B, Horton A, et al. Developmental regulation of the beta-globin gene locus. // Prog Mol Subcell Biol. 2005;38:183-206.
35. Chen A, Mannen H, Li SS. Characterization of mouse ubiquitin-like SMT3A and SMT3B cDNAs and gene/pseudogenes. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V.46. P.1161-1174.
36. Courey A, Jia S. Transcriptional repression: the long and the short of it. // Genes Dev. 2001. V.15. P.2786-2796.
37. Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT. SUMO-1 modification of IkappaBalpha inhibits NF-kappaB activation. // Mol. Cell. 1998. V.2. P.233-239.
38. Desterro JM, Rodriguez MS, Kemp GD, Hay RT. Identification of the enzyme required for activation of the small ubiquitin-like protein SUMO-1. // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P. 10618-10624.
39. Desterro JM, Thomson J, Hay RT. Ubch9 conjugates SUMO but not ubiquitin. // FEBS Lett. 1997. V.417. P.297-300.
40. Dillon N, Grosveld F. Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. V.4. P.260-264.
41. Donze D, Kamakaka R. RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae. // EMBO J. 2001. V.20. P.520-531.
42. Dorsett D. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V.9. P.505-514.
43. Dvir A, Conaway J, Conaway R. Mechanism of transcription initiation and promoter escape by RNA polymerase II. // Curr.Opin.Genet.Dev. 2001. V.ll. P.209-214.
44. Emerson B. Specificity of gene regulation. // Cell. 2002. V.109. P.267-270.
45. Epner E, Reik A, Cimbora D, Telling A, Bender MA, et al. The beta-globin LCR is not necessary for an open chromatin structure or developmentally regulated transcription of the native mouse beta-globin locus. // Mol. Cell. 1998. V.2. P.447-455.
46. Epps JL, Tanda S. The Drosophila semushi mutation blocks nuclear import of bicoid during embryogenesis. //Curr. Biol. 1998. V.8. P. 1277-1280.
47. Espinas M, Jimenez-Garcia E, Vaquero A, Canudas S, Bernues J, Azorin F. The N-terminal POZ domain of GAGA mediates the formation of oligomers that bind DNA with high affinity and specificity. // J.Biol.Chem. 1999. V.274. P.16461-16469.
48. Fiering S, Whitelaw E, Martin DI. To be or not to be active: the stochastic nature fly: different paths, same destinations. // Mol. Cell. 2005. V.18. P.395-398.
49. Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. //Nature. 2000. V.408. P.325-330.
50. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the ses chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. // Genes Dev. 1999. V.13. P.2098-2107.
51. Gdula DA, Corces VG. Characterization of functional domains of the Su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. // Genetics. 1997. V.145. P.153-161.
52. Georgiev P, Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. // Genetics. 1996. V.142. P.425-436.
53. Georgiev P., Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. // Genetics. 1996. V.142. P.425^136.
54. Gerasimova TI, Byrd K, Corces VG. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. // Mol. Cell. 2006. P.1025-1035.
55. Gerasimova TI, Byrd K, Corces VG. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. // Mol. Cell. 2000. V.6. P.1025-1035.
56. Gerasimova TI, Corces VG. Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization. // Annu. Rev. Genet. 2001. V.35. P. 193-208.
57. Gerasimova TI, Corces VG. Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. // Cell. 1998. V.92. P.511-521.
58. Geyer PK, Clark I. Protecting against promiscuity: the regulatory role of insulators. // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V.59. P.2112-2127.
59. Geyer PK. The role of insulator elements in defining domains of gene expression. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V.7. P.242-248.
60. Ghosh D, Gerasimova T, Corces V. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.
61. Ghosh D, Gerasimova TI, Corces VG. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.
62. Gill,G. Something aboutSUMOinhibits transcription. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. V.15. P.536 541.
63. Glass C, Rosenfeld M. The coregulator exchange in transcriptional functions of nuclear receptors. // Genes Dev. 2000. V.14 P.121-141.
64. Golovnin A, Birukova I, Romanova O, Silicheva M, Parshikov A, et al. An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. // Development 2003. V.130. P.3249-3258.
65. Golovnin A, Mazur A, Kopantseva M, Kurshakova M, Gulak P, Gilmore B, Whitfield W, Geyer P, Pirrotta V, Georgiev P. Integrity of the Mod(mdg4)-67.2 BTB domain is critical to insulator function in Drosophila. // Mol.Cell Biol. 2007. V.27. P.963-974.
66. Guasconi V, Souidi M, Ait-Si-Ali S. Nuclear Positioning, Gene Activity and Cancer. // Cancer Biology & Therapy. 2005. V.4. P.134-138.
67. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcription machinery. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. V.62. P.465-503.
68. Hardeland U, Steinacher R, Jiricny J, S char P. Modification of the human thymine-DNA glycosylase by ubiquitin-like proteins facilitates enzymatic turnover. // EMBO J. 2002. V.21. P.1456-1464.
69. Harrison D. A., Gdula D. A., Coyne R.S., Corces V. G. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function. // Genes Dev. 1993. V.7. P.1966-1978.
70. Hatzis P, Talianidis I. Dynamics of enhancer-promoter communication during differentiation-induced gene activation. // Mol Cell. 2002. V.10(6). P. 1467-1477.
71. Hay, R. T. Role of ubiquitin-like proteins in transcriptional regulation. // Ernst Schering Res. Found. Workshop, 2006. P. 173 192.
72. Hayashi T, Seki M, Maeda D, Wang W, Kawabe Y, et al. Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells. // Exp. Cell Res. 2002. V.280. P.212-221.
73. Hershko A, Ciechanover A. The ubiquitin system. // Annu.Rev. Biochem. 1998. V.67. P.425-479.
74. Hochstrasser M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. //Cell 2001. V. 107. P.5-8.
75. Hoege C, Pfander B, Moldovan GL, Pyrowolakis G, Jentsch S. RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO. // Nature 2002.
76. Hofmann H, Floss S, Stamminger T. Covalent modification of the transactivator protein IE2-p86 of human cytomegalovirus by conjugation to the ubiquitin-homologous proteins SUMO-1 and hSMT3b. // J. Virol. 2000. V.74. P.2510-2524.
77. Hofmann, T.G., Will, H. Body language: the function of PML nuclear bodies in apoptosis regulation. // Cell Death Differ. 2003. V.10. P.1290-1299.
78. Howe K, Williamson J, Boddy N, Sheer D, Freemont P, Solomon E. The ubiquitin-homology gene PIC1: characterization of mouse (Picl) and human (UBL1) genes and pseudogenes. //Genomics 1998.V.47. P.92-100.
79. HoY, Elefant F, Cooke N, Liebhaber S. A defined locus control region determinant links chromatin domain acetylation with long-range gene activation. // Mol. Cell. 2002. V.9. P.291-302.
80. Jackson PK. A new RING for SUMO: wrestling transcriptional responses into nuclear bodies with PIAS family E3 SUMO ligases. // Genes Dev.2001. V.15. P.3053-3058.
81. Jensen, K., Shiels, C., Freemont, P.S. PML protein isoforms and the RBCC/TRIM motif. // Oncogene. 2001. V.20. P.7223-7233.
82. Johnson Erica S. Protein modification by sumo 2004. // Annu. Rev. Biochem. V.73. P.355-382.
83. Johnson ES, Blobel G. Ubc9p is the conjugating enzyme for the ubiquitin-like protein Smt3p. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.26799-26802.
84. Johnson ES, Blobel G. Cell cycle-regulated attachment of the ubiquitin-related protein SUMO to the yeast septins. // J. Cell Biol. 1999. V.147. P.981-994.
85. Johnson ES, Gupta AA. An E3-like factor that promotes SUMO conjugation to the yeast septins. // Cell 2001. V.106. P. 735-744.
86. Johnson ES, Schwienhorst I, Dohmen RJ, Blobel G. The ubiquitin-like protein Smt3p is activated for conjugation to other proteins by an Aoslp/Uba2p heterodimer. // EMBO J. 1997. V.16. P.5509-5519.
87. Jones D, Crowe E, Stevens TA, Candido EP. Functional and phylogenetic analysis of the ubiquitylation system in Caenorhabditis elegans: ubiquitin-conjugating enzymes, ubiquitin-activating enzymes, and ubiquitin-like proteins. // Genome Biol. 2002.
88. Kagey MH, Melhuish TA, Wotton D. The polycomb protein Pc2 is a SUMO E3. //Cell 2003. V.113. P. 127-137.
89. Kahyo T, Nishida T, Yasuda H. Involvement of PIAS1 in the sumoylation of tumor suppressor p53. //Mol. Cell. 2001. V.8. P.713-718.
90. Kamitani T, Kito K, Nguyen HP, Fukuda-Kamitani T, Yeh ET. Characterization of a second member of the sentrin family of ubiquitin-like proteins. // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P. 11349-11353.
91. Kamitani T, Nguyen HP, Yeh ET. Characterization of NEDD8, a developmentally down-regulated ubiquitin-like protein. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 1400114004.
92. Katsani K, Hajibagheri M, Verrijzer C. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology. // EMBO J. 1999. V.18. P.698-708.
93. Kellum R, Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. // Mol. Cell Biol. 1992. V.12. P.2424-2431.
94. Kellum R, Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. // Cell. 1991. V.64. P.941-950.
95. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. // Mol. Cel. Biol. 1992. V.12. P.2424-2431.
96. Kim A, Dean A. Developmental stage differences in chromatin subdomains of thebeta-globin locus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101. P.7028-7033
97. Kim J., Shen B., Rosen C., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. // Mol. Cel. Biol. 1996. V.16. P.3381-3392.
98. Kim KI, Baek SH, Chung CH. Versatile protein tag, SUMO: its enzymology and biological function. // J. Cell Physiol. 2002. V.191. P.257-268.
99. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. // Genes Dev. 2004. V.18. P.1371-1384.
100. Krebs, J.E., Fry, C.J., Samuels, M.L., and Peterson, C.L. Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression. // Cell. 2000. V.102. P.587-598.
101. Kuhn EJ, Viering MM, Rhodes KM, Geyer PK. A test of insulator interactions in Drosophila. // EMBO J. 2003. V.22. P.2463-2471.
102. Kurepa J, Walker JM, Smalle J, Gosink MM, Davis SJ, et al. The small ubiquitin-like modifier (SUMO) protein modification system in Arabidopsis. Accumulation of SUMOl and -2 conjugates is increased by stress. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.6862-6872.
103. Laemmli UK, Kas E, Poljak L, Adachi Y. Scaffold-associated regions: cis-acting
104. Lee PS, Chang C, Liu D, Derynck R. Sumoylation of Smad4, the common Smad mediator of transforming growth factor-beta family signaling. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.27853-27863.
105. Lee T, Young R. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. // Annu Rev Genet. 2000. V.34. P.77-137.
106. Lefstin J, Yamamoto K. Allosteric effects of DNA on transcriptional regulators. // Nature. 1998. V.392 P.885-888.
107. Lemon B, Tjian R. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. // Genes Dev. 2000. V.14. P.2551-2569.
108. Li Y, Wang H, Wang S, Quon D, Liu YW, Cordell B. Positive and negative regulation of APP amyloidogenesis by sumoylation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P.259-264.
109. Lim C, Santoso B, Boulay T, Dong E, Ohler U, Kadonaga J. The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. // Genes Dev. 2004. V.18. P.1606-1617.
110. Lin X, Liang M, Liang YY, Brunicardi FC, Feng XH. SUMO-l/Ubc9 promotes nuclear accumulation and metabolic stability of tumor suppressor Smad4. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.31043-31048.
111. Lois LM, Lima CD, Chua NIL Small ubiquitin-like modifier modulates abscisic acid signaling in Arabidopsis. // Plant Cell. 2003. V.15. P.1347-1359.
112. Mahajan R, Delphin C, Guan T, Gerace L, Melchior F. A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAPl to nuclear pore complex protein RanBP2. // Cell. 1997. V.88. P.97-107.
113. Mahajan R, Gerace L, Melchior F. Molecular characterization of the SUMO-1 modification of RanGAPl and its role in nuclear envelope association. // J. Cell Biol. 1998. V.140. P.259-270.
114. Majumder P, Cai HN. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P.5223.
115. Mannen H, Tseng HM, Cho CL, Li SS. Cloning and expression of human homolog FISMT3 to yeast SMT3 suppressor of MIF2 mutations in a centromere protein gene. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.222. P. 178-180.
116. Matunis MJ, Coutavas E, Blobel G. A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the Ran-GTPase-activating protein RanGAPlbetween the cytosol and the nuclear pore complex. // J. Cell Biol. 1996. V.135. P.1457-1470.
117. McKenna N, O'Malley B. Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators. // Cell. 2002. V.108. P.465-474. Melchior F. SUMO nonclassical ubiquitin.// Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 2000. V.16. P.591-626.
118. Meulmeester E. and Melchior F. SUMO // Nature 2008 V.452.
119. Mongelard F, Corces VG. Two insulators are not better than one. // Nat. Struct.
120. Biol. 2001. V.8. P.192-194.
121. Muller S, Hoege C, Pyrowolakis G, Jentsch S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. V.2. P.202-210.
122. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, et al. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. // Science. 2001. V.291. P.495^98.
123. Myer VE, Young RA. RNA polymerase II holoenzymes and subcomplexes. // J Biol Chem. 1998. V.273. P.27757-27760.
124. Narlikar G, Fan H, Kingston R. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. // Cell. 2002. V.108. P.475-487.
125. Okuma T, Honda R, Ichikawa G, Tsumagari N, Yasuda H. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V.254. P.693-698.
126. Orphanides G, Lagrange T, Reinberg D. The general transcription factors of RNA polymerase II. // Genes Dev. 1996. V.10 P.2657-2683.
127. Orphanides G, Reinberg D. A unified theory of gene expression // Cell. 2002. V.108 P.439-451.
128. Pagans S, Ortiz-Lombardia M, Espinas M, Bernues J, Azorin F. The Drosophila transcription factor tramtrack (TTK) interacts with Trithorax-like (GAGA) and represses GAGA-mediated activation. //NAR. 2002. V.30. P.4406-4413.
129. Pai CY, Lei EP, Ghosh D, Corces VG. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. // Mol. Cell. 2004. V.16. P.737-748.
130. Palstra RJ, Tolhuis B, Splinter E, Nijmeijer R, Grosveld F, de Laat W. The betaglobin nuclear compartment in development and erythroid differentiation. // Nat. Genet. 2003. V.35. P.190-194.
131. Pandolfi PP, Tian Huai Shen, Hui-Kuan Lin, Scaglioni PP, Yung MT. The Mechanisms of PML-Nuclear Body Formation // Molecular Cell. 2006. V.24. P.331-339.
132. Parkhurst S.M., Harrison D.A., Remington M.P., Spana C., Kelley R.L., et al. //Genes Dev. 1988. V.2. P.1205-1215.
133. Parnell TJ, Geyer PK. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes. // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.
134. Parnell TJ, Viering MM, Skjesol A, Helou C, Kuhn EJ, Geyer PK. An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003. V.100. P. 13436-13441.
135. Parnell TJ, Kuhn EJ, Gilmore BL, Helou C, Wold MS, Geyer PK. Identification of genomic sites that bind the Drosophila suppressor of Hairy-wing insulator protein // Mol Cell Biol. 2006. V.26(16). P.5983-5993.
136. Perrod S, Gasser SM. Long-range silencing and position effects at telomeres and centromeres: parallels and differences.// Cell Mol. Life Sei. 2003. V.60. P.2303-2318.
137. Pichler A, Gast A, Seeler JS, Dejean A, Melchior F. The nucleoporin RanBP2 has SUMOl E3 ligase activity. // Cell 2002. V.108. P.109-120.
138. Pickart CM. Mechanisms underlying ubiquitination. // Annu. Rev. Biochem. 2001. V.70. P.503-533.
139. Pimpinelli S, Berloco M, Fanti L, Dimitri P, Bonaccorsi S, et al. Transposable elements are stable structural components of Drosophila melanogaster heterochromatin. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995. V.92. P.3804-3808.
140. Pirrotta V, Gross DS. Epigenetic silencing mechanisms in budding yeast and fruit fly: different paths, same destinations. // Mol. Cell. 2005. V.18. P.395-398.
141. Razin SV, FarrellCM,Recillas-Targa F. Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. // Int. Rev. Cytol. 2003. V.226. P.63-125.
142. Reynaud CA, Imaizumi-Scherrer MT, Scherrer K. The size of the transcriptional units of the avian globin genes defined at the premessenger RNA level. // J. Mol. Biol. 1980.
143. Roeder R. Role of general and gene-specific cofactors in the regulation of eukaryotic transcription. // Cold Spring Harbor Symp Quant Biol. 1998. V.58. P.201-218.
144. Rusche LN, Kirchmaier AL, Rine J. The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. // Annu Rev Biochem. 2003. V.72. P.481-516.
145. Rusche LN, Rine J. Conversion of a gene-specific repressor to a regional silencer. // Genes Dev. 2001. V.15. P.955-967.
146. Sachdev S, Bruhn L, Sieber H, Pichler A, Melchior F, Grosschedl R. PIASy, a nuclear matrix-associatcd SUMO E3 ligase, represses LEF1 activity by sequestration into nuclear bodies. // Genes Dev. 2001. V.15. P.3088-3103.
147. Saitoh H, Hinchey J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.6252-6258.
148. Schmidt,D. and Muller, S. PIAS/SUMO: new partners in transcriptional regulation. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V.60. P.2561 -2574.
149. Schubeler D, Francastel C, CimboraDM,Reik A, Martin DI, Groudine M. Nuclear localization and histone acetylation: a pathway for chromatin opening and transcriptional activation of the human beta-globin locus. // Genes Dev. 2000. V.14. P.940-950
150. Schubeler D, Groudine M, Bender MA. The murine beta-globin locus control region regulates the rate of transcription but not the hyperacetylation of histones at the active genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. P. 11432-11437
151. Schwartz DC, Hochstrasser M. A superfamily of protein tags: ubiquitin, SUMO and related modifiers. // Trends Biochem. Sci. 2003. V.28. P.321-328.
152. Scott K.S., Geyer P.K. Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. // EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279.
153. Scott KC, Taubman AD, Geyer PK. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. // Genetics 1999. V.15. P.787-798.
154. Seeler JS, Dejean A. Nuclear and unclear functions of SUMO. // Nat. Rev.Mol. Cell Biol. 2003. V.4. P.690-699.
155. Seufert W, Futcher B, Jentsch S. Role of a ubiquitin-conjugating enzyme in degradation of S- and M-phase cyclins. //Nature 1995. V.373. P.78-81.
156. Sharrocks, A. D. PIAS proteins and transcriptional regulation more than just SUMO E3 ligases? // Genes Dev. 2006. V.20. P.754 - 758.
157. Shayeghi M, Doe CL, Tavassoli M, Watts FZ. Characterisation of Schizosaccharomyces pombe rad31, a UBA-related gene required for DNA damage tolerance. //Nucleic Acids Res. 1997. V.25. P. 1162-1169.
158. Shen Z, Pardington-Purtymun PE, Comeaux JC, Moyzis RK, Chen DJ. UBL1, a human ubiquitin-like protein associating with human RAD51/RAD52 proteins. // Genomics. 1996. V.36. P.271-279.
159. Shuai K. Modulation of STAT signaling by STAT-interacting proteins. // Oncogene 2000. V.19. P.2638-2644.
160. Smale S. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. // Genes Dev. 2001. V.15. P.2503-2508.
161. Smale S. Transcription initiation from TATA-less promoters within eukaryotic protein-coding genes. // Biochim Biophys Acta. 1997. V.1351 P.73-88.
162. Sproul D, Gilbert N, BickmoreWA. The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes. //Nat Rev Genet. 2005. V.6(10) P.775-781.
163. Strahl B, Allis C. The language of eovalent histone modifications. // Nature. 2000. V.403. P.41-45.
164. Struhl K. Promoters, activator proteins, and the mechanism of transcriptional initiation in yeast. // Cell. 1987. V.49. P.295-297.
165. Struhl, K. Fundamentally different logic of gene regulation in eukaryotes and prokaryotes. // Cell. 1999. V.98. P.l-4.
166. Takahashi Y, Toh-e A, Kikuchi Y. A novel factor required for the SUM01/Smt3 conjugation of yeast septins. // Gene 2001. V.275. P.223-231.
167. Takahashi Y, Toh-e A, Kikuchi Y. Comparative analysis of yeast PIAS-type SUMO ligases in vivo and in vitro. // J. Biochem. 2003. V.133. P.415^122.
168. Tatham MH, Chen Y, Hay RT. Role of two residues proximal to the active site of Ubc9 in substrate recognition by the Ubc9.SUMO-1 thiolester complex. // Biochemistry 2003. V.42. P.3168-3179.
169. Tatham MH, Jaffray E, Vaughan OA, Desterro JM, Botting CH, et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.35368-35374.
170. Tatham MH, Kim S, Yu B, Jaffray E, Song J, et al. Role of an N-terminal site of Ubc9 in SUMO-1, -2, and -3 binding and conjugation. // Biochemistry 2003. V.42. P.9959-9969.
171. Tolhuis B, Palstra RJ, Splinter E, Grosveld F, de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. // Mol Cell. 2002. V.10(6) P.1453-1465.
172. Tong H, Hateboer G, Perrakis A, Bernards R, Sixma TK. Crystal structure of murine/human Ubc9 provides insight into the variability of the ubiquitin-conjugating system. // J. Biol. Chem. 1997.
173. Turner B.M. Histone acetylation and an epigenetic code // BioEssays. 2000. V. 22. P.836-845
174. Udvardy A, Maine E, Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. Hi Mol Biol. 1985. V.185(2) P.341-358.
175. Vakoc CR, Letting DL, Gheldof N, Sawado T, Bender MA, et al. Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. // Mol. Cell. 2005. V.17. P.453-462.
176. Valenzuela L, Gangadharan S, KamakakaRT. Analyses of SUM1-1-mediated longrange repression. // Genetics. 2006. V.172. P.99-112.
177. Valenzuela L. and Kamakaka R.T. Chromatin Insulators. // Annu. Rev. Genet. 2006. Vol.40. P. 107-38
178. Verdel A, Moazed D. RNAi-directed assembly of heterochromatin in fission yeast. //FEBS Lett. 2005. V.579. P.5872-5878.
179. Verger A, Perdomo J, Crossley M. Modification with SUMO. A role in transcriptional regulation. // EMBO Rep.2003.V.4. P.137-142.
180. Vijay-Kumar S, Bugg CE, Cook WJ. //J. Mol. Biol. 1987. V.194. P.531-544.
181. Walden H, Podgorski MS, Schulman BA. Insights into the ubiquitin transfer cascade from the structure of the activating enzyme for NEDD8. // Nature. 2003. V.422. P.330-334.
182. Wei W, Brennan MD. The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator. //Mol. Cell Biol. 2001. V.21. P.7714-7720.
183. Weis L, Reinberg D. Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. // FASEB J. 1992 V.6. P.3300-3309.
184. West A, Gaszner M, Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms. // Genes Dev. 2002. V.16. P.271-288.
185. West AG, Fraser P. Remote control of gene transcription. // Hum. Mol. Genet. 2005. V.14(Spec. No 1). P.101-111.
186. West AG, Gaszner M, Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms. // Genes Dev. 2002. V.16. P.271-288.
187. Wijgerde M, Grosveld F, Fraser P. Transcription complex stability and chromatin dynamics in vivo. //Nature. 1995. V.377(6546) P.209-213.
188. Xu Q, Li M, Adams J, Cai HN. Nuclear location of a chromatin insulator in Drosophila melanogaster. // J Cell Sci. 2004. V.l 17(Pt 7) P. 1025-1032.
189. Yamaguchi, T., Sharma, P., Athanasiou, M., Kumar, A., Yamada, S. and Kuehn, M. R. Mutation of SENPl/SuPr-2 reveals an essential role for dcsumoylation in mouse development. // Mol. Cell. Biol. 2005. V.25. P.5171 5182.
190. Zhang Y, Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. // Genes Dev. 2001. V.15. P.2343-2360.
191. Zhao K., Hart C.M., Laemmli U.K. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. // Cell. 1995. V.81. P.879-889.
192. Zhong, S., Salomoni, P., Pandolfi, P.P. The transcriptional role of PML and the nuclear body. // Nat. Cell Biol. 2000. V.2. P.85-90.
-
Волков, Илья Алексеевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.03
- Анализ энхансерных РНК, инсуляторных белков и модификаций хроматина в генетических конструкциях, трансфецированных в клетки дрозофилы
- Роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4)- компонентов инсулятора, в регуляции экспрессии генов Achaete-Scute комплекса у Drosophila melanogaster
- Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster
- Механизмы возникновения химерных элементов и их использование для изучения взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях у Drosophila melanogaster
- Генетический анализ нового семейства регуляторных генов у Drosophila melanogaster
