Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster

Головнин, Антон Клеменсович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

Головнин Антон Клеменсович

Свойства и функции 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов у ВговорЬПа те!а1^аз1ег

03.01.07 - молекулярная генетнка

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2011

4854797

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор,

академик РАН Георгиев Павел Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

академик РАН Гвоздев Владимир Алексеевич

доктор биологических наук, профессор Глазков Михаил Васильевич

доктор биологических наук Коробко Игорь Викторович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «25» марта 2011 года в «11» часов

на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН) по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г.Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан «24» февраля 2011 года. Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Нормальное функционирование эукариотического генома обеспечивается тонкими и точно скоординированными между собой механизмами регуляции экспрессии большого количества генов, отвечающими за время, место и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов. Экспрессия генов эукариот- это сложный и многостадийный процесс, важнейшим этапом которого является транскрипция. Таким образом, изучение механизмов и факторов регуляции транскрипции является одной из важнейших задач современной молекулярной генетики.

Регуляция транскрипции у высших эукариот осуществляется в результате взаимодействия между промоторами, определяющими начало транскрипции и ее базовый уровень, и различными цис-регуляторными элементами, которые либо усиливают (энхансеры), либо ослабляют (сайленсеры) базовый уровень транскрипции. Большинство энхансеров не обладает строгой специфичностью по отношению к промоторам, следовательно, должна существовать система, позволяющая энхансеру активировать только «правильный» промотор. Предполагается, что в функционировании данной системы значительную роль могут играть инсуляторы. Изначально инсуляторы были описаны как регуляторные элементы, которые: 1)находясь между энхансером и промотором способны блокировать взаимодействия между ними, при этом, не влияя на их функциональность; 2) обладают барьерными свойствами, т.е. препятствуют инактивирующему влиянию гетерохроматина на транскрипцию окруженного ими гена. Затем было установлено, что роль инсуляторов в регуляции транскрипции далеко не однозначна.

В настоящее время наиболее полно охарактеризован 8и(Н\у)-зависимый инсулятор, впервые обнаруженный в последовательности регротранспозоиа МДГ4 у ОгоъоркИа \inelanogasier . Известно, что инсулятор 8и(Нш) способен блокировать более 30 известных энхансеров,

работающих в разных тканях и на разных этапах развития. Кроме того, он способен блокировать различные репрессионные эффекты, включая негативное действие гетерохроматина и белков группы Ро1усошЬ. Белковый комплекс инсулятора 8и(Н\¥) включает три известных на данный момент белка: связывающийся с ДНК белок 8и(Н\у), белок Мос1(тс1£4) и недавно открытый белок СР190. Около 10 лет назад было показано, что в ядрах интерфазных клеток йго$орЫ\а инсуляторные белки 8и(Н\¥) и Мос1(т<1§4) колокализуются в дискретных скоплениях. На основании того, что исчезновение этих иммунофлюоресцирующих скоплений при мутации белка Мос1(ггк%4) соответствовало ослаблению 8и(Н\у)-зависимой инсуляции, такие ядерные образования были названы «инсуляторные тельца».

Предполагается, что «инсуляторные тельца» представляют собой скопления многих разнесенных по геному и связанных с ДНК белковых комплексов 8и(Н\у) инсулятора. Эти белковые комплексы объединяются друг с другом, благодаря взаимодействию между белками Мос1(тс1§4) и СР190, таким образом, образуя «отдельные хроматиновые петли-домены» и контролируя высокоупорядоченную организацию и функционирование генома. Исходя из этого предположения, была выдвинута структурная модель работы инсулятора, постулирующая, что энхансер, находящийся в одном функциональном домене, не может активировать промотор, находящийся в другом домене. К сожалению, предполагаемое сосредоточение расположенных на расстоянии друг от друга последовательностей ДНК инсуляторов внутри «инсуляторных телец» не было подтверждено экспериментально в течение многих лет.

В настоящий момент механизм действия инсуляторов изучен далеко не полностью. Существует несколько моделей их функционирования, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. В последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих, что инсуляторы являются регуляторными элементами с очень широким набором функций. Белки, традиционно воспринимаемые как компоненты инсуляторных комплексов, могут участвовать в процессах сегрегации хромосом и репарации ДНК (Мос1(тё§4) и СТСР), регуляции клеточного цикла и дозовой компенсации (СТСР), в процессах, регулирующих структуру и свойства хроматина (Мос1(тс^4)). Все это позволяет рассматривать инсуляторы как регуляторные элементы, обладающие очень широким спектром действия, а явление инсуляции как составную часть глобального процесса регуляции транскрипциии в ядре в целом.

Настоящая работа посвящена изучению роли 8и(Н\¥)-зависимых инсуляторов в регуляции транскрипции, а также изучению функций и механизма формирования внутриядерных «инсуляторных телец».

Цель и задачи исследования:

Основной целью работы являлось описание и изучение новых свойств инсулятора Su(Hvv) из ретротранспозона МДГ4 и эндогенного 8и(Н\у)-зависимого инсулятора в геноме Drosophüa melanogaster, сравнение их структуры и функций. Кроме того, целью работы являлось изучение роли отдельных белков, входящих в 5и(Н\у)-зависимый инсуляторный комплекс, в его функционировании. В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить in vivo обнаруженный эффект нейтрализации Su(Hw)-3aBncnMbix инсуляторов.

2. Выяснить, является ли взаимодействие Su(Hw) инсуляторов ориентационно-зависимым и к каким функциональным последствиям приводит такое взаимодействие.

3. В модельной системе гена yellow изучить способность Su(Hw) инсулятора стимулировать находящийся на большом расстоянии ослабленный промотор и выявить белки инсуляторного комплекса, отвечающие за этот эффект.

4. Изучить структуру и описать свойства нового эндогенного Su(Hw)-3aBHCHMoro инсулятора, обнаруженного на границе локуса yellow и генного комплекса Achaete-scuíe.

5. Изучить роль различных доменов белка Mod(mdg4)-67.2 в 8и(Нш)-зависимой инсуляции.

6. Выявить роль отдельных белков инсуляторного комплекса в образовании «инсуляторных телец». i

7. Изучить роль постгрансляционной модификации инсуляторных белков - сумолирования - в образовании «инсуляторных телец».

8. Проанализировать связь функционирования Su(Hw)-3aBncHMbix инсуляторов и образования внутриядерных «инсуляторных телец».

Научная новизна и практическая ценность работы:

В представленной работе впервые было показано, что два находящихся на расстоянии Su(Hw) инсулятора способны взаимодействовать друг с другом, причем результат такого взаимодействия зависит от взаимного расположения инсуляторов. Инсулятор Su(Hw), встроенный между двумя FRT сайтами, блокирует цис- и транс- взаимодействия между FIp-димерами, т.е. взаимодействие между не участвующими в регуляции транскрипции белковыми комплексами, как в соматических, так и в половых клетках. Полученные результаты заставляют пересмотреть широко распространенные структурные и транскрипционные модели, объясняющие механизм действия инсуляторов, и позволяют рассматривать инсулятор не только как узкоспециализированный элемент, блокирующий взаимодействие между белковыми комплексами энхансера и промотора.

Кроме того, генетическими методами было показано, что инсулятор Su(Hw) обладает свойствами активатора транскрипции. Он может активировать ослабленный промотор гена yellow, находящийся на расстоянии 5 т.п.н. Для стимуляции транскрипции на больших дистанциях необходим белок Su(Hw). Основную роль в стимуляции транскрипции играет ДНК-связывающий домен этого белка и прилегающие к нему районы.

Между генами yellow и achaete AS-C генного комплекса был обнаружен новый функциональный 8и(Н\у)-зависимый инсулятор.

В данной работе была подробно изучена структура одного из основных компонентов инсуляторного комплекса - белка Mod(mdg4)-67.2. Впервые было показано наличие в составе белка второго домена, отвечающего за его димеризацию.

Было доказано, что димеризация белка Mod(mdg4) )-67.2. не является достаточным условием для его функционирования в составе инсуляторного комплекса. Установлено, что делеция глутамин-богатого домена приводит к отсутствию белка в ядре, но это не сказывается на инсуляции.

Было установлено, что делеция любого из сайтов, необходимых для правильной локализации белка Mod(mdg4)-67.2 в ядре, приводит к тому, что видимые в ядре «инсуляторные тельца» перемещаются из ядра клетки в цитоплазму. При этом белок, остающийся в ядре, полностью функционален и способен к инсуляции. Ранее было показано, что белок Mod(mdg4)-67.2 подвергается особой модификации - сумолированию. Были получены данные, свидетельствующие, что именно сумолирование белка Mod(mdg4)-67.2 отвечает за образование «инсуляторных телец». При этом нарушение сайтов сумолирования никак не влияет на инсуляцию.

Полученные данные опровергают общепринятую модель, гласящую, что видимые в ядре «инсуляторные тельца», включающие белки инсуляторного комплекса Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2 и СР190 являются активно функционирующими инсуляторами. На основании результатов работы была предложена новая модель формирования и функционирования «инсуляторных телец».

Таким образом, представленная работа имеет большое фундаментальное значение для развития современной молекулярной генетики.

При работе с культурами клеток эукариот, для анализа взаимодействий между находящимися на большом расстоянии белковыми комплексами широко используется метод ЗС (Chromosome Conformation Capture). К сожалению, этот метод не работает в таком сложном организме как Drosophila. Полученные при изучении ориентационно - зависимого взаимодействия инсуляторов результаты показывают, что метод, основанный на анализе Flp-зависимой

рекомбинации, может служить хорошим инструментом для анализа in vivo взаимодействий удаленных белковых комплексов, образующихся на инсуляторах, энхансерах или промоторах.

Кроме того, в настоящее время в связи с быстрым развитием биотехнологической промышленности, изучение структуры и механизмов функционирования инсуляторов приобретает ярко выраженное практическое значение. Барьерные свойства этих регуляторных элементов все чаще используются при создании различных геноинженерных конструкций, применяемых для продуцирования животных и растительных белков или же используемых в генотерапии ряда заболеваний. Однако для долговременного и безопасного функционирования трансгена в эукариотнческом геноме необходимо учитывать все свойства регуляторных элементов, включенных в его состав. Поэтому, зависимость свойств регуляторных элементов, в том числе инсуляторов, от геномного окружения и их способность взаимодействовать между собой на больших дистанциях, безусловно, должны приниматься во внимание при планировании и оценке результатов экспериментов по эктопической интеграции генетического материала в геномы различных организмов.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Annual Drosophila Research Conference - Ежегодная конференция по исследованиям на дрозофиле (США, 2001, 2004, 2005); конференция «Molecular genetics of eukaryotes" (Moscow, 2003); "Advances in molecular cell biology" (Moscow, 2004); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); конференция «Control of gene expression and cancer» (Moscow, 2010).

Публикации:

По результатам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых 15 статей в российских и международных журналах и 10 тезисов докладов и материалов конференций.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 285 страницах и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, цели и задачи исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Диссертация содержит 69 рисунков и 13 таблиц. Библиография включает 461 литературный источник.

Содержание работы

1.Взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами 1.1 Два инсулятора Su(Hw), расположенные между энхансером и промотором гена miniwhite, способствуют энхансер-промоторным взаимодействиям. Ранее была получена модельная система, в которой два мобильных элемента МДГ4 окружали энхансеры тела и крыльев гена yellow. Несмотря на то, что между энхансерами и промотором гена yellow оказывался инсулятор Su(Hw), входящий в состав мобильного элемента МДГ4, он не был способен блокировать активацию промотора гена yellow этими энхансерами (Gause et al. 1998). Далее было установлено, что если в составе рекомбинантных генетических конструкций, между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow расположены два Su(Hw) инсулятора, инсуляция также отсутствует, (см. диссертацию).

Для ответа на вопрос, не является ли полученный эффект нейтрализации инсуляции частным случаем регуляторной системы гена yellow, аналогичные эксперименты были проведены в модельной системе, основой которой являлся ген miniwhite, отвечающий за пигментацию глаз. Ген miniwhite контролируется энхансером обеспечивающим экспрессию в глазах дрозофилы (в дальнейшем - энхансер глаз) (Pirrotta et al. 1985). В присутствии энхансера глаза обычно окрашены в ярко-красный цвет, а в его отсутствии - в желтый или оранжевый. Ранее было показано, что Su(Hw) инсулятор способен эффективно блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена miniwhite в трансгенных линиях (Roseman et al. 1993). Сначала были протестированы две контрольные конструкции, в которых одна копия Su(Hw) инсулятора разделяла промотор и энхансер гена miniwhite. В одной из них, EyEwSYW, инсулятор находился между группой энхансеров и промотором гена yellow (Рис.1). Было получено 22 трансгенные

линии, в большинстве которых тело и

EvEwSYW

EyEwYSW

frt trt

Su(Hw)

yellow

EyEwSYSW

э11х. Su(Hw) кр. гл. т.

Su(Hw) инс.

Su(Hw)

yellow A miniwhite

■>—ц —»_

yellow miniwhite +++[+++] -[++]

. -[+++] +++[++]

крылья у мух были слабо окрашены,

Рис.1. Схематичное изображение конструкций EyEwSYW, EyEwYSW, EyEwSYSW. Обозначения: стрелками обозначены концы Р элемента, необходимые для интеграции конструкции в геном, энх. т. и кр. -энхансеры тела и крыльев, Su(Hw) инс. -Su(Hw) инсулятор, FRT - сайты FRT для сайт-специфичной рекомбинации. В правой части рисунка указан уровень экспрессии гена yellow в теле и крыльях, а также степень активации гена miniwhite

энхансером глаз.: - нет экспрессии; +++ экспрессия на уровне у аллеля. В скобках отмечен уровень экспрессии гена yellow на фоне мутаций su(Hw)v/TM6[su(Hw)f.

при этом окраска глаз варьировала от желтой до темно-оранжевой, то есть транскрипция обоих генов была подавлена. Чтобы определить роль энхансера глаз в активации транскрипции гена miniwhite, в 8 линиях индуцировали его вырезание с помощью сайт-специфичной рекомбинации по FRT-сайтам. Отсутствие энхансера не оказывало существенного влияния на уровень пигментации, то есть в данном случае энхансер глаз действительно не был способен действовать на промотор. Чтобы показать, что Su(Hw) инсулятор блокирует энхансеры, в восемь линий EyEwSYW были введены мутации по белку su(Hw). В итоге пигментация глаз увеличивалась в различной степени в 5 линиях и не изменялась в трех. Полученный показал, что в отсутствии инсулятора энхансер глаз способен активировать транскрипцию гена miniwhite. Однако эффективность активации зависит от места встраивания конструкции в геном.

Во второй контрольной конструкции EyEwYSW Su(Hw) инсулятор был помещен между генами yellow и miniwhite, разделяя только энхансер-промоторную пару последнего (Рис.1). Во всех 9 полученных линиях пигментация гена yellow достигала максимального уровня. Окраска глаз варьировала от коричневой до светло-желтой, и оставалась неизменной при вырезании энхансера глаз в 6 линиях. Введение мутации по белку Su(Hw) в 3 случаях приводило к увеличению уровня пигментации глаз, а в одном не имело эффекта. Таким образом, один Su(Hw) инсулятор, расположенный между энхансером и промотором гена miniwhite, независимо от своего положения в конструкции, был способен блокировать активность энхансера глаз.

Для изучения эффекта нейтрализации двух Su(Hw) инсуляторов была создана конструкция EyEwSYSW, которая содержала один Su(Hw) инсулятор между группой энхансеров и промотором гена yellow, а другой - между генами yellow и miniwhite (Рис.1). В результате один Su(Hw) инсулятор разделял энхансер и промотор гена yellow и два - энхансер и промотор гена miniwhite. При трансформации этой конструкции в геном дрозофилы была получена 21 трансгенная линия. Во всех линиях экспрессия гена yellow в теле и крыльях была блокирована инсулятором и восстанавливалась при инактивации белка Su(Hw). В то же время, в большинстве линий мухи имели сильную пигментацию глаз (от коричневой до красной), что свидетельствует об активации транскрипции гена miniwhite. Чтобы выяснить какую роль энхансер глаз играет в активации транскрипции, в 10 линиях была индуцирована сайт-специфичная рекомбинация по FRT-сайтам. Делеция энхансера приводила к заметному снижению пигментации глаз во всех линиях, что подтверждает роль энхансера в стимуляции промотора гена miniwhite. Для изучения роли двух Su(Hw) инсуляторов в активации гена miniwhite 10 линий были протестированы на фоне мутаций по белку Su(Hw). Неожиданно оказалось, что пигментация глаз в 2 случаях не менялась, а в остальных 8 случаях - даже заметно уменьшалась. Таким образом, две копии Su(Hw) инсулятора

между энхансером и промотором гена miniwhite не только не препятствовали, но и способствовали взаимодействию между энхансером и промотором гена miniwhite.

1.2 Исследование влияния мутации mod(mdg4)'"' на экспрессию гена miniwhite в линиях EyEwSYSW. Ранее было показано, что явление инсуляции связано с присутствием в составе инсуляторного комплекса двух белков: Su(Hw) и одной из изоформ белка Mod(mdg4), Mod(mod4)-67.2 (Georgiev and Kozycina 1996). Чтобы выяснить, участвует ли белок Mod(mdg4)-67.2 в энхансер-промоторной коммуникации при нейтрализации инсуляции, была использована мутация mod(mdg4)1"'. Эта мутация инактивирует только изоформу белка Mod(mdg4)-67.2, отвечающую за взаимодействие с белком Su(Hw) (Gerasimova eí а). 1995). Введение мутации mod(mdg4)lul снижало пигментацию глаз в 2 линиях в той же степени, что и su(Hw)' мутации, а в 3 линиях - пигментация снижалась чуть слабее. Таким образом, в конструкции EyEwSYSW белок Mod(mdg4)-67.2 участвует в организации энхансер-промоторных взаимодействий в гене miniwhite.

При вырезании энхансера глаз по FRT-сайтам, мутации по белкам Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 не изменяли фенотип трансгенных линий. Следовательно, в конструкции EyEwSYSW эти белковые факторы действуют только на энхансер-промоторные взаимодействия, но не на уровень базовой транскрипции гена miniwhite.

1.3 Взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами зависит от их взаимной ориентации. Чтобы выяснить, влияет ли взаимное расположение инсуляторов на взаимодействие между ними, была использована модельная система, основанная на работе Ftp рекомбиназы из 2р плазмиды Saccharomyces cerevisiae. Flp рекомбиназа индуцирует рекомбинацию между двумя удаленным друг от друга сайтами рекомбинации (FRT): мономеры Flp рекомбиназы связываются с FRT сайтами и, взаимодействуя друг с другом, образуют комплекс, включающий в себя активный фермент (Lee and Jayaram 1997). Анализировалась рекомбинация между FRT сайтами ориентированными в противоположных направлениях, что позволяло отличить рекомбинацию,

Рис.2. Схема р1р-зависимой рекомбинации. Показаны различные варианты рекомбинации между разнонаправленными сайтами РЯТ (черные полустрелки): 1) рекомбинация между РЯТ сайтами, расположенными на одной и той же хроматиде, приводит к инверсии; 2) незаконная рекомбинация между РЯТ сайтами на сестринских хроматидах приводит к образованию дицентрических хромосом; 3) равная рекомбинация между РЯТ сайтами на сестринских хроматидах не меняет хромосому. Центромеры показаны овалом.

о_^

Jm.

J*.

Ля. il Ля Ля

происходящую между сайтами FRT расположенными на одной хромосоме, от рекомбинации между сайтами FRT расположенными на сестринских хроматидах. (Рис. 2).

Частота рекомбинации анализировалась по степени экспрессии гена white отвечающего за пигментацию глаз. Рекомбинация между двумя FRT сайтами приводит к инверсии, которая нарушает экспрессию гена while в фасетках, что выражается в мозаичной пигментации глаз. В созданных нами конструкциях один сайт FRT был помещен в четвертый интрон гена white, другой - в противоположной ориентации с 3' стороны за геном (Рис.3). В результате, расстояние между FRT сайтами составило около 2 т.п.н. Для того чтобы разделить FRT сайты, между ними в

четвертый интрон гена

W-FRT-m-(S)

yellow ^ white.

i lo

W-FRT-in-(S>S

yellow

W-FRT-in-(S)-S'

gggj1 Ее

^ whitet

W-FRT-out-(S)-S

yellow while

Ж „

^ Рис 3. Схематичное изображение конструкций, используемых для анализа частоты Flp-зависимой рекомбинации. В конструкциях показаны экзоны гена white (окрашенные прямоугольники), FRT сайты (черные полустрелки), сайты (вертикальные стрелки), Su(Hw) инсуляторы (S-белые пятиугольники) и энхансер глаз (Ее -окрашенный овал). Направление генов yellow и white указано стрелками.

интрон гена white был встроен Su(Hw) инсулятор (p-S), фланкированный сайтами для Сге рекомбиназы (loxP). Это позволило вырезать данный инсулятор из трансгенных мух in vivo (Siegal and Hartl 2000). Для анализа взаимодействия между двумя копиями Su(Hw) инсулятора были сделаны четыре конструкции (Рис.3). Для анализа были использованы два разных источника Flp рекомбиназы. Для среднего уровня экспрессии Flp рекомбиназы использовалась конструкция, в которой экспрессирующий рекомбиназу ген находился под контролем промотора гена теплового шока (hs-Flp). Для экспрессии рекомбиназы на значительно более высоком уровне использовалась конструкция, экспрессирующая белок только в глазах Drosophila (eyFlp) (Newsome et al. 2000). Частота рекомбинации оценивалась в F1 в глазах гетерозиготных по тестируемой конструкции самцов (Рис. 4).

Рис 4. Степень мозаичности глаз у самцов, несущих исследуемые конструкции и конструкции экспрессирующие Ьз-Р1р рекомбиназу: а - слабая, Ь - средняя, с - сильная мозаичность глаз. (I и е - дефекты развития головы, возникающие при экспрессии конструкции еуР1р.

Частота инверсий в половых клетках оценивалась в Р2 как отношение белоглазых самцов ко всем самцам, несущим тестируемую конструкцию. Инверсия подтверждалась при помощи ПЦР-анализа выборки белоглазых мух.

При отсутствии инсулятора (и'-РКТ-(Д)) в Р1 самцы с Ьк-Р1р рекомбиназой имели низкий уровень мозаичности глаз, а в VI самцов с белыми глазами было около 4.5% (Таб.1). Если инсулятор в любой ориентации находился вне сайтов ИЯТ, уровень рекомбинации сильно повышался, поскольку независимо от источника рекомбиназы самцы умирали. Таким образом, находящийся

hsFLP hsFLP eyFLP

Конструкции Fi, мозаичностъ Fi, % и дефеюы N

глаз развития

W-FRT-m<A) слабая 4,5 lethal 5

W-FRT-0\lK4>S

W-FRT-0U1-(4>S

W-FRT-m<S)

0,5

W-FRT-in<Д)-

О**

Таблица 1. Тестирование влияния одной копии Su(Hw) инсулятора на эффективность рекомбинации между FRT сайтами. Колонки hsFlp и eyFlp показывают частоту рекомбинации в соматических клетках выраженную в степени мозаичности глаз: нет, слабая, средняя или сильная; lethal - показывает, что мухи не выживали. Колонка hsFlp Fj% показывает частоту рекомбинации в половых клетках, вычисленную как отношение самцов в F2 с инверсией к общему числу самцов. N - количество исследованных линий для данной конструкции.

W-FRT-m-(4>S

вне Р11Т сайтов инсулятор стимулировал рекомбинацию, возможно, за счет способности модифицировать хроматин и облегчать связывание Р1р рекомбиназы. Если же инсулятор был встроен между РЯТ сайтами, частота рекомбинации значительно снижалась как в соматических, так и в половых клетках: в Р1 самцы отличались нормальной жизнеспособностью и низкой мозаичностью глаз. Таким образом, инсулятор, находящийся между РЯТ сайтами, значительно

снижал частоту рекомбинации и

Конструкции hsFLP Fi, мозаичностъ глаз hsFLP Fa,% eyFLP н дефекты развития N между сестринскими хроматидами,

W-FRT-in-(S)-SR средняя 21,1 д 3 на хромосоме.

su(Hw)~ слабая - - 2 Таблица 2. Ориентационно-зависимое

W-FRT-m-(S)-S

3,6

W-FRT-out-(S)-S i^O-^о средняя 28,7 сильная 4

su(Hwf слабая 5,2 - 2

W-FRT-out<S>S" i*D- слабая 9а средняя 4

взаимодеиствие между инсуляторами определяет частоту рекомбинации между удаленными РЯТ сайтами. Д - дефект развития головы. Остальные обозначения как в таблице 1.

Чтобы выяснить, является ли взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами ориентационно-зависимым, сравнивали частоту рекомбинации в линиях, где две копии инсуляторов находились между РЯТ сайтами в прямой или в обратной ориентации (Таб. 2). При разнонаправленной ориентации инсуляторов наблюдался повышенный уровень рекомбинации. Самцы с еуБ1р источником рекомбиназы выживали, но имели серьезные нарушение в развитии головы (Рис. 4., Таб. 2). Полученный результат подтверждает, что взаимодействие между инсуляторами способствует обоим видам рекомбинации. Чтобы подтвердить, что независимо от эффекта положения конструкции в геноме основную роль в рекомбинации играет 8и(Н\у) инсулятор, частота рекомбинации оценивалась на фоне мутации по белку 8и(Н\у). При введении мутации в трансгенные линии частота рекомбинации значительно снижалась, что подтверждает основную роль 8и(Н\у) инсулятора (Таб. 2).

В случае сонаправленного расположения Би(Н\у) инсуляторов между РЯТ сайтами, при использовании любого источника рекомбиназы в р 1 у самцов мозаичность глаз была слабой, а при использовании еуР1р рекомбиназы нарушений развития головы не наблюдалось вовсе. Таким образом, сонаправленные инсуляторы способны блокировать цис- и транс- рекомбинацию между ШТ сайтами.

Далее анализировались линии, в которых один из инсуляторов находился вне Р11Т сайтов (Рис.3, РЛТ-оШ). Если инсуляторы были разнонаправленными, уровень мозаицизма глаз варьировал от слабого до среднего (Таб. 2). При сонаправленном расположении инсуляторов уровень рекомбинации повышался независимо от источника рекомбиназы, что выражалось в сильном мозаицизме глаз в Р1 у самцов (Таб. 2). Однако при введении мутации по белку 8и(Н\у) частота рекомбинаций значительно снижалась, что подтверждает роль 8и(Н\у) инсулятора в поддержании Р1р-зависимой рекомбинации. В обоих случаях самцы, несущие конструкцию и источник рекомбиназы еуР1р, нормально выживали и не имели дефектов развития головы.

В сумме полученные результаты свидетельствуют, что в описанной модельной системе ориентация 8и(Н\у) инсуляторов играет ключевую роль в обеспечении эффективной рекомбинации между сайтами РЯТ. Таким образом, инсуляторы Эи(Н\у) взаимодействют между собой по ориентациопно-зависимому механизму.

Полученные в данной работе результаты показали, что два Би(Нш) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, способны нейтрализовать действие друг друга. Нейтрализацию инсуляции легче всего объяснить, предположив непосредственное взаимодействие между несколькими ближайшими инсуляторами с образованием петель ДНК между ними. Нужно отметить, что при нейтрализации энхансер-блокирующей способности несколькими 8и(Н\у) инсуляторами, каждый из них в отдельности сохраняет свои инсуляторные

Рис. S Взаимная ориентация взаимодействующих Su(Hw) инсуляторов может регулировать взаимодействие между белковыми комплексами на больших дистанциях.

свойства. Возможно, как инсуляция так и нейтрализация инсуляции являются отражением одного и того же природного явления, в основе которого лежит взаимодеиствие между инсуляторными элементами, согласно структурным моделям, инсуляторы участвуют в образовании независимых доменов транскрипции, при этом находящиеся в соседних транскрипционных доменах регуляторные элементы не могут взаимодействовать (Udvardy 1999; Mongelard and Corees 2001). Полученные нами результаты демонстрируют обратный эффект - в определенных условиях возможна активация промотора энхансером, даже если между ними расположено несколько инсуляторов. Было обнаружено, что результат взаимодействия между инсуляторами зависит от их взаимной ориентации и именно ориентация инсуляторов относительно друг друга определяла возможность взаимодействия между белковыми комплексами (Рис.5).

2. Взаимодействие ннсулягора Su(Hw) с промотором на больших дистанциях

2.1 Инсулятор Su(Hw) способен стимулировать транскрипцию гена yellow, ослабленного делецией предпромоторного района. Ранее было показано, что Su(Hw) инсулятор не способен активировать промотор гена yellow (Geyer et al. 1986; Parkhurst anCorces 1986; Geyer and Corees 1992; Georgiev and Kozycina 1996). Однако предпромоторная делеция в 77 п.н., удаляющая последовательность UPR (Upstream promoter sequence), значительно снижала экспрессию гена yellow в теле, крыльях и щетинках дрозофил (Belenkaya et al. 1998). Для дальнейшего ослабления промотора гена yellow делеция перед ним была увеличена до 368 п.н. (от -438 до -70 п.н. относительно сайта начала транскрипции). В делецию был включен кроме UPR один из расположенных в этой области личиночных энхансеров (Martin et al. 1989). Контрольная конструкция dYW (Рис. 6) в качестве маркера содержала ген white, который был встроен за геном yellow. Все десять полученных трансгенных линий демонстрировали фентип близкий к у1: мухи имели желтые тело и крылья и сильную вариабильность в окраске щетинок (одна-две щетинки

окрашены, остальные не пигментированы). Полученный результат свидетельствует о практически полной инактиваци гена yellow в конструкции dYW, в то время как экспрессия не имеющего энхансера гена white была нормальной для эухроматиновых районов генома (окраска глаз у дрозофил варьировала от желтой до оранжевой). Для изучения предполагаемой стимулирующей транскрипцию активности Su(Hw) инсулятора в конструкции (S)dY(S)W (Рис.6) одна инсуляторная последовательность размером 340 п.н. была встроена в позиции - 525 п.н., а другая - в позиции +4964 п.н. относительно сайта инициации транскрипции гена yellow.

yellow

miniwhite

yellow cDNA Su(Hw) miniwhite

Su(Hw) yellow Su<Hw) miniwhite

n-h A

—m

FRT К»"»'

Su(Hw) yellow cDNA miniwhite

Рис.6 Схематичное изображение конструкций. Энхансеры тела (Еп-b) и крыльев (En-w) показаны как частично перекрывающиеся неокрашенные прямоугольники. Энхансер щетинок (En-br) представлен как неокрашенный овал в интроне гена yellow. Стрелками показаны направления транскрипции генов yellow и white. Вертикальными стрелками показаны сайты FRT и 1охР для Flp и Сге рекомбиназ соответственно. Удлиненным закрашенным овалом показан Su(Hw) инсулятор, клонированный из ретротранспозона МДГ4.

Во всех 23 трансгенных линиях с единичной инсерцией конструкции (S)dY(S)W в геном пигментация глаз у дрозофил варьировала от желтой до темно-оранжевой. Поскольку один из Su(Hw) инсуляторов находился в позиции -525 п.н., он блокировал энхансеры тела и крыльев от промотора. Таким образом, экпрессию гена yellow можно было оценивать только по пигментации щетинок, энхансер которых находится в интроне гена и не был изолирован инсулятором (Рис.6). В отличие от результата, полученного для контрольной конструкции, в 8 из 23 линий пигментация щетинок была близка к «дикому типу» (практически все щетинки окрашены) (Таб.3), что говорит о частичной активации промотора гена yellow. В 6 линиях в окраске щетинок у мух наблюдалась средняя вариабельность (более половины щетинок окрашены) и только 9 линий имели у1 фенотип. При этом, в гомозиготных по конструкции линиях количество пигментированных щетинок у мух увеличивалось.

Для анализа роли белка Su(Hw) в стимуляции транскрипции гена yellow в линии мух с пигментированными щетинками вводилась мутация по белку - su(Hwf/su(Hwf (Таб. 4) В результате во всех тестируемых линиях пигментация щетинок

Конструкция Генотип

Уровень экспрессии гена Количество .)■<■//»>,■ в щетинках** линий* 5 w-v m-v e-v 1

dYW

(S)dY(S)W

(S)dY(AS)\V

(AS)dY(S)W

(AS)dY(ÄS)W

SdYilW

dYilSW

P/+ P/P P/+ P/P P/+ P/+ P/+ P/P P/P

14(4) 23

14(12) 11(6) 11(7) 11(11) 11 14

- - 2

12 10

9 2 2 4

Таблица 3. Фенотипы трансгенных мух изучались либо в гетеро- (Р/+), либо в гомозиготе (Р/Р). *- количество полученных трансгенных линий. В скобках указано количество линий изменивших свой фенотип; ** - количество линий с одинаковой пигментацией щетинок. Уровень вариабельности щетинок торекса и головы мухи: 1 - нет пигментации щетинок; e-var -сильная вариабельность (от одной до трех щетинок пигментированы); m-var - средняя вариабельность (пигментирована половина щетинок); w-var - слабая вариабельность (от одной до трех щетинок желтые); 5 - все щетинки пигментированы

снижалась практически до наблюдаемой при фенотипе у1. Эти результаты свидетельствуют, что Su(Hw) инсулятор стимулирует транскрипцию ослабленного промотора гена yellow и уровень данной стимуляции зависит от места инсерции конструкции в геном дрозофилы.

Для выяснения роли каждого из присутствующих в конструкции инсуляторов в стимуляции транскрипции, с помощью сайт-специфичной рекомбинации был удален либо инсулятор в позиции -525 п.н. [(AS)dY(S)W], либо инсулятор в позиции +4964 п.н. [(S)dY(AS)W], либо оба инсулятора [(AS)dY(AS)W], В 5 из 11 трансгенных линий удаление любого из инсуляторов не

вызывало изменение фенотипа, в то время

Конструкция Генотип

Уровень экспрессии гена

Количество ^/а» в шпинях"

линий* 5 w-v m-v e-v I

dYW (S)dY(S)W SdYilW dYilSW

su(Hw)' su(Hw) su(Hw)' su(Hw) su(Hw)' su(Hw) su(Hw)' sit(Hw)'

4 1

7(7) 4

5 5

как удаление обоих - приводило к полной

инактивации генаyellow (фенотип у', Таб. 3).

Таблица 4. Влияние мутации su(Hw)"/su(Hwy на экспрессию гена yellow в щетинках. Фенотип мух был определен в гетерозиготных линиях. Остальные обозначения как в таблице 3.

Полученный результат свидетельствует, что Su(Hw) инсуляторы не просто защищают трансген от негативного влияния окружающего хроматина, но являются активными стимуляторами ослабленного промотора теш yellow. В остальных шести линиях удаление любого из инсуляторов частично или полностью снимало пигментацию щетинок. Стимулирующий эффект инсулятора в позиции -525 п.н. был более выражен, поскольку в 4 из 11 случаев удаление этого инсулятора приводило к потере пигментации всех щетинок.

2.2 Инсулятор Su(Hw) не компенсирует делецию энхансера гена yellow. Поскольку Su(Hw) инсулятор может стимулировать экспрессию гена yellow на значительных расстояниях,

возможно, он способен функционировать в качестве энхансера. Для проверки этого предположения были созданы конструкции, лишенные расположенного в интроне и активирующего экспрессию гена yellow в щетинках энхансера. Ранее было показано, что у мух, несущих конструкцию, содержащую безинтронный ген yellow, щетинки не окрашенны (Geyer and Corees 1987; Martin el al. 1989). Одна из созданных конструкций содержала Su(Hw) инсулятор в позиции -893 п.н. (SYilW), а другая - в позиции +4964 п.н. (YilSW) относительно сайта инициации транскрипции гена_уе//ои> (Рис.6). В 11 линиях SYilW и в 14 YilSW мухи имели желтые щетинки (Таб.4). При введении в линии мутации su(Hw)v/su(Hw/ окраска щетинок не менялась (Таб. 4). Таким образом, Su(Hw) инсулятор не может функционально заменить энхансер стимулирующий экспрессию гена yellow в щетинках.

2.3 Функциональный анализ доменов белка Su(Hw), участвующих в стимуляции транскрипции гена yellow. Белок Su(Hw) содержит два кислых домена (Рис.7), расположенных на С- и N- концах белка, домен, состоящий из двенадцати «цинковых пальцев» и домен ответственный за инсуляцию (Harrison et al. 1993; Kim et al. 1996; Gdula and Corees 1997). Для выяснения роли этих доменов в стимуляции транскрипции гена yellow, было проанализировано влияние различных мутаций по белку Su(Hw) на фенотип отобранных конструкций - (S)dY(S)W, (Sx4)dYW, (Sx8)dY(S)W. В отобранных конструкциях окраска щетинок у мух была на уровне «дикого типа» или близка к нему. Чтобы выяснить роль кислого домена, расположенного на N конце белка, была использована мутация su(Hwf°" , являющаяся делецией 48 аминокислотных остатков. Эта делеция лишала белок Su(Hw) кислого домена, расположенного на N конце

Sii(Hw)1

Su(Hw)""1

Su(Hw)4""'

Su(Hw)"

(Harrison et al. 1993).

Mod(mdg4)

Рис 7. Схематичное изображение белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2, а также их мутаций, использованных в работе.

Окраска щетинок у гетерозиготных по исследуемой конструкции и гомозиготных по su(Hw)AW0 аллелю мух была как у мух, имеющих только исследуемую конструкцию (Таб. 5). Таким образом, расположенный на N конце белка Su(Hw) кислый домен не важен для стимуляции транскрипции гена yellow в щетинках.

Для исследования роли С-концевого района белка Su(Hw) в стимуляции промотора гена yellow была использована мутация su(Hw/ (Рис.7), которая вызвана делецией 149 аминокислотных остатков на С-конце белка, включающей кислый домен и часть домена ответственного за инсуляцию (Harrison et al. 1993; Kim et al. 1996; Gdula and Corees 1997). Так же как в случае с мутацией su(Hw)A,m, мутация su(Hw)¡ не влияла на стимуляцию экспрессии гена yellow в щетинках. Таким образом, кислый домен, расположенный на С-конце белка Su(Hw), не важен для стимуляции транскрипции гена yellow в щетинках.

Генотип

+ V// v/2 j J el &КЮ NoAD Таблица 5. Влияние различных su(Hw)' мутаций на

Конструкция № + + + + m + + -t- экспрессию гена yellow в щетинках. + - su(Hw)* или

mod(mdg4)* ; v/f - su(Hw)"/su(Hwf; v/2 - su(Hw)"/

dYW 3 e-v e-v e-v e-v e-v e-v e-v e-v su(Hw)2; j - su(Hw)/su(Hw); el - su(Hw)"/ su(Hw)'7;

A100 - su(Hw)л,т/ su(Hw) "m;su(Hw)7

(S)dY(S)W 5 5 e-v e-v 5 5 5 5 w-v su(Hwf;NoAD - su(Hwf0/tD su(Hw)v /su(HwfoAD

(S)dY(AS)W 5 5 e-v e-v 5 5 5 5 m-v su(Hw)2. Остальные обозначения как в таблице 3.

(AS)dY(S)W 5 5 e-v e-v 5 5 5 5 e-v Поскольку в мутации su(Hw/ домен

(ÄS)dY(AS)W

5 e-v e-v e-v e-v e-v e-v e-v e-v

(S")dYW 4 5 e-v e-v 5 5 5 5 m-v ответственный за инсуляцию нарушен только

(AS")dYW 4 1 1 I 1 1 1 1 1 частично (Gause et al. 2001; Ghosh et al. 2001),

(S")dYW 3 w-v 1 1 w-v w-v w-v m-v I было решено выяснить, участвует ли белок

(AS"')dYW 3 I 1 1 1 1 1 1 1 Mod(mdg4)-67.2 в стимуляции транскрипции

гена yellow. Мутация mod(mdg4)"', нарушающая связывание белка Mod(mdg4)-67.2 с белком Su(Hw), в результате генетического скрещивания была скомбинирована с аллелем su(HwУ (Georgiev and Kozycina 1996). Данная комбинация мутаций не влияла на пигментацию щетинок в несущих исследуемые конструкции линиях. Следовательно, белок Mod(mdg4)-67.2 не нужен для стимуляции транскрипции гена yellow.

Мутация Su(Hw)e7 имеет делецию 223 аминокислотных остатков на С-конце белка (Harrison et ai 1993). Данная мутация только незначительно снижала пигментацию щетинок в некоторых линиях (Таб. 6). Таким образом, белок Su(Hw), лишенный кислого домена расположенного на С-конце, и домена ответственного за инсуляцию, способен стимулировать транскрипцию гена yellow в щетинках. Причем, стимуляция промотора не зависит от положения Su(Hw) инсулятора на 5' или на 3' конце гена yellow.

Мутация su(Hw)NoAD является делецией обоих кислых доменов и частичной делецией домена ответственного за инсуляцию (Harrison et al. 1993; Gdula and Corees 1997). Данная мутация только частично и не во всех тестируемых линиях изменяла экспрессию yellow в щетинках, к тому же, наблюдаемая репрессия была значительно слабее, чем при ведении мутации su(Hw)"/su(Hw•/.

Данный результат свидетельствует, что одновременная делеция обоих кислых доменов и домена ответственного за инсуляцию может частично нарушать либо активность белка Su(Hw), либо его способность связываться с инсуляторной последовательностью.

Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод, что участок белка Su(Hw) необходимый для связывания с ДНК (домен «цинковые пальцы») и прилегающие к нему районы ответственны за наблюдаемый эффект стимуляции remyellow в щетинках.

Одна из широко распространенных моделей действия инсуляторов предполагает, что инсулятор выступает в качестве элемента мимикрирующего промотор. Поэтому энхансер способен транзиентно образовывать с инсулятором не функциональные комплексы (Geyer, Р. К.. 1997). Действительно было показано, что в состав многих сильных инсуляторов входят белки, способные участвовать в формировании активных промоторов (Bartkuhn et al., 2009). В данной работе с помощью генетических методов была доказана возможность взаимодействия инсулятора и промотора, также были выявлены домены инсуляторного белка, необходимые для этого взаимодействия. Инсулятор так же как энхансер может стимулировать транскрипцию ослабленного промотора на расстоянии, по меньшей мере, 5 т. п.н. Уровень такой активации напрямую зависит от количества сайтов связывания для белка Su(Hw). Активаторпая функция Su(Hw) инсулятора не ограничевается только промотором гена yellow. Ранее было показано, что он способен активировать промотор гена Adh (Wei and Brennan 2001) и слабый промотор гена в составе МДГ4. По-видимому, эффект Зи(Н\у)-зависимой активации наблюдается только в модельных системах со слабыми промоторами, т.к. высокий уровень транскрипции модельного гена, поддерживаемый сильным промотором, маскирует такую активацию.

З.Первый эндогенный 8и(Нуу)-зависимый инсулятор обнаруженный у

Drosophila

Гены achaete (ас), scute (sc) и 1 'sc, входящие в генный комплекс Achaete-scute (AS-C), расположены рядом с геном yellow, но отличаются от него по времени и месту экспрессии (Campuzano et al., 1985). Белки, кодируемые генами achaete (ас) и scute (sc), необходимы для правильного формирования щетинок (Modolell and Campuzano, 1998). Очень точная экспрессия этих генов (в нужное время и в нужном месте) определяется большим количеством энхансеров, которые неравномерно распределены на протяжении 90 т.п.н., занимаемых генным комплексом Achaete-scute (Ruiz-Gomez and Modolell, 1987; Gomez-Skarmeta et al., 1995; Modolell and Campuzano, 1998).

3.1 Последовательность между генами yellow и achaete, дуплицированная в регуляторную область AS-C, нарушает экспрессию гена scute. Ранее была создана модельная система (Golovnin et al., 1999; Golovnin et al., 2002), в которой в результате возникновения нестабильности Р-элементов была получена инсерция Р-элементов в регуляторную область AS-C -аллельy2sc*s, (Рис.8) Несмотря на инсерцию Р-элементов, экспрессия гена scute в аллеле j>2sets не была нарушена. Вследствие индукции нестабильности в исходной линии y2sc+s был получен ряд производных, в которых между исходными Р-элементами в регуляторной области AS-C возникла дупликация части тека yellow, включающая его промотор (РЗ и Р4 в Рис.8).

у' SC

sc ®о

5620

SC 3904 1>.< дупликация SC1" 4778 1 ..... -

I* К P HX HB Ii I' Н RP S

¡■Air

ÓynniKÍílflí*

5693

I'R P HX НИ

Генотип ни AOR PS ASA ОС PV ANP SC

sc"; +/+ ■ И □ □ □ □ □ □

su(Hw)VsufHw)' IBÖÖDDDD mod(mdg4pmod(mdg4f

sc""; +/+ IIIIBSBB

su(Hw)"/su(Hw)' IBDOOOOO

mod(mdg4l"/mod(mdg4)" ■ £]□□□□□□

Рис.8 Схематичное изображение мутаций, полученых в результате супернестабильности Р-элемента. Фенотипическое проявление мутаций, ассоциированных со sc, в щетинках. Схематически представлены локусы yellow и районы ас и sc генного комплекса AS-C. Горизонтальные стрелки указывают направление транскрипции генов. Стрелки в прямоугольниках указывают ориентацию встроившихся Р-элементов. Жирная стрелка указывает направление и размер дупликации гена yellow. Буквами указаны рестриктные сайты: Н - Hindill, В - BamHI, R - EcoRI, Р - Pstl, S - Sali, G - Bgl II, X - Xhol. Стандартная номенклатура щетинок (Lindsley and Zimm, 1992): Hu - humeral, AOR - anterior orbital, PS - presustural, ASA - anterior supra-alar, ОС - ocellar, PV - postvertical, ANP - anterior notopleural, SC - scutellar. Показаны только те щетинки, развитие которых нарушается при мутациях. Неокрашенные квадраты представляют нормально развивающуюся щетинку. Во всех случаях, кроме SC щетинок, квадраты, окрашенные на четверть, на половину или полностью представляют щетинки отсутствующие, соответственно, у 10%, 50% или 100% проанализированных самцов (выборка не менее 50 самцов). Для SC щетинок квадраты, окрашенные на четверть, на половину или полностью представляют, соответственно, присутствие 3-4, 2-3 или 0-1 щетинок. Эффект мутаций по генам su(Hw) и mod(mdg4) в аллелях sc™' and sc""2 одинаковый - указан как sc"".

Полученные производные линии различались по фенотипу scute. В части линий наблюдался слабый мутантный фенотип sc'\ выраженный в отсутствии щетинок humeral. Однако

другие производные, se""' and se™2 , имели более сильный мутантный фенотип, при котором большая часть щетинок не развивалась (Рис.8). Анализ по Саузерну с последующим сиквенированием амплифицированных фрагментов показал, что в производных scms' и scms2 был дуплицирован весь ген yellow с прилегающими 3' последовательностями, тогда как в аллелях se1' дуплицировалась только часть гена yellow (Рис.8). Значительная разница между фенотипами аллелей двух классов свидетельствует, что именно 3' область, прилегающая к гену yellow, ответственна за нарушение экспрессии гена seule. Анализ этой последовательности выявил два предполагаемых сайта связывания белка Su(Hw) (Рис. 9). Поэтому было решено проверить, какой эффект на экспрессию гена scute в аллелях scmsI и scms2 оказывают мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4). Восстановление экспрессии гена scute на фоне мутаций su(Hw)v/su(Hwf и su(Hw)v/su(Hw)2 свидетельствует о значительной роли белка Su(Hw) в репрессии гена scute (Рис, 8). Мутация mod(mdg4)"', нарушающая связывание белка Mod(mdg4)-67,2 с белком Su(Hw) и таким образом влияющая на работу инсулятора, также супрессировала se"™' и se""2 фенотипы (Рис.8).

3.2 Последовательность между генами yellow и scute содержит функциональные сайты связывания белка Su(Hw). Для выяснения функциональной роли найденных сайтов связывания белка Su(Hw), последовательность размером 125 п.н., содержащая оба сайта, была клонирована. Ее способность связывать белок Su(Hw) была протестирована in vitro (Рис. 9). В качестве контроля в данном эксперименте использовалась последовательность инсулятора из ретротранспозона МДГ4, содержащая 12 сайтов связывания белка Su(Hw). Фрагменты были протестированы на связывание с белком Su(Hw) методом задержки в геле. Белок Su(Hw) синтезировался in vitro. При тестировании фрагмента размером 125 п.н. из 3' области гена yellow на способность связывать белок Su(Hw) наблюдалась одна полоса с задержкой подвижности (Рис.9, Показана стрелкой), по-видимому, соответствующая комплексу, образуемому белком Su(Hw) с исследуемой последовательностью. Неспособность белка Su(Hw) связываться сразу с двумя близко расположенными сайтами была описана ранее (Kim et al., 1996). Чтобы доказать, что каждый из сайтов в составе фрагмента 125 п.н. способен связывать белок Su(Hw), отдельно были клонированы участки, содержащие только один из сайтов связывания. Анализ задержки этих фрагментов в геле показал, что оба они способны связывать белок Su(Hw) (Рис.9). Сайт №1 имеет замену С на А в коровой последовательности, но это не влияет на эффективность связывания белка Su(Hw). Чтобы доказать функциональность найденных сайтов связывания in vivo, использовалась модельная система, основой которой являлся ген yellow. Созданные конструкции позволяли исследовать два свойства Su(Hw) инсулятора: 1) способность блокировать энхансер от промотора; 2) способность пары инсуляторов нейтрализовать активность друг друга

pr-8

рг-1 Su(llw)ßl pr-3

■ тсстллтггатгтт0|глттссстлслттт1ссг\с10г.лсттстлттг. л Su! II«)« г

ТАЛ Su(H\v)/)l рг-7 „

^ рг-4 Su (llw)S 2

GCCAGTATATATTATGTGTTC.CATACTCTTGGTCACAGCAAAAATAAAAC

Фрагмент

Su(Hw) белок конкурент лизат

Ш Su(Hw)l2 Su(Hw)?l 454-bp

Su(Hw)-l ЫШ 125-bp fragment 454-bp

--+--+ - 4---4---+ + + +- ---+-- +

- + +- + + - + +

-----tíf'ííl'+--

+ +--k + + + + + -

— + + -+ +

AAAAAATACGCATGGTAAAAGAAT .1*

Su(Hw)ül TATTGCCTACT

5u{Hw)02 TGTTGCATACT

консенсус T G С T G С А T А С T

Рис.9 Связывание синтезированного белка Su(Hw) с предполагаемыми инсуляторными сайтами в составе фрагмента 125 п.и. (А) Показана последовательность фрагмента 125 п.н. Предполагаемые сайты связывания обведены рамкой. Праймеры, использованные для получения фрагментов ДНК, указаны стрелками. В мутированных сайтах указаны нуклеатидные замены. Консенсус связывания белка Su(Hw) взят из Scott and Geyer (Scott and Geyer, 1999). (Б) Эксперимент по задержке в геле. Меченые радиоактивным фосфором Р32 фрагменты Su(Hw) инсулятора - последовательность 125 п.н., Su(Hw)#l, Su(Hw)#2, Su(Hw)#l*, Su(Hw)#l**, 454 bp и 454*- инкубировались с синтезированным in vitro белком Su(Hw) и разгонялись на 1,5% агарозном геле. В присутствии конкурента связывание фрагмента 125 п.н. проводилось так же. Связывание снижалось в присутствии не меченого фрагмента Su(Hw)#l* и не менялось при добавлении не меченого фрагмента Su(Hw)#l ** с мутированными сайтами связывания белка Su(Hw).

(Gause et al., 1998; Cai and Shen, 2001; Muravyova et al., 2001). В составе конструкций последовательность Su(Hw) инсулятора из ретротранспозона МДГ4 была встроена между генами yellow и white, а энхансер гена white был встроен между энхансерами тела и крыльев гена yellow (Рис.10). Ранее было показано, что инсерция Su(Hw) инсулятора между энхансером и промотором гена white полностью блокировала энхансерную активность (Roseman et al., 1993). В конструкции Ey(e)(2kb)YSW тестируемый фрагмент размером 2 т. п.н., состоящий из 3' области гена yellow и части 5' района гена achaete, был встроен в позицию -893 п.н. относительно сайта инициации транскрипции гена yellow между его промотором и энхансерами тела и крыльев (Geyer and Corees, 1997) (Рис.10). Контрольная конструкция имела такой же дизайн, но в ней вместо тестируемого фрагмента был встроен Su(Hw) инсулятор. В контрольной конструкции энхансеры тела и крыльев гена yellow были блокированы, однако ген white был активирован (Рис.2). Во всех 9 полученых трансгенных линиях Ey(e)(2kb)YSW окраска тела и крыльев была желтой, как и в контрольной конструкции, что говорит об энханер-блокирующей способности тестируемого

Ey(e)(2kb)YSW £y(e)125bpY(S)W

vellow s"ll,"> mimwhile c. yellow wir») mimwhile

En-» E" En-b "■»-"•» ' A _„ _ . En-» En-b 1ВД A .

► U 'i 4 - I---< ► t-F"-' • I* «

- — - I». i.. FKT FRT ui Lei

Ey(e)454bpY(S)W Ey(c)(125bpx3)YSW

yellow Su'""> mimwhile . yellow S"»1"1 mimwhile

En-» E> En-b <■«» Д En.» " En-b >!!"» Л _.

►CZ|C|b—L - - - Ж A - I —^

FRT FRT Loi l,oi ^

Ev454 bpYW Ey(PRE)(454bp)YeW

yellow mimwhile pre ,„, Уеl,ow E.

. En-w En-b «*» _ E„-»_En-b . ---„ ,......» ^

► * ...........► Л.......' .........................1......'.......................A

FKT FRJ ■

Рис. 10 Схематичное изображение конструкций, использованных для анализа. Энхансеры тела(Еп-Ь) и крыльев (En-w) представлены как частично перекрывающиеся прямоугольники белого цвета, а энхансер гена white как белый овал, PRE - черный прямоугольник. Вертикальные стрелки показывают положение FRT или loxP сайтов, узнаваемых Flp или Сге рекомбиназами соответственно. Фрагменты 125 п.н., 454 , 454* ,125 п.н. X 3 и 2 т.п.н. встраивались в позицию - 893 п.н. относительно сайта инициации транскрипции гена yellow . Su(Hw) инсулятор показан окрашенным овалом. Направление транскрипции генов yellow и white указано стрелками.

фрагмента (Таб. 6). Удаление этого фрагмента приводило к восстановлению экспрессии гена yellow в теле и крыльях. При анализе линий на фоне мутации по белку Su(Hw), пигментация тела и крыльев также восстанавливалась. Таким образом, белок Su(Hw) необходим для энхансер-блокирующей активности исследуемого фрагмента. В то же время, в исходной линии (Ey(e)(2kb)YSW) экспрессия гена white была выше, чем в производной линии (Ey(e)(A2kb)YSW) после вырезания тестируемого фрагмента с помощью CRE рекомбиназы. После вырезания энхансера white из линии (Ey(e)(2kb)YSW) экспрессия гена white резко падала. Следовательно, в данном случае активации транскрипции гена white осуществляется именно специфичным энхансером (Таб. 6). Таким образом, исследуемый фрагмент размером 2 т.п.н. способен не только блокировать энхансеры, но и нейтрализовать инсуляторную активность Su(Hw) инсулятора из ретротранспозона МДГ4. Далее таким же образом был проанализирован фрагмент размером 125 п.н., содержащий только два сайта связывания белка Su(Hw) - конструкция Ey(e)125bpY(S)W (Рис. 10). В 10 полученных тансгенных линиях пигментация тела и крыльев была промежуточной между желтой и темно-коричневой (дикий тип). Таким образом, фрагмент в 125 п.н. только частично блокирует энхансеры от промотора по сравнению с фрагментом в 2 т. п.н. Пять трансгенных линий были протестированы на фоне мутации su(Hw)v/su(Hw)f. Во всех линиях экспрессия rem yellow в теле и крыльях восстановилась, что подтверждает необходимость

Уровень экспрессии

yellow

white

№

Конструкция 5 4 3 2 К 0 Ж Б

Ey(t)(2kb)YSW 1 8 6 2 1 9

su(Hw)' 3 2 1 3

Ey(c)(A2kb)YS\V 8 2 5 1 8

Ey(Ae)(2kb) YS W 8 2 5 1 8

Ey(Ae)(A2kb)YSW 8 1 5 2 8

Ey(e)125bpY(S)W 1 5 4 3 3 2 2 10

su(Hw) 5 3 2 5

Ev(Ae)J25bpY(S)W 1 5 4 2 5 3 10

Ey(e)125bpY(AS)VV 2 4 4 3 4 3 10

Ey(Ae)12SbpY(AS)W 2 4 4 2 5 3 10

Ey(e)454bpY(S)W 1 8 7 2 9

By(Äc)454bpY(S)W 1 8 1 5 3 9

Ey(c)454bpY(AS)W 2 6 2 4 3 9

Ev(Ac)454bpY(AS)W 2 6 1 5 3 9

Ey454'bpV\V 5 2 7

Ey(e),(125bpx3)YSW 1 6 6 1 7

Ey(Ae)(125bpx3)YSW 1 6 1 3 3 7

Ey(c)(A125bpx3)YSW 5 2 6 1 7

Ey(Ae)(A125bpx3)YS\V 5 2 1 2 4 7

Таблица 6. Анализ экспрессии генов yellow и white в гомозиготных трансгенных линиях. Цифрами указано количество линий соответствующего фенотипа. Колонка № указывает общее количество протестированных линий. Значок Д означает вырезание данного элемента из тестируемой конструкции с помощью сайт-специфичной рекомбинации. В колонке yellow цифры 5, 4, 3, 2 соответствуют активации гена yellow в теле и крыльях - от сильной до базовой соответственно. В колонке white буквы: К, О, Ж, Б означают красные, оранжевые глаза (соответствуют активации энхансером), Ж, Б - желтые и бледно-желтые (соответствуют базовому уровню транскрипции гена white). su(Hw)~ означает введение мутации sit(Hw)Vsu(Hw/.

связывания белка Su(Hw) для инсуляторной активности фрагмента. Делеция энхансера гена white значительно снижала экспрессию white в 8 из 10 Ey(e)125bpY(S)W трансгенных линий. Делеция Su(Hw) инсулятора также снижала экспрессию гена white и делала ее не чувствительной к вырезанию энхансера (Таб.6). В сумме эти результаты свидетельствуют, что фрагмент размером 125 п.н., содержащий два сайта связывания белка Su(Hw), способен блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена white. В то же время, фрагмент размером 2 т. п.н. проявляет более сильные инсуляторные свойства.

Для того чтобы исключить влияние на наблюдаемые эффекты кодирующих последовательностей гена yellow и регуляторных последовательностей гена achaete, мы исследовали фрагмент размером 454 п.н., включающий в себя фрагмент 125 п.н. с прилегающими последовательностями (Рис. 10). Во всех 9 полученных трансгенных линиях Ey(e)454bpY(S)W окраска тела и крыльев была желтой. Полученный результат свидетельствует, что фрагмент размером 454 п.н. обладает теми же инсуляторными свойствами, что и фрагмент 2 т.п.н.. Как и ранее тестируемые фрагменты, фрагмент 454 п.н. хорошо инсулировал энхансер гена white и эффективно нейтрализовал активность Su(Hw) инсулятора из ретротранспозона МДГ4. Сильные инсуляторные свойства фрагмента 454 п.н. по сравнению с фрагментом 125 п.н. могут быть объяснены либо присутствием неидентифицированных сайтов связывания белка Su(Hw) в составе

фрагмента 454 п.н. , либо наличием в составе этого фрагмента сайтов связывания дополнительных белков, стабилизирующих связывание белка Su(Hw) с инсуляторной последовательностью. В ходе дальнейших экспериментов два сайта связывания белка Su(Hw) в составе фрагмента 454 п.н. были мутированы (454*). Оба фрагмента - 454 и 454* - были протестированы на связывание с белком Su(Hw), наработанным in vitro (Рис.9). Связывание белка Su(Hw) с последовательностью фрагмента 454 и отсутствие связывания с последовательностью фрагмента 454* свидетельствуют, что дополнительных сайтов связывания белка Su(Hw) в исследуемом фрагменте нет. Для исследования функциональных свойств фрагмента 454*, он был помещен в позицию -893 п.н. относительно сайта инициации транскрипции гена yellow. В результате встраивания конструкции Ey454*bpYW в геном дрозофилы было получено 7 трансгенных линий. Окраска тела и крыльев у мух во всех трансгенных линиях была такой же как у мух «дикого типа» (Таб.6), что свидетельствует об отсутствии у фрагмента 454* инсуляторной активности. Таким образом, белок Su(Hw) необходим, но не достаточен для функционирования фрагмента 454 в качестве инсулятора.

Для проверки барьерной активности нового инсулятора была создана конструкция Ey(PRE)(454bp)YeW, в которой элемент PRE (Polycomb Responsible Element), окруженый сайтами для Flp рекомбиназы, был встроен между энхансерами тела и крыльев гена yellow (Рис. 10). Данный элемент способен организовывать Polycomb-зависимый репрессионный комплекс (Simon and Kingston, 2009). Тестируемый фрагмент 454, как и ранее, был встроен в позицию_ -893 п.н. в регуляторную часть гена yellow и окружен сайтами для CRE рекомбиназы. Энхансер гена white был встроен перед его помотором. Во всех 5 полученных трансгенных линиях экспрессия гена white была очень высокой, также как экспрессия гена yellow в щетинках.

Таблица 7. Анализ экспрессии генов

Т, vellow и white в гомозиготных

Уровень экспрессии ,, п ,

r г № трансгенных линиях. Цифрами указано

yellow white_ количество линий соответствующего

Конструкция ~ ~ 0~ к q ^ фенотипа. В колонке yellow цифры 5,2

и 0 соответствуют активации гена

Ey(FRE)(454)YeW 5 4 1 5 yellow: во всех тканях, только в

su(Hw)' 5 5 5 щетинках и полную репрессию

Ey(PRE)(A454)YcW 5 5 5

Ey(APRE)(A454)YeW 5 4 15

соответственно. В колонке white var обозначает мозаичную экспрессию гена white. Остальные обозначения как в Таблице 6.

При вырезании фрагмента 454 во всех линиях наблюдались полная репрессия гена yellow и сильная вариабельность экспрессии гена white', в части клеток экспрессия была сильно подавлена, что приводило к возникновению мозаичного фенотипа глаз (Таб.7). Те же результаты были получены при анализе трансгенных линий на фоне мутации по белку Su(Hw). Суммируя

полученные данные можно утверждать, что в конструкции Ey(PRE)(454bp)YeW фрагмент 454 надежно защищает энхансер, стимулирующий экспрессию rem yellow в щетинках, и энхансер гена white от распространения репрессионного хроматина, формируемого PRE элементом. При этом, барьерная функция фрагмента 454 полностью зависит от связывания с ним белка Su(Hw). Удаление из конструкции обоих элементов (PRE и 454) приводило к полному восстановлению экспрессии гена yellow в теле, крыльях и щетинках, а также к проявлению яркой окраски глаз у мух во всех трансгенных линиях, что говорит о нормальном функционировании всех энхансеров в составе конструкции.

4. Структурная и функциональная характеристика белка Mod(mdg4)-67.2 как компонента Su(Hw)-3aBHCHMoro инсуляторного комплекса.

4.1 Наличие определенных точечных замен в "заряженном кармане" не влияет на способность белка Mod(mdg4)-67.2 взаимодействовать с белком Su(Hw) и димеризоваться.

Главным компонентом Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторрв является ДНК-связывающий белок Su(Hw), инактивация которого приводит к полной потере активности инсулятора (Georgiev and Kozycina, 1996). С белком Su(Hw) своим С-концом связывается белок Mod(mdg4)-67.2, на N-конце которого находится высоко консервативный BTB/POZ домен. Такой домен был найден у целого семейства белков, являющихся регуляторами транскрипции и организующих структуру хроматина (Melnick et al., 2002). ВТВ домен содержит так называемый "заряженный карман". Мутации аминокислотных остатков, образующих "заряженный карман" (аргинина и аспартата) у ВТВ-содержащих белков Вс1-6 и PLZF приводят к инактивации вызываемой ими репрессии. Однако способность этих белков мультимеризоваться сохраняется (Melnick et al., 2002; Melnick et al., 2000). Для изучения функциональной роли ВТВ домена белка Mod(mdg4)-67.2 сначала были сделаны точечные замены консервативных аминокислот в "заряженном кармане" (Рис. 11).

Рис 11.

Множественное выравнивание части ВТВ доменов различных белков. Символом * отмечены сделанные замены.

М27А M5N R49Q

Каждый из производных белков, содержащих мутацию, был проверен в дрожжевой двугибридной системе на способность взаимодействовать с белком Su(Hw). Для этого мы использовали укороченную форму белка Su(Hw) - Su(Hw)MID (Mod(mdg4)-67.2 interaction domain),

Mod

Bel 6

Kaiso

GAF

Ttk

ZID

PLZF

17 nijsagfheslcrgdlvsvsgaaegqivk^ VgWSREQFR! 17 SgLNSLNEQRGHGLFcgVTSlVEDRKFR

saiqllrchgdlv3ct|aaggrsfp| t|avegqhlk^

s§yindtefq' sqefh|

18 nffltsvfdqllhaetftg

vslqkmnllrqqnlfcg

g|lckanqmrlagtlcSv

* *

54 54

54 56

которая содержит только домен белка Su(Hw), отвечающий за взаимодействие с белком Mod(mdg4)-67.2 (аминокислоты 670-890). Все тестируемые мутантные формы белка Mod(mdg4)-67.2 взаимодействовали с Su(Hw)M1D. Таким образом, наличие точечных аминокислотных замен не приводит к потере взаимодействия с Su(Hvv). Далее мы изучили способность мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 к димеризации и взаимодействию с полноразмерным не мутированным белком Mod(mdg4)-67.2. Большинство полученных мутантных белков были способны с разной эффективностью взаимодействовать с не мутированным белком Mod(mdg4)-67.2 и димеризоваться. Так белки ModH46D, ModD33N/H46D и ModD33N/R47Q медленно росли на селективной среде, что говорит об их низкой способности к взаимодействию. И только белок ModD33N совсем не был способен к взаимодействию. Этот результат может быть объяснен неспособностью данного мутантного белка правильно организовать свою третичную структуру. Действительно, похожая мутация в ВТВ-содержащих белках PLZF и BCL-6 приводила к их неправильному сворачиванию (Melnick et al., 2002; Melnick et al., 2000). Также, для определения функциональной эквивалентности ВТВ доменов различных белков был сделан химерный белок Mod(mdg4)GAF . Он содержал ВТВ домен белка GAF, т.к. ранее было показано, что ВТВ домен Mod(mdg4)-67.2 может заменить ВТВ домен GAF в тестах по ВТВ-зависимой активации транскрипции. Mod(mdg4)OAF был протестирован на способность гомо- и гетеродимеризоваться и взаимодействовать с белком Su(Hw). Во всех экспериментах химерный белок Mod(mdg4)GAF сохранял все свойства нормального белка Mod(mdg4)-67.2.

4.2 Белок Mod(mdg4)-67.2 содержит второй домен, отвечающий за димернзацшо. Ранее было показано, что при делеции ВТВ домена белок Mod(mdg4)-67.2 утрачивает способность димеризоваться и взаимодействовать с полноразмерным белком Mod(mdg4)-67.2 (Ghosh et al. 2001). Для проверки отсутствия взаимодействия была сделана конструкция с Mod(mdg4)-67.2 у которого отсутствовал ВТВ домен. Активационный домен в одном варианте был помещен в конец белка, в другом варианте - в начало. Полученные результаты приведены в Таблице 8.

Видно, что левая колонка полностью совпадает с тем, что было получено ранее (Ghosh et al. 2001), а правая ей противоречит, т.е. при делеции ВТВ домена способность белка гомо- и гетеродимеризоваться сохраняется. Отсутствие взаимодействия в полученных ранее данных связано, по-видимому, с интерференцией активационного домена в N-части белка Mod(mdg4).

Для разрешения этого противоречия были проведены дополнительные эксперименты с целью определить наличие в составе белка Mod(mdg4)-67.2 еще одного домена, отвечающего за димеризацию. Было использовано электрофоретическое разделения белковых форм в нативном полиакриламидном геле. Белки, содержащие мутации и 6 гистидинов

Взаимодействующие белки Сила взаимодействия

ОАЬ4ВО ОАЬАО 1 2

1УЫ(тс^4)-67.2 Мо<3(тс^4)-67.2 +++ +++

Мос1(тс1§4)-67.2 МоёДВТВ - ++

МосТ18 Мос1(пк^4)-67.2 - ++

Мое!""3 Мос1АВТВ - ++

Зч(№У)м|ь МосТ113 +++ +++

Моё®™ 8и(Нш)м1и +++ N0

Таблица 8. Результаты взаимодействия белков при делеции ВТВ домена. 1 - АБ вставлен до белка; 2 - АБ вставлен после белка

^ Рис.12 Вестерн-блот анализ белков после электрофореза в нативном полиакриламидном геле. Использованы антитела к С-концу белка, ъ^ а®* а5^ .¡5»# Слева указан примерный молекулярный вес маркера в кДа.

на С-конце, экспрессировались в бактериях, очищались на метал-хелатном носителе и разделялись в нативном акриламидном геле. Видно, что при делеции ВТВ домена в геле образуются 2 полосы, различающиеся по подвижности (Рис. 12), что подтверждает наличие второго домена, отвечающего за димеризацию. Для более точной его локализации было решено использовать несколько делеционных вариантов белка Мос1(тс^4)-67.2 и протестировать их на взаимодействие в дрожжевой двугибридной системе.

1-608 1-60841-120 1-6084,3"и 290-608 322-608 322-390 290-608м4!-м 420-608

1-608 ++ ++ +-Н- +++ +++ ++ +++

1-608лм20 + -н- -н- -НЧ- -н- ++ +++

1-б08йш*266 ++ ++ +++ -Н-+ +++ -И- +-Н-

290-608 ++ ++ +++ +++ N0 N0 N0 N0

322-608 ++ ++ +-Н- N0 -Н- N0 N0 N0

322-390 + ++ ++ № N0 ++ N0 N0

290-608""" ++ +++ +++ N0 N0 N0 +++ N0

420-608 - - - N0 N0 N<1 N0 N0

Таблица 9. Обобщенные результаты взаимодействия делеционных вариантов белка Мос1(тс^4)-67.2. Числа обозначают аминокислотные последовательности, верхний индекс - внутреннюю делецию.

Полученные делеционные варианты были протестированы на взаимодействие с полноразмерным белком, белком с делецией ВТВ домена, белком с делецией глутамин-богатого района и самовзаимодействие. Так же производили проверку на взаимодействие с 8и(Н\у)м|в, т.к.

это взаимодействие осуществляется через кислый домен и его наличие косвенно доказывает правильное, функциональное сворачивание укороченного белка. Полученные данные позволяют картировать второй домен (DD) в районе аминокислот 320- 400.

4.3 Функциональная активность мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 в работе инсулятора Su(Hw). Для определения in vivo эффекта мутаций в ВТВ домене и при делеции глутамин богатого района мы использовали аллели генов yellow и cut, вызванные инсерцией мобильного элемента МДГ4. Взаимодействие белков Mod(mdg4)-67.2 и Su(Hw), как было показано, имеет 2 функциональных последствия: 1 ^локирование энхансера от промотора; 2) стимуляция транскрипции. Инактивация Mod(mdg4)-67.2 в случае мутаций mod(mdg4')"' или mod(mdg4)T6 приводит к неспособности инсулятора Su(Hw) блокировать некоторые энхансеры и подавлять промотор-специфичную транскрипцию (Georgiev and Gerasimova, 1989; Gerasimova et al., 1995; Georgiev and Kozycina, 1996; Gdula et al., 1997; Cai and Levine, 1997).

В аллелs у2, как уже упоминалось выше, мобильный элемент МДГ4 встроился между промотором и энхансерами гена yellow, контролирующими его экспресию в теле и крыльях.(Оеуег et al., 1986) (Рис. 13). Таким образом, Su(Hw) инсулятор блокирует энхансеры тела и крыльев от промотора (Geyer et al., 1986; Geyer and Corees, 1987). В результате окраска абдоминальных сегментов у мух становится бледно-коричневой, что особенно хорошо видно по пигментации 5 и 6 сегментов (Рис. 14). Мутации mod(mdg4)"' и mod(mdg4)n усиливают фенотипу7, репрессируя экспресиию гена yellow в щетинках (Georgiev and Gerasimova, 1989; Gerasimova et al., 1995). Кроме того, при мутации mod(mdg4)"' самцы, несущие аллель У, имеют неоднородный фенотип брюшка из-за различного уровня экспресии гена в разных группах клеток сегментов (Рис. 14). В одних клетках кутикулы эффект инсулятора Su(Hw) не наблюдается, что приводит к нормальной экспресии renayellow, в других наоборот - эффект усилен из-за прямой репресии гена yellow инсулятором Su(Hw). Таким образом, в гишелеу2 связывание белка Mod(mdg4)-67.2 защищает ген yellow от репрессии и усиливает способность инсулятора Su(Hw) блокировать энхансер. Второй генетической системой, в которой мы исследовали мутантные формы белка Mod(mdg4)-67.2, были аллели гена eut - et6 и cf, которые вызваны инсерцией мобильного элемента МДГ4 в локус cut. В случае аллеля et6 МДГ4 встроился близко к энхансеру, который расположен на расстоянии примерно 85 т.п.н. перед промотором гена cut (Dorsett et al. 1993 ; Jack, et al. 1991 ) и полностью блокирует взаимодействие между промотором и этим энхансером, что приводит к проявлению мутантного cut фенотипа (Рис.13). Мутации mod(mdg4)"¡ и mod(mdg4)TC почти полностью подавляют мутантный et6 фенотип, что указывает на необходимость белка Mod(mdg4)-67.2 для блокирования тканеспецифичных для крыльев энхансеров (Рис. 14).

Рис.13. Схематичное изображение аллелей у2 и ct6. En-w,En-b и En-br - энхансеры крыльев, тела и щетинок соответственно.

В аллеле cf МДГ4 только частично блокирует энхансер гена cut, вызывая проявление промежуточного cut фенотипа (Рис. 14). (Hoover, Gerasimova, et al. 1998). По сравнению с другими аллелями, вызванными инсерциями мобильного элемента МДГ4, ctK наиболее чувствителен к активности белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 и в большей степени подавляется гетерозиготными мутациями в генах su(Hw) или mod(mdg4)"' (Gause, Morcillo, et al. 2001).Таким образом, ctK представляет собой модель, которая очень сильно реагирует на изменение степени блокирования тканеспецифичных энхансеров крыльев, причиной которых является изменение функциональных свойств мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2.

Для выяснения роли мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 в функционировании Su(Hw) инсулятора, были получены трансгенные линии мух, в которых экспрессия изучаемых белков находилась под контролем промотора hsp70 (для белков Mod(mdg4)-67.2; ModH46D, ModII46D/D33N и ModS25A/D33N) или под контролем повсеместно экспрессируемого промотора гена su(Hw) (для белков Mod(mdg4)-67.2; ModR47Q, ModD33N, ModD33N/R47Q и Mod(mdg4)0af). Исследование функции этих белков производили на фоне гомозиготной мутации mod(mdg4)"'lmod(mdg4)"'. Для исключения влияния «эффекта положения» в каждом случае были протестированы, по крайней мере, 8 независимых линий. В 14 трансгенных линиях, экспрессирующих белок дикого типа под контролем промотора hsp70 или промотора гена su(Hw), фенотип, вызванный мутацией mod(mdg4)"'/mod(mdg4)"', полностью восстанавливался (Рис. 14).

Далее было исследовано действие форм белка с различными мутациями в "заряженном кармане". Свойства белка ModR47Q аналогичны свойствам полноразмерного не мутированного белка Mod(mdg4)-67.2. Кроме того, при экспрессии такой мутантной формы белка в линиях, несущих аллель cf, наблюдается более сильное блокирование энхансеров крыльев, чем при экспрессии нормального белка в этих же линиях. Таким образом, изменение положительного заряда аминокислотного остатка на нейтральный не приводит к критичному изменению функциональности белка ModR47Q и не вызывает снижение активности Su(Hw) инсулятора.

Напротив - нейтрализация отрицательно заряженного аминокислотного остатка аспартата в положении 33 вследствие замены на нейтральный аспарагин (мутация ModD33N) приводит к почти полной инактивации инсуляционных свойств Su(Hw) инсулятора. Кроме того, мутантный белок ModD33N почти утрачивает антирепрессорные свойства (Рис. 14). Двойная мутация ModS25A/D33N, содержащая дополнительную аминокислотную замену на поверхности ВТВ домена, приводит к полной инактивации инсуляции. Так как оба белка ModD33N и ModS25A/D33N не способны гомодимеризоваться и частично теряют способность взаимодействовать с не мутантной формой белка Mod(mdg4)-67.2, был сделан вывод, что целостность ВТВ домена белка Mod(mdg4)-67.2. нужна для проявления как инсуляционных, так и стимулирующих свойств Su(Hw) инсулятора.

В двойной мутации ModD33N/R47Q оба - отрицательный и положительный - заряда аминокислотных остатков заменены на нейтральные. Это приводит к умеренному уровню инсуляции и способности стимулировать транскрипцию (Рис. 14). Например, ModD33N/R47Q восстанавливает энхансер-блокирующую активность Su(Hw) инсулятора в аллеле ct6, но не изменяет фенотип аллеля. При мутации ModD33N/R47Q мозаичная пигментация брюшка практически исчезает, но экспресия yellow в щетинках подавляется лишь частично. Таким образом, восстановление баланса зарядов в белке ModD33N/R47Q с помощью добавления к замене D33N замены R47Q лишь частично восстанавливает функциональную активность белка. Далее мы исследовали функциональную активность белка ModH46D, содержащего замену по наиболее консервативной аминокислоте ВТВ домена. При этой замене положительно заряженый гистидин меняется на отрицательно заряженный аспартат. Как и ожидалось, эта аминокислотная замена приводит к полной функциональной инактивации белка (Рис. 14). Однако дополнительная аминокислотная замена отрицательно заряженного остатка аспартата в положении 33 на нейтрально заряженный аспарагин приводит к тому, что белок ModD33N/H46D становится полностью функциональным, т.е. при экспрессии этой мутантной формы наблюдается такой же фенотип, как при экспрессии полноценного белка. Более того, подобно мутантной форме ModR47Q, ModD33N/H46D сильнее влияет на фенотип cfi, чем Mod(mdg4)-67.2, что говорит о большей роли белка в инсуляции. Таким образом, двойная замена аминокислот в "заряженном кармане" усиливает функциональность белка, в то время как единичные замены отдельных аминокислот приводят к функциональной инактивации белка. Так же была исследована способность ВТВ домена белка GAF функционально заменять ВТВ домен белка Mod(mdg4)-67.2. Белок Mod(mdg4)Gaf был полностью не активен во всех модельных системах (Рис. 14),

Рис.14 Эффект мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 в модельных системах генов yellow и cut.. В скобках указана окраска щетинок: 5 -черные, 1- желтые, var - промежуточный фенотип.

т.е. у такого химерного белка отсутствует как инсуляционная так и стимулирующая активность. В дрожжевой двугибридной системе Mod(mdg4)0af образовывал гомодимеры и взаимодействовал с белками Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2. Поскольку ВТВ домен белка GAF не может функционально заменить ВТВ домен белка Mod(mdg4)-67.2 предполагается, что ВТВ домен белка Mod(mdg4)-67.2 опосредует ModD33N/H46D"» специфическое взаимодействие с не идентифицированными

белковыми комплексами, необходимыми для функционирования белка Mod(mdg4)-67.2.

4.4 Локализация различных форм белка Mod(mdg4)-67.2 иа полигонных хромосомах и в «инсуляторных тельцах» диплоидных клеток. Для изучения функций 5и(Н\у)-зависимых инсуляторов на клеточном уровне было решено исследовать распределение мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2. на хромосомах и их присутствие в специфических структурах - «инсуляторных тельцах», которые, как считается, являются скоплениями активных инсуляторов. Политенные хромосомы слюнных желез были окрашены антителами к С-концу белка Mod(mdg4)-67.2, а затем вторичными флюоресцентными антителами (Рис. 15). Распределение белков Mod(mdg4)-67.2, ModR47Q, ModD33N/R47Q, ModD33N/H46D, и Mod(mdg4)ADD, экспрессируемых на фоне мутации mod(mdg4)"', на политенных хромосомах было сходным с распределением белка в линии mod(mdg4)+. Этот результат подтверждает взаимодействие данных форм белка с ДНК-

связывающим белком 8и(Н\у). Не проявляющие инсуляториой активности белки Моё(гп(%4)ДВТВ, Мос1Н460, МосЮЗЗЫ, Мос1(тс1§4)ОаТ и Мо<ШЗЗЫ/Н460ДОО не ассоциировались с политенными хромосомами.

0о

о»8

с; ьт- # «/ ^

г ЛК^ШУУУА^У ' ^ /// у* у у у у У

-г

ОАР1

аМос!

п 0 1 в

Рис.15. Локализация мутантных форм белка Моё(ггк1§4)-67.2 на политенных хромосомах дрозофилы. Верхняя панель -

окрашивание ДНК ОАР1, нижняя -специфическое окрашивание белка Мо(1(тс1§4)-67.2 и производных.

Для изучения способности мутантных белков образовывать «инсуляторные тельца» было проведено окрашивание диплоидных ядер клеток имагинальных дисков дрозофилы. В трансгенных линиях белки Мос1(тс^4)-67.2, Мос1-К47С>, Мос№ЗЗЫ/ Н460 и Мос1(тс%4)ЛПО образовывали «инсуляторные тельца», в то время как белки Мо(ЮЗЗМ/К47(3, Мос1-Н46В и Мос1-БЗЗЫ распределялись в ядре диффузно (Рис. 16). При экспрессии белка Мос1(тс^4)ОаГне образовывалось четких «инсуляторных телец», хотя и не наблюдалось абсолютно диффузного распределения белка в ядре.

Было доказано, что белок Мос1(т<1§4)-67.2, содержащий мутации в ВТВ домене, в составе инсулятора 8и(Н\у) становится менее функциональным, в то же время, сохраняя способность

димеризоваться и образовывать «инсуляторные тельца».

Рис. 16 Локализация мутантных форм белка Мос1(тё§4)-67.2 в ядре.

* * V». •• ; V •■ »<• . . Мсх){тс1в<) 67^ 'v *; Мос1(т0д4| г:*- V. *• «л • ' 1 Мо<1{п^д4)САР л* . Ь--. У %• ТЙаОя«,

о- ••''А,' Мск! Н460 «V Мо<1 Я470 \ . v*' с' ^ о о « - < ¥□0 СЗМ4.Н460

Таким образом, нам удалось показать, что проявление инсуляторной активности и способность белков инсуляторного комплекса образовывать «инсуляторные тельца» не являются тесно взаимосвязанными.

5.Исследование взаимосвязи между образованием «инсуляторных телец»

и инсуляцией

5.1 Мутантиые варианты белка Mod(mdg4)-67.2, использованные в работе. Белок Mod(mdg4)-67.2 является одним из основных компонентов инсуляторного комплекса. Нарушение его связывания с белком Su(Hw) приводит к потере инсуляции и, как было показано ранее (Gerasimova and Corees, 1998; Gerasimova et al., 2000), к исчезновению «инсуляторных телец». Поэтому в дальнейших экспериментах использовались различные мутантные производные именно этого белка.

Полноразмерный не мутированный белок Mod(mdg4)-67.2 имеет на N-конце ВТВ домен, домен, богатый глютамином, и на С-конце кислый домен, который связывается с белком Su(Hw) (Рис.17). Анализ нуклеотидной последовательности предсказал наличие двух сигналов ядерной локализации (NLS). На основании этих данных в белке Mod(mdg4)-67.2 были сделаны различные делеции. Были созданы две мутантные формы белка Mod(mdg4)-67.2: в ModAQ делеция аминокислотных остатков с 145 по 276 удаляла глютамин(<3)-богатый домен и один сигнал ядерной локализации NLS; в ModAC делеция 43-х С-концевых аминокислотных остатков удаляла основную часть домена, необходимого для связывания с белком Su(Hw) (Рис.17).

Для проверки функционального взаимодействия, полученные производные формы белка Mod(mdg4)-67.2 были проанализированы в двугибридной дрожжевой системе и в экспериментах по коиммунопреципитации из ядерного экстракта 82-клеток. В двугибридной дрожжевой системе белки ModWT и ModAQ продемонстрировали сильное взаимодействие с Su(Hw)MID в реципроктных экспериментах. Производная форма ModAC оказалась не способной

Рис. 17. Схематичное изображение форм белка 1У^(пк^4)-67.2. Сверху вниз: (дикого типа),

и МЫДС.

взаимодействовать с белком Su(Hw). Как и ожидалось, ModAC, так же как производная ModAQ, способна как к гомологичной, так и к гетерологичной олигомеризации с полноразмерным белком Mod(mdg4)-67.2. В экспериментах по коиммунопреципитации белок Su(Hw) полностью копреципитировался с производной ModAQ и только частично с ModAC (Рис.18). Следовательно, обе производные находятся в одном комплексе с белком Su(Hw). Однако в случае ModAC производной взаимодействие с Su(Hw) опосредованно.

Рис. 18. Коиммунопреципитация белков Su(Hw) и Input IP Output IP PS PS Output ModWT, ModAQ, ModAC с FLAG-эпитопом в u HWT ЛИ ' kj трансформированных S2 клетках. Input, общее нанесение;

0 " IP Output, надосадочная жидкость после

иммунопреципитации с антителами против Su(Hw); IP, иммунопреципитат; PS, первичная сыворотка; PS Output, надосадочная жидкость после иммунопреципитации с первичной сывороткой.

ModAQ ModAC

5.2 Локализация производных белка Mod(mdg4)-67.2 в 82-клетках. В ядрах клеток S2 (культура эмбриональных клеток дрозофилы) при окрашивании специфическими антителами против Mod и Su(Hw) наблюдались множественные дискретные скопления белков (Рис.19). По размерам, количеству и расположению эти скопления совпадали с ранее описанными «инсуляторными тельцами». Чтобы охарактеризовать распределение производных белка Mod(mdg4)-67.2, клетки были трансфецированы плазмидами, экспрессирующими полноразмерный белок Mod(mdg4)-67.2, ModAC и ModAQ с FLAG- эпитопом. Результаты иммуноокрашивания представлены на рисунке 20. В качестве внутреннего контроля на каждой панели показаны трансфецированные и не трансфецированные клетки.

Суперэкспрессия химерного полноразмерного белка Mod(mdg4)-67.2-FLAG не изменила «нормального» окрашивания: при окрашивании антителами к FLAG-эпитопу наблюдалось исключительно ядерное распределение белка в виде «инсуляторных телец», согласующееся с

распределением белка Su(Hw). Ввиду

uSu(Hw)

i»Su(Hw) .'FLAG

--UodAIT-f LAG я Mod/UT-f LAG ciH^ MOC1WVT-F LAG

V. i - MOClAQ-FLAG / ■ v - J * MOCUQ -F LAG ;Q ' * MocUiQ-FLAG m odaq -f lag

' > i. ■ - мойдс-f lag ■ С > T- * t. » ModAC-FLAG 4, MOdAC-F LAG

SulHwl

Merge

Рис.20 Локализация экспрессируемых в S2 клетках белков Mod(mdg4)-67.2, ModAC и ModAQ, с экспрессирующимся в рамке эпитопом FLAG.

большего количества белка при суперэкспресии рекомбинантаых генов, скопления белков Mod(mdg4)-67.2 и Su(Hw) были более насыщенными, чем в контроле.

При экспрессии ModAQ-FLAG наблюдалось обильное диффузное распределения этого белка в цитоплазме, но не в ядре клетки. Несколько ядерных скоплений, детектируемых антителами к белкам Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2, скорее всего, существовали до трансфекции, поскольку ни одно из них не окрашивалось антителами к FLAG.

При экспрессии белка ModAC-FLAG наблюдалось ядерное распределение белка в виде «инсуляторных телец» и его колокализация с белком Su(Hw). В этом случае количество «инсуляторных телец» было несколько меньше, но они были больше в размерах, чем в контроле. Все белковые скопления, которые окрашивались антителами к FLAG -эпитопу, колокализовались со скоплениями, окрашивавшимися антителами к белку Su(Hw). В то же время, небольшая часть скоплений (наиболее вероятно, уже существовавших до трансфекции) содержала белки Mod(mdg4)-67.2 и Su(Hw), но не ModAC-FLAG.

Таким образом, при суперэкспрессии производных белка Mod(mdg4)-67.2 в их внутриклеточном распределении наблюдаются очевидные различия.

Далее предстояло выяснить, присутствуют ли химерные белки в составе инсуляторного комплекса in vivo. Для этого был использован метод хроматин-иммунопреципитации (X-ChIP анализ). Для данного эксперимента использовались праймеры к уже известным эндогенным Su(Hw)-3aBHCHMbiM инсуляторам и Su(Hw) инсулятору в составе ретротранспозона МДГ4. В качестве отрицательного контроля использовались праймеры к кодирующим последовательностям генов ras и actin (Рис.21). Как видно на рисунке, значительное обогащение ПЦР-продуктов на сайтах связывания Su(Hw)-3aBHCHMoro инсуляторного комплекса наблюдалось в случае экспрессии Mod(mdg4)-67.2-FLAG и ModAQ-FLAG белков. При экспрессии белка ModAC-FLAG обогащения на инсуляторных сайтах не наблюдалось. Результаты этого эксперимента позволили сделать неожиданный вывод. Несмотря на наличие в ядре «инсуляторных телец», белок ModAC-FLAG не способен in vivo связываться с инсуляторными сайтами, в то время как белок ModAQ-

FLAG, не образующий «инсуляторных телец», участвует в формировании инсуляторных комплексов.

Рис. 21. X-ChIP анализ. Пары наибольших пиков для каждой инсуляторной последовательности соответствуют

экспрессии белков Mod(mdg4)-67.2-FLAG и ModAQ-FLAG. В контролях (крайний слева и крайний справа) обогащение не происходит.

к .4.1 к

60А 66Е act

5.2 Тестирование мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 in vivo. Следующим шагом стало сравнение функциональности производных ModAQ и ModAC в геноме Drosophila mtlanogaster. Были созданы трансгенные линии, экспрессирующие ModAQ и Mod(mdg4)-67.2 под контролем промотора, содержащего последовательность UAS. Скрещивание таких линий с GAL-драйвером позволяет индуцировать экспрессию конструкции в любых тканях и на любой стадии развития дрозофилы. Все эксперименты проводились на фоне мутации mod(mdg4)"'. Для анализа производной ModAC была использована ранее описанная мутация mod(mdg4)n. При мутации mod(mdg4)n, за счет образовавшегося в аминокислотной позиции 570 стоп-кодона, транслируется белок, лишенный, как и белок ModAC, 43 С-концевых аминокислот. Для анализа инсуляторной активности производных Mod(mdg4)-67.2 использовались аллели генов cut и yellow, связанные с инсерцией мобильного элемента МДГ4. Экспрессия как полноразмерного белка Mod(mdg4)-67.2 так и ModAQ, полностью нейтрализует эффект мутации mod(mdg4)"'. Экспрессия белка ModAQ полностью снимает связанный с мутацией mod(mdg4)ul эффект репрессии и восстанавливает инсуляцию, т.е. белок ModAQ проявляет те же свойства, что и полноразмерный белок. Интересно, что мутация mod(mdg4)n, при которой экспрессируется белок аналогичный ModAC, приводит к возникновению совершенно такого же фенотипа, что и мутация mod(mdg4)"'. Следовательно, белок ModAC в инсуляции не функционален. Мутация mod(mdg4)"' и мутация mod(mdg4)n супрессируют мутантный фенотип ct6, демонстрируя, что белок Mod(mdg4)-67.2 необходим для блокирования энхансера крыльев, и что ModAC не способен функционально заменить полноразмерный белок. Экспрессия белка ModAQ, наоборот, полностью восстанавливает функцию Su(Hw)-HHcynHTopa на фоне мутации mod(mdg4)"', функционально заменяя полноразмерный белок Mod(mdg4)-67.2.

Как упоминалось выше, аллель cf более чувствителен к уровню экспрессии белка Mod(mdg4)-67.2 и почти полностью супрессируется одной копией мутации mod(mdg4)"'. При экспрессии в линии мух, несущих аллель cf ModAQ восстанавливал активность инсулятора на фоне гомозиготной мутации mod(mdg4)"'. Этот эксперимент показал, что в ядре клетки присутствует достаточное количество функционального белка ModAQ способного связаться с сайтами инсулятора. Производная ModAC даже в этой чувствительной модельной системе не восстанавливает инсуляцию. Фенотипы крыльев в линиях, несущих мутации mod(mdg4)T6 и mod(mdg4)"1 идентичны.

5.3 Локализация призводных белка Mod(mdg4)-67.2 на политенных хромосомах и в ядрах клеток имагинальных дисков. Ранее при помощи иммунного окрашивания политенных хромосом было показано, что сайты связывания белка Su(Hw) полностью колокализуются с сайтами связывания белка Mod(mdg4)-67.2 (Gerasimova & Corees, 1998). Два хорошо видимых

места локализации 5и(Н\у) инсуляторов - это инсерции МДГ4 в локусах у2 и на конце X-хромосомы (Рис.22).

ь »Л тоб(тбд4)' - \ тос!(тс)д4)' тос!(тс1д4)'

V ' яшг ' лйЯй' МойУ/Т ггюс1(гг>с1д4)и' | ЛгМ» тосЦтддЛу' N ■V, / „•#'2" тос!(тс1д4у'

♦лмоала то<3(т&д4)и' \ 4>Мос1дСЭ тос1(тёд4)"1

■ • ъ: тоб(тбд4) — «-•

нМос!67.2 <х8и(Ниг) Мегде

(¡)

тос!(тс1д4у

<Ю

тос!(тс1д4)''1

(Ш)

моёт

mod(mdg4)'',

(¡V) МоЬ&О тос/(тс/д4у)"

(v)

моадо

тос!(тбд4)*

(VI)

тос!(тбд4)Т'

О %

-то <-то ^

•С/"^ 1 "А > V ; С,'' у .

шш ■ Ж,• Ж}

- : Ъ V . -V •/■■'• У* ■ "у ■

Рис. 22. Распределение производных форм белка Мос1(тс^4)-67.2. А. Политенные хромосомы личинок из линии у^с01. Стрелками отмечены места инсерций ¿даму-инсулятора на верхушке Х-хромосомы. Б. Клетки имагинальных дисков. 1. - окрашивание клеток mod(mdg4)+■, п.- окрашивание клеток на фоне mod(mdg4)'', \ .— суперэкспрессия \lodWT (полноразмерный белок) на фоне mod(mdg4)"l \ ¡V,- суперэкспрессия Мос1Д(5 на фоне mod(mdg4)"l; V,- суперэкспрессия Мо(1Л(3 на фоне mod(mdg4)*; VI.- окрашивание на фоне mod(mdg4)T6 (продуцируется белок МоёДС); ОАР1 - 40,6-диамидин-2-фенилиндол.

На политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы были проанализированы распределение производных белка Мос1(1т^4)-67.2 и их колокализация с сайтами инсуляторов. Как и ожидалось, МоёД(5 связывался с политенными хромосомами точно так же, как полноразмерный белок. Мос1ДС) присутствовал на бэндах, соответствующих инсулятору 8ц(Н\у) на конце Х-хромосомы. И, наоборот, МоёДС (мутация mod(mdg4)T6) практически терял способность связываться с политенными хромосомами, а редкие сайты связывания не

колоколизовались с белком Би(Н\у) (Рис.22). Эти данные подтверждают, что ModДQ, так же как полноразмерный белок Mod(mdg4)-67.2, взаимодействует с детектируемыми иммунным окрашиванием 5и(Нш) инсуляторами. Белок Мос1ДС не входит в состав инсуляторных комплексов. Далее было проведено иммунное окрашивание клеток имагинальных дисков из личинок Ого$орЫ1а. Ядра дикого типа содержали множественные колокализующиеся скопления белков \^(пк%4)-67.2 и 8и(Н\у). На фоне мутации тос1(т^4)и1 в клетках был смутно виден только неясный фон белка 8и(Н\у), не способного образовывать четких скоплений. Как и ожидалось, экспрессия полноразмерного белка Х^(п^4)-67.2 на фоне мутации mod(mdg4)ul восстанавливала «нормальное» распределение белков. Как было описано выше, белок восстанавливает все известные функции 8и(Н\у) инсулятора и связывается со всеми инсуляторными сайтами на политенных хромосомах. Однако на фоне мутации mod(mdg4)u, не формировал «инсуляторные тельца» и не входил в какие-либо ядерные скопления. Интересно, что при экспрессии белка ModДQ на фоне mod(mdg4)+ «инсуляторные тельца» восстанавливались. При этом цитоплазматическое распределение белков также сохранялось (Рис.22). Эти данные согласуются с результатами экспериментов на 82 клетках. Белок Мос1ДС не может функционировать в составе 8и(Н\у) инсуляторов и связываться с соответствующими сайтами на политенных хромосомах. Однако, в клетках mod(mdg4)T6 (экспрессирующих вариант Гк^ДС) была обнаружена его колокализация с белком 8и(Нш) в «инсуляторных тельцах».

5.4 Нефункциональный белок 8и(Н«') способен образовывать «инсуляторные тельца». Основным белком, образующим 5и(Нш)-зависимые инсуляторы является одноименный белок 8и(Нш). Связываясь с консенсусной последовательностью, он привлекает остальные белковые компоненты инсулятора. Поэтому введение мутации, нарушающей связывание 8и(Н\у) с ДНК, приводит к потере инсуляции. Возникает вопрос: каким образом связаны способность белка 8и(Нш) взаимодействовать с консенсусной ДНК, образование «инсуляторных телец» и функционирование инсулятора? Для ответа на этот вопрос была использована трансгетерозиготная линия ИгозорИНа с двумя мутациями в гене ,т(Пн>) (Рис.23). Одна мутация -зи(Нм>)>'- была вызвана делецией промотора гена и части первого его экзона.

43- -ЕНННН кн им нъ

з Рис. 23. Схематичное ; изображение мутаций зи(Нк) и

деления

ии(П«Г

Поэтому данный аллель не способен давать какой-либо продукт и является ноль-мутацией. Другая мутация - su(Hwf - была вызвана точечной заменой аминокислоты цистеина на тирозин в позиции 525, что приводило к нарушению правильного сворачивания домена «цинковый палец №10». Однако аллель su(Hwf производит полноразмерный белок, который можно детектировать антителами. Сочетание этих мутаций приводит к потере инсуляции, что было подтверждено в модельной системе аллелей у2 и ct6. В аллеле у2 наблюдалось восстановление экспрессии гена yellow во всех кутикулярных тканях, а в аллеле ct6 - восстановление целостности крыловой пластины. Окрашивание имагинальных дисков из линии su(Hw)v /su(Hwf антителами к белку Su(Hw) выявило нормально сформированные «инсуляторные тельца», образующиеся в ядрах клеток (Рис.24). К тому же, эти «инсуляторные тельца» полностью колокализовались с белками СР190 и Mod(mdg4)-67.2, против которых проводилось иммунное окрашивание.

Таким образом, белок Su(Hw), не подцеживающий инсуляцию, тем не менее, способен к формированию полноценных «инсуляторных телец».

aSu(Hw) aCPl90 Melgo

Рис. 24. Распределение инсуляторных белков в имагинальных дисках из линии su(Hw)v/su(Hw)f. Показаны результаты окрашивания имагинальных дисков антителами к белкам Su(Hw), CP 190 и Mod(mdg4)-67.2 и их наложения (Merge).

У3

SulHwIvSulHwi'

5.5 Выявление «спеклообразуннцего» компонента «инсуляторных телец». Далее следовало выяснить роль каждого из компонентов инсуляторного комплекса в формировании «инсуляторных телец». Для этого в Б2 клетках ОгояорИПа был использован метод РНК интерференции. Используя двуцепочечную РНК, гомологичную к 5-области кДНК гена, мы добивались значительного снижения количества его мРНК. Последовательно исключая каждый из компонентов инсуляторного комплекса, мы наблюдали за способностью остальных входящих в него белков формировать «инсуляторные тельца». Поскольку действие метода РНК интеференции не абсолютное, часть клеток содержало значительное количество мРНК. Эти клетки служили внутренним контролем. Снижение количества мРНК ср190 приводило к диффузному распределению как белка Мой(п^4)-67.2, так и 8и(Н\у) (Рис.25). В то же время, снижение количества мРНК ¡и(Нм) не вызывало значительного изменения в формирования «инсуляторных

Y ■>.

' • - • 1 * -."-.- •;■'. -tí*'

ГУ ■

aMod-67,2 aCPI90 Merge

телец» белками Мос1(пи^4)-67.2 и СР190. Наиболее интересный результат был получен при снижении количества мРНК mod(mdg4) (Рис. 25). В данном случае, распределение

otCP190 aMod-67.2 Mcrgc__aC'Pl'X)__qSu(Hw) _Мепк

f . 't • V Т •>• . • г . V.< ■А; ' V Ъ ш ¿> - С С; ¿Я s-, "Л:

V ч 1 .' Л • ' А, ,м > ■ *, , >> % ■ У ':> X '' % "' fc

X / сх Ss-*- * <

Рис. 25. Распределение инсуляторных белков в 82-клетках Drosophila при снижении уровня экспрессии инсуляторных белков методом РНК-интерференции. СР190 RNAi, Mod(mdg4) RNAi, Su(Hw) RNAi -клетки, обработанные методом РНК-интерференции против РНК соответствующего гена . Представлены окрашивания антителами к белкам СР190, Su(Hw), и Mod(mdg4)-67.2.

белка СР190 никак не менялось: он формировал нормальные «инсуляторные тельца». Распределение белка Su(Hw) было диффузным, однако он все еще был способен формировать некоторое количество «инсуляторных телец», колокализующихся с белком СР190.

Таким образом, данный эксперимент показал, что основным компонентом, отвечающим за образование «инсуляторных телец», является белок СР190. В то же время, белок Mod(mdg4)-67.2 способствует стабилизации Su(Hw) в «инсуляторных тельцах».

5.6 Белок SUMO необходим для формирования «инсуляторных телец». Ранее было показано, что белки инсуляторного комплекса Mod(mdg4)-67.2 и СР190 подвергаются сумолированию (Capelson et al., 2006). Кроме того была показана важная роль сумолирования в образовании PML телец (Shen et al, 2006). Чтобы выяснить роль белка SUMO в формировании «инсуляторных телец», было проведено окрашивание S2 клеток антителами к белку SUMO и к каждому из инсуляторных белков: Su(Hw), Mod(mod4)-67.2, СР190 (Рис.25). SUMO распределялся в виде множественных скоплений, многие из которых колокализовались с «инсуляторными тельцами». Затем распределение инсуляторных белков было протестировано на фоне РНК инерференции по SUMO. Вестерн-блот анализ показал значительное снижение количества белка

SUMO после РНК инерференции. Инактивация SUMO приводила к диффузному распределению инсуляторных белков в ядрах S2 клеток (Рис. 26). Таким образом, белок SUMO необходим для организации инсуляторных белков в «инсуляторные тельца».

5.7 Процесс сумолирования играет ключевую роль в образовании скоплений белка Mod(mdg4)-67.2. Далее была проанализирована связь сумолирования белка Mod(mdg4)-67.2 с его способностью образовывать «инсуляторные тельца». Прежде всего, воспользовавшись методами биоинформатики, нами были выявлены два мбНШЕ, являющихся консенсусом для связывания с белком SUMO. Один из них располагается в позиции 160, а другой в позиции 423.

На основании этих данных, нами были сделаны несколько конструкций. Производная Mod K160R имела точечную замену остатка лизина на аргинин в одном из сайтов прикрепления SUMO, таким образом, нарушалась консенсусная последовательностВ'КХЕ. Производная Mod K423R имела такую же точечную замену во втором сайте прикрепления SUMO. Производная Mod K160R/K423R имела такие же точечные замены в обоих сайтах связывания для белка SUMO.

Для того чтобы проверить способность полученых мутантных белков к сумолированию

ccMod-67.2 аСР190 aSu(Hw) аСР190

Mod-67.2 <l\ml.' Merge и' ■

С PI41» Merge

.v, ■ :

•< -

: А

ilSmi.t Merge

-<Г. '

■iiW

• • • .

■t,'17.. ■: <•

—

Рис.26. Локализация белков инсуляторного комплекса и белка SUMO (dSmt3) в S2 клетках и распределение инсуляторных белков после снижения уровня экспрессии белка SUMO методом РНК интерференции (dSmt3 RNAi).

были сделаны конструкции экспрессирующие немодифицированный белок Mod(mdg4)-67.2 и белок, несущий две мутации в сайтах сумолирования. Оба белка экспрессировались с FLAG -эпитопом. Еще одна конструкция экспрессировала белок SUMO с V5 эпитопом. Каждая из экспрессирующих какой-либо вариант Mod(mdg4)-67.2 плазмид котрансфецировалась с

плазмидой, экспрессирующей SUMO-V5. После чего проводили иммунопреципитацию с помощью антител к FLAG-эпитопу. Вестерн-блот анализ был проведен с использованием либо антител к FLAG (выявляющих формы экспрессируемых белков Mod(mdg4)-67.2), либо антител к V5 (выявляющих SUMO) (Рис. 27).

1 i Рис. 27. Мутация Mod-160/423 не сумолируется. Вестерн-

<V,ff блот анализ иммунопреципитации экспрессированых

V ^ ^ белков: дикого типа и мутантного по сайтам

сумолирования. dSmt3-Mod(mdg4) - белок Mod(mdg4)-dSmt3-Mod(mdg4)-» • . -— i20kDa 67.2 с ковалентно ассоциированным SUMO

Mod(mdg4)->IMVflMI l""k"'1

aFLAG aV5

He модифицированный белок Mod(mdg4)-67.2 (первая дорожка) в отличие от мутантного по сайтам сумолирования (вторая дорожка), при окрашивании антителами к FLAG эпитопу сохранял способность к конъюгации с SUMO. Эти результаты подтверждаются окрашиванием антителами к V5 эпитопу, узнающими экспрессированный белок SUMO. Чтобы выяснить каким образом распределяются производные белка Mod(mdg4)-67.2, S2 клетки были трансфецированы плазмидами, экспрессирующими белки: ModKlóOR, ModK423R или ModK160R-K423R.

Рис. 28. Распределение белка Mod с мутированными сайтами прикрепления белка SUMO в ядрах клеток S2 (K.160R/K.423R). aFLAG - экспрессируемый рекомбинантный белок; aSu - белок Su(Hw); aCP190 -белок СР190.

В клетках S2, экспрессирующих мутантные варианты ModKlóOR и ModK423R, при окрашивании антителами к эпитопу FLAG, белок распределялся как в клетках «дикого типа»: он находился в ядре и образовывал «инсуляторные тельца». Точно так же распределялись и другие белки - компоненты инсуляторного комплекса (Su(Hw) и CP 190), демонстрируя полную колокализацию с производными формами Mod(mdg4)-67.2. Следовательно, изменение любого из сайтов сумолирования не влияло на способность белка Mod(mdg4)-67.2 участвовать в формировании «инсуляторных телец».

Однако, при одновременном изменении обоих сайтов связывания SUMO, картина распределения белка ModK160R/K423R коренным образом менялась (Рис.28). Белок по-прежнему находился в ядре, но не образовывал «инсуляторных телец», а распределялся равномерно внутри

ядра. При этом наблюдалось изменение в распределении других белков инсуляторного комплекса. Распределение белка CP 190 не менялось по сравнению с распределением в клетках дикого типа. Однако белок Su(Hw) имел более диспергированное по сравнению с контролем распределение: с одной стороны, он частично колокализовался с белком СР190 в составе «инсуляторных телец», но, с другой стороны, частично локализовался с диффузным распределением ModK160R/K423R производной. Следовательно, можно утверждать, что несумолированная форма белка Mod(mdg4)-67.2 не в состоянии формировать «инсуляторные тельца» или входить в их состав. Экспрессия несумолированной формы белка Mod(mdg4)-67.2 частично нарушает распределение связанного с ним белка Su(Hw). Значит, белок Mod(mdg4)-67.2 может не только входить в состав «инсуляторных телец», но и участвовать в их формировании.

Каким образом мутации в белке Mod(mdg4)-67.2, нарушающие сайты сумолирования и, как следствие, образование «инсуляторных телец» будут влиять на инсуляцию в Drosophila? Для ответа на этот вопрос были получены трансгенные линии мух, экспрессирующие под промотором, содержащим последовательность UAS, мутантные производные ModK160R, Mod K423R и ModK160R/K423R. Скрещивание таких линий с GAL-драйвером позволяло индуцировать экспрессию конструкции в любых тканях на любой стадии развития мухи. Все эксперименты с трансгенными конструкциями проводились на фоне мутации mod(mdg4)"'. Когда GAL4 активатор был под контролем сильного промотора гена actin, все исследуемые варианты восстанавливали активность инсулятора Su(Hw) на фоне мутации mod(mdg4)"'/mod(mdg4)"',

В Mod-67.2 MocI16M2i

tmdfmtlgjf md(mil°4j~ moiwglt mmUmigif

7; i

V V ; % "'■■'-;,. v; %";; i. v 1 ;■ ; • и«. >V t. ■ 7 v V. '"••

• •t «а: jF: Jri —■• ,я* 1 ; : л & k f .4'-. Xi 4 ~ Л

Рис. 29.

Восстановление работы инсулятора в модельных системах у2 и с!6 при экспрессии конструкции Mod K160R K423R. Анализ распределения инсуляторных белков в имагинапьных дисках.

полностью воспроизводя эффект, наблюдаемый в случае экспрессии полноразмерного белка (Рис.29). Таким образом, in vivo ни одна из мутаций не оказывала влияние на инсуляторную функцию белка Mod(mdg4)-67.2. Полученный результат свидетельствует, что сумолирование не является обязательным условием функционирования инсулятора. Затем было исследовано распределение инсуляторных белков в имагинальных дисках личинок дрозофилы (Рис 28). Экспрессия белка Mod(mdg4)-67.2 приводила к ожидаемому распределению белков внутри «инсуляторных телец», в то время как мутантный по сайтам сумолирования белок Mod-K160R/K423R не был способен входить в инсуляторные тельца, формируемые CP 190. Белок Su(Hw) частично локализуется с инсуляторными тельцами, частично распределен в диффузной зоне Mod-K160R/K423R. Исходя из полученных данных, можно предположить, что присутствие белка Mod(mdg4)-67.2 в инсуляторных тельцах не является обязательным условием инсуляции.

Экспрессия белков в рекомбинантных конструкциях под контролем активатора GAL4 с сильным промотором гена actin в несколько раз выше, чем экспрессия эндогенного белка (Рис. 29). Поэтому возможно, что сильная экспрессия мутантного белка Mod-K160R/K423R компенсирует не вхождение его в «инсуляторные тельца». Для того, чтобы регулировать экспрессию форм белка Mod(mdg4), был использован GAL активатор под контролем промотора

гена теплового шока.

1мр"0 arivfr ¡к |ш illIva-

PHC. 30. Высокий уровень экспрессии белка Mod-K160R/K423R компенсирует его неспособность образовывать «инсуляторные тельца». (А) Относительная экспрессия трансгенов Mod(mdg4)-67.2 и Mod-K160R/K423R в зависимости от типа драйвера и времени теплового щока. Уровень экспрессии был определен относительно постоянно экспрессируемого гена ras. (В) Эффект экспрессии вариантов белка Mod(mdg4) на фенотип ct6 аллеля. Варианты белка Mod(mdg4) экспрессировались либо под контролем промотора гена actin либо под контролем промотора гена теплового шока.

Минимальное время теплового шока, восстанавливающего инсуляцию, для белка Моё(тё§4)-67.2 составляло 10 минут. То же время теплового шока было не достаточно для восстановления инсуляции в случае мутантного

белка Мос1К160К/К.42311. В этих условиях экспрессия была в два раза ниже, чем уровень экспрессии эндогенного гена (Рис. 30). Однако тридцатиминутный тепловой шок поднимал уровень экпрессии до эндогенного и восстанавливал инсуляцию в обоих случаях.

Полученные результаты показывают, что для восстановления нормальной инсуляции необходимо меньшее количество полноразмерного белка Мос1(т1^4)-67.2, чем белка, несущего мутации по сайтам сумолирования.

Чтобы выяснить, способен ли мутантный по сайтам сумолирования белок Мос1К160КУК423К связываться с инсуляторными сайтами был проведен Х-СЫР анализ на стадии куколки. Экспрессия белка Мос1(л^4)-67.2 на высоком или низком уровне одинаково приводила к связыванию с эндогенными инсуляторными сайтами. Экспрессия мутантного белка Мос!К160КУК42311 на низком уровне приводила к слабому связыванию белка с инсуляторными сайтами и только повышение экспрессии Мос1К160К/К423К приводило к нормальному связывания белка. Эти результаты подтверждают, что сумолирование улучшает активность белка Мос1(тс^4)-67.2 и меньшее его количество необходимо для нормального функционирования 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что не существует прямой связи между образованием «инсуляторных телец» в ядре клеток и функционированием инсуляторов. Основываясь на этом, можно предположить, что «инсуляторные тельца» являются своеобразными «депо» различных, в том числе и инсуляторных, белков. Клетка, сумолируя неиспользуемые в данный момент в каких-либо процессах белки, накапливает их в таких «депо». При необходимости, за счет процесса десумолирования, белки могут быстро собраться в необходимый комплекс. Таким образом, «инсуляторные тельца» могут являться аккумуляторами белков,

Recruitment

heat shock replication

Release

Рис. 31. Модель, описывающая роль сумолирования в формировании «инсуляторных телец». Красные, зеленые и голубые круги представляют соответственно белки

sumo

\jjbc9

sumolyaticm^fc

Mod(mdg4)-67.2 X SuHw

Mod(mdg4)-67.2, Su(Hw) и CP 190; желтые овалы представляют молекулы SUMO, а черная линия - фибрилла хроматина со сформированными на ней инсуляторными комплексами.

участвующих в самых разнообразных процессах жизнедеятельности клетки. Например, сумолированный белок Mod(mdg4)-67.2 взаимодействует с белком Su(Hw) и вовлекает его в «инсуляторные тельца». Возможно, это защищает инсуляторный комплекс от деградации. Более того, инсуляторные тельца могут способствовать формированию инсуляторных и других регуляторных комплексов. Сформировавшийся инсуляторный комплекс может временно взаимодействовать с хроматином и освобождаться от «инсуляторных телец» с помощью десумолирования (Рис. 31)

Проведенные исследования ставят под сомнение идею об «инсуляторных тельцах», как организаторах структуры и функции генома, поддерживающих высокоорганизованный хроматин и формирующих функциональные домены. Предложенная модель объясняет, почему сильные мутации по белку Su(Hw) нарушают только фертильность самок, а мутация mod(mdg4)"', являющаяся для инсуляции ноль-мутацией, не имеет фенотипического и функционального проявления.

Выводы

1. На основе регуляторных систем генов yellow и miniwhite создана модельная система для изучения явления нейтрализации инсуляции, базирующаяся на методе стабильной интеграции репортерных генов в геном Drosophila melanogaster.

2. Впервые показана способность двух Su(Hw) инсуляторов взаимодействовать, что может приводить к нейтрализации их инсуляторной активности.

3. Продемонстрировано, что Su(Hw) инсуляторы могут способствовать коммуникации между энхансером и промотором. Выявлена роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 в этом процессе.

4. Предложена новая модель действия инсуляторов, основанная на взаимодействии между Su(Hw) инсуляторами.

5. Выявлено, что взаимодействие Su(Hvv) инсуляторов является ориентационно-зависимым и способно либо стимулировать, либо блокировать ассоциацию расположенных на большом расстоянии друг от друга белковых комплексов.

6. Показано, что Su(Hw) инсулятор способен стимулировать транскрипцию ослабленного промотора гена yellow . Выявлено, что для эффективной стимуляции промотора необходим домен «цинковые пальцы» белка Su(Hw).

7. В геноме Drosophila melanogaster впервые обнаружен эндогенный 8и(Н\у)-зависимый инсулятор. Описаны его инсуляторные, нейтрализующие и барьерные свойства.

BTB/POZ домена, приводит к димеризации белка. Продемонстрировано, что идентифицированный домен белка Mod(mdg4)-67.2 необходим для эффективной гетеродимеризации с ВТВ-содержащим белком GAF.

9. Доказано, что специфический ВТВ домен белка Mod(mdg4)-67.2 необходим для его связывания с инсулятором Su(Hw). Замена ВТВ домена белка Mod(mdg4)-67.2 на аналогичный домен белка GAF приводит к потере взаимодействия химерного белка с Su(Hw) инсулятором in vivo. В отличие от нормального белка Mod(mdg4)-67.2, химерный белок не способен участвовать в формировании «инсуляторных телец».

10. С помощью точечного мутагенеза наиболее консервативных аминокислот в ВТВ домене белка Mod(mdg4)-67.2 продемонстрировано, что функциональность ВТВ домена во многом определяется суммарным зарядом, а не структурными особенностями наиболее консервативных аминокислот.

11. Доказано отсутствие прямой взаимосвязи между образованием внутриядерных «инсуляторных телец» и Зи(Н\у)-зависимой инсуляцией у Drosophila melanogaster.

12. Впервые показано, что включение инсуляторного белка Mod(mdg4)-67.2 в состав «инсуляторных телец» полностью зависит от процесса его сумолирования.

13. Продемонстрировано, что инсуляторный белок СР190 играет ключевую роль в образовании «инсуляторных телец».

14. Предложена новая модель функционирования «инсуляторных телец» в ядре, согласно которой «инсуляторные тельца» являются местами хранения регуляторных белков, в том числе входящих в состав инсуляторных комплексов. Таким образом, «инсуляторные тельца» могут способствовать быстрой сборке различных белковых комплексов необходимых для корректной временной и тканеспецифичной экспрессии генов.

Список публикаций по теме диссертации Статьи:

1. Георгиев ПГ, Муравьева ЕЕ, Головкин АК, Грачева ЕМ, Беленькая ТЮ. Инсуляторы и

взаимодействия между далеко удаленными регуляторными элементами у высших эукариот.

Генетика. 2000, 36: 1588-1597.

2. Murav'eva Е, Golovnin A, Gracheva Е, Parshikov A, Belen'kaya Т, Pirrotta V, Georgiev P. Loss of

insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators.

Science. 2001. 291: 495-498.

3. Муравьева EE, Головннни АК, Паршиков АФ, Георгиев ПГ. Новые свойства Su(Hw) инсулятора

ДАН. 2001.378: 181-185.

4. Романова OA, Бирюкова ИВ, Головнин АК, Георгиев ПГ. Химерные мобильные элементы способны формировать новые границы транскрипционных доменов у Drosophila melanogaster. ДАН. 2001,381: 572-575.

5. Golovnin A, Georgieva S, Hovhannisyan H, Barseguyan К, Geprgiev P. P element-mediated duplications of genomic regions in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 2002, 111: 126-138.

6. Golovnin A, Biryukova I, Romanova O, Silicheva M, Parshikov A, Savitskaya E, Pirrotta V, Georgiev P. An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development. 2003, 130: 3249-3258.

7. Мельник EC, Георгиев ПГ, Головнин АК. Анализ влияния Su(Hw) инсулятора на экспрессию гена miniwhite у Drosophila melanogaster. ДАН. 2004, 398: 282-284.

8. Мазур AM, Георгиев ПГ, Головнин АК. «Анализ взаимодействия между белками, содержащими ВТВ домен в дрожжевой двугибридной системе» ДАН. 2005,400(2): 261-264.

9. Мазур AM, Георгиев ПГ, Головнин АК. «Кислый домен, находящийся на С-конце белка Su(Hw) репрессирует транскрипцию в дрожжевой двугибридной системе» ДАН. 2005. 400(1): 113115.

10. Golovnin A, Melnick Е, Mazur A, Georgiev P. Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened_ye//ow promoter over a distance. Genetics. 2005, 170: 1133-1142.

11. Pomerantseva E, Biryukova I, Silicheva R, Savitskaya E, Golovnin A, Georgiev P. Transposition of regulatory elements by P element-mediated rearrangements in Drosophila melanogaster. Genetics. 2006, 172:2283-2291.

12. Golovnin A, Mazur A, Kopantseva M, Kurshakova M, Gulak PV, Gilmore B, Whitfield WGF, Geyer P, Pirrotta V, Georgiev P. Integrity of the Mod(mdg4)-67.2 BTB domain is critical to insulator function in Drosophila. Mol Cell Biol. 2007,27: 963-974.

13. Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Galkin AV, Georgiev P. 'Insulator bodies' are aggregates of proteins but not of insulators. EMBO Reports. 2008, 9: 440-445.

14. Костюченко MB, Савицкая EE, Волков ИА, Головнин АК, Георгиев ПГ. Изучение функционального взаимодействия между тремя копиями инсулятора из мобильного элемента МДГ4 на примере модельной системы гена miniwhite Drosophila melanoeaster ДАН. 2008. 415(5):1-4.

15. Krivega М, Savitskaya Е, Krivega I, Karakozova M, Parshikov A, Golovnin A, Georgiev P. Interaction between a pair of gypsy insulators or between heterologous gypsy and Wari insulators modulates Flp site-specific recombination in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 2010, 119: 425434.

Тезисы конференций:

16. Muravyova Е, Golovnin A, Gracheva Е, Pirrotta V, Georgiev P. Paired su(Hw) insulators lose enhancer blocking activity and may instead facilitate enhancer-promoter interactions. 41st Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, Pennsylvania (USA), March 22-26,2000: 216

17. Georgiev P, Karakozova M, Muravyova E, Golovnin A. The gypsy insulator can partially compensate for a deletion of the yellow regulatory region in Drosophila melanogaster. 42nd Annual Drosophila Research Conference. Washington (USA), March 21-25,2001: 250

18. Golovnin A, Mazur A, Melnik E, Georgiev P. Role of Mod(mdg4) in mediating of Su(Hw) insulator action in Drosophila melanogaster. 45st Annual Drosophila Research Conference Washington (USA), March 24-28, 2004: 286

19. Georgiev P, Golovnin A, Melnik E, Kostuchenko R, Mazur A. The gypsy insulator can compensate for an upstream activating region in the Drosophila yellow gene promoter. 45st Annual Drosophila Research Conference. Washington (USA), March 24-28, 2004: 284

20. Mazur A, Georgiev P, Golovnin A. BTB/POZ mutation of Mod(mdg4) in mediating Su(Hw) insulator action in Drosophila melanogaster. Advances in Molecular Cell Biology. 2004: 126-136.

21. Golovnin A, Mazur A, Kopantseva M, Kurshakova M, Gilmore B, Geyer P, Pirrotta V, Georgiev P. Role of Mod(mdg4)-67.2 domains in mediating of Su(Hw) insulator action in Drosophila melanogaster . 46st Annual Drosophila Research Conference San Diego, California (USA), March 30-April 3, 2005: 530

22. Головнин AK, Волков ИА. Исследование распределения инсуляторных белков в соматических клетках дрозофилы. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 2008: 197

23. Волков ИАа Головнин АК. Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование «инсуляторных телец» в ядрах клеток Drosophila melanogaster. Школа-конференция «Биология: традиции и инновации в 21 веке» в рамках I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия - 2008». Казанский государственный университет (г. Казань), 6-10 июля 2008 г.

24. Волков И.А, Головнин АК. Влияние различных доменов белка Mod(mdg4) на образование «инсуляторных телец» в ядрах клеток Drosophila melanogaster. I Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии». Харьковский государственный университет (г. Харьков), 15-20 сентября 2008 г.

25. Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Georgiev P. Nuclear distribution of insulator proteins in Drosophila melanogaster. International symposium «Control of gene expression and cancer». Moscow, June 21-25, 2010.

Заказ № 118/02/2011 Подписано в печать 17.02.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,6

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 Г^у1) www. cfr. ru; e-mail: info@cfr. ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Головнин, Антон Клеменсович

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА.

1.1 Геном эукариот организован в домены.

1.2. «Молчащие» домены.

1.3. Активные домены.

1.4 Участки хроматина взаимодействующие с ядерным матриксом.

1.5 Новый взгляд на устройство хроматина.

1.6 Структурная организация хроматина в ядре.

1.7 Регуляция экспрессии кластеризованных генов.

II. ИНСУЛЯТОРЫ.

2.1 Свойства инсуляторов.

2.2 Инсуляторы позвоночных.

2.2.1 Инсулятор Р-глобинового кластера.

2.2.2 Инсулятор 1^Дг19 локуса.

2.3 Барьерные элементы дрожжей.

2.4 Пнсулягоры дрозофилы.

2.4.1 ясв и 5г.?' инсуляторы.

2.4.2 СТСР-зависимые инсуляторы.

2.4.3. Инсулятор $и(Н\\/).

2.4.4. Эндогенные инсуляторы 5и(Ну^) и инсуляторные тельца.

2.4.5. Нейтрализация инсуляторов.

2.5 Механизм действия инсуляторов.

Ш. SUMO: НОВЫЙ УЧАСТНИК ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОЙ. МОДИФИКАЦИИ

БЕЛКОВ.

3.1 Функции белков семейства SUMO.

3.2. Путь конъюгации белка SUMO.

3.2.1. Особенности строении белка SUMO.

3.2.2. Функции и особенности SUMO-активирующего фермента El.

3.2.3. Функции и особенности SUMO-конъюгирующего фермента Е2.

3.2.4. Функции и особенности SUMO-лигаз ЕЗ.

3.2.5. Ферменты десомулирования.

3.2.6. Специфичность субстратов сумолирования.

3.2.7. Регуляция активности белков через SIM (SUMO interaction motif).

3.3. Биологическая роль SUMO-модификации.

3.3.1. SUMO-модификшщя участвует в регуляции различных процессов жизнедеятельности клетки. .1.

Сумолирование регуляторов транскрипции.

Сумолирование белков, ассоциированных с репарацией ДНК.

Сумолирование белков, участвующих в транспорте через ядерные норы.

Участие сумолирования в организации и функционирование хромосом.

3.3.2 Инсуляторные белки сумолируются in vitro и in vivo.

3.3.3. Формирование ядерных телег/ PML.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы.

2. Программное обеспечение, базы данных.

3. Олигонулеотидные праймеры.

4. Штаммы бактерий, дрожжей и линия культуты клеток.

Drosophila melanogaster использованные в работе.

5. Среды для выращивания бактерий, дрожжей и культуры клеток Drosophila melanogaster.

6. Антитела.

7. Линии и мутации Drosophila melanogaster использованные в работе.

8. Генетические методы.

8.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

8.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite. в трансгенных линиях.

8.3 Генетические скрещивания.

9. Биохимические методы.

Работа с ДНК.

9.1 Выделение ДНК из дрозофилы.

9.2 Саузерн-блот анализ.

9.3 Приготовление компетентных клеток для трансформации. плазмидной ДНК.

9.4 Трансформация компетентных клегок плазмидами.

9.5 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.

9.6 Полимеразная цепная реакция.

9.7 ПЦР в реальном времени (Real-time PCR ).

9.8 Обратная транскрипция.

9.9 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

9.10 Лигирование ДНК.

9.11 Тупление выступающих концов ДНК.

9.12 Агарозный гель-электрофорез.

9.13 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций.

9.14 Определение нуклеотидной последовательности.

9.15 Создание рекомбинантных генетических конструкций для получения трансгенных линий Drosophila.

9.16 Получение мутаций в гене mod(mdg4).

9.17 Получение векторов для дрожжевой двугибридной системы.

9.18 Получение конструкций, экспрессирющих белки СР190, Mod(mdg4)-67.2 и его мутантные производные в 52-клетках Drosophila.

Работа с белками.

9.19 Синтез и выделение белков.

9.20 Электрофорез белков в денатурирующем 8% ПААГ.

9.21 В естсрн-блот анализ.

9.22 Задержка в геле комплекса ДНК-белок.

9.23 Детекция белков на политенных хромосомах дрозофилы.

9.24 Детекция белков в клетках имагинальных дисков дрозофилы.

Работа с дрожжами.

9.25 Культивирование дрожжей.

9.26 Трансформация дрожжевых клеток.

9.27 Анализ взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе.

Работа с культурой клеток 52.

9.28 Трансфекция Б2 клеток.

9.29 Получение клеточного лизата из 82 клеток.

9.30 Получение ядерного лизата из Б2 клеток.

9.31 Иммунопреципитация.

9.32 Иммунопреципитация хроматина.

9.33 Окрашивание клеточных препаратов.

9.34 РНК-интерфереция.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами.

1.1 Создание модельной системы для изучения свойсгв инсулятора Su(IIw).

1.2 Два инсулятора Su(Hw), окружающие либо энхансеры, либо промотор гена yellow, сохраняют способность блокировать взаимодействия между энхансером и промотором.

1.3 Два инсулятора Su(Hw) , расположенные между энхансерами и промотором гена yellow, не способны блокировать взаимодействие между энхансером и промотором.

1.4 Два инсулятора Su(Hw), расположенные между энхансером и промотором гена miniwhite, способствуют энхансер-промоторным взаимодействиям.

1.5 Исследование влияния мутации mod(mdg4)IuI на экспрессию гена miniwhite в линиях EyEwSYSW.

1.6 Роль положения инсуляторов Su(Hw) в составе конструкций и расстояния между ними в нейтрализации инсуляции.

1.7 Взаимодействие между двумя Su(Hw) инсулягорами зависит от их взаимной ориентации.

II. Взаимодействие инсулятора Su(Hw) с промотором на больших дистанциях.

2.1 Инсулятор Su(Hw) способен стимулировать транскрипцию гена yellow, ослабленного делецией предпромоторного района.

2.2 Сила стимуляции транскрипции напрямую зависит от количества сайтов связывания для белка Su(Hw).

2.3 Инсулятор Su(Hvv) не компенсирует делецию энхансера гена yellow.

2.4 Функциональный анализ доменов белка Su(Hw), участвующих в стимуляции транскрипции гена yellow.

III. Первый эндогенный S u (Н w) -з а в и си м ы ü инсулятор обнаруженный у Drosophila.

3.1 Последовательность между генами yellow и achaete, дуплицированная в регуляторную область AS-C, нарушает экспрессию гена scute.

3.2 Последовательность между генами yellow и scute содержит функциональные сайты связывания белка Su(Hw).

3.3 Мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) влияют на экспрессию генов. в составе AS-C.

IV. Структурная и функциональная характеристика белка Mod(mdg4)-67.2 как компонента 8и(Нлу)-зависимого инсуляторного комплекса.

4.1 Наличие определенных точечных замен в "заряженном кармане" не влняег на способность белка Mod(mdg4)-67.2 взаимодействовать с белком Su(Hw) и димеризоваться.

4.2 Белок Mod(mdg4)-67.2 содержит второй домен, отвечающий за димеризацию.

4.3 Функциональная активность мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 в работе инсулятора Su(Hw).

4.4 Локализация различных форм белка на политенных хромосомах и в «инсуляторпых тельцах» в ядрах диплоидных клеток.

4.5 Инсуляторные свойства мутантиых форм белка Mod(mdg4)-67.2 не зависят напрямую от их способности взаимодействовать с белком CP 190.

V. Исследование взаимосвязи между образованием «инсуляторных телец» и инсуляцией.

5.1 Мутантные варианты белка Mod(mdg4)-67.2 использованные в работе.

5.2 Локализация Mod(mdg4) производных в 52-клетках.

5.3 Распределение мутантных варианюв белка Mod(mdg4)-67.2 в цитоплазматической и ядерной белковых фракциях S2 клеток. X-ChIP анализ.

5 4 Тестирование мутантных форм белка Mod(mdg4)-67.2 in vivo

5.5 Локализация призводных белка Mod(mdg4)-67.2 на политенных хромосомах и в ядрах клеток имагинальных дисков.

VI. Выявление фактора ответственного за формирование «инсуляторных телец».

6.1 Удаление сигналов ядерной локализации белка Mod(mdg4)-67.2 влияет на распределение белка в клетке и не влияет на его инсуляторные свойства.

6.2 Уникальные С-концевые домены белка Mod(mdg4)-67.2 не нужны для образования «инсуляторных телец».

6.3 Нефункциональный белок Su(Hw) способен образовывать. инсуляторные тельца».

6 4 Выявление «спеклообразующего» компонента «инсуляторных телец».

6.5 Белок SUMO необходим для формирования «инсуляторных телец».

6.6 Процесс сумолирования играет ключевую роль в образовании скоплений белка Mod(mdg4)-67.2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

I. В основе явлений инсуляции и нейтрализации инсуляции лежит взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами.

II. Ориентационно-зависимое взаимодействие между Su(Hav) инсуляторами играет значительную роль в регуляции взаимодействий между различными белковыми комплексами.

III. Инсулятор Su(Hw) обладает стимулирующей активностью.

IV. Роль инсуляторных белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 в регуляции транскрипции в генном комплексе AS-C.

V. Роль ВТВ доменов в инсуляции и во взаимодействии между энхансером и промотором.

VI. Между образованием «инсуляторных телец» и инсуляцией не существует прямой связи.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster"

Нормальное функционирование эукариотического генома обеспечивается тонкими и точно скоординированными между собой механизмами регуляции экспрессии большого количества генов, отвечающими за время, место и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов. Экспрессия генов эукариот - это сложный и многостадийный процесс, важнейшим этапом которого является транскрипция. Таким образом, изучение механизмов и факторов регуляции транскрипции является одной из важнейших задач современной молекулярной генетики.

В клетке ДНК эукариотических хромосом находится не в свободном состоянии. Она связывается с различными белками, образуя хроматин. Хроматин способен находиться в различных состояниях (эухроматин и гетерохроматин), различающихся по степени компактизации и транскрипционной активности. Предполагается, что пространственно хроматин организован в домены, внутри которых могут находиться либо индивидуальные гены, либо группы генов с отдельным« паттернами экспрессии. Структура хроматина является важнейшим условием, влияющим на эффективность экспрессии генов, т.к. она определяет степень доступности различных регуляторных элементов для транскрипционных факторов. Согласно широко распространенной в настоящее время структурной модели действия инсуляторов, именно эти регуляторные элементы могут играть ключевую роль в образовании независимых функциональных доменов хроматина. В настоящее время наиболее полно охарактеризован 8и(Н\у)-зависимый инсулятор, впервые обнаруженный в последовательности ретротранспозона МДГ4 у Drosophila melanogaster. Известно, что инсулятор Su(H\v) способен блокировать более 30 известных энхапсеров, работающих в разных тканях и на разных этапах развития. Кроме того, он способен блокировать различные репрессионные эффекты, включая негативное действие гетерохроматина и белков группы Polycomb. Белковый комплекс инсулятора Su(Hw) включает три известных на данный момент белка: связывающийся с ДНК белок Su(Hw), белок Mod(mdg4) и недавно открытый белок CP 190. Около 10 лет назад было показано, что в ядрах интерфазных клеток Drosophila инсуляторные белки Su(Hw) и Mod(mdg4) колокализуются в дискретных скоплениях. На основании того, что исчезновение этих иммунофлюоресцирующих скоплений при мутации белка Mod(mdg4) соответствовало ослаблению 8и(Н\у)-зависимой инсуляции, такие ядерные образования были названы «инсуляторные тельца».

Предполагается, что «инсуляторные тельца» представляют собой скопления многих разнесенных по геному и связанных с ДНК белковых комплексов Su(Hw) инсулятора. Эти белковые комплексы объединяются друг с другом, благодаря взаимодействию между белками Mod(mdg4) и CP 190, таким образом, образуя «отдельные хроматиновые петли-домены» и контролируя высокоупорядоченную организацию и функционирование генома. Исходя из этого предположения, была выдвинута структурная модель работы инсулятора, постулирующая, что энхансер, находящийся в одном функциональном домене, не может активировать промотор, находящийся в другом домене. К сожалению, предполагаемое сосредоточение расположенных на расстоянии друг от друга последовательностей ДНК инсуляторов внутри «инсуляторных телец» не было подтверждено экспериментально в течение многих лет.

В настоящий момент механизм действия инсуляторов изучен далеко не полностью. Существует несколько моделей их функционирования, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. В последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих, что инсуляторы являются регуляторными элементами с очень широким набором функций. Белки, традиционно воспринимаемые как компоненты инсуляторных комплексов, могут участвовать в процессах сегрегации хромосом и репарации ДНК (Мос1(тс^4) и СТСБ), регуляции клеточного цикла и дозовой компенсации (СТСБ"), в процессах, регулирующих структуру и свойства хроматина (Мос1(тс^4)). Все это позволяет рассматривать инсуляторы как регуляторные элементы, обладающие очень широким спектром действия, а явление инсуляции как составную часть глобального процесса регуляции транскрипциии в ядре в целом.

Кроме того, в настоящее время в связи с быстрым развитием биотехнологической промышленности, изучение структуры и механизмов функционирования инсуляторов приобретает ярко выраженное практическое значение. Барьерные свойства этих регуляторных элементов все чаще используются при создании различных геноинженерных конструкций, применяемых для продуцирования животных и растительных белков или же используемых в генотерапии ряда заболеваний. Однако для долговременного и безопасного функционирования трансгена в эукариотическом геноме необходимо учитывать все свойства регуляторных элементов, включенных в его состав. Поэтому, зависимость свойств регуляторных элементов, в том числе инсуляторов, от геномного окружения и их способность взаимодействовать между собой на больших дистанциях, безусловно, должны приниматься во внимание при планировании и оценке результатов экспериментов по эктопической интеграции генетического материала в геномы различных организмов.

Настоящая работа посвящена изучению роли 8и(Нлу)-зависимых инсуляторов в регуляции транскрипции, а также изучению функций и механизма формирования внутриядерных «инсуляторных телец».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AD (activation domain) — Активационный домен

LINE Long Interspersed Nuclear Element Длинный рассеянный (диспергированный) ядерный элемент

SINE Short Interspersed Nuclear Element Короткий рассеянный (диспергированный) ядерный элемент

HP1 Heterochromatin Protein 1 Гетерохроматиновый белок 1

PcG Polycomb Group Группа Поликомб

PRE Polycoinb Response elements Поликомб-реагирующий элемент

E(Z) Enhancer of Zeste Энхансер Zeste trxG Trithorax Group Группа Триторакс hGH human growth hormone Человеческий гормон роста

Ig (antibody) иммуноглобулин

GAL4 positive regulator of gene expression for the galactose-induced genes (4) Позитивный регулятор экспрессии галактозо-индуцированных генов

SAGA (Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase) complex facilitates the binding of TATA-binding protein (TBP) during transcriptional activation of the GAL1 gene oiSaccharomyces cerevisiae Ацетилтрансферазный комплекс, способствующий связыванию TBP у дрожжей

HS Hypersensitive site Гиперчувствительный сайт

HCNE High conservative no coding element высококонсервативный некодируюгций элемент

Lys lysine лизин

PCNA proliferating cell nuclear antigen Ядерный антиген клеточной пролиферации

ChIP Chromatin HMMyHonpeijHnHTaiiHfl Иммунопреципитация хроматина

TOPOR topoisomerase I-binding RING finger protein Связывающий топоизомеразу I белок, имеющий RING домен

RHES Ras homologue enriched in striatum Гомолог белка Ras

BEAF Boundary Element Associated Factors Фактор ассоциированный с граничными элементами

Mod(mdg4) Modifier of mdg4 Модификатор МДГ4

CP 190 Centrosomal protein 190kD Центросомный белок 190

Sn(Hw) Suppressor of Hairy-wing Суирессор крыловых волосков

CTCF Transcriptional repressor CTCF also known as 11-zinc finger protein or CCCTC-binding factor Транскрипционный репрессор, имеющий 11 «цинковых пальцев», связывается с последовательностью СССТС

SUMO Small Ubiquitin like Modifier небольшой убиквитин-подобный модификатор

SIM SUMO interaction motif Мотив взаимодействующий с SUMO

PML Progressive multifocal Ieukoencephalopathy промиелоцитарная лейкемия

GAF GAGA factor Белок ассоциированный с последовательное гыо GAGA

PIAS Protein Inhibitors of Activated STAT белок ингибитор активированного STAT

NE IF Negative elongation factor Негативный фактор элонгации

Ub ubiquitin. убиквитин

Ubis ubiquitin-like Небольшие убиквитин-подобные белки

GAP GTPase-Activating protein Ran-ГТФаза активирующий белок

Ran RAs-related Nuclear protein Ядерный белок подобный белкам семейства RAs

RING «Really Interesting New Gene» finger domain is a protein structural domain of zinc finger type which contains a Cys3HisCys4 amino acid motif which binds two zinc cations Структурный домен белков с «цинковыми пальцами», содержащий мотив Cys3HisCys4, связывающий 2 катиона цинка

Daxx death-domain-associated protein Белок содержащий «связанный со смертью» домен

NuRD multisubunit complex containing nucleosome remodeling and histone deacetylase activities Мультисубъединичный комплекс обладающий ремоделлирующей и гистон-деацетилазной активностями

Sir Silent information regulators Регуляторы сайленсинга

SWI/SNF yeast nucleosome remodeling complex composed of several proteins - products of the SWI and SNF genes Дрожжевой ремоделлирующий комплекс, состоящий из нескольких белков — продуктов генов SWI и SNF.

JRA Jun-related antigen. Mammalian JUN is a Транскрипционный фактор и онкоген млекопитающих transcription factor and oncogene.

SAP Amyloid P component, serum Амилоидный Р компонент

SU(UR) Suppressor of Under-Replication Супрессор недорепликации

BSA bovine serum albumine — Бычий сывороточный альбумин

CTD C-terminal domain — С-концевой домен

DBD DNA-binding domain — ДНК-связывающий домен

DPE downstream promoter element — Нижележащий элемент промотора

HDAC histone-deacetylase — Гистондеацетилаза

INI initiator — Инициатор

IP immunoprecipitation — Иммунопреципитация

LCR locus control region — Область контроля локуса

MAR matrix attachment region Участок прикрепления к матриксу

SAR Scaffold Associated Region Структурно организованный регион (ассоциированный с ядерным «скелетом»)

NLS nuclear localization signal — Сигнал ядерной локализации

Pol* RNA polymerase* — РНК-полимераза*

Su (var) suppressor of variegation Супрессор мозаичного эфекта положения

TF*A.II transcription factor for Pol* — Транскрипционный фактор Pol* a.o. — Аминокислотный остаток

П.Н. - Пары нуклеотидов

Т.П.Н. - Тысяча пар нуклеотидов

МДГ4 Мобильный диспергированный ген 4

UAS upstream activator sequence — Вышележащая активирующая последовательность

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Головнин, Антон Клеменсович

выводы

4. Предложена новая модель действия инсуляторов, основанная на взаимодействии между Su(Hw) инсуляторами.

5. Выявлено, что взаимодействие Su(Hw) инсуляторов является ориентационно-зависимым и способно либо стимулировать, либо блокировать ассоциацию расположенных на большом расстоянии друг от друга белковых комплексов.

7. В геноме Drosophila melanogaster впервые обнаружен эндогенный Su(Hw)-зависимый инсулятор. Описаны его инсуляторные, нейтрализующие и барьерные свойства.

8. С помощью модификации метода анализа взаимодействия белков в дрожжевой двугибридной системе показано, что в белке Mod(mdg4)-67.2 содержится второй домен, который, помимо BTB/POZ домена, приводит к димеризации белка. Продемонстрировано, что идентифицированный домен белка Mod(mdg4)-67.2 необходим для эффективной гетеродимеризации с ВТВ-содержащим белком GAF.

9. Доказано, что специфический ВТВ домен белка Mod(mdg4)-67.2 необходим для его связывания с инсулятором Su(Hw). Замена ВТВ домена белка Mod(mdg4)-67.2 на аналогичный домен белка GAF приводит к потере взаимодействия химерного белка с Su(Hw) инсулятором ш vivo. В отличие от нормального белка Mod(mdg4)-67.2 химерный белок не способен участвовать в формировании «инсуляторных телец».

11. Доказано отсутствие прямой взаимосвязи между образованием внутриядерных «инсуляторных телец» и 8и(Н\у)-зависимой инсуляцией у Drosophila melanogaster.

13. Продемонстрировано, что инсуляторный белок CP 190 играет ключевую роль в образовании «инсуляторных телец».

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Головнин, Антон Клеменсович, Москва

1. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сиб.унив.изд-во, 2006г. стр 254

2. Жимулев И.Ф., Беляева Е.С., Колесникова Т.Д., Волкова Е.И. Интеркалярный гетерохроматин и проблема сайленсинга. Вестник ВОГиС. 2004, Т. 8, № 2

3. Жимулев И.Ф. Молекулярная и генетическая организация гетерохроматина в хромосомах дрозофилы. Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6 №2

4. Жимулёв И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск, Наука, 1993

5. Патрушев Л.И., Экспрессия генов. М.: Наука, 2000.Стр. 289

6. Сингер М., Берг П., Гены и геномы: в 2-х т. М.: Мир, 1998.- 391 с.

7. Страйер Л., Биохимия: в 3-х т. Т.З М.: Мир, 1985.Стр.128

8. Abney J, Cutler В, Fillbach М, Axelrod D, Scalettar В. Chromatin dynamics in interphase nuclei and its implications for nuclear structure // J Cell Biol. 1997 V. 137 P. 1459-1468

9. Abranches R, Beven A, Aragón-Alcaide L, Shaw P. Transcription sites are not correlatedwith chromosome territories inwheatnuclei // J. Cell Biol. 1998 V.143 P.5-12.

10. Ahmad K, Melnick A, Lax S, Bouchard D, Liu J, Kiang C, Mayer S, Takahashi S, Licht J, Prive G. Mechanism of SMRT corepressor recruitment by the BCL6 BTB domain. // Mol. Cell. 2003. V.12. P.1551-1564.

11. Ahmad K, Golic KG. The transmission of fragmented chromosomes in Drosophila melanogaster // Genetics 1998 V.148 P.775-792

12. Andrews EA, Palecek J, Sergeant J, Taylor E, Lehmann AR, Watts FZ. Nse2, a component of the Smc5-6 complex, is a SUMO ligase required for the response to DNA damage. Mol Cell Biol. 2005 V.25 P.185-196.

13. Andrulis E, Neiman A, Zappulla D, Sternglanz R. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. //Nature. 1998. V.394. P.592-595.

14. Apionishev S, Malhotra D, Raghavachari S, Tanda S, Rasooly RS. The Drosophila UBC9 homologue lesswright mediates the disjunction of homologues in meiosis I. // Genes Cells 2001. V.6. P.215-224.

15. Azuma Y, Tan SH, Cavenagh MM, Ainsztein AM, Saitoh H, Dasso M. Expression and regulation of the mammalian SUMO-1 El enzyme. // FASEB J. 2001. V. 15. P. 1825-1827.

16. Baba D, Maita N, Jee JG, Uchimura Y, Saitoh H, Sugasawa K, Hanaoka F, Tochio H, Hiroaki H, Shirakawa M. Crystal structure of thymine DNA glycosylase conjugated to SUMO-1 //Nature. 2005 V.435 P.979-982.

17. Babiarz J, Halley J, Rine J. Telomeric heterochromatin boundaries require NuA4-dependent acetylation of histone variant H2A.Z in Saccharomyces cerevisiae. // Genes Dev. 2006. V.20. P.700-710.

18. Bae E, Calhoun V, Levine M, Lewis E, Drewell R. Characterization of the intergenic RNA profile at abdominal-A and Abdominal-B in the Drosophila bithorax complex // Proc Natl Acad Sci USA. 2002 V.99 P.16847-16852.

19. Baldwin ML, Julius JA, Tang X, Wang Y, Bachant J. The yeast SUMO isopeptidase Smt4/Ulp2 and the polo kinase Cdc5 act in an opposing fashion to regulate sumoylation in mitosis and cohesion at centromeres // Cell Cycle. 2009 V.8 P.3406-3419

20. Baniahmad A, Steiner C, Kohne AC, Renkawitz R. Modular structure of a chicken lysozyme silencer: involvement of an unusual thyroid hormone receptor binding site. // Cell. 1990. V.61. P.505—514.

21. Bartkuhn M, Straub T, Herold M, Herrmann M, Rathke C, Saumweber H, Gilfillan G, Becker P, Renkawitz R. Active promoters and insulators are marked by the centrosomal protein 190 // EMBO J. 2009 V.28 P.877-88S.

22. Bawa-Khalfe T, Cheng J, Wang Z, Yeh ET. Induction of the SUMO-specific protease 1 transcription by the androgen receptor in prostate cancer cells // J Biol Chem. 2007 V.282 P.37341-37349.

23. Bayer P, Arndt A, Metzger S, Mahajan R, Melchior F, et al. Structure determination of the small ubiquitin-related modifier SUMO-1. // J. Mol. Biol. 1998. V.280. P.275-286.

24. Beato M and Eisfeld K. Transcription factor access to chromatin. // Nucleic Acids Res. 1997 V.25 P.3559—3563.

25. Belenkaya T, Barseguyan K, Hovhannisyan H, Biryukova I, Kochieva EZ, Georgiev P. P element sequences can compensate for a deletion of the yellow regulatory region in Drosophila melanogaster // Mol Gen Genet. 1998 V.259 P.79-87.

26. Bell A, Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. //Nature. 2000. V.405. P.482-485.

27. Bell A, West A, Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. // Cell. 1999. V.98. P.387-396.

28. Belozerov V, Majumder P, Shen P, Cai H. A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila // EMBO J. 2003 V.22 P.3113-3121.

29. Bencsath KP, Podgorski MS, Pagala VR, Slaughter CA, Schulman BA. Identification of a multifunctional binding site on Ubc9p required for Smt3p conjugation. // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.47938—47945.

30. Bemardi R, Pandolfi PP. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies //Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 V.8 P. 1006-1016.

31. Bernier-Villamor V, Sampson DA, Matunis MJ, Lima CD. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAPl. // Cell. 2002. V.108. P.345-356.

32. Bies J, Markus J, Wolff L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity // J Biol Chem. 2002 V.277 P.8999-9009.

33. Blackwood E, Kadonaga J. Going the distance: a current view of enhancer action. // Science. 1998. V.281 P.60-63.

34. Blanton J, Gaszner M, Schedl P. Protein: protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. // Gen.Dev. 2003. V.17. P.664-675.

35. Blobel G. Gene gating: a hypothesis. // PNAS. 1985. V.82. P.8527-8529.

36. Boddy MN, Howe K, Etkin LD, Solomon E, Freemont PS. PIC 1, a novel ubiquitin-like protein which interacts with the PML component of a multiprotein complex that is disrupted in acute promyelocytic leukaemia. // Oncogene 1996. V.13. P.971-982.

37. Bondarenko VA, Liu YV, Jiang YI, Studitsky VM. Communication over a large distance: enhancers and insulators. // Biochem. Cell Biol. 2003 Vol.81. P.241-251.

38. Branco M, Pombo A. Intermingling of chromosome territories in interphase suggests role in translocations and transcription-dependent associations // PLoS Biol. 2006 V.4 P. 138

39. Brown C, Silver P. Transcriptional regulation at the nuclear pore complex. // Current Opinion in Genetics & Development. 2006. V.17. P. 1-7.

40. Buchner K, Roth P, Schotta G, Krauss V, Saumweber II, Reuter G, Dorn R. Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. //Genetics. 2000. V. 155. P.141-157.

41. Burgess-Beusse B, Farrell C, Gaszner M, Litt M, Mutskov V, Recillas-Targa F, Simpson M, West A, Felsenfeld G. The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2002. V.99. P.16433-16437.

42. Bushey A, Ramos E, Corces V. Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions // Genes Dev. 2009 V.23 P.1338-1350.

43. Bylebyl GR, Belichenko I, Johnson ES. The SUMO isopeptidase Ulp2 prevents accumulation of SUMO chains in yeast. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.44113-44120.

44. Byrd K, Corces V. Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila // J Cell Biol. 2003V. 162 P.565-574.

45. Cai H, Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. //Nature. 1995 V.376. P.533-536.

46. Cai HN, Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. // Science. 2001. V.291. P.493^195.

47. Cai HN, Zhang Z, Adams JR, Shen P.Genomic context modulates insulator activity through promoter competition. // Development. 2001. V.128. P.4339-4347.

48. Cajiao I, Zhang A, Yoo EJ, Cooke NE, Liebhaber SA. Bystander gene activation by a locus control region. // EMBO J. 2004 V.23(19). P.3854-3863.

49. Cam H, Sugiyama T, Chen S, Chen X, Fitzgerald C, Grewal S. Comprehensive analysis of heterochromatin- and RNAi-mediated epigenetic control of the fission yeast genome. // Nat.Genet. 2005. V.37. P.809-819.

50. Campuzano S, Carramolino L, Cabrera CV, Ruiz-Gomez M, Villares R, Boronat A, Modolell J. Molecular genetics of the achaete-scute gene complex of D. melanogaster. // Cell. 1985. V.40(2) P.327-338.

51. Capelson M, Corces VG. The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. // Mol. Cell. 2005. V.20. P.105-116.

52. Capelson M. and Corees VG. SUMO conjugation attenuates the activity of the gypsy chromatin insulator // The EMBO Journal. 2006.

53. Capili A, Lima C. Structure and analysis of a complex between SUMO and Ubc9 illustrates features of a conserved E2-Ubl interaction // J Mol Biol. 2007 V.369 P.608-618.

54. Carey M. Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. // Mol. Cell. 1998. V.10. P.227-236.

55. Carey M. The enhanceosome and transcriptional synergy. // Cell. 1998. V.92. P.5-8.

56. Carmena A, Bate M, Jiménez F. Lethal of scute, a proneural gene, participates in the specification of muscle progenitors during Drosophila embryogenesis // Genes Dev. 1995 V.9 P.2373-2383.

57. Casolari J, Brown C, Drubin D, Rando O, Silver P. Develomentally induced changes in transcriptionally programm alter spatial organization across chromosomes. // Gen.Dev. 2005. V.19. P.1188-1198.

58. Casolari J, Brown C, Komili S, West J, Hieronimus H, Silver P. Genome-wide localization of the nuclear transport machinary couples transcriptional status and nuclear organization. // Cell. 2004. V.l 17. P.427-439.

59. Cliambeyron S, Da Silva N, Lawson K, Bickmore W. Nuclear reorganization of the Hoxb complex during mouse embryonic development // Development 2005 V.l32 P.2215-2223.

60. Chen A, Mannen H, Li SS. Characterization of mouse ubiquitin-like SMT3A and SMT3B cDNAs and gene/pseudogenes. //Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V.46. P.l 161-1174.

61. Chopra V, Cande J, Hong J, Levine M. Stalled Hox promoters as chromosomal boundaries // Genes Dev. 2009 V.23 P. 1505-1509.

62. Chuang C, Carpenter A, Fuchsova B, Johnson T, de Lanerolle P, Belmont A. Long-range directional movement of an interphase chromosome site // Curr. Biol. 2006 V.l 6 P.825-831.

63. Chubb J, Boyle S, Perry P, Bickmore W. Chromatin motion is constrained by association with nuclear compartments in human cells // J. Cell Biol. 2002 V.12 P.439^145

64. Chung J, Whitely M, Felsenfeld G. A 5' element of the chicken b-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. // Cell. 1993. V.74. P.505-514.

65. Cleard F, Moshkin Y, Karch F, Maeda R. Probing long-distance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification. // Nat Genet. 2006. V.38. P.931-935.

66. González F, Romani S, Cubas P, Modolell J, Campuzano S. Molecular analysis of the ásense gene, a member of the achaete-scute complex of Drosophila melanogaster, and its novel role in optic lobe development // EMBO J. 1989 V.8 P. 3553-3562.

67. Cremer T, Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells // Nat Rev Genet. 2001 V.2 P.292-301

68. Crevel G, Huikeshoven H and Cotterill S. Df31 is a novel nuclear protein involved in chromatin structure in Drosophila melanogaster. J. Cell Sci. 2001 V.114 P.37—47.

69. Csink A, Henikoff S. Genetic modification of heterochromatic association and nuclear organization in Drosophila//Nature. 1996 V.381 P.529-531

70. Dehghani H, Dellaire G, Bazett-Jones D. Organization of chromatin in the interphase mammalian cell // Micron 2005 V.36 P.95-108.

71. Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N. Capturing chromosome conformation. // Science. 2002. V.295. P.1306—1311.

72. Dellaire G, Bazett-Jones D. PML nuclear bodies: dynamic sensors of DNA damage and cellular stress. // Bioessays 2004 V.26 P.963-977

73. Denning D, Mykytka B, Allen N, Huang L, A1 B, Rexach M. The nucleoporin Nup60p functions as a Gsplp-GTP-sensitive tether for Nup2p at the nuclear pore complex. // J.Cell Biol. 2001. V.154. P.937-950.

74. Dernburg A, Broman K, Fung J, Marshall W, Philips J, Agard D, Sedat J. Perturbation of nuclear architecture by long-distance chromosome interactions // Cell. 1996 V.85 P.745-759.

75. Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT. SUMO-1 modification of IkappaBalpha inhibits NF-kappaB activation.//Mol. Cell. 1998. V.2. P.233-239.

76. Desterro JM, Rodriguez MS, Kemp GD, Hay RT. Identification of the enzyme required for activation of the small ubiquitin-like protein SUMO-1. // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.10618-10624.

77. Dillon N, Grosveld F. Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. V.4. P.260-264.

78. Dilworth D, Suprapto A, Padovan J, Chait B, Wozniak R, Rout M, Aitchison J. Nup2p dynamically associates with the distal regions of the yeast nuclear pore complex. // J.Cell Biol. 2001. V.153. P.1465—1478.

79. Donze D, Kamakaka R. RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae. // EMBO J. 2001. V.20. P.520— 531.

80. Donze D., Adams C, Rine J, Kamakaka R. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae. // Genes Dev. 1999. V.13. P.698-708.

81. Dorsett D. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V.9. P.505-514.

82. Dorsett D. Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila// Genetics. 1993 V.134 P. 1135-1144.

83. Drissen R, Palstra R, Gillemans N, Splinter E, Grosveld F, Philipsen S, de Laat W. The active spatial organization of the (3-globin locus requires the transcription factor EKLF. // Genes Dev. 2004. 18. P.2485-2490.

84. Duboule D. The rise and fall of Hox gene clusters // Development. 2007 V.134 P.2549-2560

85. Faro-Trindade I, Cook P. Transcription factories: structures conserved during differentiation and evolution. // Biochem Soc Trans. 2006 V.34 P.1133-1137

86. Fiering S, Whitelaw E, Martin D. To be or not to be active: the stochastic nature of enhancer action. // Bioessays. 2000 V.22 P.381-387.

87. Endter C, Kzhyshkowska J, Stauber R, Dobner T. SUMO-1 modification required for transformation by adenovirus type 5 early region IB 55-kDa oncoprotein. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 V.98 P.l 1312-11317.

88. Engel N, Bartolomei S. Mechanisms of insulator function in gene regulation and genomic imprinting. // hit.Rev.Cyto!. 2003. V.232. P.89-127.

89. Engstrom P, Ho S, Drivenes O Becker T and Lenhard B. Genomic regulatory blocks underlie extensive microsynteny conservation in insects. // Genome Res. 2007.V.17 P.1898—1908

90. Epner E, Reik A, Cimbora D, Telling A, Bender MA, et al. The beta-globin LCR is not necessary for an open chromatin structure or developmentally regulated transcription of the native mouse beta-globin locus. // Mol. Cell. 1998. V.2. P.447-455.

91. Epps JL, Tanda S. The Drosophila semushi mutation blocks nuclear import of bicoid during embryogenesis. //Curr. Biol. 1998. V.8. P.1277-1280.

92. Espinas M, Jimenez-Garcia E, Vaquero A, Canudas S, Bernues J, Azorin F. The N-terminal POZ domain of GAGA mediates the formation of oligomers that bind DNA with high affinity and specificity. // J.Biol.Chem. 1999. V.274. P.16461-16469.

93. Everett RD, Lomonte P, Sternsdorf T, van Driel R, Orr A. Cell cycle regulation of PML modification and ND10 composition // J Cell Sci. 1999 V.l 12 P.4581-4588.

94. Farrell C, West A, Felsenfeld G. Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human p-globin loci. // Mol.Cell.Biol. 2002. V.22. P.3820-3831.

95. Fiering S, Whitelaw E, Martin DI. To be or not to be active: the stochastic nature fly: different paths, same destinations. //Mol. Cell. 2005. V.l 8. P.395-398.

96. Fischer A, Kroppenstedt RM, Stackebrandt E. Molecular-genetic and chemotaxonomic studies on Actinomadura and Nocardiopsis // J Gen Microbiol. 1983 V.129 P.3433-3446

97. Fedoriw A, Stein P, Svoboda P, Schultz R, Bartolomei M. Transgenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting. // Science. 2004. V.303. P.238-240.

98. Filippova G, Thienes C, Penn B, Cho D, Hu Y, Moore J, Klesert T, Lobanenkov V, Tapseott S. CTCF-binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation-sensitive insulator at the DM1 locus. //NatGenet. 2001. V.28 P.335-343.

99. Fourel G, Boscheron C, Revardel E, Lebrun E, Hu Y, Simmen K, Muller K, Li R, Mermod N, Gilson E. An activationindependent role of transcription factors in insulator function. // EMBO Rep. 2001. V.2. P.124-132.

100. Fourel G, Revardel E, Koering C, Gilson E. Cohabitation of insulators and silencing elements in yeast subtelomeric regions. // EMBO J. 1999. V.18. P.2522-2537.

101. Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. // Nature. 2000. V.408. P.325-330.

102. Galy V, Olivo-Marin J, Scherthan H, Doye V, Rascalou N, Nehrbass U. Nuclear pore complexes in the organization of silent telomeric chromatin. // Nature. 2000. V.403. P. 108112.

103. Gasser S. Visualizing chromatin dynamics in interphase nuclei // Science 2002 V.296 P.1412—1416

104. Gaszner M, Felsenfeld G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. //Nature Reviews Genetics. 2006. V.7. P.703-713.

105. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. // Genes Dev. 1999. V.13. P.2098-2107.

106. Gause M, Hovhannisyan H, Kan T, Kuhfittig S, Mogila V, Georgiev P. hobo Induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. // Genetics. 1998 V.149. P. 1393-1405.

107. Gdula DA, Corces VG. Characterization of functional domains of the Su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. // Genetics. 1997. V.145. P.153-161.

108. Geiss-Friedlander R, Melchior F. Concepts in sumoylation: a decade on // Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 V.8 P.947-956.

109. Georgiev P., Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. // Genetics. 1996. V.142. P.425-436.

110. Gerasimova T, Lei E, Bushey A, Corces V. Coordinated control of dCTCF and gypsy chromatin insulators in Drosophila // Mol Cell. 2007 V.28 P.761-772.

111. Gerasimova T, Gdula D, Gerasimov D, Simonova O, Corces V. A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation // Cell. 1995 V.82 P.587-597.

112. Gerasimova TI, Byrd K, Corces VG. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. //Mol. Cell. 2000. V.6. P. 1025-1035.

113. Gerasimova TI, Corces VG. Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization. // Annu. Rev. Genet. 2001. V.35. P.193-208.

114. Gerasimova TI, Corces VG. Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. // Cell. 1998. V.92. P.511-521.

115. Geyer PK. The role of insulator elements in defining domains of gene expression. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V.7. P.242-248.

116. Geyer P, Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. // Genes Dev. 1992. V.6. P.1865-1873.

117. Geyer P, Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. // Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

118. Geyer PK, Spana C, Corces VG. On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J. 1986 V.5 P.2657-2662.

119. Geiss-Friedlander R, Melchior F. Concepts in sumoylation: a decade on // Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 V.8 P.947-956.

120. Ghosh D, Gerasimova T, Corces V. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.

121. Gill,G. Something aboutSUMOinhibits transcription. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. V.15. P.536 — 541.

122. Girdwood D, Bumpass D, Vaughan OA, Thain A, Anderson LA, Snowden AW, GarciaWilson E, Perkins ND, Hay RT. P300 transcriptional repression is mediated by SUMO modification//Mol Cell. 2003 V.ll P.1043-1054.

123. Go lie KG. Local transposition of P elements in Drosophila melanogaster and recombination between duplicated elements using a site-specific recombinase // Genetics 1994 V.l37 P. 551-563

124. Golic KG, Lindquist S The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989 V.59 P.499-509.

125. Golovnin A, Birukova I, Romanova O, Silicheva M, Parshikov A, ct al. An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. // Development 2003. V.130. P.3249-3258.

126. Golovnin A, Gause M, Georgieva S, Gracheva E, Georgiev P. The su(Hw) insulator can disrupt enhancer-promoter interactions when located more than 20 kilobases away from the Drosophila achaete-scute complex // Mol Cell Biol. 1999 V.19 P.3443-3456.

127. Gong L, Millas S, Maul GG, Yeh ET. Differential regulation of sentrinized proteins by a novel sentrin-specific protease // J Biol Chem. 2000V.275 P.3355-3359.

128. Gong L, Yeh ET. Characterization of a family of nucleolar SUMO-specific proteases with preference for SUMO-2 or SUMO-3 // J Biol Chem. 2006 V.281 P.15869-15877.

129. Gotta M, Laroche T, Pormenton A, Maillet L, Scherthan H, Gasser S. The clustering of telomeres and colocalization with Rapl, Sir3, and Sir4 proteins in wild-type Saccharomyces cerevisiae. // J.Cell Biol. 1996. V.134 P.1349-1363.

130. Haldar D, Kamakaka R. tRNA genes as chromatin barriers. // Nat.Struct.Mol.Biol. 2006. V.13. P.192—193.

131. Hall I, Noma K, Grewal S. RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast // Proc Natl Acad Sci USA. 2003 V.100 P.193-198.

132. Han L, Lee D, Szabo P. CTCF is the master organizer of domain-wide allele-specific chromatin at the H19/Igf2 imprinted region // Mol Cell Biol. 2008 V.28 P. 1124-1135

133. Handwerger K, Gall J. Subnuclear organelles: new insights into form and function. // Trends Cell Biol. 2006 V.16 P. 19-26.

134. Hang J, Dasso M. Association of the human SUMO-1 protease SENP2 with the nuclear pore // J Biol Chern. 2002 V.277 P.l9961-19966.

135. Hannich JT, Lewis A, Kroetz MB, Li SJ, Heide H, Emili A, Hochstrasser M. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem. 2005 V.80 P.4102-4110.

136. Hardeland U, Steinacher R, Jiricny J, Schar P. Modification of the human thymine-DNA glycosylase by ubiquitin-like proteins facilitates enzymatic turnover. // EMBO J. 2002. V.21. P.1456—1464.

137. Hari KL, Cook KR, Karpen GH. The Drosophila Su(var)2-10 locus regulates chromosome structure and function and encodes a member of the PIAS protein family // Genes Dev. 2001 Y.15 P. 1334-1348

138. Hark A, Schoenherr C, Katz D, Ingram R, Levorse J, Tilghman S. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. // Nature. 2000. V.405. P.486-489

139. Harrison D. A., Gdula D. A., Coyne R.S., Corces V. G. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function. // Genes Dev. 1993. V.7. P. 1966-1978.

140. Hashimoto N, Brock H, Nomura M, Kyba M, Hodgson J, Fujita Y, Takihara Y, Shimada K, Higashinakagawa T. // RAE28, BMI1, and M33 are members of heterogeneous multimeric mammalian Polycomb group complexes. Biochem Biophys Res Commun. 1998 V.245 P.356-65.

141. Hay, R. T. Role of ubiquitin-like proteins in transcriptional regulation. // Ernst Schering Res. Found. Workshop, 2006. P. 173 192.

142. Hayashi T, Seki M, Maeda D, Wang W, Kawabe Y, et al. Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells. // Exp. Cell Res. 2002. V.280. P.212-221.

143. Hebbes T, Allen S. Multiple histone acetyltransferases are associated with a chicken erythrocyte chromatin fraction enriched in active genes // J Biol Chem. 2000 V.275 P.31347-31352.

144. Hentges K, Pollock D, Liu B, Justice M. Regional variation in the density of essential genes in mice // PLoS Genet. 2007 V.3 P.72

145. Hershko A, Ciechanover A. The ubiquitin system. // Annu.Rev. Biochem. 1998. V.67. P.425-479.

146. Hirano Y, Murata S, Tanaka K, Shimizu M, Sato R. Sterol regulatory element-binding proteins are negatively regulated through SUMO-1 modification independent of the ubiquitin/26 S proteasome pathway // J Biol Chem. 2003 V.278 P. 16809-16819.

147. Hochstrasser M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. //Cell 2001. V. 107. P.5-8.

148. Hoeller D, Hecker CM, Wagner S, Rogov V, Dotsch V, Dikic I. E3-independent monoubiquitination of ubiquitin-binding proteins //Mol Cell. 2007 V.26 P.891-898.

149. Hogga I, Karch F. Transcription through the iab-7 cis-regulatory domain of the bithorax complex interferes with maintenance of Polycomb-mediated silencing // Development. 2002 V.29 P.4915-4922.

150. Hoege C, Pfander B, Moldovan GL, Pyrowolakis G, Jentsch S. RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO. // Nature 2002.

151. Hofmann, T.G., Will, H. Body language: the function of PML nuclear bodies in apoptosis regulation. // Cell Death Differ. 2003. V.10. P.1290-1299.

152. Hollenbach AD, McPherson CJ, Mientjes EJ, Iyengar R, Grosveld G. Daxx and histone deacetylase II associate with chromatin through an interaction with core histones and the chromatin-associated protein Dek // J Cell Sci. 2002 V. 115 P.3319-3330.

153. Holmgren C, Kanduri C, Dell G, Ward A, Mukhopadhya R, Kanduri M, Lobanenkov V, Ohlsson R. CpGmethylation regulates the Igf2/H19 insulator. // Curr.Biol. 2001. V.ll. P.l128-1130

154. Holohan E, Kwong C, Adryan B, Bartkuhn M, Herold M, Renkawitz R, Russell S, White R. CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of the bithorax complex. // PLoS Genetics. 2007. V.3. P.el 12.

155. Hong Y, Rogers R, Matunis MJ, Mayhew CN, Goodson ML, Park-Sarge OK, Sarge KD. Regulation of heat shock transcription factor 1 by stress-induced SUMO-1 modification // J Biol Chem. 2001 V.276 P.40263-40267.

156. Howe K, Williamson J, Boddy N, Sheer D, Freemont P, Solomon E. The ubiquitin-homology gene PIC1: characterization of mouse (Picl) and human (UBL1) genes and pseudogenes. // Genomics 1998.V.47. P.92-100.

157. HoY, Elefant F, Cooke N, Liebhaber S. A defined locus control region determinant links chromatin domain acetylation with long-range gene activation. // Mol. Cell. 2002. V.9. P.291-302.

158. Horie K, Tomida A, Sugimoto Y, Yasugi T, Yoshikawa H, Taketani Y, Tsuruo T. SUMO-1 conjugation to intact DNA topoisomerase I amplifies cleavable complex formation induced by camptothecin // Oncogene. 2002 V.21 P.7913-7922.

159. Huang K, Diener DR, Rosenbaum JL. The ubiquitin conjugation system is involved in the disassembly of cilia and flagella // J Cell Biol. 2009 V. 186 P.601-613.

160. Ishii K, Arib G, Lin C, Van Houwe G, Laemmli U. Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection. // Cell. 2002. V.109. P.551-562.

161. Itahana Y, Yeh ET, Zhang Y. Nucleocytoplasmic shuttling modulates activity and ubiquitination-dependent turnover of SUMO-specific protease 2 // Mol Cell Biol. 2006 V.26 P.4675-4689

162. Jack J, Dorsett D, Delotto Y, Liu S. Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development// 1991 V.113 P.735-747.

163. Jackson PK. A new RING for SUMO: wrestling transcriptional responses into nuclear bodies with PIAS family E3 SUMO ligases. // Genes Dev.2001. V.15. P.3053-3058.

164. Jensen, K., Shiels, C., Freemont, P.S. PML protein isoforms and the RBCC/TRIM motif. // Oncogene. 2001. V.20. P.7223-7233.

165. Jiang N, Emberly E, Cuvier O, Hart C. Genome-wide mapping of boundary element-associated factor (BEAF) binding sites in Drosophila melanogaster links BEAF to transcription // Mol Cell Biol. 2009V.29 P.3556-3568.

166. Johnson Erica S. Protein modification by sumo 2004. // Annu. Rev. Biochem. V.73. P.355-382.

167. Johnson ES, Blobel G. Ubc9p is the conjugating enzyme for the ubiquitin-like protein Smt3p. // J. Biol. Chcm. 1997. V.272. P.26799-26802.

168. Johnson ES, Blobel G. Cell cycle-regulated attachment of the ubiquitin-related protein SUMO to the yeast septins. // J. Cell Biol. 1999. V.147. P.981-994.

169. Johnson ES, Gupta AA. An E3-like factor that promotes SUMO conjugation to the yeast septins. // Cell 2001. V.106. P. 735-744.

170. Johnson ES, Schwienhorst I, Dohmen RJ, Blobel G. The ubiquitin-like protein Smt3p is activated for conjugation to other proteins by an Aoslp/Uba2p heterodimer. // EMBO J. 1997. V.16. P.5509—5519.

171. Jones D, Crowe E, Stevens TA, Candido EP. Functional and phylogenetic analysis of the ubiquitylation system in Caenorhabditis elegans: ubiquitin-conjugating enzymes, ubiquitin-activating enzymes, and ubiquitin-like proteins. // Genome Biol. 2002.

172. Joseph J, Tan SH, Karpova TS, McNally JG, Dasso M. SUMO-1 targets RanGAPl to kinetochores and mitotic spindles // J Cell Biol. 2002V. 156 P.595-602.

173. Kagey Mil, Melhuish TA, Wotton D. The polycomb protein Pc2 is a SUMO E3. // Cell 2003. V.113. P.127—137.

174. Kahyo T, Nishida T, Yasuda H. Involvement of PIAS1 in the sumoylation of tumor suppressor p53. // Mol. Cell. 2001. V.8. P.713-718.

175. Kamath R, Fraser A, Dong Y, Poulin G, Durbin R, Gotta M, Kanapin A, Le Bot N, Moreno S, Sohrmann M, Welchman D, Zipperlen P, Ahringer J. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi // Nature. 2003 V.421 P.231-237.

176. Kamitani T, Kito K, Nguyen HP, Fukuda-Kamitani T, Yeh ET. Characterization of a second member of the sentrin family of ubiquitin-like proteins. // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.11349-11353.

177. Kamitani T, Nguyen HP, Yeh ET. Characterization of NEDD8, a developmentally down-regulated ubiquitin-like protein. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.14001-14004.

178. Karch F, Weiffenbach B, Peifer M, Bender W, Duncan I, Celniker S, Crosby M, Lewis E. The abdominal region of the bithorax complex // Cell. 1985 V.43 P.81-96.

179. Karess R, Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila. // Cell. 1984. V.38P.135-146.

180. Kato Y, Sasaki H. Imprinting and looping: epigenetic marks control interactions between regulatory elements. // BioEssays. 2005. V.27. P. 1-4.

181. Katsani K, Hajibagheri M, Verrijzer C. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology. // EMBO J. 1999. V.18. P.698-708.

182. Kellum R, Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. //Mol. Cell Biol. 1992. V.12. P.2424-2431.

183. Kellum R, Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. // Cell. 1991. V.64. P.941-950.

184. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. //Mol. Cel. Biol.1992. V.12. P.2424-2431.

185. Kerscher O, Felberbaum R, Hochstrasser M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins // Annu Rev Cell Dev Biol. 2006 V.22 P. 159-180.

186. Kerscher O. SUMO junction-what's your function? New insights through SUMO-interacting motifs // EMBO Rep. 2007 V.8 P.550-5.

187. Kim A, Dean A. Developmental stage differences in chromatin subdomains of thebeta-globin locus. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. V.101. P.7028-7033

188. Kim J., Shen B., Rosen C., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. // Mol. Cel. Biol. 1996. V.16. P.3381-3392.

189. Kim KI, Baek SH, Chung CH. Versatile protein tag, SUMO: its enzymology and biological function. // J. Cell Physiol. 2002. V.191. P.257-268.

190. Kimura A, Horikoshi M. Partition of distinct chromosomal regions: negotiable border and fixed border. // Genes Cells 2004. V.9. P.499-508.

191. Kimura A, Umehara T, Horikoshi M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. // Nat.Genet. 2002. V.32. P.370-377.

192. Kirsh O, Seeler JS, Pichler A, Gast A, Müller S, Miska E, Mathieu M, Harel-Bellan A, Kouzarides T, Melchior F, Dejean A. The SUMO E3 ligase RanBP2 promotes modification of the HDAC4 deacetylase //EMBO J. 2002 V.21 P.2682-2691

193. Kobor M, Venkatasubrahmanyam S, Meneghini M, Gin J, Jennings J, Link A, Madhani H, Rine J. A protein complex containing the conserved Swi2/Snf2-related ATPase Swrlp deposits histone variant H2A.Z into euchromatin. // PLoS Biol. 2004. V.2. P.E131

194. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. // Genes Dev. 2004. V.18. P. 1371-1384.

195. Kotaja N, Karvonen U, Janne OA, Palvimo JJ. PIAS proteins modulate transcription factors by functioning as SUMO-1 ligases // Mol Cell Biol. 2002 V.22 P.5222-5234

196. Krebs, J.E., Fry, C.J., Samuels, M.L., and Peterson, C.L. Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression. // Cell. 2000. V.102. P.587-598.

197. Kroetz MB, Su D, Ilochstrasser M. Essential role of nuclear localization for yeast Ulp2 SUMO protease function // Mol Biol Cell. 2009 V.20 P.2196-2206.

198. Kuhn EJ, Viering MM, Rhodes KM, Geyer PK. A test of insulator interactions in Drosophila. // EMBO J. 2003. V.22. P.2463-2471.

199. Kumaran R, Spector D. A genetic locus targeted to the nuclear periphery in living cells maintains its transcriptional competence // J Cell Biol. 2008 V.180 P.51-65.

200. Kurz A, Lampel S, Nickolenko J, Bradl J, Benner A, Zirbel R, Cremer T, Lichter P. Active and inactive genes localize preferentially in the periphery of chromosome territories // J Cell Biol. 1996 V.135P.1195-1205

201. Kusch T, Guelman S, Abmayr SM, Workman JL. Two Drosophila Ada2 homologues function in different multiprotein complexes // Mol Cell Biol. 2003 V.23 P.3305-3319

202. Kyrchanova O, Toshchakov S, Parshikov A, Georgiev P. Drosophila bithorax complex: effects of insulator pairing on the enhancer-promoter communication. // Mol Cell Biol. 2007 V.27. P.3035-3043.

203. Labrador M, Sha K, Li A, Corces VG. Insulator and Ovo proteins determine the frequency and specificity of insertion of the gypsy retrotransposon in Drosophila melanogaster // Genetics. 2008 V.180 P. 1367-1378.

204. Laemmli UK, Kas E, Poljak L, Adachi Y. Scaffold-associated regions: cis-acting determinants of chromatin structural loops and functional domains. // Curr Opin Genet Dev. 1992 V.2 P.275-85

205. Lanzuolo C, Roure V, Dekker J, Bantignies F, Orlando V. Polycomb response elements mediate the formation of chromosome higher-order structures in the bithorax complex // Nat Cell Biol. 2007 V.9 P.l 167-1174.

206. Lee J, Jayaram M. A tetramer of the Flp recombinase silences the (rimers within it during resolution of a Holliday junction substrate // Genes Dev 1997 V.l 1 P.243 8-2447

207. Lee P, Chang C, Liu D, Derynck R. Sumoylation of Smad4, the common Smad mediator of transforming growth factor-beta family signaling. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.27853— 27863.

208. Lee J. Molecular links between X-inactivation and autosomal imprinting: X-inactivation as a driving force for the evolution of imprinting? // Curr Biol. 2003. V.13. P.R242-R254.

209. Lee J, Sonnhammcr E. Genomic gene clustering analysis of pathways in eukaryotcs. // Genome Res. 2003 V.13 P.875-882.

210. Lee D, Teyssier C, Strahl BD, Stallcup MR. Role of protein methylation in regulation of transcription // Endocr Rev. 2005 V.26 P. 147-170.

211. Lewis EB. A gene complex controlling segmentation in Drosophila // Nature. 1978 V.276 P.565-570.

212. Lewis A, Mitsuya K, Constancia M, Reik W. Tandem repeat hypothesis in imprinting: deletion of a conserved direct repeat element upstream of hi 9 has no effect on imprinting in the igf2-hl9 region. //MoI.CeU.Biol. 2004. V.24. P.5650-5656.

213. Li Y, Wang H, Wang S, Quon D, Liu YW, Cordell B. Positive and negative regulation of APP amyloidogenesis by sumoylation. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P.259-264.

214. Lieb J, Liu X, Botstein D, Brown P. Promoter-specific binding of Rap 1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. //Nat.Genet. 2001. V.28. P.327-334.

215. Liñon R, Goldberg M, Karp R, Hogness D. The organization of the histone genes in Drosophila melanogaster: functional and evolutionary implications // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1978 V.42 Pt 2:1047-1052

216. Lin X, Liang M, Liang YY, Brunicardi FC, Feng XH. SUMO-l/Ubc9 promotes nuclear accumulation and metabolic stability of tumor suppressor Smad4. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.31043-31048.

217. Lindsley D, Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. // Academic Press. New York. 1992

218. Ling J, Li T, Hu J, Vu T, Chen FI, Qiu X, Cherry A, Hoffman A. CTCF Mediates Interchromosomal Colocalization Between Igf2/H19 and Wsbl/Nfl. // Science. 2006. V.312. P.269-272.

219. Lipshitz H, Peattie D, Hogness D. Novel transcripts from the Ultrabithorax domain of the bithorax complex // Genes Dev. 1987 V.l P.307-322.

220. Lois LM, Lima CD, Chua NH. Small ubiquitin-like modifier modulates abscisic acid signaling in Arabidopsis. // Plant Cell. 2003. V.15. P.1347-1359.

221. Lucchesi J, Kelly W, Panning B. Chromatin remodeling in dosage compensation. // Annu Rev Genet. 2005. V.39. P.615-651.

222. Lutz M, Burke L, LeFevre P, Myers F, Thome A, Crane-Robinson C, Bonifer C, Filippova G, Lobanenkov V, Renkawitz R. Thyroid hormone-regulated enhancer blocking: cooperation of CTCF and thyroid hormone receptor. // EMBO J. 2003. V.22. P. 1579-1587.

223. Maeda R, Karch F. Cis-regulation in the Drosophila Bithorax Complex // Adv Exp Med Biol. 2010 V.689 P.17-40.

224. Maeda R, Ilozumi S, Taniguchi K, Sasamura T, Murakami R. Matsuno K. Roles of single-minded in the left-right asymmetric development of the Drosophila embryonic gut // Mech Dev. 2007V. 124 P.204-217.

225. Maillet L, Gaden F, Brevet V, Fourel G, Martin S, Dubrana K, Gasser S, Gilson E. Ku-deficient yeast strains exhibit alternative states of silencing competence. // EMBO Rep. 2001. V.2. P.203-210

226. Mahajan R, Delphin C, Guan T, Geraee L, Melchior F. A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAPl to nuclear pore complex protein RanBP2. // Cell. 1997. V.88. P.97-107.

227. Mahajan R, Gerace L, Melchior F. Molecular characterization of the SUMO-1 modification of RanGAPl and its role in nuclear envelope association. // J. Cell Biol. 1998. V.140. P.259-270.

228. Majumder P, Cai HN. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P.5223.

229. Makhnevych T, Ptak C, Lusk CP, Aitchison JD, Wozniak RW. The role of karyopherins in the regulated sumoylation of septins // J Cell Biol. 2007 V.177 P.39-49.

230. Mannen H, Tseng HM, Clio CL, Li SS. Cloning and expression of human homolog HSMT3 to yeast SMT3 suppressor of MIF2 mutations in a centromere protein gene. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.222. P. 178-180

231. Mao Y, Mehl IR, Muller MT. Subnuclcar distribution of topoisomerase I is linked to ongoing transcription and p53 status // Proc Natl Acad Sei USA. 2002V.9 9 P.1235-1240.

232. Mao Y, Okada S, Chang LS, Muller MT. p53 dependence of topoisomerase I recruitment in vivo // Cancer Res. 2000 V.60 P.4538-4543.

233. Marlor RL, Parkhurst SM, Corces VG. The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins // Mol Cell Biol. 1986 V.6 P.l 129-1134.

234. Martin M, Meng YB, Chia W. Regulatory elements involved in the tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila // Mol Gen Genet. 1989 V.218 P.l 18-126

235. Martin S, Pombo A. Transcription factories: quantitative studies of nanostructures in the mammalian nucleus. // Chromosome Res. 2003 V.ll P.461-470

236. Martinez-Balbas M, Tsukiyama T, Gdula D and Wu C. Drosophila NURF-55, a WD repeat protein involved in histone metabolism. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1998. V.95 P.132-137

237. Matunis MJ, Coutavas E, Blobel G. A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the Ran-GTPase-activating protein RanGAPl between the cytosol and the nuclear pore complex. // J. Cell Biol. 1996. V.135. P.1457-1470.

238. Matsuzaki K, Minami T, Tojo M, Honda Y, Uchimura Y, Saitoh H, Yasuda H, Nagahiro S, Saya II, Nakao M. Serum response factor is modulated by the SUMO-1 conjugation system // Biochem Biophys Res Commun. 2003 V.306 P.32-38.

239. Melchior F. SUMO nonclassical ubiquitin.// Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 2000. V.16. P.591-626.

240. Melniek A, Carlile G, Ahmad KF, Kiang CL, Corcoran C, Bardwell V, Prive GG, Licht JD. Critical residues within the BTB domain of PLZF and Bcl-6 modulate interaction with corepressors // Mol Cell Biol. 2002 V.22 P. 1804-1818.

241. Melnikova L, Juge F, Grazdeva N, Mazur A, Cavalli G, Georgiev P. Interaction between theGAGAfactor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101. P.14806-14811.

242. Meluh PB, Koshland D. Evidence that the MIF2 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a centromere protein with homology to the mammalian centromere protein CENP-C // Mol Biol Cell. 1995 V.6 P.793-807.

243. Mencia M., Moqtaderi Z., Geisberg J.V., Kuras L., and Struhl K. Activator-specific recruitment of TFIID and regulation of ribosomal protein genes in yeast. // Mol. Cell. 2002. V.9. P.823-833.

244. Meneghini M, Wu M, Madhani H. Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. // Cell. 2003. V.l 12. P.725-736.

245. Merli C, Bergstrom D, Cygan J, Blackman R. Promoter specificity mediates the independent regulation of neighboring genes // Genes Dev. 1996 V.10 P.1260-1270.

246. Meulmeester E. and Melchior F. SUMO // Nature 2008 V.452.

247. Mihaly J, Barges S, Sipos L, Maeda R, Cleard F, Hogga I, Bender W, Gyurkovics H, Karch F. Dissecting the regulatory landscape of the Abd-B gene of the bithorax complex // Development. 2006 V.133 P.2983-2993.

248. Minty A, Dumont X, Kaghad M, Caput D. Covalent modification of p73alpha by SUMO-1. Two-hybrid screening with p73 identifies novel SUMO-1-interacting proteins and a SUMO-1 interaction motif// J Biol Chem. 2000 V.275 P.36316-36323.

249. Misteli T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function // Cell. 2007 V.128 P.787-800

250. Mito Y, Henikoff J, Henikoff S. Genome-scale profiling of histone H3.3 replacement patterns // Nat Genet. 2005 V.37 P.1090-1097.

251. Miyauchi Y, Yogosawa S, Honda R, Nishida T, Yasuda H. Sumoylation of Mdm2 by protein inhibitor of activated STAT (PIAS) and RanBP2 enzymes // J Biol Chem. 2002 V.277 P.50131-50136.

252. Modolell J, Campuzano S. The achaete-scute complex as an integrating device. // Int J Dev Biol. 1998. V.42. N3. P.275-282.

253. Mohideen F, Capili AD, Bilimoria PM, Yamada T, Bonni A, Lima CD. A molecular basis for phosphorylation-dependent SUMO conjugation by the E2 UBC9 // Nat Struct Mol Biol. 2009 V.16 P.945-952.

254. Mongelard F, Corces VG. Two insulators are not better than one. // Nat. Struct. Biol. 2001. V.8. P.192-194.

255. Morcillo P, Rosen C, Baylies MK, Dorsett D. Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila // Genes Dev. 1997 V.ll P.2729-2740.

256. Mukhopadhyay D, Ayaydin F, Kolli N, Tan SH, Anan T, Kametaka A, Azuma Y, Wilkinson KD, Dasso M. SUSP1 antagonizes formation of highly SUM02/3-conjugated species // J Cell Biol. 2006 V.174 P.939-949.

257. Müller J, Hart C, Francis N, Vargas M, Sengupta A, Wild B, Miller E, O'Connor M, Kingston R, Simon J. // Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 2002. V. 111. P. 197-208

258. Muller S, Hoege C, Pyrowolakis G, Jentsch S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. V.2. P.202-210.

259. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, et al. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. // Science. 2001. V.291. P.495-498.

260. Murrell A, Heeson S, Reik W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Ig£2 and H19 into parent-specific chromatin loops. // 2004. Nat.Genet. V.36. P.889-893.

261. Mutskov V, Farrell C, Wade P, Wolffe A, Felsenfeld G. The barrier function of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation. // Genes Dev. 2002. V.16. P.1540-1554

262. Nagy P, Griesenbeck J, Kornberg R and Cleary M. A trithorax-group complex purified from Saccharomyces cerevisiae is required for methylation of histone H3. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002 V.99 P.90-94.

263. Newsome TP, Asling B, Dickson BJ. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics // Development 2000 V.127 P.851-860

264. Nishida T, Kaneko F, Kitagawa M, Yasuda H. Characterization of a novel mammalian SUMO-l/Smt3-specific isopeptidase, a homologue of rat axam, which is an axin-binding protein promoting beta-catenin degradation // J Biol Chem. 2001 V.276 P.39060-3906.

265. Noma K, Allis C, Grewal S. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. // Science. 2001. V.293. P. 1150-1155.

266. Ohtsuki S, Levine M. GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1998V.12 P.3325-3330.

267. Ohtsuki S, Levine M, Cai H. Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1998 V.12 P.547-556.

268. Oki M, Kamakaka R. Barrier function at HMR. // Mol.Cell. 2005. V.19. P.707-716.

269. Oki M, Valenzuela L, Chiba T, Ito T, Kamakaka T. Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. // Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P.1956-1967

270. Okuma T, Honda R, Ichikawa G, Tsumagari N, Yasuda H. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V.254. P.693-698.

271. Osborne C, Chakalova L, Brown K, Carter D, Plorton A, Debrand E, Goyenechea B, Mitchell J, Lopes S, Reik W, Fraser P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. //Nat. Genet. 2004 V.36 P.1065-1071

272. Owerbach D, McKay E, Yeh E, Gabbay K, Bohren K. A proline-90 residue unique to SUMO-4 prevents maturation and sumoylation // Biochem Biophys Res Commun. 2005 V.337 P.517-520.

273. Ouyang J, Shi Y, Valin A, Xuan Y, Gill G. Direct binding of CoRESTl to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSDl/CoRESTl/HDAC complex // Mol Cell. 2009 V.34 P.145-154.

274. Pagans S, Ortiz-Lombardia M, Espinas M, Bernues J, Azorin F. The Drosophila transcription factor tramtrack (TTK) interacts with Trithorax-like (GAGA) and represses GAGA-mediated activation. //NAR. 2002. V.30. P.4406-4413.

275. Pai CY, Lei EP, Ghosh D, Corces VG. The centrosomal protein CP190 is a component of the gypsy chromatin insulator. //Mol. Cell. 2004. V.16. P.737-748.

276. Palstra R, Tolhuis B, Splinter E, Nijmeijer R, Grosveld F, de Laat W. The beta-globin nuclear compartment in development and erythroid differentiation // Nat Genet. 2003 V.35 P.190-194.

277. Pandolfi PP, Tian Huai Shen, Hui-Kuan Lin, Scaglioni PP, Yung MT. The Mechanisms of PML-Nuclear Body Formation // Molecular Cell. 2006. V.24. P.331-339.

278. Panse VG, Kiister B, Gerstberger T, Hurt E. Unconventional tethering of Ulpl to the transport channel of the nuclear pore complex by karyopherins // Nat Cell Biol. 2003 V.5 P.21-27.

279. Parkhurst S.M., Harrison D.A., Remington M.P., Spana C., Kelley R.L., et al. //Genes Dev. 1988. V.2. P.1205-1215.

280. Parkhurst SM, Corces VG. Retroviral elements and suppressor genes in Drosophila // Bioessays 1986 V.5 P.52-57.

281. Parnell TJ, Geyer PK. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes. // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

282. Parnell TJ, Viering MM, Skjesol A, Helou C, Kuhn EJ, Geyer PK. An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003. V.100. P. 13436-13441.

283. Parnell TJ, Kuhn EJ, Gilmore BL, Helou C, Wold MS, Geyer PK. Identification of genomic sites that bind the Drosophila suppressor of Hairy-wing insulator protein // Mol Cell Biol. 2006. V.26(16). P.5983-5993.

284. Perry JJ, Tainer JA, Boddy MN. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin // Trends Biochem Sei. 2008 V.33 P.201-208.

285. Petrie K, Guidez F, Howell L, Healy L, Waxman S, Greaves M, Zelent. The histone deacetylase 9 gene encodes multiple protein isoforms // J Biol Chem. 2003 V.278 P. 1605972.

286. Paule M, White R. Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. // NAR. 2000. V.28. P. 1283-1298.

287. Perrod S, Gasser SM. Long-range silencing and position effects at telomeres and centromeres: parallels and differences.// Cell Mol. Life Sei. 2003. V.60. P.2303-2318.

288. Pichler A, Gast A, Seeler JS, Dejean A, Melchior F. The nucleoporin RanBP2 has SUMOl E3 ligase activity. // Cell 2002. V.108. P.109-120.

289. Pichler A, Knipscheer P, Saitoh H, Sixma TK, Melchior F. The RanBP2 SUMO E3 ligase is neither HECT- nor RING-type // Nat Struct Mol Biol. 2004 V.l 1 P.984-991.

290. Pickart CM. Mechanisms underlying ubiquitination. // Annu. Rev. Biochem. 2001. V.70. P.503-533.

291. Pickersgill H, Kalverda B, de Wit E, Talhout W, Fornerod M,. van Steensel B. Characterization of the Drosophila melanogaster genome at the nuclear lamina // Nat. Genet. 2006 V.38 P. 1005-1014

292. Pirrotta V, Steller H, Bozzetti MP. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene // EMBO J. 1985 V.16 P.3501-358.

293. Poukka H, Karvonen U, Janne OA, Palvimo JJ. Covalent modification of the androgen receptor by small ubiquitin-Iike modifier 1 (SUMO-1). Proc Natl Acad Sci USA. 2000 V.97 P.14145-14150.

294. Prioleau M, Nony P, Simpson M, Felsenfeld G. An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken beta-globin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene // EMBO J. 1999 V.18 P.4035-4048.

295. Pryde F, Louis E. Limitations of silencing at native yeast telomeres. // EMBO J.1999. V.18. P.2538-2550.

296. Raisner R, Madhani H. Patterning chromatin: form and function for H2A.Z variant nucleosomes. // Curr.Opin.Genet.Dev. 2006. V.16. P. 119-124.

297. Rank G, Prestel M, Paro R. Transcription through intergenic chromosomal memory elements of the Drosophila bithorax complex correlates with an epigenetic switch // Mol Cell Biol. 2002 V.22 P.8026-8034

298. Razin SV, FarrellCM,Recillas-Targa F. Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. // Int. Rev. Cytol. 2003. V.226. P.63-125.

299. Read D, Butte MJ, Dernburg AF, Frasch M, Romberg TB. Functional studies of the BTB domain in the Drosophila GAGA and Mod(mdg4) proteins // Nucleic Acids Res. 2000 V.28 P.3864-3870.

300. Reed M, Riggs A, Mann J. Deletion of a direct repeat element has no effect on Igf2 and HI 9 imprinting. // Mamm.Genome. 2001. V.12. P.873-876.

301. Reindle A, Belichenko I, Bylebyl GR, Chen XL, Gandhi N, Johnson ES Multiple domains in Siz SUMO ligases contribute to substrate selectivity // J Cell Sci. 2006 V.l 19 P.4749-4757.

302. Reverter D, Lima CD. Insights into E3 ligase activity revealed by a SUMO-RanGAPl-Ubc9-Nup358 complex // Nature. 2005 V.435 P.687-692

303. Reverter D, Lima CD. A basis for SUMO protease specificity provided by analysis of human Senp2 and a Senp2-SUMO complex // Structure. 2004 V.12 P.1519-1531.

304. Reverter D, Lima CD. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates //Nat Struct Mol Biol. 2006 V.13 P.1060-1068

305. Ringrose L, Chabanis S, Angrand P-O, Woodroofe C, Stewart AF. Quantitative comparison of DNA looping in vivo: chromatin increases effective DNA flexibility at short distances // EMBO J 1999 V.18 P.6630-6641

306. Ripoche M, Chantal K, Poirier F, Dandolo L. Deletion of the H19 transcription unit reveals the existence of a putative imprinting control element. // Genes Dev. 1997. V.ll. P.1596-1604.

307. Pluta AF, Earnshaw WC, Goldberg IG. Interphase-specific association of intrinsic centromere protein CENP-C with HDaxx, a death domain-binding protein implicated in Fasmediated cell death // J Cell Sci. 1998 V.l 11 P.2029-2041.

308. Rodriguez MS, Dargemont C, Hay RT. SUMO-1 conjugation in vivo requires both a consensus modification motif and nuclear targeting // J Biol Chem. 2001 V.276 P. 1265412659

309. Roseman R., Pirrotta V., Geyer P. The Su(FIw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. // EMBO J. 1993. V.12. P.435-442.

310. Ross S, Best JL, Zon LI, Gill G. SUMO-1 modification represses Sp3 transcriptional activation and modulates its subnuclear localization // Mol Cell. 2002V. 10 P.831-842.

311. Rubin G, Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. // Science. 1982. V.218. P.348-353.

312. Ruiz-Gômez M, Modolell J. Deletion analysis of the achaete-scute locus of Drosophila melanogaster // Genes Dev. 1987 V.l P.1238-1246.

313. Rusche L, Kirchmaier A, Rine J. The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. // Annu. Rev.Biochem. 2003. V.72. P.481-516.

314. Rusche LN, Rine J. Conversion of a gene-specific repressor to a regional silencer. // Genes Dev. 2001. V.l5. P.955-967.

315. Ryu SW, Chae SK, Kim E. Interaction of Daxx, a Fas binding protein, with sentrin and Ubc9 // Biochem Biophys Res Commun. 2000 V.279 P.6-10.

316. Sachdev S, Bruhn L, Sieber H, Pichler A, Melchior F, Grosschedl R. PlASy, a nuclear matrix-associated SUMO E3 ligase, represses LEF1 activity by sequestration into nuclear bodies. // Genes Dev. 2001. V.15. P.3088-3103.

317. Sachs R, van den Engh G, Trask B, Yokota II, Hearst J. A random-walk/giant-loop model for interphase chromosomes // Proc Natl Acad Sci USA. 1995 V.92 P.2710-2714.

318. Saitoh H, Hinchey J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.6252-6258.

319. Saitoh N, Bell AC, Recillas-Targa F, West A, Simpson M, Pikaart M, Felsenfeld G. Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken beta-globin domain // EMBO J. 2000 V.19 P.2315-2322.

320. Sanchez-Eisner T, Gou D, Kremmer E, Sauer F. Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax // EMBO J. 2007 V.26 P.4203-4214.

321. Sapetschnig A, Rischitor G, Braun H, Doll A, Schergaut M, Melchior F, Suske G. Transcription factor Sp3 is silenced through SUMO modification by PIAS1 // EMBO J. 2002 V.21 V.5206-5215.

322. Schmidt,D. and Muller, S. PIAS/SUMO: new partners in transcriptional regulation. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V.60. P.2561 -2574.

323. Schmid M, Arib G, Laemmli C, Nishikawa J, Durussel T, Laemmli U. Nup-PI: The nucleopore-promoter interaction genes in yeast. // Mol.Cell. 2006. V.21. P.379-391.

324. Schul W, de Jong L, van Driel R. Nuclear neighbours: the spatial and functional organization of genes and nuclear domains // J Cell Biochem. 1998 V.70 P. 159-71

325. Schoenherr C, Levorse J, Tilghman S. CTCF maintains differential methylation at the Igf2/H19 locus. //Nat.Genet. 2003. V.33. P.66-69.

326. Schübeler D, Groudine M, Bender M. The murine beta-globin locus control region regulates the rate of transcription but not the hyperacetylation of histones at the active genes. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001 V. 98 P.l 1432-11437

327. Schubeler D, Francastel C, CimboraDM,Reik A, Martin DI, Groudine M. Nuclear localization and histone acetylation: a pathway for chromatin opening and transcriptional activation of the human beta-globin locus. // Genes Dev. 2000. V.14. P.940-950

328. Schwaiger M., Stadler M, Bell O, Kohler H, Oakeley E and Schubeler D. Chromatin state marks cell-type- and gender-specific replication of the Drosophila genome. // Genes Dev. 2009 V.23 P.589-601.

329. Schwartz DC, Hochstrasser M. A superfamily of protein tags: ubiquitin, SUMO and related modifiers. // Trends Biochem. Sci. 2003. Y.28. P.321-328.

330. Schwartz Y, Kahn T, Nix D, Li X, Bourgon R, Biggin M, Pirrotta V. Genome-wide analysis ofPolycomb targets in Drosophila melanogaster//Nat Genet. 2006 V.38 P.700-705.

331. Schweinsberg S, Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar R, Mishra R, Karch F. The enhancerblocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. // Genetics. 2004. V.168. P.1371-1384.

332. Scott K, Merrett S, Willard H. A heterochromatin barrier partitions the fission yeast centromere into discrete chromatin domains. // Curr.Biol. 2006. V.16. P.l 19-129.

333. Scott K.S., Geyer P.K. Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. // EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279.

334. Scott KC, Taubman AD, Geyer PK. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. // Genetics 1999. V.15. P.787—798.

335. Seeler JS, Dejean A. Nuclear and unclear functions of SUMO. // Nat. Rev.Mol. Cell Biol. 2003. V.4. P.690-699.

336. Seufert W, Futcher B, Jentsch S. Role of a ubiquitin-conjugating enzyme in degradation of Sand M-phase cyclins. // Nature 1995. V.373. P.78-81.

337. Shalizi A, Gaudilliere B, Yuan Z, Stegmiiller J, Shirogane T, Ge Q, Tan Y, Schulman B, Harper JW, Bonni A. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation // Science. 2006 V.311 P. 1012-1017.

338. Sharrocks, A. D. PIAS proteins and transcriptional regulation more than just SUMO E3 ligases? // Genes Dev. 2006. V.20. P.754 - 758.

339. Shayeghi M, Doe CL, Tavassoli M, Watts FZ. Characterisation of Schizosaccharomyces pombe rad31, a UBA-related gene required for DNA damage tolerance. // Nucleic Acids Res. 1997. V.25. P. 1162—1169.

340. Shen Z, Pardington-Purtymun PE, Comeaux JC, Moyzis RK, Chen DJ. UBL1, a human ubiquitin-like protein associating with human RAD51/RAD52 proteins. // Genomics. 1996. V.36. P.271-279.

341. Shen LN, Geoffroy MC, J affray EG, Hay RT. Characterization of SENP7, a SUMO-2/3-specific isopeptidase // Biochem J. 2009 V.421 P.223-230

342. Shuai K. Modulation of STAT signaling by STAT-interacting proteins. // Oncogene 2000. V.19. P.2638—2644.

343. SiegalML, Hartl DL. Application of Cre/ loxP in Drosophila. Sitespecific recombination and transgene co-placement // Methods Mol Biol 2000 V.136 P.487-495

344. Simon J, Tamkun J. Programming off and on states in chromatin: mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes. // Curr Opin Genet Dev. 2002 V.12 P.210-218.

345. Simon JA, Kingston RE. Mechanisms of polycomb gene silencing: knowns and unknowns // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 V.10 P.697-708.

346. Simonis M, de Laat W. FISH-eyed and genome-wide views on the spatial organisation of gene expression // Biochim Biophys Acta. 2008 V.1783 P.2052-2060

347. Sobko A, Ma H, Firtel RA. Regulated SUMOylation and ubiquitination of DdMEKl is required for proper chemotaxis // Dev Cell. 2002 V.2 P.745-756

348. Spana C, Harrison D, Corces V. The Drosophila melanogaster supressor of Hairy wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon. II Genes Dev. 1988. V.2. P.1414-1423.

349. Sparago A, Cerrato F, Vernucci M, Ferrero G, Silengo M, Riccio A. Microdeletions in the human H19 DMR result in loss of IGF2 imprinting and Beckwith-Wiedemann syndrome. // Nat.Genet. 2004. V.36. P.958-960.

350. Splinter E, Heath H, Kooren J, Palstra R, Klous P, Grosveld F, Galjart N, de Laat W. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the (3-globin locus. 11 Gen.Dev. 2006. V.20. P.2349-2354.

351. Sproul D, Gilbert N, BiekmoreWA. The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes. // Nat Rev Genet. 2005. V.6(10) P.775-781.

352. Stade K, Vogel F, Schwienhorst I, Meusser B, Volkwein C, Nentwig B, Dohmen RJ, Sommer T. A lack of SUMO conjugation affects cNLS-dependent nuclear protein import in yeast // J Biol Chem. 2002 V.277 P.49554-49561.

353. Stadnick M, Pieracci F, Cranston M, Taksel E, Thorvaldsen J, Bartolomei M. Role of a 461 bp G-rich repetitive element in H19 transgene imprinting. // Dev.Genes Evo. 1999. V.209. P.239-248.

354. Stehmeier P, Muller S. Phospho-regulated SUMO interaction modules connect the SUMO system to CK2 signaling // Mol Cell. 2009 V.33 P.400-409.

355. Stelter P, Ulrich HD. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO andubiquitin conjugation//Nature. 2003 V.425 P.188-191

356. Sternsdorf T, Puccetti E, Jensen K, Hoelzer D, Will H, Ottmann OG, Ruthardt M. PIC-1/SUMO-l-modified PML-retinoic acid receptor alpha mediates arsenic tri oxide-induced apoptosis in acute promyelocytic leukemia // Mol Cell Biol. 1999 V.19 P.5170-5178.

357. Strambio-de-Castillia C, Blobel G, Rout M. Proteins connecting the nuclear pore complex with the nuclear interior. // J.Cell Biol. 1999. V.144. P.839-855.

358. Strunnikov AV, Aravind L, Koonin EV. Saccharomyces cerevisiae SMT4 encodes an evolutionarily conserved protease with a role in chromosome condensation regulation. Genetics. 2001 V.158 P.95-107.

359. Steinacher R, Schar P. Functionality of human thymine DNA glycosylase requires SUMO-regulated changes in protein conformation // Curr Biol. 2005 V.15 P.616-623.

360. Stogios PJ, Downs GS, Jauhal JJ, Nandra SK, Privé GG. Sequence and structural analysis of BTB domain proteins // Genome Biol. 2005 V.6 P.82.

361. Strouboulis J, Damjanovski S, Vermaak D, Meric F, Wolffe A. // Transcriptional repression by XPcl, a new Polycomb homolog in Xenopus laevis embryos, is independent of histone deacetylase. Mol Cell Biol. 1999 V.19 P.3958-68

362. Subramaniam S, Sixt KM, Barrow R, Snyder SH. Rhes, a striatal specific protein, mediates mutant-huntingtin cytotoxicity // Science. 2009V.324 P.1327-1330

363. Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Moazed D, Grewal S. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production // Proc Natl Acad Sci USA. 2005 V.102 P.152-157.

364. Suka N, Luo K, Grunstein M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysinel6 and spreading of heterochromatin. //Nat.Genet. 2002. V.32. P.378-383.

365. Szabo P, Tang S, Rentsendoij A, Pfeifer G, Mann J. Maternal-specific footprints at putative CTCF sites in the H19 imprinting control region give evidence for insulator function. // Cuix.Biol. 2000. Y.10. P.607-610.

366. Szabo P, Tang S, Silva F, Tsark W, Mann J. Role of CTCF binding sites in the Ig£2/H19 imprinting control region. II Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P.4791-4800.

367. Tackett A, Dilworth D, Davey M, O'Donnell M, Aitchison J, Rout M, Chait B. Proteomic and genomic characterization of chromatin complexes at a boundary. // J. Cell Biol. 2005. V.169. P.35-47.

368. Takahashi Y, Toh-e A, Kikuchi Y. A novel factor required for the SUM01/Smt3 conjugation of yeast septins. // Gene 2001. V.275. P.223-231.

369. Takahashi Y, Toh-e A, Kikuchi Y. Comparative analysis of yeast PIAS-type SUMO ligases in vivo and in vitro. // J. Biochem. 2003. V.133. P.415-422.

370. Talbert P, Henikoff S. Spreading of silent chromatin: inaction at a distance // Nat Rev Genet. 2006 V.7 P.793-803.

371. Tanimoto K, Sugiura A, Omori A, Felsenfeld G, Engel J, Fukamizu A Human b-globin locus control region HS5 contains CTCF- and developmental stage-dependent enhancer-blocking activity in erythroid cells. // Mol Cell Biol. 2003. V.23. P.8946-8952.

372. Tatham MH, Jaffray E, Vaughan OA, Desterro JM, Botting CH, et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.35368-35374.

373. Tatliam MH, Kim S, Jaffray E, Song J, Chen Y, Hay RT. Unique binding interactions among Ubc9, SUMO and RanBP2 reveal a mechanism for SUMO paralog selection // Nat Struct Mol Biol. 2005 V.12 P.67-74.

374. Tatham MH, Kim S, Yu B, Jaffray E, Song J, et al. Role of an N-terminal site of Ubc9 in SUMO-1, -2, and -3 binding and conjugation. // Biochemistry 2003. V.42. P.9959-9969.

375. Taylor DL, Ho JC, Oliver A, Watts FZ. Cell-cycle-dependent localisation of Ulpl, a Schizosaccharomyces pombe Pmt3 (SUMO)-specific protease // J Cell Sci. 2002 V.115 P.l 113-1122

376. Thorvaldsen J, Duran K, Bartolomei M. Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2. // Genes Dev. 1998. V.12. P.3693-3702.

377. Thorvaldsen J, Mann M, Nwoko O, Duran K, Bartolomei M. Analysis of sequence upstream of the endogenous HI 9 gene reveals elements both essential and dispensable for imprinting. // Mol. Cell. Biol. 2002. V.22. P.2450-2462.

378. Tie F, Furuyama T, Prasad-Sinha J, Jane E and Harte P. The Drosophila Polycomb Group proteins ESC and E(Z) are present in a complex containing the histone-binding protein p55 and the histone deacetylase RPD3. // Development 2001 V.128 P. 275-286.

379. Tolhuis B, Palstra R, Splinter E, Grosveld F, de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active p-globin locus. // Mol.Cell. 2002. V.10. P.1453-1465.

380. Tong H, Hateboer G, Perrakis A, Bernards R, Sixma TK. Crystal structure of murine/human Ubc9 provides insight into the variability of the ubiquitin-conjugating system. // J. Biol. Chem. 1997.

381. Torigoi E, Bennani-Baiti IM, Rosen C, Gonzalez K, Morcillo P, Ptashne M, Dorsett D. Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates bicoid activity in vivo // Proc Natl Acad Sci USA. 2000 V.97 P.2686-91.

382. Tremblay K, Duran K, Bartolomei M. A 5' 2-kilobase-pair region of the imprinted mouse H19 gene exhibits exclusive paternal methylation throughout development. // Mol.Cell.Biol. 1997. V.17. P.4322-4329.

383. Turner B.M. Histone acetylation and an epigenetic code // BioEssays. 2000. V. 22. P.836-845

384. Udvardy A, Maine E, Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. // J Mol Biol. 1985. V.185(2) P.341-358.

385. Ungureanu D, Vanhatupa S, Kotaja N, Yang J, Aittomaki S, Janne OA, Palvimo JJ, Silvennoinen O. PIAS proteins promote SUMO-1 conjugation to STAT1 // Blood. 2003 V.102 P.3311-333.

386. Vakoc C, Letting D, Gheldof N, Sawado T, Bender M, Groudine M, Weiss M, Dekker J, Blobel G. Proximity among distant regulatory elements at the P-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. // Mol.Cell. 2005. V.17. P .453^162.

387. Valenzuela L. and Kamakaka R.T. Chromatin Insulators. II Annu. Rev. Genet. 2006. Vol.40. P. 107-3 8

388. Vazquez J, Muller M, Pirrotta V, Sedat J. The Mcp element mediates stable long-range chromosome-chromosome interactions in Drosophila. // Mol.Biol.Cell. 2006. V.17. P.2158-2165.

389. Verdel A, Moazed D. RNAi-directed assembly of heterochromatin in fission yeast. // FEBS Lett. 2005. V.579. P.5872-5878.

390. Verger A, Perdomo J, Crossley M. Modification with SUMO. A role in transcriptional regulation. // EMBO Rep.2003.V.4. P.137-142.

391. Verona R, Mann M, Bartolomei M. Genomic imprinting: intricacies of epigenetic regulation in clusters. //Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 2003. V.19. P.237-259.

392. Verschure P, van der Kraan I, Manders E, van Driel R. Spatial relationship between transcription sites and chromosome territories // J. Cell Biol. 1999 V.147 P.13-24

393. Verschure P, van der Kraan I, Manders E, Hoogstraaten D, Houtsmuller A, van Driel R. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules // EMBO Reports 2003 V.4 P.861-866.

394. Vostrov A, Quitschke W. The zinc finger protein CTCF binds to the APBb domain of the amyloid b-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation. // J Biol Chem. 1997. V.272. P.33353-33359.

395. Walden H, Podgorski MS, Schulman BA. Insights into the ubiquitin transfer cascade from the structure of the activating enzyme forNEDDS. //Nature. 2003. V.422. P.330-334.

396. Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Topors acts as a SUMO-1 E3 ligase for p53 in vitro and in vivo // FEBS Lett. 2005 V.579 P.5007-5012.

397. Weger S, Hammer E, Engstler M. The DNA topoisomerase I binding protein topors as a novel cellular target for SUMO-1 modification: characterization of domains necessary for subcellular localization and sumolation // Exp Cell Res. 2003 V.290 P. 13-27.

398. Wei W, Brennan MD. The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator. //Mol. Cell Biol. 2001. V.21. P.7714-7720.

399. Weis L, Reinberg D. Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. // FASEB J. 1992 V.6. P.3300-3309.

400. Weinmann R, Roeder R. Role of DNA-dependent RNA polymerase 3 in the transcription of the tRNA and 5S RNA genes. // PNAS. 1974. V.71. P.1790-1794.

401. West AG, Gaszner M, Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms. // Genes Dev. 2002. V.16. P.271-288.

402. Wijgerde M, Grosveld F, Fraser P. Transcription complex stability and chromatin dynamics in vivo. //Nature. 1995. V.377(6546) P.209-213.

403. Wood V, Gwilliam R, Rajandream M, Lyne M, Lyne R, et al. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. // Nature. 2002. V.415. P.871-880.

404. Wood LD, Irvin BJ, Nucifora G, Luce KS, Hiebert SW. Small ubiquitin-like modifier conjugation regulates nuclear export of TEL, a putative tumor suppressor // Proc Natl Acad Sci USA. 2003 V.100 P.3257-3262.

405. Xu Q, Li M, Adams J, Cai HN. Nuclear location of a chromatin insulator in Drosophila melanogaster. // J Cell Sci. 2004. V.l 17(Pt 7) P.1025-1032.

406. Xu Z, Lam LS, Lam LH, Chau SF, Ng TB, Au SW. Molecular basis of the redox regulation of SUMO proteases: a protective mechanism of intermolecular disulfide linkage against irreversible sulfhydryl oxidation // FASEB J. 2008 V.22 P. 127-137.

407. Yamaguchi, T., Sharrna, P., Athanasiou, M., Kumar, A., Yamada, S. and Kuehn, M. R. Mutation of SENPl/SuPr-2 reveals an essential role for desumoylation in mouse development. // Mol. Cell. Biol. 2005. V.25. P.5171 5182.

408. Yang SH, Jaffray E, Senthinathan B, Hay RT, Sharrocks AD. SUMO and transcriptional repression: dynamic interactions between the MAP kinase and SUMO pathways // Cell Cycle. 2003 V.2 P.528-530.

409. Yang M, Hsu CT, Ting CY, Liu LF, Hwang J. Assembly of a polymeric chain of SUMOl on human topoisomerase I in vitro // J Biol Chem. 2006 V.281 P.8264-8274.

410. Yi H, Richards EJ. A cluster of disease resistance genes in Arabidopsis is coordinately regulated by transcriptional activation and RNA silencing // Plant Cell. 2007 V.19 P.2929-2939

411. Yoon Y, Jeong S, Rong Q, Chung J, Pfeifer K. Analysis of the H19ICR Insulator. // Mol.Cell Biol. 2007 V.27. P.3499-3510.

412. Yu Q, Qiu R, Foland T, Griesen D, Galloway C, Chiu Y, Sandmeier J, Broach J, Bi X. Raplp and other transcriptional regulators can function in defining distinct domains of gene expression. //Nucleic Acids Res. 2003. V.31. P.1224-1233.

413. Yunus AA, Lima CD. Structure of the Siz/PIAS SUMO E3 ligase Sizl and determinants required for SUMO modification of PCNA // Mol Cell. 2009 Y.35 P.669-682

414. Yusufzai T, Tagami H, Nakatani Y, Felsenfeld G. CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. // Mol.Cell. 2004. V.13. P.291— 298.

415. Zhang Y, Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. // Genes Dev. 2001. V.15. P.2343-2360.

416. Zhao X, Blobel G. A SUMO ligase is part of a nuclear multiprotein complex that affects DNA repair and chromosomal organization // Proc Natl Acad Sci USA. 2005 V.102 P.4777-4782.

417. Zhao J. Sumoylation regulates diverse biological processes // Cell Mol Life Sci. 2007 V.64 P.3017-3033.

418. Zhao K., Hart C.M., Laemmli U.K. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. // Cell. 1995. V.81. P.879-889.

419. Zhao H, Kim A, Song S, Dean A. Enhancer blocking by chicken beta-globin 5'-HS4: role of enhancer strength and insulator nucleosome depletion // J Biol Chem. 2006 V.281 P.30573-30580

420. Zhao H, Dean A. An insulator blocks spreading of histone acetylation and interferes with RNA polymerase II transfer between an enhancer and gene // Nucleic Acids Res. 2004 V.32 P.4903-4919.

421. Zhong, S., Salomoni, P., Pandolfi, P.P. The transcriptional role of PML and the nuclear body. //Nat. Cell Biol. 2000. V.2. P.85-90.1. ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

422. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.1. БЛАГОДАРНОСТИ

423. Исследования проводились при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского Фонда Фундаментальных Исследований, Центра медицинских исследовании университета г. Осло в Москве.

424. Автор выражает благодарность всем принявшим участие и помогавшим в проведении исследований, обсуждении их результатов и предоставившим уникальные реагенты для их проведения.

425. Отдельную благодарность автор выражает Георгиеву Павлу Георгиевичу, в тесном сотрудничестве с которым была выполнена представленная работа.

426. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам за внимательное прочтение данной работы и ценные замечания.

Информация о работе

Головнин, Антон Клеменсович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.07

Диссертация

Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Головнин, Антон Клеменсович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Головнин, Антон Клеменсович

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Головнин, Антон Клеменсович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и функции Su(Hw)-зависимых инсуляторов у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика