Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов у Drosophila melanogaster

Максименко, Оксана Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 577 214 4 575 22

Максименко Оксана Геннадьевна

Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов

у 1эяовортьа меьа№оа8те11

Специальность 03 00 26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

-------

2007

003160864

Работа выполнена в лаборатории Регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель: академик РАН, доктор биологических наук, профессор ПГ Георгиев

Официальные оппоненты: чл -корр РАН, доктор биологических наук, профессор С В Разин

кандидат биологических наук Л Г Николаев Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 23 октября 2007 года в 11 час на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан 24 сентября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного сов?—

канд фарм наук

Грабовская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Транскрипция - важная стадия в процессе реализации генетической информации Ключевую роль в регуляции этого процесса играют транскрипционные факторы - белки, способные контролировать активность РНК - полимеразы Как известно, для высших эукариот характерна наиболее развитая система регуляции транскрипции, связанная с необходимостью в транскрипции различных генов в зависимости от типа клеток и стадии развития организма, в результате только определенный набор генов экспрессируется в данном типе дифференцирующихся клеток, большинство же генов находится в стабильно неактивном состоянии Доступность и набор специфических регуляторных элементов ДНК в совокупности с комбинациями активных транскрипционных факторов обеспечивают специфическую транскрипцию гена в данном типе клеток Определенный контроль за экспрессией гена может осуществляться за счет прямых взаимодействий между белками основного транскрипционного комплекса, собранного на промоторе, и специфическими белковыми комплексами на регуляторных элементах, названных энхансерами (т е усилителями транскрипции) Энхансеры способны работать на очень больших дистанциях Большая часть экспериментальных данных согласуется с так называемой «петлевой» моделью, согласно которой белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, в результате чего ДНК между этими элементами выпетливается Однако в рамках этой модели возникает вопрос, каким образом энхансеру, взаимодействующему с промотором на больших расстояниях, удается правильно узнавать свой промотор, какие механизмы препятствуют установлению связей (контакта) с другими генами Ясно то, что должны существовать механизмы, разграничивающие регуляторные последовательности в специфические участки генной экспрессии, и, таким образом, препятствующие образованию случайных связей между энхансерами и промоторами Возможно, важную роль в этих процессах играют инсуляторы -регуляторные элементы, при расположении между энхансером и промотором способные препятствовать установлению эффективного взаимодействия между этими элементами, в результате чего активация промотора не происходит Кроме этого, инсуляторы могут разделять эу-и гетерохроматиновые участки, и с этой точки зрения основная роль инсуляторов -компартментализация генома и организация хроматина в ядре, инсуляторы способны собирать хроматин в доменные структуры, каждая из которых представляет собой независимую функциональную единицу генной экспрессии В данной работе на примере эндогенного 8и(Н\у)-зависимого инсулятора представлен сравнительный анализ инсуляторных активностей, более того, показано непосредственное влияние инсулятора на активность промоторов, продемонстрировано, какой вклад инсуляторы могут вносить в энхансер-промоторные взаимодействия благодаря еще одной, к настоящему моменту, не выделенной отдельно, активности - коммуникаторной {

Все вышесказанное и определяет актуальность настоящей диссертационной работы, посвященной изучению особенностей функционирования инсуляторов дрозофилы в контексте их влияния на процессы регуляции экспрессии генов, и, в частности, на установление энхансер-промоторных взаимодействий

Цель и задачи исследования.

Основной целью работы явилось изучение роли инсуляторов в процессах регуляции экспрессии генов

Для осуществления поставленной цели были определены следующие экспериментальные

задачи

• Проанализировать структурно-функциональные особенности Зи(Н\¥)-зависимых инсуляторов и определить компоненты, ответственные за проявление энхансер-блокирующей и барьерной активностей,

• Подобрать оптимальную модельную систему для проверки взаимодействий между разными наборами 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов,

• Продемонстрировать возможную потенциальную роль межинсуляторных взаимодействий в тонкой регуляции работы генов

Научная новизна и практическое значение работы

В работе впервые показано, что у 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов за энхансер-блокирующую и барьерную активности отвечают разные белки, каждый из которых, в свою очередь, взаимодействует с белком 8и(Н\у) Более того, продемонстрировано, что эндогенный 8и(Н\у)-зависимый инсулятор, несмотря на свое структурное сходство с инсулятором из ретротранспозона МДГ4, обладает рядом уникальных свойств Полученные результаты по изучению функциональных активностей 1А2 инсулятора позволили обобщить данные, ранее полученные для инсулятора из ретротранспозона МДГ4 Все это помогло создать удобную тест-систему на базе 1А2 инсулятора, при помощи которой удалось на примере простой модели с двумя маркерными генами показать влияние межинсуляторных взаимодействий на энхансер-промоторную коммуникацию Результаты данной работы вносят вклад в развитие представлений о механизмах регуляции транскрипции генов на уровне активации энхансером промотора Кроме того, они позволяют по-новому взглянуть на функциональное значение инсуляторов в процессах регуляции транскрипции, давая все основания подвергнуть сомнению упрощенные модели о разобщении энхансера и промотора друг от друга В то же время появляются все основания рассматривать инсуляторы в качестве коммуникационных элементов, способных взаимодействовать друг с другом, и в зависимости от конфигурации таких взаимодействий возможна либо активация энхансером своего промотора либо его изоляция

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, 2005), 10-й международной

конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), XIV международной конференции «Ломоносов 2007», на международных конференциях Meeting of International Research Scholars HHMI (Menda, Mexico, 2005), EMBO «4th Elmau conference on nuclear organization» (Gösau, Austria, 2006), «Nuclear structure and dynamics» (Montpellier, France, 2007), FEBS «The biology of modular protein domains» (Seefeld in Tirol, Austria, 2007), 2"d Transregio 5 Symposium "Chromatin - assembly and inheritance of functional states" (München, September 13-15, 2007)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ Из них статей - 4, материалов конференций - 8

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 23 рисунка и состоит из разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы, включающий 168 цитируемых источников, и приложение (1 рисунок и 4 таблицы)

Основное содержание работы

В данной работе на примере Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов показано влияние инсуляторов на экспрессию генов и исследованы свойства первого эндогенного Su(Hw)-зависимого инсулятора В результате (I раздел) были изучены энхансер-блокирующая и барьерная активности этого инсулятора, определены белки, участвующие в реализации активностей, и были продемонстрированы эффекты влияния инсулятора на активность промотора гена yellow Далее (II раздел) на основе 1А2 инсулятора была создана модельная система для анализа влияния межинсуляторных взаимодействий на энхансер-промоторные взаимоотношения В качестве маркерных генов были использованы стандартные в подобных трансгенных работах yellow (пигментация кутикулярных структур) и white (окраска глаз) (описание см в Диссертации)

I. Изучение структуры и активностей эндогенного Su(Hw)-3ABHCHMoro инсулятора.

К настоящему времени наиболее хорошо изученным инсулятором у дрозофилы является Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4 (ниже в тексте называется просто Su(Hw)), найденный рядом с 5' длинным концевым повтором Этот инсулятор содержит 12 сайтов связывания для белка Su(Hw), с которым взаимодействуют два других компонента инсуляторного комплекса - Mod(mdg4)-67 2 и СР190 Известно, что существует большое количество (более 500) эндогенных сайтов связывания для белка Su(Hw. Данная работа сконцентрирована на исследовании свойств первого идентифицированного эндогенного инсулятора, названного по месту локализации на X хромосоме -1А2 Этот инсулятор содержит два сайта связывания белка Su(Hw) и интересен он с нескольких точек зрения (рис 1Б). Инсулятор 1А2 - эндогенный 8и(Нуу)-зависимый инсулятор, и его изучение важно с точки зрения выяснения значения белка Su(Hw) в рамках генома дрозофилы. Расположение данного инсулятора между геном yellow, имеющим относительно простую систему регуляции экспрессии, и генным комплексом achaete-scute (участвует в формировании периферической нервной

системы)(рис 1А), для которого характерна очень сложная временная и пространственная регуляция экспрессии, возможно, важно в установления паттернов независимой экспрессии этих генов.

1 Анализ структуры и функциональной активности 1а2 инсуаятора

1 1 Изучение энхансер-блокирующей активности

Энхансер-блокирующая - основная активность инсуляторов- например, инсулятор Su(Hw) способен полностью изолировать энхансер от промотора, то есть он является очень сильным инсулятором. В рамках данной работы нас интересовал, прежде всего, 1А2 инсулятор Ранее было показано, что этот инсулятор длиной 454 п н содержит на 3' (дистальном) конце два Su(Hw)-связывающих сайта Однако 125 п н. фрагмент 1А2 инсулятора, который содержит только сайты связывания для белка Su(Hw), теряет способность блокировать энхансеры Это можно объяснить тем, что для работы 1А2 инсулятора нужны какие-то дополнительные белки Например, недавно в системе /я vitro было показано связывание белка СР190 с проксимальным концом 1А2 инсулятора и с белком Su(Hw), что дало основание предполагать участие белка СР190 в работе 1А2 инсулятора

Рис 1 Инсулятор 1А2 А) Расположение 1А2 инсулятора

в геноме Б) Структура 1А2 инсулятора

Первой задачей настоящего исследования было выяснение значения проксимального участка в работе 1А2 инсулятора Анализ последовательности 1А2 инсулятора выявил в центральной его части 92 п н участок, высоко гомологичный району из мобильного элемента jockey Для выяснения роли в блокировании энхансеров проксимальной части инсулятора (218 па), включающей СР190-связывающую область и гомологию с jockey (рис 1Б), мы сравнили эффективность действия 1А2 инсулятора и его части, содержащей только 236 пне дистальной стороны, в трансгенных линиях Для этого были использованы наиболее удобные регуляторные системы генов yellow (определяет пигментацию тела, крыльев, щетинок и др) и white (определяет пигментацию глаз) В созданных конструкциях En(lA2454)YW и En(lA2236)YW (рис 2А), ген yellow (Y) был встроен перед геном white (W) Перед промотором гена yellow находились энхансеры, ответственные за пигментацию кутикулы тела (Веп) и крыльев (Wen) Между ними был встроен энхансер, активирующий ген white в глазах (Ее„) В интроне гена yellow находился энхансер, отвечающий за экспрессию этого гена в щетинках (Вгеп) Исследуемые элементы 1А2454 и 1А2236 были вставлены между энхансерами и промоторами генов в положение -893 относительно начала транскрипции yellow 1А2454 и 1А2236 фрагменты были окружены /ox-сайтами, узнающимися Сге рекомбиназой

В результате трансформации конструкции En(lA2454)YW в эмбрионы линии y'w1118 было получено 28 трансгенных линий, содержащих единичную инсерцию конструкции В 26 трансгенных линиях (рис 2Б) мухи имели промежуточную пигментацию тела, крыльев и глаз, что предполагает частичное блокирование энхансеров генов yellow и white 1А2 инсулятором При удалении инсулятора уровень пигментации мух значительно увеличивался Таким образом, полный 454 п н инсулятор эффективно, но не полностью блокирует энхансеры генов yellow и white При исследовании инсуляторной активности 236 п н фрагмента было получено 16 трансгенных линий (рис2Б) с конструкцией En(lA2236)YW Сравнение уровня пигментации мух исходных трансгенных En(lA2236)YW линий и производных с вырезанным 1А2236 элементом показал, что исследуемый элемент способен блокировать промоторы маркерных генов от их энхансеров Более того, при сравнении среднего уровня пигментации трансгенных линий с 1А2454 и 1А2236 оказалось, что оба элемента обладают приблизительно одинаковой по силе энхансер-блокирующей активностью Таким образом, 218 пн последовательность, содержащая CP 190-связывающий участок, не нужна для блокирования энхансеров и, по всей видимости, функционирующий инсуляторный комплекс может собираться на базе 236 п н района

i i

yellow white

Д EndA^lYW

En(1A2M6JYW

В yellow (тело) white

S 4 3 2 1 ЮТ Kp Кор тОр Op тЖ Ж сЖ ют

yellow

EtlflAZ^YW 8 14 6 28 2 2 1 10 6 5 2 28

En(«YW 16. 8 4 26/28 6 9 5 3 2 12 23/28

BndA^jYY» 3 3 4 18 1 1 2 4 5 3 16

En(i)YW 10 4 2 15/16 7 5 1 2 1 14/16

Рис 2 Исследование энхансер-блокирующей активности инсулятора 1А2 А) Схема En(1A2454)YW и En(1A2 )YW конструкций Черно-белый квадрат - инсулятор 1А2454, черный прямоугольник - участок 1А2 Вертикальные стрелки - сайты узнавания рекомбиназы Б) Анализ экспрессии генов yellow и white Ген yellow в последних парасегментах брюшка 1 - отсутствие экспрессии, 5 - нормальный уровень экспрессии, 2-4 - промежуточные уровни Ген white в глазах Кр -красный, нормальный уровень экспрессии, Кор - коричневый, тОр - темно-оранжевый, Ор - оранжевый, тЖ - темно-желтый, Ж - желтый, сЖ - светло-желтый Цифры в строках - число линий с соответствующим уровнем экспрессии гена N/T - отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение уровня экспрессии гена при удалении исследуемого элемента, к общему числу анализируемых линий

1 2 Изучение барьерной активности

Часть инсуляторов обладает способностью защищать экспрессирующийся ген от позитивных и негативных эффектов хроматина, окружающего ген или генный локус. Ранее для Su(Hw) инсулятора было показано, что он является не только самым эффективным в блокировании энхансеров, но и может создавать барьер между областями активного и репрессионного хроматина, в частности индуцированного комплексом из Ро1усотЬ-белков (далее Рс) Рс-белки образуют мультимерные комплексы на особых последовательностях, названных PRE (Polycomb Responsible Element) Механизм устанавливаемой ими репрессии пока до конца не ясен Предполагается, что репрессионные комплексы, наподобие энхансеров, могут взаимодействовать непосредственно с белковыми комплексами на промоторе В результате происходит репрессия транскрипции

Возможно, важную роль в репрессии играет участие Рс комплекса в осуществлении модификаций гистоновых белков, в результате этого Рс-зависимый репрессионный комплекс может распространяться по пуклеосомам, что приводит к формированию неактивного хроматина и репрессии рядом расположенных генов.

Для исследования способности 1А2 инсулятора являться границей между активным и репрессионным хроматином нами был использован известный 660 п н элемент PRE из регуляторной области гена Ultrabithorax В созданной конструкции (PRE)(1A2)Y(1A2)W элемент PRE был вставлен в регуляторную область yellow между энхансерами тела и крыльев и окружен сайтами узнавания для дрожжевой Flp рекомбиназы - frt Два 1А2 инсулятора были вставлены выше промотора yellow в положении -893 и между генами yellow и mimwhite в положении +4964 относительно начала транскрипции yellow Для исследования роли каждого из инсуляторов в регуляции экспрессии репортерных генов, они были клонированы между lox и Sce-I сайтами, узнающимися Сге рекомбиназой и Sce-I эндонуклеазой, соответственно (рис ЗА)

В результате трансформации конструкции (PRE)(1A2)Y(1A2)W были получены 52 трансгенные линии При этом только в трех линиях наблюдалась репрессия гена yellow в щетинках, которая восстанавливалась при удалении PRE из конструкции В других трансгенных линиях удаление PRE не влияло на уровень экспрессии rem. yellow Эти данные предполагают, что элемент 1А2 является эффективной границей, способной препятствовать распространению Рс-белков В 35 линиях наблюдалась полная репрессия гена white (белые глаза) При вырезании PRE происходило восстановление уровня экспрессии гена white Подробное обсуждение этого результата будет представлено ниже (3 часть I раздела)

yellow white

А кШ^ Ш-Ш-Е -4 t -|BiS Ш ШЖ Мш-П \4

г ™ J^J тТ TT

g yellow тело 5 4 3 2 1 ОТ 5 щетинки wv mv ev 1 N/T

(PRE}(1 A2)Y{1 A2}W 14 3 21 18 1 2 21

(A)(1A2)Y(1A2)W 1 7 13 4/21 20 1 3/21

(PRE)(fl)Y(1A2)W a 11 15/21 10 7 4 20/21

(PRE)(1A2)Y(fi)W 1 S 15 6/21 20 1 3/21

white Kop Op ТЖ ж саЖ Б N/T

<PRE)(1A2)Y(1A2)W 4 17 21

¡A)(1A2)Y(1A2)W i 5 9 6 20/21

(PRE)(&)Y{1A2)W 4 17 0/21

(PRE!(1A2)Y(A)W 1 1 9 8 2 17/21

РисЗ Изучение барьерной активности1А2 инсулятора А) Схема (PRE)(1A2)Y(1A2)W конструкции

Б) Анализ экспрессии генов yellow и white Оценка уровней экспрессии генов yellow (тело) и white аналогична рис 2 Экспрессия гена yellow в грудных щетинках и волосках 1 - все щетинки и волоски желтые, отсутствие экспрессии, ev - большинство щетинок желтые, mv - волоски и половина щетинок желтые, wv- волоски и 1-2 щетинки желтые, 5 - нормальный уровень экспрессии, все волоски и щетинки черные

Для более детального анализа мы отобрали 21 линию (рис ЗБ), в которых ген white был

зарепрессирован При удалении дистального 1А2 инсулятора, расположенного рядом с

промотором гена white, ген yellow оставался защищен от репрессионного влияния PRE, а

экспрессия гена white восстанавливалась То есть наличия одной копии 1А2 инсулятора,

отделяющего ген от PRE, достаточно для установления границы между активным и

репрессионным хроматином При вырезании проксимального фрагмента 1А2 наблюдалось распространение репрессионного комплекса на ген yellow (о чем свидетельствовала желтая окраска тела, крыльев и большинства щетинок), что подтверждает сделанное выше предположение о барьерной активности инсулятора 1А2 В то же время ген white оставался зарепрессированным несмотря на то, что расстояние от PRE до промотора гена white превышало 5 тпн и перед промотором гена располагался 1А2 инсулятор, способный выполнять барьерные функции Возможное объяснение такого неожиданного результата представлено ниже (3 часть)

Таким образом, можно сделать выводы, что инсулятор 1А2: 1) обладает энхансер-блокирующей активностью средней силы по сравнению с Su(Hw) инсулятором, и реализация этой активности не зависит от проксимальной части инсулятора, 2) способен препятствовать распространению репрессионного хроматина, индуцированного белками Рс-группы.

2. Роль белков SpIHw). ModImdg4)-67 2 и E1y)2 в активности 1А2 инсулятора Еще одной важной задачей при характеристике инсулятора является определение белков-участников реализации энхансер-блокирующей и барьерной активностей Ранее для инсулятора Su(Hw) была показана важная роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67 2 Поэтому в данном случае мы сконцентировали свое внимание прежде всего на этих белках Кроме этого недавно в двугибридной дрожжевой системе было показано, что продукт гена е(у)2 способен взаимодействовать с районом Su(Hw) белка, который включает несколько цинковых пальцев (лаборатория Ю В Ильина) Это взаимодействие было доказано в системах in vitro и m vivo Более того, оказалось, что белок Е(у)2 колокализуется с участками связывания белка Su(Hw), в частности, с районом 1А2 инсулятора Все это наводило на мысль о возможном важном функциональном значении белка Е(у)2 в функционировании 8и(Нте)-зависимых инсуляторов Поэтому особое место в настоящем исследовании заняло тестирование белка Е(у)2 в качестве нового компонента $и(Нуг)-зависимых инсуляторов

2 1 Белок SufHw)

Для проверки роли белка Su(Hw) в функционировании инсулятора 1А2 были использованы 3 варианта мутантных аллелей гена su(Hw)

su(Hw)" - нуль-мутация, вызванная делецией промотора гена su(Hw), детальна в гомозиготе из-за делеции соседнего гена;

su(Hw)2 - гипоморфная мутация, десятикратное снижение экспрессии гена, инсерция мобильного элемента jockey в интрон гена.

Почти полную инактивацию гена Su(Hw) можно воспроизвести на фоне гетерозиготной мутации su(Hw)2/su(Hw)v (su(Hw)~)

Во-первых, была изучена роль белка Su(Hw) в проявлении энхансер-блокирующей активности 1А2 инсулятора Для этого 4 трансгенные линии En(lA24S4)YW, в которых конструкция находилась на 2-ой хромосоме, были выведены на мутантный фон su(Hw) (рис 4А) У полученных таким образом линий уровень окраски тела и крыльев восстанавливался до уровня

производных, содержащих En(lA2454)YW конструкцию с удаленным инсулятором Для гена white

был получен интересный результат на su(Hw)~ фоне пигментация глаз восстанавливалась у 2 линий, а у других 2 - уменьшалась Пока объяснение этому факту не найдено

Далее мы приступили к выяснению роли белка Su(Hw) в осуществлении барьерной активности инсулятора в линии (PRE)(1A2)Y(1A2)W были также введены мутантные аллели su(Hw) (рис 5В) Оказалось, что для установления эффективной границы на пути распространения Рс-белков, как и при реализации энхансер-блокирующей активности, необходимо наличие функционально активного белка Su(Hw)

2 2 Белок Mod(mdg4)-67 2

Мутация mod(mdg4)"' получена при вставке мобильного элемента Stalker в кодирующую область гена mod(mdg4), в результате чего у белка Mod(mdg4)-67 2 отсутствует С-концевой домен, отвечающий за взаимодействие с белком Su(Hw) Именно этим фактом и обусловлен выбор данного аллельного варианта мутации при тестировании роли белка Mod(mdg4)-67 2 в функционировании 1А2 инсулятора Эта мутация полностью жизнеспособна в гомозиготе, поэтому трансгенные линии со встройкой конструкции на 2-й хромосоме выводились на гомозиготный по мутации mod(mdg4')"' фон Ранее была описана роль белка Mod(mdg4)-67 2 в активности Su(Hw) инсулятора Далеко не всегда инсулятор просто теряет эихансер-блокирующую активностьво, во многих случаях он превращается в сайленсер, который, в частности, способен специфично репрессировать промотор гена yellow Стоит отметить, что такой интересный эффект, по всей видимости, сильно зависит от места интеграции трансгенных конструкций в геноме

эффективность инсупяции

sa(Hwf" su(Hwf'* moct""1 mod"'* e(y)2

En{1 A2)YW ++ + ++ + +

К „ тело щетинки " yellow

' S 4 3 2 1 N/T 5 wv mv ev 1

En(1A2'№,)YW m/m 5 9 1 2 17 10 1 1 2 3 17

en(1A2454)YW ml* 2 4 4 6 1 13/17 14 1 1 1 16/17

6n(1A2!3s)YW m/m 5 6 1 12 12 12

En(1A2Me)YW mIt white Kp 3 Kop Г 2 TOP Op 12/12 ТЖ 12 Ж сЖ N/T 0/12

6n(1A2454)YW m/m 5 3 4 3 2 17

En(1A24S4)YW ml* 2 3 4 4 2 2 13/17

En(1A2MS)YW mlm 1 2 3 4 1 1 12

En(1A2»6)YW ml* 1 2 7 2 11/12

S__yellow

SBlLQEIB^ + Ф1Г *

Ensu-mtsu) 2L tas_21A 5 1 ev 1

Л1А2Р

* suWHfefyir' •*• »feW ♦ «W2"

En(tA2)YW(iA2) 3R12685208 wv ev ev ev ev wv ev

3t 22094115 wv 1 1 ev 1 ev 1 A1A2 Ag

+ sv(Hwr<,(y!Z" * + eM2"

En(1A2)VW(Su) . ' . ' . -

2R14458492 5 5 5 1 1 5 ev

mv 1 111 11

Рис 4 Изучение вклада белков Su(Hw), Mod9mdg4)-67 2, E(y)2 в энхансер-блокирующуга активность инсулятора 1А2

A) Влияние белков Su{Hw), Mod(mdg4), Е(у)2 на блокирование энхансеров инсулятором 1А2

++ средний уровень, + слабый, -отсутствие инсуляции Б) Анализ экспрессии генов yellow и white в линиях, полученных путем транспозиций Р-элемента на фоне мутации mod(mdg4)u1 (m -mod(mdg4)u1, + - mod(mdg4)*) Оценка уровней экспрессии генов yellow (тело, щетинки) и white аналогична рис 2,3

B) Роль белка Е(у)2 в изоляции конструкций от негативного влияния окружающего хроматина Оценка уровня репрессии гена yellow проводилась по степени пигментации щетинок в линиях и их производных

1А2Р - инсулятор, вставленный между энхансерами и

промотором,

1А2" - инсулятор, вставленный в конце гена yellow

Рядом с названиями конструкций указаны координаты встройки конструкций в геноме (карты с окружающими генами

представлены в Диссертации)

Мутантный mod(mdg4)ul фенотип был изучен на тех же линиях, что и su(Hw)' В гомозиготных mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul линиях EyEe(lA2454)YW и EyEe(lA2236)YW происходило полное восстановление пигментации тела, крыльев и глаз до дикого типа (рис 4А) То есть можно констатировать тот факт, что белок Mod(mdg4)-67 2 играет очень важную роль в блокировании энхансеров инсулятором 1А2 При анализе 4 линий на фоне гомозиготной mod(mdg4)"' мутации не было найдено ни одной, в которой инсулятор начинал бы вести себя как репрессор Выше уже было отмечено, что способность к репрессии может сильно зависеть от места интеграции конструкции в геноме, поэтому для более детального исследования влияния мутации mod(mdg4)ul на активность 1А2 инсулятора необходимо было на фоне гомозиготной mod(mdg4)ul мутации получить достаточно большое количество независимых трансгенных линий, содержащих ЕуЕе( 1 A2454)YW или ЕуЕе( 1А2236) Y W конструкции С этой целью в трансгенные линии, содержащие инсерции EyEe(lA2454)YW или ЕуЕе(1 A2236)YW конструкции на Х-хромосоме, была введена мутация mod(mdg4)"' Затем в этих линиях на фоне мутации mod(mdg4)"' были индуцированы транспозиции конструкции с Х-хромосомы на аутосомы В результате были получены гомозиготные по мутации mod(mdg4)"' линии, содержащие единичную инсерцию либо EyEe(lA2454)YW конструкции, либо EyEe(lA2236)YW (рис4Б) Во всех полученных линиях на фоне mod(mdg4)"' энхансер-блокирующая активность инсулятора 1А2 исчезала, и уровень пигментации тела, крыльев, глаз приближался к дикому типу При введении в эти линии дикого аллеля mod(mdg4) уже в гетерозиготе mod(mdg4)ul'/+ происходило восстановление энхансер-блокирующей активности инсулятора Кроме этого, необходимо отметить, что для полного инсулятора 1А2434 наблюдалась картина, сходная с инсулятором Su(Hw) из МДГ4 в 6 из 17 линий происходила репрессия промотора гена yellow (щетинки становятся желтыми) В конструкции с элементом 1А2236 не было получено ни одной зарепрессированной линии, что, возможно, свидетельствует о том, что функциональная дистальная часть 1А2 инсулятора не способна к репрессии транскрипции yellow на фоне мутации mod(mdg4)"' без проксимального района, который т vitro связывает белок CP 190

В линии (PRE)(1A2)Y(1A2)W была также введена мутация mod(mdg4)"' (рис 5В) По полученным данным эта мутация не оказывает влияния на проявление барьерной активности инсулятором 1А2 По всей видимости, такой результат исключает белок Mod(mdg4)-67 2 из списка возможных кандидатов на участие в установлении границы между активным и репрессионным хроматином

2 3 Белок Е(у)2

Во всех сериях экспериментов мы использовали достаточно слабую мутацию е(у)2которая была получена встройкой мобильного элемента Stalker в промоторный участок гена, в результате чего количество мРНК гена е(у)2 уменьшается приблизительно в 2 раза Сама по себе эта мутация характеризуется достаточно слабыми морфологическими проявлениями короткое бочкообразное тело, разделенные крылья, измененные фасетки, низкая фертильность Комбинация su(Hw)' с е(у)2"' приводит к смерти на личиночной стадии Это является иллюстрацией того, что su(Hw) и е(у)2

функционально связаны.

Вначале была изучена роль белка Е(у)2 в реализации энхансер-блокирующей активности Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов Ранее полученные в нашей лаборатории по введению мутации е(у)2"' в EnSuY(Su)W линии (в них Su(Hw) инсулятор вставлен в положении -893 относительно начала транскрипции yellow и за геном yellow) демонстрируют, что энхансер-блокирующая активность инсулятора не изменяется Только в одной линии, попавшей в область гетерохроматина - теломер-ассоциированную последовательность на 2L хромосоме, на фоне мутации е(у)2"' происходила репрессия гена yellow в щетинках (рис 4В, верхняя панель) По аналогичной схеме, мы решили проверить роль белка Е(у)2 в работе 1А2 инсулятора В En(lA2)YW(lA2) и En(lA2)YW(Su) конструкциях (рис 4В, две нижние панели), 1А2, окруженный ./ri-сайтами был вставлен в положении -893 относительно старта транскрипции гена yellow, а окруженный /ас-сайтами 1А2 или Su(Hw) были помещены с 3' стороны гена mini white Среди полученных трансгенных линий были найдены 4, в которых делеция переднего 1А2 инсулятора либо инактивация белка Su(Hw) приводили к репрессии гена yellow в щетинках Эти линии были локализованы, и оказалось, что во всех 4 случаях конструкции встроилась в межгенные участки, на значительном расстоянии от генов Таким образом, в этих линиях инсуляторы, с которыми связывается белок Su(Hw), скорей всего, защищают транскрипцию гена yellow от негативного влияния окружающего хроматина Но самое главное - мутация е(у)21,1 влияла на экспрессию yellow только в этих четырех линиях, в то время как в остальных протестированных линиях (порядка 30) на фоне этой мутации 1А2 инсулятор «вел себя в рамках стандартной», энхансер-блокирующей, активности Однако эти результаты не являются полным доказательством вовлеченности белка Е(у)2 в проявление именно барьерной активности Su(Hw) инсуляторов

Поэтому следующим шагом стала необходимость демонстрации того, что наблюдаемые выше эффекты на щетинках не связаны со специфичным участием белка Е(у)2 в экспрессии гена yellow в щетинках Для этого была создана конструкция EnPrY(lA2)YW (рис 5А), в которой 1А2 инсулятор был вставлен в положении +660 в интрон гена yellow, между энхансером щетинок и промотором гена В 9 из 11 трансгенных линий у мух был промежуточный уровень пигментации щетинок, что подтверждает реализацию энхансер-блокирующей активности 1А2 инсулятора в этом положении Далее во все исследуемые линии была введена мутация е(у)2"', и оказалось, что уменьшение количества белка Е(у)2 не влияет на 1) проявление энхансер-блокирующей активности 1А2 инсулятора, 2) эффективность действия энхансера щетинок (что видно при вырезании инсулятора из трансгенных линий) Таким образом, белок Е(у)2 не участвует в активации гена yellow в щетинках

Далее мы использовали трансгенные конструкции с PRE Конструкция (PRE)(Su)YW была ранее получена в нашей лаборатории, в процессе проверки барьерной активности Su(Hw) инсулятора (рис 5Б) Для анализа были выбраны линии, в которых PRE полностью репрессировал экспрессию гена yellow при удалении инсулятора, и протестированы на фоне мутации е(у)2"' Эта

мутация имела менее выраженный эффект по сравнению с фоном $и(Ну>)\ но тем не менее в 8 из 16 линий уменьшение количества белка Е(у)2 приводило к заметному ухудшению барьерной активности инсулятора

yellow

4Щ.

5 "wv' mv ev 1 N/T

Er»PrY(1A2)YW 2 4 e(y}2 11

11 0/11

EnPrY(A)YW 11 е(у)2"1Л 2 3

9/11 2/11

yellow

ш. —

5 wv mv ev 1 N/T

(PRE)(Su)YW 16

е(у)2иЮ 8 6 1

16 8/16

(PRE)(A)YW

5 11 16/16

yellow

5 wv mv ev 1 N/T

(PRE)(1A2)YW 14 1 3 е(У)2"\ 4 5

moa 6

3 18/18

2 em 0/6

(A)(1A2)YW 18

.'u»

e(y)2 18 (PRE)(a)YW

4/18 _0/18

8 18/18

Рис 5 Изучение вклада белков Е(у)2, Su(Hw), Мос1(тс1д4)-67 2 в барьерную активность инсулятора 1А2

A) Анализ ЕпРгУ(1А2)У\Л/ - белок Е(у)2 не нужен для блокирования энхансера щетинок Б) Конструкция (РЯЕ)(5и)У\М

Роль белка Е(у)2 в барьерной активности 8и(1№) инсулятора

B) Конструкция ^Е)(1А2)\ТЛ/

Роль белков Е(у)2, Зи(Нх^), Мос1(тс1д4) в барьерной активности 1А2 инсулятора Оценка уровня экспрессии гена проводилась по щетинкам аналогично рис 3

Подобная серия экспериментов была проведена и для 1А2 инсулятора (рис 5В) В конструкцию (PRE)(1A2)YW был введен аллель е(у)2"', в результате чего происходила практически полная репрессии гена yellow То есть 1А2 инсулятор очень резко отреагировал на уменьшение количества белка Е(у)2 В то же время при вырезании PRE из трансгенных линий е(у)2"' мутация никак не влияет на уровень экспрессии тепа.yellow

Таким образом, важным выводом этой части работы является то, что белок Е(у)2 вовлечен в реализацию 8и(Н\у)-зависимыми инсуляторами именно барьерной, но никак не энхансер-блокирующей, активности

Полученные результаты предполагают, что 1А2 инсулятор имеет модульное строение. Так, он содержит в своем составе, по крайней мере, два участка, обладающие разными активностями. Один участок, содержащий сайты связывания для белка Su(Hw), обладает энхансер-блокирующей и барьерной активностями, реализация первой зависит от белка Mod(mdg4)-67 2, второй - от белка Е(у)2 Сам белок Su(Hw) необходим для проявлении и энхансер-блокирующей и барьерной активностей Другой участок, расположенный с 5'-стороны от первого, возможно, модулирует активность инсулятора и в некоторых случаях превращает его в репрессор. Роль белка СР190 в функционировании 1А2 инсулятора

определить пока не удалось.

3 1а2 ИНСУЛЯТОР СПОСОБЕН К ФУНКЦИОНАЛЬНЫМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯМ

При постановке экспериментальных задач одной из причин детального изучения 1А2 инсулятора стала потенциальная возможность использования этого инсулятора для изучения вклада взаимодействий между инсуляторами в регуляцию экспрессии генов. Однако прежде чем использовать 1А2 инсулятор именно в этом контексте, помимо пристального изучения его энхансер-блокирующей и барьерной активностей, необходимым шагом является доказательство способности 1А2 инсулятора к функциональным взаимодействиям Так, ранее возможности реализации такого типа взаимодействий были продемонстрированы для Su(Hw)-HHcyiiHTopa и инсулятора MCP из локуса Abd-B гена

Стоит отметить, что в первой части работы, где изучалась барьерная активность инсулятора на примере конструкции (PRE)(1A2)Y(1A2)W, для 1А2 инсулятора уже была продемонстрирована способность к функциональным взаимодействиям Так, в большинстве трансгенных линиях наблюдалась полная репрессия гена white При вырезании PRE происходило восстановление уровня экспрессии гена white до базового уровня Этот результат вполне объясним, если предположить, что 1А2 инсуляторы в данном случае взаимодействуют друг с другом, в результате чего PRE приближается к промотору гена white и начинает репрессировать его через два инсулятора В результате взаимодействия 1А2 инсуляторов друг с другом создается домен, в пределах которого ген yellow оказывается эффективно защищен от действия Рс-зависимой репрессии Можно предположить, что домен, формируемый двумя взаимодействующими инсуляторами, стерически препятствует прямому взаимодействию репрессионого комплекса, связанного с PRE, с факторами транскрипции на промоторе гена yellow В то же время, при взаимодействии инсуляторов PRE приближается к промотору гена white, в результате прямого контакта между белками репрессионного комплекса на PRE и транскрипционными факторами на white промоторе происходит репрессия транскрипции (рис 6А)

Чтобы показать, что наблюдаемый нами эффект взаимодействия двух 1А2 инсуляторов не является уникальным для модельных систем с элементами PRE, мы проверили эффективность взаимодействия между 1А2 инсуляторами на другой системе

Для этого была создана конструкция 1z(1A2)Y(1A2) (рис 6Б), в которой ген yellow был окружен 1А2 инсуляторами Выше гена yellow в противоположном направлении вставлен ген ß-галактозидазы под минимальным промотором hsp43 (в результате ген практически не экспрессируется) За геном yellow были вставлены 10 сайтов связывания для дрожжевого белка-активатора GAL4, который способен активировать транскрипцию мишеневых генов только в тех случаях, когда оказывается приближен к промотору На больших расстояниях (в данном случае порядка 5 тпн) и с 3' конца гена (в данном случае yellow) он не работает Скрещивая трансгенные линии с линией мух, экспрессирующих белок GAL4, активация гена ß-галактозидазы не будет происходить в тех случаях, когда GAL-сайты оказываются на большом расстоянии от

Ььр43 промотора. Однако если ]А2 инсуляторы способны взаимодействовать друг с другом, они могут подтягивать САЬ-сайты к промотору гена р-галактозидазы, и в этом случае при наличии белка САЬ4 можно наблюдать активацию 0-галактозидазы.

Рис. 6. Способность 1А2 инсулятора участвовать в установлении функциональных взам м одемелвий

A) модель

функционирования 1А2 инсуляторов при блокировании Резав и си мой репрессии Б) Конструкт lz{1A2)Y(1A2), Оценивалось изменение активности гена lacZ при введении в трансгенные линии белка-активатора GAL4, способного работать на коротких дистанциях. Были проанализированы 3 линии с производными, в которых удалялись 1А2 инсуляторы. Все

измерения были

нормированы на общее содержание белка в пробах. Представлены относительные значения активности гена в разных nviHW**. у1«1 -

отрицательный контроль. 1 А2р - инсулятор, вставленный выше гена yellow,

1A2d- инсулятор, вставленный ниже гена yellow

B) Конструкция dY(1A2)W, Скобками показана депеция в промоторной области гена yellow. Анализ экспрессии гена yellow проводился в брюшке и щетинках. Оценки уровней экспрессии аналогичны использованным в рис.2, 3.

Из полученных трансгенных линий детальный анализ активации гена (Э-галактозидазы был проведен для 3 линий. Приведены относительные средние значения активности р-галактозидазы, полученные б двух независимых повторностях и нормированные на общее содержание белка в пробах (рис.бБ), Из представленных данных видно, что во всех 3 линиях при введении белка GAL4 происходила активация гена р-галактоз ид азы. При вырезании IA2 инсулятора активность резко падает. Интересно, что при вырезании IA2 инеулятора, расположенного перед геном yellow, остается достаточно хорошо различимый уровень активации Р-галактозидазы. Пока этот результат трудно объяснить с позиций известных свойств инсуляторов. Однако подобные данные нами были уже получены выше, в первой части работы-.

lacZ

ЩШ-Ш-ВС

1Р1

yellow

Измерена

а мости В'Гадяктозкд»»! а лм

id*

ijot-Я U(l*i]Y(lA2]

Э.

е- ■

г-

1—■ И .7 11.П ¿мыл in ' GAL

1—1 -

1 ■ ■ lA2p*CAL

1 1 ■ UOi

■ lA2i'OAL

ИГЛ

Трансг*нны* линии и их протводны«

yollow

3—оШ-ED-G

yellow dV(1A2)W dY(ü)W

ешш

I I

white

тело 4 3 2

4 6 10

N)T 13

3 10/13

щетинки

5 VW mv ev 1

ЦП

2 1 13 7 3 12/13

при вырезании проксимального фрагмента IA2 из конструкции с элементом PRC глаза у мух

оставались белыми, то есть уровень экспрессии гена white не восстанавливался даже несмотря на то, что расстояние от PRE до промотора гена white превышало 5 т п н и перед промотором гена располагался 1А2 инсулятор, способный выполнять барьерные функции То есть мы, по всей видимости, получили не артефакт системы, а закономерность А в качестве объяснения такой закономерности можно предположить, что 1А2 инсулятор, расположенный в 3' области гена yellow, способен взаимодействовать с промотором гена yellow, и в результате GAL-сайты оказываются приближены к hsp43 промотору, a PRE - к промотору гена white

Для подтверждения высказанной гипотезы о возможности взаимодействия между 1А2 инсулятором и промотором гена yellow мы использовали ранее сделанное наблюдение, что Su(Hw) инсулятор может на большом расстоянии стимулировать ослабленный промотор гена yellow Наиболее вероятным объяснением такого дистанционного эффекта является прямое взаимодействие между Su(Hw) инсулятором и промотором гена, yellow Поэтому было решено проверить, может ли 1А2 инсулятор стимулировать ослабленный промотор гена yellow на большом расстоянии Для тестирования стимулирующей активности 1А2 инсулятора была создана конструкция dY(lA2)W (рис 6В), в которой перед промотором была сделана делеция от -146 до -70 п н 1А2 инсулятор, окруженный /оя-сайтами, был встроен между генами yellow и white Возможность вырезать 1А2 инсулятор позволяла сравнивать экспрессию гена yellow в присутствии и отсутствии 1А2 инсулятора в одних и тех же местах генома Во всех полученных линиях наблюдался пониженный уровень экспрессии гена^е/tow, что легко объясняется наличием в конструкции ослабленного промотора гена При удалении инсулятора 1А2 происходило еще большее снижение уровня экспрессии гена yellow несмотря на то, что инсулятор располагался за геном yellow и не мог защищать промотор yellow от негативного эффекта окружающего хроматина Следовательно, 1А2 инсулятор находясь на 3' конце гена (в своем нативном положении) может стимулировать работу ослабленного промотора Полученные результаты можно объяснить наличием прямых взаимодействий между белковыми комплексами, собранными на промоторе и инсуляторе Однако о глобальной роли установления таких связей в геноме дрозофилы пока ничего нельзя сказать В дальнейшем неплохо было бы провести проверку на наличие таких взаимодействий непосредственно в локусе yellow в геноме дрозофилы

Итак, два 1А2 инсулятора способны осуществлять функциональные взаимодействия даже на расстоянии в 5 т п.н через активный ген yellow. Полученные данные предполагают, что 1А2 инсулятор способен образовывать слабые контакты (прямые или опосредованные -неизвестно) с промоторной областью гена yellow

II Демонстрация возможного участия инсуаяторов в установлении энхансер-промоторных взаимодействий

В рамках этого раздела на примере «минимальной» системы с двумя генами осуществлена попытка демонстрации потенциальной возможности инсуляторов регулировать

взаимодействия между энхансерами и промоторами Необходимо отметить, что самая главная

задача при проведении этой части работы - показать, что инсуляторы являются не просто границами разделяющими независимые домены транскрипции На самом деле даже просто разные варианты 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов способны очень специфично и тонко регулировать уровень транскрипции генов Несмотря на одинаковую природу этих инсуляторов и на то, что все они способны взаимодействовать друг с другом, эффекты таких взаимодействий порой оказываются непредсказуемыми В соответствии с главной целью данной работы предполагается не только показать простую возможность взаимодействия разных инсуляторов друг с другом, но, прежде всего, на примере простой трансгенной системы представить насколько обширным может оказаться поле для возможностей тонкой регулировки работы генов благодаря межинсуляторным, по всей видимости, многополярным, взаимодействиям

1. Дизайн тест-системы для изучения влияния функциональных взаимодействий

МЕЖДУ РАЗНЫМИ НАБОРАМИ ИНСУЛЯТОРОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

Вся работа для упрощения интерпретации получаемых результатов была проведена на Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторах (рис 7 А)'

• Инсулятор Su(Hw) в 340 п н из ретротранспозона МДГ4, содержащий 12 сайтов связывания для белка Su(Hw), соединенных друг с другом АТ-богатыми последовательностями Самый сильный из известных инсуляторов дрозофилы

• Синтетический элемент S4, полученный путем тетрамеризации 30 пи последовательности, соответствующей 3-му сайту связывания Su(Hw) с окружающими участками в Su(Hw) инсуляторе Средний по силе инсулятор

• 1А2 инсулятор с 2 8и(Н\у)-связывающими сайтами Средний по силе инсулятор

В одной серии конструкций окруженный ^-сайтами 1А2 инсулятор был вставлен в положении -893 относительно старта транскрипции yellow, между энхансерами и промоторами генов, а окруженный fox-сайтами 1А2, S4 или Su(Hw) инсуляторы были встроены с 3'стороны гена white (рис 7Б, положение +3291) Таким образом, в данных конструкциях 2 вырезаемых инсулятора окружают оба маркерных гена, что дает возможность проверить, способны ли инсуляторы функционально взаимодействовать друг с другом на расстоянии в 10 т п н

В другой серии 'инвариантный' 1А2 располагается в положении -893, в то время как 2 вырезаемых 1А2, S4 или Su(Hw) инсулятора встроены в положении -343 (frt) и +4817 (1ох) относительно начала транскрипции yellow (рис 7Б) Таким образом, в этих конструкциях можно сравнивать энхансер-блокирующую активность 1А2 инсулятора в комбинации с другими инсуляторами, помещенными либо между энхансерами и промотором гена yellow либо за 3'концом тена. yellow

Основная часть работ по функциональным взаимодействиям инсуляторов проводится на примере Su(Hw) инсулятора Это очень сильный инсулятор, способный, с одной стороны, в случае одной копии, полностью изолировать энхансеры от промоторов, с другой стороны, в случае тандемной встройки 2 инсуляторов, эффективно сближать энхансер с промотором Однако

вследствие большой силы инсулятора 8и(Нлу) промежуточные уровни инсуляции обычно оказывается невозможно продемонстрировать С этой точки зрения 1А2 инсулятор является более чувствительным так, он обладает всеми типичными инсуляторными активностями (что детально было продемонстрировано в первой части работы), при этом по сравнению с инсулятором 8и(Н\у) как более слабый инсулятор он будет работать в гораздо более чувствительной манере (появляется большое число промежуточных уровней блокирования энхансеров) Соответственно, и созданная на базе 1А2 инсулятора тест-система для изучения вклада инсуляторов в установление энхансер-промоторных взаимодействий будет обладать большей чувствительностью

А*" ГШИПППОПОППШ »«"" ++++

ЦШШЩ 130«* ++

1Аг I 'Цию-ьжд ■ ■»,.. П П 454 + +

yellow

white

-893 -343 +4817 +3291

тэ эффективность инсуляции

JO •BS 13 y&iow white yellow white

НЕЕШЙЕ Rt_КЯЮЭ fi—"CI 1 ++ ++

-34-3 ye/tow white

4wlslat— JBMSSHE2I- ++ ++

— Л ellow _ wftfte

ЧНЗЕМЗ 1знВД1_51.......... - ++

yellow while

- -

Рис 7 Дизайн тест-системы

A) Структура Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов, используемых в работе

Б) Общий вид модельной системы Инвариантный 1А2 инсулятор в положении -893 относительно старта транскрипции yellow Вертикальными стрелками указаны позиции, в которые встраивались инсуляторы -343 и +4817 относительно транскрипции гена yellow и +3291 - относительно гена white W -энхансер крыльев, В - энхансер тела, Е -энхансер глаз

B) Тестирование активности 1А2 инсулятора во всех используемых положениях в трансгенной системе

++ средний уровень блокирования энхансеров,

- отсутствие эффекта блокирования энхансеров

Прежде чем использовать 1А2 инсулятор в таком контексте был проведен контроль всех позиций в трансгенной системе, в которые планировалось встраивать инсуляторы Так, была проанализирована серия конструкций (рис 7В), в которых 1А2 инсулятор был помещен в разные места относительно энхансеров и промоторов генов -893, -343, +4817 относительно начала транскрипции гена yellow и +3291 относительно начала транскрипции гена white Выше уже было показано, что в положении -893 1А2 инсулятор способен частично изолировать энхансер от промотора, далее такой уровень энхансер-блокирующей активности мы будем считать средним В то же время энхансер-блокирующую активность, соответствующую Su(Hw) инсулятору, будем считать полной При приближении инсулятора к промотору гена yellow в положении -343 1А2 инсулятор блокирует энхансеры генов yellow и white от промоторов с такой же средней силой 1А2 инсулятор, помещенный между генами yellow и white, нормально инсулирует ген white, в то же время на уровень экспрессии гена yellow не влияет, что полностью согласуется с принципами реализации энхансер-блокирующей активности Аналогично 1А2 инсулятор, размещенный ниже гена white, не оказывает никакого влияния на уровни экспрессии маркерных генов

2. Сила влияния взаимодействий между инсуляторами на работу генов зависит от

взаимного расположения и расстояний между всеми участниками транскрипционной регуаяторнон системы.

2.1 Взаимодействия между тлцо£.мно расположенными инсуляторами - BCÉffiA ли работает нейтрализация?

Прежде всего, было проведено Сравнение энхансер-блок иру ющей актин мости 1А2 инсулятора в его комбинации с другим инсулятором, вставленным тандем но близко перед промотором гена yellow, но на расстоянии в 5 т.п.н, от промотора гена while.

Сначала проанализируем результаты по отношению к гену yellow (рис.8Б): во всех тестируемых тандемах (1А2-1Л2, 1A2-SJ, I А2—Su) зн.чанссры достаточно эффективно активируют промотор, демонстрируя ранее описанный феномен нейтрализации инеуляции (Muravyova el al., 1999). Неожиданным оказался результат, полученный для гена white. Во всех 3 вариантах (рис.8В) уровень инеуляции гена заметно не изменялся в присутствии одной или двух копни инсулятора. То есть в данном случае функциональные пары инсуляторов, расположенные на значительном расстоянии от промотора гена while, никоим образом не способны приводить к проявлению эффекта нейтрализации инеуляции

g эффективность инеуляции

У №

УОГСО» whllo

.Еяттдашл — ++

_ re/tow wt)!!!п

flíBOCteOl- + ++

yrtlovf * frite

Рис.8, Эффекты взаимодействий между тандемно расположенными инсуляторами. А) Модель влияния на энхансер-промоторную коммуникацию тандемно

встроенных инсуляторов (пятиугольники):

промотор гена yellow (серый прямоугольник) приближен к энхансерам и нормально активируется, промотор гена white (белый прямоугольник) оказывается в невыгодной конфигурации по отношению к энхансеру. Б) Анализ эффективности блокировании промоторов генов yellow и white от их энхансеров: ++ средний уровень; + слабый уровень; - нейтрализация инеуляции, у — yellow. w - white.

Объяснение этого результата связано с двумя возможностями: во-первых, наблюдаемые

эффекты могут быть сильно зависимы от природы энхансеров и/или промоторов, используемых в

модельной системе, во-вторых, все регул яторные элементы в данной системе распределены в

определенном порядке и на определенных расстояниях друг относительно друга, В данном случае

(рис.8А) промотор гена yellow достаточно близко расположен по отношению к инсулятору, в

результате при взаимодействии 2 инсуляторов энхансеры гена yellow оказываются в

непосредственном соседстве с промотором. В то же время промотор гена while находится очень

далеко от инсуляторов - на расстоянии в 5 т.п.н.,- и в данном случае при взаимодействии между

инсуляторами расстояние от промотора гена white до энхансера практически не изменяется (с 5

т.п.н. до 4,5 т.п.н.). Другими словами, полученные результаты показывают, что взаимодействие

между тандемно расположенными инсуляторами помогает энхансеру активировать промотор

только в том случае, когда инсуляторы оказываются вблизи энхансера и промотора и в процессе взаимодействия инсуляторов друг с другом происходит значительное сближение энхансера с промотором В то же время существует еще один вариант возможного объяснения не «оттягивает» ли на себя сигнал, идущий от всех энхансеров, промотор гена yellow, который в результате взаимодействия инсуляторов оказался в более выгодном положении относительно энхансеров по сравнению с промотором white Для ответа на этот вопрос с парой 1А2 инсуляторов была сделана конструкция, в которой промотор гена yellow был удален Как видно, результаты по уровню транскрипции гена white никак не отличаются от полученных выше Это говорит о том, что в данном случае при интерпретации результатов, действительно, скорей всего, основное значение следует отводить расстоянию между элементами

2 2 Взаимодействия между инсуляторами, окружающими первый маркерный ген - что произойдет при увеличении расстояния между инсуляторамир

Следующим логичным шагом стала проверка значения линейных расстояний между взаимодействующими элементами при активации энхансером мишеневого промотора В результате были проанализированы варианты, в которых инсулятор был приближен к промотору гена white и находился между генами, так что ген yellow оказывался окруженным инсуляторами (рис 9Б)

Рис 9 Эффекты взаимодействий между инсуляторами, окружающими один ген А) Модель влияния на энхансер-промоторную коммуникацию инсуляторов, фланкирующих ген промотор гена yellow оказывается блокирован в петле и поэтому активация не происходит, промотор гена white в результате взаимодействия между инсуляторами сближается с энхансером и запускается активация гена white Б) Анализ эффективности блокировании промоторов генов yellow и white ++++ полная инсуляция, +++ сильный уровень, ++ средний уровень, + слабый уровень, - нейтрализация инсуляции

Как видно из представленных данных, при размещении инсулятора перед геном white во всех случаях изоляция его промотора снимается (рис 9Б, панели 2,4,6) Этот результат подтверждает предположение о том, что при помещении инсулятора вблизи промотора гена в результате взаимодействия между инсуляторами происходит уменьшение физического расстояния между энхансером и промотором, энхансер оказывается в выгодной конфигурации по отношению к промотору и начинает его эффективно активировать (рис 9А)

В то же время для yellow полученная картина тоже логично вписывается в логику наших рассуждений эффект нейтрализации, наблюдаемый в предыдущей серии экспериментов,

отсутствует (рис 9Б, панели 2,4,6) Более того, в парах 1A2-IA2 и 1A2-Su энхансер-блокирующая активность 1А2 инсулятора значительно усиливается

Интересно, как будут перераспределяться «мощности», если в системе находятся все три инсулятора - можно было бы предположить, что преимущественно будут реализовываться взаимодействия между более близко друг по отношению к другу расположенными инсуляторами Однако оказалось, что не все так просто (рис 9Б, панели 1,3,5) для гена white во всех случаях наблюдалась очень слабая инсуляция, а для гена yellow, в зависимости от конкретных комбинаций инсуляторов блокирование энхансеров варьировало от слабого до полного уровня То есть, скорей всего, в данном случае мы имеем дело не с парами взаимодействующих инсуляторов, а с комбинациями именно из трех инсуляторов, так как два инсулятора, расположенные в предпромоторной области гена yellow не способны нейтрализовать друг друга в том случае, когда у них появляется третий напарник, размещенный ниже теш yellow

2 3 Взаимодействия между инсуляторами, окружающими оба маркерных гена - можно ли ксмоделировать> независимые транскрипционный домен7'

В предыдущем разделе был описан случай значительного усиления энхансер-блокирующей активности 1А2 инсулятора в тех вариантах конструкций, когда инсулятор-партнер находился ниже гена yellow на расстоянии в 5 т п н от инвариантного инсулятора Для проверки возможностей взаимодействия между инсуляторами на еще более внушительных расстояниях мы переместили инсулятор еще дальше, расположив его ниже гена white Таким образом, расстояние между потенциально взаимодействующими инсуляторами увеличилось до 10 т п н

д Г?В|

В эффективность инсуляции

У w

yellow white

НИ yeilw white ++

н® Ills i «■■ ми; i.'" ¿1 ■ yellow white В- +++ +++

•в lili t'EHl *^frjl yellow whitо з> +++ +++

•ш left 1 ) ^ yellow whit« ¡}- ++ ++

НЕ fe. - ■

Рис 10 Эффекты взаимодействий между инсуляторами, окружающими два гена А) Модель влияния на энхансер-промоторную коммуникацию инсуляторов, фланкирующих два гена промоторы генов yettow и white оказываются блокированы в петле и поэтому активация не происходит, более того, в результате взаимодействия между инсуляторами происходит значительное увеличение силы 1А2 инсулятора

Б) Анализ эффективности блокировании промоторов генов yellow и white +++ сильный уровень, ++ средний уровень, - отсутствие инсуляции

Аналогичным образом 1А2 и Su(Hw) инсуляторы, вставленные ниже гена white, достаточно ощутимо увеличивали энхансер-блокирующую активность 1А2 инсулятора, расположенного перед геном yellow (рис 10Б) Единственным исключением, как и в случае с меньшим расстоянием (5 т п н), оказалась комбинация с S4 инсулятором, который в этом положении никак не влияет на усилении или ослабление активности промоторов генов, заключенных между инсуляторами

Таким образом, по всей видимости, инсуляторы (1А2 и Su(Hw)), окружая маркерные гены, способны образовать петлю, которая формируется в виде компактно распределенной в пространстве структуры с конформационно и стерически изолированными регуляторными элементами (рис 10А) Однако природа взаимодействующих инсуляторов играет важную роль в формировании стабильной петли с эффективно изолированной от энхансеров конфигурацией Вполне возможно, что на этом этапе важная роль отводится структуре белковых комплексов, связывающихся со взаимодействующими инсуляторами и стабилизирующих структуру петли - в одних случаях конформационно петля оказывается изолирована от поступающих извне сигналов, в других случаях (с другими белковыми комплексами) наоборот элементы, попавшие в петлю оказываются подвержены влиянию внешних элементов (как в случае с S4 инсулятором)

Таким образом, стерически-конформационная изоляция энхансеров сильно зависит от природы взаимодействующих инсуляторов, их окружения, взаимного расстояния и расположения энхансеров и промотров.

3. Значение структуры инсуляторов при модулировании энхансер-промоторных

взаимодействий - SulHwl-зависимые инсуляторы не едины в эффектах влияния на уровень экспрессии генов.

В результатах, представленных выше ясно видно, что поведение инсулятора S4 сильно отличается от 1А2 и Su(Hw) Можно было бы предположить, что он не взаимодействует с другими инсуляторами, однако при демонстрации феномена нейтрализации эффекта инсуляции для генов yellow и white он вел себя типично, не выбиваясь из рядов 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов В то же время в тестах по усилению энхансер-блокирующей активности инсуляторов и моделированию независимых доменов экспрессии он начинал проявлять себя в нетипичной манере, не оказывая никакого влияния на уровни экспрессии генов Возможно, S4 инсулятор способен каким-то образом переключать активность ?А2 инсулятора либо взаимодействие между S4 инсуляторами создает особую конфигурацию, отличающуюся от создаваемых остальными наборами инсуляторов Так, мы решили разобраться, какое направление реализуется в действительности Поэтому для этого инсулятора была создана более «гомогенная» система, в которой инвариантный 1А2 инсулятор был заменен на S4 Итоговая конструкция содержала 3 копии инсулятора S4

Рис 11 Сравнение функциональных активностей 1А2 и S инсуляторов Анализ эффективности блокировании промоторов генов yellow и white ++++ полная инсуляция, +++ сильный уровень, ++ средний уровень, + слабый уровень, - отсутствие инсуляции Пятиугольники - 1А2 или S4 элемент

Как видно из результатов по этой конструкции инсулятор S4 ведет себя во всех комбинациях точно также как и в сочетании с 1А2 инсулятором (особенно интересно, что усиление изоляции гена yellow в тех случаях, когда он оказывается окружен двумя S4

инсуляторами, не происходит) Вполне возможно, что на S4 элементах собираются белковые комплексы, отличные от 1А2 инсулятора, в результате чего формируется особая пространственная структура (в которой, например, по-особому изогнута ДНК-последовательность) и оказавшиеся в ней регуляторные элементы не оказываются функционально изолированными от внешних элементов, расположенных вне петли

Таким образом, изоляция энхансера от промотора в петле далеко не всегда приводит к усилению энхансер-блокирующего эффекта. Возможно, это связано с формированием разных по природе белковых комплексов, собирающихся на разных типах иисуляторов.

заключение

В данной работе в процессе изучения структурно-функциональных особенностей эндогенного 8и(Н\у)-зависимого инсулятора был идентифицирован новый белковый компонент, участвующий в работе 8и(Н\у)-инсуляторов Это белок Е(у)2, способный связываться с цинковыми пальцами белка Su(Hw) Е(у)2 необходим для осуществления инсулятором барьерной активности Так, он является компонентом SAGA комплекса, одной из функций которого является ацетшшрование гистонов Можно предположить, что Su(Hw) рекрутирует через взаимодействие с белком Е(у)2 SAGA комплекс, который, ацетилируя окружающие гистоны, блокирует распространение зоны гетерохроматина Полученные в данной работе результаты для инсулятора 1А2 согласуются с этим механизмом, так как при введении мутации по гену е(у)2 наблюдалось значительное снижение способности 1А2 инсулятора блокировать Рс-зависимую репрессию Таким образом, в данной работе удалось не только разделить энхансер-блокирующую и барьерную активности, но и определиться с белками, осуществляющими каждую из этих активностей Оказалось, что, в принципе, можно проводить параллель с наиболее хорошо изученным у позвоночных инсулятором 5'HS4 из (З-глобинового локуса кур, в котором за энхансер-блокирующую и барьерную активности отвечают разные белки - CTCF и USF, соответственно В случае с Su(Hw)-HHcyiMTopaMH получена подобная картина блокирование энхансеров - белок Mod(mdg4)-67 2, барьер между активным и зарепрессированным хроматином -белок Е(у)2 Но есть и отличие, заключающееся в следующем белки CTCF и USF содержат в своем составе ДНК-связывающие домены и поэтому посадочной площадкой для них выступает ДНК-последовательность инсулятора, а белки Mod(mdg4)-67 2 и Е(у)2 специфичных ДНК-связывающих доменов не имеют, поэтому они пользуются услугами посредника, в роли которого выступает ДНК-связывающий белок Su(Hw), способный специфично взаимодействовать и с белками Mod(mdg4)-67 2 и Е(у)2 и с ДНК-последовательностью инсулятора

Далее в данной работе не просто продемонстрирована возможность функционального взаимодействия между инсуляторами Здесь показано, что взаимодействия между одними и теми же наборами инсуляторов в одних случаях приводят к усилению эффекта изоляции энхансера от

промотора, в других случаях, наоборот, способствуют сближению этих регуляторных элементов и эффективной активации энхансером промотора Уровень влияния инсуляторов на регуляцию экспрессии гена зависит от природы инсуляторов-участников взаимодействия, взаимного расположения и расстояний между всеми элементами, вовлеченными в регуляторную машину, и их относительной «силы» друг по отношению к другу Вероятно, что функционирование данного инсулятора сильно зависит от свойств самого инсулятора, его локализации относительно энхансера и промотора и присутствия других инсуляторов Кроме этого нельзя исключать участие дополнительных сил в установлении определенного статуса экспрессии гена Так, не исключено, что взаимодействие инсуляторов с белками ядерного скелета также может модулировать (усиливать или ослаблять) эффективность блокирования энхансеров Наконец, активность инсуляторов, способных создавать границы между активным и неактивным хроматином, возможно, реализуется за счет привлечения инсуляторами комплексов, модифицирующих гистоны

Можно предположить, что одной из функций регуляторных элементов, обладающих свойствами инсуляторов, является контроль за установлением правильных взаимодействий между энхансерами и промоторами За счет эффективного и селективного взаимодействия на больших дистанциях инсуляторы могут регулировать пространственную локализацию хромосом в ядре При активации ген перемещается в зоны активной транскрипции, названные «транскрипционными фабриками», в то же время неактивные гены аналогичным образом группируются в зонах с повышенным содержанием репрессоров Возможно, что инсуляторы с регулируемой активностью могут участвовать в таких процессах перелокализации генов в ядре

Таким образом, стерическая изоляция энхансера может являться только одной из составляющих механизма действия инсуляторов Образование петель само по себе не объясняет эффективную изоляции энхансера от промотора Например, в данной работе было показано, что как минимум три инсулятора могут одновременно взаимодействовать и в результате определять, какой из двух промоторов генов yellow и white оказывается более предпочтительным для активации энхансерами Кроме этого рядом с инсуляторами могут находиться сайты связывания для регуляторных белков, рекрутируемых на энхансер или промотор или определяющих способность данного инсулятора взаимодействовать с другими инсуляторами в геноме для установления дальних взаимодействий между энхансерами и промоторами

Хотя некоторые свойства и механизмы действия регуляторных элементов, обладающих свойствами инсуляторов, становятся понятными, их роль в регуляции транскрипции только начинает проясняться Возможно, для того чтобы пролить свет на решение этой фундаментальной проблемы, целесообразным шагом будет поиск новых подходов, направленных на изучение регулируемости и функциональной нагрузки взаимодействий между регуляторными элементами на больших дистанциях

Выводы

1 Показано, что 1А2 инсулятор имеет модульное строение дистальная (236 п н) относительно гена yellow часть 1А2 инсулятора, содержащая два сайта связывания для белка Su(Hw), является достаточной для инсуляции, а проксимальная часть (218 пн) модулирует активность инсулятора и определяет способность инсулятора являться промотор-специфичным сайленсером в отсутствии белка Mod(mdg4)

2 Впевые продемонстрировано, что за барьерную активность Su(Hw)-3aBHCHMbix

инсуляторов отвечает белок Е(у)2, который связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw)

3 Впервые показано, что как минимум три разных по структуре Su(Hw)-3aBHCHMbix

инсулятора могут функционально взаимодействовать друг с другом на расстоянии до 10 т п н

4 Показано, что степень изоляции энхансера от промотора сильно зависит от природы

участвующих в регуляторной системе инсуляторов, их окружения, взаимных расстояний и расположения

5 Продемонстрировано, что изоляция энхансера от промотора в петле далеко не всегда

приводит к усилению энхансер-блокирующсго эффекта Возможно, это связано с формированием разных по природе белковых комплексов, собирающихся на разных типах инсуляторов

список печатных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи.

1 Максименко О Г , Четверина Д А, Георгиев П Г 2006 Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции Генетика 42 (8), 845857

2 Kurshakova М *, Maksimenko О *, Golovmn А, Pulina М , Georgieva S , Georgiev Р , Krasnov А 2007 Evolutionary conserved E(y)2/Susl protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators m Drosophila Molecular Cell 27, 332-338

3 Максименко О Г. Георгиев ПГ 2007 Исследование барьерной активности 1А2-инсулятора Drosophila melanogaster Доклады Академии наук, 416 (2)

4 Максименко О Г, Георгиев ПГ 2007 Изучение структуры 1А2-инсулятора Drosophila melanogaster Доклады Академии наук, 416 (3)

Тезисы конференций

1 Р Georgiev, M Kostuchenko, Е Kravchenko, D Chetverma, О Maksimenko. A Parshikov, L_ Melnikova, A Golovnin The mechanisms of long-distance interactions and insulator action in Drosophila melanogaster HHMI, Menda, Mexico June 22-25, 2005

2 Максименко О Г Изучение свойств эндогенного Su(Hw) инсулятора у Drosophila melanogaster Материалы школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», Звенигород, 28 ноября-1 декабря 2005 г

3 Максименко О Г. Георгиев П Г Структура и функциональные взаимодействия 1А2 инсулятора у Drosophila melanogaster Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 апреля 2006 г

4 Максименко О Г . Куршакова M M , Краснов А H , Георгиев П Г Исследование участия белка Е(у)2 в реализации барьерной активности Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов D melanogaster Материалы 14-й Международной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007», Москва, МГУ, 11-14 апреля 2007 г

5 Maksimenko О . Kurshakova M, Golovnin А , Georgiev Р Е(у)2 protein is essential for the barrier activity of the Su(Hw) insulators m Drosophila melanogaster 4th Elmau conference on nuclear organization at Gosau, Austria, October 12th- October 15th 2006

6 Maksimenko О. Georgiev P Interplay of Su(Hw)-dependent insulators can redirect the communication between regulatory elements m transgenic Drosophila EMBO conference «Nuclear structure and dynamics» Montpellier, France, September 1-5, 2007

7 Maksimenko О . Kurshakova M , Krasnov A , Georgiev P Different domains of the Su(Hw) protein interact with Mod(mdg4)-67 2 and E(y)2 proteins mediating various functions of Drosophila Su(Hw)-dependent insulators FEBS workshop «The biology of modular protein domains», Seefeld m Tirol, Austria, September 8-13, 2007

8 Maksimenko О , Kurshakova M, Krasnov A , Georgiev P Analysis of the boundary activity of the Su(Hw)-dependent insulators of Drosophila melanogaster 2nd Transregio 5 Symposium "Chromatin - assembly and inheritance of functional states", Munich, Germany, September 1315, 2007

Заказ № 172/09/07 Подписано в печать 19 09 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 дЛ . угтч с/г ги, е-тай т/о@с/г ги

^ У)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максименко, Оксана Геннадьевна

Оглавление.

Список используемых сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Особенности регуляции транскрипции у высших эукариот.

1.1.1 Регуляторные последовательности.

1.1.2 Структура хроматина.

1.1.3 Возможные принципы взаимодействий между регуляторными элементами на больших дистанциях.

Прямое» взаимодействие энхансера и промотора.

Взаимодействия транскрипционных факторов с энхансером.

1.2 Инсуляторы и системы регуляции экспрессии генов.

1.2.1 Разнообразие инсуляторов высших эукариот.

1.2.2 Механизмы регуляции активности инсуляторных белков на примере СТСР.

1.2.3 Возможные принципы работы инсуляторов.

Локальные взаимодействия между белками инсулятора и белками энхансера (или других регуляторных элементов).

Структурная роль инсуляторов.

Роль химических модификаций в функционировании инсуляторов.

1.2.4 Реализация активностей инсуляторов.

Связи между инсуляцией и транскрипционными активаторами.

Связи между инсуляцией и топологическими доменами.

1.3 Роль инсуляторов в регуляции транскрипции.

2. Материалы и методы.

2.1. Генетические методы.

2.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster.

2.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

2.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях.

2.1.4. Генетические скрещивания.

2.2. Биохимические методы.

2.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.

2.2.2. Саузерн-блот-анализ.

2.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.4. Молекулярное клонирование.

2.2.5. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.7. Измерение активности (3-галактозидазы.

2.3. Создание трансгенных конструкций.

3. Актуальность проводимого исследования.

4. Цель и задачи исследования.

5. Результаты.

5.1. Анализ структуры и функциональной активности 1А2 инсулятора.

5.1.1. Изучение энхансер-блокирующей активности.

5.1.2. Изучение барьерной активности.

5.1.3. Роль белков Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2 и Е(у)2 в активности 1А2 инсулятора. .84 Белок Su(Hw).

Белок Mod(mdg4)-67.2.

Белок Е(у)2.

5.1.4. 1А2 инсулятор способен к функциональным взаимодействиям.

5.2. Демонстрация возможного участия инсуляторов в установлении энхансер-промоторных взаимодействий.

5.2.1. Дизайн тест-системы для изучения влияния функциональных взаимодействий между разными наборами инсуляторов на экспрессию генов.

5.2.2.Сила влияния взаимодействий между инсуляторами на работу генов зависит от взаимного расположения и расстояний между всеми участниками транскрипционной регуляторной системы.

Взаимодействия между тандемно расположенными инсуляторами - всегда ли работает нейтрализация?.

Взаимодействия между инсуляторами, окружающими первый маркерный ген - что произойдет при увеличении расстояния между инсуляторами?.

Взаимодействия между инсуляторами, окружающими оба маркерных гена - можно ли «смоделировать» независимый транскрипционный домен?.

5.2.3. Значение структуры инсуляторов при модулировании энхансер-промоторных взаимодействий - 8и(Н\у)-зависимые инсуляторы не едины в эффектах влияния на уровень экспрессии генов.

6. Обсуждение.

7. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов у Drosophila melanogaster"

Транскрипция - важная стадия в процессе реализации генетической информации. Ключевую роль в регуляции этого процесса играют транскрипционные факторы - белки, способные контролировать активность РНК

- полимеразы. Как известно, для высших эукариот характерна наиболее развитая система регуляции транскрипции, связанная с необходимостью в транскрипции различных генов в зависимости от типа клеток и стадии развития организма, в результате только определенный набор генов экспрессируется в данном типе дифференцирующихся клеток, остальные же гены находятся в стабильно неактивном состоянии. Определенный контроль за экспрессией гена может осуществляться за счет прямых взаимодействий между белками основного транскрипционного комплекса, собранного на промоторе, и специфическими белковыми комплексами на регуляторных элементах, названных энхансерами т.е. усилителями транскрипции). Энхансеры способны работать на очень больших дистанциях (Bondarenko et al., 2003; Dorsett, 1999; de Laat & Grosveld,

2003; West, Fraser, 2005). Большая часть экспериментальных данных согласуется с так называемой «петлевой» моделью, согласно которой белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, в результате чего ДНК между этими элементами выпетливается

Tolhuis, 2002; de Laat & Grosveld, 2003). Однако в рамках этой модели возникает вопрос, каким образом энхансеру, взаимодействующему с промотором на больших расстояниях, удается правильно узнавать свой промотор, какие механизмы препятствуют установлению связей с другими генами. Ясно то, что должны существовать механизмы, разграничивающие регуляторные последовательности в специфические участки генной экспрессии, и, таким образом, препятствующие образованию случайных связей между энхансерами и промоторами (<3е Ьаа1 & ОгоБУеЫ, 2003). Возможно, важную роль в этих процессах играют инсуляторы - регуляторные элементы, при расположении между энхансером и промотором способные препятствовать установлению эффективного взаимодействия между этими элементами, в результате чего активация промотора не происходит. Кроме этого, инсуляторы могут разделять эу- и гетерохроматиновые участки, и с этой точки зрения основная роль инсуляторов - компартментализация генома и организация хроматина в ядре, инсуляторы способны собирать хроматин в доменные структуры, каждая из которых представляет собой независимую функциональную единицу генной экспрессии. В данной работе на примере эндогенного 8и(Н\у)-зависимого инсулятора представлен сравнительный анализ инсуляторных активностей, более того, показано непосредственное влияние инсулятора на активность промоторов, продемонстрировано, какой вклад инсуляторы могут вносить в энхансер-промоторные взаимодействия благодаря еще одной, к настоящему моменту, не выделенной отдельно, активности - коммуникаторной. Все вышесказанное определяет актуальность настоящей диссертационной работы, посвященной изучению особенностей функционирования инсуляторов дрозофилы в контексте их влияния на процессы регуляции экспрессии генов и, в частности, на установление энхансер-промоторных взаимодействий.

1. Обзор литературы

Для высших эукариот характерно наличие очень сложных систем регуляции экспрессии генов - так, некоторые гены объединены в кластеры, в рамках которых гены регулируются автономно от соседних генов, с очень четкой пространственной и временной программой работы. О том, каким образом происходит ограничение экспрессии в ненужное время и в ненужном месте, известно мало. Возможно, определенную роль в этих процессах играют инсуляторы. Одни инсуляторы разделяют гены с независимыми системами регуляции экспрессии, другие работают в рамках одного генного локуса для разделения программ регуляции на разных этапах развития и в разных типах тканей. Четкие гомологии в последовательностях разных инсуляторов найдены не были, нет и универсального белка-кандидата для выполнения инсуляторной функции, кроме, пожалуй, млекопитающих, для которых на сегодняшний день описаны только СТСБ-зависимые инсуляторы, по это никак не может служить доказательством универсальности механизмов инсуляции даже в пределах группы млекопитающих. На данном этапе изучения инсуляторов отсутствует какая-либо единая концепция по принципам работы и роли инсуляторов в геноме. Исходя из этих предпосылок в данном обзоре будет представлен краткий обзор регуляторных элементов, проведен сравнительный анализ инсуляторных активностей и возможных механизмов работы инсуляторов, а также продемонстрировано, какой вклад инсуляторы могут вносить в энхансер-промоторные взаимодействия.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Максименко, Оксана Геннадьевна

7. Выводы.

1. Показано, что 1А2 инсулятор имеет модульное строение: дистальная (236 п.н.) относительно гена yellow часть 1А2 инсулятора, содержащая два сайта связывания для белка Su(Hw), является достаточной для инсуляции, а проксимальная часть (218 п.н.) модулирует активность инсулятора и определяет способность инсулятора являться промотор-специфичным сайленсером в отсутствии белка Mod(mdg4).

2. Впервые продемонстрировано, что за барьерную активность Su(Hw)-зависимых инсуляторов отвечает белок Е(у)2, который связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw).

3. Впервые показано, что как минимум три разных по структуре Su(Hw)-зависимых инсулятора могут функционально взаимодействовать друг с другом на расстоянии до 10 т.п.н.

4. Показано, что степень изоляции энхансера от промотора сильно зависит от природы участвующих в регуляторной системе инсуляторов, их окружения, взаимных расстояний и расположения.

5. Продемонстрировано, что изоляция энхансера от промотора в петле далеко не всегда приводит к усилению энхансер-блокирующего эффекта. Возможно, это связано с формированием разных по природе белковых комплексов, собирающихся на разных типах инсуляторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максименко, Оксана Геннадьевна, Москва

1. Максименко О.Г., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции, 2006, Генетика, 42: 845-857.

2. Albiez Н., Cremer М., Tiberi С. et al. Chromatin domains and the interchromatin compartment form structurally defined and functionally interacting nuclear networks, 2006, Chromosome Research, 14:707-733.

3. Ameres S. L., Drueppel L., Pfleiderer K., Schmidt A., Hillen W., Berens C. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer, 2005, EMBO J., 24. P:358-367.

4. Arnosti D. N., Kulkarni M. M. Transcriptional Enhancers: Intelligent Enhanceosomes or Flexible Billboards? 2005, J. of Cell. Biochemistry, 94:890-898.

5. Barges S., Mihaly J., Galloni M., Hagstrom K. et al., The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-7 domain and insulates iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain, 2000, Dev., 127: 779-790.

6. Bell A.C., Felsenfeld G., Stopped at the border: boundaries and insulators, 1999, Cur.Opin. in Gen&Dev, 9:191-198.

7. Bell A. C., West A. G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators, 1999, Cell, 98:387-396.

8. Bell A.C., West A.G., Felsenfeld G., Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome, 2001, Science, 291: 447-450.

9. Bender M.A., Reik A., Close J., et al., Description and targeted deletion of 5' hypersensitive site 5 and 6 of the mouse p-globin locus control region, 1998, Blood, 92:4394 -4403.

10. Blackwood E.M., Kadonaga J.T., Going the distance: a current view of enhancer action, 1998, Science, 281:60-63.

11. Blanton J., Gaszner M., Schedl P. Protein : protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo, 2003, Genes &Dev., 17: 664-675.

12. Bondarenko V.A., Jiang Y.I., Studitsky V.M. Rationally designed insulator-like elements can block enhancer action in vitro, 2003, EMBO J., 22: 4728-4737.

13. Bondarenko V.A., Liu Y.V., Jiang Y.I., Studitsky V.M., Communication over a largedistance: enhancers and insulators, 2003, Biochem.Cell Biol., 81: 2241-251.

14. Brasset E., Vaury C. Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes, 2005, Heredity, 94: 571-576.

15. Breiling A., O'Neill L. P., D'Eliseo D., Turner B. M., Orlando V. Epigenome changes in active and inactive Polycomb-group-controlled regions, 2004, EMBO reports, 5: 976-982.

16. Burgess-Beusse B., Farrell C., Gaszner M. et al. The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin, 2002, PNAS, 99: 16433-16437.

17. Burke L.J., Zhang R., Bartkuhn M. et al. CTCF binding and higher order chromatin structure of the H19 locus are maintained in mitotic chromatin, 2005, EMBO J., 24:32913300.

18. Butler J.E., Kadonaga J.T. Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs, 2001, Genes & Dev. ,15: 2515-2519.

19. Byrd K., Corces V. G. Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila, 2003, J. Cell Biol., 162: 565-574.

20. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo, 1995, Nature, 376: 533-536.

21. Cai H.N., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity, 2001, Science, 291: 493-495.

22. Cai H.N., Zhang Z., Adams J.R., Shen P. Genomic context modulates insulator activity through promoter competition, 2001, Dev., 128: 4339-4347.

23. Capelson M., Corces V.G. Boundary elements and nuclear organization, 2004, Biol. Cell., 96: 617-629.

24. Carmo-Fonseca M. The contribution of nuclear compartmentalization to gene regulation, 2002, Cell, 108:513-521.

25. Chen Q., Lin L., Smith S. et al. Multiple promoter targeting sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation, 2005, Dev. Biol., 286: 629-636.

26. Chung J., Whiteley M., Felsenfeld G. A 5' element of the chicken p-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila, 1993, Cell, 74:505-514.

27. Chung J.H., Bell A.C., Felsenfeld G. Characterization of the chicken p-globin insulator, 1997, PNAS, 94: 575-580.

28. Comet I., Savitskaya E., Schuettengruber B. PRE-mediated bypass of two Su(Hw) insulators targets PcG proteins to a downstream promoter, 2006, Dev. Cell, 11:117-124.

29. Cook P.R. Nongenic transcription, gene regulation and action at a distance, 2003, J.of Cell Science, 116: 4483-4491.

30. Cosma M.P. Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation, 2002, Mol.Cell, 10: 227-236.

31. Cremer T., Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells, 2001, Nat. Rev.Genetics, 2: 292-301.

32. Dean A. Chromatin remodelling and the interaction between enhancers and promoters in the p-globin locus, 2004, Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 2: 344-354.

33. Defossez P.-A., Kelly K.F., Filion G. et al. The human enhancer-blocker CTCF interacts with the transcription factor Kaiso, 2005, J. Biol. Chem., 280: 43017- 43023.

34. Dhillon N., Kamakaka R.T., Breaking through to the other side: silencers and barriers, 2002, Cur.Opin.in Gen&Dev., 12:188-192.

35. Dillon N., Sabbattini P. Functional gene expression domains: defining the functional unit of eukaryotic gene regulation, 2000, BioEssays, 22: 657-665.

36. Donze D., Adams C.R., Rine J., Kamakaka R.T. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae, 1999, Genes&Dev., 13: 698-708.

37. Donze D., Kamakaka R.T. RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexe are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae, 2001, EMBO J., 20: 520531.

38. Dorsett D. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila, 1999, Curr.Opin.Genet.Dev., 9:505-514.

39. Drewell R.A., Goddard C.J., Thomas J.O., Surani M.A. Methylation-dependent silencing at the H19 imprinting control region by MeCP2,2002, Nucl. Ac. Res., 30: 1139-1144.

40. Dunn K.L., Zhao H., Davie J.R. The insulator binding protein CTCF associates with the nuclear matrix, 2003, Exp. Cell Res., 288: 218-223.

41. Ehrlich M. Expression of various genes is controlled by DNA methylation during mammalian development, 2003, J.of Cell.Biochem., 88: 899-910.

42. Epner E., Reik A., Cimbora D. et al. The P-globin LCR is not necessary for an open chromatin structure or developmentally regulated transcription of the native mouse (3-globin locus, 1998, Mol. Cell, 2: 447-455.

43. Farrell C.M., West A.G., Felsenfeld G. Conserved CTCF Insulator Elements Flank the Mouse and Human p-Globin Loci, 2002, Mol. Cell. Biol., 22: 3820-3831.

44. Felsenfeld G., Burgess-Beusse B., Farrell C. et al. Chromatin Boundaries and Chromatin Domains, 2006, Cold Spr. Harb. Symp. on Quant. Biol., LXIX: 245-250.

45. Fraser P. Transcriptional control thrown for a loop, 2006, Cur. Opin. in Genetics & Dev., 16:490-495.

46. Fraser P., Bickmore W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation, 2007, Nature, 447:413-417.

47. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction, 1999, Genes Dev., 13: 20982107.

48. Gause M., Morcillo P., Dorsett D. Insulation of enhancer-promoter communication by a gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of hairy-wing and modifier of mdg4 proteins, 2001, Mol.Cell.Biol., 21: 4807-4817.

49. Gdula D.A., Corces V.G. Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations, 1997, Genetics, 145: 153-161.

50. Georgiev P.G. Identification of mutations in three genes that interact with zeste in the control of white gene expression in Drosophila melanogaster, 1994, Genetics, 138:733-739.

51. Georgiev P., Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations, 1996, Genetics, 142:425-436.

52. Gerasimova T.I., Corces V.G. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator, 1998, Cell, 92: 511-521.

53. Gerasimova T. I., Byrd K., Corces V. G. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA, 2000, Mol. Cell, 6: 1025-1035.

54. Gerasimova T.I., Corces V.G. Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization, 2001, Annu.Rev.Genet., 35: 193-208.

55. Geyer P.K., Corces V.G. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melcmogaster, 1987, Genes & Dev., 1: 996-1004.

56. Geyer P. K., Clark I. Protecting against promiscuity: the regulatory role of insulators, 2002, CMLS, 59:2112-2127.

57. Ghosh D., Gerasimova T.I., Corces V.G. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function, 2001, EMBO J., 20: 2518-2527.

58. Gilbert N., Boyle S., Fiegler H. Chromatin architecture of the human genome: gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers, 2004, Cell, 118:555-566.

59. Golic K. G., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome, 1989, Cell, 59: 499-509.

60. Golovnin A., Birukova I., Romanova O. et al. An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the achaete-scute complex in Drosophila, 2003, Dev., 130:3249-3258.

61. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance, 2005, Genetics, 170: 1133-1142.

62. Gombert W.M., Farris S.D., Rubio E.D, et al. The c-myc insulator element and matrix attachment regions define the c-myc chromosomal domain, 2003, Mol. Cell. Biol., 23:93389348.

63. Grimaud C., Negre N. , Cavalli G. From genetics to epigenetics: the tale of Polycomb group and trithorax group genes, 2006, Chromosome Research, 14:363-375.

64. Gruzdeva N., Kyrchanova 0., Parshikov A. et al. The Mcp element from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication, 2005, Mol. Cell. Biol., 25: 3682-3689.

65. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex, 1996, Genes & Dev., 10:3202-3215.

66. Harrison D.A., Gdula D.A., Coyne R.S., Corces,V.G. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function, 1993, Genes & Dev., 7: 1966-1978.

67. Hawkins R. D., Ren B. Genome-wide location analysis: insights on transcriptional regulation, 2006, Hum. Mol. Genetics, 15:Rl-7.

68. Hebbes T.R., Clayton A.L., Thorne A.W., Crane-Robinson C. Core histone hyperacetilation comaps with generalized DNase I sensitivity in the chicken (3-globin chromosomal domain, 1994, EMBO J., 13: 1823 1830.

69. Holohan E. E., Kwong C., Adryan B. et al. CTCF Genomic Binding Sites in Drosophila and the Organisation of the Bithorax Complex, 2007, PLoS Genetics, 3: el 12

70. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids, 1990, Gene, 96:23-28.

71. Ishihara K., Oshimura M., Nakao M. CTCF-dependent chromatin insulator is linked to epigenetic remodeling, 2006, Mol. Cell, 23:733-742.

72. Ishii K., Arib G., Lin C., Van Houwe G., Laemmli U.K. Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection, 2002, Cell, 109: 551-562.

73. Kaffer C.R., Srivastava M., Park K.Y. et al. A transcriptional insulator at the imprinted H19/Igf2 locus, 2000, Genes & Dev., 14: 1908-1919.

74. Kares R.E., Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila, 1984, Cell, 38:135-146.

75. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains, 1991, Cell, 64:941-950.

76. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay, 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 2424-2431.

77. Kim J., Shen B., Rosen C., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein, 1996, Mol. Cell. Biol., 16: 3381-3392.

78. Kim T.H., Abdullaev Z.K, Smith A.D. et al. Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF-binding sites in the human genome, 2007, Cell, 128:1231-1245.

79. Kosak S. T., Groudine M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation, 2004, Genes & Dev., 18:1371-1384.

80. Kuhn E. J., Geyer P. K. Genomic insulators: connecting properties to mechanism, 2003, Curr. Opin. Cell Biol., 15:259-265.

81. Kuhn E.J., Viering M.M., Rhodes K.M., Geyer P.K. A test of insulator interactions in Drosophila, 2003, EMBO J, 22: 2463-2471.

82. Kuhn E., Hart C., Geyer P. Studies of the role of the Drosophila scs and scs' insulators in defining boundaries ofa chromosome puff, 2004, Mol. Cell. Biol., 24: 1470-1480.

83. Labrador M., Corces V.G. Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization, 2002,Cell, 111: 151-154.

84. Leighton P.A., Ingram R.S., Eggenschwiler J., Efstratiadis A., Tilghman S.M. Disruption of imprinting caused by deletion of the H19 gene region in mice, 1995, Nature, 375:34-39.

85. Levine M., Tjian R. Transcription regulation and animal diversity, 2003, Nature, 424: 147151.

86. Li B., Carey M., Workman J. L. The role of chromatin during transcription, 2007, Cell, 128:707-719.

87. Li Q., Stamatoyannopoulos G. Hypersensitive site 5 of the human beta locus control region functions as a chromatin insulator, 1994, Blood, 84:1399-401.

88. Li Y.-J., Fu X.-H., Liu D.-P., Liang C.-C. Opening the chromatin for transcription, 2004, IJBCB, 36:1411-1423.

89. Lin Q., Chen Q., Lin L., Zhou J. The Promoter Targeting Sequence mediates epigenetically heritable transcription memory, 2004, Genes & Dev., 18: 2639-2651.

90. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster, 1992, Academic Press, New York.

91. Lutz M., Burke L.J., Barreto G. Transcriptional repression by the insulator protein CTCF involves histone deacetylases, 2000, Nucl. Ac. Res., 28: 1707-1713.

92. Lutz M., Burke L.J., LeFevre P. et al. Thyroid hormone-regulated enhancer blocking: cooperation of CTCF and thyroid hormone receptor, 2003, EMBO J., 22: 1579-1587.

93. Majumder P., Cai H.N. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo, 2003, PNAS, 100: 5223-5228.

94. Mailin D.R., Myung J. S., Patton J. S., Geyer P. K. Polycomb group repression is blocked by the Drosophila Suppressor of Haiiy-wing Su(Hw). insulator, 1998,Genetics, 148: 331339.

95. Mazo A. M., Mizrokhi L. J., Karavanov A. A. et al. Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity, 1989, EMBO J., 8: 903-911.

96. Melnikova L., Juge F., Gruzdeva N., et al. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila, 2004, PNAS, 101: 14806— 14811.

97. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Galloni M. et al. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex, 1998, Cell Mol.Life Sei., 54: 60-70.

98. Moazed D. Common themes in mechanisms of gene silencing, 2001, Mol.Cell., 8:489-49

99. Mongelard F., Corces V.G. Two insulators are not better than one, 2001, Nat. Struct. Biol., 8:192-194.

100. Moon H., Filippova G., Loukinov D. et al. CTCF is conserved from Drosophila to humans and confers enhancer blocking of the Fab-8 insulator, 2005, EMBO Rep., 2:165-170.

101. Mukhopadhyay R., Yu W.-Q., Whitehead J. et al. The binding sites for the chromatin insulator protein CTCF map to DNA methylation-free domains genome-wide, 2004, Gen. Res., 14:1594-1602.

102. Muller J., Hart C. M., Francis N.J. et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex, 2002, Cell, 111: 197-208.

103. Muller J., Kassis J.A. Polycomb response elements and targeting of Polycomb group proteins in Drosophila, 2006, Genes Dev, 16:476-484.

104. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E., Parshikov A., Belenkaya T., Pirotta V., Georgiev P. Loss of insulator activity by paired Su(hw) chromatin insulators, 2001, Science, 291:495-498.

105. Mutskov V.J., Farrell C.M., Wade P.A., Wolffe A.P., Felsenfeld G. The barrier function of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation, 2002, Genes&Dev., 16: 1540-1554.

106. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence, 1998, J. Biol. Chem., 273. 2473-2479.

107. Ohtsuki S., Levine M., GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo, 1998, Genes&Dev., 12: 3325-3330.

108. Oki M., Kamakaka R. T. Blockers and barriers to transcription: competing activities? 2002, Curr. Opin. Cell Biol., 14: 299-304.

109. Orphanides G, Reinberg D. A unified theory of gene expression, 2002, Cell,108:439-451.

110. Pai C.-Y., Corces V.G. The nuclear pore complex and chromatin boundaries, 2002, Trends in Cell Biol., 12:452-455.

111. Pai C., Lei C., Ghosh D., Corces V. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator, 2004, Mol. Cell, 16: 737-748.

112. Parkhurst S.M., Harrison D.A., Remington M.P. et al. The Drosophila su(Hw) gene, which controls the phenotypic effect of the gypsy transposable element, encodes a putative DNA-binding protein, 1988, Genes & Dev., 2: 1205-1215.

113. Parnell J.T., Geyer P.K. Differences in insulator properties revealed by enancer blocking assays on episomes, 2000, EMBO J., 19: 5864-5874.

114. Parnell J.T., Viering M.M., Skjesol A. et al. An endogenous Su(Hw) insulator separates theregulatory domains in Drosophila, 2003, PNAS, 100: 13436-13441.

115. Parnell T. J., Kuhn E. J., Gilmore B. L., Helou C., Wold M.S., Geyer P. K. Identification of genomic sites that bind the Drosophila Suppressor of Hairy-wing insulator protein, 2006, Mol. Cel. Biol., 26: 5983-5993.

116. Patrinos G. P., de Krom M., de Boer E., Langeveld A. et al. Multiple interactions between regulatory regions are required to stabilize an active chromatin hub, 2004, Genes & Development, 18:1495-1509.

117. Pikaart M.J., Recillas-Targa F., Felsenfeld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is prevented by insulators, 1998, Genes&Dev., 12: 2852-2862.

118. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene, 1985, EMBO J., 4: 3501-3508.

119. Pirrotta V., Gross D.S. Epigenetic silencing mechanisms in budding yeast and fruit fly: different paths, same destinations, 2005, Mol. Cell, 18:395-398.

120. Prioleau M.-N., Nony P., Simpson M., Felsenfeld G. An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken P-globin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene, 1999, EMBO J., 18: 4035-4048.

121. Ramos E., Ghosh D., Baxter E., Corces V. Genomic organization of gypsy-like chromatin insulators in Drosophila melanogaster, 2006, Genetics, 172: 2337-2349.

122. Renaud S., Loukinov D., Bosman F.T. CTCF binds the proximal exonic region of hTERT and inhibits its transcription, 2005, Nucl. Ac. Res., 33: 6850—6860.

123. Recillas-Targa F., Pikaart M.J., Burgess-Beusse B. et al. Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken P-globin insulator are separable activities, 2002, PNAS, 99:6883-6888.

124. Ringrose L., Paro R. Polycomb/Trithorax response elements and epigenetic memory of cell identity, 2007, Development, 134: 223-232.

125. Robinett C.C., O'Connor A., Dunaway M. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes, 1997, Mol. Cell. Biol., 17:2866-2875.

126. Rodin S., Georgiev P. Handling three regulatory elements in one transgene: a new I-Scel recombination system to supplement the Cre/LOX and Flp/FRT, 2005, BioTechniques, 39: 871-876.

127. Rong Y.S., Golic K.G., Gene targeting by homologous recombination in Drosophila, 2000, Science, 288: 2013-2018.

128. Roseman R. R., Pirrotta V., Geyer P. K. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects, 1993, EMBO J., 12:435-442.

129. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors, 1982, Science, 218: 348-353.

130. Saitoh N., Bell A.C., Recillas-Targa F. Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken 0-globin domain, 2000, EMBO J., 19: 2315-2322.

131. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

132. Savitskaya E., Melnikova L., Kostuchenko M. et al. Study of long-distance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancer-promoter communication in Drosophila melanogaster, 2006, Mol. Cell. Biol., 26:754-761.

133. Schwartz Y. B., Kahn T. G., Nix D. A., Li X.-Y., Bourgon R., Biggin M., Pirrotta V. Genome-wide analysis of Polycomb targets in Drosophila melanogaster, 2006, Nature Genetics, 38: 700-705.

134. Scott K.C., Taubman A.D., Geyer P.K. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength, 1999, Genetics, 153: 787798.

135. Sigrist C. J. A., Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila Polycomb Response Element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes, 1997, Genetics, 147:209-221.

136. Sipos L., Gyurkovics H. Long-distance interactions between enhancers and promoters. The case of the Abd-B domain of the Drosophila bithorax complex, 2005, FEBS J., 272: 3253— 3259.

137. Smale S.T. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation, 2001, Genes & Dev., 15:2503-8.

138. Smith P. A., Corces V. G. The Suppressor of Hairy-wing protein regulates the tissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon, 1995, Genetics, 139: 215-228.

139. Spitz F., Gonzales F., Duboule D. Coordinate regulation of an extended chromosome domain, 2003, Cell, 113:405-417.

140. Splinter E., Heath H., Kooren J. et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the (3-globin locus, 2006, Genes & Dev., 20:2349-2354.

141. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence, 1999, Cell, 99: 459-462.

142. Szabo P.E., Tang S.-H.E., Silva F.J. et al. Role of CTCF binding sites in the Igf2/H19 imprinting control region, 2004, Mol. Cell. Biol., 24: 4791-4800.

143. Szutorisz H., Dillon N., Tora L. The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment, 2005, Trends in Biochemical Sciences, 30:593-599.

144. Taddei A. Active genes at the nuclear pore complex, 2007, Current Opinion in Cell Biology, 19: 305-310.

145. Tanimoto K., Sugiura A., Omori A. et al. Human (3-Globin Locus Control Region HS5 contains CTCF- and developmental stage-dependent enhancer-blocking activity in erythroid cells, 2003, Mol. Cel. Biol., 23: 8946 8952.

146. Tolhuis B., Palstra R. J., Splinter E. et al. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus, 2002, Mol. Cell, 10:1453-1465.

147. Tolhuis B., Muijrers I., de Wit E. et al. Genome-wide profiling of PRC1 and PRC2 Polycomb chromatin binding in Drosophila melanogaster, 2006, Nature Genetics, 38:694-699.

148. Torigoi E., Bennani-Baiti I.M., Rosen C. et al. Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates bicoid activity in vivo, 2000, PNAS, 97: 2686-2691.

149. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains, 1985, J. Mol. Biol., 185: 341-358.

150. Udvardy A. Dividing the empire: boundary chromatin elements delimit the territory of enhancers, 1999, EMBO J., 18:1-8.

151. Valenzuela L., Kamakaka R.T. Chromatin Insulators, 2006, Annu. Rev. Genet., 40:107138.

152. Wai A.W.K., Gillemans N., Raguz-Bolognesi S. et al. HS5 of the human p-globin locus control region: a developmental stage-specific border in erythroid cells, 2003, EMBO J., 22: 4489-4500.

153. Wei W., Brennan M.D. Polarity of transcriptional enhancement revealed by an insulator element, 2000, PNAS, 97: 14518-14523.

154. West A., Gaszner M., Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms, 2002, Genes&Dev., 16:271-288.

155. West A.G., Huang S., Gaszner M. et al. Recruitment of Histone Modifications by USF Proteins at a Vertebrate Barrier Element, 2004, Mol. Cell, 16:453^63.

156. West A.G., Fraser P. Remote control of gene transcription, 2005, Hum. Mol. Genet., 14:101-111.

157. Yang Y., Quitschke W.W., Vostrov A.A., Brewer G.J. CTCF is essential for up-regulating expression from the amyloid precursor protein ptomoter during differentiation of primary hippocampal neurons, 1999, J. ofNeurochem., 73: 2286-2298.

158. Yu W., Ginjala V., Pant V. et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation, 2004, Nat. Genet., 36:1105-1110.

159. Yusufzai T.M., Felsenfeld G. The 5'-HS4 chicken P-globin insulator is a CTCF-dependent nuclear matrix-associated element, 2004, PNAS, 101: 8620-8624.

160. Zhan H.C., Liu D.-P., Liang C.-C. Insulator: from chromatin domain boundary to gene regulation, 2001, Hum Genet, 109: 4711-478.

161. Zhong X.-P., Krangel M.S. An enhancer-blocking element between a and 5 gene segments within the human T cell receptor a/5 locus, 1997, PNAS, 94: 5219-5224.

162. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. et al. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo, 1996, Genes & Dev., 10: 3195-3201.

163. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo, 1999, Cell, 99:567-575.

Информация о работе

Максименко, Оксана Геннадьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.26

Диссертация

Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы